KR100434067B1 - Device and method for detecting a nucleic acid hybridization - Google Patents
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Abstract
본 발명은 핵산 검출을 위한 핵산검출장치 및 전기화학발광(Electrochemiluminescence) 측정 시스템에 관한 것으로, 인터컬레이터(intercalator)와 전이금속착물 유도체 간의 산화-환원반응에서 발생하는 빛으로 핵산의 혼성화(hybridization) 여부를 판별하여 핵산의 구성을 검출하는 장치 및 핵산의 혼성화 검출방법을 제공한다.The present invention relates to a nucleic acid detection device for detecting nucleic acids and an electrochemiluminescence measurement system, wherein hybridization of nucleic acids with light generated from an oxidation-reduction reaction between an intercalator and a transition metal complex derivative. An apparatus for detecting the structure of a nucleic acid by discriminating whether or not is provided, and a hybridization detection method for a nucleic acid.
Description
본 발명은 인터컬레이터를 이용하여 전기화학발광을 유도하여 핵산의 혼성화를 검출하는 장치 및 방법에 관한 것이다.The present invention relates to an apparatus and method for detecting hybridization of nucleic acids by inducing electrochemiluminescence using an intercalator.
핵산을 분석하는 방법은 생물학 연구나 의료진단 및 치료, 신약탐색, 법의학 등 많은 분야에서 사용되고 있다. 이와 관련하여, 특정한 염기서열을 가진 DNA를 찾아내는 방법인 서던 블라팅(Southern blotting)과 RNA 서열을 분석하는 노던 블라팅(Northern blotting)이 개발되었다. 이들은 아가로오스 겔 또는 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하여 크기별로 분획된 시료를 비방사성 표지된 핵산 절편을 사용하여 분석하는 것으로, 많은 노동력, 숙련된 기술 및 과다한 시간이 필요하다는 단점이 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 많은 양의 핵산을 고체 기판 위에 이차원으로 배열시킨 핵산검출장치가 개발되었다.Nucleic acid analysis methods are used in many fields such as biological research, medical diagnosis and treatment, drug discovery, and forensic science. In this regard, Southern blotting, a method of finding DNA with specific sequences, and Northern blotting, which analyzes RNA sequences, have been developed. They are electrophoresed on agarose gels or polyacrylamide gels to analyze samples fractionally sized using non-radiolabeled nucleic acid fragments, which requires a lot of labor, skilled skills and excessive time. In order to solve this problem, a nucleic acid detection device in which a large amount of nucleic acids are arranged two-dimensionally on a solid substrate has been developed.
핵산검출장치는 좁은 고체 기판 표면에 염기서열에 대한 정보를 알고 있는 핵산 단편을 고밀도로 배열하여 고정시킨 것을 의미한다. 이 때, 표면에 고정된 핵산 단편을 탐침핵산(probe nucleic acid)이라 하며, 여기에 미지 시료를 반응시켜 혼성화시킴으로써 미지 시료 내의 핵산에 대한 정보를 알아내는데 사용된다. 이 때, 탐침핵산과 혼성화되는 미지 시료내의 핵산 단편을 타겟핵산(target nucleic acid)이라 한다. 핵산의 혼성화(hybridization)라 함은, 핵산 염기를 구성하는 아데닌(adenine)-티민(thymine), 구아닌(guanine)-시토신(cytosine) 간의 수소 결합에 의하여, 상보적인 염기서열을 갖는 유전자 부위(subsequence)가 서로 결합하여 이중나선 핵산을 형성하는 것을 의미한다.Nucleic acid detection means that the nucleic acid fragments that know information about the nucleotide sequence are arranged on a narrow solid substrate surface at high density. At this time, the nucleic acid fragment immobilized on the surface is called probe nucleic acid, and is used to find out information about the nucleic acid in the unknown sample by reacting and hybridizing the unknown sample. At this time, the nucleic acid fragment in the unknown sample hybridized with the probe nucleic acid is called target nucleic acid. Hybridization of nucleic acid refers to a gene sequence having a complementary base sequence by hydrogen bonding between adenine-thymine and guanine-cytosine constituting the nucleic acid base. ) Is bound to each other to form a double helix nucleic acid.
핵산의 혼성화 반응 결과를 측정하기 위하여, 통상적으로 타겟핵산을 방사성동위원소인32P로 표지(labelling)하고, 타겟핵산과 탐침핵산의 혼성화를 사진 건판(photographic film)을 이용하여 검출하는 방사능사진법이 널리 사용되고 있다. 그러나, 이 방법은 분석에 하루 이상의 장시간이 소요되며, 분해능이 낮고 방사성 동위원소의 안정성에 대한 문제점 등이 단점으로 지적되고 있다.In order to measure the results of hybridization reactions of nucleic acids, the radionuclide is usually labeled with radioactive isotope 32 P, and the hybridization of the target nucleic acid with the probe nucleic acid is detected using a photographic film. This is widely used. However, this method takes longer than one day to analyze, and it is pointed out that the problem of low resolution and problems of stability of radioisotope is disadvantageous.
이 외에도, 전기화학적인 활성을 갖는 금속착물과 이중나선 핵산이 산화-환원반응 한다는 것을 이용하여 핵산의 혼성화를 측정하는 전기화학방법이 있다. 이러한 방법은 매우 간단한 시스템으로 저가형 측정장치에 적용가능하지만, 분석 감도가 떨어진다는 단점이 있다(미국특허 제5,312,527호 참조).In addition, there is an electrochemical method of measuring hybridization of nucleic acids by using an oxidation-reduction reaction between a metal complex having an electrochemical activity and a double-stranded nucleic acid. This method is a very simple system that can be applied to low-cost measuring devices, but has the disadvantage of poor analysis sensitivity (see US Pat. No. 5,312,527).
상기한 바와 같이, 현재의 핵산 혼성화 검출방법은 여러 가지 단점을 가지고 있어서 이를 극복한 새로운 측정방법의 개발이 요구되고 있다. 특히, 시료를 미리 표지물질과 공유결합시키고 이를 분리, 정제하는 과정이 필요없어서 간편하면서도 측정감도가 우수하고, 신속한 검출이 가능하며, 휴대가 용이한 저가의 검출 시스템의 개발의 필요성이 증대되고 있다.As described above, current nucleic acid hybridization detection methods have various disadvantages, and thus development of a new measurement method is required. In particular, there is an increasing need for the development of a low-cost detection system that is simple, has excellent measurement sensitivity, enables rapid detection, and is easy to carry since there is no need to covalently bond a sample with a labeling material, and separate and purify the sample. .
본 발명은 핵산의 혼성화 측정에 전기화학발광법을 도입하여, 이 때 발생하는 빛을 효과적으로 검출할 수 있는 핵산검출장치와 이를 이용한 핵산 혼성화 검출방법을 제공함으로써, 기존의 핵산 혼성화 시스템에 대한 기술적 문제점을 해결하고자 한다. 특히, 본 발명에 따른 핵산검출장치 및 이를 이용한 핵산 혼성화 검출방법은 인터컬레이터와 전이금속착물 간의 산화-환원반응을 유도하여 전기화학적발광을 유발시킴으로써, 특별한 표지방법이 필요없는 간편하고 측정감도가 우수한 새로운 방식의 효과적인 핵산 혼성화 검출방법을 제공한다.The present invention provides an nucleic acid hybridization method capable of detecting light generated at this time by introducing an electrochemical light emission method to the hybridization of nucleic acids, and a nucleic acid hybridization detection method using the same. To solve this problem. In particular, the nucleic acid detection device and nucleic acid hybridization detection method using the same according to the present invention induces an electrochemical emission by inducing an oxidation-reduction reaction between an intercalator and a transition metal complex, so that a simple and sensitive measurement method is not required. It provides an excellent novel method for detecting effective nucleic acid hybridization.
도 1은 핵산칩의 구조를 나타낸 것이다. 도 1a는 멀티어레이 전극이 장치된 전극기판, 도 1b는 덮개, 도 1c와 도 1d는 전극기판과 덮개가 결합된 형태를 나타낸다.Figure 1 shows the structure of the nucleic acid chip. 1A shows an electrode substrate equipped with a multi-array electrode, FIG. 1B shows a cover, and FIGS. 1C and 1D show a form in which an electrode substrate and a cover are combined.
도 2는 인터컬레이터에 의한 전기화학발광의 원리를 나타낸 것이다.2 shows the principle of electrochemiluminescence by an intercalator.
도 3은 전극 위에 고정화된 탐침핵산(probe nucleic acid)과 타겟핵산(target nucleic acid)이 혼성화되는 과정, 상기 혼성화된 핵산에 인터컬레이터가 결합되는 과정 및 인가전압에 의하여 전기화학발광이 일어나는 과정을 나타낸 것이다.3 shows a process of hybridizing a probe nucleic acid and a target nucleic acid immobilized on an electrode, a process of coupling an intercalator to the hybridized nucleic acid, and a process of electrochemical emission by an applied voltage. It is shown.
도 4는 광섬유(optical fiber)를 이용한 전기화학발광 측정장치를 나타낸 것이다.4 shows an electrochemiluminescence measuring device using an optical fiber.
도 5는 PMT(photomultiplier tube)와 CCD 카메라를 이용한 전기화학발광 측정장치를 나타낸 것이다.5 shows an electrochemiluminescence measuring device using a photomultiplier tube (PMT) and a CCD camera.
*** 도면 주요부분의 설명 ****** Description of the main parts of the drawing ***
(1) : 멀티레이어 핵산검출장치 (2) : 대전극(counter electrode)(1): multilayer nucleic acid detection device (2): counter electrode
(3) : 지시전극(working electrode) (4) : 기준전극(reference electrode)(3): working electrode (4): reference electrode
(5) : 핵산칩의 전극 연결부분 (6) : 플라스틱으로 제작된 칩 덮개(5): Electrode connection part of nucleic acid chip (6): Chip cover made of plastic
(7) : 용액주입구 (8) : 볼록렌즈(7): solution inlet (8): convex lens
(9) : 용액 배출구 (10) : 탐침 핵산(9): solution outlet (10): probe nucleic acid
(11) : 전이금속착물 유도체 (12) : 메캅토에탄올(mercaptoethanol)(11): transition metal complex derivative (12): mercaptoethanol
(13) : 타겟 핵산 (14) : 핵산 혼성화 상태(13): target nucleic acid (14): nucleic acid hybridization state
(15) : 인터컬레이터15: intercalator
(16) : 혼성화된 핵산에 인터컬레이터가 결합되어 있는 상태(16): Intercalator is bound to the hybridized nucleic acid
(17) : 인가전압으로 +1.19V를 걸어준 상태(17): + 1.19V applied with applied voltage
(18) : 버퍼용액 저장용기 (19) : 전이금속착물유도체용액 저장용기(18): buffer solution storage container (19): transition metal complex derivative solution storage container
(20) : 타겟핵산용액 저장용기 (21) : 인터컬레이터용액 저장용기(20): target nucleic acid solution storage container (21): intercalator solution storage container
(22) : 정밀펌프 (23) : 폐기용 용기(22): precision pump (23): container for disposal
(24) : PMT (25) : 광섬유24: PMT 25: optical fiber
(26) : 위치제어장치 (27) : 반사거울(26) Positioning device (27): Reflective mirror
(28) : CCD 카메라 (29) : 리볼버(revolver)(28): CCD camera (29): revolver
(30) : 대물렌즈(objective lens) (31) : 광섬유(30): objective lens (31): optical fiber
(32) : 일루미네이터(illuminator) (33) : 투명창(window)(32): illuminator (33): transparent window
본 발명은 핵산의 혼성화 검출장치 및 핵산의 혼성화 검출방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 반응물질의 공급이 용이하고 간편한 저장용기와 펌프 및 발생된 빛의 측정에 효과적인 광측정장치를 포함하는 핵산검출장치, 및 이를 이용하여, 혼성화된 핵산에 특이적으로 결합하며 전이금속착물의 전기화학발광을 유도하는 인터컬레이터를 핵산과 전이금속착물에 반응시켜 발생하는 빛을 측정함으로써 핵산의 혼성화를 측정하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to an apparatus for detecting nucleic acid hybridization and a method for detecting hybridization of nucleic acid. More specifically, the present invention provides a nucleic acid detection device that includes an easy-to-supply and easy-to-use storage container, a pump, and an optical measuring device effective for measuring generated light, and specifically, a hybridized nucleic acid using the same. The present invention relates to a method for measuring hybridization of nucleic acids by measuring light generated by reacting an intercalator that binds to and induces electrochemiluminescence of a transition metal complex.
본 발명에서 검출하고자 하는 핵산은 올리고뉴클레오타이드(oligo- nucleotide), DNA, RNA, PNA, cDNA 등을 총칭한다.Nucleic acid to be detected in the present invention are oligonucleotide, DNA, RNA, PNA, cDNA and the like generically.
본 발명에 따른 핵산 혼성화 측정방법은 핵산어레이(nucleic acid array), 핵산센서(nucleic acid sensor), 핵산칩(nucleic acid chip) 등을 포함하는 핵산검출장치 상에서의 핵산 혼성화 검출방법에 응용할 수 있다. 상기 핵산검출장치는 좁은 기판 위에 매우 다양한 염기서열을 가지는 핵산단편을 고밀도로 배열시킨 것으로, 여기에 고정화된 핵산(탐침핵산)과 이에 대하여 상보적인 염기서열을 갖는 미지의 시료에 있는 타겟핵산을 혼성화시킴으로써, 미지의 시료 내의 핵산에 대한 정보를 알아내는데 사용되는 장치를 의미한다.The nucleic acid hybridization measuring method according to the present invention can be applied to a nucleic acid hybridization detection method on a nucleic acid detection apparatus including a nucleic acid array, a nucleic acid sensor, a nucleic acid chip, and the like. The nucleic acid detection device is a high density array of nucleic acid fragments having a wide variety of base sequences on a narrow substrate, and hybridizes the nucleic acid immobilized thereon and the target nucleic acid in an unknown sample having a complementary base sequence thereto. By means of a device used to find out information about a nucleic acid in an unknown sample.
본 발명의 핵산검출장치는 본 발명에 사용되는 반응물질, 즉 버퍼, 전이금속착물, 타겟핵산 및 인터컬레이터를 저장하는 용기와 이를 탐침핵산이 고정된 핵산칩에 공급하는 정밀 펌프를 포함하고 있어 간편하며, 발생하는 빛을 효과적으로 측정할 수 있도록 볼록렌즈, 광섬유, PMT(Photomultiplier Tube) 등을 포함하는 것을 특징으로 한다.The nucleic acid detection apparatus of the present invention includes a container for storing the reactants used in the present invention, that is, a buffer, a transition metal complex, a target nucleic acid and an intercalator, and a precision pump for supplying the nucleic acid chip to which the probe nucleic acid is fixed. It is simple and includes a convex lens, an optical fiber, and a photomultiplier tube (PMT) to effectively measure the generated light.
본 발명에 따른 검출방법에 사용되는 인터컬레이터는 상기 핵산검출장치에 고정화된 탐침핵산과 시료 내의 타겟핵산 간의 혼성화 반응으로 형성되는 이중나선 핵산에 특이적으로 결합하며, 전이금속착물의 산화-환원반응을 유도하여 전기화학발광이 나타나도록 하는 것을 특징으로 한다.The intercalator used in the detection method according to the present invention specifically binds to a double-stranded nucleic acid formed by a hybridization reaction between a probe nucleic acid immobilized on the nucleic acid detection device and a target nucleic acid in a sample, and the oxidation-reduction of a transition metal complex. It is characterized in that the electrochemical emission is induced by inducing a reaction.
본 발명은 특이적으로 핵산의 이중나선 상태에만 결합하는 인터컬레이터 중에서 전이금속착물의 산화-환원 반응을 유도하여 전기화학발광을 유발하는 인터컬레이터를 선택 ·사용하는 핵산검출장치상의 핵산 혼성화를 검출에 관한 것으로, 반응물질을 간편하게 공급할 수 있는 저장용기와 펌프 및 전기화학발광을 효과적으로 측정할 수 있는 장치를 포함하는 저렴하고 간단한 휴대용 핵산검출장치 및 이를 이용하여 특별한 표지작업이 필요 없고 신속하게 핵산의 혼성화 결과를 측정할 수 있는 방법을 제공한다.The present invention specifically relates to nucleic acid hybridization on a nucleic acid detection device that selects and uses an intercalator that induces an electrochemical emission by inducing an oxidation-reduction reaction of a transition metal complex among intercalators that bind only to a double-helix state of a nucleic acid. The present invention relates to a simple and inexpensive portable nucleic acid detection device including a storage container for easily supplying a reactant, a pump, and a device capable of effectively measuring electrochemical luminescence, and a nucleic acid that does not require special labeling and can be used quickly. It provides a method to measure the hybridization result of.
우선, 본 발명의 핵산검출장치는First, the nucleic acid detection apparatus of the present invention
1) 탐침핵산이 고정화된 핵산칩,1) nucleic acid chip to which probe nucleic acid is immobilized,
2) 전이금속착물, 버퍼용액, 타겟핵산, 인터컬레이터 등의 용액을 효율적으로 공급하기 위한 저장용기와 정밀펌프,2) Storage vessels and precision pumps for efficiently supplying transition metal complexes, buffer solutions, target nucleic acids, intercalators, etc .;
3) 기준전극 대비 일정한 전압을 인가하여 주는 핵산칩의 전극연결부분과 전기공급 장치부분, 및3) an electrode connection portion and an electricity supply device portion of the nucleic acid chip applying a constant voltage to the reference electrode, and
4) 인터컬레이터와 전이금속착물의 전기화학발광반응을 측정하는 광측정장치 부분을 포함하여 구성된다. 또한, 본 발명에 따른 핵산검출장치는 핵산칩의 x축과 y축의 위치를 제어하기 위한 위치제어장치를 추가적으로 포함할 수 있다.And 4) an optical measuring device portion for measuring the electrochemiluminescence reaction of the intercalator and transition metal complex. In addition, the nucleic acid detection apparatus according to the present invention may further include a position control device for controlling the position of the x-axis and y-axis of the nucleic acid chip.
또한, 본 발명에 따른 측정방법은, 상기의 핵산검출장치를 사용하여,In addition, the measuring method according to the present invention, using the nucleic acid detection device,
(1) 반응용기에서 티올작용기를 5'-포스페이트 위치에 가지고 있는 탐침핵산을 핵산칩의 전극 표면에 고정화시키는 단계,(1) immobilizing a probe nucleic acid having a thiol functional group at a 5'-phosphate position in a reaction vessel on an electrode surface of a nucleic acid chip;
(2) 핵산칩에 멀티어레이 전극을 설치하고 버퍼용액을 공급해주면서 탐침핵산이 고정화된 전극 표면을 세척하는 단계,(2) installing a multi-array electrode on the nucleic acid chip and supplying a buffer solution to clean the electrode surface to which the probe nucleic acid is immobilized;
(3) 타겟핵산용액을 공급하면서 상기 탐침핵산과 혼성화시키는 단계,(3) hybridizing with the probe nucleic acid while supplying a target nucleic acid solution,
(4) 이를 버퍼용액으로 세척한 후, 인터컬레이터 용액을 공급하면서 상기 혼성화된 이중나선 핵산에 인터컬레이터를 결합시키는 단계,(4) washing it with a buffer solution, and then binding the intercalator to the hybridized double-stranded nucleic acid while supplying an intercalator solution,
(5) 이를 버퍼용액으로 세척하여 결합하지 않은 인터컬레이터를 제거하는 단계,(5) washing it with a buffer solution to remove unbound intercalators;
(6) 여기에 전이금속착물 유도체 용액을 공급하고, 전원공급장치로 전압을 인가함으로써, 상기 인터컬레이터가 전이금속착물의 산화-환원반응을 유도하여 전기화학발광이 나타나게 하는 단계, 및(6) supplying a transition metal complex derivative solution thereto and applying a voltage to a power supply device, wherein the intercalator induces an oxidation-reduction reaction of the transition metal complex so that electrochemical luminescence appears, and
(7) 이 때 발생하는 빛을 측정하는 단계를 포함하여 이루어진다(7) including measuring the light generated at this time
이 때, 상기 버퍼용액, 타겟핵산 용액, 인터컬레이터 용액, 전이금속착물 용액은 각각의 저장용기와 핵산칩의 용액주입구에 연결된 정밀펌프를 통하여 공급된다. 상기 버퍼용액으로 인산버퍼(phosphate buffer saline), 5X SSC 버퍼 또는 1XSSC 버퍼용액을 사용한다. 상기 전기화학장치는 핵산칩 위에 미세 패턴된 금을 지시전극 및 대전극으로, Ag/AgCl을 기준전극으로 하여 삼전극계를 구성하여 사용한다. 여기에 기준전극과 지시전극 간의 전압을 인가해 주는 장치로 +1.19 V의 전압을 걸어주어 루테늄 유도체와 인터컬레이터의 산화-환원반응을 유도하고, 이 때 발생하는 빛을 측정한다. 전기화학발광으로 발생하는 빛의 측정 시, 전압를 걸어주고 200 ~ 300 초 후 안정화 되었을 때 나타나는 빛을 광측정장치로 검출하고, 검출된 빛을 PC에 전달하여 시간에 대한 광량변화로 자료를 분석한다. 광측정장치 부분은 암실상자(dark box) 안에서 포토카운터(photo-counter) 검출기를 사용하여 전이금속이 나타내는 빛의 변화량을 디지털 신호로 변환시켜서 PC에서 시간에 대한 발광량을 그래프로 표시하고 자료를 저장하는 역할을 한다. 상기 반응은 반응온도 20 ~ 25 ℃, 반응 pH 7.0 ~ 7.5 에서 수행한다.At this time, the buffer solution, the target nucleic acid solution, the intercalator solution, the transition metal complex solution are supplied through a precision pump connected to each storage container and the solution inlet of the nucleic acid chip. Phosphate buffer (phosphate buffer saline), 5X SSC buffer or 1XSSC buffer solution is used as the buffer solution. The electrochemical apparatus uses a three-electrode system using finely patterned gold on a nucleic acid chip as an indicator electrode and a counter electrode, and Ag / AgCl as a reference electrode. In addition, a device that applies a voltage between the reference electrode and the indicator electrode induces a redox reaction between the ruthenium derivative and the intercalator by applying a voltage of +1.19 V and measures the light generated at this time. When measuring light generated by electrochemical emission, apply voltage and detect light that stabilizes after 200 ~ 300 seconds by using optical measuring device, and transmit the detected light to PC and analyze data by light quantity change over time. . The optical measuring unit uses a photo-counter detector in a dark box to convert the amount of light represented by the transition metal into a digital signal, displaying the amount of light over time on a PC and storing the data. It plays a role. The reaction is carried out at a reaction temperature of 20 to 25 ℃, reaction pH 7.0 ~ 7.5.
이를 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.This will be described in more detail as follows.
도 1a 내지 도 1d에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 핵산칩은 멀티어레이칩(1), 대전극(2), 지시전극(3), 기준전극(4), 전극연결부(5) 및 덮개(6)을 포함하여 구성된다. 지시 전극표면(3)은 금(gold) 박막을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 전극기판은 PCB(printed circuit board)에 전자빔을 이용한 진공증착법으로 티타늄층을 약 100Å 두께로 증착시키고, 그 위에 금을 400 ~ 500Å 두께로 코팅한 것을 사용하는 것이 바람직하다. 전극패턴 외의 부분은 폴리아미드로 처리하여 절연시킨다. 도 1에서 알수 있는 바와 같이, 완성된 핵산칩은 전극패턴의 PCB 기판이 용액배출구(7)와 용액배출구(9)를 포함하는 덮개와 결합되어 있어서, 유체의 흐름을 이용한 측정이 가능한 형태로 구성되어 있다. 덮개에서 전극표면에 해당되는 위치에는 볼록렌즈(8)를 장착하여 발광되는 빛을 효과적으로 광섬유(optica fiber)에 전달될 수 있도록 한다. 이 때, 볼록렌즈와 전극표면 사이에는 일정한 간격을 유지하여 용액주입구(7)에 유입된 용액의 이용을 용이하게 한다. 상기 핵산칩은 용액을 흘려주는 형태를 하고 있어 버퍼용액, 타겟핵산용액, 인터컬레이터 용액, 전이금속착물 유도체 용액 등을 순차적으로 처리하며 측정이 가능하다. 이 때, 탐침핵산은 자기조립 단분자층(self assembled monolayer : SAM)을 형성하여 미세패턴으로 제작된 핵산칩 상의 전극표면(3)에 고정화된다. 상기 전극표면에 탐침핵산의 SAM를 형성하기 전에, 전극을 피라나(Piranha, H2SO4:H2O2=2:1) 용액에 수 초간 담가 세척한 후, 최종적으로 물로 세척한다. 피라나 용액은 강한 산성 물질로 취급에 주의가 필요하다. 전극표면에 탐침핵산의 SAM을 형성시키기 위하여, 반응용기에서 상기 핵산칩을 5'-포스페이트 위치에 티올작용기를 갖는 탐침핵산으로 처리한 후 세척하고, 메캅토에탄올(mercaptoethanol)로 처리한 후, 에탄올과 물로 순차적으로 세척하여 핵산칩의 제작을 완료한다.As can be seen in Figure 1a to 1d, the nucleic acid chip of the present invention is a multi-array chip (1), counter electrode (2), indicator electrode (3), reference electrode (4), electrode connecting portion (5) and cover It is comprised including (6). As the indicator electrode surface 3, a gold thin film is preferably used. In addition, the electrode substrate is preferably deposited by using a vacuum vapor deposition method using an electron beam on a printed circuit board (PCB) to deposit a titanium layer of about 100 kW thick, and coated with a gold 400 ~ 500 kW thick thereon. Portions other than the electrode pattern are treated with polyamide and insulated. As can be seen in Figure 1, the completed nucleic acid chip is a PCB substrate of the electrode pattern is combined with a cover including a solution outlet (7) and the solution outlet (9), it is configured in a form that can be measured using the flow of fluid It is. The convex lens 8 is mounted at a position corresponding to the surface of the electrode in the cover so that the emitted light can be effectively transmitted to the optical fiber. At this time, a constant gap is maintained between the convex lens and the electrode surface to facilitate the use of the solution introduced into the solution inlet 7. The nucleic acid chip has a form in which a solution flows, so that a buffer solution, a target nucleic acid solution, an intercalator solution, a transition metal complex derivative solution, etc. may be sequentially processed and measured. At this time, the probe nucleic acid is immobilized on the electrode surface 3 on the nucleic acid chip formed in a fine pattern by forming a self assembled monolayer (SAM). Before forming the SAM of the probe nucleic acid on the electrode surface, the electrode is immersed in a solution of Piranha (Piranha, H 2 SO 4 : H 2 O 2 = 2: 1) for several seconds, and finally washed with water. Pirana solution is strongly acidic and must be handled with care. In order to form a SAM of probe nucleic acid on the electrode surface, the nucleic acid chip was treated with a probe nucleic acid having a thiol functional group at a 5'-phosphate position in a reaction vessel, washed, treated with mercaptoethanol, and then ethanol. And sequentially washed with water to complete the production of nucleic acid chips.
도 2는 인터컬레이터에 의한 전기화학발광의 원리를 나타낸 것이다. 인터컬레이터가 결합된 상태에서 전극(2) 상에 인가전압을 걸어주면 용액 속의 Ru(byp)3 2+이 산화되어 Ru(byp)3 3+유도체가 되고, 이는 인터컬레이터에 의하여 여기상태의 Ru(byp)3 2+*유도체가 되며, 이 유도체가 기저상태인 Ru(byp)3 2+로 되돌아올 때 약620 nm의 붉은색 빛을 발생하게 된다. 이 때 발생하는 빛을 광측정장치로 검출한다.2 shows the principle of electrochemiluminescence by an intercalator. When an applied voltage is applied on the electrode 2 while the intercalator is coupled, Ru (byp) 3 2+ in the solution is oxidized to become Ru (byp) 3 3+ derivative, which is excited by the intercalator. Ru (byp) 3 2 + * derivative of, and when the derivative is returned to the ru (byp) 3 2+ ground state, it generates a red light of about 620 nm. The light generated at this time is detected by an optical measuring device.
도 3은 상기 제작한 핵산칩에 고정된 탐침핵산(10)에 타겟핵산(13)을 투입하여 혼성화시키고, 상기 혼성화된 이중나선 핵산(14)에 인터컬레이터(15)를 결합시켜 전이금속착물 유도체(11)의 전기화학발광을 유도하는 과정을 보여준다. 여기서, 탐침핵산과 타겟핵산의 상보적인 염기서열 간 결합에 의하여 혼성화되며, 비상보적인 핵산들은 결합하지 않는다. 이 때, 전극의 양극(+)에 전압을 걸어주면 음전하를 띤 타겟핵산은 전극으로 보다 빠르게 이동하여 탐침핵산과의 결합, 즉 혼성화 반응이 빠르게 진행된다. 핵산 혼성화 과정이 끝난 후, 전극에 음극(-)에 전압을 인가하고 세척하여 반응하지 않은 탐침핵산의 제거가 용이하도록 한다. 이와 같이 혼성화 된 핵산에 인터컬레이터가 결합한다(16). 인터컬레이터는 혼성화된 이중나선 핵산에만 결합하며, 주로 이중나선 핵산의 마이너그루브(minor groove) 또는 메이저그루브(major groove)의 염기쌍 사이에 결합한다. 상기 인터컬레이터로 쓰이는 물질로는 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신 하이드로클로라이드(daunorubicin hydrochloride), 노갈라마이신(nogalamycin), 미토산트론, DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole), 스트렙토마이신 설페이트(streptomycin sulfate), 젠타마이신 설페이트(gentamycin sulfate), 훽스트(hoechst 33258), 퀴나크린(Quinacrine), 아크리딘오렌지(Acridin Orange) 등이 있다. 또한, 프롤린(proline), 옥살산(oxalic acid) 등은 핵산 및 단백질과 결합(conjugate) 가능한 유도체를 합성하여 전기화학발광에 사용될 수 있다. 즉, 이중나선 핵산에는 인터컬레이팅이 잘 되지만, 전기화학발광을 나타내지 않는 인터컬레이터와 프롤린, 옥살산 등을 결합시킴으로써, 전기화학발광이 나타나는 새로운 인터컬레이터 유도체를 합성할 수 있는 것이다. 상기 전이금속착물 유도체로서 트리스(2,2'-바이피리딜) 루테늄 이가이온 [Ru(byp)3 2+], 트리스(1,1'-페난스롤라인) 루테늄 이가이온 [Ru(phen)3 2+] 또는 루테늄 유도체의 합성물질인 루테늄-NHS에스테르 [Ru(byp)3 2+-NHS ester]를 사용할 수 있다. 본 발명은 인터컬레이터를 사용하여 핵산의 혼성화를 검출하는 방법에 관한 것으로, 인터컬레이터를 사용하지 않은 전이금속착물에 의한 전기화학발광은 측정대상에서 제외된다.3 is hybridized by inserting the target nucleic acid 13 into the probe nucleic acid (10) fixed to the prepared nucleic acid chip, the intercalator (15) is coupled to the hybridized double-stranded nucleic acid (14) transition metal complex It shows the process of inducing electrochemiluminescence of the derivative (11). Here, hybridization is performed by binding between the complementary nucleotide sequences of the probe nucleic acid and the target nucleic acid, and the non-complementary nucleic acids do not bind. At this time, when a voltage is applied to the positive electrode (+) of the electrode, the negatively charged target nucleic acid moves faster to the electrode, thereby rapidly coupling to the probe nucleic acid, that is, hybridization reaction. After the nucleic acid hybridization process is completed, a voltage is applied to the negative electrode (-) and washed to facilitate removal of unreacted probe nucleic acid. The intercalator binds to the hybridized nucleic acid as described above (16). Intercalators bind only to hybridized double-stranded nucleic acids, mainly between base grooves of minor grooves or major grooves of double-stranded nucleic acids. As the intercalator, doxorubicin, daunorubicin hydrochloride, nogalamycin, mitosantron, DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole), strepto Streptomycin sulfate, gentamycin sulfate, hoechst 33258, quinacrine, acridin orange, and the like. In addition, proline, oxalic acid, and the like may be used for electrochemical light emission by synthesizing derivatives conjugated with nucleic acids and proteins. In other words, the double-stranded nucleic acid is well intercalated, but by combining an intercalator that does not exhibit electrochemiluminescence with proline, oxalic acid, and the like, a new intercalator derivative exhibiting electrochemiluminescence can be synthesized. As the transition metal complex derivative, tris (2,2'-bipyridyl) ruthenium divalent ion [Ru (byp) 3 2+ ], tris (1,1'-phenanthroline) ruthenium divalent ion [Ru (phen) 3 2+ ] or ruthenium-NHS ester [Ru (byp) 3 2+ -NHS ester] which is a synthetic material of ruthenium derivative can be used. The present invention relates to a method for detecting hybridization of nucleic acids using an intercalator, and electrochemiluminescence by transition metal complexes without an intercalator is excluded from the measurement object.
도 4는 유체의 흐름을 이용하여 원하는 핵산검출장치를 제작하고 동시에 측정하는 장치 및 방법을 보여준다. 버퍼용액 저장용기(18), 전이금속착물 유도체 용액 저장용기(19), 타겟핵산용액 저장용기(20) 및 인터컬레이터용액 저장용기(21)가 정밀펌프(22)와 연결되어 있으며, 여기서 용액주입구(7)로 주입된다. 상기한 바와 같이, 탐침핵산은 지시전극(3)인 금 표면에 고정화되어 있다. 측정하고자 하는 양을 배열하여 분석용 핵산칩을 제작한다. 핵산칩은 탐침핵산을 고정화시키고 인가전압을 가할 수 있도록, 상기 멀티어레이 전극의 한 부분을 Ag/AgCl로 처리할 수 있으며, 특히, 미세 패턴으로 제작된 금을 지시전극 및 대전극으로 사용하고, Ag/AgCl을 기준전극으로 사용할 수 있다. 또한, 전압을 인가하기 위하여 포텐시오스텟(potentiostat)을 설치할 수 있다.4 shows an apparatus and method for fabricating and simultaneously measuring a desired nucleic acid detection device using a fluid flow. The buffer solution reservoir 18, the transition metal complex derivative solution reservoir 19, the target nucleic acid solution reservoir 20 and the intercalator solution reservoir 21 are connected to the precision pump 22, where the solution It is injected into the inlet (7). As described above, the probe nucleic acid is immobilized on the gold surface of the indicator electrode 3. Arrange nucleic acid chips for analysis by arranging the amount to be measured. The nucleic acid chip can treat a portion of the multi-array electrode with Ag / AgCl to immobilize the probe nucleic acid and apply an applied voltage, and in particular, using a fine patterned gold as the indicator electrode and the counter electrode, Ag / AgCl may be used as the reference electrode. In addition, a potentiostat may be installed to apply a voltage.
기준전극의 제작과정은 다음과 같다. 기준전극 부위에 은(Ag) 페이스트를 코팅하고, 소결한 후, 100 mM FeCl3 용액으로 1분 간 처리하고, 증류수로 여분의 FeCl3 용액을 씻어내면 Ag/Agcl 기준전극이 완성된다.The manufacturing process of the reference electrode is as follows. The silver (Ag) paste is coated on the reference electrode, sintered, treated with 100 mM FeCl 3 solution for 1 minute, and the excess FeCl 3 solution is washed with distilled water to complete the Ag / Agcl reference electrode.
전기화학발광 측정은 다음과 같은 방법으로 실시한다. 각종 시료용액 및 버퍼용액은 정밀펌프(22)와 여기에 연결된 용액주입구(7)를 통하여 핵산검출장치로 공급된다. 상기 전기화학발광은 탐침핵산과의 혼성화를 위한 타겟핵산을 주입, 인터컬레이터 주입, 세척과정 및 전이금속착물 유도체 주입과정을 거쳐 측정된다. 전압은 +1.19 V로 하여 인가하며, 이 때, 전기화학발광으로 인하여 약 620 nm의 빛을 방출되고, 이를 광측정장치(24)를 통하여 측정하게 된다. 광측정장치로서는 포토멀티플라이어튜브(Photomultiplier Tube: PMT), 아바란체 포토다이오드(Avalanche photodiode) 등의 증폭 증력을 가진 광검출기를 사용할 수 있으며, 냉각 CCD 카메라(cooled CCD camera) 등도 추가적으로 사용가능하다. 분석이 끝난 시료들은 폐기용 용기(23)을 통하여 버려진다. 이 때, 정밀하게 x축과 y축을 제어 가능한 위치제어장치(26)를 사용하여 멀티어레이 전극을 이동시킴으로써, 핵산칩에서 발생하는 빛을 광섬유(25)에 통과시켜 검출하도록 한다. 멀티어레이 전극 위에 설치된 개의 포토다이오드(photodiode)를 이용하여, 핵산칩 위에 설치된 볼록렌즈(8)를 통과한 각각의 전극에서 발생한 빛을 측정하여 신호를 처리할 수 있다.The electrochemiluminescence measurement is performed in the following manner. Various sample solutions and buffer solutions are supplied to the nucleic acid detection device through the precision pump 22 and the solution inlet 7 connected thereto. The electrochemiluminescence is measured through injection of a target nucleic acid for hybridization with the probe nucleic acid, injection of an intercalator, washing, and injection of a transition metal complex derivative. The voltage is applied at +1.19 V, and at this time, light of about 620 nm is emitted due to electrochemical emission, which is measured by the optical measuring device 24. As the optical measuring device, a photodetector having an amplifying power such as a photomultiplier tube (PMT) and an avalanche photodiode can be used, and a cooled CCD camera can be additionally used. . The analyzed samples are discarded through the waste container 23. At this time, the multi-array electrode is moved using the position control device 26 capable of precisely controlling the x-axis and the y-axis so that light generated from the nucleic acid chip passes through the optical fiber 25 to be detected. By using photodiodes provided on the multiarray electrodes, light generated from each electrode passing through the convex lens 8 provided on the nucleic acid chip can be measured to process a signal.
도 5는 PMT와 CCD 카메라를 이용한 전기화학발광 측정장치를 나타낸 것이다. 광측정장치로서 CCD 카메라와 PMT를 설치하고 대물렌즈(30)을 통하여 핵산칩에서 발생하는 빛을 측정 할 수 있으며, 이 때, CCD 카메라(28)는 멀티어레이 전극에서얻은 영상을 분석함으로써 핵산칩의 위치를 효과적으로 제어하는데 사용된다. PMT를 이용하여 전기화학발광을 측정할 때에는 반사거울(27)의 위치를 변환시키면서 핵산칩에서 나타나는 빛을 검출할 수 있으며, CCD 카메라를 이용할 때에는 일루미네이터(32)에서 나오는 빛을 광섬유(31)로 유도하여 핵산칩 위에 비추어 영상을 얻을 수 있다. 핵산칩에 있는 투명창(33)은 대물렌즈가 설치된 측정장치에 효과적으로 빛을 전달하는 역할을 한다.Figure 5 shows an electrochemiluminescence measuring device using a PMT and a CCD camera. As an optical measuring device, a CCD camera and a PMT are installed, and light generated from the nucleic acid chip can be measured through the objective lens 30. At this time, the CCD camera 28 analyzes the image obtained from the multi-array electrode. It is used to effectively control the position of. When measuring electrochemical light emission using PMT, it is possible to detect the light appearing from the nucleic acid chip while changing the position of the reflection mirror 27, and when using a CCD camera, the light emitted from the illuminator 32 is transferred to the optical fiber 31. Induction can be obtained in the light of the nucleic acid chip to obtain an image. The transparent window 33 in the nucleic acid chip serves to effectively transmit light to the measuring device in which the objective lens is installed.
본 발명의 기본개념은 탐침핵산과 타겟핵산이 결합된 이중나선구조 핵산에 인터컬레이터를 결합시키고, 상기 결합된 인터컬레이터가 전이금속착물 유도체의 산화-환원반응을 유도하여, 이 때 발생하는 빛을 측정하여 핵산의 혼성화 결과를 효과적으로 검출할 수 있는 방법을 제공하는데 있다. 이와 같이 인터컬레이터를 사용하는 전기화학발광법은 루테늄만 사용하여 측정하던 기존의 개념과 다른 새로운 핵산 혼성화 검출법을 제공한다.The basic concept of the present invention binds an intercalator to a double-stranded nucleic acid in which a probe nucleic acid and a target nucleic acid are combined, and the combined intercalator induces an oxidation-reduction reaction of a transition metal complex derivative. The present invention provides a method for effectively detecting the result of hybridization of nucleic acids by measuring light. As such, electrochemical luminescence using an intercalator provides a new method for detecting nucleic acid hybridization, which is different from the conventional concept measured using only ruthenium.
본 발명에서는 기존의 전기화학발광 방법과 비교하여, 핵산칩 설치 후, 용액을 흘려주면서 각 단계에서 나타나는 변화를 효과적으로 측정함으로써 발광측정 감도를 높이는 효과와 다중채널의 멀티어레이 전극을 효율적으로 이용하여 측정할 수 있는 장치를 제공한다.In the present invention, compared to the conventional electrochemical light emitting method, after the nucleic acid chip is installed, the effect of increasing the sensitivity of luminescence measurement by measuring the change appearing at each step while flowing the solution effectively by using the multi-channel multi-array electrode efficiently measured Provide a device that can.
본 발명의 핵산에 복잡한 표지과정을 거치지 않아 기존의 핵산 어레이 등에 사용되는 Cy3, Cy5 등의 형광물질을 탐침핵산 또는 타겟핵산 등의 표지반응과 비교하여 검출과정이 신속하며, 별도의 복잡한 공정을 필요치 않으므로 간단한 작업으로 검출할 수 있다. 게다가, 전이금속착물을 전기화학발광으로 측정함으로써 레이저 또는 램프 등의 외부 광원이 필요하지 않으며, 기타 광학 부품인 필터나 편광기 등이 필요하지 않다. 그러므로, 저가의 측정시스템이 가능하며, 간단한 구성이 가능하다. 또한 레이저 등의 광원을 사용하게 되면 노이즈 및 산란이 생기게 되는데, 본 발명은 이를 사용하지 않으므로 노이즈와 산란의 발생 없이 정확한 측정이 가능하다.Since the nucleic acid of the present invention does not undergo a complex labeling process, the fluorescent process such as Cy3 and Cy5 used in the existing nucleic acid array is compared with the labeling reaction of the probe nucleic acid or the target nucleic acid, and thus the detection process is quick and requires a separate complicated process. Therefore, it can be detected by a simple operation. In addition, by measuring the transition metal complex by electrochemiluminescence, no external light source such as a laser or a lamp is required, and other optical components such as a filter or a polarizer are not necessary. Therefore, a low cost measurement system is possible and a simple configuration is possible. In addition, when a light source such as a laser is used, noise and scattering are generated. However, the present invention does not use this, and thus accurate measurement can be performed without generating noise and scattering.
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