KR100428480B1 - 호박청주의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 호박청주의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 쌀을 증자하여 고두밥을 제조하는 단계와, 호박 껍질을 박피한 후 증자하여 호박증숙물을 얻고, 껍질을 박피하지 않고 증자한 후 착즙하여 호박추출물을 제조하는 단계와, 고두밥과 누룩, 효모, 호박증숙물과 호박추출물을 혼합한 후 발효시켜 호박탁주를 얻는 단계와, 호박탁주에 다시 고두밥과 누룩, 효모, 호박증숙물과 호박추출물을 사입한 후, 숙성시키고 여과하여 호박청주를 얻은 후, 살균하여 저장하는 단계로 구성된다.

본 발명은 발효중에 호박증숙물과 호박추출물을 1-3회 다단계적으로 사입함으로써 알콜함량이 좋고 맛과 품질이 우수한 호박청주를 제공한다. 또한 호박의 가공도를 높임으로써 농가의 소득증대에도 기여할 수 있다.

Description

호박청주의 제조방법{Manufacturing Method for Pumpkin Wine}

본 발명은 호박 껍질을 박피한 후 증자하여 얻은 호박증숙물과, 껍질을 박피하지 않고 증자한 후 착즙하여 얻은 호박추출물을 고두밥, 누룩, 효모와 함께 혼합한 후 발효시켜 호박술을 얻고, 호박술에 다시 고두밥과 누룩, 효모를 혼합하고 호박증숙물과 호박추출물을 사입한 후, 숙성시키고 여과하여 호박청주를 얻은 후, 살균 및 저장하는 호박청주의 제조방법에 관한 것이다.

호박은 열대 아메리카가 원산지인 작물로서 옛부터 우리나라 전국각처에서 널리 재배하고 있는 귀화식물로서 길이는 5m안팎이고 덩굴손으로 감으면서 자라지만 개량된 것은 덩굴성이 아닌 것도 있다. 6∼10월에 황색 꽃이 피고 9월부터 열매가 성숙되며 장과는 크고 많은 변종이 있으며 모양과 빛깔도 변종에 따라 다르고대개는 벽돌색으로 익으며 많은 종자가 들어있고 종자는 편평하고 맛은 고소하다. 호박 과육은 식용과 약용으로 쓰이고 성숙함에 따라 카로틴(Caroten)성분이 풍부해져 항암, 항산화, 지방 독성해독, 중풍 등에 효능이 있으며, 특히 민간에서는 산후부종과 이뇨작용, 신경통, 소염통증에 사용하는 등 영양과 기능성을 동시에 가지고 있어 건강식품으로 개발가치가 매우 크다.

또한 호박씨에는 아미노산의 일종인 쿠쿠르비틴이 0.5%정도 함유되어 있으며 그 밖에도 산성, 중성, 염기성 아미노산이 다량 들어있고, 비타민 B, C, E와 우레아제 효소가 함유되어 있으며, 기름이 34%정도의 함유되어 있다. 호박 기름의 주성분은 리놀산, 올레산, 팔미트산, 스테아르산의 글리세린 등이다. 호박씨 유제는 촌충을 죽이는 구충작용이 있으며 그 성분을 쿠쿠르비틴이라고 보고되어 있다.

호박 과육은 이뇨작용이 있으며 염화나트륨의 배설을 빠르게 하며 약한 설사작용이 있으므로 과육을 지나치게 많이 섭취하면 피부가 누런 색을 띠게 되는데 이것은 호박에 풍부한 카로티노이드가 체외로 배출되면서 피부 각질층의 기름을 물들이기 때문에 일어나는데 건강에 해로운 것은 아니다. 이러한 효과들을 이용하여 호박은 곤충이나 회충을 죽이기 위한 구충제로 임신부나 어린이들에게 쓰이며, 과육은 이뇨약으로 콩팥 염, 간질병 등에 쓰고, 약한 설사약으로 쓰이기도 한다. 또한 호박은 즙을 짜거나 죽을 만들어서 먹기도 한다.

한편 호박을 이용한 가공식품에 관한 종래기술로는 한국공개특허 1997-21278(효모에 의한 호박술의 제조방법), 한국공개특허 1990-469(호박술의 제조방법), 한국공개특허 1993-11838(호박농축물을 이용한 호박차 및 호박음료의 제조방법)이 있으나 본 발명과는 목적이 다른 것들이다.

본 발명은 호박술 발효중에 호박증숙물과 호박추출물을 1-3회 단계적으로 사입함으로써 알콜함량이 좋고 맛과 품질이 우수한 호박청주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 본 발명의 원료처리 공정도이다.

도 2는 본 발명의 호박청주 제조공정도이다.

본 발명의 하는 호박청주의 제조방법은 쌀을 세척하고 침지하여 증자시킨 쌀에 뜸을 드려 냉각하여 고두밥을 얻는 단계와,

호박 또는 호박과육을 증자한 후, 여과 및 농축과정을 거쳐 호박증숙물과 호박추출물을 얻는 단계와,

전기의 고두밥 43-44wt%, 누룩 6-7wt%, 효모 0.1-0.3wt% 및 호박추출물 또는 호박증숙물 45-50wt%를 혼합한 후 22-27℃에서 5-10일간 발효시켜 호박탁주를 제조하는 단계와,

전기의 호박탁주를 50메쉬 여과포로 여과한 여액에 고두밥 43-44wt%, 누룩 6-7wt%, 효모 0.1-0.3wt% 및 호박추출물 또는 호박증숙물 45-50wt%를 사입하고 18-22℃에서 7-10일간 숙성시킨 후, 여과하여 얻은 호박청주를 70-90℃에서 20-40분간 살균하는 단계를 포함한다.

상기에서 고두밥은 쌀을 물로 세척하고 11-15시간 이상 침지한 후, 재차 쌀을 세척하여 증자기에서 10-15분간 증자된 쌀의 상하부를 교반하여 위치를 바꾸어 균일하게 증자시킨 후, 증자된 쌀에 증기를 투입하지 않고 5-10분간 뜸을 드린 후, 10-20℃ 내외로 냉각하여 고두밥을 얻는다.

호박추출물은 호박 껍질을 박피한 후 5-6cm로 절단한 호박에 대하여 정제수를 5-6배 첨가하여 90∼100℃에서 2∼3시간 추출한 후 여과하여 70-90℃에서 서서히 농축한 호박추출물 얻고, 호박증숙물은 통호박을 깍뚝썰기한 호박에 대하여 정제수를 5-6배 첨가하여 100℃에서 2∼3시간 증자한 후 여과하여 얻은 과피가 포함된 호박증숙물을 얻는다.

본 발명에 사용된 호박은 강원도 화천군에서 재배되어 화천군농업기술센터에서 제공받은 것으로 사용 부위별로 정선하여 깨끗하게 세척, 건조하여 저장고에 보관한 것을 사용하였다.

호박의 일반성분을 분석하기 위하여 A.O.A.C.법에 따라 수분은 105℃ 건조에 의한 중량 감소율을 백분율로 표시하였고, 조 단백질은 캘달(Kjeldahl) 분해장치로 분해하여 질소 자동분석기로 정량하였고, 조 지방은 시료 2-3g을 원통 여지에 넣고 속시렛(Soxhlet) 추출기 내에서 15-18시간 에테르(Ether) 추출 후 건조 평량하였으며, 조 회분은 시료 10-20g을 도가니에 평취하여 500-600℃에서 5-10시간 작열 회화시켜 정량하였고, 조섬유는 조섬유 측정장치로 분석하여 그 결과를 다음의 표 1에 나타냈다.

표 1. 호박의 일반성분(단위: %)

구 분	수 분	회 분	조단백질	조섬유질	조지방
과 육	94.04	0.80	0.58	0.65	0.25
과피 포함	92.73	0.88	1.30	0.93	0.57

본 발명에서 사용한 호박 추출물의 수율을 알아 보기 위하여 증자한 후, 증류수와 에탄올로 추출하여 얻은 결과를 다음의 표 2에 나타냈다.

표 2. 호박 추출물 수율

시 료	추출용매	수율(%)	농도(mg/ml)
과 육	물	6.53	43.5
	에탄올	7.08	47.2
과피포함	물	9.02	59.8
	에탄올	8.16	54.4

본 발명은 쌀을 증기로 증자하여 냉각하여 얻은 고두밥과 누룩, 효모 및 호박증숙물 또는 호박추출물을 혼합한 후 상온에서 1주일간 발효시켜 호박술을 얻는다. 상기의 술에 다시 고두밥, 누룩, 효모 및 호박추출물 또는 호박증숙물을 사입하고 상온에서 1주일 이상 숙성시킨 후 여과기로 여과하여 얻은 호박청주를 고온에서 살균하여 저장하는 단계로 구성된다.

이하 본 발명을 다음의 실시예 및 시험예에 의하여 설명하고자 한다. 그러나이들이 본 발명의 권리범위를 한정하는 것은 아니다.

＜실시예 1＞; 1단사입

[고두밥 제조공정]

쌀을 물로 세척하고 10-15시간 이상 침지한 후, 재차 쌀을 세척하여 증자기에서 10-15분 증자한다. 증자된 쌀을 위 아래로 교반하여 고루 증자 되도록 자리를 바꾼 후, 증자된 쌀에 증기를 투입하지 않고 5-10분간 뜸을 드리고 즉시 10-20℃ 내외로 냉각한다.

[호박 증숙물과 호박 추출물 제조공정]

호박술에 이용되는 호박은 껍질을 박피한 후 5-6cm로 절단한 호박과육에 대하여 정제수를 6배 첨가하여 90∼100℃에서 2∼3시간 추출한 다음 여과하여 80℃에서 서서히 농축한 호박추출물과, 호박을 박피하지 않고 깍뚝썰기한 호박에 대하여 정제수를 6배 첨가하여 100℃에서 2∼3시간 증자한 후, 여과하여 호박과피가 포함된 호박증숙물을 얻어 사입수로 사용하였다.

[호박술 제조공정]

고두밥 43.7%, 누룩 6.2%, 효모 0.2% 및 호박추출물과 호박증숙물 49.9%를 혼합한 후 25℃에서 7일간 발효시키고 침전하여 호박술을 얻었다.

[호박청주 제조공정]

호박탁주를 50mesh로 여과한 후 여액에 호박술과 동일한 비율의 재료를 사입하고 20℃에서 7-10일간 숙성시킨 후 여과기로 여과하여 40v/wt%의 호박청주를 얻었다.

전기와 같이 제조된 호박청주를 80℃에서 30분간 살균하여 저장한다.

호박술 제조에 사용된 누룩은 한국효소(주)에서 생산되는 개량누룩을 사용하였고, 효모는 (주)비전바이오켐에서 판매하는 건조효모를 사용하였다.

＜실시예 2＞; 2단사입

실시예 1과 동일하게 고두밥, 누룩, 효모를 넣고 호박증숙물과 호박추출물을 혼합하여 7일동안 발효한 후 찌꺼기는 제거하고 여기에 호박탁주 재료동량을 2단사입 발효시켜 호박청주를 얻었다.

＜실시예 3＞; 3단사입

실시예 2와 동일하게 하고 호박증숙물과 호박추출물을 넣고 발효시작하여 7일경과후 여과하여 2단사입과 동량의 재료를 3단사입 발효시켜 호박탁주를 얻은 후 전기와 동일하게 발효하여 호박청주를 얻었다.

표 3. 호박증숙물 및 추출물의 사입시기에 따른 술의 품질 특성

사입시기	호박사입방 법	알콜함량	사입방법	관능검사
1차	호박증숙물 49.9% 첨가	18%	1단사입	보통(단맛)
	호박추출물 49.9% 첨가	16%	"	"
2차	호박증숙물 49.9% 첨가	14%	2단사입	양호
	호박추출물 49.9% 첨가	14%	"	양호
3차	호박증숙물 49.9% 첨가	16%	3단사입	보통(뒷맛불량)
	호박추출물 49.9% 첨가	15%	"	"

이상의 결과로부터 호박증숙물과 호박추출물을 2단 사입하는 것이 가장 좋으며 알콜함량이 청주에 가깝고 관능검사에서도 좋은 것으로 나타났다.

＜시험예 1＞: 호박청주의 품질특성

호박증숙물과 호박추출물을 별도로 2단사입하여 얻은 호박청주에 대하여 수분, pH, 탁도, 당도, 알콜 함량, 진균수, 수율을 측정하여 그 결과를 표 4에 나타냈다. 또한 색도와 잘 훈련된 관능검사요원 10명으로 하여금 색, 맛, 향기, 전반적인 기호도를 측정하여 표 5에 나타냈다.

표 4. 호박청주의 품질 특성

구 분	수분	pH	탁도	Brix	알코올함량(%)	진균수	수율(%)
호박증숙물첨가	87.6	5.5	0.47	16.4	15	음성	50
호박추출물첨가	82.3	5.6	0.39	18.4	16	"	55

* (65℃, 15분 가열)

표 5. 호박청주의 관능검사 결과

구 분	색 도 *	관능검사(1-5점)**
	L	a	b	색	맛	향기	전반적인기호도
호박증숙물첨가	86.5	-4.0	21.1	3.7	3.5	3.1	3.4
호박추출물첨가	87.3	-3.2	17.0	3.7	3.6	3.3	3.5

* : L, + white, - black, a : +Red, - Green, b :Yellow, -Blue

** : 1. 아주 나쁘다 2. 나쁘다 3. 보통이다 4. 좋다 5. 아주 좋다

상기의 제조방법으로 반복 실험을 통해 최종적으로 생산한 호박 술의 품질특성은 그 성상이 노란색을 띄고 있으며 알콜함량은 15% 내외이고, 살균으로 진균은 검출되지 않았으며 제품수율은 50% 내외 수준이었다.

＜시험예 2＞; 기능성 검정

기능성은 항암, 세포독성, 항 돌연변이, 혈당강하, 고혈압 저해, 간기능개선, 면역활성, 항산화, 항균 등을 검정하였다.

1) 항암 활성

(1) 세포 주 및 배지조성

본 실험에 이용된 세포주는 암세포로 인간 간암세포인 Hep3B (hepatocellular carcinoma, human), 인간 폐암세포인 A549(Lung carcinoma, human), 인간 유방암세포인 MCF7(brest adenocarcinoma, pleural effusion, human)을 사용하였고 시료 자체의 세포 독성을 알아 보기 위한 정상세포로는 인간 정상 간세포인 WRL68(Human embryo liver)을 사용하였다. 실험에 사용된 세포들 중 Hep3B, MCF7, WRL68 은 DMEM배지를 A549는 RPMI 1640배지에서 가열시켜 불활성화된 10% FBS(fetal bovin serum)으로 적응시켜 배양하였다.

(2) SRB 분석

SRB(sulforhodamine B)분석은 세포 단백질을 염색하여 세포의 증식이나 독성을 측정하는 방법으로 실험 대상 세포인 WRL68, Hep3B, MCF7(10% FBS, DMEM 배지)과 A549(10% FBS, RPMI 1640 배지)의 농도를 4∼5×10⁴cell/㎖으로 96 well plate의 각 well에 100㎕씩 첨가하여 24시간 동안 배양(37℃, 5% CO₂)한 후, 각각의 시료를 최종농도 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0㎎/㎖로 100㎕씩 첨가하여 48시간 배양하였다.

배양이 완료된 후에 상등액을 제거하고 차가운 10%(w/v) TCA(trichloroacetic acid) 100㎕를 가하여 4℃에서 1시간동안 방치한 후 증류수로 4∼5회 세척하여 TCA를 제거하고 실온에서 plate를 건조한 뒤 각 well에 1%(v/v) acetic acid에 녹인 0.4%(w/v) SRB용액을 100㎕씩 첨가하고 상온에서 30분 동안 염색시켰다.

결합되지 않은 SRB 염색액은 1% 초산으로 4∼5회 정도 세척, 건조시킨 후에 10mM Tris buffer 100㎕를 첨가하여 염색액을 녹여낸 후 540nm에서 흡광도(microplate reader를 이용)를 측정하였다.

표 6. 정상세포 독성 및 암 유발 관련 기능성

시료	용매	WRL68(정상간세포)
		0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
호박	과육	DH2O	4.62	8.144	10.64	11.96	14.30
		EtOH	+11.66	+4.22	3.33	13.44	18.22
	과피포함	DH2O	0.461	4.92	10.9	14.15	22.31
		EtOH	2.94	4.57	7.51	13.07	15.68
효과기준	50% 이하
검정방법	SRB assay

표 7. 간암세포(%/mg/ml)

시료	용매	Hep3B(인간간암세포)
		0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
호박	과육	DH2O	4.26	9.70	13.07	14.16	20.69
		EtOH	1.95	6.56	9.12	9.74	16.41
	과피포함	DH2O	17.82	20.96	22.98	25.56	32.74
		EtOH	9.24	23.89	32.58	34.85	48.79
효과기준	50% 이상
검정방법	SRB assay

표 8. 유방암세포(%/mg/ml)

시료	용매	MCF-7(인간유방암세포)
		0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
호박	과육	DH2O	3.71	7.26	12.36	16.87	18.65
		EtOH	1.79	4.16	9.68	10.26	13.25
	과피포함	DH2O	1.65	4.19	5.84	6.06	6.99
		EtOH	0.52	2.32	4.90	28.89	55.78
효과기준	50% 이상
검정방법	SRB assay

표 9. 폐암세포(%/mg/ml)

시료	용매	A549(인간폐암세포)
		0.2	0.4	0.629	380.8	1.0
호박	과육	DH2O	26	29	38	43	48
		EtOH	27	32	36	48	52
	과피포함	DH2O	23	29	32	38	47
		EtOH	29	39	44	53	70
효과기준	50% 이상
검정방법	SRB assay

2) 항 돌연변이원성

(1) Rec-assay

a) 균주 및 전처리

본 실험에 사용된 균주는 Franca Zani 박사(Italy)로부터 분양 받은Bacillus subtilisPB 1652 rec+(repair proficient)와 PB 1791 rec-(repairdeficient)이며 동결건조된 이 균주를 Clean bench에서 메스를 이용하여 nutrient agar를 고화 시킨 petri-dish에 접종시킨 후 24∼48시간 배양을 하였다. 배양이 완료되면 멸균된 TSB 액체 배지에 1백금이 취하여 37℃에서 24시간 배양하여 실험에 사용하였다.

b) Spore agar plate 조제 및 실험 방법

배양이 완료된 0.1㎖ spore 액이 첨가된 soft broth agar 10㎖를 petri -dish에 분주하여 고화시킨 후 paper disc를 올려놓고 각 추출물은 20㎕씩, 대조구인 MNNG는 10㎕ 접종하고 37℃에서 12∼24시간 배양한 후 Inhibition zone을 측정하였다.

c) 돌연변이원성 측정

무균 상태인 clean-bench하에서 여러 돌연변이원성 물질 중 강한 돌연변이원 물질인 MNNG(2㎍/㎕)를 돌연변이원성(DNA-damaging activity) 대조구로 하여 20㎍/paper disc의 양으로 멸균 처리된 paper disc에 첨가하였고 각 추출물을 4∼100㎍/paper disc가 되도록 첨가하고 rec(+)균과 rec(-)균에 의해 형성된 Inhibition zone(㎝)의 차이로 돌연 변이원성을 측정하였다.

표 10. DNA-손상으로 인한 돌연변이 유발

시료	amount test(㎍/disk)	Inhibition halodiameter	DNA-damaging activity(rec-/rec+)
		rec+		rec-
호박	과육	DH2O	50	0.8	0.8	1
			10	0.8	0.8	1
		EtOH	50	0.8	0.8	1
			100	0.8	0.8	1
	과피포함	DH2O	50	0.8	0.8	1
			100	0.8	0.8	1
		EtOH	50	0.8	0.8	1
			100	0.8	0.8	1
MNNG	20	1.23	3.02	2.45
안정성 및 효과기준	1 이하
검정방법	Rec assay

d) 항돌연변이원성 측정

돌연변이원성을 확인한 후에 MNNG(10㎍/p.disc)와 추출물(50, 100㎍/p.disc)을 1 : 1 (10㎕:10㎕)로 혼합하여 돌연변이원성 측정과 같은 방법으로 배양한 후 각기 형성된 Inhibition zone을 비교하여 각 추출물이 돌연변이원 물질인 MNNG의 돌연변이원성을 어느 정도 억제하는가를 rec(+)균과 rec(-)균의 difference zone(㎝)과 difference ratio (sample + MNNG / MNNG)로 나타내었다. 대조구는 MNNG만 처리한 것으로 하였다.

표 11. 항돌연변이원성

시료	amounttest(㎍/disk)	Inhibition halodiameter(cm)	differnce zone(cm)	differnce ratio(sample/MNNG)
		rec+			rec-
산사	잎	DH2O	50	1.1	2.5	1.4	0.83
			100	1.0	2.4	1.4	0.83
		EtOH	50	0.9	2.5	1.6	0.95
			100	0.8	2.4	1.5	0.89
	열매	DH2O	50	0.9	2.5	1.6	0.95
			100	0.8	2.4	1.6	0.95
		EtOH	50	1.2	2.4	1.2	0.71
			100	1.0	2.2	1.2	0.71
MNNG	10	1.25	2.72	1.67	1
효과기준	0.55 이상
검정방법	Rec assay

3) 혈당 강하 기능 측정

생체 내에서 혈당 상승의 결정적인 역할을 하는 α-glucosidase를 이용하여 실험을 수행하였다. 먼저 효소를 10mM PIPES buffer에 용해시켜 효소액을 제조하고 20mM maltose와 각 추출물을 각각 10㎕, 40㎕, 10㎕를 혼합하여 최종 부피를 60㎕로 각 추출물을 농도별로 혼합한 후 37℃에서 20분간 배양한다. 반응액 60㎕에 1㎖ DNS 시약을 첨가하고 100℃ 물에서 열탕 처리(10min)하여 반응을 정지시킨 후에 540nm에서 흡광도를 측정하여 효소 반응으로 생성된 환원당을 정량하여 각 추출물을 처리하지 않은 대조구와 비교하여 효소활성 저해율을 계산하였다.

표 12. α-glucosidase(혈당강하) 효과(%/mg/ml)

시료	용매	농도
		0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
호박	과육	DH2O	14	19	21	25	29
		EtOH	16	18	23	31	36
	과피포함	DH2O	15	16	24	27	29
		EtOH	17	19	28	34	35
효과기준	50% 이상
검정방법	α-glucosidase 효소 활성억제

4) 고혈압 저해능 측정

ACE(angiotensin converting enzyme)는 고혈압을 유도하는 효소이므로 이 효소의 억제 활성을 측정하기 위해 ACE reagent를 사용했다. 실험 전에 모든 반응물을 37℃로 유지시켜 놓은 후 37℃ 증류수 10㎖에 ACE reagent one vial을 용해시키고 1㎖씩 취하여 effendorf tube에 넣었다. 각 effendorf tube 에 농도별 추출물과 ACE calibrator를 100㎕씩 첨가한 후 37℃에서 5분간 반응시켜 340nm에서 흡광도를 측정하여 이것을 초기 A 값으로 정하고 다시 5분이 지난 후 측정한 흡광도를 최종 A라 정하였다. 대조구로는 추출물 대신 증류수 100㎕를 첨가한 것으로 하였다.

Control의 ACE(U/L) 값은 아무 것도 첨가하지 않았을 때의 흡광도 변화를 측정한 것으로 하였으며 ACE의 활성 계산은 다음 공식에 준하여 산출하였다.

ACE (U/L) = (Initial A - Final A)_test/ (Initial A - Final A)_control× active of ACE reagent (50U/L)

표 13. 고혈압 조절능(ACE)(%/mg/ml)

시료	용매	농도
		0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
호박	과육	DH2O	16	17	21	26	29
		EtOH	15	19	25	32	37
	과피포함	DH2O	15	16	19	21	26
		EtOH	17	21	24	30	33
효과기준	50% 이상
검정방법	ACE system

5) 간 기능 개선 활성 측정

(1) 해독작용 - Glutathione S-transferase 측정

시료의 해독작용 정도를 측정하기 위하여 간의 중요 해독기전 중의 하나인 GST(gultathion-S-transferase)의 활성을 측정하였다. 조제된 반응시약에 대조구로 추출물이 제외된 반응액을 대조구로 하였으며, 각 추출물을 농도별로 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시킨 다음 기질로서 1-chloro-2,4dinitro benzene을 첨가한 후 다시 37℃에서 2분간 반응시켰다. 반응후 20% TCA를 가하여 반응을 종결시키고 원심분리한 후 상등액을 340nm에서 흡광도를 측정한 뒤 다음과 같이 GST의 specific activity와 활성율을 계산하였다.

Total activity (units) = (A₃₄₀/ 9.6) × 희석배수 × (3ml / 0.1) × crude extract(㎖)

Specific activity ( units/㎖ protein ) = total activity / total protein

활성율 (%) = specific activity_test/ specific activity_control× 100

표 14. 간해독능력: Glutathione S transferase 활성능(%/mg/ml)

시료	용매	농도
		0.4	1.0
호박	과육	DH2O	76	80
		EtOH	77	78
	과피포함	DH2O	105	101
		EtOH	103	103
효과기준	100% 이상
검정방법	GST 활성

6) 면역 활성 측정

면역이란 우리 몸의 내, 외부로부터의 자극 및 손상에 대항하는 방어기작을 총칭한다. 면역활성의 측정은 면역물질의 측정, 면역세포의 생육도 측정 등을 통하여 이루어지는데 면역 세포의 증가 및 감소는 우리 몸 면역계의 이상을 실질적으로 나타내주는 지표라 할 수 있을 것이다.

실험 면역 세포주 : Raji(RPM1-1640 medium)을 seeding하여 세포 정상 생육기에 도달(7일정도 소요)시킨 후 96-well Plate(5×10⁴Cell/㎖로 농도 조절한 배지 100㎕/well)를 37℃에서 5% CO₂상태로 24시간 incubation하고 각 농도로 100㎕의 sample을 투여한 후 37℃에서 5% CO₂상태로 48시간 incubation한 후 상등액을 제거하고 차가운 10%(w/v) TCA(trichloroacetic acid) 100㎕를 가하여 4℃에서 1시간동안 방치한 후 증류수로 4∼5회 세척하여 TCA를 제거하고 실온에서 plate를 건조한 뒤 각 well에 1%(v/v) acetic acid에 녹인 0.4%(w/v) SRB용액을 100㎕씩 첨가하고 상온에서 30분 동안 염색시켰다.

결합되지 않은 SRB 염색액은 1% acetic acid로 4∼5회 정도 세척, 건조시킨 후에 10mM Tris buffer 100㎕를 첨가하여 염색액을 녹여낸 후 540nm에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

암세포 생육도(%) = test/control × 100

면역세포인 Raji의 생육을 증가시키는 정도를 측정하는 것이므로 세포생육이 증가함에 해당식품이 면역력을 증가시킬 수 있음을 시사한다. 면역 기능 증강 효과는 인간 면역 세포인 B cell(Raji)을 이용하여 검증하였다. 세포의 생육은 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 5% CO₂, 37℃에서 배양하였으며, 면역 기능 증강 효과는 SRB assay를 사용하여 측정하였다.

표 15. 면역활성(%/mg/ml)

시료	용매	Raji cell(인간B-임파세포)
		0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
호박	과육	DH2O	108	115	117	122	128
		EtOH	104	108	112	119	127
	과피포함	DH2O	103	116	132	167	148
		EtOH	109	113	122	136	141
효과기준	100% 이하
검정방법	SRB assay

7) 항산화 활성 측정

산화는 우리체 내에서 세포막 내 손상을 일으키고 노화를 촉진하며 발암이나 성인병 등과도 밀접한 관련을 갖고 있다. 노화 및 성인병 예방의 측면에서 항산화 활성 물질이 요구되어지며 산화 억제 물질에 대한 검색으로 4.5×10^-3linolenic acid 수용액 5㎖에 sample 0.5㎖를 넣어서 50℃에서 incubation 시키면서 마개 달린 test tube에 1.1㎖씩 4일마다 채취하여 TCA, TBA, BHT, SDS 각각 1, 2, 0.1, 1㎖혼합한 후 N₂gas를 취입하고 밀봉한 후 비등 수욕조에서 15분간 incubation하고 방냉시킨 후 1㎖ acetic acid와 2㎖ chloroform을 혼합 진탕후 2,500rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 532nm에서 흡광도를 측정한다.

linolenic acid는 필수 지방산이며 다가 불포화 지방산으로 산화되기 쉽다.그러한 linolenic acid에 대한 항산화성을 나타내는 해당식품은 노화 방지 및 성인병 예방에 효과적임을 시사한다. 산화억제물질에 대한 검색은 TBA법으로 측정하였다.

표 16. 항산화 활성(TBA법)(%/mg/ml)

시료	용매	농도
		0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
호박	과육	DH2O	16	18	20	24	25
		EtOH	11	19	29	35	37
	과피포함	DH2O	8	12	16	17	19
		EtOH	143	21	26	33	38
효과기준	50% 이하
검정방법	TBA method

8) 항균 활성 측정

항균력 검색을 위하여 공시균주는 Gram positive bacteria(Listeria monocytogenes, Bacillus subtilis, Staphylocoocus aureus),Gram negative bacteria(Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa)이고 배지는 Tryptic soy broth and agar를 사용하고, 검색방법은 paper disc, bioscreen C를 사용하였고, 항균력 검색은 TSB배지를 121℃에서 15분간 살균한 후 냉각하여 무균적으로 petri-dish에 15ml씩 분주하여 무균상에서 하룻밤 방치하여 굳힌 후 준비된 피검균 배양액 0.1ml를 평판배지에 주입하여 균일하게 도포한다. 각 시료를 멸균된 8.0mm filter paper disc(Whatman No.2)에 농도별로 흡수시킨 후 시험용 평판배지에 올려놓고 난 다음, 30℃의 인큐베이터에서 24-48시간 배양하면서 disc주변의 clear zone(mm)을 측정하여 항균력 조사하였다.

표 17. 항균활성(항균력)(mm:5mg/disc)

시료	용매	사용균주*
		LM	BC	SA	ST	EC	PA
호박	과육	DH2O	0	0	0	0	0	0
		EtOH	0	0	0	0	0	0
	과피포함	DH2O	0	0	0	0	0	0
		EtOH	0	0	0	0	0	0
효과기준	14 mm 이상
검정방법	Paper disc법

* LM :L. monocytogenesATCC 19111 BC :B. cereusKCCM 11204

SA :Staphy. aureusKCCM 32395 ST :S. typhimuriumATCC 14028

EC :E. coliO157:H7 932 PA :Ps. aeruginosaATCC 27853

최소저해농도 측정은 각 시료를 0.45㎛의 membrane filter(Whatman No.2)로 제균하고 농도별로 멸균한 broth에 첨가한다. 전배양된 각 균의 농도를 10⁵CFU/㎖되도록 접종하여 bioscreen C로 35℃에서 24시간 배양하면서 피검균의 생육을 O.D값으로 측정한다.

표 18. 최소저해농도

시료	용매	사용균주*
		LM	BC	SA	ST	EC	PA
호박	과육	DH2O	+	+	+	+	+	+
		EtOH	+	+	+	+	+	+
	과피포함	DH2O	+	+	+	+	+	+
		EtOH	+	+	+	+	+	+
효과기준	125 mg/ml 이상
검정방법	Bioscreen C법

* LM :L. monocytogenesATCC 19111 BC :B. cereusKCCM 11204

SA :Staphy. aureusKCCM 32395 ST :S. typhimuriumATCC 14028

EC :E. coliO157:H7 932 PA :Ps. aeruginosaATCC 27853

본 발명은 호박을 증숙시켜 얻은 호박증숙물과 호박추출물을 호박술 발효중에 단계적으로 사입함으로써 알콜함량이 좋고 맛과 품질이 우수한 호박청주를 제공한다. 또한 호박의 가공도를 높임으로써 농가의 소득증대에도 기여할 수 있다.

Claims (5)

1. 호박청주를 제조함에 있어서,

   쌀을 세척하고 침지하여 증자시킨 쌀에 뜸을 드려 냉각하여 고두밥을 얻는 단계와,

   호박 또는 호박과육을 증자한 후, 여과 및 농축과정을 거쳐 호박증숙물과 호박추출물을 얻는 단계와,

   전기의 고두밥에 누룩, 효모, 호박증숙물 또는 호박추출물을 혼합한 후 발효시켜 호박탁주를 제조하는 단계와,

   전기의 호박탁주를 여과한 여과액에 고두밥 43-44wt%, 누룩 6-7wt%, 효모 0.1-0.3wt% 및 호박증숙물 또는 호박추출물 45-50wt%을 사입하고 18-22℃에서 7-10일간 숙성시킨 후 여과한 다음 70-90℃에서 20-40분간 살균 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 호박청주의 제조방법.
2. 제 1 항에 있어서, 고두밥은 쌀을 물로 세척하고 11-15시간 이상 침지한 후, 재차 쌀을 세척하여 증자기에서 10-15분간 증자된 쌀의 상하부를 교반하여 위치를 바꾸어 균일하게 증자시킨 후, 증자된 쌀에 증기를 투입하지 않고 5-10분간 뜸을 드린 후, 10-20℃ 내외로 냉각하여 고두밥을 얻는 것을 특징으로 하는 호박청주의 제조방법
3. 제 1 항에 있어서, 호박추출물은 호박 껍질을 박피한 후 절단한 호박에 대하여 정제수를 첨가하여 90∼100℃에서 2∼3시간 추출한 후 여과하여 70-90℃에서 서서히 농축한 호박추출물 얻고, 호박증숙물은 통호박을 깍뚝썰기한 호박에 대하여 정제수를 첨가하여 100℃에서 2∼3시간 증자한 후 여과하여 얻은 과피가 포함된 호박증숙물을 얻는 것을 특징으로 하는 호박청주의 제조방법
4. 제 1 항에 있어서, 고두밥 43-44wt%, 누룩 6-7wt%, 효모 0.1-0.3wt% 및 호박추출물 또는 호박증숙물 45-50wt%를 혼합한 후 22-27℃에서 5-10일간 발효하고 침전시켜 호박술을 얻는 것을 특징으로 하는 호박청주의 제조방법
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