KR100427259B1

KR100427259B1 - 양이온성 고분자 물질과 막활성 물질을 이용한 새로운 유전자 전달 복합체

Info

Publication number: KR100427259B1
Application number: KR10-2001-0006528A
Authority: KR
Inventors: 염영일; 민상현; 임미정; 이동철; 윤도영; 조정원
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2001-02-09
Filing date: 2001-02-09
Publication date: 2004-04-17
Also published as: KR20020066299A

Abstract

본 발명은 양이온성 고분자 물질과 막활성 물질을 이용한 새로운 유전자 전달 복합체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 폴리에틸렌이민과 같은 양이온성 고분자 물질과 DNA의 혼합물에 KALA 펩타이드와 같은 막활성 물질을 첨가한 유전자 전달 복합체가 근육세포를 비롯한 여러 가지 동물세포에 대해 양이온성 고분자 물질 단독 사용의 경우에 비해 독성이 덜하면서도 보다 향상된 유전자 전달효과를 가지는 새로운 유전자 전달 복합체에 관한 것이다.

Description

양이온성 고분자 물질과 막활성 물질을 이용한 새로운 유전자 전달 복합체 {Novel gene delivery system consisting of cationic polymers and fusogenic peptides}

본 발명은 양이온성 고분자 물질과 막활성 물질을 이용한 새로운 유전자 전달 복합체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 폴리에틸렌이민과 같은 양이온성 고분자 물질과 DNA의 혼합물에 KALA[Wyman 등, Biochemistry, 36:3008-3017(1997)] 펩타이드와 같은 막활성 물질을 첨가한 유전자 전달 복합체가 근육세포를 비롯한 여러 가지 동물세포에 대해 양이온성 고분자 물질 단독 사용의 경우에 비해 독성이 덜하면서도 보다 향상된 유전자 전달효과를 가지는 새로운 유전자 전달 복합체에 관한 것이다.

보다 효과적인 유전자 전달 조성물의 개발은 선천적 혹은 후천적 질병의 치료에 있어서 생물학적 결함을 제거하거나 생체에 필요한 성분을 생산하게 하고, 생산된 성분이 다른 기관에서 이용됨으로써 질병을 치료할 수 있도록 하는 유전자 치료의 가장 기본적이면서도 중요한 일로 여겨져 왔다.

최근의 DNA 재조합 기술과 유전학적 기술의 도래로 인하여 숙주세포에서 유전자의 발현을 중재할 수 있는 재조합 유전자 발현 구조물 및 약리학적 기술들이 발달하게 되었고, 분자 약물, 특히 유전자 치료가 가능하게 되어 다양한 유전자 질환을 완화시킬 수 있게 되었다. 특히, 근육세포로의 유전자 전달은 다른 조직에서 나타날 수 있는 부작용이 덜하고 더 이상 성장하지 않는 분화된 세포를 형성할 수 있으므로 장기간에 걸쳐 필요한 단백질을 지속적으로 공급해 줄 수 있다는 장점이 있어 유전자 치료의 좋은 대상 조직으로 분류되고 있으며, 현재 이 원리를 이용하여 당뇨병이나 근위축증 등의 질병에 대한 유전자 치료의 임상실험이 진행 중에 있다[Anna 등, Hum. Gene Ther., 10:2637-2649(1999)].

유전자치료 목적으로 사용되는 유전자 전달체는 바이러스성 벡터와 비바이러스성 벡터의 두 가지로 대별되는데, 레트로바이러스, 아데노바이러스, AAV 등이 바이러스성 벡터의 대표적인 예로써 이들은 감염성이 높기 때문에 생체 외에서의 유전자 전달효율이 우수하다는 장점이 있으나, 숙주의 염색체내에 삽입 시 돌연변이 유발가능성과 감염성 바이러스의 생성가능성 등이 위험요소로서 지적되고 있다 [Kremer 등, Br. Med. Bull., 51:31-44(1995); Vile and Russell, Br. Med. Bull., 51:12-30(1995); Smith, Annu. Rev. Microbiol., 49:807-838(1995)]. 비바이러스성 벡터는 칼슘포스페이트 공침법, DEAE-덱스트란(dextran), 양이온성 리포좀, 양이온성 고분자물질을 이용한 분자 복합체 등 주로 물리적 전달 수단에 해당하는 것으로서 안전성이 뛰어나고 DNA의 크기에 제한을 받지 않는다는 장점을 가지고 있다. 하지만, 이런 방법도 유전자 전달효율이 낮고 전달된 유전자의 발현이 일시적이라는 단점이 지적되고 있다.

이와 같이 기존의 비바이러스성 벡터를 이용한 유전자 전달 효과가 기대에 미치지 못한 점을 보완하여 높은 유전자 전달효율과 지속적인 발현으로서 효과적인 유전자 치료를 기대할 수 있는 새로운 방법의 개발이 절실히 요구된다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래의 유전자 전달 수단이 갖는 문제점을 보완하기 위하여 연구 노력한 결과, 독성이 덜하고 높은 유전자 전달효율로써 효과적인 유전자 치료를 기대할 수 있는 새로운 유전자 전달 복합체를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 양이온성 고분자 물질과 막활성 물질을 이용한 새로운 유전자 전달 복합체를 제공하는데 그 목적이 있다.

도 1a 및 도 1b는 폴리에틸렌이민-DNA-KALA 펩타이드로 이루어지는 복합체에 있어서 각 성분의 혼합 순서와 상대적 농도변화에 따른 유전자 발현효율을 C₂C₁₂근아세포에서 측정한 것이다.

도 2는 상기 도 1a와 도 1b에서 최적화한 복합체를 여러 가지 다른 동물세포에 적용시켰을 때의 유전자 발현효율을 나타낸 것이다.

도 3은 상기 최적화된 복합체의 유전자 전달효율에 대한 우태아 혈청의 영향을 C₂C₁₂세포에서 측정한 것이다.

도 4는 분화 유도된 C₂C₁₂세포에 대한 상기 복합체의 유전자 전달효과를 나타낸 것이다.

도 5a는 폴리에틸렌이민-DNA로 구성되는 유전자 전달 복합체에 대한 전자현미경 사진이다.

도 5b는 폴리에틸렌이민-DNA-KALA 펩타이드로 구성되는 유전자 전달 복합체에 대한 전자현미경 사진이다.

도 6은 폴리에틸렌이민-DNA 또는 폴리에틸렌이민-DNA-KALA 펩타이드로 구성되는 유전자 전달 복합체가 C₂C₁₂근아세포에 미치는 세포독성의 정도를 나타낸 것이다.

본 발명은 양이온성 고분자 물질과 DNA의 혼합물에 막활성 물질을 첨가한 유전자 전달 복합체를 그 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 낮은 세포독성과 높은 유전자 전달 특성을 갖는 유전자 전달 복합체로서, 작용성 유전자의 전달에 적합한 담체(carrier)로서 폴리에틸렌이민과 같은 양이온성 고분자물질을 사용하여 복합체를 형성시킨 후, 복합체의 여분의 공간에작용성 유전자의 세포내 이입을 촉진하고 라이소좀 분해를 억제할 수 있도록 하는 푸소제닉(fusogenic) 펩타이드를 첨가하여 유전자의 높은 발현효율을 나타내도록 제조한 보다 안정적이고 응축된 형태의 유전자 전달 복합체이다.

본 발명의 유전자 전달 복합체는 상기 복합체를 형성하는 다수의 매개변수에 의해 특성화된다. 상기 매개변수로는 폴리에틸렌이민의 분자량, DNA : 폴리에틸렌이민 : 펩타이드의 조성비 및 혼합 순서, 복합체의 크기, DNA를 제조하는 방법, DNA의 순도, 복합체를 제조하는 방법 및 그 밖의 매개변수들을 포함하고 있다.

사용된 폴리에틸렌이민의 분자량은 2 KD, 25 KD, 750 KD인데, 이때 2 KD와 750 KD의 경우 25 KD에 비해 유전자 전달효과가 낮은 문제점이 있어 유전자 전달 담체로서 좋지 않다.

상기 복합체에서 DNA : 폴리에틸렌이민의 적절한 조성비(전하비; N : P ratio)는 1 : 4 ∼ 1 : 20, 바람직하게는 약 1 : 4 ∼ 1 : 10이며, 이의 범위를 벗어나면 유전자 응축 및 우수한 전달효과를 발휘할 수 없다. 또한, DNA : KALA 펩타이드의 중량비(g)는 약 1 : 8 ∼ 1 : 20, 바람직하게는 약 1 : 8 ∼ 1 : 12이며, 이의 범위를 벗어나면 유전자 응축, 세포막 투과시 향상효과 및 세포독성경감효과를 발휘할 수 없는 문제점이 있다.

한편, 본 발명의 유전자 전달 복합체를 혼합 및 제조할 때 각 성분을 혼합하는 순서에 따라 적합한 유전자 전달 복합체가 제조될 수 있다. 일반적으로 DNA : 폴리에틸렌이민 : 펩타이드의 비를 1 : 4 : 8 ∼ 1 : 4 : 12로 하여 폴리에틸렌이민과 펩타이드를 DNA에 첨가해서 응집을 최대화하는 것이 바람직하고, 특히 DNA에 폴리에틸렌이민을 먼저 첨가한 후 펩타이드를 첨가하면 보다 우수한 결과를 얻을 수 있다. 이때 음으로 하전된 DNA는 양이온성 폴리에틸렌이민, 펩타이드 등의 담체와 결합하여 매우 안정한 복합체를 형성하게 된다.

또한, 유전자 전달 복합체를 주사용으로 사용하기 위해서는 복합체의 크기를 적절히 조절하여야 한다. 즉, 담체-DNA 복합체가 거대 입자를 형성하면 주사바늘을 통과하기가 어렵고 숙주 동물의 부위에 따라 유전자 전달 목적에 부적합할 수 있기 때문에 큰 입자로 응집이 되어 침전이 형성되는 것을 막아야 한다. 따라서 이를 방지하기 위해 DNA : 담체의 중량비를 적절히 조절하고, 용액중의 DNA-담체 복합체의 전체 농도를 5 mg/㎖ 미만으로 한다. 또한, 거대 응집을 촉진시키는 경향이 있는 EDTA와 같은 킬레이트성 물질 및 상당량의 염의 사용을 피한다.

한편, 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체는 비면역원성, 비독성, 비감염성이며, 레트로바이러스 또는 아데노바이러스와 같은 벡터 유기체의 DNA가 패키징되어 있지 않기 때문에 플라스미드 크기에 제한을 받지 않는다. 따라서, 어떠한 실용적인 크기의 재조합 유전자 발현 구조물에도 사용될 수 있다.

이와 같이 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체를 이용하여 근육으로의 이식 또는 근육내 직접주사에 의한 DNA의 생체 내 발현으로 유전자의 전달을 수행할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체는 그 효용이 단지 근육조직에만 그치지 않으며, 종양이나 내부장기 등 일반적인 생체내 유전자전달과 배양세포 등 시험관내 유전자전달에도 충분히 확대 적용될 수 있다.

도입된 복합체는 분해되지 않고 세포 내 핵에 도달하여야 하며 복합체의 구성 성분은 생체유래의 비면역성, 생분해성 고분자이어야 한다. 이러한 관점에서 볼 때, 본 발명자들은 폴리에틸렌이민과 유전자의 복합체에 푸소제닉 (fusogenic) KALA 펩타이드를 첨가함으로써 유전자의 세포내 이입이 증진되고 라이소좀에 의한 분해를 피하는 능력이 배가된 유전자 전달체를 제조할 수 있고, 또한 이 유전자전달체가 세포에 대한 독성은 경감되고 유전자 발현효율은 우수하다는 점을 확인할 수 있었다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 상세하게 설명하겠는 바, 본 발명이 다음 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 루시퍼라아제 DNA를 가지는 플라스미드 pGL2의 제조

루시퍼라아제 DNA를 가지는 플라스미드 pGL2는 알칼리 분해, 더블 염화세슘 (double cesium chloride) 방법을 사용하여 제조되었다[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press: New York (1990)].

상기 방법을 자세히 하면, 100 ㎍/㎖ 암피실린이 포함된 15 ㎖ LB 배양액에서 단일 콜로니를 포함하는 박테리아를 37 ℃의 온도에서 16시간동안 교반(250 rpm)하면서 배양하였다. 그런 다음, 이 배양액에서 3 ㎖을 취하여 4개의 100 ㎍/㎖ 암피실린이 포함된 500 ㎖ LB에 각각 첨가하여 37 ℃의 온도에서 16시간동안 교반하면서 배양하였다. 배양한 후에 베크만(Beckman) 원심분리기를 이용하여 4 ℃의 온도에서 10분 동안 원심분리하여 박테리아를 회수하였다. 회수된 박테리아를 25 mM HCl 완충액(pH 8)/10 mM EDTA/50 mM 글루코오스의 혼합용액 20 ㎖에서 가볍게 재현탁하였다. 상기 재현탁된 박테리아 세포 펠릿에 0.2 N NaOH/1%SDS(sodium dodecyl sulfate)의 혼합용액 40 ㎖을 실온에서 첨가한 후, 약 5분 동안 얼음상에서 상기 혼합물을 가볍게 교반함으로써 세포를 분해하였다. 그 다음에 분해된 박테리아의 혼합물에 3 M 아세트산칼륨 20 ㎖을 첨가하고, 가볍게 혼합시킨 후, 10분 동안 얼음상에서 저장하여 박테리아 염색체 DNA, RNA 및 SDS/단백질/막 복합체를 포함하는 백색 침전물을 얻고 이를 4 ℃에서 15분간 10,000 rpm의 속도로 원심분리하였다. 원심분리 후에 상층액을 멸균 거즈를 통해 250 ㎖ 원심분리기병으로 여과하면서 옮기고, 실온에서 이소프로판올 50 ㎖을 첨가하여 혼합한 후, 10분 동안 저장하였다. 그런 다음, 실온에서 10분 동안 5,000 rpm의 속도로 원심분리하여 알코올을 함유하는 상층액을 따라내고, 나머지 상층액을 진공 아스퍼레이션을 사용하여 제거한 다음, 플라스미드 DNA 페릿을 10분 동안 건조시켰다.

건조된 플라스미드 DNA 펠릿을 트리스-HCl(pH 8) 6 ㎖로 용해하고, 0.6 mg의 이자 RNase를 첨가하여 플라스미드 DNA로부터 오염 박테리아 RNA를 제거하였다. 그리고, 염화 세슘-에티듐 브로마이드 원심분리법을 이용하여 플라스미드 DNA를 정제하였다[Sambrook et al., ibid (1990)]. 즉, 플라스미드 DNA 용액 ㎖당 1.109 g의 염화세슘과 0.2 mg의 에티듐 브로마이드를 가하여 용해시킨 후, 상온에서 4분 동안 5,000 rpm의 속도로 원심분리하여 불용성 부유물을 제거한 다음, 혼합용액을 초원심분리용 튜브(Beckman polyallomer Quick-sealTM centrifuge tube)로 옮겼다. VTi 65 로터가 장착된 베크만 초원심분리기 내에 튜브를 장착하고 20 ℃의 온도에서 45,000 rpm의 속도로 18시간동안 원심분리 후, 튜브의 윗 부분에 21게이지(gauge) 주사기를 꽂아 공기가 유입되도록 하고, 멸균된 18 게이지(gauge) 주사기를 사용하여 플라스미드 DNA가 함유되어 있는 중간 층 밴드만을 분리한 다음, 새로운 초원심분리 튜브로 옮겼다. 그런 다음, 상기와 같은 방법으로 재원심분리하고, 얻은 플라스미드 DNA를 멸균된 팰콘(Falcon) 튜브로 옮겼다. 플라스미드 DNA와 동량의 트리스-포화된 1-부탄올을 첨가하여 완전히 혼합시킨 후, 실온에서 5분 동안 1,500 rpm의 속도로 에티듐 브로마이드의 분홍빛이 제거될 때까지 반복하였다. 플라스미드 DNA 용액을 투석막에 장치한 후, 트리스-HCl 완충액(pH 8)을 4회 교체하면서 48시간동안 투석하여 남아있는 미량의 에티듐 브로마이드를 제거하고 여기에 플라스미드 DNA 용액의 2배 부피의 에탄올을 첨가하여 -20 ℃에서 1시간동안 DNA를 침전시켰다. 그런 다음, 약 10,000 rpm으로 원심분리하여 플라스미드 DNA를 수거하였다. 수거한 플라스미드 DNA 펠릿을 3 ㎖의 10 mM 트리스-HCl(pH 8)에서 용해시키고, 용해된 플라스미드를 1/500로 희석하여 A₂₆₀에서 분광광도법을 사용하여 농도를 결정하였다.

실시예 2 : 폴리에틸렌이민-DNA와 폴리에틸렌이민-DNA-펩타이드 유전자 전달 복합체 제조

폴리에틸렌이민-DNA 유전자 전달 복합체를 다음과 같이 제조하였다. DNA와 분자량이 각기 다른 3가지(2-, 25-, 750-KD) 폴리에틸렌이민의 전하비를 1 : 2에서 1 : 20으로 변화시켜가며 복합체를 제조하였다. 복합체의 제조시 적정DNA 농도를 0.5 ㎍/㎕로 하여 사용하였고, 폴리에틸렌이민은 1 mM로 희석하였다. 적정량의 DNA를 하나의 튜브에 첨가하고, 물과 5 M 염화나트륨 용액을 첨가하여 최종 염화나트륨 농도가 150 mM이 되도록 조절한 다음, 적량의 폴리에틸렌이민을 넣어주고 튜브를 3초간 교반 후 30분간 혼합시켰다. 폴리에틸렌이민-DNA-펩타이드 복합체는 상기의 혼합액을 30분간 반응이 일어나게 상온에 둔 후, 적량의 펩타이드를 다시 첨가하여 튜브를 3초간 교반, 혼합한 다음 트랜스팩션에 이용되기 전까지 30분간 상온에서 반응시켜서 제조하였다. 이 단계에서 혼합물을 고속으로 교반할 경우, 형성된 복합체의 보전 및 유용성이 많이 손상될 수 있으므로 주의하여야 한다.

실시예 3 : 폴리에틸렌이민-DNA와 폴리에틸렌이민-DNA-펩타이드 유전자 전달 복합체의 유전자 전달 효율 측정

상기 실시예 2에서 제조된 폴리에틸렌이민-DNA와 폴리에틸렌이민-DNA-펩타이드 유전자 전달 복합체를 이용하여 루시퍼라아제 DNA를 C₂C₁₂근아세포에 트랜스팩션하고, 루시퍼라아제의 발현을 검출하여 복합체의 발현율에 대한 펩타이드의 영향을 확인함으로써 최적의 유전자 전달체계를 설계하였다.

복합체를 세포에 도입하기 약 24시간 전에 10% 우태아 혈청과 페니실린-스트렙토마이신 100 단위/㎖을 첨가한 DMEM-h 배지[GIBCO BRL, NY, USA]에서 배양한 C₂C₁₂근아세포 15,000개씩을 24-웰 플레이트(well plate)의 각 웰에 분주하고, 플레이트의 약 70% 정도 세포가 자랄 때까지 37 ℃/5% CO₂에서 18시간에 걸쳐 배양하였다. 각 웰로부터 배지를 제거하고 인산 완충액(pH 7.4) 2 ㎖로 세척한 다음, 혈청 함유 배지 0.3 ㎖을 각 웰에 첨가하고, 상기 세포를 37 ℃에서 30분 동안 배양하였다. 이어서, 상기의 유전자 복합체(10 ㎍ DNA/㎖) 0.1 ㎖을 가한 다음 24시간 동안 37 ℃/5% CO₂조건으로 배양하고, 배지를 각 웰로부터 아스퍼레이션하고 인산완충액 1 ㎖로 두 번 세척하였다. 세포를 0.1 ㎖ 트립신-이디티에이(Trypsin-EDTA)로 처리하고 피펫을 이용하여 세포를 튜브로 회수한 다음, 세포현탁액을 4 ℃에서 4분 동안 4,000 rpm으로 원심분리하여 상층액을 아스퍼레이션으로 제거하였다. 세포 펠릿에 얼음냉각된 250 mM 트리스(pH 7.8)/1 mM DTT의 혼합용액 40 ㎕를 가하고 가볍게 재현탁시킨 후, 액체질소와 37 ℃ 항온조에서 반복하여 동결, 해동과정을 3 회 실시하여 얻어진 세포 파쇄물을 4 ℃의 온도에서 15분 동안 13,000 rpm으로 원심분리하고 상층액을 얼음냉각된 멸균 마이크로퓨지 튜브에 첨가하였다.

혼합용액 A[25 mM 글라이실글라이신(Glycylglycine)(pH 7.8) 9 ㎖, 0.2 M ATP 0.1 ㎖, 1 M MgSO₄0.1 ㎖ 및 증류수 0.8 ㎖] 350 ㎕를 튜브에 각각 첨가하고, 상기 상층액 20 ㎕를 첨가하여 세게 혼합한 후, 혼합용액 B[25 mM 글라이실글라이신(Glycylglycine)(pH 7.8) 4 ㎖ 및 D-루시페린 1 ㎖]가 첨가된 형광 루미노메타 [Lumar TM, LB 9501, Berthold, Germany]를 사용하여 30초간 루시퍼라아제 활성을 측정하였다.

3 종류의 서로 다른 분자량(2-, 25-, 750-KD)을 가진 폴리에틸렌이민의 DNA 도입 효과 중 25 KD의 분자량을 가진 가지친 구조(branched form)가 가장 좋은 루시퍼라아제 활성을 보였으며, 이것을 이용하여 폴리에틸렌이민-DNA-KALA 펩타이드 혹은 KALA 펩타이드-DNA-폴리에틸렌이민과 같이 복합체의 구성 순서와 상대적 농도변화에 따른 유전자 발현효율을 측정한 결과, 첨부도면의 도 1에서 보는 바와 마찬가지로 폴리에틸렌이민-DNA 복합체에 KALA 펩타이드를 첨가시킴으로써 폴리에틸렌이민의 단독 유전자 도입보다 4 ∼ 10 배 이상의 증가된 값을 얻었다. 얻어진 복합체의 최적 구성조건을 근아세포 외의 다른 세포들에 도입한 결과 근아세포에서와 유사한 증가치를 나타내었다[도 2].

최적화된 폴리에틸렌이민-DNA-KALA 펩타이드 유전자 복합체의 유전자 전달효율에 혈청이 미치는 영향에 대해 시험한 결과, 본 발명의 새로운 최적화된 복합체는 근육세포의 유전자 전달시 배지 내에 혈청이 존재할 때보다 향상된 결과를 얻을 수 있었다[도 3]. 또한, 근아세포를 분화시킨 상태의 세포에서도 유사한 현상을 나타내었다[도 4].

최적화된 폴리에틸렌이민-DNA와 폴리에틸렌이민-DNA-KALA 펩타이드 유전자 복합체의 기본구조를 비교 분석하기 위하여 투시전자현미경을 사용하였다. 그 결과, 폴리에틸렌이민-DNA-KALA 펩타이드가 폴리에틸렌이민-DNA 복합체에 비해 다소 응축된 양상을 나타내어 평균크기가 작고 타원형에 가까운 모양을 보여주었다 [도 5].

실시예 4 : 폴리에틸렌이민-DNA-펩타이드 복합체의 세포독성도 측정

상기 실시예 2와 같이 제조된 폴리에틸렌이민-DNA-KALA 펩타이드, 폴리에틸렌이민-DNA-폴리라이신, 폴리에틸렌이민-DNA-폴리에틸렌이민의 복합체들이 상기 실시예 3과 같이 준비된 근아세포에 대해 미치는 독성에 관하여 알아보았다. 복합체들을 트랜스팩션 한 24시간 후 아스퍼레이션으로 배지를 제거하고, 혈청함유 배지 0.5 ㎖과 [³H]-티미딘(thymidine)을 최종농도 2μci/㎖가 되도록 넣어준 다음 37 ℃/5% CO₂에서, 6시간 동안 배양하였다. 배지를 각 웰로부터 아스퍼레이션하고, 인산 완충액 1 ㎖로 두 번 세척한 후 2 ㎖의 차가운 10% 트리클로로아세트산 (trichloroacetic acid)을 넣어주고 5분간 방치하였다. 이어서 웰로부터 용액을 제거하고 0.5 ㎖의 10% 소디움 도데실설페이트(sodium dodecyl sulfate)를 첨가하여 세포를 회수한 뒤 3 ㎖의 LSC(liquid scintillation counting) 칵테일이 들어있는 튜브에 넣은 후 베크만 카운터[Beckman LS 6000 TA, 미국]를 사용하여 티미딘의 함입량을 측정하였다. 그 결과, KALA 펩타이드를 첨가한 복합체가 폴리에틸렌이민-DNA 또는 폴리에틸렌이민-DNA-폴리라이신 복합체의 경우보다 다소 독성이 덜한 것으로 나타났다[도 6].

상기 결과는 본 발명의 폴리에틸렌이민-DNA-KALA의 유전자 전달 복합체가 보다 증가된 발현 효율과 낮은 세포독성을 갖는 유전자 전달 벡터로서 사용될 수 있는 가능성을 입증하였다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 폴리에틸렌이민, DNA, KALA 펩타이드를 함유하는 유전자 전달 복합체는 작용성 유전자 또는 이들의 단편을 암호화하는 재조합 유전자 발현 구조물에 대한 포유동물 세포로의 효율적인 전달을 중재하여 유전자의 보다 증가된 발현 효율을 유발할 뿐만 아니라 폴리에틸렌이민-DNA 복합체에 비해 세포에의 독성을 경감시키는 특성을 지닌다. 특히, 근아세포와 분화된 근육세포에서의 유전자 전달효율이 뛰어남을 이용하여, 당뇨병이나 근위축증 등과 같은 근육을 표적으로 하는 여러 질병의 유전자 치료 모델에 유용할 것으로 사료되며, 그 용도가 이에 한정되지 않고 암, 선천성 질병, 후천성 대사장애 질병, 감염성 질병, 퇴행성 질환 등 유전자 치료법이 유용한 모든 질병에 미칠 수 있다.

Claims

폴리에틸렌이민과 DNA로 이루어지거나 DNA와 KALA 펩타이드로 이루어진 2종의 유전자 전달 복합체에 있어서, 폴리에틸렌이민, DNA 혼합물 및 KALA 펩타이드의 3종 복합체로 구성되며, 상기 폴리에틸렌이민과 DNA의 전하비가 4 : 1 ∼ 20 : 1이고, DNA와 KALA 펩타이드의 중량비는 1 : 8 ∼ 1 : 20인 것을 특징으로 하는 유전자 전달 복합체.
삭제
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제 1 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌이민은 분자량이 25 KD인 것을 특징으로 하는 유전자 전달 복합체.
삭제
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제 1 항에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체를 동물세포 및 동물조직에로의 유전자 전달 목적으로 적용하는 것을 특징으로 하는 유전자 전달 복합체.
제 7 항에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체를 근육세포 및 근육조직에로의 유전자 전달 목적으로 적용하는 것을 특징으로 하는 유전자 전달 복합체.