JP5425477B2 - 形質転換細胞の製造のための方法 - Google Patents
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Description
i)少なくとも2つのアミン基を有するアミンモノマーの、少なくとも2つのエポキシド基を有するエポキシドモノマーとの反応によって得ることができる、生体分子、好ましくは核酸、およびポリマーからの複合体の調製、および
ii)細胞を複合体と接触させることによって、生体分子を細胞内へ導入。
ここで官能基中の残基R1は、同一でも異なってもよく、およびC1〜C20炭化水素残基、特に好ましくはC1〜C10炭化水素残基および非常に好ましくはC1〜C5炭化水素残基、特にメチル残基、エチル残基、n−プロピル残基またはイソプロピル残基、ヒドロキシ官能性C1〜C20炭化水素残基、特に好ましくはヒドロキシ官能性C1〜C10炭化水素残基および非常に好ましくはヒドロキシ官能性C1〜C5炭化水素残基または代替的に水素原子を表す。さらに、本発明によると、構造Iの官能基中の残基R1のうち少なくとも1つが水素原子であることもまた好ましい。「炭化水素残基」の語はそのとき、炭素原子および水素原子だけから成る残基、および炭素原子および水素原子と共にヘテロ原子、特にハロゲン類の原子もまた含む残基(=ハロゲン化炭化水素)の両方を含む。
II
ここで
Xは、存在する場合、酸素原子または窒素原子、特に好ましくは酸素原子または窒素原子であり、および酸素原子の場合には原子X上のR3基は存在せず、およびアミンモノマー中の原子Xはまた異なりうる、
構造II中のR1は、同一でも異なってもよく、およびC1〜C20炭化水素残基、特に好ましくはC1〜C10炭化水素残基および非常に好ましくはC1〜C5炭化水素残基、特にメチル残基、エチル残基、n−プロピル残基またはイソプロピル残基、ヒドロキシ官能性C1〜C20炭化水素残基、特に好ましくはヒドロキシ官能性C1〜C10炭化水素残基および非常に好ましくはヒドロキシ官能性C1〜C5炭化水素残基または代替的に水素原子を表し、
構造II中のR2は、同一でも異なってもよく、およびC1〜C20アルキレン基、特に好ましくはC1〜C10アルキレン基および非常に好ましくはC1〜C6アルキレン基またはC1〜C200オキシアルキレン基、特に好ましくはC1〜C50オキシアルキレン基および非常に好ましくはC2〜C10オキシアルキレン基を表し、残基R2として残基−CH2CH2−、−CH2CH2CH2−および−CHCH3CH2−が特に好ましくおよび−CH2CH2−が非常に好ましく、
nは、R2がアルキレン基である場合は、0ないし6、特に好ましくは1ないし5、さらにより好ましくは1ないし3および非常に好ましくは1ないし3の範囲の整数であり、およびR2がオキシアルキレン基である場合には、0ないし100、特に好ましくは1ないし50、さらにより好ましくは2ないし25および非常に好ましくは2ないし10の範囲の整数であり、および
構造II中のR3は、同一でも異なってもよく、およびC1〜C20炭化水素残基、特に好ましくはC1〜C10炭化水素残基および非常に好ましくはC1〜C5炭化水素残基、特にメチル残基、エチル残基、n−プロピル残基またはイソプロピル残基、ヒドロキシ官能性C1〜C20炭化水素残基、特に好ましくはヒドロキシ官能性C1〜C10炭化水素残基および非常に好ましくはヒドロキシ官能性C1〜C5炭化水素残基、水素原子または構造IIIの残基を表し、
特にR1=HおよびR2=−CH2CH2−の残基−CH2−CH2−NR1Hが残基R3として非常に好ましい。
I
の少なくとも2つの官能基が結合していてR1が上記で定義される通りのアミンモノマーを使用することもまた可能である。
ここで構造IV中の残基R4は、同一でも異なってもよく、およびC1〜C20炭化水素残基、特に好ましくはC1〜C10炭化水素残基および非常に好ましくはC2〜C5炭化水素残基、特にメチル残基、エチル残基、n−プロピル残基またはイソプロピル残基、ヒドロキシ官能性C1〜C20炭化水素残基、特に好ましくはヒドロキシ官能性C1〜C10炭化水素残基および非常に好ましくはヒドロキシ官能性C2〜C5炭化水素残基または水素原子を表し、残基R4として水素原子が非常に好ましい。
ここで
R4は上記で定義される通りであり、および
R5は、存在する場合、
C1〜C20アルキレン基、特に好ましくはC1〜C10アルキレン基および非常に好ましくはC1〜C6アルキレン基を表し、アルキレン基として−CH2CH2−、−CH2CH2CH2−または−CHCH3CH2−が特に好ましく、および−CH2CH2−が非常に好ましく、または構造VIの基であり、
ここでR6は
C1〜C20アルキレン基、特に好ましくはC1〜C10アルキレン基および非常に好ましくはC1〜C6アルキレン基を表し、ここで
−CH2CH2−、
−CH2CH2CH2−、
−CHCH3CH2−、
[−CH2CH2−]n、n=1〜10、
[−CH2CH2CH2−]n、n=1〜10、
[−CHCH3CH2−]n、n=1〜10、
またはエチレンおよびプロピレン単位を含むポリアルキレンが、アルキレン基として特に好ましく、
またはC1〜C200オキシアルキレン基、特に好ましくはC2〜C100オキシアルキレン基および非常に好ましくはC2〜C5オキシアルキレン基を表し、ここで
[−CH2CH2−O−]nCH2−、n=2〜100、
[−CH2CH2CH2−O−]nCH2CH2CH2−、n=2〜100、
[−CHCH3CH2−O−]nCHCH3CH2−、n=2〜100、
またはオキシエチレンおよびオキシプロピレン単位を含むポリオキシアルキレンが、オキシアルキレン基として特に好ましい。
およびここでR1およびR4は前記で定義される通りである。
(β1)少なくとも2つのアミノ基を有するアミンモノマーの、少なくとも2つのエポキシド基を有するエポキシドモノマーとの反応によって得ることができる上記のポリマー、および
(β2)他のキット成分、特にエンハンサー(核酸の濃縮の目的でまたは取り込み改善のため)、たとえばサケ***由来の硫酸プロタミン、PBSのような追加の緩衝液、または生理食塩水、形質転換効率を調節するための試薬、および別の形質転換試薬、たとえばリポソーム脂質または非リポソーム脂質または別のポリマー。
I)生物からの細胞の採取、
II)採取された細胞への生体分子の導入、好ましくは生体分子を細胞へ導入するための本発明に記載の方法による、採取された細胞の形質転換、および
III)生物へ細胞を戻す。
ポリマーの製造
トリエチレンテトラミン(10mmol)およびエチレングリコールジグリシジルエーテル(10mmol)をジメチルスルホキシド50mlに溶解し、および溶液を丸底フラスコ内で3時間60℃にて調整する。次いで反応混合物を同量の脱塩水で倍量に希釈し、および脱塩水に対して18時間透析し、水を3回交換した(分子量カットオフ1kDaの透析膜)。透析後、試料を凍結乾燥し、無色透明の粘性物質を得た。これをエンドトキシンフリー脱塩水に溶解し、ポリマー濃度3mg/mlを得た。このように得られたポリマー水溶液を滅菌ろ過によって滅菌した。
肝細胞がん細胞株Huh−7を、96ウェルプレートに、密度2x104細胞/ウェルにてウェル当たり100μlのDMEM培地中に播種した。細胞播種の24時間後、トランスフェクションを実施した。
核酸およびポリマーから複合体を形成するために、DMEMS培地(0.01μg/μl*)に溶解した表1に示すDNAの量(pCMVβプラスミド、クロンテック・ラボラトリーズ社(Clontech Laboratories))、およびトリエチレンテトラミンおよびエチレングリコールジグリシジルエーテル(「MK−7−11」)から得られたポリマーの滅菌水溶液の表1に示す量を96ウェルプレートのウェルへピペットで加え、および10分間室温にてインキュベートした。先行技術で公知である、キアゲン社(Qiagen GmbH)(ドイツ、ヒルデン(Hilden))のトランスフェクション試薬スーパーフェクト(SuperFect)(登録商標)を用いたトランスフェクションを対照として実施した。
トランスフェクションのために、直前に培地を交換しておき、複合体を細胞へ加え、および4時間37℃にてインキュベートした。4時間のインキュベート時間後、培地を交換し、複合体を含む溶液を新しい細胞培地と取り替えた。細胞を本発明に記載の複合体と、または核酸およびスーパーフェクト(SuperFect)の複合体とインキュベート後、トランスフェクション後2日目に細胞を溶解緩衝液(5mM MgCl2、1% NP−40、100mM NaCl、10mM Tris/HCl、pH7.4)を用いて溶解した。トランスフェクション効率を、β−ガラクトシダーゼ検定によって、ONPG(2−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシド、メルク社(Merck KGaA)、ドイツ、ダルムシュタット(Darmstadt))を基質として用いて測定した。トランスフェクション効率(ml当たりβ−ガラクトシダーゼ単位で)を図1に示す。
Claims (11)
- i)生体分子、およびトリエチレンテトラミンとエチレングリコールジグリシジルエーテルとの反応によって得ることができるポリマーからの複合体の製造、および
ii)細胞を複合体と接触させることによる、生体分子の細胞への導入
の段階を含む、生体分子を細胞へ導入するためのin vitroの方法であって、前記生体分子は核酸であり、かつ前記ポリマーが1ないし500kDaの範囲の分子量を有する方法。 - 段階i)における複合体の調製が、ポリマーを生体分子とpH値6ないし8の範囲にて接触させることによって実施される点で特徴づけられる、請求項1で請求される方法。
- 生体分子がデオキシリボ核酸である点で特徴づけられる、請求項1または2で請求される方法。
- ポリマー中に存在するアミノ基または水酸基が以下から選択される1以上の修飾で化学的に修飾される点で特徴づけられる、請求項1〜3のいずれか一項で請求される方法:ビオチン基の結合;アビジン、ストレプトアビジン、トランスフェリンおよびガラクトシドからなる群より選択されるエフェクター基での修飾;前記ポリマーをグリシドールで処理することによる末端ジオール基の形成;前記ポリマーをブロモ酢酸またはその塩で処理することによる負に荷電した基の作製;硫酸ジメチル、臭化メチル、メチルトシラートおよびメチルメシラートからなる群より選択されるアルキル化剤での処理による前記アミノ基の少なくとも一部の四級化;ならびにアミノ基のアルギニン基への変換。
- トリエチレンテトラミンとエチレングリコールジグリシジルエーテルとの反応によって得ることができるポリマーを含む、生体分子の細胞への導入剤であって、前記生体分子は核酸であり、かつ前記ポリマーが1ないし500kDaの範囲の分子量を有する導入剤。
- 生体分子がデオキシリボ核酸である点で特徴づけられる、請求項5で請求される導入剤。
- (β1)トリエチレンテトラミンとエチレングリコールジグリシジルエーテルとの反応によって得ることができる、請求項1から4のうちの一つで定義されるポリマー、および
(β2)他のキット成分
を含む、生体分子を細胞へ導入するためのキットであって、前記生体分子は核酸であるキット。 - 生体分子がデオキシリボ核酸である点で特徴づけられる、請求項7に記載のキット。
- 請求項7または8で請求されるキットを使用する点で特徴づけられる、請求項1から4のうちの一つで請求される方法。
- 遺伝子治療に用いられる細胞の製造方法であって、
i)生体分子、および少なくともトリエチレンテトラミンとエチレングリコールジグリシジルエーテルとの反応によって得ることができるポリマーからの複合体の製造であって、前記生体分子は核酸であり、前記ポリマーは1ないし500kDaの範囲の分子量を有する製造、および
ii)細胞を複合体と接触させることによる、生物から採取された細胞への生体分子の導入の段階を含む、製造方法。 - 生体分子がデオキシリボ核酸である点で特徴づけられる、請求項10で請求される製造方法。
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