KR100420988B1 - 파리유충 살충용 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis) 균제제의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 축산용 BT(바실러스 츄린겐시스)제제의 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 가축 전염병의 주요 매개체이며 스트레스의 주요 요인인 파리의 발생 억제 및 사료 이용효율의 증대를 위한 바실러스 츄린겐시스(이하 BT로 약칭) 제제의 제조방법으로 영양배지를 이용하여 배양 16시간 후에 망간 1% 중량을 첨가하여 최대의 내생포자를 형성시켜 이와 함께 최대의 내독소를 형성하게 하는 BT 제제의 제조방법에 관한 것이다. 가축사료에 첨가시 사료 이용효율 증대를 위해 자일란분해효소(xylanase), 단백질분해효소(protease), 섬유소분해효소(cellulase) 및 전분분해효소(amylase) 등의 효소활성을 나타내는 BT 균을 선발한 결과 파리 유충을 사멸시키는 내독소를 생산하며 효소활성이 가장 높은 한국종균협회로부터 분양받은 케이시시엠(KCCM) 11579 균주가 선발되었다. 본 발명은 사료 이용효율을 높이는데 기여할 수 있는 각종 효소활성을 나타내는 BT 균주를 내생포자 형태로 제조하여 가공사료 제조 시의 열처리에 안정하며 내생포자 형성과 함께 합성되는 파리 유충을 치사시키는 내독소 단백질을 생산하는 배양방법을 확립하여 가축사료에 본 발명에 따른 제제를 지속적으로 공급할 경우 사료의 이용효율 제고는 물론 분뇨에서의 파리 발생을 억제하여 파리로부터 옮겨지는 각종 질병발생을 억제할 수 있는 잇점이 있다.

Description

파리유충 살충용 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis) 균제제의 제조방법{Bacillus thuringiensis preparations for animal husbandry}

본 발명은 내포자의 형성과 함께 내독소(endotoxin)를 배출하여 무공해 살충제 효과를 보이는 세균인 BT에 관한 것이다. 기존에 많이 사용되어 오던 유기합성 농약의 독성 및 공해문제에 반하여 세균, 곰팡이, 바이러스를 이용한 생물농약은 인축(人畜)에는 전혀 문제가 없으며 토양 및 잔류독성이 문제되지 않는 이유로 앞으로의 친 환경농업에 널리 이용될 전망이다. 이러한 무공해 생물농약의 개발에 있어 BT를 이용한 살충제 개발 연구가 가장 앞서 있는 실정이다.

BT는 주모성 편모를 갖고 그람양성 반응을 나타내며 내포자 및 단백질 결정체를 생성하는 호기성 간균으로 여러 종류의 독소를 생산한다. 이 중δ-내독소가 독성이 낮고 살충효과도 우수한 것으로 알려져 있다. 한편β-외독소는δ-내독소에 비해 살충효과가 뛰어나고 해충적용범위도 넓으나 생태계에 대한 유해성 때문에 일부국가에서만 사용되고 있다. 또한 여러 종의 BT에 의해 생산되는 각각의 독소는 그 고유의 표적 해충에 작용을 한다.

한국특허 공개 제 10-1997-703708에서는 바실러스 츄린겐시스 변종 이스라엘렌시스 독소가 바퀴벌레에 대하여 활성을 가지고 있음을 밝혔다. 한국특허 공개 제 10-1992-005849에서는 바실러스 츄린겐시스 분리체를 사용하여 작은 가루진드기속(알리토비우스 디아페리누스)에 대하여 효과적인 살충효과를 보임을 제시하고 있다. 한국특허 공보 제 10-099068-0000에서는 BT 살충성 유전자를 식물체내에서 발현이 잘 되도록 변형시킴으로서 바실러스 츄린겐시스 테네브리오니스(Bacillus thuringiensissubsp.tenebrionis)로부터 변형된 유전자를 감자 또는 토마토에 감염시켜 살충성 독소를 생산하는 종자를 생산하였다.

또한 미국에서도 BT의 살충력을 이용한 발명 특허가 많이 발표되고 있다. 미국특허 제4,797,276호 및 제4,853,331호는 다양한 환경에서 초시류 해충을 억제하는데 이용될 수 있는 바실러스 츄린겐시스 테네브리오니스 변종을 개시하고 있다. 미국특허 제4,918,006호는 쌍시류 해충에 대해서 활성이 있는 BT 독소를 개시하고 있다. 미국특허 제4,849,217호는 알팔파 바구미에 대해서 활성이 있는 BT 분리주를 개시하고 있다. 미국특허 제 5,208,077호는 초시류에 대해 활성을 갖는 바실러스 츄린겐시스 분리주들을 개시하고 있다. 미국특허 제 5,151,363호 및 미국특허 제 4,948,734호는 선충류에 대한 활성을 갖는 BT의 특정한 분리주들을 개시하고 있다.

BT를 이용한 많은 실험에서는 주로 BT균이 내포자를 생산하기 좋은 환경의 배지를 조성하여 사용함으로서 보다 많은 내생포자를 형성하는 것에 그 초점을 두었다(한국산업미생물학회지. Vol. 16. No 1.11∼16 1988). 이들 대부분의 배지들은 많은 미네랄성분을 함유하고 있어 BT균이 빠른 내포자 형성하는데는 효과적이나 균의 대량증식에는 일반 영양배지에 비해 매우 떨어짐이 본 발명의 실험에서 나타났다. 또한 BT의δ-내독소 단백질을 제제화함에 있어 많은 연구가 이루어졌는데 대부분의 논문에서 내생포자와δ-내독소를 형성한 BT균을 용해시킴에 있어 초음파분쇄(Sonication)하여 이를 밀도구배를 이용, 초원심분리하여δ-내독소를 분리하였다(Applied Microbiology, Vol. 30, No. 6, p. 1052∼1053, 1975). 이 방법의 경우 초음파분쇄, 초원심분리를 통한 내독소의 생산량이 극소량이며 그 생산 절차의 복잡성으로 인해 BT균을 이용한 생물농약의 경제적인 실용화에는 많은 문제점이 있다.

상기한 특허와 논문 등에서 BT균이 표적으로 삼고 있는 해충이 주로 바퀴벌레, 진드기, 바구미 등의 해충에만 집중되었을 뿐 축산업에서 문제 시 되고 있는 파리의 구제에 대한 연구는 아직은 없다. 파리는 여러 가축질병의 매개체이며, 가축에게 스트레스를 주는 점을 감안 할 경우 파리의 구제는 간과할 수 없는 문제이다. 축산분야에 있어 파리를 구제하기 위해 BT 독소를 정화조에 살포시킴으로서 분뇨중의 구더기를 구제할 수 있으나 가격면이나 효과면에서도 월등한 화학 살충제를 능가하지 못했기 때문에 뚜렷한 연구가 없는 것으로 생각된다. 하지만 이러한 화학 살충제를 사용할 경우 그 사용이 합리적일 수 있으나 그 가축분뇨의 퇴비화시 토양내 화학제의 잔류 등 많은 환경문제를 야기 할 수 있으며 발효저하로 양질의 퇴비를 얻을 수 없다. 따라서 본 연구자들은 축산에서 좀더 효율적인 BT제제의 이용방법을 연구하게 되었다. 즉, 가축의 장관과 가축분뇨에서 생장 및 유기물의 분해력이 우수하고 파리에 대한 내독소를 생산하는 BT균주를 확보하여 사료에 첨가시 내열성이 요구되기 때문에 내포자 형성 조건과 함께 내독소를 형성하는 조건을 검토하였다. 한국특허 공보 제 1985-0008815는 대두박을 이용한 고체배양을 통해 BT를 배양하는 방법을 나타내었다. 또한 BT균이 NaCl 내성과 삼투압에 대한 내성을 가지고 있음을 생각해 볼 때 가축 체내 및 분뇨에서의 높은 생존율과 번식 또한 유리하다. 이러한 BT의 특성을 이용하여 가축사료를 통해 체내로 들어간 BT균은 체내에서 증식하여 분뇨를 통해 체외로 배출되며 이렇게 배출된 분뇨는 정화조내에서도 증식하면서 구더기 및 파리 구제에 효과를 보일 것이다. 이러한 파리의 구제 방법은 노동력뿐만 아니라 친환경적 농업에도 한 걸음 더 다가가는 획기적인 방안이 될 것이라 생각된다.

이에 본 연구자들은 상기의 문제점을 감안하여 일반 영양배지의 사용을 통한 BT균의 대량증식을 꾀하면서 균 배양액에 인위적 망간처리 및 열처리를 통해 내생포자의 형성을 유도함으로서 이에 부차적으로 생산되는 내독소의 생산을 높이는데 그 목적이 있다. 망간 처리를 통해 내생포자 형성을 유도하여 사료가공시의 열처리에 안정한 균 형태를 제공하며 내생포자와 함께 형성되는 내독소를 동시에 생산하고자 하는 것이다. 이러한 BT균의 활용성을 연구함으로서 그 동안 농업분야에만 편중되어온 실용화와 더불어 축산분야에 활용하려함이 본 발명의 목적이라 하겠다.

본 발명은 BT 균을 내생포자를 형성함과 동시에 파리 유충에 살충력을 나타내는 내독소의 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 사용한 BT 균주인 케시시엠(KCCM) 11579는 한국종균협회로부터 분양을 받았다. BT균의 기본적 특성을 알아보기 위해 다음과 같은 실험을 하였다.

① BT의 형태적 관찰

그람염색을 실시함으로서 그람양성임을 관찰하였으며 전자현미경을 이용 균의 형태적 특징을 관찰하였다. 이 실험에서 그람양성과 간균의 형태를 균이 가지고 있음을 확인하였다.

② 생장경향 관찰

여러 내생포자 형성 액체배지 및 일반 영양액체 배지에 균을 접종하여 37℃에서 180rpm으로 교반배양기에서 12시간 배양 이후부터 일정시간의 간격으로 흡광도계(Spectrophotometer)를 이용 흡광도를 측정함으로서 각 배지에서의 균의 성장경향을 관찰하였다.

이 실험에서 일반 영양배지에서는 균의 빠른 성장과 대량증식이 관찰되었으며 기존 논문 등에 제시된 내생포자형성 액체배지 내에서는 비교적 느린 성장과 낮은 증식이 관찰되었다.

③ 망간 무첨가 배지에서 배양된 균의 총균수 및 내생포자 형성균수 측정

성장경향 관찰에 사용하였던 배지에 균을 접종한 후 8시간, 12시간 16시간에 배양액을 희석 영양고체배지(Nutrient agar)에 도말한 후 37℃에서 12시간 배양 후 총균수를 측정하였으며 같은 시간대에 배양액을 100℃에서 10분간 가열 처리하여 영양세포를 사멸시킨 후 이를 다시 영양고체배지에 희석, 도말하여 내생포자 형성균의 수를 관찰하였다.

이 실험에서 영양액체배지(Nutrient broth)와 비에이치아이 액체배지(BHIbroth)에서 총균수 및 내생포자 형성 균수가 높게 관찰되었다.

④ 망간 첨가 배지에서 배양된 균의 총균수 및 내생포자 형성균수 측정

성장경향 실험과 망간 무첨가 배지에서의 총균수 및 내생포자 형성균수에서 좋은 결과를 얻은 영양액체배지와 비에이치아이 액체배지를 선택하여 이 두 액체배지에 균을 상기의 방법에서처럼 배양한 후 6시간, 12시간, 16시간에 각각 0.01, 0.1, 0.5, 1 중량% 망간을 첨가한 후 영양고체배지에 도말, 배양 후 균수를 측정하였으며 동시에 같은 처리구를 100℃에서 10분간 가열처리한 후 같은 방법으로 균수를 측정하였다.

이 실험에서 비가열 처리시 망간의 농도가 높을수록 균수는 적게 나타났으나 가열처리구에서는 망간의 농도가 높을수록 더 많은 균수가 측정되어 망간 첨가에 따라 내생포자가 효과적으로 형성되어 내열성을 제공하는 것을 알 수 있다.

⑤ BT균의 효소활성 측정

각종 유기물 분해도를 측정하기 위해 BT균의 자일란분해효소(xylanase), 단백질분해효소(protease), 섬유소분해효소(cellulase), 전분분해효소(α-amylase)의 효소활성도를 측정하였다. 효소의 활성이 우수할 경우 가축의 장관내에서 발아된 BT균주에 의해 사료의 분해력이 높아져 증체와 사료이용효율이 높아지며, 가축 분뇨에서 유기물 분해로 폐수처리가 용이하고 파리발생도 감소시킬 수 있다. 이 실험을 위해서 자일란(xylan) 1%, 탈지유(skim milk) 2%, 섬유소(carboxymethyl cellulose) 1%, 수용성 전분(soluble starch) 1%를 기질로 하여 각각 영양고체배지와 혼합하여 고체배지를 만들고 균 접종부위에 생긴 투명대를 관찰하여 효소활성도를 측정하였다.

본 실험 결과 각종 분해효소의 생산량이 높은 것으로 관찰되었다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 살펴보지만 하기 예에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다. 하기 실시예에서 단위 "%"는 별도의 언급이 없는 한 "중량%"를 의미한다.

실시예 1

BT의 형태적 관찰

그람염색과 전자현미경을 이용한 BT균의 형태를 관찰하는데 필요한 BT균의 배양을 위해 영양액체배지(Nutrient Broth)를 준비한다. 이때 바실러스 균주가 호기성임을 감안하여 플라스크와 실리콘마개를 배지와 함께 고온고압 멸균시킨 다음 접종에 적당한 37℃ 정도가 되면 플레이트상의 콜로니를 1 백금정도를 취하여 접종한 후 37℃ 180rpm의 교반배양기에서 12시간 동안 배양하였다. 균배양액을 이용하여 그람 염색을 하여 BT균이 그람양성임을 확인하고 주사 전자현미경을 통한 BT의 형태를 관찰하여 단간균임을 관찰하였다.

실시예 2

생장경향 관찰

BT균의 각각 다른 배지에서의 성장경향을 파악하기 위하여 표 1과 같은 배지를 50㎖씩 준비하였다. 준비된 액체배지에 균 배양액을 50㎕씩 취하여 접종한 후 37℃, 180rpm에서 배양하면서 일정한 시간에 각각의 배지에서 1㎖를 취하여 590nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 균의 성장도를 관찰하였다. 이때 바실러스의 빠른성장을 감안하여 유도기(lag phase)때는 1시간 간격으로 흡광도를 측정하였다.

이 실험 결과 영양배지(NB), 비에이치아이 배지(BHI), 피와이지 배지(PYG)에서 높은 성장률을 나타내었다.

실시예 3

망간 무첨가 배지에서 배양된 균의 총균수 및 내포자 형성균수 측정

균의 성장에 있어 배지3, 배지4 배지에서의 균의 성장은 매우 느리게 나타남에 따라 이 두 배지는 이번 실험에서부터는 제외를 시키고 나머지 배지를 100㎖씩 각각 준비한 다음 준비된 배지에 100㎕의 균 배양액을 접종, 배양하면서 8시간, 12시간, 16시간 세 번에 걸쳐 총균수 및 내생포자 형성균의 수를 측정하였다. 접종 후 배양을 실시하면서 정해진 시간에 각각의 배지에서 3㎖씩을 취하여 시험관에 넣었으며, 3㎖ 중 100㎕를 뽑아 0.5% 펩톤수 9.9㎖에 희석하여 십진 희석법에 따라희석하여 영양고체배지에 도말하였다. 나머지 균 배양액은 100℃에서 10분간 가열 처리한 다음 가열 처리한 균 배양액을 위와 같은 절차에 따라 영양고체배지에 도말하였다.

실험 결과 영양배지와 비에이치아이 배지에 있어서 총 균수 및 내생포자형성 균수 두 부분 모두에서 좋은 결과가 얻어졌다.

실시예 4

망간 첨가 배지에서 배양된 균의 총균수 및 내생포자 형성균수 측정

본 실험은 망간을 균이 최고의 성장을 보일 때 망간을 첨가함으로서 내생포자를 형성하기 좋은 조건을 형성하여 많은 양의 내독소를 생산하기 위함이다. 상기실험에서 좋은 결과를 보여 준 영양배지와 비에이치아이 배지만을 본 실험에서는 사용하였다. 100㎖의 두 배지에 100㎕의 균 배양액을 접종한 후 망간 무첨가시와 마찬가지로 균주 접종 후 배양 8시간, 12시간, 16시간 세 번에 걸쳐 균 배양액 5㎖를 취하여 시험관에 넣고 망간을 0.01%, 0.1%, 0.5%, 1%를 각각 첨가한 후 37℃, 90rpm으로 교반 배양기에서 20분간 처리하였다. 처리 후 준비된 펩톤수에 십진법에 따라 희석하여 영양고체배지에 도말, 총균수 및 내생포자 형성균의 수를 측정하였다. 나머지 배양액은 100℃에서 10분간 온탕기에서 가열처리 한 후 같은 방법으로 균수를 측정하였으며, 이때 5㎖의 균배양액에 첨가되는 망간의 양이 매우 극소량이므로 표 3과 같은 방법으로 희석하여 첨가하였다.

본 실험결과 표 4에 나타난 바와 같이 망간 처리 후 총균수에 있어서는 영양 배지와 비에이치아이 배지 모두 1.0×10⁷CFU/ml 이상으로 망간 처리에 의해 균의 성장에 별다른 저해를 받지 않았으며, 망간 처리 후 가열처리에 의해 내생포자 형성된 균수만을 측정한 결과 영양배지 비에이치아이 배지보다 내생포자 형성율이 높았으며, 망간의 첨가수준이 증가함에 따라 내생포자 균수도 증가함을 나타내고 있다. 또한 망간 첨가 시간을 검토한 결과 배양 16시간 후 망간처리에 의해 내생포자 생성율이 높은 것으로 나타났다.

실시예 5

BT균의 효소활성 측정

BT균을 먼저 영양고체배지에 37℃에서 12시간동안 계대배양 한 다음 각각의 기질을 함유한 배지에 균주를 1 백금이씩 그어 자일란 분해효소(xylanase), 단백질분해효소(protease), 섬유소 분해효소(cellulase), 전분 분해효소(α-amylase)의 효소 활성을 측정하였다. 효소활성을 측정하는데 자일란 분해효소는 1%의 오트스펠트 자일란(oat spelt xylan)을 함유한 영양고체배지 상에서, 단백질 분해효소 측정은 2% 탈지분유를 함유한 영양고체배지 상에서 37℃에서 8시간 배양 후 투명대의 생성 및 크기로 파악하였고, 섬유소 분해효소는 카르복시메틸셀룰로스 1%를 함유한 영양고체배지 상에서 배양 후 0.2% congo red 용액으로 염색 후 1M NaCl을 이용하여 씻어내어 투명대 생성 및 크기를 파악하였으며α-amylase의 경우에는 수용성 전분 1%를 함유한 영양고체배지 상에서 배양 후 0.2% 요오드와 2% 요오드화칼륨(KI)을 함유한 용액으로 염색하여 투명대의 생성 및 크기를 통해 각각의 효소활성도를 측정하였다. 투명대의 크기는 균이 증식된 부분의 폭과 투명대의 폭의 길이를 측정한다. 실험 결과 섬유소 분해효소를 제외하고는 효소 활성도가 높게 나타났으며, 특히 자일란 분해효소 활성이 특히 높게 나타나 난분해성 섬유소인 자일란 분해효과가 우수하여 사료의 이용효율 제고에 크게 기여할 것으로 나타났다.

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Claims (1)

1. 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis) 제제를 제조함에 있어서, 바실러스 츄린겐시스 균을 영양배지(nutrient broth)에 접종한 다음 37℃의 교반배양기에서 정지기인 13~16시간동안 배양 후 망간 1.0중량%를 첨가하여 내열성의 내생포자 형성 및 이에 따른 내독소를 형성함을 특징으로 하는 파리유충 살충용 바실러스 츄린겐시스 균제제의 제조방법.