KR100403570B1 - 효소적 방법에 의한 진세노사이드 ｆ₂의 제조방법 - Google Patents

효소적 방법에 의한 진세노사이드 ｆ₂의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 효소적 방법에 의한 진세노사이드 F2의 제조방법에 관한 것이다.
진세노사이드 F2는 고려인삼의 뿌리에는 함유되어 있지 않으나, 고려인삼 잎에 0.2%, 미국삼의 뿌리에 0.018%, 전칠삼의 꽃눈에 0.1%, 히말리야삼의 뇌두에 0.02% 함유하고 있으며, 종양세포에 대한 증식억제, 종양세포나 세균에서 나타나는 다제내성을 반전시키는 효과 등이 있는 것으로 알려져 있으나 다량의 시료를 얻기가 어려운 실정이다.
본 발명의 진세노사이드 F2는 인삼사포닌의 장내세균에 의한 대사산물로서 인삼 성분중에서 함량이 많고 분리하기가 용이한 다이올계 사포닌을 효소적 방법으로 구조전환시켜 진세노사이드 F2를 대량으로 제조하는 방법에 관한 것이다. 진세노사이드 F2는 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, 이들의 혼합물 또는 이들이 함유된 추출물을 완충용액 중에서 아스퍼질러스(Aspergillus)속 미생물에서 분리한 효소인 락타제, 셀룰라제, 베타-갈락토시다제 또는 비스코자임엘과 반응시키면 간단하게 진세노사이드 F2를 고수율로 얻을 수 있다.
본 발명의 진세노사이드 F2는 종양세포 증식억제, 종양세포나 세균에서 나타나는 다제내성을 반전시키는 등 여러 가지 유효한 효능이 있으므로 치료제로 제공될 수 있다.

Description

효소적 방법에 의한 진세노사이드 Ｆ₂의 제조방법{Method for the Production of Ginsenoside F2 by Enzymatic Process}
본 발명은 인삼으로부터 효소적 방법에 의하여 20(S)-프로토파낙사다이올-3-0-베타-디-글루코피라노시도-20-0-베타-디-글루코피라노사이드(20(S)-protopanaxadiol-3-O-β-D-glucopyranosido-20-O-β-D-glucopyranoside, 이하 진세노사이드 F2라고 약칭함)의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 고려인삼종의 뿌리에는 함유되어 있지 않고 고려인삼 잎에 0.2%, 미국삼 뿌리에 0.018%, 중국 전칠삼의 꽃눈에 0.1%, 히말리야삼의 뇌두에 0.02% 함유하고 있으며, 인삼사포닌의 장내세균에 의한 대사산물로서 여러가지 우수한 효능을 지니고 있는 것으로 밝혀져 있는 진세노사이드 F2의 새로운 제조방법에 관한 것이다. 즉 인삼에 다량 함유되어있고, 분리하기가 용이한 주요 다이올형 사포닌을 효소적인 방법으로 구조전환시켜 장내 대사산물인 진세노사이드 F2를 간단하게 대량 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 인삼의 다이올형 사포닌으로부터 효소적 방법에 의하여 다음 일반식(Ⅰ)으로 표시되는 20(S)-프로토파낙사다이올-3-0-베타-디-글루코피라노시도-20-0-베타-디-글루코피라노사이드를 제조한다.
(Ⅰ)
상기 일반식(Ⅰ)의 진세노사이드 F2는 종양세포에 대한 증식억제, 종양세포나 세균에서 나타나는 다제내성을 반전시키는 효과 등이 있는 성분으로 이미 알려져 있다(한국생약학회지 28(1), 35, 성종환 등, 1997년).
인삼 특유의 약리활성 사포닌인 진세노사이드 유도체들은 다마란계의 트리테르페노이드인 프로토파낙사다이올 또는 프로토파낙사트라이올에 글루코스, 람노스, 아라비노스 또는 자일로스와 같은 당류가 결합한 화합물들로서 현재까지 고려인삼에서 약 34종의 유도체들이 밝혀져 있다. 또한 인삼 사포닌은 아글리콘에 결합되어있는 당의 종류나 결합된 당류의 수 또는 결합위치에 따라 약리효능이 각각 다르다는 것이 이미 밝혀져 있으며, 인삼 중 함량이 많고 분리하기가 용이한 주요 사포닌의 약리효능에 대해서는 많은 연구가 수행되었으나, 미량 사포닌의 약리효능에 관한 연구는 극히 적은 편이다.
본 발명의 진세노사이드 F2의 분포는 고려인삼 잎에 0.2%, 미국삼의 뿌리에 0.018%, 전칠삼의 꽃눈에 0.1%, 히말리야삼의 뇌두에 0.02% 함유하고 있는 것으로 알려지고 있다(아시아산 Panax속 식물의 화학적 연구, 森田俊信, 1986년). 인삼의 사포닌을 경구 투여하게 되면 장내세균, 특히 프레보텔라리스(Prevotellaris) 의해 대사되어 흡수되며 이들 대사산물이 인삼사포닌의 약효를 나타내는 체내 매개물임이 밝혀져 있다(The Ginseng Review 10, Kobayashi 등, 1994년). 진세노사이드 F2는 효능실험을 통하여 종양세포 증식억제, 종양세포나 세균에서 나타나는 다제내성을 반전시키는 등 여러 가지 유효한 효능이 있는 것으로 밝혀지고 있으나 고려인삼종 뿌리에는 함유되어 있지 않고, 인삼사포닌을 섭취할 경우 장내 대사산물로서 그 수율도 낮아 일시에 다량의 시료를 얻기가 어려운 실정이다.
인삼 사포닌중 다이올계 사포닌은 함량이 높고 진세노사이드 Rd로 구조전환될 수 있는 구조를 갖고 있어 효소적 방법으로 다이올계 사포닌을 구조전환시켜 진세노사이드 Rd를 고수율로 얻을 수 있는 방법을 밝혀 특허출원한 바 있다(대한민국 특허출원 제16212호, 1998년). 한편 진세노사이드 F2는 프로토파낙사다이올 사포게닌의 C3와 C20위치에 글루코스 한분자씩 각각 결합된 성분으로 진세노사이드 Rd 성분의 C20위치에 결합된 글루코스 한 분자는 그대로 두고 C3위치에 결합된 글루코스 두 분자중 말단 글루코스 한분자를 선택적으로 절단할 경우 진세노사이드 F2로 전환된다는 점에 착안하여 본 연구를 수행하게 되었다.
홍삼에만 함유되어 있는 미량 사포닌인 진세노사이드 Rh1이나 Rh2를 제조하는 방법으로서 산 가수분해법이 개발되어 있으나 (대한민국특허 제82730호 : 대한민국특허 제186757호) 진세노사이드의 아글리콘 C20위치의 배당체 결합을 분해하기 때문에 산 가수분해법으로 프로토파낙사다이올의 C3와 C20위치에 글루코스가 각각 1분자 결합된 형태인 진세노사이드 F2를 제조하기는 어렵다.
종래 진세노사이드 F2의 제조방법으로는 진세노사이드 Rb2표준품 500㎎을 효소 나린지나제로 가수분해시켜 컴파운드 오, 와이, 케이(compound O, Y, K)와 함께 진세노사이드 F2115㎎을 분리하였고, 진세노사이드 Ra1200㎎을 효소 나린지나제와 반응시켜 컴파운드 K, Mc와 함께 F22.6㎎을 분리 제조한 바 있다(Chem. Pharm. Bull. 30(7), 2393, Koizumi 등, 1982년). 또한 Rb2300㎎을 쥐에 경구투여후 대장에서 분해산물로 생성되는 진세노사이드 F2를 5㎎ 제조한 바 있다 (Chem. Pharm. Bull. 38(10). 2859, Karikura 등, 1990년). 이와 같이 진세노사이드 F2는 생성수율이 극히 낮을 뿐만 아니라 여러가지 2차 대사산물이 생성되기 때문에 진세노사이드F2를 고순도로 정제하는데 어려움이 있다.
본 발명은 인삼에 다량 함유되어 있는 주요 다이올계 사포닌인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd 및 이들의 혼합물 또는 다이올계 사포닌 함량이 높은 각종 인삼 추출물을 효소적 방법으로 구조전환시켜 진세노사이드 F2를 간단히 대량으로 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 본 발명의 진세노사이드 F2의 구조식이다.
본 발명에서는 인삼의 주요 다이올계 사포닌인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd 또는 이들의 혼합물을 수성용매 또는 수성용매와 유기용매의 혼합액 중에서 아스퍼질러스(Aspergillus)속에서 분리한 락타제(Lactase), 아스퍼질러스(Aspergillus)속에서 분리한 셀룰라제(Cellulase), 아스퍼질러스(Aspergillus)속에서 분리한 베타-갈락토시다제(β-galactosidase) 또는 아스퍼질러스(Aspergillus)속에서 분리한 비스코자임엘(Viscozyme L)과 반응시키면 단기간 내에 아글리콘 C3위치의 글루코스 한 분자와 C20위치에서 글루코스 1분자를 제외한 나머지 배당체 결합이 용이하게 절단되어 다음의 일반식(Ⅰ)으로 표시되는 진세노사이드 F2가 고수율로 생성된다.
보다 상세하게는 효소적 방법에 의한 진세노사이드 F2의 제조방법은 인삼의 다이올계 사포닌을 수성용매 또는 수성용매와 유기용매의 혼합액중에 용해시켜 아스퍼질러스(Aspergillus)속에서 분리한 효소를 첨가하여 가온 상태의 수욕조상에서 교반하면서 반응시키는 단계와,
반응액을 박층크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여 기질이 완전히 소실되면 열수중에서 가열하여 반응을 종료시키는 단계와,
전기의 반응액을 이온교환 수지를 충진한 컬럼에 흡착시킨 후 당류와 효소는 증류수로 세척하여 제거하는 단계와,
반응생성물은 유기용매로 용출한 후 농축시켜 진세노사이드 F2가 고농도로 함유된 분말상 반응생성물을 얻는 단계를 포함하여 다음의 일반식(Ⅰ)으로 표시되는 화합물을 얻는 것을 특징으로 한다.
상기에서 다이올계 사포닌은 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd 또는 다이올계 사포닌 혼합물중에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다.
(Ⅰ)
본 발명에 사용되는 수성용매로는 물, 초산, 시트레이트, 인산 또는 시트레이트-인산의 완충용액과 같이 효소의 활성을 저하시키지 않는 것을 사용하는 것이 좋다. 가장 바람직한 수성용매로는 pH 4∼8, 특히 pH 4∼6범위의 완충용액이 바람직하다. 전술한 수성용매는 단독으로 사용할 수도 있으나 다른 수성용매 및 유기용매와 혼합하여 사용할 수도 있는데, 혼합하여 사용할 수 있는 유기용매는 물과 혼화되면서 효소의 활성을 저하시키지 않는 것이어야 한다. 바람직한 유기용매로는 아세토니트릴, 디옥산, 디메틸 설폭사이드, 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올 등이 있으며, 유기용매의 사용량은 사용한 기질을 기준으로 1∼50% 농도, 특히 2∼30% 농도가 되도록 하거나 또는 수성용매와 같이 사용하는 경우 수성용매 중량을 기준으로 40% 이하로 사용하는 것이 반응생성물의 생성수율 증대 측면에서 바람직하다.
반응온도는 효소의 불활성화가 일어나지 않는 온도조건이어야 하는데, 수성용매만을 사용하는 경우는 60℃ 이하가 바람직하고, 수성용매와 유기용매의 혼합액을 사용하는 경우는 50℃ 이하가 바람직하다. 전체적인 온도는 10∼50℃으로 유지하는 것이 좋다.
본 발명에 사용되는 반응시간 역시 효소의 활성이 유지되는 기간이라면 특별히 제한을 받지 않으나 1∼72시간, 바람직하게는 효소의 활성이 활발하게 유지되는 24∼48시간이 적당하다.
본 발명에 의한 진세노사이드 F2제조방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd 또는 이들의 혼합물 및 이들의 함유비율이 높은 인삼 추출물을 수성용매 또는 수성용매와 유기용매의 혼합비가 19:1∼5:1인 혼합액에 용해시키고 미생물 아스퍼질러스(Aspergillus)속에서 유래한 락타제, 셀룰라제, 베타-갈락토시다제 또는 비스코자임엘을 가하고 20∼60℃에서 1∼72시간 반응시킨 후 비등 수욕조에서 2∼15분간 가열하여 효소를 불활성화시켜 진세노사이드 F2가 다량 함유된 반응액을 얻는다. 이와 같은 효소적 방법에 의하면 종래에는 고순도의 진세노사이드 표준품을 효소 나린지나제와 반응시켜 제조하거나 또는 사포닌의 장내 대사산물로부터 분리 제조하여 얻었으나, 본 방법에서는 반응의 기질인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd 등을 고순도의 순품으로 분리해야 하는 어려운 과정을 거치지 않고 사포닌 혼합물을 아스퍼질러스(Aspergillus)속에서 분리한 효소 락타제, 아스퍼질러스속에서 분리한 효소 셀룰라제, 아스퍼질러스속에서 분리한 효소 베타-갈락토시다제 또는 아스퍼질러스(Aspergillus)속에서 분리한 효소 비스코자임엘과 반응시키면 단기간내에 진세노사이드 F2만이 주로 생성되기 때문에 분리하기가 용이한 장점이 있다. 본 발명에 의해 제조된 생성물은 다음과 같은 물리화학적 성상을 나타내어 이를 진세노사이드 F2로 동정하였다.
진세노사이드 F 2 의 물리화학적 성상
성상 : 백색 무정형 분말(부탄올)
녹는점 : 186-188℃
[alpha]D 20: ＋29.6°(c=1.01, MeOH)
Rf 값 : 키젤겔 60 F254박층크로마토그래피를 이용하여 클로로포름-메탄올-물(=65:35:10, 아래층)으로 전개하였을 때 0.49
고속원자 충격 질량 스펙트럼(positive) : m/z 807.4〔M++Na〕+
수소 핵자기공명 스펙트럼(δ) : 4.92(1H, d, J=7.02 Hz, 베타-아노머릭) , 5.17(1H, d, J=7.27 Hz, 베타-아노머릭)
탄소 핵자기공명 스펙트럼(δ) : 15.8, 16.1, 16.6, 17.1, 17.6, 18.2, 22.3, 23.1, 25.6, 26.4, 26.5, 27.9, 29.8, 30.6, 34.9, 35.8, 36.7, 38.9, 39.5, 39.8, 49.5, 49.9, 51.2, 51.5, 56.1, 62.5, 62.8, 70.1, 71.3, 71.7, 75.0, 75.6, 78.1, 78.5, 79.0, 79.6, 83.1, 88.6, 98.1, 106.7, 125.7, 130.8
이하 본 발명을 실시 예에 의하여 상세히 설명하면 다음과 같다. 다만, 이들 실시예가 본 발명의 기술적 범위를 한정하는 것은 아니다.
＜실시예 1＞
진세노사이드 Rb11g을 0.1M 초산 완충용액(pH 4.5)에 용해시켜 전체를 50㎖로 정용한 다음 여기에 아스퍼질러스(Aspergillus)속에서 분리한 락타제 3g을 첨가하여 37℃ 수욕조상에서 교반하면서 48시간 반응시킨다. 박층크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여 기질이 완전히 소실되면 열수중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 다음 다이아이온 HP-20 수지를 충진한 컬럼에 흡착시킨 후 당류와 효소는 증류수로 세척하여 제거하고 반응생성물은 에탄올로 용출후 농축시켜 진세노사이드 F2가 90% 이상 함유된 분말상 반응생성물을 얻었다.
＜실시예 2＞
진세노사이드 Rb21g을 인산 완충용액(pH 4.8)에 용해시켜 전체를 50㎖로 정용한 다음 아스퍼질러스(Aspergillus)속에서 분리한 베타-갈락토시다제 3g을 첨가하여 45℃ 수욕조상에서 교반하면서 72시간 반응시킨다. 반응액은 열수중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 다음 수포화 부탄올로 추출후 감압농축한다. 농축액은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름-메탄올=9:1)에 의해 진세노사이드 F2554㎎을 얻었다.
＜실시예 3＞
진세노사이드 Rc 1g을 0.1M 초산 완충용액(pH 4.5)에 용해시켜 전체를 50㎖로 정용한 다음 여기에 아스퍼질러스(Aspergillus)속에서 분리한 셀룰라제 3g을 첨가하여 37℃ 수욕조상에서 교반하면서 48시간 반응시킨다. 박층크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여 기질이 완전히 소실되면 열수중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 다음 다이아이온 HP-20 수지를 충진한 칼럼에 흡착시킨 후 당류와 효소는 증류수로 세척하여 제거하고 반응생성물은 에탄올로 용출후 농축시켜 진세노사이드 F2가 90% 이상 함유된 분말상 반응생성물을 얻었다.
＜실시예 4＞
진세노사이드 Rd 1g을 인산-시트레이트 완충용액(pH 5.0)에 용해시켜 전체를 50㎖로 정용한 다음 여기에 아스퍼질러스(Aspergillus)속에서 분리한 비스코자임엘 4g을 첨가하여 40℃ 수욕조상에서 교반하면서 72시간 반응시킨다. 반응액은 열수중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 다음 수포화 부탄올로 추출, 농축하여 분말상의 반응생성물 760㎎을 얻었다. 농축액은 실리카겔 컬럼크로마토그래피(클로로포름-메탄올-물=70:30:5)와 역상 RP-8 컬럼 크로마토그래피(85% 메탄올)로 분리하여 진세노사이드 F2525㎎을 얻었다.
＜실시예 5＞
진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd의 혼합물 1g을 시트레이트 완충용액(pH 5.0)에 용해시켜 전체를 50㎖로 정용한 다음 아스퍼질러스(Aspergillus)속에서 분리한 락타제 4g을 첨가하여 50℃ 수욕조상에서 교반하면서 72시간 반응시킨다. 반응액은 열수중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 다음 수포화 부탄올로 추출, 농축한다. 농축액은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름-메탄올=9:1)에 의해 진세노사이드 F2545 mg을 얻었다.
＜실시예 6＞
다이올계 사포닌이 주로 함유된 인삼근에서 분리한 조사포닌 분획 1g을 인산 완충용액(pH 4.5)에 용해시켜 전체를 50㎖로 정용한 다음 여기에 아스퍼질러스(Aspergillus)속에서 분리한 베타-갈락토시다제 3g을 첨가하여 42℃의 수욕조상에서 교반하면서 48시간 반응시킨다. 반응액은 열수중에서 가열하여 반응을 종료시킨 다음 수포화 부탄올로 추출 후, 감압 농축한다. 농축액은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름-메탄올=9:1)에 의해 진세노사이드 F2436mg을 얻었다.
＜실시예 7＞
인삼 추출엑스 1g을 물에 용해시켜 전체를 50㎖로 정용한 다음 여기에 아스퍼질러스(Aspergillus)속에서 분리한 셀룰라제 4g을 첨가하여 37℃에서 48시간 반응시킨다. 반응액은 열수중에서 가열하여 효소를 불활성화시킨 다음 다이아이온 HP-20 수지를 충진한 컬럼에 흡착시킨 후 증류수로 세척하여 당류와 효소류를 제거하고 반응생성물은 에탄올로 용출후 농축시켜 진세노사이드 F2가 70% 이상 함유된 분말상 반응생성물을 얻었다.
상기 실시예처럼 본 발명자들은 효소적 방법에 의해 인삼중에 함량이 높은 다이올계 사포닌으로부터 진세노사이드 F2의 제조법 개발을 목적으로 각종 미생물에서 분리한 효소를 사용하여 다각적인 시험을 실시한 결과 아스퍼질러스(Aspergillus)속에서 분리한 락타제, 아스퍼질러스(Aspergillus)속에서 분리한 셀룰라제, 아스퍼질러스(Aspergillus)속에서 분리한 베타-갈락토시다제 및 아스퍼질러스(Aspergillus)속에서 분리한 비스코자임엘을 진세노사이드 Rb1,Rb2, Rc, Rd 또는 이들의 혼합물과 반응시켰을 때 제조수율 85% 이상의 고수율로 진세노사이드 F2를 생성할 수 있다.

Claims (8)

  1. 인삼의 다이올계 사포닌을 수성용매 또는 수성용매와 유기용매의 혼합액중에 용해시켜 효소로서 아스퍼질러스(Aspergillus)속에서 분리한 셀룰라제 또는 아스퍼질러스속에서 분리한 비스코자임엘을 첨가하여 가온 상태의 수욕조상에서 교반하면서 반응시키는 단계와,
    반응액을 박층크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여 기질이 완전히 소실되면 열수중에서 가열하여 반응을 종료시키는 단계와,
    전기의 반응액을 이온교환 수지를 충진한 컬럼에 흡착시킨 후 당류와 효소는 증류수로 세척하여 제거하는 단계와,
    반응생성물은 유기용매로 용출한 후 농축시켜 진세노사이드 F2가 함유된 분말상 반응생성물을 얻는 단계를 포함하여 다음의 일반식(Ⅰ)으로 표시되는 화합물을 얻는 것을 특징으로 하는 효소적 방법에 의한 진세노사이드 F2의 제조방법.
    (Ⅰ)
  2. 제1항에 있어서, 다이올계 사포닌은 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd 또는 이들의 혼합물중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 효소적 방법에 의한 진세노사이드 F2의 제조방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 효소반응은 10∼50℃ 범위에서 반응시키는 것을 특징으로 하는 효소적 방법에 의한 진세노사이드 F2의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 유기용매는 아세토니트릴, 디옥산, 디메틸 설폭사이드, 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 효소적 방법에 의한 진세노사이드 F2의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 수성용매는 물, 초산, 시트레이트, 인산 또는 시트레이트-인산의 완충용액중에서 선택된 어느 하나를 유기용매와 혼합시켜 pH 4∼8의 범위로 사용하는 것을 특징으로 하는 효소적 방법에 의한 진세노사이드 F2의 제조방법.
  8. 삭제
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