KR100388256B1 - 재구성 인간 항에이치엠 1.24 항체 - Google Patents

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Abstract

(A)(1) 인간 L쇄 C영역 및
(2) 인간 L쇄 FR와 마우스 항-HM 1.24 모노클로날 항체의 L쇄 CDR을 함유하여서 되는 L쇄 V영역으로 이루어진 L쇄, 그리고
(B)(1) 인간 H쇄 C영역 및
(2) 인간 H쇄 FR과 마우스 항-HM 1.24 모노클로날 항체의 H쇄 CDR을 함유하여서 되는 H쇄 V영역으로 이루어진 H쇄를 함유하여서 되는 재구성 인간 항HM 1.24 항체.
대부분의 상기 재구성 인간 항체는 인간 항체로부터 유래하고 CDR은 낮은 항원성을 갖기 때문에, 본 발명의 재구성 인간 항체는 낮은 항원성을 갖고, 그로 인하여 의학 치료용으로 사용되는 것이 예상된다.

Description

재구성 인간 항에이치엠 1.24 항체{Reconstituted Human Anti-HM 1.24 Antibody}
인간 B 세포는 발현하고 있는 표면 항원의 종류에 기초해서 분류되는 몇 개의 공정을 거쳐서 최종적으로 항체 생산 형질 세포로 성숙한다. B세포의 최종 분화 단계에서는, 한편으로 세포질 면역글로불린 생산능을 획득하고, 다른 한편으로는 세포 표면 면역글로불린, HLA-DR, CD20, Fc리셉터, 보체 C3리셉터 등의 B세포 관련 항원이 소실한다(Ling, N.R. et al, Leucocyte TypingⅢ(1986) p320, Oxford, UK. Oxford).
이제까지, 형질세포의 세포막상의 항원을 인식하는 항 PCA-1(Anderson, K.C. et al., J. Immunol. (1983) 130, 1132), 항 PC-1(Anderson, K.C. et al., J. Immunol. (1983) 132, 3172), 항 MM4(Tong, A.W. et al., Blood (1987) 69, 238) 등의 모노클로날 항체가 보고되어 왔었다. 그러나, 형질 세포와 골수종 세포의 검출에는 여전히 항 CD38 모노클로날 항체가 사용되고 있다. (Epstein, J. et al., N. Engl. J. Med. (1990) 322, 664, Terstappen, L.W.M.M. et al., Blood (1990) 76, 1739, Leo, R. et al., Ann. Hematol. (1992) 64, 132, Shimazaki, C. et al., Am J. Hematol. (1992) 39, 159, Hata, H. et al., Blood (1993) 81, 3357, Harada, H. et al., Blood (1993) 81, 2658, Billadeau, D. et al., J. Exp. Med. (1993) 178, 1023).
그러나, 항 CD38 모노클로날 항체는 B세포의 분화에 관련하는 항원보다 오히려 T세포의 활성화에 관련하는 항원이고, B세포 이외의 여러가지 세포상에도 발현한다. 또한, CD38은 림포플라스마 사이토이드(lymphoplasmacytoid)의 일부에 발현하지 아니할지라도, 조혈전구세포상에 강하게 발현하고 있다. 이러한 이유로, 항 CD38 모노클로날 항체는 인간 B 세포의 분화 및 성숙에 관한 연구 및 형질 세포의 질환의 치료에 적합하지 않은 것으로 생각된다.
고또, 티.(Goto, T.)등은 B세포계열에 특이적으로 발현하는 분자량 29 내지 33 kDa를 갖는 항원을 인식하는 마우스 항HM 1.24 모노클로날 항체를 보고하고 있다(Blood(1994) 84, 1922-1930). 항HM 1.24 모노클로날 항체에 의해 인식되는 항원이 B세포의 종말분화에 관련된 것이라고 생각되어지는 것(Goto. T. et al., Jpn. J. Clin, Immun. (1992) 16, 688-691) 및 형질세포종을 이식한 마우스에 항HM 1.24 모노클로날 항체를 투여함으로써 상기 항체가 종양에 특이적으로 집적하는 것(Shuji Ozaki et al., The Program of General Assembly of the 19th Japan Myeloma Study Meeting, genernal presentation 3)의 사실에서, 항HM 1.24 모노클로날 항체는 방사성 동위원소로 표지함으로써 종양국재(腫瘍局在)의 진단, 방사선 면역요법(radioimmunotherapy) 등의 미사일 요법(missile therapy)에 사용될 수 있는 것이 제안되고 있다.
또한, 상기 Blood에는 항HM 1.24 모노클로날 항체가 인간 골수종 세포주 RPMI 8226에 대해서 보체의존성 세포독성 활성을 갖는 것이 기재되어 있다.
골수종은 모노클로날 형질 세포(골수종 세포)의 골수내 집적을 특징으로 하는 종양성 질환이다. 골수종은 면역글로불린을 생산 및 분비하는 종말 분화 B세포,또는 형질 세포가 주로 골수에 모노클로날로 증가하는 질환이므로, 모노클로날 면역글로불린 또는 그의 구성성분인 L쇄(鎖) 또는 H쇄가 혈청 중에서 검출된다 (Masaaki Kosaka et al., Nippon Rinsho(1995) 53, 91-99).
종래에는 골수종의 치료로서 화학요법제가 사용되어 왔었지만, 골수종을 경감시킬 수 있고, 골수종 환자의 생존기간을 연장할 수 있는 유효한 치료제는 발견하지 못했다. 그러므로, 골수종의 치료효과를 갖는 약제의 출현이 오래동안 요구되고 있다.
마우스의 모노클로날 항체는 인간에 있어서 고도의 면역원성(종종 '항원성'으로 언급함)을 갖는다. 그리하여, 인간에 있어서 마우스 모노클로날 항체의 의학요법적 가치는 제한된다. 예를 들면, 마우스 항체를 인간에게 투여하면 이물질(異物質)로서 대사되므로, 인간에 있어서 마우스 항체의 반감기는 비교적 짧고, 그리하여 상기 마우스 항체의 기대된 효과를 충분히 발휘할 수 없다. 또한, 투여한 마우스 항체에 대해서 발생하는 인간 항 마우스 항체는 혈청병, 기타 알레르기성 반응 등, 환자에게 불리하고 위험한 면역응답을 야기한다. 그러므로, 마우스 모노클로날 항체를 인간에게 빈번하게 투여할 수 없다.
이들 문제를 해결하기 위하여, 비인간 유래 항체, 예를 들면 마우스 유래의 모노클로날 항체의 면역원성을 저감하는 방법이 개발되었다. 이와 같은 예의 하나로서, 항체의 가변영역(V영역)은 원래의 마우스 모노클로날 항체에서 유래하고, 불변영역(C영역)은 적당한 인간 항체에서 유래하는 키메라 항체를 생산하는 방법이 있다.
이와 같이 하여 얻어진 키메라 항체는 원래의 마우스 항체의 가변영역을 완전한 형으로 함유하므로, 원래의 마우스 항체와 동일한 특이성을 갖고 항원에 결합하는 것이 기대된다. 또한, 키메라 항체에 있어서, 인간 이외에서 유래하는 아미노산 서열의 비율이 실질적으로 감소하고, 그리하여 상기 키메라 항체는 원래의 마우스 항체에 비하여 면역원성이 낮은 것으로 기대된다. 키메라 항체는 원래의 마우스 모노클로날 항체와 동일한 방법으로 항원에 결합할 수 있고, 면역원성이 감소 되었지만 마우스 가변영역에 대하여 면역응답을 가질 수 있다 (LoBugio,A.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 4220-4224, 1989).
마우스 항체의 면역원성을 저감하는 제 2 방법은 더욱 복잡하지만, 마우스 항체의 잠재적인 면역원성을 더 크게 저감시킬 수 있다. 이 방법에서, 마우스 항체의 가변영역에서 상보성 결정영역(complementarity determining region(CDR))만을 인간 항체의 가변영역에 이식하여 재구성(reshaped) 인간 항체 가변영역을 제조한다.
그러나, 재구성 인간 항체 가변영역의 CDR의 구조를 보다 일층 원래의 마우스 항체의 구조에 가깝게 하기 위하여, 필요에 따라서, CDR를 지지하고 있는 프레임워크 영역(framework region(FR))의 아미노산 서열의 일부를 마우스 항체의 가변영역으로부터 인간 항체의 가변영역에 이식할 수 있다. 다음에, 인간형화 재구성 인간 항체의 V영역을 인간 항체의 불변영역에 연결한다. 최종적으로 재구성된 인간형화 항체에 있어서 인간 이외의 아미노산 서열로부터 유래하는 부분은 CDR, 및 FR의 일부만 아니다. CDR는 종특이성 서열을 나타내지 않는 초가변 아미노산 서열로 구성된다. 그러므로, 마우스 CDR를 담지하는 인간형화 항체는 인간 항체 CDR를 갖는 천연 인간 항체보다 강한 면역원성을 가져서는 안된다.
인간형화 항체에 대해서는 다음과 같은 문헌을 참조하기 바란다.
Riechmann, L. et al., Nature, 332, 323-327, 1988; Verhoeye, M. et al., Science, 239, 1534-1536, 1988; Kettleborough, C.A. et al., Protein Engng., 4, 773-783, 1991; Meada, H. et al., Human Antibodies and Hybridoma, 2, 124-134, 1991; Groman, S.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4181-4185, 1991; Tempest, P.R. et al., Bio/Technology, 9, 266-271, 1991; Co, M.S. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2869-2873, 1991; Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992; Co. M.S. et al., J. Immunol., 148, 1149-1154, 1992; and Sato K. et al, Cancer Res., 53, 851-856, 1993.
퀸(Queen) 등의 국제특허출원 공개번호 WO 90-07861호에는 항IL-2 리셉터 항체 항 Tac의 인간형화 항체를 제조하는 방법이 기재되어 있다. 그러나, 상기 WO90-07861호에 기재된 바와 같은 방법을 따르더라도 모든 항체를 완전히 인간형화 하는 것은 어렵다. 따라서, 상기 WO 90-07861호는 항체를 인간형화 하는 일반적인 방법을 기술하지 않고, 단지 항IL-2 리셉터 항체 중의 하나인 항 Tac 항체를 인간형화하는 방법을 기술하고 있다. 또한, WO 90-07861호의 방법을 완전히 따르더라도, 원래의 마우스 항체와 완전히 동일한 활성을 갖는 인간형화 항체를 제조하는 것은 어렵다.
일반적으로, 개별 항체의 CDR/FR의 아미노산 서열은 다르다. 그리하여, 인간형화 항체의 구조에 대체될 아미노산 잔기의 결정과, 이 아미노산 잔기를 대체하는 아미노산 잔기의 선택은 개별항체에 따라서 변한다. 그러므로, WO 90-07861호에 기재된 바와 같은 인간형화 항체의 제조방법은 모든 항체의 인간형화에 적용할 수 없다.
퀸 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA,(1989) 86, 10029-10033에는 WO 90-07861호의 것과 유사한 것이 기재되어 있다. 이 참고문헌에는 원래의 마우스 항체의 활성이 1/3만이 WO 90-07861호에 기재된 것과 같은 방법으로 제조한 인간형화 항체에 대해서 얻어졌다고 기재하고 있다. 바꾸어 말하면, 이것은 WO 90-07861호의 방법 자체는 원래의 마우스 항체의 것과 동일한 활성을 갖는 완전히 인간형화한 항체를 생산할 수 없는 것을 나타내 주고 있다.
코(Co) 등의 암 연구(1996) 56, 1118-1125는 상기 퀸 등의 무리에 의해 출판되었다. 이 참고문헌은 원래의 마우스 항체의 것과 동일한 활성을 갖는 인간형화 항체가 WO 90-07861호에 개재된 것과 같은 인간형화 항체의 제조방법으로도 구조될수 없음을 기재하고 있다. 따라서, WO 90-07861호 방법 자체는 원래의 마우스 항체와 동일한 활성을 갖는 완전히 인간형화한 항체를 생산할 수 없을 뿐만 아니라 WO 90-07861호에 기재된 것과 같은 인간형화 항체를 제조하는 방법은 모든 항체의 인간형화에 적용될 수 없다.
오토모(Ohtomo) 등의 분자 면역학(1995) 32, 407-416에는 마우스 ONS-M21 항체의 인간형화가 기재되어 있다. 이 참고 문헌은 WO 90-07861호에서 항 Tac 항체의 인간형화에 제안되었던 아미노산 잔기가 활성과 아무런 관계를 갖지 아니하고, WO 90-07861호에 기재된 것과 같은 방법이 적용될 수 없음을 나타내고 있다.
케틀보로우(Kettleborough) 등의 Protein Eng. (1991) 4, 773-783에는 아미노산 잔기를 치환시킴으로써 마우스 항체로부터 몇 개의 인간형화 항체가 제조되었음이 기재되어 있다. 그러나, WO 90-07861호에 기재된 항 Tac 항체의 인간형화 방법에서 제안되었던 것 보다도 더 많은 아미노산 잔기의 치환이 요구되었다.
상기 참고문헌은 WO 90-07861호에 기재된 인간형화 항체의 제조방법이 상기 문헌에 기재된 항 Tac 항체에만 적용할 수 있는 기술이고, 상기 기술을 사용할지라도 원래의 마우스 항체의 것과 같은 활성은 되지 못함을 나타내고 있다.
상기 문헌들에 기재된 원래의 마우스 항체는 WO 90-07681호에 기재된 항 Tac 항체의 것과 다른 아미노산 서열을 갖는다. 그리하여, 항 Tac 항체에 적용될 수 있는 인간형화 항체를 제조하는 방법은 다른 항체에 적용될 수 없다. 이와 비슷하게, 본 발명의 마우스 항HM 1.24 항체는 항 Tac 항체의 것과 다른 아미노산 서열을 가지므로, 항 Tac 항체의 인간형화 항체를 제조하는 방법은 적용될 수 없다. 또한,본 발명에서 성공적으로 제조된 인간형화 항체는 WO 90-07681호에 기재된 인간형화 항 Tac 항체의 것과 다른 아미노산 서열을 갖는다. 이 사실은 또한 동일한 방법이 다른 CDR-FR 서열을 갖는 항체의 인간형화에 적용될 수 없음을 나타내 주고 있다.
따라서, 인간형화용 원래의 마우스 항체가 알려졌다라도, 활성을 갖는 인간형화 항체의 CDR-FR 서열의 동일성을 시련과 실수를 거친 실험을 행한 후에만 확인되었다. WO 90-07681호는 본 발명에서 제조된 인간형화 항체에 화합된 FR 서열과, 활성 인간형화 항체가 CDR의 서열보다는 훨씬 적게, FR와의 혼합물로부터 얻어질 수 있는 사실에 관하여 전혀 언급하지 않고 있다.
상기한 바와 같이, 인간형화 항체는 요법목적에 유용한 것으로 예상되지만, 인간형화 항HM 1.24 항체는 알려지지 않았거나 또는 시준도 되어있지 않다. 또한, 인간형화 항체의 제조방법에 있어서 임의의 항체에 보편적으로 적용될 수 있는 표준화된 방법은 없으며, 특정의 항원에 대해서 충분한 결합활성, 결합저해활성 및 중화활성을 나타내는 인간형화 항체를 제조하기 위하여 여러가지의 연구가 필요하다 (예를 들면, Sato,K. et al., Cancer Res., 53, 851-856, 1993).
본 발명은 재구성 인간 항HM 1.24 항체 및 키메라 항HM 1.24 항체, 이들을 코드하는 유전자, 상기 항체의 제조방법 및 상기 항체의 사용에 관한 것이다. 본 발명의 재구성 인간 항체 및 키메라 항체는 골수종의 치료제 등으로서 유용하다.
도 1은 인간골수종 세포주 KPMM2를 사용하는 FCM 분석에 있어서, 키메라 항HM 1.24 항체의 형광강도가 대조 항체와 비교해서 마우스 항HM 1.24 항체의 형광강도와 같이 이동했음을 나타낸 그래프이다.
도 2는 WISH 세포를 사용하는 Cell-ELISA에 있어서, 키메라 항HM 1.24 항체는 마우스 항HM 1.24 항체와 같이, WISH 세포에 대한 비오티닐화 마우스 항HM 1.24 항체의 결합을 투여량 의존 방식으로 억제하는 것을 나타낸 그래프이다.
도 3은 대조 인간 IgG1 또는 마우스 항HM 1.24 항체가 세포독성을 갖지 않는 것에 반하여, 키메라 항HM 1.24 항체가 E/T의 비가 증가함에 따라 RPMI 8226 세포에 대하여 증가된 세포독성을 나타내는 것을 나타낸 그래프이다.
도 4는 PCR법에서 CDR 그래프팅(grafting)에 의한 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 L쇄 제조방법의 도해도이다.
도 5는 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 H쇄의 제조에 있어서 PCR법에 의해 RVH1, RVH2, RVH3 및 RVH4의 올리고뉴클레오티드를 어셈블링(assemblying)하는 방법을 나타낸 도해도이다.
도 6은 PCR법에 의해 인간·마우스 하이브리드 항HM 1.24 항체의 H쇄의 V영역을 제조하는 방법을 나타낸 도해도이다.
도 7은 PCR법에 의해 마우스·인간 하이브리드 항HM 1.24 항체의 H쇄의 V영역을 제조하는 방법을 나타낸 도해도이다.
도 8은 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 L쇄의 버전a가 키메라 항HM 1.24 항체의 것과 동일한 항원결합활성을 갖고, -1 및 -2는 롯트(lot)가 다른 것을 나타낸 그래프이다.
도 9는 L쇄의 버전a 및 H쇄의 버전 a,b,f 또는 h를 조합한 재구성 인간 항HM 1.24 항체 및 키메라 항HM 1.24 항체의 항원결합활성을 나타낸 그래프이다.
도 10은 L쇄의 버전b 및 H쇄의 버전 a,b,f 또는 h를 조합한 재구성 인간 항HM 1.24 항체, 및 키메라 항HM 1.24 항체의 결합활성을 나타낸 그래프이다.
도 11은 L쇄의 버전a 및 H쇄의 버전 a,b,f 또는 h를 조합한 재구성 인간 항HM 1.24 항체, 및 키메라 항HM 1.24 항체의 결합저해활성을 나타낸 그래프이다.
도 12는 L쇄의 버전b 및 H쇄의 버전 a,b,f 또는 h를 조합한 재구성 인간 항HM 1.24 항체, 및 키메라 항HM 1.24 항체의 결합저해활성을 나타낸 그래프이다.
도 13은 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 H쇄의 버전 a,b,c 및 d, 및 키메라 항HM 1.24 항체의 항원결합활성을 나타낸 그래프이다.
도 14는 재구성 인간 항HM1.24 항체의 H쇄의 버전 a 및 e, 및 키메라 항HM 1.24 항체의 항원결합활성을 나타내고, -1 및 -2는 롯트가 다른 것을 나타낸 그래프이다.
도 15는 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 H쇄의 버전 a,c,p 및 r, 및 키메라 항HM 1.24 항체의 결합저해활성을 나타낸 그래프이다.
도 16은 인간·마우스 하이브리드 항HM 1.24 항체, 마우스·인간 하이브리드항HM 1.24 항체 및 키메라 항HM 1.24 항체의 항원결합활성을 나타낸 그래프이다.
도 17은 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 H쇄 버전 a,b,c 및 f, 및 키메라 항HM 1.24 항체의 항원결합활성을 나타낸 그래프이다.
도 18은 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 H쇄 버전 a 및 g, 및 키메라 항HM 1.24 항체의 항원결합활성을 나타낸 그래프이다.
도 19는 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 H쇄 버전 a 및 g, 및 키메라 항HM 1.24 항체의 결합저해활성을 나타낸 그래프이다.
도 20은 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 H쇄 버전 h 및 i, 및 키메라 항HM 1.24 항체의 항원결합활성을 나타낸 그래프이다.
도 21은 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 H쇄 버전 f,h 및 i, 및 키메라 항HM 1.24 항체의 항원결합활성을 나타낸 그래프이다.
도 22은 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 H쇄 버전 h 및 i, 및 키메라 항HM 1.24 항체의 결합저해활성을 나타낸 그래프이다.
도 23은 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 H쇄의 버전 f,h 및 키메라 항HM 1.24 항체의 결하저해활성을 나타낸 그래프이다.
도 24는 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 H쇄의 버전 h,k,l.m.n 및 o, 및 키메라 항HM 1.24 항체의 항원결합활성을 나타낸 그래프이다.
도 25는 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 H쇄의 버전 a,h,p 및 q, 및 키메라 항HM 1.24 항체의 항원결합활성을 나타낸 그래프이다.
도 26은 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 H쇄 버전 h,k,l,m,n 및 o, 키메라항HM 1.24 항체의 WISH 세포에 대한 결합저해활성을 나타낸 그래프이다.
도 27은 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 H쇄 버전 a,h,p 및 q, 및 키메라 항HM 1.24 항체의 결합저해활성을 나타낸 그래프이다.
도 28은 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 H쇄 버전 a,c,p 및 r, 및 키메라 항HM 1.24 항체의 항원결합활성을 나타낸 그래프이다.
도 29는 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 버전 S가 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 버전 r과 동일한 항원결합활성을 갖는 것을 나타낸 그래프이다.
도 30은 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 버전 S가 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 버전 r과 동일한 결합저해활성을 갖는 것을 나타낸 그래프이다.
도 31은 정제 재구성 인간 항HM 1.24 항체가 키메라 항HM 1.24 항체의 것과 동일한 항원결합활성을 갖는 것을 나타낸 그래프이다.
도 32는 정제 재구성 인간 항HM 1.24 항체가 키메라 항HM 1.24 항체의 것과 동일한 결합저해활성을 갖는 것을 나타낸 그래프이다.
도 33은 키메라 항HM 1.24 항체의 투여가 인간 골수종 세포이식 마우스에 있어서 대조 인간 IgG1의 투여와 비교해서 생존기간의 연장을 일으켰음을 나타낸 그래프이다.
도 34는 건강한 인간의 말초혈액에서 유래한 세포를 이펙터 세포(effector cell)로 사용했을 경우, 대조 인간 IgG1은 KPMM2 세포에 대해서 전혀 세포독성을 나타내지 않고, 마우스 항HM 1.24 항체는 또한 약한 세포독성을 갖음에 반하여, 재구성 인간 항HM 1.24 항체는 KPMM2 세포에 대해서 강한 세포독성을 갖는 것을 나타낸 그래프이다.
도 35는 건강한 인간의 말초혈액에서 유래한 세포를 이펙터 세포로 사용했을 경우, 대조 인간 IgG1은 ARH-77 세포에 대해서 전혀 세포독성을 나타내지 않고, 마우스 항HM 1.24 항체는 또한 약한 세포독성을 갖음에 반하여, 재구성 인간 항HM 1.24 항체는 ARH-77 세포에 대해서 강한 독성을 갖는 것을 나타낸 그래프이다.
도 36은 SCID 마우스의 골수에서 유래한 세포를 이펙터 세포로 사용했을 경우, 대조 인간 IgG1은 KPMM2 세포에 대해서 전혀 세포독성을 나타내지 않는 것에 반하여, 재구성 인간 항HM 1.24 항체는 항체농도가 증가함에 따라서 KPMM2 세포에 대한 세포독성이 증가하는 것을 나타낸 그래프이다.
도 37은 인간 골수종 세포이식 마우스에 있어서, 혈청 IgG 인간농도는 대조 인간 IgG1 투여 전의 농도와 비교해서 투여 후에 증가한 반면에, 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 투여는 혈청인간 IgG 농도의 증가를 억제하는 것을 나타낸 그래프이다.
도 38은 인간 골수종 세포 이식 마우스에 있어서, 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 투여가 대조인간 IgG1의 투여와 비교해서 생존기간의 연장을 일으키는 것을 나타낸 그래프이다.
도 39는 인간 골수종 세포 이식 마우스에 있어서, 혈청인간 IgG 농도가 멜팔란(melphalan) 및 대조 인간 IgG1의 투여 전의 농도와 비교해서 투여 후에 증가한 반면에, 재구성 인간 항HM1.24 항체의 투여는 혈청 인간 IgG 농도의 증가를 억제하는 것을 나타낸 그래프이다.
도 40은 인간 골수종 세포이식 마우스에 있어서, 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 투여가 멜팔란 또는 대조인간 IgG1의 투여와 비교해서 생존기간의 연장을 일으키는 것을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 항HM 1.24 항체의 재구성 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 재구성 항체의 제조과정에서 유용한 인간/마우스 키메라 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 재구성 항체의 단편을 제공한다. 또한, 본 발명은 키메라 항체, 재구성 항체 및 이들의 단편의 제조용 발현계를 제공한다. 본 발명은 또한 항HM 1.24 항체의 키메라 항체 및 그의 단편의 제조방법, 및 항HM 1.24 항체의 재구성 항체 및 그의단편의 제조방법을 제공한다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 서열번호 103에 기재된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 키메라 항체 및 재구성 항체를 제공한다. 상기 폴리펩티드를 코드하는 cDNA는 pUC19벡터의 XbaI 분할 부위 사이에 삽입되어서 플라스미드 pRS38-pUC19로서 제조된다. 이 플라스미드 pRS38-pUC19를 함유하는 대장균은 부다페스트 조약의 규정에 의거, 1993년 10월 5일 국립공업기술원 생명공학공업기술연구소(일본국 이바라기현, 쯔꾸바시, 히가시 1쪼메 1반 3고)에 대장균 DH 5α(pRS38-pUC19)로서 기탁번호 FERM BP-4434로 국제기탁되었다 (일본국 특허공개 평 7-196,694호 참조).
이와 같은 키메라 항체 또는 재구성 항체의 한 구현예로서, 키메라 항HM 1.24 항체 또는 재구성 인간 항HM 1.24 항체를 언급한다. 키메라 항HM1.24 항체 또는 재구성 인간 항HM1.24 항체의 상세한 기재는 이하에 제시된다.
따라서, 본 발명은 또한 인간 경(L)쇄의 불변영역(C영역) 및 항HM 1.24 항체의 L쇄 가변영역(V영역)으로 이루어지는 키메라 L쇄, 및 인간 중(H)쇄의 불변영역 및 항HM 1.24 항체의 중(H)쇄의 V영역으로 이루어지는 키메라 H쇄를 제공한다.
본 발명은 또한,
(1) 인간 L쇄의 C영역 및 항HM 1.24 항체의 L쇄의 V영역으로 이루어지는 L쇄, 및
(2) 인간 H쇄의 C영역 및 항HM 1.24 항체의 H쇄의 V영역으로 이루어지는 H쇄로 구성되는 키메라 항체를 제공한다.
본 발명은 또한,
(1) 인간 L쇄의 V영역의 프레임워크 영역(FR) 및
(2) 항HM 1.24 항체의 L쇄의 V영역의 CDR로 이루어지는 항HM 1.24 항체의 재구성 인간 L쇄의 V영역과
(1) 인간 H쇄의 V영역의 FR 및
(2) 항 HM1.24 항체의 H쇄의 V영역의 CDR로 이루어지는 항HM 1.24 항체의 재구성 인간 H쇄의 V영역을 제공한다.
본 발명은 또한,
(1) 인간 L쇄의 C영역 및
(2) 인간 L쇄의 FR 및 항HM 1.24 항체의 L쇄의 CDR로 이루어지는 항HM 1.24 항체의 재구성 인간 L쇄, 및
(1) 인간 H쇄의 C영역 및
(2) 인간 H쇄의 FR 및 항HM1.24 항체의 H쇄의 CDR로 이루어지는 항HM 1.24 항체의 재구성 인간 H쇄를 제공한다.
본 발명은 또한,
(A) (1) 인간 L쇄의 C영역 및
(2) 인간 L쇄의 FR 및 항HM 1.24 항체의 L쇄의 CDR로 이루어지는 L쇄의 V영역, 및
(B) (1) 인간 H쇄의 C영역 및
(2) 인간 H쇄의 FR 및 항HM 1.24 항체의 H쇄의 CDR로 이루어지는 H쇄의 V영역으로 구성되는 항HM 1.24 항체의 재구성 인간 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 항HM 1.24 항체의 L쇄의 V영역을 코드하는 DNA 및 항HM 1.24 항체의 H쇄의 V영역을 코드하는 DNA를 제공한다.
본 발명은 또한,
(1) 인간 L쇄의 C영역 및
(2) 항HM 1.24 항체의 L쇄의 V영역으로 이루어지는 키메라 L쇄를 코드하는 DNA, 및
(1) 인간 H쇄의 C영역 및
(2) 항HM 1.24 항체의 H쇄의 V영역으로 이루어지는 키메라 H쇄를 코드하는 DNA를 제공한다.
본 발명은 또한,
(1) 인간 L쇄의 V영역의 FR 및
(2) 항HM 1.24 항체의 L쇄의 V영역의 CDR로 이루어지는 항HM 1.24 항체의 재구성 인간 L쇄의 V영역을 코드하는 DNA, 및
(1) 인간 H쇄의 V영역의 FR 및
(2) 항HM 1.24 항체의 H쇄의 V영역의 CDR로 이루어지는 항HM 1.24 항체의 재구성 인간 H쇄의 V영역을 코드하는 DNA를 제공한다.
본 발명은 또한,
(1) 인간 L쇄의 C영역 및
(2) 인간 L쇄의 FR 및 항HM 1.24 항체의 L쇄의 CDR로 이루어지는 항HM 1.24항체의 재구성 인간 L쇄를 코드하는 DNA, 및
(1) 인간 H쇄의 C영역 및
(2) 인간 H쇄의 FR 및 항HM 1.24 항체의 H쇄의 CDR로 이루어지는 항HM 1.24 항체의 재구성 인간 H쇄를 코드하는 DNA를 공급한다.
본 발명은 또한 상기한 여러가지 DNA의 어느 것으로 이루어지는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 키메라 L쇄를 코드하는 DNA로 이루어지는 발현 벡터 및 상기 H쇄를 코드하는 DNA로 이루어지는 발현벡터로 동시혈질전환된 숙주세포를 배양하고, 목적하는 항체를 회수하는 단계로 구성되는 항HM 1.24 항체의 키메라 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 재구성 인간 L쇄를 코드하는 DNA로 이루어지는 발현 벡터 및 상기 재구성 인간 H쇄를 코드하는 DNA로 이루어지는 발현 벡터로 동시형질전환된 숙주세포를 배양하고, 목적하는 항체를 회수하는 단계로 구성되는 항HM 1.24 항체의 재구성 인간 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 키메라 항체 또는 재구성 인간 항체로 이루어지는 제약 조성물, 특히 골수종 치료제를 제공한다.
본 발명은 또한 유효성분으로서 서열번호 103에 기재된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 키메라 항체를 함유하는 제약 조성물, 및 유효성분으로서 서열번호 103에 기재된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 재구성 인간 항체를 함유하는 제약 조성물을 제공한다. 제약 조성물로서, 특히 골수종치료제를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다.
1. 키메라 항체의 제조
(1) 마우스 항HM 1.24 모노클로날 항체의 V영역을 코드하는 DNA의 클로닝 mRNA의 제조
마우스 항HM 1.24 모노클로날 항체의 V영역을 코드하는 DNA를 클로닝시키기 위하여, 전체 RNA를 공지의 방법, 예를 들면 구아니딘 초원심분리법(Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry(1979), 18, 5294-5299), AGPC법(Chomczynski, P. et al.(1987, 162, 156-159) 등을 사용하여 회수된 하이브리드로부터 제조하고, mRNA 정제키드(Pharmacia제)가 부착된 올리고(dT)-셀룰로스 스핀 칼럼 등을 사용하여 mRNA를 제조했다. 또한, QuickPrep mRNA 정제키드(Pharmacia 제)를 사용하여, mRNA를 전체 RNA의 추출단계를 거치지 않고 제조했다.
cDNA의 제조 및 증폭
상기 mRNA의 제조에서 얻은 mRNA로부터, 역전사효소를 사용하여 L쇄 및 H쇄의 V 영역의 cDNA는 AMV Reverse Transcriptase First-Strand cDNA Synthesis Kit를 사용해서 합성했다. 합성한 cDNA를 증폭시키기 위하여, 항체 유전자의 리더 서열 및 C영역으로 교잡하는 적당한 프라이머(예를 들면, 서열번호 29 내지 39로 나타낸 염기서열을 갖는 MKV 프라이머, 및 서열번호 40으로 나타낸 염기서열을 갖는 MKC 프라이며)를 사용할 수 있다.
H쇄의 V영역의 cDNA의 합성 및 증폭은 5'-Ampli FINDER RACE kit(CLONTECH제)를 사용하여 5'-RACE법(Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1998, Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989)에 의해 PCR(폴리머라제 연쇄반응)로 행할 수 있다. 위와 같이 합성한 cDNA의 5'말단에 Ampli FINDER Anchor를 연결하고, H쇄의 V영역을 증폭시키기 위한 프라이머로서, Anchor 프라이머(서열번호 77) 및 마우스 H쇄의 불변영역(Cγ영역)에 특이적으로 교잡하는 프라이머(예를 들면, 서열번호 42로 나타낸 염기서열을 갖는 MHC2a 프라이머)를 사용할 수 있다.
DNA의 정제 및 그의 염기서열의 결정
공지 방법을 사용하여 PCR 생성물에 대해서 아가로스 겔 전기영동을 행하여 목적하는 DNA 단편을 잘라내고, DNA를 회수하고, 정제한 다음에 벡터 DNA에 연결했다.
DNA 시판 키트(예를 들면, GENECLEANⅡ;BIO101)를 사용하여 정제할 수 있다. DNA 단편을 보유하기 위하여 공지의 벡터 DNA(예를 들면, pUC19, Bluescript, etc.)를 사용할 수 있다.
상기 DNA 및 상기 DNA 벡터를 공지 결찰키트(Takara Shuzo제)를 사용하여 연결해서 재조합 벡터를 얻었다. 이어서, 얻어진 재조합 벡터를 대장균 JM109에 도입한 후, 암피실린 내성 클로니를 선발해고, 벡터DNA를 공지방법에 기초해서 제조했다(J. Sambrook, et al., 'Molecular Cloning.'Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
상기 벡터 DNA를 제한효소를 소화한 후, 목적하는 DNA의 염기서열을 공지의 방법(예를 들면, 디데옥시법)에 의해 결정한다(J. Sambrook, et al.'Molecular Cloning,' Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). 본 발명에 따라서, 자동서열결정시스템(DNA Sequencer 373A; ABI Co., Ltd.제)을 사용할 수 있다.
상보성 결정영역
H쇄의 V영역 및 L쇄의 V영역은 항원결합부위를 형성하며, 그의 전체구조는 서로 비슷한 특성들을 갖는다. 따라서, 네개의 프레임워크 영역(FR) 각각은 세개의 초가변 영역, 즉 상보성 결정 영역(CDRs)에 의해 연결되어 있다. FRs의 아미노산 서열은 비교적 잘 보존되어 있지만, CDR 영역의 아미노산 서열의 변이성은 지극히 높다(Kabat, E.A. et al., 'Sequence of Proteins of Immunologicla Interest,' US Dept. Health and Human Services, 1993).
상기 네개의 FRs의 많은 부분은 β-시이트 구조를 취하며, 그 결과 세개의 CDRs는 루프를 형성한다. CDRs는 종종 β-시이트 구조의 일부를 형성할 수 있다. 세개의 CDRs는 서로 입체적으로 매우 가까운 위치에 보유되고, 쌍을 짓는 영역(Pairing region)의 세개의 CDRs와 함께 항원결합부위를 형성한다.
이러한 사실에 기초하여, 마우스 항HM 1.24 항체의 가변영역의 아미노산 서열을 카바트(Kabat) 등에 의해 제조한 항체의 아미노산 서열의 데이타 베이스 ('Sequence of Proteins of Immunological Interest.' US Dept. Heatlh and HumanServices, 1983)에 적용시켜 상동성(相同性)을 조사해서 CDR 영역을 찾아냈다.
(2) 키메라 항체의 발현 벡터의 제조
마우스 모노클로날 항체의 마우스 L쇄 및 H쇄의 V영역을 코드하는 DNA 단편이 클로닝되기만 하면, 키메라 항HM 1.24 항체는 이들 마우스 V영역을 인간 항체의 불변영역을 코드하는 DNA에 연결하여 발현시킴으로써 얻어질 수 있다.
키메라 항체를 제조하는 기본적인 방법은 클로닝된 cDNA에 존재하는 마우스 리더 서열 및 V영역 서열을 포유류 세포의 발현 벡터에 존재하는 인간항체의 C영역을 코드하는 서열에 연결시키는 것으로 이루어진다. 다른 방법으로, 상기 방법은 클로닝된 cDNA에 존재하는 마우스 리더 서열 및 V영역 서열을 인간항체의 C영역을 코드하는 서열에 연결시킨 후, 포유류 세포의 발현 벡터에 연결시키는 것으로 이루어진다.
인간항체의 C영역은 임의 H쇄의 C영역 및 임의 L쇄의 C영역이 될 수 있다. 예를 들면, 인간 H쇄의 Cγ1, Cγ2, Cγ3 또는 Cγ4 또는 L쇄의 Cλ 또는 Cκ를 언급할 수 있다.
키메라 항체를 생산하기 위하여, 두 종류의 발현 벡터를 다음과 같이 제조할 수 있다. 인핸서/프로모터 시스템(enhancer/promoter system) 등의 발현조절영역의 제어하에 마우스 L쇄의 V영역 및 인간 L쇄의 C영역을 코드하는 DNA로 되는 발현 벡터, 및 인핸서/프로모터 시스템 등의 발현조절영역의 제어하에 마우스 H쇄의 V영역 및 인간 H쇄의 C영역을 코드하는 DNA로 되는 발현 벡터를 제조할 수 있다. 이어서, 이들 발현 벡터를 사용하여 포유류 세포와 같은 숙주세포를 동시형질전환시키고,형질전환된 세포를 시험관 내 또는 생체 내에서 배양해서 키메라 항체를 제조했다(예를 들면, 국제특허출원공개번호 WO 91-16928).
다른 방법으로, 클로닝된 cDNA에 존재하는 마우스 리더 서열 및 L쇄의 V영역 및 인간 L쇄의 C영역을 코드하는 DNA, 및 마우스 리더 서열 및 H쇄의 V영역 및 인간 H쇄의 C영역을 코드하는 DNA를 단일 발현 벡터에 도입하고(국제특허출원공개번호 WO 94-11523), 숙주 세포를 상기 벡터를 사용해서 형질전환시켰다. 이어서, 형질전환된 숙주를 시험관내 또는 생체 내에서 배양해서 목적하는 키메라 항체를 제조했다.
1) 키메라 H쇄의 제조
키메라 항체의 H쇄의 발현 벡터는 마우스 H쇄의 V영역을 코드하는 cDNA를 인간 항체의 H쇄의 C영역을 코드하는 게놈 DNA 또는 cDNA를 함유하는 적당한 발현 벡터에 도입해서 얻을 수 있다. 상기 H쇄의 C영역으로서, 예를 들면 Cγ1, Cγ2, Cγ3 또는 Cγ4를 언급할 수 있다.
Cγ1 게놈 DNA를 함유하는 키메라 H쇄의 발현벡터의 제조
H쇄의 C영역으로서 Cγ1의 게놈 DNA를 갖는 발현 벡터로서, 예를 들면 HFE-PMh-gγ1(국제특허출원공개번호 WO 92-19759) 또는 DHFR-△E-RVh-PM1f(국제특허출원 공개번호 WO 92-19759)를 사용할 수 있다.
마우스 H쇄의 V영역을 코드하는 cDNA를 이들 발현벡터에 삽입하기 위하여, 적당한 염기서열을 PCR법을 사용하여 도입할 수 있다. 이들 적당한 염기서열은 5'말단에 적당한 제한효소의 인식서열과 개시코돈(start codon) 직전에 코작 콘센서스 서열(Kogak consensus sequence)를 갖도록 설계한 PCR 프라이머와, 3'말단에 적당한 제한효소의 인식서열과 게놈 DNA의 일차 전사물이 적당하게 스플라이스되어 mRNA가 되는 스플라이스 도너 부위(splice donor site)를 갖도록 설계한 PCR 프라이머를 사용하여 PCR법으로 도입할 수 있다.
이와 같이하여 제조한 마우스 H쇄의 V영역을 코드하는 cDNA를 적당한 제한효소로 처리하고, 상기 발현 벡터에 삽입하여, Cγ1DNA로 되는 키메라 H쇄 발현벡터를 제조할 수 있다.
cDNA 키메라 H쇄의 발현벡터의 제조
H쇄의 C영역으로서 Cγ1의 cDNA를 갖는 발현벡터는 다음과 같이 제조할 수 있다. 즉, 인간형화 PM1 항체 H쇄의 V영역 및 인간 항체 H쇄의 C영역 Cγ1의 게놈 DNA(N. Takahashi, et al., cell 29, 671-679, 1982)를 코드하는 발현벡터 DHFR-△E-RVh-PM1f(국제특허출원공개번호 WO 92-19759 참조)와 인간형화 PM1 항체 L쇄의 V영역 및 인간항체 L쇄의 κ쇄 C영역이 게놈 DNA를 코드하는 발현벡터 RV1-PM1a(국제특허출원 공개번호 WO 92-19759 참조)를 도입한 CHO 세포로부터 mRNA를 제조하고, RT-PCR법으로 인간형화 PM1 항체 H쇄 V영역 및 인간항체 H쇄의 C영역 Cγ1으로 되는 cDNA를 클로닝하고, 적당한 제한효소 부위를 사용하여 동물세포의 적당한 발현벡터에 연결하여 제조할 수 있다.
마우스 H쇄 V영역을 코드하는 cDNA를 인간항체 H쇄의 C영역 Cγ1을 함유하는 cDNA에 직접 연결하기 위하여, 적당한 염기서열을 PCR법으로 도입할 수 있다. 예를 들면, 이들 적당한 염기서열은, 5'말단에서 적당한 제한효소의 인식서열과 개시 코돈 직전에 코작 콘센서스 서열을 갖도록 설계한 PCR 프라이머, 및 3'말단에서 H쇄 C영역 Cγ1의 직접적인 연결에 사용한 적당한 제한효소의 인식서열을 갖도록 설계한 PCR 프라이머를 사용하여 PCR법으로 도입할 수 있다.
cDNA 키메라 H쇄를 함유하는 발현벡터는, 이와 같이하여 제조한 마우스 H쇄의 V영역을 코드하는 cDNA를 적당한 제한효소로 처리하고, 상기 H쇄의 C영역 Cγ1을 함유하는 cDNA에 연결하고, pCOS1 또는 pCHO1 등의 발현벡터에 삽입하여 제조할 수있다.
2) 키메라 항체 L쇄의 제조
키메라 항체 L쇄의 발현벡터는 마우스 L쇄의 V영역을 코드하는 cDNA를 인간항체 L쇄의 C영역을 코드하는 게놈 DNA 또는 cDNA에 연결하고, 이어서 이것을 적당한 발현벡터에 도입시킴으로써 얻어질 수 있다. L쇄 C영역으로서, 예를 들면 κ쇄 또는 λ쇄를 언급할 수 있다.
cDNA 키메라 L쇄 κ쇄의 발현벡터의 제조
마우스 L쇄의 V영역을 코드하는 cDNA를 함유하는 발현벡터를 제조하기 위하여, 적당한 염기서열을 PCR법으로 도입할 수 있다. 예를 들면, 이들 적당한 염기서열은 5'말단에서 적당한 제한효소의 인식서열과 코작 콘센서스 서열을 갖도록 설계한 PCR 프라이머 및 3'말단에서 적당한 제한 효소의 인식서열과 갖도록 설계한 PCR 프라이머를 사용하여 PCR법으로 도입할 수 있다.
마우스 L쇄의 V영역에 연결시키기 위한 인간 L쇄 κ쇄(영역은 예를 들면 게놈 DNA를 함유하는 HEF-PM1κ-gκ(국제특허출원공개번호 WO 92-19759 참조)로부터제조될 수 있다. cDNA 키메라 항체 L쇄 κ쇄의 발현벡터는, PCR법으로 L쇄 κ쇄 C영역을 코드하는 DNA의 5'말단 또는 3'말단에 적당한 제한효소의 인식서열을 도입하고, 이와 같이하여 제조한 마우스 L쇄의 V영역을 L쇄 κ쇄 C영역에 연결하고, 이어서 pCOS1 또는 pCHO1 등의 발현벡터에 삽입시킴으로써 제조될 수 있다.
2. 재구성 인간항체의 제조
(1) 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 V영역의 설계
마우스 모노클로날 항체의 CDR가 인간 항체에 이식되어 있는 재구성 인간 항체를 제조하기 위하여, 마우스 모노클로날 항체의 FR와 인간항체의 FR 사이에 높은 상동성이 존재하는 것이 바람직하다. 따라서, 마우스 항HM 1.24 항체의 L쇄 및 H쇄의 V영역을 Protein Data Bank를 사용하여 구조가 밝혀져 있는 공지의 모든 항체의 V영역과 비교했다.
마우스 항HM 1.24 항체의 L쇄의 V영역은 인간항체 L쇄 V영역의 서브그룹 Ⅳ(HSGⅣ)의 콘센서스 서열과 거의 유사하며, 상동성 66.4%를 갖는다. 한편, HSGI, HSGⅡ 및 HSGⅢ는 각각 56.9%, 55.8% 및 61.5%의 상동성을 나타낸다.
마우스 항HM 1.24 항체의 L쇄의 V영역은 공지의 인간항체 L쇄의 V영역과 비교했을 때, 인간항체 L쇄의 V영역으 서브그룹I의 하나인, 인간항체 PEI L쇄의 V영역에 67.0%의 상동성을 나타낸다. 그러므로, REI의 FR은 재구성 인간 항HM 1.24 항체 L쇄의 V영역 제조용 출발물질로서 사용된다.
재구성 인간 항HM 1.24 항체의 L쇄의 V영역의 버전 a를 설계했다. 이 버전에서, 인간항체의 FR는 재구성 인간 CAMPATH-1H 항체에 존재하는 REI 기초FR(Riechmann, L. et al., Nature 322, 21-25, (1988) 참조, 국제특허출원공개번호 WO 92-19759에 기재된 재구성 인간 PM-1 항체 L쇄의 V영역의 버전 a에 함유된 FR)와 동일하고, 마우스 CDR는 마우스 항HM 1.24 항체 L쇄의 V영역 중의 CDR과 동일했다.
마우스 항HM 1.24 항체 H쇄의 V영역은 인간항체 H쇄의 V영역(HSGI)의 콘센서스 서열과 거의 유사하며, 상동성 54.7%를 갖는다. 한편, HSGⅡ 및 HSGⅢ과는 각각 34.6% 및 48.1%의 상동성을 나타낸다. 마우스 항HM 1.24 항체 H쇄의 V영역을 공지의 인간항체 H쇄의 V영역과 비교했을 때에, FR1 내지 FR3는 인간 H쇄 V영역의 서브그룹I의 하나인, 인간 항체 HG3 H쇄의 V영역과 거의 유사하며(Reichavi, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 855-859), 상동성 67.3%를 갖는다.
그러므로, 인간항체 HG3의 FR를 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 H쇄의 V영역 제조용 출발물질로서 사용했다.
그러나, 인간항체 HG3의 FR4의 아미노산 서열이 기재되지 않았기 때문에, FR4에 관해서는 마우스 항HM 1.24 항체의 FR4와 가장 높은 상동성을 나타내는 인간항체 JH6(Ravetch, J.V. et al., cell, 27, 583-591)의 FR4의 아미노산 서열을 사용했다. JH6의 FR4는 1개의 아미노산만을 제외하고, 마우스 항HM 1.24 항체 H쇄의 FR4와 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄의 V영역의 제 1버전 a에 있어서, FR1 내지 FR3는, 인간 FR1 중의 30위치과 인간 FR3 중의 71위치에서 아미노산이 마우스 항HM1.24 항체의 아미노산과 동일한 것은 제외하고, 인간 항체 HG3의 FR1 내지 FR3과 동일하고, CDR는 마우스 항HM 1.24 항체 H쇄의 V영역 중의 CDR와 동일하게 했다.
(2) 재구성 인간 항HM 1.24 항체 L쇄 V영역의 제조
재구성 인간 항HM 1.24 항체의 L쇄는 PCR법으로 CDR 그라프팅에 의해 제조한다. 이 방법을 도 4에 도식적으로 나타냈다. 인간항체 RE1에서 유래된 FR를 갖는 재구성 인간 항HM 1.24 항체(버전 a)를 제조하기 위하여 8개의 PCR 프라이머를 사용했다. 외부 프라이머 A(서열번호 47) 및 H(서열번호 48)를 설계하여 HEF 발현벡터 HEF-VL-gκ의 DNA 서열과 교잡시켰다.
CDR 그라프팅 프라이머 L1S(서열번호 49), L2S(서열번호 50) 및 L3S(서열번호 51)은 센스 DNA 서열을 갖는다. CDR 그라프팅 프라이머 L1A(서열번호 52), L2A(서열번호 53) 및 L3A(서열번호 54)는 안티센스 DNA 서열을 가지며, 이들 각각은 프라이머 L1S, L2S 및 L3S의 5'말단에서 DNA 서열에 대한 상보적 DNA 서열(20 내지 23bp)를 갖는다.
PCR의 제 1단계에서, 4개의 반응 A-L1A, L1S-L2A, L2S-L3A 및 L3S-H 행하고, 각 PCR 생성물을 정제한다. 제 1 PCR에서 4개의 PCR 생성물을 그들 자체의 상보성에 의해 서로 어셈블리시킨다(국제특허출원공개번호 WO 92-19759 참조). 이어서, 외부 프라이머 A 및 H를 첨가해서 재구성 인간 항HM 1.24 항체 L쇄 V영역을 코드하는 전장 DNA를 증폭시킨다(제 2 PCR). 상기 PCR에서, 인간항체 REI 유래 FR에 기초한 재구성 인간 ONS-M21 항체 L쇄 V영역의 버전 a를 코드하는 플라스미드 HEF-RVL-M21a(국제특허출원공개번호 WO 95-14041 참조)를 주형으로서 이용할 수 있다.
PCR의 제 1단계에서, 주형 DNA 및 각 프라이머르 사용했다.
PCR 생성물 A-L1A(215 bp), L1S-L2A(98 bp), L2S-L3A(140 bp) 및 L3S-H(151 bp)를 1.5% 저융점 아가로스 겔을 사용하며 정제하고, 제 2 PCR에서 어셈블리했다. 제 2 PCR에서, 제 1 PCR에서 얻은 각 생성물과 각 외부 프라이머(A 및 H)를 사용했다.
제 2 PCR에서 생성되는 516 bp DNA 단편을 1.5% 저융점 아가로스 겔을 사용하여 정제하고, BamHI 및 HindⅢ으로 소화하고, 이와 같이하여 얻은 DNA 단편을 HEF 발현벡터 HEF-VL-gκ로 클로닝했다. DNA 서열을 결정한 후, 재구성 인간 항HM 1.24 항체 L쇄 V영역의 정확한 아미노산 서열을 갖는 DNA 단편을 함유하는 플라스미드를 플라스미드 HEF-RVLa-AMH-gκ로 명명했다. 이 플라스미드 HEF-RVLa-AHM-gκ 중에 함유된 L쇄 V영역의 아미노산 서열과 염기서열은 서열번호 9에 나타냈다.
재구성 인간 항HM 1.24 항체 L쇄 V영역의 버전 b는 PCR를 사용하는 변이유발법(變異誘潑法)에 의해 제조할 수 있다. 변이원 프라이머 FTY-1(서열번호 55) 및 FTY-2(서열번호 56)는 71위치에서 페닐알라닌이 티로신으로 변이하도록 설계한다.
상기 프라이머를 주형으로서 플라스미드 HEF-RVLa-AMH-gκ를 사용하여 증폭시킨 후, 최종 생성물을 정제한다. BamHI 및 HindⅢ으로 소화한 후, 얻어진 DNA 단편을 HEF 발현벡터 HEF-VL-gκ로 클로닝시켜서 플라스미드 HEF-RVLb-AHM-gκ를 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVLb-AHM-gκ에 함유된 L쇄 V영역의 아미노산 서열과 염기서열을 서열번호 10에 나타냈다.
(3) 재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역의 제조
3-1. 재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역의 버전 a-e의 제조
재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역을 코드하는 DNA를 다음과 같이 설계할 수 있다. 인간 항체 GH3의 FR 1-3 및 인간항체 JH6의 FR4를 코드하는 DNA 서열을 마우스 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역의 CDR를 코드하는 DNA 서열에 연결함으로써, 재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역을 코드하는 전장 DNA를 설계할 수 있다.
이어서, HindⅢ 인식부위/ KOZAK 콘센서스 서열 및 BamHI 인식부위/스플라이스 도너 서열을 각각 상기 DNA 서열의 5'말단 및 3'말단에 부가하여 HEF 발현벡터에 삽입할 수 있도록 한다.
이와 같이 설계된 DNA 서열을 4개의 올리고뉴클레오티드로 분할하고, 이어서 이들 올리고뉴클레오티드의 어셈블리를 방해할 가능성이 있는 올리고뉴클레오티드의 이차 구조에 대해서 컴퓨터 해석을 행했다.
4개의 올리고뉴클레오티드 RVH1 내지 RVH4의 서열을 서열번호 57-60에 기재했다. 이들 올리고뉴클레오티드는 119 내지 144 염기의 길이와, 25 내지 26 bp 오버래핑 영역(overlapping region)을 갖는다. 올리고뉴클레오티드 중에서, RVH2(서열번호 58) 및 RVH4(서열번호 60)는 센스 DNA 서열을 가지며, RVH1(서열번호 57) 및 RVH3(서열번호 59)는 안티센스 DNA 서열을 갖는다. 이들 4개의 올리고뉴클레오티드를 PCR법으로 어셈블링하는 방법은 도 5에 나타냈다.
PCR는 4개의 올리고뉴클레오티드와 외부 프라이머로서 RHP1(서열번호 61) 및 RHP2(서열번호 62)를 사용하여 행했다.
증폭시킨 438 bp DNA 단편을 정제하고, HindⅢ 및 BamHI로 소화하고, 이어서HEF 발현벡터 HEF-VH-gγ1으로 클로닝했다. 염기서열을 결정한 후, H쇄 V영역의 정확한 아미노산 서열을 코드하는 DNA 단편을 함유하는 플라스미드를 HEF-RVHa-AHM-gγ1으로 명명했다. 이 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열과 염기 서열을 서열번호 11에 나타냈다.
재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역의 버전 b,c,d 및 e 각각은 다음과 같이 제조했다. 재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역의 버전 b 이후 각각을 제조함에 있어서, 항체 분자 중에서 치환되는 아미노산 잔기의 위치를 예보하기 위하여 마우스 항HM 1.24 항체 V영역의 삼차원적 구조 모델을 제작할 수 있다.
PCR법으로, 변이원 프라이머로서 66위치에서 아르기닌을 라이신으로 변이하도록 설계한 BS(서열번호 63) 및 BA(서열번호 64)와, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1을 사용하여, 버전 b를증폭하여 플라스미드 HEF-BVHb-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHb-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열과 염기 서열을 서열번호 12에 나타냈다.
PCR법으로, 변이원 프라이머로서 73위치에 트레오닌을 라이신으로 변이하도록 설계한 프라이머 CS(서열번호 65) 및 CA(서열번호 66)와 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1을 사용하여, 버전 C를 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHc-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHc-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열과 염기 서열을 서열번호 13에 나타냈다.
PCR법으로, 변이원 프라이머로서 66위치에서 아르기닌을 라이신으로 변이하도록 설계한 프라이머 DS(서열번호 67) 및 DA(서열번호 68)와 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1을 사용하여, 버전 d를 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHd-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHd-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열과 염기서열을 서열번호 14에 나타냈다.
PCR법으로, 변이원 프라이머로서 67위치에서 발린을 알라닌으로, 그리고 69위치에서 메티오닌을 로이신으로 변이하도록 설계한 프라이머 ES(서열번호 69) 및 EA(서열번호 70)와, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHa-gγ1을 사용하여, 버전 e를 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHe-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHe-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열과 염기 서열을 서열번호 15에 나타냈다.
3-2. H쇄 하이브리드 V영역의 제조
H쇄 하이브리드 V영역을 제조함으로써, 인간형화 항체의 V영역의 어느 FR가 결합활성 및 결합저해활성에 기여하는 가를 조사할 수 있다. 제조된 2종류 중에서, 하나는 FR1 및 FR2의 아미노산 서열이 마우스 항HM 1.24 항체에서 유래했고, FR3 및 FR4의 아미노산 서열이 재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역의 버전 a에서 유래한 것(마우스·인간 하이브리드 항HM 1.24 항체)이고, 다른 하나는 FR1 및 FR2의 아미노산 서열이 재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역의 버전 a에서 유래했고. FR3 및 FR4의 아미노산 서열이 마우스 항HM 1.24 항체에서 유래한 것(인간·마우스 하이브리드 항HM 1.24 항체)이다. CDR 영역의 아미노산 서열은 모두 항HM 1.24 항체로부터 유래한다.
2개의 H쇄 하이브리드 V영역을 RCR법으로 제조했다. 이 방법을 도 6 및 도 7에 도식적으로 나타냈다. 2개의 H쇄 하이브리드 V영역을 제조하기 위하여, 4개의 프라이머가 사용될 수 있다. 외부 프라이머 a(서열번호 71) 및 h(서열번호 72)를 설계하여 HEF 발현벡터 HEF-VH-gγ1의 DNA 서열로 교잡했다. H쇄 하이브리드 제조 프라이머 HYS(서열번호 73)를 설계하여 센스 DNA 서열을 갖도록 하고, H쇄 하이브리드 프라이머 HYA(서열번호 74)를 설계하여 안티센스 DNA 서열을 갖도록하여 DNA 서열이 서로 상보적이 되도록 설계한다.
FR1 및 FR2의 아미노산 서열이 마우스 항HM 1.24 항체에서 유래되고, FR3 및 FR4의 아미노산 서열이 재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역의 버전 a에서 유래된 H쇄 하이브리드 V영역을 제조하기 위하여, 주형으로서 플라스미드 HEF-1.24H-gγ1, 외부 프라이머 a 및 H쇄 하이브리드 프라이머 HYA를 사용하는 PCR, 및 주형으로서 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1, H쇄 하이브리드 프라이머 HYA 및 외부 프라이머 h를 사용하는 PCR를 PCR의 제 1단계에서 행하고, 각 PCR 생성물을 정제했다.
FR1 내지 FR2의 아미노산 서열이 재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역의 버전 a에서 유래되고, FR3 및 FR4의 아미노산 서열이 마우스 항HM 1.24 항체에서 유래된 H쇄 하이브리드 V영역을 제조하기 위하여, 주형으로서 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1, 외부 프라이머 a 및 H쇄 하이브리드 프라이머 HYA를 사용하는 PCR, 및 주형으로서 플라스미드 HEF-1.24H-gγ1, H쇄 하이브리드 프라이머 HYS 및 외부 프라이머 h를 사용하는 PCR를 PCR의 제 1단계에서 행하고, 각 PCR 생성물을 정제했다.
제 1 PCR로부터 얻은 2개의 PCR 정제 생성물을 이들 자체의 상보성에 의해어셈블리시킨다(국제특허출원 공개번호 WO 92-19759 참조). 이어서, 외부 프라이머 a 및 h를 첨가해서, FR1 및 FR2의 아미노산 서열이 재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역의 버전 a에서 유래되고, FR3 및 FR4의 아미노산 서열이 마우스 항HM 1.24 항체에서 유래된 H쇄 하이브리드 V영역을 코드하는 전장 DNA를 제 2 PCR 단계에서 증폭했다.
제 1 PCR, PCR 생성물의 정제, 어셈블링, 제 2 PCR, 및 HEF 발현벡터 HEF-VH-gγ1으로의 클로닝의 방법은 실시예 9, 재구성 인간 항HM 1.24 항체 L쇄 V영역의 제조에 기재된 방법에 따라서 행했다. DNA 서열을 결정한 후, FR1 및 FR2의 아미노산 서열이 재구성 인간 항HM 1.24 항체에서 유래되고, FR3 및 FR4의 아미노산 서열이 재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역의 버전 a에서 유래된 H쇄 하이브리드 V영역의 정확한 아미노산 서열을 코드하는 DNA 단편을 함유하는 플라스미드를 HEF-MH-RVH-AHM-gγ1으로 명명했다.
이 플라스미드 HEF-MH-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기 서열을 서열번호 75에 나타냈다. 또한 FR1 및 FR2의 아미노산 서열이 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 버전 a에서 유래되고, FR3 및 FR4의 아미노산 서열이 마우스 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역에서 유래된 H쇄 하이브리드 V영역의 정확한 아미노산 서열을 코드하는 DNA 단편을 함유하는 플라스미드를 HEF-HM-RVH-AHM-gγ1 으로 명명했다. 이 플라스미드 HEF-HM-RVH-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열과 염기서열을 서열번호 76에 나타냈다.
3-3. 재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역의 버전 f-s의 제조
재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역의 버전 f,g,h,i,j,k,l,m,n,o,p,q,r 및 s를 다음과 같이 제조했다. 상기 재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역의 버전f 이후의 각 버전을 제조함에 있어서, 항체분자 중에서 치환되는 아미노산 잔기의 위치를 예보하기 위하여, 상기한 바와 같이 마우스 항HM 1.24 항체 V영역의 삼차원 구조 모델을 제작할 수 있다.
변이원 프라이머로서 75위치의 트레오닌을 세린으로 변이하고, 78위치의 발린을 알라닌으로 변이하도록 설계한 FS(서열번호 78) 및 FA(서열번호 79)를 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHe-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 f를 PCR법으로 증폭해서 플라스미드 HEF-RVHf-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHf-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열과 염기 서열을 서열번호 16에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 40 위치의 알라닌을 아르기닌으로 변이하도록 설계한 GS(서열번호 80) 및 GA(서열번호 81)를 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 g를 증폭해서 플라스미드 HEF-RVHg-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHg-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기 서열을 서열번호 17에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 FS 및 FA를 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHb-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 h를 증폭해서 플라스미드 HEF-RVHh-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHh-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기 서열을 서열번호 18에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 83위치의 아르기닌을 알라닌으로 변이하고, 84위치에세린을 페닐알라닌으로 변이하도록 설계한 IS(서열번호 82) 및 IA(서열번호 83)를 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHh-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 i를 증폭해서 플라스미드 HEF-RVHi-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHi-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기 서열을 서열번호 19에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 66위치의 아르기닌을 라이신으로 변이하도록 설계한 JS(서열번호 84) 및 JA(서열번호 85)를 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHf-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 j를 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHj-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHj-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기 서열을 서열번호 20에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 81위치의 글루타민산을 글루타민으로 변이하도록 설계한 KS(서열번호 86) 및 KA(서열번호 87)를 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHh-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 k를 증폭해서 플라스미드 HEF-RVHk-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHk-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기서열을 서열번호 21에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 81위치에 글루타민산을 글루타민으로 변이하고, 82B위치의 세린을 이소로이신으로 변이하도록 설계한 LS(서열번호 88) 및 LA(서열번호 89)를 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHh-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 l을 증폭해서 플라스미드 HEF-RVHl-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHl-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열과 염기 서열을 서열번호 22에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 81위치의 글루타민산을 글루타민으로 변이하고, 82b위치의 세린을 이소로이신으로 변이하고, 87위치의 트레오닌을 세린으로 변이하도록 설계한 MS(서열번호 90) 및 MA(서열번호 91)를 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHh-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 m을 증폭해서 플라스미드 HEF-RVHm-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHm-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기서열을 서열번호 23에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 82b위치의 세린을 이소로이신으로 변이하도록 설계한 NS(서열번호 92) 및 NA(서열번호 93)를 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHh-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 n을 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHn-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHn-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기 서열을 서열번호 24에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 87위치의 트레오닌을 세린으로 변이하도록 설계한 OS(서열번호 94) 및 OA(서열번호 95)를 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHh-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 o를 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHo-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHo-AHM-gγ1에 함유된 아미노산 서열 및 염기 서열을 서열번호 25에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 78위치의 발린을 알라닌으로 변이하도록 설계한 PS(서열번호 96) 및 PA(서열번호 97)를 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 p를 PCR법으로 증폭해서 플라스미드 HEF-RVHp-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHp-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열및 염기 서열을 서열번호 26에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 75위치의 트레오닌을 세린으로 변이하도록 설계한 QS(서열번호 98) 및 QA(서열번호 99)를 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 q를 PCR법으로 증폭해서 플라스미드 HEF-RVHq-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHq-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기 서열을 서열번호 27에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 CS(서열번호 65) 및 CA(서열번호 66)를 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHp-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 r를 PCR법으로 증폭해서 플라스미드 HEF-RVHr-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHr-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기 서열을 서열번호 28에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 69위치의 메티오닌을 이소로이신으로 변이하도록 설계한 SS(서열번호 100) 및 SA(서열번호 101)를 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHr-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 s를 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHs-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHs-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기 서열을 서열번호 102에 나타냈다.
제조된 L쇄 V영역의 아미노산 서열을 하기 표 1에 나타냈고, H쇄 V영역의 아미노산 서열을 하기 표 2 내지 4에 나타냈다.
3. 키메라 항체 및 재구성 인간 항체의 제조
키메라 항체 또는 재구성 인간 항체를 제조하기 위하여, 다음과 같은 2개의 발현벡타 각각, 즉 인핸서/프로모터 시스템과 같은 발현조절영역의 제어하에 마우스 H쇄 V영역 및 인간 H쇄 C영역을 코드하는 DNA 및 인핸서/프로모터 시스템과 같은 발현조절영역의 제어하에 마우스 L쇄 V영역 및 인간 L쇄 C영역을 코드하는 DNA로 이루어지는 발현벡터, 또는 인핸서/프로모터 시스템과 같은 발현조절영역의 제어하에 인간화 H쇄 V영역 및 인간 H쇄 C영역을 코드하는 DNA 및 인핸서/프로모터 시스템과 같은 발현조절영역의 제어하에 인간화 L쇄 V영역 및 인간 L쇄 C영역을 코드하는 DNA로 이루어지는 발현벡터를 제조했다.
이어서, 이들 발현벡터를 사용해서 포유류 세포와 같은 숙주세포를 동시에 형질전환시키고, 형질전환된 세포를 시험관내 또는 생체내에서 배양해서 키메라 항체 또는 재구성 인간 항체를 제조했다(예를 들면, 국제특허출원 공개번호 WO 91-16928 참조). 또한, 항체 유전자를 염소와 같은 포유동물에 도입하여 트랜스제닉 동물(Transgenic animal)을 생산하고, 이 동물의 젖에서 키메라 항체 또는 재구성 인간항체를 얻을 수 있다.
또한 H쇄 V영역 및 H쇄 C영역, 및 L쇄 V영역 및 L쇄 C영역을 단일 벡터에 연결해서 적당한 숙주세포를 형질전환시켜서 항체를 생산하였다. 따라서, 키메라 항체를 발현시키기 위하여, 클로닝된 cDNA에 존재하는 마우스 리더서열, H쇄 V영역 및 인간 H쇄 C영역을 코드하는 DNA, 및 마우스 리더 서열, L쇄 V영역 및 인간 L쇄 C영역을 코드하는 DNA를 단일 발현벡터에 도입한다(국제특허출원 공개번호 WO 94-11523 참조).
재구성 인간 항체를 발현시키기 위하여, 인간화 H쇄 V영역 및 인간 H쇄 C영역을 코드하는 DNA, 및 인간화 L쇄 V영역 및 인간 L쇄 C영역을 코드하는 DNA를 단일 발현벡터에 도입한다(국제특허출원 공개번호 WO 94-11523 참조). 상기 벡터를 사용하여 숙주세포를 형질전환시키고, 형질전환된 숙주세포를 시험관 내 또는 생체 내에서 배양해서 목적하는 키메라 항체 또는 재구성 인간항체를 생산했다.
상기한 바와 같이, 목적하는 키메라 항체 또는 재구성 인간항체를 코드하는 유전자로 형질전환된 형질전환체를 배양하고, 키메라 항체 또는 재구성 인간 항체를 세포내부 또는 세포외부에서 단리시켜 균일할 때까지 정제했다.
본 발명의 목적하는 단백질인 키메라 항체 또는 재구성 인간 항체의 단리 및 정제는 어피니티 컬럼(affinity column)을 사용해서 행할 수 있다. 예를 들면, 단백질 A를 이용하는 컬럼으로서, HyperD, POROS, Sepharose F·F등을 언급할 수 있다. 다른 방법으로, 단백질에 대해서 사용되는 통상의 단리 및 정제법을 사용할 수 있으며, 이 방법은 어떻든 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 여러가지 크로마토그라피 방법, 한외여과, 염석(鹽析), 투석 등을 적당히 선택 조합하면 키메라 항체 또는 재구성 인간 항체를 단리 및 정제할 수 있다.
본 발명의 키메라 항HM 1.24 항체 또는 재구성 인간 항HM 1.24 항체를 제조하기 위하여 임의의 발현계, 예를 들면 동물세포 등의 진핵세포, 확립된 포유류 세포계, 곤충 세포계, 진균류 세포계, 효모 세포계, 및 대장균 세포 등의 세균세포와 같은 원핵세포를 사용할 수 있다. 본 발명의 키메라 항체 또는 재구성 인간 항체는 COS 세포, CHO 세포, Hela 세포, Vero 세포, 골수종 세포 또는 BHK 세포 중에서 발현시키는 것이 바람직하다.
이들의 경우에 있어서, 포유류 세포의 발현에 유용한 보통의 프로모터를 사용할 수 있다. 예를 들면, 인간 사이토메갈로 비루스 임미디어트 어얼리(human cytomegalovirus immediate early)(HCMV)프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. HCMV 프로모터를 함유하는 발현벡터의 예는 HCMV-VH-HCγ1, HCMV-VL-HCκ 등과 pSV2neo에서 유래된 것을 포함한다(국제특허출원 공개번호 WO 92-19759).
또한, 본 발명에서 사용되는 포유류 세포 중의 유전자 발현의 프로모터로서,레트로비루스(retrovirus), 폴료마비루스(polyomavirus), 아데노비루스 (adeno-virus), 시미안비루스(simian virus) 40(SV40) 등의 비루스성 프로모터, 및 인간 폴리펩티드쇄 신장인자 1α(HEF-1α)등의 포유류 세포에서 유래한 프로모터를 사용할 수 있다. 예를들면, SV40의 프로모터를 사용할 경우, 물리간(Mulligan)등의 방법(Nature 277,108 (1979))을 사용하여 발현을 용이하게 행할 수 있으며, HEF-1α 프로모터를 사용할 경우에는 미즈시마, 에스(Mizushima, S.)등의 방법(Nucleic Acids Research, 18, 5322, 1990)을 사용하여 발현을 행할 수 있다.
복제기원으로서, SV40, 폴료마 비루스, 아네노 비루스, 소의 유두종 비루스(BPV) 등에서 유래된 것들을 사용할 수 있고, 숙주 세포계 중에서 유전자의 카피수(copy number)를 증폭시키기 위하여, 발현벡터는 선택 마커(selective marker)로서 아미노글리코시드 포스포트란스페라제(APH)유전자, 티미딘 키나제(TK)유전자, 대장균 크산틴-구아닌 포스포리보실 트란스페라제(Ecogpt)유전자, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)유전자 등을 포함할 수 있다.
4. 키메라 항체 또는 재구성 인간 항체의 결합저해활성
(1) 항체농도의 측정
정제된 항체의 농도는 ELISA 또는 흡광도 측정에 의해서 측정할 수 있다.
항체의 농도를 측정하기 위한 ELISA 플레이트를 다음과 같이 제조할 수 있다. 96개의 웰(well)로 된 ELISA 플레이트(예를 들면 NUNC사 제품, Maxisorp)의 각 정을 1㎍/㎖ 농도에서 염소 항인간 IgG 항체 100㎕로 고정화했다.
희석 완충액(예를 들면, 50㎚ Tris-HCl 1㎚ MgCl2, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, 0.02% NaN3, 1% 소혈청 알부민(BSA), pH 8.1)으로 블로킹시킨 후, 키메라 항체, 하이브리드 항체 또는 재구성 인간 항체를 발현시킨 세포의 배양 상징액, 예를 들면 COS 세포 또는 CHO 세포의 배양 상징액의 순차적 희석액, 또는 정제 키메라 항체, 하이브리드 항체 또는 재구성 인간 항체의 순차 희석액을 각 웰에 첨가했다. 이어서, 알카리성 포스파타제 결합 염소 항인간 IgG 항체 100㎕를 첨가하고, 기질 용액(Sigma 104, p-니트로페닐 포스페이트, SIGMA사제) 1㎎/ml를 첨가하고, 이어서 405㎚에서 흡광도를 마이크로플레이트 리더(microplate reader(Bio Rad))를 사용하여 측정했다. 농도 측정의 스탠다드로서, 인간 IgG1κ(The BInding site제)를 사용할 수 있다. 정제 항체의 농도는 280㎚에서 흡광도를 측정하고, 1㎎/ml를 1.35 OD로서 계산하여 얻는다.
(2) 결합활성
결합활성은 인간양막 세포주(人間羊膜細胞株) WISH(ATCC CCL 25)를 사용하는 Cell-ELISA에 의해서 측정할 수 있다. Cell-ELISA 플레이트는 다음과 같이 제조할 수 있다. 10% 소태아 혈청으로 보충한 PRMI 1640 배지로 적당한 농도에서 제조한 WISH 세포를 96웰 플레이트에 첨가하고, 철야 배양하고, PBS(-)로 2회 세정한 후, 글루타르 알데히드(Nakalai tesque사제)로 고정한다.
블로킹시킨 후, 키메라 항HM 1.24 항체, 하이브리드 항HM 1.24 항체 또는 재구성 인간 항HM 1.24 항체를 발현시킨 세포의 배양 상징액, 예를 들면 COS 세포 또는 CHO 세포의 배양 상징액을 순차적 희석액, 또는 정제 키메라 항HM 1.24 항체, 하이브리드 항HM 1.24 항체 또는 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 순차 희석액 100㎕를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 배양시킨 후, 퍼옥시다제 표지 토끼 항인간 HgG 항체(DAKO사)를 첨가했다.
실온에서 1시간 동안 배양시킨 후, 기질 용액을 첨가하고, 이어서 배양했다. 이어서, 반응을 6N 황산 50㎕로 정지시키고, 이어서 490㎚에서 흡광도를 MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad사 제)를 사용하여 측정했다.
(3) 결합저해활성의 측정
비오티닐화 마우스 항HM 1.24 항체에 의한 결합저해활성은 인간양막세포주 WISH(ATCC CCL25)를 사용하는 Cell-ELISA에 의해서 측정했다. Cell-ELISA 플레이트는 상기(2)에 따라서 제조할 수 있다. 10% 소태아 혈청으로 보충한 PRMI 1640 배지로 적당한 농도에서 제조한 WISH 세포를 96웰 플레이트에 첨가하고, 철야 배양시키고, PBS(-)로 2회 세정한 후, 0.1% 글루타르 알데히드(Nakalai tesque사제)로 고정했다.
블로킹시킨 후, 키메라 항HM 1.24항체, 하이브리드 항HM 1.24 항체 또는 재구성 인간 항HM 1.24 항체를 발현시킨 세포의 배양 상징액, 예를 들면 COS 세포 또는 CHO 세포의 배양 상징액, 또는 정제 키메라 항HM 1.24 항체, 하이브리드 항HM 1.24항체 또는 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 순차 희석액 50㎕를 각 웰에 첨가하고, 동시에 비오티닐화 마우스 항HM 1.24 항체 2㎍/ml의 50㎕를 첨가하고, 이어서 실온에서 2시간 동안 배양시키고, 세척한 후, 퍼옥시다제 표지 스트렙타비딘 (DAKO사 제)을 첨가했다.
실온에서 1시간 동안 배양시키고, 세척한 후, 기질 용액을 첨가하고, 이어서 배양했다, 이어서, 반응을 6N 황산 50㎕로 정지하고, 이어서 490㎚에서 흡광도를 MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad사 제)을 사용하여 측정했다.
ADCC 활성의 측정
본 발명의 키메라 항체 또는 재구성 인간 항체의 ADCC 활성은 다음과 같이 측정할 수 있다. 처음에, 단핵 세포를 비중 원심법으로 인간 말초혈 및 골수로부터 분리시키고, 이펙터 세포(effector cell)로서 제조했다. RPMI 8226 세포(ATCC CCL 155)를51Cr로 표지하여 인간 골수종 세포를 표적 세포로서 제조했다. 이어서, ADCC 활성을 측정하고자 하는 키메라 항체 또는 재구성 인간 항체를 표지를 한 표적 세포에 첨가하고, 배양시킨 후, 표적 세포에 적당한 비율의 이펙터 세포를 첨가한 후, 배양시켰다.
배양시킨 후, 상징액을 취하여 감마 계수관을 사용하여 방사능을 측정했다. 이 때에, 최대 방출방사능을 측정하기 위해 1% NP-40을 사용할 수 있다. 세포독성율(%)은 (A-C)/(B-C)×100으로 계산할 수 있으며, 여기서 A는 항체 존재하에 방출된 방사능(cpm)이고, B는 NP-40에 의해 방출된 방사능(cpm)이고, C는 항체없이 배양액만에서 방출된 방사능(cpm)이다.
항체 C영역에 대해서 ADCC 활성 또는 CDC 활성을 기대하는 경우, 항체 C영역으로서 인간 Cγ1 또는 인간 Cγ3를 사용할 수 있다. 또한, 항체 C영역의 아미노산의 일부를 첨가, 변경 또는 변이시킴으로써, 보다 높은 ADCC활성 또는 CDC 활성을 유도할 수 있다.
예를 들면, 아미노산 치환에 의한 IgG의 IgM과 같은 중합화(Smith, R.I.F. & Morrison, S.L, BIO/TECHNOLOGY (1994) 12, 683-688), 아미노산 첨가에 의한 IgG의 IgM과 같은 중합화(Smith, R.I.F. et al., J. Immunol. (1995) 154, 2226-2236), L쇄를 코드하는 유전자의 직열연결에 의한 발현(Shuford, W. et al., Science (1991) 252, 724-727), 아미노산 치환에 의한 IgG의 이량체화(Caron, P.C. et al., J. Exp. Med. (1992) 176, 1191-1195, Shopes, B.J. Immunology (1992) 148, 2918-2922), 화학적 변이에 의한 IgG의 이량체화(Wolff, E.A. et al., Cancer Res. (1993) 53, 2560-2565), 및 항체 힌지 영역(hinge region)에서 아미노산 변경에 의한 이펙타 기능(effector function)의 도입(Norderhaug, L. et al., Eur. J. Immunol. (1991) 21, 2379-2384)을 열거할 수 있다. 이들 프라이머를 사용하는 올리고머 부위 특이적 변이도입법, 제한효소 분할부위를 사용하는 염기서열의 첨가 및 공유결합을 유도하는 화학적 개질제에 의해서 성취할 수 있다.
골수종 체내 진단약
본 발명의 키메라 항HM 1.24 항체 또는 재구성 인간 항HM 1.24 항체를 방사성 동위원소 등과 같은 표지 화합물과 결합시킴으로써 골수종 체내 진단약으로서 사용할 수 있다.
또한, 키메라 항HM 1.24 항체 또는 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 단편, 예를 들면 Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fr(scFv)(여기서, Fv 또는 H쇄 및 L쇄의 Fv는 방사성 동위원소 등의 표지 화합물에 결합되어 있는 적당한 결합제에 의해서 결합됨)를 골수종 체내 진단약으로서 사용할 수 있다.
구체적으로, 이들 항체의 단편은 이들 항체 단편을 코드하는 유전자를 구축하고, 이 유전자를 발현벡터에 도입하고, 이어서 적당한 숙주세포 중에서 발현시키든가, 또는 키메라 항HM 1.24 항체 또는 재구성 인간 항HM 1.24 항체를 적당한 효소로 소화시킴으로써 얻을 수 있다.
상기 골수종 체내 진단약은 비경구적으로 전신에 투여할 수 있다.
제약 조성물 및 골수종 치료제
본 발명의 키메라 항HM 1.24 항체 또는 인간화 항HM 1.24 항체의 치료효과를 확인하기 위하여, 상기 항체를 골수종 세포를 이식한 동물에게 투여하고, 항 종양효과를 평가한다.
동물에게 이식되는 골수종 세포로서, 인간 골수종 세포가 바람직하며, 예를 들면 KPMM2(일본국 특허공개 7-236,475호), RPMI 8226(ATCC CCL 155), ARH-77(ATCC CRL 1621), 및 S6B45(Suzuki, H. et al., Eur. J. Immunol. (1992) 22, 1989-1993)를 열거할 수 있다. 상기 골수종 세포를 이식하는 동물로서, 면역기능이 저하되었거나 결실(缺失)한 동물이 바람직하며, 그 예로는 누드 마우스(nude mouse), SCID 마우스, 베이지 마우스(beige mouse) 및 누드 쥐를 열거할 수 있다.
또한, 평가하는 항종양효과는 혈청 중의 인간 면역글로불린 양의 변화, 종양체적 및/또는 중량의 측정, 뇨 중의 인간 벤스 존스 단백질(human Bence Jones proteins) 중량의 변화, 동물의 생존기간 등으로 확인할 수 있다.
유효성분으로서 본 발명의 키메라 항HM 1.24 항체 또는 재구성 인간 항HM 1.24 항체를 함유하는 골수종 치료제 또는 제약조성물은 비경구적 방법으로 전신 또는 국소에 투여할 수 있다. 예를 들면, 적주(滴注) 등의 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사 또는 피하 주사를 선택할 수 있으며, 투여량은 환자의 연령, 의학적 증상에 의존해서 적의 선택할 수 있다.
유효투여량은 0.1 내지 1000㎎/㎏ 체중/투여량의 범위에서 선택한다. 다른 방법으로, 5㎎/체중, 바람직하기로는 50-100㎎/체중의 투여량을 선택할 수 있다.
유효성분으로서 본 발명의 키메라 항HM 1.24 항체 또는 재구성 인간 항HM 1.24 항체를 함유하는 골수종 치료제 또는 제약조성물은 투여경로에 의존해서 약물학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 함유할 수 있다.
상기 담체 또는 첨가제의 예로서, 물, 약물학적으로 허용되는 유기용매, 콜라겐, 폴리비닐 알콜, 폴리피롤리돈, 카르복시비닐 폴리머, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소듐 폴리아크릴레이트, 알긴산 나트륨, 수용성 덱스트란, 소듐 카르복시메틸 스타치, 펙틴, 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 크산탄 검, 아라비아 검, 카세인, 젤라틴, 한천, 디글리세린, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴 알콜, 스테아르 산, 인간 혈청 알부민(HSA), 만니톨, 솔비톨, 락토스, 약물학적으로 허용되는 계면활성제 등을 열거할 수 있다. 사용하는 첨가제는 제한하는 것은 아니지만, 상기한 것들 또는 이들의 조합에서 선택할 수있다.
다음에, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다.
실시예 1. 마우스 항HM 1.24 항체 V 영역을 코드하는 cDNA의 클로닝
1. 메신저-RNA(mRNA)의 단리
마우스 항HM 1.24 항체를 생산하는 2×108개의 하이브리도마 세포(FERM BP-5233)으로부터 Fast Track mRNA Isolation Kit Version 3.2(Invitrogen사제)을 사용하고 키트에 첨부된 지시서에 따라 mRNA의 단리를 행하였다.
2. 항체 가변 영역을 코드하는 유전자의 PCR 법에 의한 증폭
증폭 Thermal Cycler(Perkin Elmer Cetus사제)를 사용하여 PCR을 수행하였다.
2-1. 마우스 L쇄 V영역을 코드하는 유전자의 증폭 및 단편화
단리한 mRNA부터 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(Life Science사제)을 사용하여 단일 가닥 cDNA를 합성하고, PCR에 사용하였다. 또, PCR에 사용하는 프라이머는 마우스 카파형 L쇄의 리더 서열과 교잡하는 서열번호 29-39으로 나타낸 MKV(Mouse Kappa Variable) 프라이머(Jones, S.T. 등, Bio/Technology, 9, 88-89, (1991))를 사용하였다.
PCR 용액 100㎕은 10mM Tris-HCl(pH 8.3), 50mM KCl, 0.1mM dNTPs(dATP, dGTP, dCPT, dTTP), 1.5mM MgCl2, 5유니트의 DNA 폴리머라제 Ampli Taq(Perkin Elmer Cetus사제), 0.25mM의 서열번호 29-39으로 나타낸 MKV 프라이머 3mM의 서열번호 40으로 나타낸 MKC 프라이머 및 단일 가닥 cDNA 100ng을 함유하는 PCR 용액 100㎕을 광유 50㎕로 덮고, 이어서 94℃의 초기 온도에서 3시간, 이어서 94℃에서 1시간, 55℃에서 1분간 및 72℃에서 1분간, 이 순서로 가열하였다. 이 온도 사이클을 30회 반복한 후, 반응 혼합물을 72℃에서 10분간 배양하였다. 증폭한 DNA 단편을 저융점 아가로스(Sigma사제)로 정제하고, XmaI(New England Biolabs사제) 및 SalI(Takara Shuzo사제)에 의해 37℃에서 소화하였다.
2-2. 마우스 H쇄 V 영역을 코드하는 cDNA의 증폭 및 단편화
마우스 H쇄 V영역을 코드하는 유전자를 5'-RACE법(Rapid Amplification of cDNA ends; Frohman, M.A. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, (1988), Edwards, J.B.D.M 등, Nucleic Acid Res., 19, 5227-5232, (1991))에 의해 증폭하였다. 마우스 IgG2a 불변영역에 특이적으로 교잡하는 프라이머 P1(서열번호 41)을 사용하여 cDNA를 합성한 후, 5'-AmpliFINDER RACE KIT(CLONTECH사제)를 사용하여 마우스 H쇄 V영역을 코드하는 cDNA의 증폭을 마우스 IgG2a 불변영역에 특이적으로 교잡하는 프라이머-MHC2a(서열번호 42) 및 키트 첨부 앤커 프라이머 (서열번호 77)을 사용하여 행했다. 증폭한 DNA단편을 저융점 아가로스 (Sigma사제)로 정제하고, 이어서 EcoRI(Takasa Shuzo사제) 및 XmaI(New England Biolabs사제)으로 37℃에서 소화하였다.
3. 연결 및 형질전환
상기와 같이 제조한 마우스 카파형 L쇄 V영역을 코드하는 유전자로 이루어진DNA 단편을 50mM Tris-HCl(pH 7.6), 10mM MgCl2, 10m 디티오트레이톨, 1mM ATP, 50mg/ml의 폴리에틸렌 글리콜(8000) 및 1유니트의 T4 DNA 리가제(GIBCO-BRL사제)를 함유하는 반응 혼합물 중에서, 16℃에서 2.5시간 반응시켜, SalI 및 XmaI으로 소화시켜 제조한 pUC19에서 벡터와 연결하였다. 유사하게, 마우스 H쇄 V영역을 코드하는 유전자로 이루어진 DNA 단편을, EcoRI 및 Xmal로 제조한 pUC19 벡터와 16℃에서 3시간 반응시켜 연결하였다.
이어서, 10㎕의 상기 연결 혼합물을 대장균 DH5α의 수용성 세포 (competent cell) 50㎕에 첨가한 다음, 이 세포를 빙상에서 30분간, 42℃ 1분간, 이어서 다시 빙상에서 1분간 방치하였다. 이어서, 여기에 400㎕의 2xYT배지 (Molecular Cloning:A Laboratory Manua1, Sambrook 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989))를 첨가하고, 37℃에서 1시간 배양한 후, 대장균을 50㎍/ml의 앰피실린을 함유하는 2xYT한천배지(Molecular Cloning:A Laboratory Manua1, Sambrook 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)) 위에 플레이트 하고 37℃에서 철야 배양하여 대장균 형질전환체를 얻었다.
이 형질전환체를, 50㎍/ml의 앰피실린을 함유하는 2xYT배지 10ml 중에서 37℃에서 배양한 다음, 이 배양물로부터, 알카리법(Molecular Cloning:A Laboratory Manua1, Sambrook 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989))에 따라서 플라스미드 DNA를 제조하였다.
이와 같이하여 얻은, 항HM 1.24 항체를 생성하는 하이브리도마에 유래하는마우스 카파형 L쇄 V영역을 코드하는 유전자를 함유하는 플라스미드를 pUCHMVL9로 명명하였다. 상기 방법에 따라서 얻어진, 항HM 1.24 항체를 생성하는 하이브리도마에 유래하는 마우스 H쇄 V영역을 코드하는 유전자를 함유하는 플라스미드를 pUCHMVHR16으로 명명하였다.
실시예 2. DNA 염기서열의 결정
상기 플라스미드 중의 cDMA 코드영역의 염기서열을, 자동 DNA 시퀀서(Applied Biosystem Inc.사제)와 Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystem Inc.사제)를 사용하고, 메이커 지정의 프로토콜에 따라서 결정하였다.
플라스미드 pUCHMVL9에 함유된 마우스 항HM 1.24 항체의 L쇄 V영역을 코드하는 유전자의 염기서열을 서열번호 1에 나타냈다. 플라스미드 pUCHMVHR16에 함유된 마우스 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역을 코드하는 유전자의 염기서열을 서열번호 2에 나타냈다.
실시예 3. CDR의 결정
L쇄 및 H쇄의 V영역의 전체 구조는, 서로 유사성을 갖고 있고, 여기서 각각 4개의 프레임워크 부분이 3개의 초가변영역, 즉 상보성결정영역(CDR)에 의해 연결된다. 프레임워크의 아미노산 서열은, 비교적 잘 보존되지만, 한편 CDR영역의 아미노산 서열의 변이성은 매우 높다(Kabat, E.A., 등,'Sequences of Proteins of Immunological Interest', US Dept. Health and Human Services, 1983).
이러한 사실에 기초하여, 항HM 1.24 항체 가변영역의 아미노산 서열은 상동성을 조사하기 위하여 데이타베이스에서 항체 아미노산 서열과 비교하여, CDR 영역을 표 5에 나타낸 바와 같이 결정하였다.
플라스미드 서열번호 CDR(1) CDR(2) CDR(3)
pUCHMVL9 3-5 24-34 50-56 89-97
pUCHMVHR16 6-8 31-35 50-66 99-109
실시예 4. 클로닝한 cDNA의 발현의 확인(키메라 항HM 1.24 항체의 제조)
1. 발현 벡터의 제조
키메라 항HM 1.24 항체를 발현하는 벡터를 제조하기 위하여, 마우스 항HM 1.24 항체 L쇄 및 H쇄 V영역을 각각 코드하는 cDNA 클론 pUCHMVL9 및 pUCHMVHR16을 PCR법에 의하여 변이시킨 다음, HEF 발현 벡터(국제특허출원공개번호 WO92-19757 참조)에 도입하였다.
L쇄 V영역을 위한 후방 프라이머 ONS-L722S(서열번호 43)과 H쇄 V영역을 위한 후방 프라이머 VHR16S(서열번호 44)는 각 V영역의 리더 서열의 처음을 코드하는 DNA에 교잡하고 Kozak 콘센서스 서열(Kozak, M, 등, J. Mol. Biol., 196, 947-950, (1987))과 HindⅢ 제한효소인식부위를 갖도록 설계하였다. L쇄 V영역을 위한 전방 프라이머 VL9A(서열번호 45)와 H쇄 V영역을 위한 전방 프라이머 VHR16A(서열번호 46)는, J영역의 말단을 코드하는 DNA서열에 교잡하고 스플라이스 도너 서열과 BamHI 제한효소인식부위를 갖도록 설계하였다.
10mM Tris-HCl(pH 8.3), 50mM KCl, 0.1mM dNTPs, 1.5mM MgCl2, 100pmol씩의각 프라이머, 100ng의 주형 DNA(pUCHMVL 9 또는 pUCHMVHR16)과 5유니트의 Ampli Taq 효소를 함유하는 100㎕의 PCR 반응 혼합물을 50㎕의 광유로 덮고, 94℃에서 최초의 변성 후, 94℃에서 1분간, 55℃에서 1분간, 72℃에서 1분간 가열하고, 이 온도 사이클로 30회 반복하고, 최종적으로 72℃에서 10분간 배양하였다.
PCR 생성물을 1.5% 저융점 아카로스 겔을 사용하여 정제하고, HindⅢ 및 BamHI로 소화한 다음, L쇄 V영역에 대하서는 HEF-VL-gκ에, H쇄 V영역에 대해서는 HEF-VH-gγ1에 각각 클로닝하였다. DNA 서열 결정 후, 정확한 DNA 서열을 갖는 DNA 단편을 함유하는 플라스미드를 각각 HEF-1.24L-gκ 및 HEF-1.24H-gγ1으로 명명하였다.
상기 플라스미드 HEF-1.24L-gκ1 및 HEF-1.24H-gγ1으로부터 각각의 가변영역을 코드하는 영역을 제한효소 HindⅢ 및 BamHI로 소화하여 제한단편을 만들고, 이들을 플라스미드 벡터 pUC19의 HindⅢ부위 및 BamHI부위에 삽입하고, 각 pUC19-1.24L-gκ 및 pUC19-1.24H-gγ1으로 명명하였다.
각각의 플라스미드 pUC19-1.24L-gκ 및 pUC19-1.24H-gγ1을 함유하는 대장균을 각각 대장균 DH5α(pUC19-1.24L-gκ) 및 대장균 DH5α(pUC19-1.24H-gγ1)로 칭하고, 부다페스트 조약의 규정에 의하여 각각 수탁번호 FERM BP-5646 및 FERM BP-5644로서, 공업기술원생명공학공업기술연구소(일본국, 이바라키켄, 츄쿠바시, 히가시 1-쵸메 1-3)에 1996년 8월 29일에 국제기탁되었다.
2. COS-7 세포로의 트렌스펙션(transfection)
키메라 항HM 1.24 항체의 일과성 발현을 관찰하기 위하여, 상기 발현 벡터를COS-7(ATCC CRL-1651) 세포 중 에서 시험하였다. HEF-1.24L-gκ 및 HEF-1.24H-gγ1을 Gene Pulser 장치(BioRad사제)를 사용하여 전기영동에 의해 COS-7세포로 동시형질전환하였다. 각 DNA(10㎍)을, PBS 중에서 1×107세포/ml의 부분 표본(aliquot) 0.8ml에 첨가하고, 1500V, 25μF의 용량으로 펄스를 부여하였다.
실온에서 10분간의 회복기간 후, 전기영동 처리된 세포를, 10% γ-글로블린 유리 소태아혈청을 함유하는 DMEM 배양액(GIBCO사제) 30ml에 첨가하였다. CO2인큐베이터 BNA120D(TABAI사제) 중에서 72시간의 배양시킨 후, 배양 상징액을 모으고, 원심분리에 의해 세포 단편을 분리하여, 이것을 이하의 실험에 사용하였다.
3. FCM 분석
키메라 항HM 1.24 항체의 항원 결합활성은, KPMM2 세포를 사용한 FCM(flow cytometry) 분석으로 조사하였다. 4.7×105개의 KPMM2 세포(일본국 특허공개 7-236475)를 PBS(-)로 세정한 후, 상기 키메라 항HM 1.24 항체를 생성하는 COS-7 세포 배양액 50㎕ 및 FACS 완충액(2% 소태아 혈청 및 0.1% 아지드화 나트륨을 함유하는 PBS(-)) 50㎕, 또는 500㎍/ml의 정제 마우스 항HM 1.24 항체 5㎕ 및 FACS 완충액 95㎕를 첨가하고, 얼음 위에서 1시간 동안 배양했다.
대조군으로서, 2㎍/ml 키메라 SK2(국제특허출원공개번호 WO94-28159) 50㎕ 및 FACS 완충액 50㎕, 또는 정제 마우스 항HM 1.24 항체 대신에 500㎍/ml의 정제 마우스 IgG2aκ(UPC10)(CAPPEL사제) 5㎕ 및 FACE 완충액 95㎕을 첨가하고, 유사하게 배양하였다. FACE 완충액으로 세정한 후, 25㎍/ml의 FITC 결합 염소 항 인간 항체(GAH)(CAPPEL사제) 또는 10㎍/ml의 FITC 결합 염소 항마우스 항체 (GAM)(Becton Dickinson사제) 100㎕를 첨가하고, 빙온하에서 30분간 배양하였다. FACS 완충액으로 세정한 후, FACS 완충액 1ml에 현탁하고, FACScan(Becton Dickinson사제)으로 각세포의 형광강도를 측정하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 키메라 항HM 1.24 항체를 첨가한 세포에서는, 마우스 항HM 1.24 항체를 첨가한 경우와 유사하게, 대조군과 비교하여 형광강도의 피크가 우측으로 이동하였기 때문에, 키메라 항HM 1.24 항체가 KPMM2 세포에 결합한 것으로 나타났다. 이것에 의해, 클로닝한 cDNA는 마우스 항HM 1.24 항체의 가변 영역을 코드하고 있는 것이 확인되었다.
실시예 5. 키메라 항HM 1.24 항체를 안정하게 생성하는 CHO 세포주의 수립
1. 키메라 H쇄 발현 벡터의 제조
상기 플라스미드 HEF-1.24H-gγ1을 제한효소 PvuI 및 BamHI로 소화한 후, EF1 프로모터 및 마우스 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역을 코드하는 DNA를 함유하는 약 2.8kbp의 단편을 1.5% 저융점 아가로스 겔을 사용하여 정제하였다. 이어서, DHFR 유전자와 인간 H쇄 불변영역을 코드하는 유전자를 함유하는 인간 H쇄 발현벡터-DHFR-△E-RVh-PM1f(국제특허출원공개번호 WO92/19757 참조)에 사용되고 있는 발현 벡터를 PvuI 및 BamHI으로 소화시켜 제조된 약 6kbp의 단편에 상기 DNA 단편을 삽입하여, 키메라 항HM 1.24 항체 H쇄의 발현 벡터 DHFR-△E-HEF-1.24H-gγ1을 제조하였다.
2. CHO 세포로의 유전자 도입
키메라 항HM 1.24 항체의 안정생성계를 수립하기 위하여, PvuI로 소화해서 직쇄상으로 한, 상기 발현 벡터, HEF-1.24L-gκ 및 DHFR-△E-HEF-1.24H-gγ1의 유전자를 전기영동법에 의해 상기한 것과 유사한 조건(상기 CDS-7 세포로의 트랜스펙션)하에서, 동시에 CHO 세포 DXB11(Medical Reserch Council Collaboration Center로부터 공여)에 도입하였다.
3. MTX에 의한 유전자 증폭
유전자 도입 CHO 세포 중에서, 500㎍/ml의 G418(GIBCO-BRL사제)와 10%의 소태아 혈청을 첨가한 뉴클레오시드가 없는 α-MEM 배양액(GIBCO-BRL사제) 중에서는 L쇄 및 H쇄 발현 벡터가 함께 도입된 CHO 세포만이 생존할 수 있으므로, 이 CHO 세포를 선택하였다. 이어서, 상기 배양액 중에 10nM MTX(Sigma사제)를 첨가하였다. 증식한 클론 중에서, 키메라 항HM 1.24 항체를 다량으로 생성하는 클론을 선택했다 그 결과, 약 20㎍/ml의 키메라 항체 생성효율을 나타내는 클론 #8-13을 얻었으며, 이것을 키메라 항HM 1.24 항체 생성세포주로 칭하였다.
실시예 6. 키메라 항HM 1.24 항체의 제조
키메라 항HM 1.24 항체는 이하의 방법으로 제조하였다. 상기 키메라 항HM 1.24 항체생성 CHO 세포를, 배지로서 5% γ-글로불린 유리 신생 소혈청(GIBCO-BRL사제) 함유 Iscove's Modified Dulbecco's Medium(GIBCO-BRL사제)을 사용하고, 고밀도 세포 배양장치 Verax system 20(CELLEX BIOSCIENCE Inc.사제)로 30일간 연속배양하였다.
배양 개시 후 13, 20, 23, 26 및 30일째에, 배양액을 가압식 필터 유니트 SARTOBRAN(Sartorius사제)를 사용하여 회수한 후, 항체 대량 분취 시스템 Afi-Prep System(일본 가이시사제)와 Super Protein A column(bed volume:100ml, 일본 가이시사제)을 사용하고, 부속 설명서에 따라서 흡착/세정 완충액으로서 PBS(-)를 사용하고, 용출 완충액으로서 0.1M 구연산 나트륨 완충액(pH 3)을 사용하여 키메라 항HM 1.24 항체를 친화-정제하였다. 용출 분류물을 즉시로 1M Tris-HCl(pH 8.0)을 첨가하여, pH 7.4로 조정하였다. 항체 농도는, 280nm에서 흡광도를 측정하고, 1㎍/ml을 1.35OD로 하여 산출하였다.
실시예 7. 키메라 항HM 1.24 항체 활성의 측정
키메라 항HM 1.24 항체는 하기의 결합 저해 활성에 의해 평가를 행하였다.
1. 결합 저해 활성의 측정
1-1. 비오티닐화 항HM 1.24 항체의 제조
마우스 항HM 1.24 항체를 0.1M 중탄산염 완충액으로 4mg/ml로 희석한 후, 50mg/ml의 비오틴-N-히드록시 숙신이미드(EY LABS Inc.사제) 4㎕를 첨가하고, 실온에서 3시간 반응시켰다. 그 후, 0.2M 글라이신 용액 1.5ml을 첨가하고, 실온에서 30분간 배양하여 반응을 정지시키고, PD-10 컬럼(Pharmacia Biotech사제)을 사용하여 비오티닐화 IgG 분류물을 분취하였다.
1-2. 결합 저해 활성의 측정
비오티닐화 마우스 항HM 1.24 항체에 의한 결합 저해 활성은, 인간 양막 세포주 WISH 세포(ATCC CCL 25)을 사용하는 CELL-ELISA로 측정하였다. CELL-ELISA 플레이트는 다음과 같이 제조하였다. 96-웰 플레이트에 10% 소태아 혈청을 함유하는 PRMI 1640 배지에 의해 4×105세포/ml로 제조한 WISH 세포 현탁액 100㎕를 첨가하고, 하룻 밤 배양한 후, PBS(-)로 2회 세정 후, 0.1% 글루타르알데히드 (Nakalai tesque사제)로 고정하였다.
블로킹 후, 친화-정제에 의해 얻어진 키메라 항HM 1.24 항체 또는 마우스 항 1.24 항체의 순차 희석액 50㎕를 각 웰에 첨가하고, 동시에 2㎍/ml의 비오티닐화 마우스 항HM 1.24 항체 50㎕을 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 배양시킨 후, 퍼옥시다제 표지 스트렙타비딘(streptavidin)(DAKO사제)을 첨가하였다. 실온에서 1시간 배양시킨 후, 세정하고, 기질 용액을 첨가하였다. 6N 황산 50㎕을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad사제)를 사용하여 490nm에서의 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 비오티닐화 마우스 항HM 1.24 항체에 대하여 키메라 항HM 1.24 항체는 마우스 항HM 1.24 항체와 동등의 결합 저해 활성을 나타내었다. 이것에 의하여, 키메라 항체는 마우스 항HM 1.24 항체와 같은 V영역을 갖는 것을 나타내었다.
실시예 8. 키메라 항HM 1.24 항체의 ADCC 활성의 측정
ACDD(Antibody-dependent Cellular Cytotoxicity) 활성을 Current Protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E., Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., 1993에 기재된 방법에 따라서측정했다.
1. 이펙터 세포(effector cell)의 제조
건강한 사람과 다발성 골수종 환자의 말초혈 및 골수로부터 비중원심법으로 단핵구를 분리하였다. 이리하여 건강한 사람과 다발성 골수종 환자의 말초혈 및 골수에 등량의 PBS(-)를 첨가하고, 이것을 Ficoll(Pharmacia사제)-Conrey(제일제약사제)(비중 1.077)에 적층하고, 400g으로 30분간 원심 분리하였다. 단핵구층을 분취하고, 10% 소태아 혈청(Witaker사제)를 함유하는 RPMI1640(Sigma사제)로 2회 세정 후, 동배양액으로 세포수가 5×106/ml이 되도록 제조하였다.
2. 표적 세포의 제조
인간 골수종 세포주 RPMI 8226(ATCC CCL 155)을 0.1mCi의51CR-크롬산 나트륨과 함께 10% 소태아 혈청(Witaker사제)를 함유하는 RPMI 1640(Sigma사제) 중에서 37℃에서 60분 동안 배양시킴으로써 방사성 표지하였다. 방사성 표지 후, 세포를 행크스 평형 염 용액(Hanks blanced salt solution)(HBSS)으로 3회 세정하고, 2×105/ml의 농도로 조정하였다.
3. ADCC 평가
96-웰 U-바닥 플레이트(Corning사제)에 방사성 표지한2×10 5 /ml의 표적 세포 50㎕,1㎍/ml의 친화-정제 키메라 항HM 1.24 항체 및 마우스 항HM 1.24 항체, 또는 대조 인간 IgG1(Serotec사제)를 50㎕ 첨가하고, 4℃에서 15분 동안 반응시켰다.
이어서,5×10 6 /ml 이펙터 세포 100㎕를 첨가하고, 탄산 가스 배양기 중에서 4시간 배양했다. 이때, 이펙터 세포(E) 대 표적 세포(T)의 비(E:T)를 0:1, 5:1, 20:1 또는 50:1로 하였다.
상징액 100㎕를 취하고, 감마 카운터(ARC361, Aloka사제)로 배양 상징액 중에 방사된 방사능을 측정하였다. 최대 방사능을 측정하기 위하여 1% NP-40(BRL사제)를 사용하였다. 세포독성(%)는 (A-C)/(B-C)×100으로 계산하였고, 여기서 A는 항체 존재하에 방출된 방사능(cpm)이고, B는 NP-40에 의하여 방출된 방사능(cpm)이고, C는 항체를 함유하지 않는 배양액에서 방출된 방사능(cpm) 이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 대조군 IgG1과 비교하여, 키메라 항HM 1.24 항체를 첨가한 경우, 세포독성 E:T의 비가 증가함에 따라 증가하였으며, 이것은 키메라 항HM 1.24 항체가 ADCC 활성을 갖는 것을 나타내 주었다. 또한, 마우스 항HM 1.24 항체를 첨가해도 세포독성이 관찰되지 아니했으므로, 이펙터 세포가 인간 유래의 세포인 경우, ADCC 활성을 얻기 위해서는 인간 항체의 Fc부분이 필요한 것으로 나타났다.
실시예 9. 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 제작
1. 재구성 인간 항HM 1.24 항체 V영역의 설계
마우스 모노클로날 항체의 CDR이 인간 항체에 이식되어 있는 재구성 인간 항체를 제조하기 위해서는, 마우스 항체의 FR과 인간 항체의 FR과의 사이에 높은 상동성이 존재하는 것이 바람직하다. 그리하여, 마우스 항HM 1.24 항체의 L쇄와 H쇄의 V영역을, Protein Data Bank를 사용하여 구조가 밝혀져 있는 공지의 항체의 V영역과 비교하였다.
마우스 항HM 1.24 항체의 L쇄 V영역은 인간 L쇄 V영역 서브그룹Ⅳ(HSGIV)의 콘센서스 서열과 가장 유사하고, 상동성은 66.4% 이다. 한편, HSGI, HSGⅡ 및 HSGⅢ와는 각각 56.9%, 55.8% 및 61.5%의 상동성을 나타냈다.
마우스 항HM 1.24 항체의 L쇄 V영역을 공지 인간 항체 L쇄 V영역과 비교할 경우, 인간 L쇄 V영역의 서브 그룹 I의 하나인 인간 L쇄 V영역 REI에 67.0%의 상동성을 나타내었다. 따라서, 재구성 인간 항HM 1.24 항체 L쇄 V영역을 제조하기 위한 출발 물질로서 REI의 FR을 사용하였다.
재구성 인간 항HM 1.24 항체 L쇄 V영역의 버전 a를 설계하였다. 이 버전에 있어서, 인간 FR은 재구성 인간 CAMPATH-1H 항체 중에 존재하는 REI에 기초한 FR(Riechmann, L. 등, Nature 322, 21-25, (1988)을 참조, 국제특허출원공개번호 WO92-19759에 기재된 재구성 인간 PM-1의 L쇄 V영역의 버전 a에 함유된 FR)과 동일하게 제조하고, 마우스 CDR은 마우스 항HM 1.24 항체 L쇄 V영역 중의 CDR과 동일하게 제조하였다.
마우스 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역은 인간 H쇄 V영역의 HSGI의 콘센서스 서열과 가장 유사하고, 상동성은 54.7% 이다. 한편, HSGⅡ와 HSGⅢ와는 각각 34.6%와 48.1%의 상동성을 나타내었다. 마우스 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역을 공지의 인간 항체 H쇄 V영역과 비교한 경우, FR1 내지 FR3은, 인간 H쇄 V영역의 서브 그룹 I의 하나인, 인간 항체 HG3의 H쇄 V영역(Rechavi, G. 등, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 80, 855-859)과 가장 유사하고, 상동성은 67.3%이었다.
그러므로, 인간 HG3의 FR을, 재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역을 제조하기 위한 출발 물질로서 사용하였다. 그러나, 인간 항체 HG3의 FR4의 아미노산 서열은 기술되어 있지 않기 때문에, 마우스 항HM 1.24 항체 H쇄의 FR4와 가장 높은 상동성을 나타내는 인간 항체 JH6(Ravetch, J, V. 등, Cell, 27, 583-591)의 FR4의 아미노산 서열을 사용하였다. JH6의 FR4는 하나의 아미노산을 제외하고 마우스 항HM 1.24 항체 H쇄의 FR4와 동일의 아미노산 서열을 갖는다.
재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역의 제 1버전 a에 있어서, 인간 FR1 중의 30위치와 인간 FR3 중의 71위치의 아미노산을 마우스 항HM 1.24 항체의 아미노산과 동일하게 만든 것을 제외하고는, FR1 내지 FR3은 인간 HG3의 FR1 내지 FR3과 동일하게 만들고, CDR은 마우스 항HM 1.24 항체의 H쇄 V영역 중의 CDR와 동일하게 만들었다.
2. 재구성 인간 항HM 1.24 항체 L쇄 V영역의 제조
재구성 인간 항HM 1.24 항체 L쇄를, PCR법에 의한 CDR 그레프팅(grafting)에 의하여 제조하였다. 이 방법을 도 4에 나타내었다. 인간 항체 REI 유래의 FR을 갖는 재구성 인간 항HM 1.24 항체(버전 a)를 제조하기 위하여 8개의 PCR 프라이머를 사용하였다. 외부 프라이머 A(서열번호 47)과 H(서열번호 48)를 발현 벡터 HEF-VL-gκ의 DNA 서열과 교잡하도록 설계하였다.
CDR 그레프팅 프라이머 LIS(서열번호 49), L2S(서열번호 50) 및 L3S(서열번호 51)는 센스 DNA 서열을 갖는다. CDR 그레프팅 프라이머 LIA(서열번호 52), L2A(서열번호 53) 및 L3A(서열번호 54)는 안티센스 DNA 서열을 갖고, 이들은 각각 프라이머 LIS, L2 및 L3S의 5'-말단의 DNA 서열에 대한 상보적 DNA 서열(20∼23bp)을 갖는다.
제 1 PCR 단계에 있어서, 4개의 반응, A-L1A, L1S-L2A, L2S-L3A 및 L3S-H를 행하여, 각 PCR 생성물을 정제하였다. 제 1 PCR로부터 4개의 PCR 생성물을 그것들 자체의 상보성에 의하여 서로 어셈블리시켰다(국제특허출원공개번호 WO92-19759 참조). 이어서, 외부 프라미어 A와 H을 첨가해서, 재구성 인간 항HM 1.24 항체 L쇄 V영역을 코드하는 전장(全長) DNA을 증폭하였다(제 2 PCR). 상기 PCR에 있어서, 인간 항체 REI 유래의 FR에 기초한 재구성 인간 ONS-M21 항체 L쇄 V영역 버전 a를 코드하는 플라스미드 HEF-RVL-M21a(국제특허출원공개번호 WO95-14041을 참조)을 주형으로 사용하였다.
제 1 PCR 단계에 있어서, 10mM Tris-HCl(pH 8.3), 50mM KCl, 0.1mM dNTPs, 1.5mM MgCl2, 100ng의 주형 DNA, 100pmole의 각 프라이머와 5u의 Ampli Taq를 함유하는 PCR 혼합물을 사용하였다. 각 PCR 튜브는 광유 50㎕로 덮었다. 이어서, 최초에 94℃에서 가열시켜 변성한 후, 94℃에서 1분간, 55℃에서 1분간 및 72℃에서 1분간 반응 사이클을 행한 다음, 72℃에서 10분간 배양하였다.
PCR 생성물 A-L1A(215bp), L1S-L2A(98bp), L2S-L3A(140bp) 및 L3S-H(151bp)을 1.5% 저융점 아가로스 겔을 사용하여 정제하고, 제 2 PCR에서 어셈블리하였다.제 2 PCR에 있어서는, 1㎍의 제 1 PCR 단계의 각 생성물, 및 5u의 Ampli Taq를 함유하는 PCR 혼합물 98㎕를, 94℃에서 2분간, 55℃에서 2분간 및 72℃에서 2분간으로 2사이클 배양한 다음, 100pmole의 각 외부 프라이머(A와 H)를 첨가하였다. PCR 튜브를 광유 50㎕로 덮고, 상기와 동일한 조건에서 30사이클의 PCR을 행하였다.
제 2 PCR에서 생성되는 516bp의 DNA단편을 1.5% 저융점 아가로스 겔로 정제하고, BamHI 및 HindⅢ으로 소화하고, 이와 같이하여 얻어진 DNA 단편을 HEF 발현 벡터 HEF-VL-gκ에 클로닝하였다. DNA 서열 결정 후, 재구성 인간 항HM 1.24 항체 L쇄 V영역의 정확한 아미노산 서열을 갖는 DNA 단편을 함유하는 플라스미드를 플라스미드 HEF-RVLa-AHM-gκ로서 명명하였다. 이 플라스미드 HEF-RVLa-AHM-gκ에 함유된 L쇄 V영역의 아미노산 서열과 염기 서열을 서열번호 9에 나타냈다.
재구성 인간 항HM 1.24 항체 L쇄 V영역의 버전 b를 PCR을 사용하는 변이유발법에 의하여 제조하였다. 변이원 프라이머 FTY-1(서열번호 55) 및 FTY-2 서열번호 56)은, 71위치의 페닐알라닌을 티로신으로 변이되도록 설계하였다.
상기 프라이머를 주형으로 플라스미드 HEF-RVLa-AHM-gκ를 증폭시킨 후, 최종 생성물을 정제하고, BamHI와 HindⅢ로 소화했다. 얻어진 DNA 단편을 HEF 발현 벡터 HEF-VL-gκ로 클로닝하여, 플라스미드 HEF-RVLb-AHM-gκ를 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVLb-AHM-gκ에 함유된 L쇄 V영역의 아미노산 서열과 염기 서열을 서열번호 10에 나타냈다.
3. 재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역의 제조
3-1. 재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역의 버전 a-e의 제조
재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역을 코드하는 DNA를 다음과 같이 설계하였다. 인간 항체 HG3의 FR1 내지 FR3과 인간 항체 JH6의 FR4를 코드하는 DNA 서열을 마우스 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역의 CDR를 코드하는 DNA서열에 연결시킴으로써, 재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역을 코드하는 전장 DNA를 설계하였다.
이어서, 이 DNA 서열의 각각 5'-말단 및 3'-말단에 HindⅢ 인식부위/Kozak 콘센서수 서열과 BamHI 인식부위/스플라이스 도너(splice donor) 서열을 부가하여, HEF 발현 벡터에 삽입할 수 있도록 하였다.
이와 같이 설계한 DNA 서열을 4개의 올리고뉴클레오티드로 분할하였다. 이어서, 이들 올리고뉴클레오티드의 어셈블리를 방해할 가능성이 있는 올리고 뉴클레오티드의 이차 구조에 대하여 컴퓨터 분석하였다. 4개의 올리고 뉴클레오티드 서열 RVH1 내지 RVH4를 서열번호 57 내지 60에 나타냈다. 이들 올리고 뉴클레오티드는 119 내지 144 염기의 길이를 갖고, 25 내지 26 bp 중복 영역(overlapping region)을 갖는다. 올리고 뉴클레오티드 중에서, RVH2(서열번호 58) 및 RVH4(서열번호 60)는 센스 DNA 서열을 갖고, 그리고 RVH1(서열번호 57) 및 RVH3(서열번호 59)는 안티센스 DNA 서열을 갖는다. 이들 4개의 올리고뉴클레오티드의 PCR 법에 의한 어셈블리 방법을 도면에 나타냈다(도 5 참조).
100ng씩의 4종의 올리고뉴클레오티드와 5u의 Ampli Taq를 함유하는 PCR 혼합물(98㎕)을, 94℃에서 2분간 가열시켜 최초 변성한 후, 94℃에서 2분간, 55℃에서 2분간 및 72℃에서 2분간으로, 이와 같은 온도 사이클 2회로 배양시켰다. 100pmole씩의 RHP1(서열번호 61) 및 RHP2(서열번호 62)를 외부 프라이머로서 첨가한 후,PCR 튜브를 광유 50㎕로 덮은 다음, 94℃에서 1분간 가열시켜 최초 변성한 후, 94℃에서 1분간, 55℃에서 1분간 및 72℃에서 1분간으로 38사이클을 행하고, 이어서 72℃에서 10분간 배양하였다.
438bp DNA 단편을 1.5% 저융점 아가로스 겔을 사용하여 정제하고, Hind Ⅲ 및 BamHI으로 소화한 다음, HEF 발현 벡터 HEF-VH-gγ1으로 클로닝하였다. DNA 서열 결정 후, 정확한 H쇄 V영역의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 단편을 함유하는 플라스미드를 HEF-RVHa-AHM-gγ1으로서 명명하였다. 이 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열과 염기 서열을 서열번호 11로 나타냈다.
재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역의 각 버전 b, c, d 및 e를 다음과 같이 제조하였다.
변이원 프라이머로서 66위치의 아르기닌을 라이신으로 변이하도록 설계한 BS(서열번호 63) 및 BA(서열번호 64)를 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 b를 PCR법으로 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHb-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHb-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기서열을 서열번호 12에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 73위치의 트레오닌을 라이신으로 변이하도록 설계한 CS(서열번호 65) 및 CA(서열번호 66)을 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 c를 PCR법으로 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHc-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHc-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기 서열을 서열번호 13에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 66위치의 아르기닌을 라이신으로, 73위치의 트레오닌을 라이신으로 변이하도록 설계한 DS(서열번호 67) 및 DA(서열번호 68)을 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 d를 PCR법으로 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHd-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHd-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기서열을 서열번호 14에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 67위치의 발린을 알라닌으로, 69위치의 메티오닌을 로이신으로 변이하도록 설계한 ES(서열번호 69) 및 EA(서열번호 70)을 사용하여, 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1를 사용하고, 버전 e를 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHe-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHe-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기 서열을 서열번호 15에 나타냈다.
3-2. H쇄 하이브리드 V영역의 제작
2개의 H쇄 하이브리드 V영역을 제조하였다. 하나는 FR1 및 FR2의 아미노산 서열이 마우스 항HM 1.24 항체에서 유래되고, FR3 및 FR4의 아미노산 서열이 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 H쇄 V영역의 버전 a에서 유래된 마우스·인간 하이브리드 항HM 1.24 항체이고 또 다른 하나는 FR1 및 FR2의 아미노산 서열이 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 H쇄 V영역의 버전 a에서 유래되고, FR3 및 FR4의 아미노산 서열이 마우스 항HM 1.24 항체에서 유래된 인간·마우스 하이브리드 항HM 1.24 항체이다. CDR 영역의 아미노산 서열은 모두 마우스 항-HM 1,24 항체에서 유래된다.
2개의 H쇄 하이브리드 V영역을 PCR법으로 제조하였다. 이 방법을 도 6 및 7에 도식적으로 나타내었다. 2개의 H쇄 하이브리드 V영역을 제조하기 위하여, 4종의 프라이머를 사용하였다. 외부 프라이머 a(서열번호 71) 및 h(서열번호 72)를, HEF 발현 벡터 HEF-VH-gγ1의 DNA 서열과 교잡하도록 설계하였다. H쇄 하이브리드 제조 프라이머 HYS(서열번호 73)는 센스 DNA 서열을 갖고, H쇄 하이브리드 프라이머 HYA(서열번호 74)는 안티센스 DNA 서열을 갖도록 설계해서 DNA 서열이 서로 상보성을 갖도록 한다.
FR1 및 FR2의 아미노산 서열이 마우스 항HM 1.24 항체에서 유래되고, FR3과 및 FR4의 아미노산 서열이 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 H쇄 V영역의 버전 a에서 유래되는 H쇄 하이브리드 V영역을 제조하기 위하여, 제 1 PCR 단계에서 플라스미드 HEF-1.24H-gγ1을 주형으로 하고, 외부 프라이머 a와 H쇄 하이브리드 프라이머 HYA를 사용하는 PCR와, 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1을 주형으로 하고, H쇄 하이브리드 프라이머 HYS(서열번호 73)과 외부 프라이머 h(서열번호 72)를 사용하는 PCR을 행하고, 각 PCR 생성물을 정제하였다. 제 1 PCR로부터 얻은 2개의 PCR 생성물을 그들 자체의 상보성에 의하여 어셈블리 시켰다(국제특허출원공개번호 WO92-19759 참조).
이어서, 외부 프라이머 a(서열번호 71) 및 h (서열번호 72)을 첨가하고, FRI 및 FR2의 아미노산 서열이 마우스 항HM 1.24 항체 유래되고, FR3와 FR4의 아미노산 서열이 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 H쇄 V영역의 버전 a에서 유래된 H쇄 하이브리드 V영역을 코드하는 전장 DNA를 제 2 PCR 단계에서 증폭하였다.
FR1 및 FR2의 아미노산 서열이 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 H쇄 V영역의 버전 a에서 유래되고, FR3 및 FR4의 아미노산 서열이 마우스 항HM 1.24 항체에서유래된 H쇄 하이브리드 V영역을 제조하기 위하여, 제 1 PCR 단계에서 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1을 주형으로 하고, 외부 프라이머 a와 H쇄 하이브리드 프라이머 HYA를 사용하는 PCR와, 플라스미드 HEF-1.24H-gγ1을 주형으로 하고, H쇄 하이브리드 프라이머 HYS와 외부 프라이머 h을 사용하는 PCR을 행하고, 그리고 각 PCR 생성물을 정제하였다. 제 1 PCR로부터 얻은 2개의 PCR 정제 생성물을 그들 자체의 상보성에 의하여 어셈블리시켰다(국제특허출원공개번호 WO92-19759 참조).
이어서, 외부 프라이머 a 및 h를 첨가해서, FR1 및 FR2의 아미노산 서열이 재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역의 버전 a에서 유래되고, FR3 및 FR4의 아미노산 서열이 마우스 항HM 1.24 항체에서 유래된 H쇄 하이브리드 V영역을 코드하는 전장 DNA를 제 2 PCR 단계에서 증폭하였다.
제 1 PCR, PCR 생성물의 정제, 어셈블링, 제 2 PCR, 및 HEF 발현 벡터 HEF-VH-gγ1으로의 클로닝의 방법은 실시예 9 '재구성 인간 항HM 1.24 항체 L쇄 V영역의 제조에 나타낸 방법'에 따라서 행하였다.
DNA 서열 결정 후, FR1 및 FR2의 아미노산 서열이 마우스 항HM 1.24 항체에서 유래되고, FR3 및 FR4의 아미노산 서열이 재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역의 버전 a에서 유래된 H쇄 하이브리드 V영역의 정확한 아미노산 서열을 코드하는 DNA 단편을 함유하는 플라스미드를 HEF-MH-RVH-AHM-gγ1으로 명명했다. 이 플라스미드 HEF-MH-RVH-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기 서열을 서열번호 75에 나타냈다. 또한, FR1 및 FR2의 아미노산 서열이 재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역의 버전 a에서 유래되고, FR3 및 FR4의 아미노산 서열이 마우스 항HM 1.24 항체에서 유래된 H쇄 하이브리드 V영역의 정확한 아미노산 서열을 코드하는 DNA 단편을 함유하는 플라스미드를 HEF-HM-RVH-AHM-gγ1으로 명명했다. 이 플라스미드 HEF-HM-RVH-AMH-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 및 염기서열을 서열번호 76으로 나타낸다.
3-3. 재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역 버전 f 내지 s의 제조
재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역의 각 버전 f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, q, r 및 s를 다음과 같이 제조하였다.
변이원 프라이머로서 75위치의 트레오닌을 세린으로, 그리고 78위치의 발린을 알라닌으로 변이하도록 설계한 FS(서열번호 78) 및 FA(서열번호 79)를 사용하여, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHe-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 f를 PCR법으로 증폭하여, 플라스미드 HEF-RVHf-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHf-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 및 염기서열을 서열번호 16에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 40위치의 알라닌을 아르기닌으로 변이하도록 설계한 GS(서열번호 80) 및 GA(서열번호 81)을 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 g를 증폭하여, 플라스미드 HEF-RVHg-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHg-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기서열을 서열번호 17에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 FS(서열번호 78) 및 FA(서열번호 79)를 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHb-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 h를 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHh-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHh-AHM-gγ1을 함유한 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기 서열을 서열번호 18에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 83위치의 아르기닌을 알라닌으로, 그리고 84위치의 세린을 페닐알라닌으로 변이하도록 설계한 IS(서열번호 82)와 IA(서열번호 83)을 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHh-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 i를 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHi-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHi-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기 서열을 서열번호 19에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 66위치의 아르기닌 DMF 라이신으로 변이하도록 설계한 JS(서열번호 84) 및 JA(서열번호 85)을 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHf-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 j를 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHj-AHM-gγ1를 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHj-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기 서열을 서열번호 20에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 81위치의 글루탐산을 글루타민으로 변이하도록 설계한 KS(서열번호 86) 및 KA(서열번호 87)을 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHh-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 k를 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHk-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHk-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기서열을 서열번호 21에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 81위치의 글루탐산을 글루타민으로, 그리고 82B위치의 세린을 이소로이신으로 변이하도록 설계한 LS(서열번호 88) 및 LA(서열번호 89)을 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHh-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 l을 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHl-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHl-AHM-gγ1에함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기 서열을 서열번호 82에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 81위치의 글루탐산을 글루타민으로, 82b위치의 세린을 이소로이신으로, 그리고 87위치의 트레오닌을 세린으로 변이하도록 설계한 MS(서열번호 90) 및 MA(서열번호 91)을 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHh-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 n을 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHm-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHm-AHM-gγ1에 함유된 아미노산 서열 및 염기 서열을 서열번호 23에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 82B위치의 세린을 이소로이신으로 변이하도록 설계한 NS(서열번호 92) 및 NA(서열번호 93)을 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHh-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 n을 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHn-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHn-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기 서열을 서열번호 24에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 87위치의 트레오닌을 세린으로 변이하도록 설계한 OS(서열번호 94) 및 OA(서열번호 95)을 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHh-AHM-gγ1를 사용하고, 버전 o를 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHo-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHo-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기 서열을 서열번호 25에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 78위치의 발린을 알라닌으로 변이하도록 설계한 PS(서열번호 96) 및 PA(서열번호 97)을 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 p를 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHp-AHM-gγ1을 얻었다.이 플라스미드 HEF-RVHp-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기서열을 서열번호 26에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 75위치의 트레오닌을 세린으로 변이하도록 설계한 QS(서열번호 98) 및 QA(서열번호 99)를 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1을 사용하고, 버전 q를 PCR법으로 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHq-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHq-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기서열을 서열번호 27에 나타냈다.
변이원 프라이머로서 CS(서열번호 65) 및 CA(서열번호 66)을 사용하고, 주형 DNA로서 플라스미드 HEF-RVHp-AHM-gγ1를 사용하고, 버전 r를 PCR법으로 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHr-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHr-AHM-gγ1에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기서열을 서열번호 28에 나타냈다.
재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역의 버전 s는 PCR을 사용하는 변이유발법으로 제조하였다. 변이원 프라이머 SS(서열번호 100) 및 SA(서열번호 101)를 69위체의 메티오닌을 이소로이신으로 변이하도록 설계하였다.
상기 프라이머를 주형으로서 플라스미드 HEF-RVHr-AHM-gγ1을 사용하여 증폭한 후, 최종 생성물을 정제하고, BamHI 및 HindⅢ으로 소화하고, 이와 같이하여 얻은 DNA 단편을 HEF 발현 벡터 HEF-VH-gγ1으로 클로닝하여 플라스미드 HEF-RVHs-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드에 함유된 H쇄 V영역의 아미노산 서열 및 염기 서열을 서열번호 102에 나타냈다.
상기 플라스미드 HEF-RVLa-AHM-gκ 및 HEF-RVHr-AHM-gγ1 각각의 가변영역을코드하는 영역을 제한효소 HindⅢ 및 BamHI로 소화하여 제한단편을 만들었다. 이들을 플라스미드 벡터 pUC19의 HindⅢ 및 BamHI 부위에 삽입하였다. 각각의 플라스미드는 pUC19-RVLa-AHM-gκ및 pUC19-RVHr-AHM-gγ1으로 명명하였다.
각각의 플라스미드 pUC19-RVLa-AHM-gκ 및 pUC19-RVHr-AHM-gγ1을 함유하는 대장균을 각각 대장균 DH5α(pUC19-RVLa-AHM-gκ) 및 대장균 DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγ1)으로 각각 칭하고, 이들을 부다페스트 조약의 규정에 의거하여, 1996년 8월 29일에 공업기술원생명공학공업기술연구소(일본국, 이바라키켄, 츠쿠바시, 히가시 1-쵸메 1-3)에 각 수탁번호 FERM BP-5645 및 FERM BP-5643으로서 국제기탁하였다.
상기 플라스미드 HEF-RVHs-AHM-gγ1의 가변영역을 코드하는 영역을 제한효소 HindⅢ 및 BamHI로 소화하여 제한단편을 만들었다. 이들을 플라스미드 벡터 pUC19의 HindⅢ 및 BamHI 부위에 삽입하였다. 얻어진 플라스미드는 pUC19-RVHs-AHM-gγ1으로 명명하였다.
플라스미드 pUC19-RVHs-AHM-gγ1을 함유하는 대장균을 대장균 DH5α(pUC19-RVHs-AHM-gγ1)으로 칭하고, 이것을 부다페스트 조약의 규정에 의거하여, 1997년 9월 29일에 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(일본국, 이바라키켄, 츠쿠바시, 히가시 1-쵸메 1-3)에 국제기탁하였다.
4. 재구성 인간 항HM 1.24 항체, 키메라 항HM 1.24 항체, 및 H쇄 하이브리드 항체
재구성 인간 항HM 1.24 항체의 각 쇄를 평가하기 위하여, 재구성 인간 항HM1.24 항체와 포지티브 대조 항체(positive control antibody)로서 키메라 항HM 1.24 항체를 발현시켰다. 이어서 재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역의 버전 b 이후의 각 버전 을 제작할 때, 어느 FR 내의 아미노산 서열을 치환해야하는가를 검토하기 위하여 H쇄 하이브리드 항체를 발현시켰다. 또한, 재구성 인간 항HM 1.24 항체 L쇄의 버전 a를 평가하기 위하여 키메라 H쇄와 조합하여 발현시켰다.
4-1. 재구성 인간 항HM 1.24 항체(1)의 발현
재구성 인간 항HM 1.24 항체의 H쇄의 발현 벡터(HEF-RVHa-AHM-gγ1 내지 HEF-RVHr-AHM-gγ1)와 재구성 인간 항HM 1.24 항체 L쇄의 발현 벡터(HEF-RVLa-AHM-gκ 또는 HEF-RVLb-AHM-gκ)의 각 10㎍을 Gene Pulser 장치(BioRad사제)을 사용하여 전기 영동에 의하여 COS-7 세포에 동시형질전환하였다. 각 DNA(10㎍)을, PBS 중 1×107세포/ml의 부분 표본 0.8ml에 첨가하고, 1500V, 25μF의 용량으로 펄스를 부여하였다.
실온에서 10분간의 회복기간 후, 전기 영동 처리된 세포를, 10%의 γ-글로블린 유리 소태아 혈청을 함유하는 DMEM 배지액 30ml(GIBCO사제)에 첨가하였다. 37℃, 5% CO2의 조건 하에서, CO2인큐베이터 BNA120D(TABAI사제) 중에서 72시간 동안 배양시킨 후, 배양 상징액을 모으고, 원심 로터 03(HITACHI사제)을 장치한 원심기 15PR-22(HITACHI사제)에 의하여 1000rpm으로, 5분간의 원심분리를 행하여 세포 부스러기를 제거하고, 마이크로콘센트레이터(Centricon 100, Amicon사제)를 원심 로터 JA-20·1(BECKMAN사제)를 장치한 원심기 J2-21(BECKMAN사제)에 의하여 한외여과농축하고, 이것을 Cell-ELISA 시험에 사용하였다.
재구성 인간 항HM 1.24 항체(2)의 발현
재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄의 버전 s을 위한 발현 벡터(HEF-RVHs-AHM-gγ1)와 재구성 인간 항HM 1.24 항체 L쇄의 발현 벡터(HEF-RVLa-AHM-gκ) 각 10㎍을 Gene Pulser 장치(BioRad사제)을 사용하여 전기 영동에 의하여 COS-7 세포에 동시형질전환하였다. 각 DNA(10㎍)을, PBS 중 1×107세포/ml의 부분 표본 0.8ml에 첨가하고, 1500V, 25μF의 용량으로 펄스를 부여하였다.
실온에서 10분간의 회복기간 후, 전기 영동 처리된 세포를, 10%의 γ-글로블린 유리 소태아 혈청을 함유하는 DMEM 배지액 30ml(GIBCO사제)에 첨가하였다. 37℃, 5% CO2의 조건 하에서 CO2인큐베이터 BNA120D(TABAI사제) 중에서 72시간 동안 배양시킨 후, 배양 상징액을 모으고, 원심 로터 03(HITACHI사제)을 장치한 원심분리기 15PR-22(HITACHI사제)에 의하여 1000rpm으로 5분간의 원심분리를 행하여 세포 파편을 제거하고, 마이크로콘센트레이터(Centricon 100, Amicon사제)를 원심 로터 JA-20·1(BECKMAN사제)를 장치한 원심기 J2-21(BECKMAN사제)에 의하여 한외여과농축하고, 필터, Millex GV13mm(Millipore사제)를 사용하여 여과 멸균하고, 이것을 Cell-ELISA 시험에 사용하였다.
4-2. 키메라 항HM 1.24 항체의 발현
키메라 항HM 1.24 항체 H쇄의 발현 벡터(HEF-1.24H-gγ1)와 키메라 항HM 1.24 항체의 L쇄의 발현 벡터(HEF-1.24L-gκ) 각 10㎍을 사용하고, 상기 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 발현 방법에 따라서 Cell-ELISA에 사용하기 위한 키메라 항HM 1.24 항체를 제조하였다.
4-3. 인간형화 L쇄 버전 a 및 키메라 H쇄로 되는 항HM 1.24 항체의 발현
키메라 항HM 1.24 항체 H쇄의 발현 벡터(HEF-1.24-gγ1) 및 재구성 인간 항HM 1.24 항체 L쇄 버전 a의 발현 벡터(HEF-RVLa-AHM-gκ) 각 10㎍을 사용하여, 상기 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 발현 방법에 따라서, Cell-ELISA에 사용하기 위한 인간형 L쇄 버전 a 및 키메라 H쇄로 되는 항HM 1.24 항체를 제조하였다.
4-4. H쇄 하이브리드 항체의 발현
H쇄 하이브리드 V영역의 발현 벡터(HEF-MH-RVH-AHM-gγ1 또는 HEF-HM-RVH-AHM-gγ1)와 재구성 인간 항HM 1.24 항체 L쇄의 발현 벡터 HEF-RVLa-AHM-gκ 각 10㎍을 사용하여, 상기 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 발현 방법에 따라서 Cell-ELISA에 사용하기 위한 H쇄 하이브리드 항체를 제조하였다.
4-5. 항체 농도의 측정
얻어진 항체의 농도는 ELISA법으로 측정했다. ELISA용 96-웰 플레이트(Maxisorp, NUNC사제)의 각 웰에 코팅 버퍼(0.1M NaHCO3, 0.02% NaN3, pH 9.6)로 1㎍/ml의 농도로 제조한 염소 항-인간 IgG 항체(BIO SOURCE사제) 100㎕을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양해서 고정하였다. 희석 완충액 100㎕(50mM Tris-HCl, 1ml MgCl2, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, 0.02% NaN3, 1% 소혈청 알부민(BSA), pH 8.1) 100㎕로 블로킹한 후, 한외여과농축을 행한 재구성 인간 항HM 1.24 항체, 키메라 항HM 1.24 항체, 또는 H쇄 하이브리드 항체를 분비하는 COS-7 세포의 배양 상징액을 순차적으로 희석하여 각 정에 100㎕씩 첨가하여, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 세척 후 알카리 포스파타아제-표지 염소 항-인간 IgG 항체(DAKO사제) 100㎕를 첨가하였다.
실온에서 1시간 동안 배양 및 세정한 후, 기질 완충액(50mM NaHCO3, 10mM MgCl2, pH 9.8) 중에 용해한 1mg/ml의 기질 용액(Sigma104, p-니트로페닐 포스페이트, SIGMA사제) 100㎕를 첨가하고, 405nm에서의 흡광도를 MICROPLATE READER Model 3550(BioRad사제)을 사용하여 측정하였다. 농도측정의 표준으로서, 인간 IgG1κ(The Binding Site사제)를 사용하였다.
5. 재구성 인간 항HM 1.24 항체를 안정하게 생산하는 CHO 세포주의 수립
5-1. 재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄의 발현 벡터의 제조
플라스미드 HEF-RVHr-AHM-gγ을 제한효소 PvuI 및 BamHI로 소화하고, EF1 프로모터 및 재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄 V영역을 코드하는 DNA를 함유하는 약 2.8kbp의 단편을 1.5% 저융점 아가로스 겔을 사용하여 정제하였다. 이어서, DHFR 유전자 및 인간 H쇄 불변 영역을 코드하는 유전자를 함유하는 인간 H쇄 발현 벡터 DHFR-△E-RVh-PM1f(국제특허출원공개번호 WO92-19759)에 사용된 발현 벡터를 PvuI 및 BamHI으로 소화해서 제조한 약 6kbp의 단편에 상기 DNA 단편을 삽입하여, 재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄의 발현 벡터 DHFR-△E-HEF-RVHr-AHM-gγ1을 제조하였다.
5-2. CHO 세포로의 유전자 도입
재구성 인간 항HM 1.24 항체의 안정한 생산계를 수립하기 위해서, PvuI으로 소화하여 직쇄상으로 된 상기 발현 벡터 DHFR-△E-HEF-RVHr-AHM-gγ1 및 HEF-RVLa-AHM-gκ의 유전자를 전기영동법에 의하여 상기와 동일(상기 COS-7 세포로의 트랜스펙션)한 조건 하에서 동시에 CHO 세포 DX-11에 동시에 도입하였다.
5-3. MTX에 의한 유전자 증폭
유전자를 도입한 CHO 세포 중에서, 500㎍/ml의 G418(GIBCO-BRL사제) 및 10%소태아 혈청을 첨가한 뉴클레오시드가 없는 α-MEM 배지(GIBCO-BRL사제)에서는 L쇄 및 H쇄 발현 벡터가 함께 도입된 CHO 세포만이 증식될 수 있으므로, 이 세포만을 선별하였다. 이어서, 상기 배지 10nM의 MTX(Sigma사제)를 첨가하였다. 증식한 클론 중에서, 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 생산량이 높은 것을 선택한 결과, 약 3㎍/ml의 재구성 인간 항HM 1.24 항체 생산율을 나타내는 클론 1을 얻었고, 이것을 재구성 인간 항HM 1.24 항체 생산 세포주로 칭하였다.
5-4. 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 제조
재구성 인간 항HM 1.24 항체는 다음의 방법으로 제조하였다. 상기 재구성 인간 항HM 1.24 항체를 생산하는 CHO세포를 배지로서 500㎍/ml G418(GIBCO-BRL사제) 및 10%의 γ-유리 소태아 혈청을 첨가한 뉴클레오시드가 없는 α-MEM 배지(GIBCO-BRL사제)을 사용하여, 37℃, 5% CO2의 조건 하에서, CO2인큐베이터 BNAS120D(TABAI사제)를 사용하여 10일 동안 배앙하였다. 배양 개시 후 8일 및 10일째에 배양액을회수하고, TS-9 로터를 장치한 원심기 RL-500SP(Tpmy Seiko사제)를 사용하여 2000rpm으로, 10분간 원심 분리를 행하여 배양액 중의 세포 부스러기를 제거한 후, 0.45㎛ 직경의 막을 갖는 보틀 탑 필터(bottle top filter)(FALCON사제)에 의하여 여과 멸균하였다.
이 재구성 인간 항HM 1.24 항체생산 CHO 세포 배양액에 등량의 PBS(-)를 첨가한 후, 고속항체정제 장치 ConSep LC100(MILLIPORE사제) 및 Hyper D Protein A 컬럼(Nippon Gaisha사제)을 사용하고, 첨부 설명서에 따라서 흡착/세척 완충액으로서 PBS(-) 및 용출 완충액으로서 0.1m 구연산 나트륨 완충액(pH 3)을 사용하여 재구성 인간 항HM 1.24 항체를 친화-정제하였다. 용출 분류물을 1M Tris-HCl(pH 8.0)을 즉시로 첨가하여 pH 7.4 부근으로 조정 한 후, 원심 한외여과농축기 Centriprep 10(MILLIPORE사제)을 사용하여 농축 및 PBS(-)으로의 치환을 행하고, 기공 크기 0.22㎛의 멤브레인 필터 MILLEX-GV(MILLIPORE사제)를 사용하여 여과 멸균하여 정제하여 재구성 인간 항HM 1.24 항체를 얻었다. 정제 항체의 농도는 280nm의 흡광도를 측정하여, 1mg/ml을 1.35OD로 하여 산출하였다.
실시예 11. 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 활성 측정
재구성 인간 항HM 1.24 항체는 다음의 항원결합활성 및 결합저해활성으로 평가를 행하였다.
1. 항원결합활성 및 결합저해활성의 측정법
1-1. 항원결합활성의 측정
항원결합활성의 측정은, WISH 세포를 사용하는 Cell-ELISA로 행하였다.Cell-ELISA 플레이트는 상시 실시예 7.1-2에 기재된 바와 같이 제조하였다.
블록킹시킨 후, COS-7 세포의 배양 상징액을 농축하여 얻거나, 또는 CHO 세포의 배양 상징액으로부터 정제된 제구성 인간 항HM 1.24 항체를 순차적으로 희석하여 각 정에 100㎕씩 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 배양 및 세정시킨 후, 퍼옥시다제-표지 토끼 항 인간 IgG 항체(DAKO사제)를 첨가하였다. 이것을 실온에서 1시간 동안 배양 및 세정한 후, 기질 용액 100㎕을 각 정에 첨가하였다. 배양한 후, 6N 황산 50㎕으로 반응을 정지시키고, MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad사제)를 사용하여 490nm에서의 흡광도를 측정하였다.
1-2. 결합저해활성의 측정
비오틴-표지 마우스 항HM 1.24 항체에 의한 결합저해활성은, WISH 세포를 사용하는 Cell-ELISA로 행하였다. Cell-ELISA 플레이트는 상기 실시예 7. 1-2에 기재된 바와 같이 제조하였다. 블로킹시킨 후, COS-7 세포의 배양 상징액을 농축하여 얻거나 또는 CHO 세포의 배양 상징액으로부터 정제된 재구성 인간 항HM 1.24 항체를 순차적으로 희석하여 각 정에 50㎕씩 첨가하고, 비오틴-표지 마우스 항HM 1.24 항체 50㎕를 동시에 첨가하였다. 이것을 실온에서 2시간 동안 배양 및 세정한 후, 퍼옥시다제-표지 스트렙타비딘(DAKO사제)를 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 배양하고, 이어서 세정한 후, 기질 용액 100㎕를 각 정에 첨가하였다. 배양 후, 6N 황산 50㎕으로 반응을 정지시키고, MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad사제)을 사용하여 490nm에서의 흡광도를 측정하였다.
2. 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 평가
2-1. L쇄
재구성 인간 항HM 1.24 항체 L쇄의 버전 a의 평가는, 상기의 항원결합활성의 측정에 의하여 행하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, L쇄의 버전 a는 키메라 H쇄와 조합하여 발현시키는 경우, 키메라 항HM 1.24 항체와 비슷한 정도의 항원결합활성을 나타내었다. 그러나, 추가로 활성의 상승 또는 H쇄와의 상용성(compatibility)을 고려하여, L쇄의 버전 b를 제조하였다. H쇄의 버전 a, b, f 또는 h와 조합된 경우의 항원결합활성 및 결합억제활성의 측정을 행하여, L쇄의 버전 a 및 b를 함께 평가하였다. 도 9, 10, 11 및 12에 나타낸 바와 같이, H쇄의 버전 a, b, f 및 h 모두에서, L쇄의 버전 a가 버전 b에 비해 항원결합활성 및 결합억제활성 모두가 높았다. 그리하여, 재구성 인간 항HM 1.24 항체 L쇄의 버전 a를 다음 실험에 사용하였다.
2-2. H쇄 버전 a 내지 e
재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄의 버전 a 내지 e의 평가는 상기 항원결합활성 및 결합저해활성의 측정과 관련하해서 언급한 상기 L쇄 버전 a와 조합해서 행하였다. 그 결과, 도 11, 13, 14 및 15에 나타낸 바와 같이, 전체 버전에 있어서 키메라 항HM 1.24 항체와 비교하여 양 활성이 모두 약하였고, 또한 아미노산의 치환이 필요하다는 것을 암시해 주었다.
2-3. H쇄 하이브리드 항체
H쇄 하이브리드 항체의 평가는 상기의 항원결합활성의 측정에 의하여 행하였다. 그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, 항원결합활성은 인간-마우스 하이브리드 항HM 1.24 항체에서는 키메라 항HM 1.24 항체와 비슷한 정도의 활성을 갖고 있는 한편, 마우스-인간 하이브리드 항HM 1.24 항체는 키메라 항HM 1.24 항체와 비교하여 그 활성이 약하였다. 이것은 키메라 항HM 1.24 항체와 비슷한 정도의 항원결합활성을 갖는 재구성 인간 항HM 1.24 항체를 제조하기 위해서는, H쇄 V영역이 함유되어 있는 것들 중에서, FR3 또는 FR4에 함유된 아미노산을 전환시킬 필요가 있는 것을 나타내었다
2-4. H쇄 버전 f 내지 r
재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄의 버전 f의 평가는 상기 항원결합활성 측정에 의하여 행하였다. 그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, 상기 버전 f의 항원 결합활성은 키메라 항HM 1.24 항체와 비교하면 감소하고, 상기 버전 a 내지 c와 비교하여 활성이 향상되는것으로 나타났으며, 이것은 이 버전에서 새롭게 전환한 67, 69, 75 및 78위치에서 4개의 아미노산 중 어느 하나가 재구성 인간 항체의 활성에 관여하는 것을 암시해 준다.
재구성 인간 항HM 1.24 항체의 H쇄의 버전 g의 평가는 상기의 항원결합활성의 측정에 의하여 행하였다. 그 결과, 도 18 및 19에 나타낸 바와 같이, 이 버전은 상기 버전 a와 거의 비슷한 정도의 활성밖에 나타내지 않았으며, 상기 H쇄 인간 마우스 하이브리드 항체의 평가에서 나타낸바와 같이, 이 버전에서 전환한 40위치에서 아미노산은 재구성 인간 항체의 활성의 향상에는 기여하지 않는 것을 나타내었다.
재구성 인간 항HM 1.24 항체의 H쇄의 버전 h 내지 j의 평가는 상기 항원결합활성 및 결합저해활성의 측정에 의하여 행하였다. 그 결과, 도 20, 21, 22 및 23에 나타낸 바와 같이, 전체 버전에서 양 활성 모두 키메라 항HM 1.24 항체와 비교하면 약하고, 상기 버전 f와 비슷한 정도이며, 이것은 버전 f에서 새롭게 전환한 4개의 아미노산 중, 67 및 69위치의 아미노산이 재구성 인간 항체의 활성의 향상에 기여하지 않는 것을 암시해 주었다.
재구성 인간 항-HM 1.24 항체 H쇄의 버전 k 내지 p의 평가는 상기의 항원결합활성 및 결합저해활성의 측정에 의하여 행하였다. 그 결과, 도 24, 25, 26 및 27에 나타낸바와 같이, 전체 버전에서 양 활성 모두 키메라 항HM 1.24 항체와 비교하면 약하고, 상기 버전 h와 비슷한 정도이었으며, 이것은 이들 6개의 버전에서 새롭게 전환한 80번째 이후의 아미노산은 재구성 인간 항체의 활성 향상에 기여하지 않는 것을 암시해주었다.
재구성 인간 항HM 1.24 항체의 H쇄의 버전 q의 평가는 상기의 항원결합활성, 및 결합저해활성의 측정에 의하여 행하였다. 그 결과, 도 25 및 27에 나타낸 바와 같이, 이 버전은 양 활성 모두 상기 버전 h 또는 버전 p와 비교하면 약하고, 상기 버전 a와 비슷한 정도의 활성을 가졌으며, 이것은 78위치의 아미노산의 치환이 재구성 인간 항체의 활성의 향상에 필수적이라는 것을 암시해주었다.
재구성 인간 항HM 1.24 항체의 H쇄의 버전 r의 평가는 상기 방법으로 행하였다. 그 결과, 도 15 및 28에 나타낸바와 같이, 버전 r은 키메라 항HM 1.24 항체와 비슷한 정도의 항원결합활성 및 결합저해활성을 갖는 것으로 나타났다.
이상의 결과로부터, 재구성 인간 항HM 1.24 항체가 마우스 항HM 1.24 항체 또는 키메라 항HM 1.24 항체와 비슷한 정도의 항원결합능을 갖기위해 필요한 최소 전환은 30, 71 및 78위치, 추가로는 78위치의 아미노산인 것을 나타내었다.
재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄의 버전 a 내지 r의 항원결합활성 및 결합저해활성을 표 6에 요약하였다.
H쇄 버전 항원결합활성 결합저해활성
a + +
b + +
c + +
d + 미측정
e + 미측정
f ++ ++
g + +
h ++ ++
i ++ ++
j ++ ++
k ++ ++
l ++ ++
m ++ ++
n ++ ++
o ++ ++
p ++ ++
q + +
r +++ +++
2-5. H쇄 버전 s
재구성 인간 항HM 1.24 항체 H쇄의 버전 s의 평가는 항원결합활성, 및 결합저해활성의 측정과 관련한 상기 L쇄의 버전 a와 조합하여 행하였다. 그 결과, 도 29과 30에 나타낸 바와 같이, 이 버전 s는 상기 버전 r와 거의 비슷한 정도의 항원결합활성과 결합저해활성을 갖는 다는 것을 나타내었다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 재구성 인간 항HM 1.24 항체는 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치횐된 이후에도 항원에 대한 결합능을 보유한다. 그리하여, 본 발명은 본래의 특성이 유지되는 한 H쇄 또는 L쇄의 가변 영역에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 재구성 인간 항HM 1.24 항체를 포함한다.
3. 정제 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 평가
상기 정제 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 평가는 상기 항체결합활성 및 결합저해활성으로 행하였다. 그 결과, 도 31 및 32에 나타낸 바와 같이 재구성 인간 항HM 1.24 항체는, 키메라 항HM 1.24 항체와 비슷한 정도의 항원결합활성 및 결합저해활성을 갖는 것을 나타내었다. 이 사실은, 재구성 인간 항HM 1.24 항체가 마우스 항HM 1.24 항체와 동일한 항원 결합을 갖는 것을 나타내었다.
실시예 12. 키메라 항HM 1.24 항체의 인간 골수종 마우스 모델애 대한 항-종양 효과
1. 투여 항체의 제조
1-1. 키메라 항HM 1.24 항체의 제조
상기 실시예 6에서 얻은 정제 키메라 항HM 1.24 항체를, 원심 한외여과원심농축기 Centriprep 10(MILLIPORE사제)을 사용하여 농축, 및 PBS(-)으로의 치환을 행하고, 이것을 기공 크기 0.22㎛의 막 필터 MILLEX-GV(MILLIPORE사제)를 사용하여 여과 멸균하였다. 이것을 여과-멸균한 PBS(-)를 사용하여 200㎍/ml의 농도로 제조하고, 다음의 시험에 사용하였다. 항체의 농도는 280nm에서 흡광도를 측정하고, 1mg/ml을 1.35OD로 하여 산출하였다.
1-2. 대조 인간 IgG1의 정제
키메라 항HM 1.24 항체의 대조로서 사용하는 인간 IgG1은 다음과 같이 정제하였다. Hu IgG1 Kappa Purified(BINDING SITE사제)에 동량의 PBS(-)를 첨가한 후, 고속 항체정제 장치 ConSep LC100(MILLIPORE사제) 및 Hyper D Protein A 컬럼(Nippon Gaishai사제)을 사용하고, 부속 설명서에 따라서 흡착 완충액으로서 PBS(-)를, 용출 완충액으로서 0.1M 구연산 나트륨 완충액(pH 3)을 사용하여 친화-정제하였다. 용출된 분류물을 1M Tris-HCl(pH 8.0)을 즉시로 첨가하여 pH 7.4 부근으로 조정한 후, 원심한외여과농축기 Centriprep 10(Amicon사제)을 사용하여 농축 및 PBS(-)으로의 완충액 치환을 행하고, 기공 크기 0.22㎛의 막 필터 MILLEX-GV(MILLIPORE사제)를 사용하여 여과 멸균하였다. 이것을 여과 멸균한 PBS(-)를 사용하여 200㎍/ml의 농도로 조정하고, 다음의 시험에 사용하였다. 항체의 농도는, 280nm에서 흡광도를 측정하여, 1mg/ml을 1.35OD로 하여 산출하였다.
2. 마우스 혈청 중 인간 혈청 IgG의 정량법
마우스의 혈청 중에 함유된 인간 IgG의 정량은 다음과 같은 ELISA법으로 행하였다. 0.1M 중탄산염 완충액(pH 9.6)으로 1㎍/ml로 희석한 염소 항-인간 IgG(TAGO사제) 100㎕를 96웰-플레이트(NUNC사제)에 첨가하고, 4℃에서 철야 배양하여, 항체를 고정하였다. 이것을 블로킹한 후, 순차적으로 희석한 마우스 혈청 또는 표준으로서 인간 IgG(CAPPEL사제) 100㎕를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 세정 후, 2000배 희석한 알카리 포스파타제-표지 항-인간 IgG(CAPPEL사제) 100㎕을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 세정 후, 기질 용액을 첨가하고, 배양한 후, MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad사제)을 사용하여 405nm에서의 흡광도를 측정하였다.
3. 키메라 항HM 1.24 항체의 인간 골수종 세포 이식 마우스에 대한 항종양 효과
3-1. 인간 골수종 세포 이식 마우스의 제조
인간 골수종 세포 이식 마우스는 다음과 같이 제조하였다. SCID 마우스(Nihon CLEA사 양식)을 사용하여 생체 내 실험에서 계대 접종한 KPMM2 세포를, 10% 소태아 혈청(GIBCOBRL사제)을 함유한 RPMI 1640배지(GIBCOBRL사제)로 3×107세포/ml의 농도로 제조하였다. 항-아시알로(anti-asisalo) GM1(Wake Pure Chemical Industries Co., Ltd.제) 100㎕을 전날 복강내로 투여한 SCID 마우스(수컷, 생후 8주)(Nihon CLEA사 양식)에 상기 KPMM2 세포 현탁액 200㎕를 미정맥(尾靜脈)에 주입하였다.
3-2. 항체 투여
KPMM2 세포 이식 후 12일 후에 상기 인간 골수종 세포 이식 마우스로부터 혈청을 채취하고, 상기 2의 ELISA를 사용하여, 혈청 중의 인간 IgG를 정량하였다. 혈청 중의 인간 IgG 농도의 상승에 의하여 KPMM2 세포의 골수생착(骨髓生着)을 확인하였다. 이들 마우스에 대하여, KPMM2 세포 이식 후 14일, 21일 및 28일째에 상기 1에서 제조한 항체를 각각 100㎕을 복강내로 투여하였다.
3-3. 키메라 항HM 1.24 항체의 인간 골수종 세포 이식 마우스에 대한 항종양효과의 평가
키메라 항HM 1.24 항체의 항종양 효과를 마우스의 생존기간으로 평가하였다. 도 33에 나타낸 바와 같이, 키메라 항HM 1.24 항체를 투여한 마우스에서는 대조 인간 IgG를 투여한 마우스와 비교하여 생존기간의 연장이 확인되었다. 따라서, 키메라 항HM 1.24 항체가 인간 골수종 세포 이식 마우스에 대하여 항종양 효과를 갖는다는 것이 확인되었다.
실시예 13. 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 ADCC 활성의 측정
ADCC(Antibody-dependent Cellular Cytotoxicity) 활성을 Current Protocols in Immunology, Chapter 7, Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., 1993에서 기재된 바와 같은 방법에 따라서 측정하였다.
1. 이펙터 세포의 제조
단핵 세포를 건강한 사람의 말초혈으로부터 비중 원심법에 의해 분리하였다. 따라서, 동량의 PBS(-)를 건강한 사람의 말초 혈액에 첨가하고, 이것을 Ficoll-Paque PLUS(Pharmacia사제) 위에 놓은 다음, 40분 동안 400g으로 원심분리하였다. 상기 단핵 세포층을 모으고, 10% 소태아 혈청(GIBCO BRL사제)로 보충된 RPMI 1640 배양액(GIBCO BRL사제)으로 4회 세정하여, 동일한 배양액을 이용하여 세포 밀도 5×106/ml에서 제조하였다.
LAK(Limphokine Activated Killer Cell)을 SCID 마우스(Nihon CLEA사제)의골수 세포에서 유도하였다. 따라서, 골수 세포를 마우스의 대퇴부 뼈로부터 단리하고, 10% 소태아 혈청(GIBCO BRL사제)로 보충된 RPMI 1640 배양액(GIBCO BRL사제)으로 2회 세정하고, 동일한 배양액을 이용하여 세포 밀도 2×105/ml에서 제조하였다. 이것을 재조합 인간 IL-2(R & D SYSTEM사제) 50ng/ml과 재조합 마우스 GM-CSF(R & D SYSTEM사제) 10ng/ml와 함께 CO2인큐베이터(TABAI사제) 중에서 7일 동안 배양하였다.
2. 표적 세포의 제조
인간 골수종 세포주 KPMM2(일본국 특허출원 공개 (평)7-236475호) 또는 플라스마 세포 백혈병-유도 ARH-77(ACTT CCL-1621)을 0.1mCi의51Cr-크롬산 나트륨(ICN)과 함께 10% 우태아 혈청(GIBCO BRL사제)으로 보충된 RPMI 1640 배지(GIBCO BRL사제) 중에서 37℃에서 60분 동안 배양하여 방사능 표지하였다. 방사능 표지 후, 세포를 동일한 배양액으로 3회 세정하고, 2×105/ml로 조정하였다.
3. ADCC 분석
96-웰 U자형 바닥 플레이트(Becton Dickinson사제)에 2×105표적 세포/ml 50㎕, 재구성 인간 항HM 1.24 항체 50㎕, 마우스 항HM 1.24 항체, 대조 인간 IgG1(THE BINDING SITE사제) 또는 대조 마우스 IgG2a(UPC10, CAPPEL사제)를 첨가하고, 4℃에서 15분 동안 반응하였다.
이어서, 이펙터 세포 100㎕를 CO2인큐베이터에서 4시간 동안 배양하고, 이때에 이펙터 세포(E) 대 표적 세포(T)의 비는 0:1, 3.2:1, 8:1, 20:1, 또는 50:1로 하였다.
상징액 100㎕을 취하고, 배양 상징액으로 방출되는 방사능을 감마 계수기(ARC-300, Aloka사제)로 사용하였다. 최대 방사능을 측정하기 위하여, 1% NP-40(Nakalai사제)를 사용하였다. 세포독성(%)을 (A-C)/(B-C)×100으로 산출하였고, 여기서 A는 항체 존재 하에 방출되는 방사능(cpm)이고, B는 NP-40에서 방출되는 방사능이고, C는 항체 없이 배양액만에 의해 방출되는 방사능(cpm)이다.
도 34는 건강한 사람의 말초 혈액으로부터 제조된 세포가 이펙터 세포로서 사용되고, KPMM2 세포가 표적 세포로서 사용될 때에는 얻어진 결과를 나타낸 것이 다. 도 35는 건강한 사람의 말초 혈액으로부터 제조된 세포가 이펙터 세포로서 사용되고, ARH-77 세포가 표적 세포로서 사용될 때에 얻어진 결과를 나타낸 것이다. 재구성 인간 항-HM1.24 항체를 첨가하는 경우, 세포독성은 대조 인간 IgG1과 비교하여 항체 농도의 상승와 함께 상승하였으며, 이것은 재구성 인간 항HM 1.24 항체가 ADCC 활성을 갖는 것을 나타내었다.
또한, 재구성 인간 항HM 1.24 항체를 첨가하는 경우, 세포독성은 마우스 항HM 1.24 항체와 비교하여 명백히 상승되었으며, 이것은 재구성 인간 항HM 1.24 항체가 마우스 항HM 1.24 항체보다 높은 ADCC 활성을 갖는것을 나타내었다. 또한, KPMM2를 표적 세포로서 사용하는 경우, 0.1㎍/ml 이상의 농도에서 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 첨가는 세포독성에서 아무런 변화도 일으키지 않으며, 이것은 0.1㎍/ml 이상의 농도는 충분한 ADCC 활성을 갖는 것을 나타나주었다. 또한, ARH-77을 표적 세포로서 사용하는 경우, 0.1㎍/ml 이상의 농도에서 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 첨가는 세포독성에서 아무런 변화도 일으키지 않았으며, 이것은 0.1㎍/ml 이상의 농도가 ADCC 활성을 갖는 것을 나타내주었다.
도 36은 SCID 마우스 골수 세포에서 제조된 세포를 이펙터 세포로서 사용했을 경우 때에 얻어진 결과를 나타낸것이다. 재구성 인간 항HM 1.24 항체를 첨가하는 경우, 세포독성은 대조 인간 IgG와 비교하여 항체 농도에서 증가와 함께 증가되었고, 이것은 재구성 인간 항HM 1.24 항체가 ADCC 활성을 갖는것을 나타내주었다. 또한, 0.1㎍/ml 이상의 농도에서 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 첨가는 세포독성에서 아무런 변화도 일으키지 않았으며, 이것은 0.1㎍/ml 이상의 농도가 충분한 ADCC 활성을 갖는 것을 나타내주었다.
이들 결과는, 사용된 이펙터 세포가 인간 또는 마우스로부터 유래되는 경우에도, 재구성 인간 항HM 1,24 항체가 ADCC 활성을 갖는다는 것을 나타내준다.
실시예 14. 재구성 항HM 1.24 항체의 인간 골수종 마우스 모델에 대한 항종양 효과
1. 투여 항체의 제조
플라스미드 HEF-RVLa-AHM-gκ 및 플라스미드 HEF-RVHr-AHM-gγ1을 CHO 세포로 도입해서 얻은 재구성 인간 항HM 1.24 항체를 여과-멸균된 PBS(-)를 사용하여 40, 200, 및 1000㎍/ml의 농도로 제조하였고, 실시예 12.1-2에서 얻어진 대조 인간 IgG1을 여과-멸균 PBS(-)를 사용하여 200㎍/ml로 제조하였고, 이들을 투여 항체로 사용하였다.
2. 재구성 항HM 1.24 항체의 인간 골수종 세포 이식 마우스에 대한 항-종양 효과
2-1. 인간 골수종 세포 이식 마우스의 제조
인간 골수종 세포 이식 마우스를 실시예 12.3-1.에 따라서 제조하였다. 사용된 바우스는 SCID 마우스(생후 5주)(Nihon CLEA사 양식)를 사용하였다.
2-2. 항체 투여
상기 2-1에서 제조된 인간 골수종 세포 이식 마우스로부터 KPMM2 세포 이식 후 9일째에 혈청을 채취하고, 상기 12.1의 ELISA를 사용하여, 혈청 중의 인간 IgG를 정량하였다. 혈청 중의 인간 IgG 농도의 상승에 의하여 KPMM2 세포의 골수생착을 확인하였다. KPMM2 세포 이식 후 10일째에 상기 1에서 제조한 항체를 각각 100㎕을 이들 마우스에 복강내로 투여하였다.
2-3. 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 인간 골수종 세포 이식 마우스에 대한 항종양 효과의 평가
재구성 항HM 1.24 항체의 항종양 효과를 마우스 혈청 중의 인간 IgG의 양의 변화 및 마우스의 생존기간의 변화로 평가하였다.
마우스 혈청 중 인간 IgG의 양의 변화는 실시예 12.2의 ELISA를 사용하여 인간 IgG를 결정하여 KPMM2 세포의 이식 후 35일째에 수집된 혈청을 정량하였다. 도 37에 나타낸 결과는, 대조 인간 IgG1-투여군에서는 KPMM2 세포 이식 후 35일째에 혈청 중 인간 IgG의 양은 제 9일째(항체 투여 전날)와 비교하여 약 1000배 상승하였고, 반면에 재구성 인간 항HM 1.24 항체-투여군에서는 상기 인간 IgG의 양은 어떠한 투약량에 대해서도 제 9일째의 양과 거의 동일하거나 그 이하였고, 이것은 재구성 인간 항HM 1.24 항체가 KPMM2 세포 성장을 억제하는 것을 나타내고 있는 것이다. 한편, 도 38에 나타낸 바와 같은 생존 기간에 대해서는, 재구성 인간 항HM 1.24 항체는 대조 인간 IgG1-투여군과 비교하여 연장된 것으로 관찰되었다. 상기 사실은 재구성 인간 항HM 1.24 항체는 인간 골수종-이식 마우스에 대해서 항종양 효과를 갖는다는 것을 나타내 준다.
실시예 15. 재구성 인간 항HM 1.24 항체와 현존하는 약물인 멜팔란(Melphalan)의 인간 골수종 마우스 모델에 대한 항종양 효과의 비교
1. 투여 약품의 제조
1-1. 투여 항체의 제조
플라스미드 HEF-RVLa-AHM-gκ 및 플라스미드 HEF-RVHr-AHM-gγ1을 CHO 세포에 도입해서 얻은 재구성 인간 항HM 1.24 항체를 여과 멸균된 PBS(-)를 사용하여 40 및 200㎍/ml의 농도로 제조하였고, 실시예 12.1-2에서 얻어진 대조 인간 IgG1을 여과-멸균 PBS(-)를 사용하여 200㎍/ml로 제조하였고, 이것을 투여 항체로 사용하였다.
1-2. 멜팔란의 제조
골수종용 현존 약품인 멜팔란(SIGMA사제)을 0.2% 카르복시메틸 셀룰로오스 (CMC)(Daicel Chemical Industris, Ltd.제)을 사용하여 0.1mg/ml의 농도로 제조하였다.
2. 재구성 항HM 1.24 항체와 멜팔란의 인간 골수종 세포 이식 마우스에 대한 항종양 효과
2-1. 인간 골수종 세포 이식 마우스의 제조
인간 골수종 이식 마우스를 실시예 14.2-1.에 따라서 제조하였다.
2-2. 약품의 투여
상기 2-1에서 제조된 인간 골수종 세포 이식 마우스로부터 KPMM2 세포 이식 후 9일째에 혈청을 취하고, 상기 12.1의 ELISA를 사용하여, 혈청 중의 인간 IgG 농도를 정량하였다. 혈청 중의 인간 IgG의 상승에 의하여 KPMM2 세포의 골수생착을 확인하였다. KPMM2 세포 이식 후 10일째에, 상기 1-1에서 제조한 항체를 상기 마우스에 복강내로 100㎕씩 투여하였다. 또한, 이식 후 10일째로부터 5일 동안 하루에 한번씩 0.2% CMC 용액 200㎕을 경구 투여하였다. 한편, 멜팔란-투여군에 대하여, NPMM2 세포 이식 후 10일째로부터 5일동안 하루에 한번 상기 1-2에서 제조된 멜팔란 용액을 체중 10g 당 100㎕의 양으로(1mg/kg Melphalan) 경구 투여하였다.
2-3. 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 인간 골수종 세포 이식 마우스에 대한 항종양 효과의 평가
재구성 항HM 1.24 항체의 항종양 효과는 마우스 혈청 중의 인간 IgG의 양의 변화와 마우스의 생존기간의 변화로 평가하였다.
마우스 혈청 중 인간 IgG의 양의 변화는 실시예 12.2의 ELISA를 사용하여 인간 IgG를 결정하여 KPMM2 세포의 이식 후 35일에 수집된 혈청에 대하여 정량하였다. 도 39에 나타낸 결과는 대조 인간 IgG1-투여군에서는, KPMM2 세포 이식 후 35일째에 혈청 중 인간 IgG의 양은 9일째(항체 투여 전날)와 비교하여 약 1000배 상승하였고, 반면에 재구성 인간 항HM 1.24 항체-투여군에서는, KPMM2 세포가 이들 마우스에서 성장한 것으로 나타났다. 마찬가지로 멜팔란-투여군에서, 비록 대조 인간 IgG-투여군에서와 같이 높지는 않아도, 혈청 중의 인간 IgG의 양은 약품이 투여되기 전보다 더욱 상승하였다. 이러한 결과는 멜팔란 투여가 KPMM2의 성장을 완전하게 억제하지는 않는다는 것을 나타내 주는것이다. 한편, 재구성 인간 항HM 1.24 항체-투여군에서 어떤 투여에 대하여 이식 후 첫째 날의 혈청 인간 IgG의 양은 어떠한 투약량에 대해서도 제 9일째의 양 보다는 적으며, 이것은 재구성 인간 항HM 1.24 항체가 KPMM2 세포 성장을 억제한다는 것을 나타내 주는것이다.
한편, 생존 기간에 대해서는, 도 40에서 나타낸 바와 같이, 재구성 인간 항HM 1.24 항체-투여군의 생존 기간이 대조 인간 IgG1-투여군 또는 멜파란-투여군과 비교하여 연장된 것이 관찰되었다. 상기 사실로부터, 재구성 인간 항HM 1.24 항체가 인간 골수종-세포이식 마우스에 대하여 항종양 효과를 갖고 있고, 본 발명의 항체는 항종양 효과가 현존 약품인 멜파란보다 강하다는 것이 나타났다.
상기 결과는, 인간-유도 이펙터 세포가 사용되는 경우, 마우스 항HM 1.24 항체는 인간 골수종 세포에 대한 세포독성을 거의 갖지 않고, 반면에 재구성 인간 항HM 1.24 항체와 키메라 항-HM 1,24 항체는 강한 세포독성을 갖는다는 것을 나타내었다. 이러한 사실은 인간화 항체의 중요성을 나타내고, 인간에서 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 유용성에 대한 희망을 준다.
재구성 인간 항HM 1.24 항체는 인간 골수종-세포이식 SCID 마우스에서 매우강한 항-종양 효과를 나타냈다. 인간에 있어서 이펙터 세포는 인간으로부터 유래되고, 임파구는 전상적으로 존재하므로 더욱 강력한 재구성 인간 항HM 1.24 항체의 항종양 효과가 기대된다.
골수중 모델에서, 재구성 인간 항HM 1.24 항체는 현존 약품과 비교하여 강력한 항종양 효과를 나타냈으므로, 재구성 인간 항HM 1.24 항체가 골수종 치료용 획기적인 약품을 만들것으로 기대된다.
참고예 1. 마우스 항HM 1.24 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 제조
Goto, T. et al., Blood(1994) 84, 1992-1930에 기재된 방법에 따라서, 마우스 항HM 1,24 모노클로날 항체를 생사하는 하이브리도마를 제조하였다. 인간 다발성 골수종 환자의 골수에서 유래한 엡스타인-바 바이러스 핵항원(Epstein-Barr virus nuclear antigen)(EBNA)-음성 형질세포주 KPC-32(1×107세포)(Goto, T. et al., Jpn. J. Clin. Hematol.(11991) 32, 1400)을 BALB/C마우스(Charles River사 양식)의 복강 내에 6주간 마다 2회 주사하였다.
마우스 항체 생산가를 더욱 상승시키기 위하여, 마우스를 죽이기 3일 전에 1.5×106개의 KPC-32 세포를 마우스의 비장 내에 주사하였다(Goto, T. et al., Tokushima J. Exp. Med. (1990) 37, 89). 마우스를 죽인 후에, 마우스의 비장을 적출하고, Groth, de St. & Schreidegger의 방법(Cancer Research (1981) 41, 3465)에 따라서 적출한 비장 세포와 골수종 세포 SP2/0과 함께 세포융합으로 처리하였다.
KPC-32 세포를 덮은 플레이트를 사용하는 ELISA(Posner, M. R. et al., J. Immunol. Methods(1982) 48, 23)에 의해 하이브리도마 배양 상징액 중의 항체 스크리닝을 했다. 5×104개의 KPC-32 세포를 50ml의 PBS에 현탁하고, 96-웰 플레이트(U 자 바닥형, Corning, Iwaki사제)에 분주(分注)하였다. 1% 소태아 알부민(BSA)을 함유하는 PBS로 블로킹한 후, 하이브리도마 배양 상징액을 첨가하고, 4℃에서 2시간 동안 배양하였다. 이어서, 이것을 퍼옥시다제-표지 염소 항 마우스 IgG 항체(Zymed사제)와 4℃에서 1시간 동안 반응시키고, 한번 세척 한 후, 실온에서 30분 동안 o-페닐렌디아민 기질 용액(Sumitomo Bakelite사제)과 반응시켰다.
반응을 2N 황산으로 정지시킨 후, ELISA reader(Bio-Rad사제)를 사용해서 492nm에서 흡광도를 측정하였다. 인간 면역글로빈에 대하여 항체를 생산하는 하이브리도마를 제거하기 위하여, 양성 하이브리도마 배양 상정액을 인간 혈청에 미리 흡착시키고, 다른 하부세포성분들에 대한 반응성을 ELISA로 스크리닝하였다. 양성의 하이브리도마를 선택하고, 여러가지 세포주와 인간 샘플에 대한 반응성을 플로우 사이토메트리(flow cytometry)를 사용하여 조사하였다. 최종적으로 선택된 하이브리도마 클론을 2회 클론닝하고, 이것을 프리스탄 처리 BALB/C마우스의 복강에 주사하여, 복수(腹水)를 취득하였다.
모노클로날 항체는, 황산 암모니아에 의한 침전과 프로테인 A 친화 크로마토그래피 키트(Ampure PA, Amersham사제)에 의하여 마우스 복수로부터 정제하였다.정제 항체는, Quick Tag FITC 결합 키트(Boehringer Mannhein사제)를 사용하여 플루어레신 이소티오시아네이트(FITC)와 결합시켰다.
그 결과, 30개의 하이브리도마 클론이 생산하는 모노클로날 항체가 KPC-32 및 RPMI 8226 세포와 반응하였다. 클로닝 후, 이들의 하이브리도마의 배양 상징액과 다른 세포주 및 말초혈 유래 단핵구와의 반응성을 조사하였다.
이들 중에서, 3개의 클론이 형질세포에 특이적으로 반응하는 모노클로날 헝체를 생산했다. 이들 3개의 클론 중, 플루오 사이토메트리 분석에 가장 유용하고, 또한 RPMI 8226 세포에 대하여 보체의존성 세포독성을 갖는 모노클론 항체를 생산하는 하이브리도마 클론을 선택하여, HM 1.24로서 명명하였다. 이 하이브리도마가 생산하는 모노클로날 항체의 서브 클래스를, 서브 클래스 특이적 토끼 항 마우스 항체(Zymed사제)를 사용하는 ELISA로 결정하였다. 항HM 1.24 항체는, IgG2aκ의 서브 클래스를 갖고 있다. 항HM 1.24 항체를 생산하는 하이브리도마는, 부다페스트 조약의 규정에 의하여, 공업기술원생명공학공업연구소(일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1-쵸메 1-3)에, 1995년 9월 14일에 수탁번호 FERM BP-5233으로 국제기탁되었다.
참고예 2. HM 1.24 항원 폴리펩티드를 코드하는 cDNA의 클로닝
1. cDNA 라이브러리 제조
1) 전체 RNA의 제조
마우스 항HM 1.24 모노클로날 항체로 특이적으로 인식되는 폴리펩티드인 HM 1.24 항원을 코드하는 cDNA를 다음과 같이 단리하였다.
인간 다발성 골수종 세포주 KPMM2로부터, 전장 RNA를 Chirgwin 등의 방법(Biochemistry, 18, 5294 (1979))에 따라서 제조하였다. 따라서, 2.2×108KPMM2 세포를 4M의 구아니딘 티오시아네이트(Nakalai tesaue사제) 20ml 중에서 완전히 균질하게 하였다.
균질체를 원심분리기 튜브 중에서 5.3M 염화 세슘 위에 놓은 다음, Beckman SW40 로터를 사용하여 31,000rpm에서 20℃에서 24 시간 동안 원심분리하여 RNA를 침전하였다. RNA 침전물을 70% 에탄올로 세척하고, 1mM EDTA와 0.5% SDS를 함유하는 10mM Tris-HCl(pH 7.4) 300㎕에 용해하였다. 여기에 프로나세(Boehringer사제)를 0.5mg/ml의 농도로 첨가한 후, 이것을 37℃에서 30분간 배양하였다. 이 혼합물을 페놀 및 클로로포름으로 추출하여 RNA를 침전하였다. 이어서, RNA 침전물을 1mM EDTA를 함유하는 10mM Tris-HCl(pH 7.4) 200㎕에 용해하였다.
2) 폴리(A)+RNA의 제조
원료로서 상기와 같이 제조된 전체 RNA 약 500㎍을 사용하여, 폴리(A)+RNA를 Fast Track 2.0m RNA 단리 키트(Invitrogen사제)를 사용하고, 그에 첨부된 설명서에 따라서 정제하였다.
3) cDNA 라이브러리의 제조
원료로서 상기 폴리(A)+RNA 10㎍을 사용하고, 이중 가닥 cDNA를 cDNA 합성 키트인 TimeSaver cDNA 합성 키트(Pharmacia사제)를 사용하고, 그에 첨부된 설명서에 따라서 합성하였고, Drectional Cloning Toolbox(Pharmacia사제)를 사용하고,키트에 부착된 설명서에 따라서 EcoRI 어댑터를 상기 이중 가닥 cDNA에 연결하였다. EcoRI 어댑터의 키네이션(kination)과 제한 효소 NotI 처리는 키트에 첨부된 설명서에 따라서 수행하였다. 또한 약 500bp 이상의 크기를 갖는 어댑터-부착 이중 가닥 cDNA를 단리하고, 1.5% 저융점 아가로스 겔(SIGMA사제)로 정제하여 약 40㎕의 어댑터-부착 이중 가닥 cDNA를 얻었다.
이와 같이하여 제조된 어댑터-부착 이중 가닥 cDNA를, 미리 제한 효소 EcoRI 및 NotI와, DNA 리가제(GIBCO BRL사제)를 제조하기 위해 T4를 사용하는 알카리 포스파타아제(Takara Shuzo사제)로 미리 처리한 pCOS1 벡터(일본국 특허 공개 (평)8-255196호)와 연결해서 cDNA 라이브러리를 제조하였다. 제조된 cDNA 라이브러리를 대장균주 DH5α(GIBCO BRL사제)로 형질도입하였고, 총 크기는 약 2.5×106개의 독립 클론으로 평가하였다.
2. 직접 발현에 의한 클로닝
1) COS-7 세포로의 트랜스펙션
cDNA를 50㎍/ml의 앰피실린을 함유하는 2-YT 배지(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)) 중에서 상기 형질도입시킨 대장균의 약 5×105클론을 배양하여 증폭하였고, 플라스미드 DNA를 알카리법(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989))에 의해 대장균으로부터 회수하였다. 얻어진 플라스미드 DNA를 Gene Pluser 장치(BioRad사제)를 사용하여 전기영동에 의해 COS-7 세포로 트랜스펙션하였다.
정제 플라스미드 DNA 10㎍을 1×107세포/ml의 농도에서 PBS에 현탁시킨 COS-7 세포 0.8ml에 첨가하고, 1500V에서 25μF의 용량으로 펄스를 부여하였다. 실온에서 10분간의 회복기 후에, 전기 영동된 세포를 10% 소태아 혈청으로 보충된 DMEM(GIBCO BRL사제) 중에서 37℃, 5% CO2조건하에서 3일 동안 배양하였다.
2) 패닝 디쉬(panning dish)의 제조
마우스 항HM 1.24 항체로 덮은 패닝 디쉬를 B. Seed 등의 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84, 3365-3369 (1987))에 의해 제조하였다. 마우스 항HM 1.24 항체를 50mM Tris-HCl, pH 9.5에 10㎍/ml의 농도로 첨가하였다. 이와 같이하여 제조된 항체 용액 3ml를 60mm 직경의 조직 배양 플레이트에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 0.15M의 NaCl 용액으로 3회 세척한 후, 5% 소태아 혈청, 1mM EDTA 및 0.02% NaN3를 함유하는 PBS로 블로킹한 후, 이들 플레이트를 다음 클로닝에 사용했다.
3) cDNA 라이브러리의 클론닝
상기와 같이 트랜스펙트한 COS-7 세포를 5mM EDTA를 함유하는 PBS로 분리한 다음, 5% 소태아 혈청을 함유하는 PBS로 1회 세정하였다. 이어서, 이 세포를 5% 소태아 혈청 및 0.02% NaN3를 함유하는 PBS 중에 1×106세포/ml의 농도로 현탁하고, 이것을 상기와 같이 제조된 패닝 디쉬에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 5% 소태아 혈청 및 0.02% NaN3를 함유하는 PBS로 부드럽게 3회 세정한 후, 플라스미드 DNA를 0.6% SDS 및 10mM EDTA를 함유하는 용액을 사용하여 패닝 디쉬에 결합된 세포로부터 회수하였다.
회수된 플라스미드 DNA를 다시 대장균 DH5α로 형질도입하였다.상기와 같이 플라스미드 DNA를 증폭한 후에, 알카리법으로 회수하였다. 회수된 플라스미드 DNA를 전기영동법에 의해 COS-7 세포로 형질도입하고, 플라스미드 DNA를 상기와 같이 결합 세포로부터 회수하였다. 동일한 절차를 한번 이상 반복하였고, 회수된 플라스미드 DNA를 제한 효소 EcoRI 및 NotI로 소화하였다. 그 결과, 약 0.9kbp 크기를 갖는 삽입체의 농도가 확정되었다. 일부 회소된 플라스미드 DNA로 형질도입된 대장균을 50㎍/ml의 앰피실린을 함유하는 2-YT한천 플레이트에 접종하였다. 철야 배양한 후에, 플라스미드 DNA를 단일 콜로니로부터 회수하였다. 이것을 제한 효소 EcoRI 및 NotI로 소화하여, 0/9kbp의 삽입물을 갖는 클론 p3.19를 얻었다.
상기 클론의 염기 서열을 PRISM, Dye Terminater Cycle Sequencing kit(Perkin Elmer사제)를 사용하고, 이 키트에 첨부된 설명서에 따라서 반응시키고 ABI 373A DNA Sequencer(Perkin Elmer사제)를 사용하여 서열화하여 결정하였다. 이것의 아미노산 서열 및 염기서열을 서열번호 103에 나타냈다.
서열번호 103에서 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 cDNA를 pUC19벡터의 XbaI 분할 부위로 삽입하여, 플라스미드 pRS38-pUC19를 제조하였다. 상기 플라스미드 pRS38-pUC19를 함유하는 대장균은 부다페스트 조약의규정에 의하여, 대장균 DH5α(pRS-pUC19)로 공업기술원생명공학공업연구소(일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1-쵸메 1-3)에, 1993년 10월 5일에 수탁번호 FERM BP-4434으로서 국제기탁되었다(일본국 특허 공개 평(7)-196694호 참조).
키메라 항HM 1.24 항체는 마우스 항HM 1.24 항체의 가변 영역과 인간 항체 불변 영역으로되고, 재구성 항HM 1.24 항체는 마우스 항HM 1.24 항체의 상보성 결정 영역과 인간 항체 프레임워크 영역 및 인간 항체의 불변영역으로 구성되므로, 인간에 대한 항원성이 저하하고, 따라서 의학 조성물, 특히 골수종 치료용 의약 조성물로서 사용되는 것이 기대된다.
기탁된 미생물에 대한 참고
관련된 국제 기탁 기관의 명칭 : 공업기술원생명공학공업연구소, MITI
주소: 일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1-쵸메 1-3
1. 대장균 DH5α(pRS 38-pUC19)
수탁번호: FERM BP-4434
수탁일: 1993년 10월 5일
2. 마우스-마우스 하이브리도마 HM 1.24
수탁번호: FERM BP-5233
수탁일: 1995년 4월 27일
3. 대장균 DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγ1)
수탁번호: FERM BP-5643
수탁일: 1996년 8월 29일
4. 대장균 DH5α(pUC19-1.24H-gγ1)
수탁번호: FERM BP-5644
수탁일: 1996년 8월 29일
5. 대장균 DH5α(pUC19-RVLa-AHM-gκ)
수탁번호: FERM BP-5645
수탁일: 1996년 8월 29일
6. 대장균 DH5α(pUC19-1.24L-gκ)
수탁번호: FREM BP-5646
수탁일: 1996년 8월 29일
7. 대장균 DH5α(pUC19-RVHs-AHM-gγ1)
수탁번호: FREM BP-6127
수탁일: 1997년 9월 29일

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  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 서열번호(SEQ ID NO) 103의 폴리펩티드 (HM1.24 항원)에 결합하는 인간형화된 항체의 경쇄 가변 영역으로,
    상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 인간형화된 항체의 경쇄 가변 영역.
  24. 서열번호 103의 폴리펩티드 (HM1.24 항원)에 결합하는 인간형화된 항체의 경쇄로,
    서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 및 인간 경쇄 불변 영역을 포함하는 인간형화된 항체의 경쇄.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 인간 경쇄 불변 영역은 Cκ인 것을 특징으로 하는 경쇄.
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 서열번호 103의 폴리펩티드 (HM1.24 항원)에 결합하는 인간형화된 항체의 중쇄 가변 영역으로,
    상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 28 또는 102의 아미노산 서열을 갖는 인간형화된 항체의 중쇄 가변 영역.
  29. 서열번호 103의 폴리펩티드 (HM1.24 항원)에 결합하는 인간형화된 항체의 중쇄로,
    서열번호 28 또는 102의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 인간 중쇄 불변 영역을 포함하는 인간형화된 항체의 중쇄.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 인간 중쇄 불변 영역은 Cγ1인 것을 특징으로 하는 중쇄.
  31. 삭제
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  33. 삭제
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  35. 서열번호 103의 폴리펩티드 (HM1.24 항원)에 결합하고 경쇄들 및 중쇄들로 이루어지는 인간형화된 항체 또는서열번호 103의 폴리펩티드 (HM1.24 항원)에 결합하는그것의 단편으로,
    각각의 경쇄는 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 및 인간 경쇄 불변 영역을 포함하고 그리고,
    각각의 중쇄는 서열번호 28 또는 102의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 인간 중쇄 불변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간형화된 항체 또는 그것의 단편.
  36. 삭제
  37. 제 35항에 있어서, 상기 경쇄 불변 영역은 Cκ이고, 그리고 상기 중쇄 불변 영역은 Cγ1인 것을 특징으로 하는 인간형화된 항체.
  38. 제 35항에 있어서, 상기 단편은 Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv인 것을 특징으로 하는 단편.
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 제 23항에 따른 L 쇄의 V 영역을 코드하는 DNA.
  42. 제 24항 또는 제 25항에 따른 L쇄를 코드하는 DNA.
  43. 삭제
  44. 제 28항에 따른 H쇄의 V영역을 코드하는 DNA.
  45. 제 29항 또는 제 30항에 따른 H쇄를 코드하는 DNA.
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  72. 제 41항에 따른 DNA을 포함하는 벡터.
  73. 제 42항에 따른 DNA를 포함하는 벡터.
  74. 제 44항에 따른 DNA를 포함하는 벡터.
  75. 제 45항에 따른 DNA를 포함하는 벡터.
  76. 제 42항에 따른 DNA 및 제 45항에 따른 DNA를 포함하는 벡터.
  77. 제 73항에 따른 벡터 및 제 75항에 따른 벡터로 공동-형질전환된 숙주 세포.
  78. 제 76항에 따른 벡터로 공동-형질전환된 숙주 세포.
  79. 서열번호 103의 폴리펩티드 (HM1.24 항원)에 결합하는 인간형화된 항체의 제조 방법으로,
    제 77항 또는 제 78항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계 및 인간형화된 항체를 회수하는 단계로 이루어지는 제조방법.
  80. 삭제
  81. 삭제
  82. 삭제
  83. 제 35항 또는 제 37항에 따른 인간형화된 항체 또는 그것의 단편을 활성 성분으로서 함유하는 골수종 치료제.
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