KR100345752B1 - 구성약제의 골다공증과 퇴행성 골질환 및 류마티스 관절염치료를 위한 물추출물 및 추출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 구성약제에서 추출한 물추출물에 함유하는 성분이 만성 골질환(골다공증, 류마티스 관절염 및 디스크)과 퇴행성 골질환에 관련하여 골세포 증식과 분화유도에 골형성 및 골조직의 분해를 억제함으로써, 골질환의 치료 및 예방효과를 얻을 수 있도록 한 구성약제의 골다공증 및 류마티스 관절염 치료를 위한 물추출물 및 추출방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 물추출물에서 파골세포의 증식억제 및 골형성 유도성분이 함유되어 있음을 확인되고, 이들의 조성물의 제조방법 및 신규 항소염성 약리작용을 제공한다.

Description

구성약제의 골다공증과 퇴행성 골질환 및 류마티스 관절염 치료를 위한 물추출물 및 추출방법{Pharmacolocial effect and extracting method for chronic osteoporosis and degenerative bone marrow diseases and rhematoid arthritis treatment by constituent drugs of oriental medicine}

본 발명은 구성약제에서 추출한 물추출물에 함유한 골수세포내 조골세포의 증식촉진과 파골세포의 분해를 억제함으로 골형성에 유효성분이 함유되어 있음을 검정하는 구성약제의 골다공증과 퇴행성골질환 및 류마티스 관절염 치료를 위한 물추출물 및 추출방법에 관한 것이다.

주지하는 바와 같이 현재 우리나라에서 다양한 골질환으로 호소하는 환자가 매년 증가 추세인 것으로 알려져 있으나, 골질환 치료를 목적으로 사용하는 화학요법, 수술요법 등은 아직 완벽한 성과를 거두지 못한 형편이다.

이러한 골질환은 노화로 인한 만성 내지 퇴행성으로 진행되고 그에 따르는 고통뿐만 아니라 의료부담이 많이 차지하고 있어 임상 분야에 전반적으로 활용할 수 있는 신물질의 개발이 절실히 요청되고 있는 실정이다.

특히, 상기한 골질환 중 골다공증(Osteoporosis)은 골조직 내 미세환경 하에 존재하는 조골세포와 파골세포의 불균형에 의해 유발되는데, 지금까지 알려진 보고에 의하면 노화나 여성의 갱년기 장애로 인한 산전ㆍ후로 보통 일시적으로 일어나지만 외부로부터 병원체의 유입에 따른 항원의 2차적인 T세포 자가면역이 결국 골조직의 파괴를 촉발시키는 요인이 된다고 하나 아직 명확하지 않으며, 현재로는 바이러스나 세균의 감염으로 세포 내 IL-1, IL-6, M-CSF, TGF-β, PTH, Vitamin D3 같은 요인에 의해 파골세포화가 유도된다고 보고되고 있다.

또한, 에스트로젠의 고갈과 그로 인한 파골세포 주위의 IL-6의 촉진에 따라 활성화를 유도됨으로 OPG와 RANK의 불균형적인 분비로 인한 파골세포화가 진행되고 다핵세포이면서 TRAP 양성반응을 가진 파골세포가 크게 증식되면 골단백분해효소인 Cathepsin K/L 같은 것이 분비하여 골조직에 구성하는 콜라겐(Collagen)과 칼슘의 결합이 붕괴되고 그로 인해 혈액내로 유출되어진 칼슘은 소변으로 배출하는데 결국 골조직내 칼슘의 고갈이라는 골조직내 구멍이 형성된 것 같은 질환으로 유발됨으로 여러 가지 이차적인 요인에 의해 골절이나 디스크 및 골격의 탈출이완이 초래되므로 그로 인한 심한 통증 내지 신경 염증을 동반한 신체 마비를 유발하는 지경으로 진행되어지며 한편 골조직의 붕괴와 연관지어 디스크나 만성 류마티스 관절염의 병인에 골조직 주변의 자가면역이 유발되므로 해서 촉발된 NO의 형성을 유도하는iNOS의 합성이 촉진됨과 동시에 COX-2의 발현이 증가하고 부수적으로 PGE2의 분비가 증가되어진다.

그로 인한 염증이 유발되고 연골조직을 파괴하는 환경이 조성됨으로 활액막의 붕괴를 촉진시키게 되며 상대적으로 통증을 호소하는 악순환이 가속화 될 것이다.

현재 상기와 같은 골질환에 관한 연구가 활발히 진행되고, 이에 따라 골수 내 일련의 면역지식이 급증함에 따라 최근에 몇 가지 골다공증 치료제가 개발되어 이들 중에는 allendrate, Tamoxifen, Vitamin D3, PTH 그리고 류마티스 관절염 치료제로 COX-2 저해제가 이미 상품화에 성공하였다.

한편, 오래 전부터 한방에서 사용하는 구성약제에는 조혈, 강장, 이뇨, 골수형성, 보신, 보양, 산전ㆍ후 관절, 요통, 건위, 소염, 활혈거습, 거풍, 해독, 지혈, 갱년기 장애, 통경, 자양, 보혈기능 등 다양한 효능이 있는 것으로 동의보감과 신농본초경에 수록되어 있으며, 기타 효능에 대해 고대문헌에 기록되어 있다.

그러나, 상기한 기록을 바탕으로 한방에서 많이 사용하는 구성약제의 유효한 약리 효능에 대한 구체적인 연구는 미약한 수준으로, 최근에 구성약제에서 골질환에 뛰어난 약효를 나타내는 약리 효능을 파악하여 이를 치료제로 활용하는 방안이 대두되고 있다.

본 발명은 상기한 구성약제에서 골질환에 뛰어난 효과를 갖는 치료제를 개발하고자 하는 노력과 그 연구 성과를 통해 나타난 결과물로써, 본 발명의 목적은 구성약제의 약리 효능 연구를 통해 얻어진 결과를 토대로 다양한 구성약제를 감압 농축한 물추출물의 동결건조 중량들을 유효성분으로 함유하는 골다공증과 퇴행성골질환 및 류마티스 관절염 같은 골질환 억제 내지 골재생 촉진용 조성물을 제공하는데 있다.

또한 본 발명의 다른 목적은, 구성약제의 조성물에서 유효성분으로 사용되는 물추출물을 추출하는 방법을 제공하는데 있다.

이와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 골다공증과 퇴행성 골질환 및 류마티스 관절염 같은 여러 가지 골질환에 응용할 치료제를 발견하기 위하여 수 천년간 동양에서 골질환 및 한의학적 관점에서 사용되어진 상기 구성약제(감초, 당귀, 홍화자, 마발, 익모초, 계혈등, 속단, 적두, 약콩, 홍화, 호프, 맥아, 구판, 구기자, 숙지황, 육계, 옥발, 녹각, 단삼, 방풍, 우슬, 오가피, 두충, 오공, 산사, 신곡)를 대상으로 연구를 수행하여 상기 약제의 물추출물이 골다공증과 퇴행성 골질환 및 류마티스 관절염의 치료 및 예방에 효과적인 유효물질이 있음을 확인할 수 있었으며, 이 물추출물에서 골다공증과 퇴행성 골질환 및 류마티스 관절염에 유효성분을 찾아내어 그 성분을 분리, 정제하고 그 활성성분의 구조를 밝혀내도록 함을 특징으로 한다.

따라서, 본 발명은 물추출물로부터 골다공증 억제제 내지 골형성 성분을 찾아내어 작용점과 유효성분을 통해 골다공증, 류마티스 관절염, 골절, 디스크, 기타 만성 및 퇴행성 골질환 같은 임상 분야에 전반적으로 활용할 수 있다.

도 1은 유효약물의 추출과정에 따르는 물추출물의 추출방법을 나타낸 도면.

도 2는 유효약물의 추출 후 동결 건조하여 물추출물의 분광광도계로 나타낸 주 흡광도.

도 3은 유효약물인 물추출물을 통해 부종을 유도시 소염작용을 나타낸 도면.

도 4는 유효약물인 물추출물을 통해 조골세포인 ST-1의 형태학적 모양을 현미경으로 관찰한 도면.

도 5는 유효약물인 물추출물을 통해 Raw264.7 세포주에 LPS를 자극하여 NO생성을 억제하는 것을 나타낸 그래프.

도 6은 유효약물인 물추출물을 통해 파골세포 내 COX-2의 발현을 억제한 것을 나타낸 도면.

도 7은 유효약물인 물추출물을 통해 LPS를 자극하여 COX-2 단백질 발현 유도해서 발현을 억제한 것을 RT-PCR을 통해 확인 이를 전기영동장치에서 나타낸 도면.

도 8은 유효약물인 물추출물을 통해 LPS를 자극하여 iNOS 단백질 발현 유도해서 발현을 억제한 것을 RT-PCR을 통해 확인 이를 전기영동장치에서 나타낸 도면.

도 9는 유효약물인 물추출물을 통해 난소 적출 흰쥐의 골다공증 모델을 통해 골소주의 수와 길이가 증가되어 골다공증 치료에 효과적임을 나타낸 도면.

도 10은 유효약물인 물추출물을 통해 난소 적출 흰쥐의 골다공증모델을 통해 골 분해효소의 분비억제를 확인하기 위해 면역조직화학분석을 나타낸 도면.

도 11은 유효약물인 물추출물을 통해 임상적으로 디스크가 흘러나온 환자를 대상으로 치료에 디스크가 거의 소실되어 원상 복귀된 것을 CT촬영을 통해 나타낸 사진을 나타낸 도면.

도 12는 유효약물은 물추출물로 처방하여 복용한 후 호전된 환자들에게 설문조사하여 통계 처리한 그래프.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하도록 한다.

도 1은 본 발명에 따른 유효약물의 추출과정에 따르는 물추출물의 추출방법을 나타낸 도면이다.

본 발명의 대상이 되는 구성약제는 감초, 당귀, 홍화자, 마발, 익모초, 계혈등, 속단, 적두, 약콩, 홍화, 호프, 맥아, 구판, 구기자, 숙지황, 육계, 옥발, 녹각, 단삼, 방풍, 우슬, 오가피, 두충, 오공, 산사, 신곡 등으로, 본 발명에 따르는 조성물에서 유효성분으로 사용되는 물추출물은 다음과 같은 함량으로 이루어진다.

즉, 본 발명의 물추출물은, 감초 75g, 당귀 150g, 홍화자 75g, 마발 75g, 익모초 150g, 계혈등 100g, 속단 150g, 적두 50g, 약콩 80g, 홍화 100g, 호프 50g, 맥아 50g, 구판 75g, 구기자 150g, 숙지황 45g, 육계 45g, 옥발 100g, 녹각 150g, 단삼 70g, 방풍 50g, 우슬 112.5g, 오가피 50g, 두충 150g, 오공 50g, 산사 25.5g, 신곡 47.5g 을 포함하여 이루어진다.

이와 같은 함량을 가지는 물추출물의 추출방법은 다음과 같다.

즉, 감초, 당귀, 홍화자, 마발, 익모초, 계혈등, 속단, 적두, 약콩, 홍화, 호프, 맥아, 구판, 구기자, 숙지황, 육계, 옥발, 구척, 녹각, 단삼, 방풍, 우슬, 오가피, 두충, 오공, 산사, 신곡의 총 건조 중량을 2Kg으로 해서 3차 증류수 5-15배의 부피(여기서는 5,000㎖)로 배합하여 120℃ 조건 하에 6시간동안 서서히 열을 가하여 최종적인 부피가 1,000㎖이 되게 한 다음, 여과장치에서 여과 후 감압 농축하여 200㎖이 되게 한 다음, 이를 동결 건조시켜 120g의 동결 건조중량을 얻었다.

상기한 바와 같은 일련의 건조과정에 수득되는 엑기스 물추출물은 각각 후술하는 실험 예에 의해 입증하는 바와 같이 골다공증, 류마티스 관절염 및 항소염 활성효과를 가지고 있기 때문에 물추출물 엑기스는 본 발명의 조성물에서 유효성분으로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 사용되는 물추출물 중에 활성성분을 규명하기 위하여 본 발명의 방법에 따라 수득된 물추출물에 대하여 자외선 분광광도계(UV-spectrophotometer)을 수행하였으며 그 결과 유효성분의 주 패턴이 260 nm와 835 nm의 피크(peak)를 포함하고 있었다.(도면 2)

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 사용되는 물추출물 중에 활성성분을 규명하기 위하여 본 발명의 방법에 따라 수득된 물추출물에 대하여 본 발명의 조성물이 가지는 부종 억제효과를 λ- 카라게닌(λ- Carrageenan) 0.2mg/㎖ 와 자이모산-A(Zymosan-A)를 5㎍/ 0.1㎖이 되게 흰쥐의 좌측 족부에 주사를 한 후 본 발명에 따른 물추출물의 건조중량을 0.5g/㎖이 되게 해서 2일간 경구 투여한 결과를 부종감소가 100%이상 감소시킴을 알 수 있다.(도면 3)

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 사용되는 물추출물 중에 활성성분을 규명하기 위하여 본 발명의 방법에 따라 수득된 물추출물에 대하여 bone marrow세포인 ST-2를 통해 세포 형태적인 변화를 확인하기 위해 6 well에 세포를 10⁴세포를 분주한 다음, 이를 5% CO₂인큐베이터(Incubator)에서 37℃하에 배양한 다음 상기 물추출물을 처리하여 세포 형태적인 변화를 확인한 결과 세포증식보다는 세포사를 유도하는 양상을 보임을 알 수 있었다.(도면 4).

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 사용되는 물추출물 중에 활성성분을 규명하기 위하여 본 발명의 방법에 따라 수득된 물추출물에 대하여 상기한 바와 같이 부종을 인한 혈액내의 강력한 염증 유발원인 NO의 합성억제를 확인하기 위해 macrophage인 RAW264.7을 96 microplate에 각 well마다 10³세포수가 되게 분주한 다음 12시간 배양하여 LPS를 50 ng/well이 되게 각 well에 분주하고 2시간동안 자극을 가한 다음 물추출물의 최종농도가 50㎍/㎖이 되도록 가한다.

여기서, 상기 물추출물의 처리는 LPS의 처리 전, 후로 해서 실시한다. 그 결과에 따른 NO의 생성은 대조군에서 약 79 ~ 98 ㎛정도인데 반해 물추출물의 생성은 약 8 ~ 21 ㎛정도 감소함을 알 수 있었다. (도면 5).

상기 결과에서처럼 본 발명의 조성물에서 유효성분으로 사용되는 물추출물 중에 활성성분을 규명하기 위하여 본 발명의 방법에 따라 수득된 물추출물에 대하여 류마티스 관절염의 원인인자인 COX-2의 발현을 억제하는지를 면역세포화학분석법을 조사한 결과 커버 글라스(cover glass)위에 흰쥐로부터 분리된 파골세포를 분주하고 12시간 배양한 다음 LPS를 적당량 처리해서 자극하여 상기 물추출물을 처리하고 PBS로 2번 세척하여 1차 항체인 COX-2를 반응시켜 표지 한 다음, 이를 2차 항체인 Texas Red를 표지하여 형광 현미경하에서 조사해 보면 본 조성물의 COX-2의 발현이 억제됨을 알 수 있다(도면 6).

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 사용되는 물추출물 중에 활성성분을 규명하기 위하여 본 발명의 방법에 따라 수득된 물추출물에 대하여 류마티스 관절염의 지표 단백질인 iNOS나 COX-2 발현의 억제에 미치는 영향을 알아보기 위해 상기 방법과 같이 세포를 PBS로 2회 세척한 다음, 이를 RNA zol 용액을 가하여 이를 세포 내 핵산과 단백질을 분리한 다음, 이를 15,000rpm으로 15분간 원심 분리하여 상등액과 isopropanol 200㎕을 가해 혼합한 후 냉장고(-20℃)에 15분간 방치한 다음, 이를 원심 분리하여 total RNA를 분리하여 이를 RT-PCR를 실시한 다음 1% agarose gel에서 확인한 결과 대조군에서는 발현을 유도되는 양상을 보인 반면에 물추출물 처리군에서는 발현이 억제됨을 알 수 있었다(도면 7)(도면 8).

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 사용되는 물추출물 중에 활성성분을 규명하기 위하여 본 발명의 방법에 따라 수득된 물추출물에 대하여 골다공증에 미치는 영향을 조사하기 위해 난소 적출 흰쥐에 물추출물을 0.5g/1㎖이 되게 경구투여를 7일간 실시하고 2주간 사육하여 대퇴골을 적취한 다음 이를 골조직의 표본으로 제작하였다.

헤마토시렌/에오신(hematoxylen/eosin)으로 염색하여 현미경하에서 관찰한 결과 대조군경우 성장판 부위의 골소주 수와 길이가 상대적으로 많이 소실된 데 비해 물추출물 처리군은 경골(tibia)의 수와 길이가 정상군과 유사하였으며, 면역조직화학 분석법에서처럼 콜라겐IV(collagen IV)의 분해효소의 발현양상 또한 대조군 경우는 상대적으로 많이 존재하나 정상군과 물추출물 처리군은 거의 발현이 없음을 알 수 있다.(도면 9)(도면 10).

상기 발명에 따른 일련의 물추출물 활성효과에 대한 임상적인 약리 효과를 조사하기 위해 본 발명의 방법에 따라 수득된 물추출물에 대하여 디스크 환자를 대상으로 디스크가 흘러나온 실례를 통해 물추출물을 복용한 다음 치료 후 CT촬영을 실시하여 본 결과, 도면의 화살표에서처럼 디스크가 거의 소실됨을 알 수 있었다.

따라서, 본 물추출물의 분석결과와 약리작용 및 골질환 환자의 실질적인 치료효과를 확인함으로 본 물추출물의 물추출물이 골질환에 유익한 치료 및 예방효과를 가짐이 입증되었다(도면 11).

또한 본 발명의 조성물에서 유효성분으로 사용된 상기 물추출물을 이용하여 골질환 환자 40명을 대상으로 임상적을호 투여한 후 유효성을 조사하기 위해 설문조사를 한 결과, 약물처리 후 호전되었다고 응답한 환자 수는 32명이고 비슷하거나 악화된 환자는 8명으로 나타났다.(도면 12).

이상에서 설명한 바와 같은 본 발명은 조성물의 약제조성, 추출방법, 추출조건 특히 물추출물에서 동결 건조시켜 수득되어진 분말 엑기스는 골다공증과 퇴행성 골질환, 류마티스 관절염에 우수한 치료 효과가 나타남은 물론 항소염 효과를 나타낸다.

본 발명에 따라 물추출물이 엑기스보다 동결건조 상태에서의 보존기간에 따른 변형 및 약리효과의 손실이 전무하고 본 발명에 의해 밝혀진 조성물이 골다공증이나 류마티스 관절염 및 디스크 같은 골질환 증상의 임상 분야에 예방 및 치료제로서 사용될 수 있는 효과가 있다.

Claims (3)

1. 감초 75g, 당귀 150g, 홍화자 75g, 마발 75g, 익모초 150g, 계혈등 100g, 속단 150g, 적두 50g, 약콩 80g, 홍화 100g, 호프 50g, 맥아 50g, 구판 75g, 구기자 150g, 숙지황 45g, 육계 45g, 옥발 100g, 녹각 150g, 단삼 70g, 방풍 50g, 우슬 112.5g, 오가피 50g, 두충 150g, 오공 50g, 산사 25.5g, 신곡 47.5g 의 유효성분을 함유하는 것을 특징으로 하는 구성약제의 골다공증과 퇴행성 골질환 및 류마티스 관절염 물추출물.
2. 제1항에 있어서,

   상기 유효성분으로서 물추출물을 동결 건조시켜 물추출물과 동일한 활성을 함유하는 건조분말을 제조하는 것을 특징으로 하는 구성약제의 골다공증과 퇴행성 골질환 및 류마티스 관절염 물추출물.
3. 감초, 당귀, 홍화자, 마발, 익모초, 계혈등, 속단, 적두, 약콩, 홍화, 호프, 맥아, 구판, 구기자, 숙지황, 육계, 옥발, 녹각, 단삼, 방풍, 우슬, 오가피, 두충, 오공, 산사, 신곡의 건조중량 약제 2Kg을 증류수 5000㎖로 배합하는 제1단계,

   120℃ 조건 하에 6시간동안 서서히 열을 가하여 최종적인 부피가 1,000㎖이 되게 하는 제2단계,

   상기 제2단계 수행 후, 여과장치에서 여과하고 감압 농축하여 200㎖이 되게하는 제3단계,

   상기 제3단계에서 감압 농축된 것을 동결 건조시켜 120g의 동결건조 중량을 얻는 제4단계로 이루어짐을 특징으로 하는 구성약제의 골다공증과 퇴행성 골질환 및 류마티스 관절염 물추출물 추출방법.