KR100316278B1 - Method for culturing Grifola frondosa mycelium on solid medium - Google Patents
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Abstract
본 발명은 잎새버섯 균사체의 고체배양법에 관한 것으로, 구체적으로는 전분류가 주 탄소원인 식용 곡류를 기질로 하고 상기 균사체 배양에 적합하도록 고체배지를 수분 함량 50∼70범위로 하여 성형 및 가공하여 기질 사이의 간극을 발생시킨 후, 18∼28℃, pH 4.5∼5.5에서 생육인자로 CaCl2를 0.01∼0.35첨가함으로써 상기 잎새버섯 균사체를 대량생산하는 고체배양법에 관한 것이다. 본 발명의 고체배양법은 장치비가 싸고 잡균의 오염가능성이 적을 뿐 아니라 기질 자체의 풍미가 좋아 배양물 자체를 직접 첨가하여 여러 가지의 드링크류나 다류(茶類)를 제조할 수 있는 장점이 있다.The present invention relates to a solid culture method of leaf mycelium mycelium, specifically, the starch is edible grains of which the main carbon source as a substrate, and the solid medium to a range of 50 to 70 moisture content so as to be suitable for cultivating the mycelium substrate and After producing the gap between, the present invention relates to a solid culture method for mass production of the mycelium mycelium mycelium by adding CaCl 2 as a growth factor at 18 to 28 ℃, pH 4.5 to 5.5. The solid culture method of the present invention has the advantage of manufacturing a variety of drinks or teas by directly adding the culture itself as well as low equipment cost and low possibility of contamination of various germs.
Description
본 발명은 잎새버섯 (Grifola frondosa) 균사체 (mycelium)를 대량으로 생산할 수 있는 고체배양법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명은 전분이 주성분인 식용 곡류를 균사체의 생육에 적합하도록 성형하여 기질 사이에 간극을 발생시킨 것을 특징으로 하는 고체배지에서, 수분 함량, 온도, pH 및 생육인자 첨가물에 의한 최적의 생육조건을 맞춰줌으로써 잎새버섯의 균사체를 대량생산하는 고체배양법에 관한 것이다.The present invention relates to a solid culture method capable of producing a large amount of mycelium ( Grifola frondosa ) mycelium (mycelium), and more particularly, the present invention is to form a edible grain of the starch is suitable for the growth of mycelium between the substrates In a solid medium characterized by generating a gap, it relates to a solid culture method for mass production of mycelium of leaf mushrooms by matching the optimum growth conditions by water content, temperature, pH and growth factor additives.
담자균류에 속하는 버섯은 영양학적 가치가 높고 독특한 향과 맛을 지니고 있어 식품용으로 적합할 뿐 아니라, 여러 가지 약리적 효과를 나타내기도 하기 때문에 버섯의 다양한 약리작용을 나타내는 생리활성들에 대한 연구가 광범위하게 진행되어 왔다. 현재 버섯은 농업 및 공업의 부산물을 인간의 식품으로 전환시킨 것 중 가장 성공적인 사례으로 간주되고 있으며, 1991년 전세계에서 생산된 식용버섯의 총 생산량은 3,763,000 톤으로 추정되고 있다.Mushrooms belonging to Basidiomycetes have high nutritional value and unique flavor and taste, making them suitable for food as well as having various pharmacological effects. Has been going. Mushrooms are now considered the most successful example of the conversion of agricultural and industrial by-products to human food, and the total production of edible mushrooms produced worldwide in 1991 is estimated at 3,763,000 tonnes.
식용버섯 중 잎새버섯은 당, 스테롤류, 단백질, 유기산, 지방산, 아미노산, 핵산, 비타민, 효소류 및 무기염류 등 생체의 생리 조절에 필요한 성분 뿐만 아니라 향미 성분 등이 풍부하게 포함되어 있어 송이버섯과 더불어 건강 및 기호 식품으로서 유용한 고급버섯의 하나로 취급되고 있다. 또한, 다당류인 글루칸 (glucan)은 항암성과 항궤양성이 있는 것으로 알려졌는데, 식품으로서 글루칸을 섭취하기에는 잎새버섯이 가장 적합한 소재로 판단되고 있다.Among edible mushrooms, leaf mushrooms are rich in flavors as well as ingredients necessary for physiological control of living organisms such as sugars, sterols, proteins, organic acids, fatty acids, amino acids, nucleic acids, vitamins, enzymes and inorganic salts. In addition, it is treated as one of the high-grade mushrooms useful as health and favorite foods. In addition, the polysaccharide glucan (glucan) is known to have anti-cancer and anti-ulcer properties, the leaf mushroom is considered to be the most suitable material for ingesting glucan as a food.
한편 식용버섯 유래의 다당류 및 이의 유도체들은 자실체나 균사체를 대상으로 하여 얻어지는데, 상황버섯의 경우 인공배양한 균사체의 열수 추출물과 천연 자실체 (버섯)의 추출물을 가지고 항암 활성을 측정한 결과 엔리치 (Enrich) 복수암에 대해 둘 다 항암 활성이 우수하다는 것이 보고되어 상황버섯 균사체의 산업상 이용가능성을 시사한 바 있다 (The Korean Journal of Mycology,24(3), 214-222, 1996).Meanwhile, polysaccharides derived from edible mushrooms and derivatives thereof are obtained from fruiting bodies or mycelium. In case of situation mushrooms, anti-cancer activity was measured using hydrothermal extracts of natural cultured mycelium and extracts of natural fruiting bodies (mushrooms). Both have been reported to have good anticancer activity against ascites, suggesting the industrial applicability of S. mushroom mycelium (The Korean Journal of Mycology, 24 (3), 214-222, 1996).
이처럼 유용한 버섯을 대량으로 생산하기 위하여 인공배양법이 도입되었지만, 인공배양법은 많은 노동력과 넓은 재배면적을 필요로 할 뿐만 아니라 생산에 장시간이 소요되고 작업도 번잡하다. 이와 같은 인공배양법의 단점을 극복하기 위해 버섯의 균사체 생산에 대한 연구가 널리 진행되고 있다.Artificial culture has been introduced to produce such useful mushrooms in large quantities, but artificial culture requires not only a lot of labor and a large cultivation area, but also takes a long time and is complicated to produce. In order to overcome the drawbacks of the artificial culture method, research on the mycelium production of mushrooms has been widely progressed.
기존의 버섯 균사체에 관한 대부분의 연구는 액체배양법으로 진행되고 있으며 그 대표적인 예로서 영지버섯 균사체를 액체배양하여 얻은 영비천과 같은 제품을 들 수 있다. 그러나 이러한 액체배양법도 산업적 생산의 규모로 균사체의 배양하기 위해서는 장치비용이 과다하게 투자되는 단점이 있다. 또한 미생물 중에서도 담자균류는 증식속도가 가장 느리기 때문에 일단 다른 미생물에 오염되면 오염 미생물들이 배지 중의 영양분을 소모시켜 정작 담자균류의 증식은 저하되는 문제가 발생할 수도 있으므로, 액체배양법을 통한 버섯 균사체의 배양은 실패의 위험도가상당히 크다고 할 수 있다. 따라서 액체배양법도 버섯의 대량 생산을 위한 인공배양법의 단점을 보완하기에는 미흡하다.Most of the existing researches on mushroom mycelium have been conducted by liquid culture, and representative examples thereof are products such as Yeongbicheon obtained by liquid culture of Ganoderma lucidum mycelium. However, such a liquid culture method also has the disadvantage that the cost of the apparatus is excessively invested to culture the mycelium on the scale of industrial production. Also, among the microorganisms, soybean fungus has the slowest growth rate, so once contaminated with other microorganisms, contaminating microorganisms consume nutrients in the medium, which can cause the growth of soybean fungus to decrease. Therefore, culture of mushroom mycelium by liquid culture method The risk of failure is quite large. Therefore, the liquid culture method is also insufficient to supplement the disadvantages of the artificial culture method for mass production of mushrooms.
반면 고체배양법은 톱밥의 고체 기질에 수분을 70∼80정도가 되도록 조절한 후 우선 버섯의 균사체를 어느 정도 증식시켜 미리 원기를 형성시켜 주는 것으로서, 현재 버섯을 생산하기 위해 널리 사용되는 있는 방법이다. 이 고체배양법은 액체배양법과는 달리 미생물이 오염되어 증식하기에는 수분 함량이 너무 낮고, 병 모양의 살균 용기에 균사체를 접종하여 앵글로 짜여진 평판마다 각각 쌓아서 공간을 활용할 수 있는데다가 전체 온도를 맞추어 주면 동시에 다량의 균사체를 배양할 수 있기 때문에 많은 장치비를 들이지 않아도 된다는 장점을 가지고 있다. 식용의 기질을 선정하여 기존의 배양방법을 통해 균사체를 고체배양한 연구로는 영지버섯 균사체로부터 면역 활성물질을 추출 및 정제하는 방법 및 표고, 만년 및 구름버섯에서 항암성 단백다당체를 추출 및 정제하는 방법에 관한 일본 특허 공개 제95-016763호와 균사체의 고체배양에서 바가스 (bagasse)와 폐인삼박 (인삼을 추출하고 남은 잔여물)을 기질로 이용한 것에 관한 대한민국 특허 공고 제96-009928호 등이 알려져 있다. 그러나 바가스와 폐인삼박을 고체배양의 기질로 사용하여 균사체를 생육시킨 경우에는 기질 자체의 풍미가 식품에 좋지 않은 영향을 미치기 때문에 배양물 자체를 식품 첨가물이나 드링크류로 사용하기에는 문제점이 있었으며, 이와 같이 고체배양법으로 버섯 균사체를 배양한 경우 배양물 자체를 식용으로는 이용할 수 없다는 단점이 있었다.On the other hand, the solid culture method is to control the moisture to a solid substrate of sawdust to 70 ~ 80, and then first to multiply the mycelium of the mushrooms to some extent to form the original, is a widely used method for producing mushrooms at present. Unlike the liquid culture method, unlike the liquid culture method, the water content is too low for the microorganisms to be contaminated and multiply.The solid inoculation is inoculated with mycelium in a bottle-shaped sterilization container, and each of the angled plates can be stacked to utilize the space. Since it can cultivate a large amount of mycelium has the advantage that it does not have to cost a lot of equipment. The study of solid culture of mycelium through the conventional culture method by selecting edible substrates includes extracting and purifying immune active material from Ganoderma lucidum mycelium, and extracting and purifying anticancer protein polysaccharides from alveolar, perennial and cloud mushroom. Japanese Patent Publication No. 95-016763 on the method and Korean Patent Publication No. 96-009928 concerning the use of bagasse and waste ginseng foil (residue after extracting ginseng) as a substrate in solid culture of mycelia. Known. However, when the mycelia were grown using vargas and waste ginseng foil as a substrate for solid culture, there was a problem in that the culture itself was used as a food additive or drink because the flavor of the substrate itself adversely affects the food. When the mushroom mycelium was cultured by the solid culture method, the culture itself could not be used for food.
이에 본 발명자들은 잎새버섯 균사체를 대량생산할 수 있으며 배양물 자체 그대로를 식품첨가물로 사용할 수 있도록 배양하는 방법을 연구할 결과, 식용자원 중에서 가장 풍부한 원료인 전분을 주성분으로 하는 옥수수를 기질로 선정하여 배양물 자체가 균사체 고유의 풍미만을 지니도록 하고, 균사체가 기질 속에서 호흡할 수 있도록 최적의 수분 함량을 유지하기 위해 옥수수를 별도로 가공 및 성형하여 기질 사이에 간극을 형성시키는 독특한 배지의 가공방법을 개발했으며, 또한 균사체 배양에 최적 조건이 될 수 있는 온도, pH 및 생육인자 등을 결정함으로써 전분이 주성분인 식용기질을 이용하여 균사체를 대량생산할 수 있는 고체배양법을 발명하였으며, 본 발명의 고체배양법에 의해 배양된 잎새버섯 균사체의 배양물 자체를 식품첨가물이나 드링크류로 활용할 수 있는 용도를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors can mass-produce leaf mycelium mycelium and study the culture method so that the culture itself can be used as a food additive. As a result, the corn is selected as a substrate containing starch, which is the most abundant raw material, as a substrate. Development of a unique method of processing a unique medium that creates water gaps between the substrates by processing and shaping corn separately so that the water itself has a unique mycelium flavor and maintain the optimal moisture content for the mycelium to breathe in the substrate. In addition, by determining the temperature, pH and growth factors that can be optimal conditions for mycelial culture, the inventors invented a solid culture method capable of mass production of mycelia using an edible substrate containing starch as a main ingredient, and by the solid culture method of the present invention. Culture of leaf mushroom mycelium cultured itself is added to food additive or de By developing applications that can be utilized to keuryu and completed the present invention.
본 발명의 목적은 잎새버섯 균사체를 대량생산할 수 있는 고체배양법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a solid culture method capable of mass production of leaf mycelium mycelium.
도 1은 본 발명의 고체배지를 성형하여 기질 사이의 간극을 형성하고 수분 함량을 70로 조정함으로써 균사체가 기질 사이로 침투하여 생육이 개선된 상태를 나타낸 것이고, 1 shows a state in which the mycelia are infiltrated between the substrates to improve growth by forming a gap between the substrates by forming a solid medium of the present invention and adjusting the water content to 70,
도 2는 본 발명의 성형하지 않은 낱알 상태의 옥수수 고체배지에서 수분 함량을 70로 하여 잎새버섯 균사체를 배양했을 때, 균사체 접종 14일 후 균사체가 표면에만 생육한 결과를 나타낸 것이고, Figure 2 shows the results of the mycelia grown only on the surface 14 days after inoculation of mycelia when incubated with mycelium mycelium with a water content of 70 in the unmolded corn solid medium of the present invention,
도 3은 본 발명의 잎새버섯 균사체의 온도별 생육정도를 균사체의 건조무게로 비교한 것이고, Figure 3 is a comparison of the growth of the leaf mycelium mycelium according to the temperature of the present invention with the dry weight of the mycelium,
도 4a는 생육인자를 첨가하지 않은 경우 10일 동안 고체배양한 잎새버섯 균사체의 생육상태를 나타낸 것이고, Figure 4a shows the growth of leaf mushroom mycelium cultured for 10 days without the growth factor,
도 4b는 생육인자로 CaCl2를 첨가하여 10일 동안 고체배양한 잎새버섯 균사체의 생육상태를 나타낸 것이고, Figure 4b shows the growth of leaf mycelium mycelium cultured for 10 days by adding CaCl 2 as a growth factor,
도 5는 글루코사민과 균사체 건조물과의 관계를 정량적으로 나타낸 것이다. 5 quantitatively shows the relationship between glucosamine and mycelium dry matter.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 우선 고체배지의 성형 및 가공방법을 제공한다. 구체적으로 식용 곡류를 마쇄하여 수분을 첨가하여 반죽한 후 가늘고 길게 성형하여 기질 사이의 간극을 발생시킨 다음 수분 함량을 재조정한 고체배지에서 잎새버섯 균사체를 배양하는 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention first provides a method for forming and processing a solid medium. Specifically, edible grains are ground, kneaded by adding water, and then formed into thin and long forms to form a gap between the substrates, and then a method of cultivating leaf mycelium in a solid medium with readjusted water content.
좀 더 상세하게는, 식용 곡류는 쌀, 보리, 밀, 감자, 대두 및 옥수수 등 전분류가 주 탄소원인 식용의 곡류를 사용하는 것이 바람직하다. 또한 최종 수분 함량은 50∼70로 하는 것이 바람직하다.More specifically, it is preferable to use edible grains of which starch is the main carbon source such as rice, barley, wheat, potato, soybean, and corn. In addition, it is preferable to make final moisture content into 50-70.
또한 본 발명은 잎새버섯 균사체의 고체배양에 최적인 생육 조건을 제공한다. 구체적으로 최적 온도, 최적 pH 및 생육인자를 제공한다.In another aspect, the present invention provides growth conditions that are optimal for the solid culture of leaf mycelium mycelium. Specifically, it provides the optimum temperature, optimal pH and growth factor.
좀 더 상세하게는, 생육 온도는 18∼28℃인 것이 바람직하고, 최적 생육 pH는 4.5∼5.5인 것이 바람직하다. 또한 생육인자로서 CaCl2를 0.01∼0.35추가로 더 첨가하는 것이 바람직하다.More specifically, the growth temperature is preferably 18 to 28 ° C, and the optimum growth pH is preferably 4.5 to 5.5. In addition, it is preferable to further add 0.01 to 0.35 of CaCl 2 as a growth factor.
또한 잎새버섯 균사체의 고체배양물에서, 액체배양에서 얻은 균사체 건조물의 양과 글루코사민의 양이 직선 관계를 이루는 것을 이용하여, 균사체가 고체배지에 활착하여 균사체를 따로 분리할 수 없는 고체배양물의 균사체만의 양을 정량하는 방법을 제공한다.In addition, in the solid culture of leaf mycelium mycelium, the mycelium only adheres to the solid medium and the mycelium adheres to the solid medium by using a linear relationship between the amount of dried mycelium obtained from the liquid culture and the amount of glucosamine. Provide a method of quantifying the amount.
또한 본 발명은 상기 방법에 의해 배양된 잎새버섯 균사체의 고체배양물을 뜨거운 물로 추출한 후 α-아밀라제 (amylase) 효소를 첨가하여 전분을 분해하고 알콜로 침전시켜 얻는 것을 특징으로 하는 잎새버섯 균사체의 단백다당체 추출물을 제공한다.In another aspect, the present invention is a protein of leaf mycelium mycelia obtained by extracting the solid culture of the leaf mycelium mycelium cultured by the above method with hot water and decomposing the starch by the addition of α-amylase enzyme and precipitation with alcohol Provides a polysaccharide extract.
더불어 본 발명은 상기 배양방법에 의한 잎새버섯 균사체 또는 상기 단백다당체 추출물을 유효성분으로 하는 균사체음료(드링크)류 또는 다류를 제공한다.좀 더 상세하게는, 잎새버섯 균사체 또는 단백다당체 추출물의 함량은 0.1∼10인 것을 특징으로 하는 균사체음료(드링크)류 또는 다류를 제공한다.In addition, the present invention provides a mycelium beverage mycelium or mycelium beverage (drink) or the polysaccharide as an active ingredient according to the culture method according to the culture method. More specifically, the content of leaf mycelium mycelium or protein polysaccharide extract Provided are mycelium beverages (drinks) or teas, characterized in that 0.1 to 10.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
기존의 톱밥배지를 사용하는 고체배양에서는 균사체의 생육에 적합한 수분 함량은 공통적으로 60∼70로 정해져 있다. 그러나 전분이 주성분인 쌀, 보리, 밀, 감자, 대두 및 옥수수 등 식용 곡류를 기질로 사용할 경우, 일반적인 고체배양에서 최적 수분 함량인 60∼70에서 살균을 행하면 전분의 호화현상으로 인하여 기질이 서로 달라붙기 때문에 기질 사이의 간극이 거의 없어져 균사체의 호흡이 저해되어 표면에만 균사체가 자라는 단점이 있다. 따라서 균사체가 식용 기질을 효율적으로 이용하도록 하기 위해서는 기질 사이의 충분한 간극을 주어 공기가 원할히 통과할 수 있도록 배지를 제조하는 것이 고체배양 기술의 가장 중요한 부분이다. 따라서 본 발명에서는 기질 사이의 간극이 잘 형성되어 고체배양시 균사체의 생육이 잘 되도록 하기 위하여, 고체배지 반죽물을 지름 0.2∼2 cm, 길이 0.5∼3 cm가 되도록 성형하여 기질 사이에 간극을 형성시켜 기질이 다시 붙지 않도록 한다. 또한 고체배양시 기질 사이의 간극이 잘 유지되도록 하는 최적의 수분 함량을 선택해야 하는데, 본 발명에서는 50∼70범위의 수분 함량이 상기 균사체의 생육에 가장 우수하다.In the solid culture using the conventional sawdust medium, the water content suitable for the growth of mycelia is commonly set at 60 to 70. However, when edible grains such as rice, barley, wheat, potatoes, soybeans, and corn, which are main components, are used as substrates, the substrates are different from each other due to gelatinization of starch when sterilization is performed at the optimum moisture content of 60 to 70 in general solid culture. Because of the adhesion, the gap between the substrates is almost eliminated, which inhibits mycelium respiration, so mycelium grows only on the surface. Therefore, in order for the mycelium to efficiently use the edible substrate, it is the most important part of the solid culture technology to prepare the medium so that the air can pass smoothly with sufficient clearance between the substrates. Therefore, in the present invention, a gap between the substrates is well formed so that the mycelium grows well during solid culture, and the solid medium dough is formed to have a diameter of 0.2 to 2 cm and a length of 0.5 to 3 cm to form a gap between the substrates. To prevent the substrate from sticking again. In addition, it is necessary to select the optimum moisture content to maintain the gap between the substrates well during the solid culture, in the present invention the water content in the range of 50 to 70 is the best for the growth of the mycelium.
한편 잎새버섯 균사체 고체배양을 위한 고체배지로는 식용기질 중에서 질소원의 비율이 탄소원에 비해 10이상이며 전분이 주성분인 쌀, 대두, 옥수수, 보리,밀 및 감자를 사용한다. 이 중에서도 특히 옥수수 기질에서 상기 균사체의 생장이 가장 활발한데, 낱알 상태의 옥수수는 낱알 표면에 얇은 필름이 존재하고 있어 균사체가 옥수수 낱알 속으로 침투하기 어려워 균사체의 생육이 더디고, 마쇄하여 표면에 균사체를 접종하면 균사체가 표면에만 생육하여 옥수수의 속부분과 바닥부분에는 균사체가 전혀 생육하지 못하게 되며, 이러한 현상은 마쇄하지 않은 감자와 쌀, 보리, 밀 및 대두에서도 똑같이 발생한다.On the other hand, as a solid medium for cultivating leaf mycelium mycelium solid, rice, soybean, corn, barley, wheat, and potato, in which the ratio of nitrogen source is 10 or more than carbon source in the food substrate and starch is the main ingredient, are used. In particular, the growth of the mycelium is the most active in the corn substrate, the grain of corn has a thin film on the surface of the grain is difficult to penetrate the mycelium into the corn grain, the growth of the mycelium is slow, grinding the mycelium on the surface When inoculated, the mycelium grows only on the surface, so that the mycelium does not grow at all in the inner and bottom portions of corn, and the same phenomenon occurs in unground potatoes, rice, barley, wheat and soybean.
본 발명에서는 잎새버섯 균사체를 고체배양하기 위한 최적의 생육조건, 즉 온도 및 pH를 결정하는데, 구체적으로 잎새버섯 균사체를 YM 액체배지에 접종하여 여러 온도 범위 또는 여러 pH에서 액체배양하고 그 배양물을 건조시킨 건조물의 양을 비교한다. 본 발명의 잎새버섯 균사체를 배양하기 위한 생육온도는 18∼28 ℃인 것이 바람직하며, 30℃ 이상의 온도에서는 균사체의 양이 현저히 감소되어 그 이상의 온도 범위에서는 균사체의 생육이 온도에 민감하다는 것을 알 수 있다. 또한 상기 균사체의 배양에 가장 적합한 pH는 4.5∼5.5이다.In the present invention, the optimum growth conditions for the solid culture of leaf fungus mycelium, that is, temperature and pH are determined, specifically, the leaf fungus mycelium is inoculated in YM liquid medium to liquid culture at various temperature ranges or pH and the culture Compare the amount of dry matter dried. The growth temperature for cultivating the leaf mycelium mycelium of the present invention is preferably 18 ~ 28 ℃, the amount of the mycelium is significantly reduced at a temperature of 30 ℃ or more, it can be seen that the growth of the mycelium is sensitive to the temperature above have. In addition, the most suitable pH for the culture of the mycelium is 4.5 to 5.5.
고체배양의 경우 균사체가 고체배지에 활착하여 균사체를 따로 분리할 수 없으므로 균사체의 양을 직접적으로 정량하는 것이 불가능하다. 이에 본 발명에서는 액체배양에서 얻은 균사체 건조물의 양과 글루코사민의 양이 직선 관계를 이루는 것을 이용하여, 고체배양물의 균사체만의 양을 정량한다.In the case of solid culture, it is impossible to directly quantify the amount of mycelium because the mycelium adheres to the solid medium and cannot separate the mycelium separately. Accordingly, the present invention quantifies the amount of the mycelium only of the solid culture by using a linear relationship between the amount of the mycelium dried product obtained in the liquid culture and the amount of glucosamine.
상기와 같은 최적 조건 및 방법으로 잎새버섯 균사체를 고체배양하여 얻은 고체배양물로부터 조단백다당체 (β-glucan)를 추출하는데, 구체적으로 고체배양물을 뜨거운 물로 추출한 후 α-아밀라제 효소를 첨가하여 전분을 분해하고 알콜로침전시켜 조단백다당체를 추출한다. 상기 조단백다당체 추출물을 동결건조하여 얻은 양은 전체 잎새버섯 균사체 배양물의 10∼12에 해당한다.Extracting crude protein polysaccharide (β-glucan) from the solid culture obtained by solid culture of leaf fungus mycelium under the optimum conditions and methods as described above. Specifically, the solid culture was extracted with hot water, followed by addition of α-amylase enzyme to starch. Decompose and precipitate with alcohol to extract crude protein polysaccharide. The amount obtained by lyophilizing the crude protein polysaccharide extract corresponds to 10 to 12 of the mycelial culture of the whole leaf mushroom.
본 발명의 배양방법에 의해 고체배양된 잎새버섯 균사체의 배양물을 유효성분으로 하여 다양한 드링크류 및 다류를 제조할 수 있는데, 구체적으로 상기 균사체 배양물에 함량을 전체 건조물의 0.1∼10로 하여 제조한다. 또한 관능검사 요원에게 실시한 기호성 조사에서 상기 제조된 드링크류 및 다류가 잎새버섯 균사체 배양물을 포함하지 않은 것에 비하여 높은 선호도를 보이며, 이로부터 본 발명에서 고체배양된 잎새버섯 배양물이 여러 가지 드링큐류 및 다류에 효과적으로 사용될 수 있음을 알 수 있다.By using the culture of the leaf cultured mycelium mycelium solid cultured as an active ingredient by the culturing method of the present invention can be prepared a variety of drinks and teas, specifically, the content of the mycelium culture is prepared by 0.1 to 10 of the total dry matter do. In addition, in the palatability study conducted by sensory test personnel, the prepared drinks and polysaccharides showed a higher preference than the leaf mushroom mycelium culture, and the leaf culture of the leaf culture cultured in the present invention was various drinks. And it can be seen that it can be effectively used in the multi stream.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples.
단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited by the examples.
<참조예 1> 잎새버섯 균사체의 전배양<Reference Example 1> Preculture of leaf mushroom mycelium
한국종균협회에서 분양받은 잎새버섯 균사체 (Grifola frondosa, KCCM 11929)를 공시 균주로 하였다. 사면배양으로부터 YM (Difco 사) 고체평판배지에 잎새버섯 균사체를 5(vol/wt)의 농도로 접종하여 인큐베이터 (incubator)에서 25℃로 7일간 배양하여 균사체가 고체평판배지에 활착되면 균사체를 직경 10 mm의 구멍 뚫는 기계 (perforator)로 아가 (agar)와 함께 구멍을 뚫어 접종원으로 하였다.접종원은 살균된 100 ㎖ YM 액체배지에 접종하여 25℃로 7일간 배양한 후 전배양으로 사용하였다. 전배양된 100 ㎖ 배양액을 살균된 균질기 (homogenizer) 용기에 담아 균사체가 파괴되지 않도록 6000 rpm에서 30초간 마쇄한 후, 무균실에서 살균된 피펫을 사용하여 100 ㎖의 YM 액체배지에 5(wt/wt)의 접종량으로 상기 마쇄된 균사체를 접종하여 진탕배양기에서 25℃에서 120 rpm으로 7∼14일간 배양하였다.Leaf fungus mycelium ( Grifola frondosa , KCCM 11929) received from the Korean spawn association was used as the disclosed strain. Inoculate the mycelial fungus mycelium at a concentration of 5 (vol / wt) on YM (Difco) solid flat media from slope culture and incubate at 25 ° C. in an incubator for 7 days to allow the mycelium to adhere to the solid flat media. A 10 mm perforator was used to make a hole with agar to inoculate the inoculum. The inoculum was inoculated in sterilized 100 ml YM liquid medium and incubated at 25 ° C. for 7 days before being used as a preculture. The precultured 100 ml culture was placed in a sterile homogenizer container and ground at 6000 rpm for 30 seconds to prevent mycelium destruction, and then, in a sterilized pipette in a sterile chamber, 5 (wt / The ground mycelia were inoculated with the inoculum of wt) and incubated for 7-14 days at 25 ° C. and 120 rpm in a shaker incubator.
<실시예 1> 잎새버섯 균사체 고체배양을 위한 고체배지의 성형 및 식용기질 사이의 간극 형성을 위한 최적 수분 함량의 결정Example 1 Determination of Optimum Moisture Content for Forming Solid Medium and Forming Gap between Edible Substrates
(1) 고체배지의 성형(1) forming of a solid medium
전분이 주성분인 옥수수를 분말 상태로 만든 뒤 수분을 40∼50로 하여 반죽하고 살균기 (또는 스팀)에서 찐 후 상온으로 식혔다. 식힌 반죽물은 국수 제조기로 지름 0.2∼2 cm 정도의 국수모양으로 몰딩 (moulding)하고 길이 0.5∼3 mm가 되도록 칼로 잘랐으며, 상기와 같이 성형한 고체배지 기질을 삼각플라스크에 넣으면 기질 사이의 간극이 발생하여 기질이 다시 붙지 않았다.Starch-based corn was made into powder, kneaded with water to 40-50, steamed in a sterilizer (or steam), and cooled to room temperature. The chilled dough was molded into a noodle shape of 0.2-2 cm in diameter using a noodle maker and cut with a knife so as to be 0.5-3 mm in length. This occurred and the substrate did not reattach.
이어서 수분 함량을 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70 및 75가 되도록 조절하여 살균기 (또는 스팀)에서 성형한 옥수수 반죽물을 살균하였다. 성형한 옥수수 기질 중 수분 함량 조건이 60이상인 것은 전분의 호화현상에 의하여 팽윤되므로 성형 상태가 파괴되고 기질이 서로 달라붙어 기질 사이의 간극을 주고자 하는 성형의 의미가 없었다. 반면 수분 함량이 30∼55범위인 옥수수 기질은 성형한 모양을 그대로 유지하였다.The water content was then adjusted to 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70 and 75 to sterilize the corn dough formed in the sterilizer (or steam). Moisture content of more than 60 of the molded corn substrate was not meaningful because of the swelling caused by gelatinization of the starch, the shaping state is broken and the substrates stick together to give a gap between the substrates. On the other hand, the corn substrate with a water content in the range of 30 to 55 retained the molded shape.
(2) 최적 수분 함량 결정(2) Determination of Optimum Moisture Content
수분 함량을 30∼55범위로 하여 살균 후 기질 사이의 간극이 어느 정도 형성되어 성형한 모양을 그대로 유지한 옥수수 기질에 살균증류수를 무균적으로 추가로 첨가하여 수분 함량을 여러 가지로 재조정하였다. 그리고 나서 수분 함량이 재조정된 옥수수 기질 300 g에 대해 고체평판배지에 활착된 균사체를 직경 10mm의 구멍뚫는 기계를 이용하여 아가와 함께 접종하여 25℃에서 14일간 배양하고 생육정도를 비교하였다 (표 1 참조). 한편 고체배양시에는 균사체가 고체배지에 활착하여 균사체의 양을 직접 측정할 수 없으므로, 균사체의 상대적인 생육정도를 비교하기 위해 균사체가 배양된 고체배지를 1시간 동안 밀봉한 후에 적외선 이산화탄소 모니터 (Infra-Red CO2monitor, Gaurdian II)를 사용하여 기질 당 생성되는 이산화탄소의 양을 측정하였다After sterilization with a water content in the range of 30 to 55, sterilization distilled water was added aseptically to the corn substrate, which had a certain gap formed between the substrates and maintained the molded shape. Then, the mycelium that adhered to the solid flat medium was inoculated with agar using a 10 mm diameter boring machine for 300 g of the corn substrate with the water content readjusted, incubated at 25 ° C. for 14 days, and the growth degree was compared (Table 1). Reference). On the other hand, since the mycelium adheres to the solid medium during the solid culture, the amount of the mycelium cannot be measured directly.In order to compare the relative growth of the mycelium, an infrared carbon dioxide monitor (Infra- Red CO 2 monitor, Gaurdian II) was used to measure the amount of carbon dioxide produced per substrate.
상기 표 1에서 볼 수 있듯이, 최종 수분 함량이 40, 50, 55, 60, 65, 70 및 75였을 때 초기 기질양 300g에 대한 1시간 당 이산화탄소의 발생량은 각각 7, 12,14, 14.5, 15.2, 15및 7였으며, 수분 함량 50∼70범위의 조건이 잎새버섯 균사체의 생육에 가장 우수하다는 것을 알 수 있었다. 그 중 수분 함량을 70로 하여 25℃에서 2주 동안 배양한 결과를 살펴보면 균사체가 기질의 바닥 쪽으로 많이 내려가는 것을 볼 수 있다 (도 1참조).As can be seen in Table 1, when the final moisture content is 40, 50, 55, 60, 65, 70 and 75, the amount of carbon dioxide generated per hour for the initial substrate amount 300g is 7, 12, 14, 14.5, 15.2, respectively. , 15 and 7, and the water content of 50 ~ 70 range was the best for the growth of leaf mycelium. Looking at the results of incubation for 2 weeks at 25 ℃ with a water content of 70 can be seen that the mycelium is much lowered to the bottom of the substrate (see Figure 1 ).
이상의 결과로부터 잎새버섯 균사체의 고체배양에 있어 균사체가 가질에 침투하여 호흡할 수 있는 기질 사이의 간극과 수분 함량 조건이 균사체의 생육에 중요한 인자임을 알 수 있다.From the above results, it can be seen that in the solid culture of leaf mycelium mycelium, the gap between the mycelium and the respirable substrate and the water content condition are important factors for the growth of mycelium.
<실시예 2> 잎새버섯 균사체의 고체배지 선정<Example 2> solid medium of leaf mycelium mycelium
잎새버섯 균사체의 고체배양에 가장 적합한 고체배지를 결정하기 위하여, 균사체 생장에 필요한 식용기질 중에서 질소원의 비율이 탄소원에 비해 10이상인 대두, 쌀, 보리, 밀, 감자 및 옥수수를 선정하여 고체배양 실험을 행하였다.In order to determine the most suitable solid medium for the cultivation of leaf mycelium mycelium, solid culture experiment was conducted by selecting soybean, rice, barley, wheat, potato and corn whose nitrogen source is 10 or more than carbon source among the edible substrates required for mycelial growth. It was done.
대두, 쌀, 보리, 밀, 감자 및 옥수수를 기질로 하여 상기 참조예 1에서 배양된 잎새버섯 균사체를 실시예 1과 동일한 방법으로 접종시켜 수분 함량을 70로 맞춘 동일한 조건으로 25℃에서 2주 동안 배양한 결과, 관능적으로 대두, 쌀 및 감자는 균사체의 생육정도를 이산화탄소의 생성량으로 비교하였을 때 이산화탄소가 시간당 각각 1, 1.5 및 0.6 /100g로 발생되었다. 옥수수는 낱알 상태로는 균사체가 잘 생육하지 않았으나 마쇄하여 분말 상태에서 균사체를 접종시켰을 때에는 대두, 쌀 및 감자에 비해 관능적으로 표면에 빽빽하게 균사체가 자랐으며 시간 당 3/100g의 이산화탄소를 발생시켜 상기 대두, 쌀 및 감자보다 생육이 우수하다는 것을 알수 있었다.Soybean, rice, barley, wheat, potatoes and corn as a substrate was inoculated in the same manner as in Example 1 leaf mycelium mycelium cultured in the same manner as in Example 1 moisture content at 70 for 2 weeks at 25 ℃ As a result of culturing, soybean, rice and potato produced carbon dioxide at 1, 1.5 and 0.6 / 100g per hour, respectively, when the growth rate of mycelium was compared with the amount of carbon dioxide produced. Corn did not grow well in the mycelium, but when the mycelium was inoculated in the ground state, the mycelium grew more densely on the surface than in soybean, rice, and potatoes, and produced 3 / 100g of carbon dioxide per hour. It was found that growth was better than rice and potatoes.
한편 낱알 상태의 옥수수는 낱알 표면에 얇은 필름이 존재하고 있어 균사체가 옥수수 낱알 속으로 침투하기 어려워 균사체의 생육이 더디고, 마쇄하여 표면에 균사체를 접종하면 균사체가 표면에만 생육하여 옥수수의 속부분과 바닥부분에는 균사체가 전혀 생육하지 못하는 현상을 볼 수 있었다 (도 2참조). 이러한 현상은 마쇄하지 않은 감자, 쌀, 보리, 밀 및 대두에서도 똑같이 발생하였다.On the other hand, the grain of corn has a thin film on the surface of the grain, so it is difficult for the mycelium to penetrate into the grain of corn. Therefore, the growth of the mycelium is slow, and when the mycelium is inoculated on the surface, the mycelium grows only on the surface. At this point, the mycelia could not grow at all (see FIG. 2 ). The same was true of unmilled potatoes, rice, barley, wheat and soybeans.
<실시예 3> 잎새버섯 균사체의 최적 생육 온도 결정Example 3 Determination of Optimal Growth Temperature of Leaf Mushroom Mycelium
참조예 1에서 배양된 잎새버섯 균사체를 18, 20, 22, 26, 28, 30, 33 ℃의 온도로 조절된 진탕교반기에서 10일간 YM 액체배지에서 액체배양하고 그 배양액을 여과지 (Whatman No. 41)로 여과하여 105℃로 맞춘 건조기에서 2시간 동안 건조시킨 후 균사체의 무게를 측정하여 생육정도를 비교하였다 (도 3참조). 건조균체량으로 비교한 잎새버섯 균사체의 최적 생육 온도는 18∼28℃인 것으로 결정되었다. 30℃ 이상의 온도에서는 균사체의 양이 현저히 감소되어 그 이상의 온도 범위에서는 균사체의 생육이 온도에 민감하다는 것을 알 수 있었다.The leaf fungus mycelium cultured in Reference Example 1 was cultured in YM liquid medium for 10 days in a shaker controlled at a temperature of 18, 20, 22, 26, 28, 30, 33 ° C., and the culture solution was filtered (Whatman No. 41). ) And dried for 2 hours in a dryer adjusted to 105 ℃ by measuring the weight of the mycelium to compare the growth degree (see Figure 3 ). The optimum growth temperature of the leaves mycelium compared to the dry cell weight was determined to be 18 ~ 28 ℃. At temperatures above 30 ° C., the amount of mycelium was significantly reduced, and the growth of mycelium was sensitive to temperature at temperatures higher than that.
<실시예 4> 잎새버섯 균사체의 최적 pH 결정Example 4 Determination of Optimum pH of Leafy Mycelium
잎새버섯 균사체 배양의 최적 pH를 결정하기 위하여, 식용으로 사용되는 산 가운데 구연산을 선정하여 50의 구연산 용액으로 YM 액체배지의 pH를 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5 및 7로 pH 미터 (pH meter)를 이용하여 조정하였다. 그리고 나서상기 참조예 1에서 배양된 잎새버섯 균사체를 5(wt/vol)의 접종량으로 접종하여 25℃에서 7일간 액체배양하고, 그 배양액을 여과지 (Whatman No. 41)로 여과하여 105℃로 맞춘 건조기에서 2시간 동안 건조시킨 후 균사체의 무게를 측정하여 생육정도를 비교하였다. 그 결과, 잎새버섯 균사체의 최적 생육 pH는 4.5∼5.5인 것으로 결정되었다.To determine the optimal pH of leaf fungus mycelium culture, citric acid was selected among the edible acids and the pH of YM liquid medium was adjusted to 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5 and 7 with 50 citric acid solutions. Adjustments were made using a pH meter. Then, inoculated with mycelial mycelium cultured in Reference Example 1 at an inoculation amount of 5 (wt / vol) and cultured in liquid at 25 ° C. for 7 days, and the culture solution was filtered with filter paper (Whatman No. 41) and adjusted to 105 ° C. After drying for 2 hours in a drier, the mycelia were weighed to compare the growth. As a result, the optimum growth pH of leaf mushroom mycelium was determined to be 4.5 to 5.5.
<실시예 5> 잎새버섯 균사체의 생육인자 결정Example 5 Determination of Growth Factors of Leaves Mushrooms
생육인자로서 유기산으로는 구연산; 당류로는 설탕; 염류로는 CaCl2; 지방으로는 야자유; 및 단백질원으로는 유청단백, 대두단백, 유청분말 및 이스트 추출물 등을 선정하여, 옥수수 고체배지에 상기 생육인자를 추가로 첨가했을 때 잎새버섯 균사체의 고체배양시 생육에 어떠한 영향을 미치는지 다음과 같은 방법으로 알아보았다.As the growth factor, organic acids include citric acid; Sugars include sugar; Salts include CaCl 2 ; Palm oil as fat; Whey protein, soy protein, whey powder, yeast extract, etc. are selected as protein sources, and when the additional growth factors are added to corn solid medium, the effect of the growth of leaf fungus mycelium on solid growth is as follows. Learned how.
담자균류 균사체의 액체배양에서 생육인자로 사용되고 있는 유기산 (구연산, 0.1), 당류 (수크로즈 (sucrose) 1), 단백질 (유청단백, 대두단백, 유청분말, 이스트 추추물 각 0.1), 지방 (야자유 2) 및 염류 (CaCl20.1)를 각각 옥수수 고체배지 300 g에 추가로 첨가하여 2주 동안 잎새버섯 균사체를 25℃에서 고체배양하였다. 대조군으로는 생육인자를 첨가하지 않은 옥수수 고체배지에서 상기와 같은 조건에서 2주 동안 고체배양한 잎새버섯 균사체를 사용하였다.Organic acids (citric acid, 0.1), sugars (sucrose 1), proteins (whey protein, soy protein, whey powder, yeast extract each 0.1), fat (palm oil) which are used as growth factors in the liquid culture of basidiomycete mycelium 2) and salts (CaCl 2 0.1) were further added to 300 g of corn solid medium, respectively, and the leaf fungus mycelium was solid cultured at 25 ° C. for 2 weeks. As a control, leaf mushroom mycelium was cultured for 2 weeks under the same conditions in corn solid medium without growth factor.
그 결과 유기산, 당류, 단백질원 및 지방을 첨가한 경우에는 시간당 이산화탄소의발생량이 15정도로, 첨가하지 않은 경우와 별 차이가 없었다. 이러한 현상은 옥수수 성분 중 탄수화물, 단백질 및 지방이 이미 포함되어 있기 때문에 첨가의 효과를 볼 수 없었던 것으로 생각된다.As a result, when the organic acid, sugar, protein source and fat were added, the amount of carbon dioxide generated per hour was about 15, which was not significantly different from the case without addition. This phenomenon is thought to have not seen the effect of the addition because the carbohydrate, protein and fat already contained in the corn component.
그러나 CaCl2를 첨가한 경우에는 시간당 이산화탄소의 발생량이 대조군에 비하여 높게 나왔다. 따라서 최적의 CaCl2첨가 농도를 알아보기 위하여 옥수수 고체배지에 CaCl2의 농도를 달리하여 첨가하고 10일 간 25℃에서 잎새버섯 균사체를 고체배양하였다 (표 2 참조).However, when CaCl 2 was added, the amount of carbon dioxide generated per hour was higher than that of the control group. Therefore, an optimum addition of CaCl 2 Maitake mushroom mycelium at 25 ℃ liver to evaluate the concentration added to different concentrations of CaCl 2 in solid medium corn and 10 days were solid culture (see Table 2).
상기 표 2에서 볼 수 있듯이, 0.01, 0.05, 0.1, 0.15, 0.25및 0.35의 농도별로 첨가하여 그 결과 CaCl2가 첨가되었을 때 시간당 이산화탄소의 발생량은 첨가량 순서대로 17.5, 18.7, 17.5, 16.5, 16및 15로서, 생육인자가 첨가되지 않은 대조구의 15(기질 300 g 당)에 비해 높게 나왔다. 그 중에서도 특히 CaCl2가 0.01∼0.1로 첨가된 실험군의 이산화탄소발생량이 가장 높게 나타났으며 바닥에서도 균사체를 볼 수 있었다 (도 4참조). 상기 배양물을 정량했을 때, 균사체의 양은 전체 기질에 대해 10∼11인 것으로 측정되었다.As can be seen in Table 2, when the concentration of 0.01, 0.05, 0.1, 0.15, 0.25 and 0.35 is added, and as a result, when CaCl 2 is added, the amount of carbon dioxide generated per hour is 17.5, 18.7, 17.5, 16.5, 16 and As 15, it was higher than 15 (per 300 g substrate) of the control without the growth factor. In particular, the amount of carbon dioxide generated in the experimental group added with CaCl 2 0.01 ~ 0.1 was the highest and the mycelium was also visible from the bottom (see Figure 4 ). When the culture was quantified, the amount of mycelium was determined to be 10-11 based on the total substrate.
<실시예 6> 잎새버섯 균사체 고체배양시 균사체의 정량<Example 6> Determination of mycelium during leaf culture of mycelial mycelium
고체배양시에는 균사체가 고체배지에 활착하여 균사체양을 직접 측정하는 것이 불가능하므로, 하기 방법에서와 같이 담자균류의 세포벽 (cell wall) 성분인 글루코사민 (glucosamine)의 함량을 측정하여 균사체양을 정량하였다.During the solid culture, the mycelium adhered to the solid medium and thus it was impossible to directly measure the mycelial mass. As shown in the following method, the mycelial mass was quantified by measuring the content of glucosamine, which is the cell wall component of the basidiomycetes. .
고체배양된 시료를 송풍건조시킨 후 맷돌 믹서기로 분쇄하고 이 중 0.5 g을 취하여 시험관에 담고 아세톤 9 ㎖를 첨가하여 2분 동안 흔들어준 다음 3000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였으며, 시료는 아세톤 9 ㎖로 재현탁하여 다시 원심분리하였다. 시료 중의 아세톤은 휘발시키고 진한 KOH 4 ㎖로 현탁하고 121 ℃에서 15분 동안 가압살균한 후 방냉하였다. 시료는 얼음으로 냉각한 75에탄올 8 ㎖에 녹여 얼음조 (ice-bath)에서 15분 동안 방치하였고, 75에탄올 60 ㎖에 3 g의 셀라이트 (celite) 545를 섞어서 2분 동안 방치해 두었던 셀라이트 현탁액 0.9 ㎖를 상기 시료의 윗부분에 살며시 얹은 다음, 2℃에서 3000 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 펠렛 (pellet)은 얼음으로 냉각한 40에탄올 8 ㎖로 재현탁하여 5분 동안 와동 혼합 (vortex mixing)하고 2℃에서 3000 rpm으로 10분 동안 재원심분리하였다. 그 후 냉각한 증류수 10 ㎖로 펠렛을 세척하고 상기 원심분리하는 공정을 두 번 반복하였다.The solid cultured sample was blow-dried and pulverized with a millstone mixer, 0.5 g of which was taken into a test tube, added with 9 ml of acetone, shaken for 2 minutes, centrifuged at 3000 rpm for 2 minutes, and the sample was 9 ml of acetone. Resuspend and centrifuge again. Acetone in the sample was volatilized, suspended with 4 ml of concentrated KOH, autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes, and allowed to cool. The sample was dissolved in 8 ml of ice-cold 75 ethanol and left for 15 minutes in an ice-bath. Celite was mixed with 60 ml of 75 ethanol and 3 g of celite 545 and left for 2 minutes. 0.9 ml of the suspension was gently placed on top of the sample and then centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes at 2 ° C. The pellet was resuspended in 8 ml of ice-cold 40 ethanol, vortex mixed for 5 minutes and recentrifuged for 10 minutes at 3000 rpm at 2 ° C. Thereafter, the pellet was washed with 10 ml of cooled distilled water and the centrifugation was repeated twice.
원심분리 후 남은 부분에 증류수를 가하여 전체 부피가 1.5 ㎖가 되게 조정하였고 여기에 5KHSO41.5 ㎖를 넣어 혼합하고 5분 동안 와동 혼합한 후 다시 0.5MBTH (3-methyl-2-benzothiozolone hydrazone) 0.5 ㎖를 첨가하여 혼합하였다. 혼합물은 끓는 물 속에서 3분 동안 반응시킨 후 냉각시켰고, 여기에 0.5FeCl30.5 ㎖를 첨가하여 실온에서 30분 동안 방치시킨 후 자외선-가시광선 분광기 (UV-vis spectrophotemeter, UV-1201, Shimadzu)를 사용하여 650 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 글루코사민 HCl 표준곡선을 이용하여 환산하였으며 고체배양된 시료 0.5 g에 들어있는 글루코사민의 양을 ㎍으로 표현하였다. 증류수를 첨가하여 1.5 ㎖로 맞춘 글루코사민 표준용액은 5KHSO41.5 ㎖와 5NaNO21.5 ㎖로 처리한 후 상기 공정과 똑같이 하여 650 nm에서의 흡광도를 측정하였다.Distilled water was added to the remaining part after centrifugation to adjust the total volume to 1.5 ㎖, and 1.5 ㎖ of 5KHSO 4 was added thereto, mixed and vortexed for 5 minutes, and then 0.5 ㎖ 0.5MBTH (3-methyl-2-benzothiozolone hydrazone) Was added and mixed. The mixture was reacted in boiling water for 3 minutes and then cooled, and 0.5 ml of 0.5FeCl 3 was added thereto, and the mixture was left at room temperature for 30 minutes, followed by UV-vis spectrophotemeter (UV-1201, Shimadzu). Absorbance at 650 nm was measured using. The absorbance was converted using the glucosamine HCl standard curve and expressed in μg of the glucosamine contained in 0.5 g of the solid culture sample. The glucosamine standard solution adjusted to 1.5 ml by adding distilled water was treated with 1.5 ml of 5KHSO 4 and 1.5 ml of 5NaNO 2 , and the absorbance at 650 nm was measured in the same manner as above.
참조예 1에서 배양된 잎새버섯 균사체를 25℃, pH=5에서 30일간 액체배양하고, 그 5일 간격으로 얻어진 건조 균사체의 양과 상기 방법에 의해 추출된 N-글루코사민의 양을 비교한 결과, 균사체 건조물과 글루코사민의 함량과의 관계가 직선적인 상관관계를 보이는 것을 알 수 있었다 (도 5참조). 따라서 고체의 식용기질에 균사체가 활착되어 균사체만을 따로 떼어 분리하는 것이 불가능한 고체배양에서도, 상기와 같이 N-글루코사민의 함량을 측정함으로써 균사체의 건조량을 측정할 수 있었다.The leaf fungus mycelium cultured in Reference Example 1 was incubated for 30 days at 25 ° C. and pH = 5, and the amount of dry mycelium obtained at the 5 day interval was compared with the amount of N-glucosamine extracted by the above method. It was found that the relationship between the dry matter and the content of glucosamine showed a linear correlation (see FIG. 5 ). Therefore, even in a solid culture in which a mycelium adhered to a solid food substrate and it was impossible to separate and separate only the mycelium, the amount of dry mycelium could be measured by measuring the content of N-glucosamine as described above.
<실시예 7> 잎새버섯 균사체 고체배양물에서 단백다당체의 추출Example 7 Extraction of Protein Polysaccharide from Leafy Mushroom Mycelium Solid Cultures
잎새버섯의 균사체가 활착된 고체배양물로부터 조단백다당체 (β-glucan)을다음과 같은 방법으로 추출하였다.Crude protein polysaccharide (β-glucan) was extracted from the solid culture medium containing mycelia of leafy mushroom in the following manner.
참조예 1에서 배양된 잎새버섯 균사체를 최종 수분 함량을 70로 맞춘 옥수수 기질에서 25℃, pH=5인 조건으로 CaCl2를 0.1첨가하여 90일간 고체배양하였다. 상기 고체배양물 10 g에 5∼10배의 물을 첨가하여 100℃에서 24시간 동안 가열하고 상온으로 식인 후, 알콜을 전체 가열물에 대해 1∼2.5배로 첨가하여 다당류를 침전시켰다. 침전시킨 다당류를 6000 rpm에서 1 시간 동안 원심분리하여 상등액은 버리고 스피드박 (speedvac) 농축기 (Savant사)로 건조시켰다. 건조물은 물 50 ㎖에 녹이고 α-아밀라제 (amylase)를 첨가하여 전분류를 분해시킨 후 다시 알콜로 침전시켰다. 침전물을 다시 원심분리하여 건조시킨 후, 건조물을 물 10 ㎖에 녹여 투석 (dialysis)을 실시하고 나서 동결건조시킨 결과, 전체 균사체의 양에 대하여 10∼12의 조단백다당체를 얻을 수 있었다.The leaf mushroom mycelium cultured in Reference Example 1 was solid-cultured for 90 days by adding CaCl 2 at 25 ° C. and pH = 5 in a corn substrate having a final moisture content of 70. To 10 g of the solid culture was added, 5 to 10 times of water, heated at 100 ° C. for 24 hours, cooled to room temperature, and alcohol was added 1 to 2.5 times with respect to the total heating to precipitate polysaccharides. The precipitated polysaccharide was centrifuged at 6000 rpm for 1 hour to discard the supernatant and dried in a speedvac concentrator (Savant). The dried product was dissolved in 50 ml of water, and α-amylase was added to decompose the starch and settle again with alcohol. The precipitate was centrifuged again and dried, and then, the dried product was dissolved in 10 ml of water, subjected to dialysis, and lyophilized. As a result, 10-12 crude protein polysaccharides were obtained with respect to the total amount of mycelia.
<제조예 1> 잎새버섯 균사체 추출물을 이용한 드링크의 제조Preparation Example 1 Preparation of Drinks Using Leaf Mushroom Mycelium Extract
참조예 1에서 배양된 잎새버섯 균사체를 최종 수분 함량을 70로 맞춘 옥수수 기질에서 25℃, pH=5인 조건으로 CaCl2를 0.1첨가하여 90일간 고체배양하였다. 상기 고체배양물은 스피드박으로 건조시키고, 배양건조물 10 g에 증류수 90 g을 첨가하여 냉각기가 부착된 멘들 (mentle)에서 24시간 동안 열수 추출한 후 여과지 (Whatman No. 1)로 여과하여 얻어진 여과액 (8 Brix)을 사용하여 표 3에서와 같은 조성비로 드링크를 제조하였다.The leaf mushroom mycelium cultured in Reference Example 1 was solid-cultured for 90 days by adding CaCl 2 at 25 ° C. and pH = 5 in a corn substrate having a final moisture content of 70. Filtrate obtained by drying the solid culture with a speed foil, hot water extraction for 10 hours to 10 g of the culture dry to the culture dry to the menle (mentle) attached to the cooler and then filtered with a filter paper (Whatman No. 1) (8 Brix) was used to prepare a drink at the composition ratio as shown in Table 3.
<제조예 2> 잎새버섯 균사체 추출물을 이용한 보리차 및 옥수수차의 제조Preparation Example 2 Preparation of Barley Tea and Corn Tea Using Leaf Mushroom Mycelium Extract
참조예 1에서 배양된 잎새버섯 균사체를 최종 수분 함량을 70로 맞춘 옥수수 기질에서 25℃, pH=5인 조건으로 CaCl2를 0.1첨가하여 90일간 고체배양하고, 얻어진 고체배양물은 스피드박으로 건조시켰다. 시중에 시판되고 있는 티백으로 되어 있는 보리차와 옥수수차에 대해 티백을 개봉한 후 상기 건조물을 전체 건조 중량에 대해 0.5, 1, 1.5. 2, 2.5, 3, 3.5 및 4씩 각각 첨가하고 다시 살균한 실로 밀봉한 다음, 끓는 물에서 30분 씩 가열하여 보리차와 옥수수차를 제조하였다. 잎새버섯 균사체의 배양 건조물을 첨가하여 제조한 보리차와 옥수수차에 대해 각각 20명으로 구성된 관능검사 요원에게 기호성을 조사한 결과는 표 4와 같다.The leaf mushroom mycelium cultured in Reference Example 1 was solid-cultured for 90 days by adding CaCl 2 at a temperature of 25 ° C. and pH = 5 in a corn substrate having a final moisture content of 70, and the obtained solid culture was dried with speed foil. I was. After opening the teabags for barley and corn teas made of commercially available tea bags, the dried products were added to the total dry weight of 0.5, 1, 1.5. 2, 2.5, 3, 3.5 and 4 each was added and sealed again with sterilized yarn, and then heated in boiling water for 30 minutes to prepare barley tea and corn tea. Table 4 shows the results of palatability test of 20 barley and corn teas prepared by adding cultured dried mycelium mycelium.
표 4에서 A는 보리차 또는 옥수수차에 잎새버섯 균사체 건조물을 첨가하지 않은 것이고, B는 보리차 또는 옥수수차의 전체 중량에 대해 잎새버섯 균사체 건조물을 1첨가한 것이고, C는 보리차 또는 옥수수차의 전체 중량에 대해 잎새버섯 균사체 건조물을 2첨가한 것이고, D는 보리차 또는 옥수수차의 전체 중량에 대해 잎새버섯 균사체 건조물을 2.5첨가한 것이고, E는 보리차 또는 옥수수차의 전체 중량에 대해 잎새버섯 균사체 건조물을 3첨가한 것이다. 표 4에서 나타난 바와 같이 잎새버섯 균사체를 2.5까지 첨가한 경우에는 옥수수차와 보리차 모두에서 잎새버섯 균사체 건조물을 첨가하지 않은 것보다 높은 선호도를 보였으며, 잎새버섯 균사체를 0.1∼2.5포함하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있었다.In Table 4, A does not add the leaf mycelium mycelium dry matter to barley tea or corn tea, B is the addition of leaf mycelium mycelium dry matter to the total weight of barley tea or corn tea, and C is the total weight of barley tea or corn tea. The leaves were added mycelial mycelium dried to the two, D is the leaves added mycelium mycelium 2.5 to the total weight of barley tea or corn tea, E is the leaves mycelium mycelium dried to the total weight of the barley tea or corn tea It is added. As shown in Table 4, when added to the leaf mycelium mycelium up to 2.5, both corn tea and barley tea showed higher preference than without adding the leaf mycelium mycelium, and it is preferable that the leaf mycelium contains 0.1 to 2.5 I could see that.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법에 의하면 전분이 주성분인 식품 원료를 잎새버섯 균사체의 생육에 적합하도록 가공하고 생육조건이 최적이 되도록 온도, pH, 수분 및 첨가물 등을 조절하여 잎새버섯 균사체를 대량으로 배양할 수 있을 뿐만 아니라, 본 발명의 고체배양법은 장치비가 싸고 잡균의 오염가능성이 적으며 기질 자체의 풍미가 좋기 때문에 배양물 자체를 직접 첨가하여 여러 가지의 드링크류나 다류(茶類)를 제조할 수 있는 장점이 있다.As described above, according to the method of the present invention, processing the raw material of starch as a main component to grow the leaf mushroom mycelium, and to adjust the temperature, pH, moisture and additives such that the growth conditions are optimal, In addition to culturing in large quantities, the solid culture method of the present invention is low in cost of equipment, less likely to be contaminated with bacteria and good flavor of the substrate itself, so that the culture itself is added directly to various drinks or teas. There is an advantage to manufacture.
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