KR100307289B1 - Qs-21을 함유하는 강글리오사이드-klh 접합체 백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 백신이 투여되는 피검자에게서 갱글리오사이드를 인지하는 항체의생산을 자극하거나 또는 증가시키는 백신을 제공한다.
이 백신은 피검자에게서 항체생산을 자극하거나 또는 증가시키는데 유효한 양의, 면역원성 단백질에 컨쥬게이션된 갱글리오사이드 또는 이것의 올리고당부분으로 이루어진다. 또 이 백신은 아주반트와 제약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함하여 이루어 진다.
본 발명은 또한 암세포의 표면상 또는 스트로마내에 갱글리오사이드가 존재하는 암을 처치 또는 예방하는 백신을 사용하는 방법을 제공한다.
Description
[발명의 명칭]
QS-21을 함유하는 강글리오사이드-KLH 접합체 백신
본 발명은 정부 허가 제 RO1 CA45032에 의거한 지원 하에서 이루어졌다. 따라서, 미합중국 정부는 본 발명에 대해 일정한 권리를 갖는다.
[발명의 배경]
강글리오사이드(ganglioside)는 소수성 세라미드 부위에 결합된 복합 탄수화물체(complex carbohydrate moiety)로 이루어진 글리코스핑고리피드(glycosphingolipid)를 포함하는 시알산(sialic acid)이다. 세포막의 외막 내부에 묻혀 있으면서, 탄수화물 사슬은 세포의 매트릭스내로 노출되어 있다. 세포의 분화 및 증식 도중에 강글리오사이드 조성이 정성적으로, 그리고 정량적으로 변화하는 것이 관찰되었으며, 이것은 신경외배엽에서 유래된 암의 악성 변형의 상태를 반영하는 것으로 추측된다(Hakomori 1985). 악성 흑색종 세포는 정상적인 흑색세포에 존재하는 주요 강글리오사이드인 GM3 이외에도 다양한 종류의 복합체 강글리오사이드를 발현시킨다 (Carubia et al., 1984). 흑색 종에서의 변형된 강글리오사이드 대사는 추가적으로 GD3, GD2, GM2, 9-0-Acetyl-GD3 및 GT3의 발현을 유발한다 (Hamilton et al. 1993; Tsuchida et al., 1987). 항-GD3 단클론성 항체로 환자를 처치하면 종양 부위에 염중이 발생하고 암의 전이가 부분적으로 억제되는 것이 때때로 관찰되는데, 이는 강글리오사이드가 면역 공격법에 있어서 적절한 표적임을 시사하는 것이다(Houghton et al., 1985). 흑색종 환자에서 유래된 GD3에 반응하여 인간 Mab’가 생성되는 것은(Yamagucki et al., 1987) 강글리오사이드가 잠재적인 면역원일 것이라고 하는 아이디어를 뒷받침하는 것이기도 하다.
능동면역법에 의해 흑색종 환자에게서 강글리오사이드에 대항하는 체액성 반응을 일으키고자 하는 목적의 연구에서, GM2/BCG가 가장 효과적일 것이라는 결과가 있었다(Livingston et al., 1987; Livingston et al., 1989). 수술 후에 완치된 122명의 흑색종 환자에 대한 무작위 연구에서, BCG 단독 치료를 받은 64명의 환자와 GMl/BCG 치료를 받은 58명의 환자 중에서, GM2를 투여 받은 환자의 대부분 (86%)이 항체를 생성해낸 것으로 밝혀졌다. 항-GM2 항체를 생성해 낸 환자들은 항체-음성의 환자에 비해 현저히 오랜 기간 동안 질병을 앓지 않았으며 긴 생존 기간을 나타내었다. 실험의 두 측면을 비교하면, GM2/BCG 백신을 투여 받은 환자들은 BCG 대조군과 비교하여, 비록 통계적으로 유의한 것은 아니지만, 질병을 않지 않은 간격의 측면에서 17%의 개선을, 그리고 생존율에서 9%의 개선을 나타내었다(Livingston et al., 1993a). 불행하게도, 면역 반응은 단기간 동안만 지속되는 IgM이 대부분이고 그 역가 역시 온화하다.
이것은 GM2가 탄수화물 항원의 결과로서 GM-2가 T-세포 비의존성 항원으로서 인식되며(Livingston et al., 1989), 또한 강글리오사이드가 몇몇 정상 조직에서 발현되는 자가 항원(auto antigen) 이기 때문이기도 하다(Hamilton et at., 1993). GO2와 9-0-아세틸-GD3 백신을 이용한 비슷한 접근방법에 있어서도 때때로 역가가 낮았으며 GD3에 대항하는 항원 반응이 검출되지 않는 경우도 있었다 (Livingston, 1991).
경우에 따라서는 새로운 강력한 보조약(adjuvants)이 강글리오사이드에 대한 면역 반응을 증강시킬 수도 있긴 하지만, 종양과 관련된 강글리오사이드와 같은 자가 항원의 경우에는 특히 새로운 접근법이 이용되어야만 한다. 햅텐-담체 접합체(hasten-carrier conjugate)를 이용한 랜드스타이너(Landsteiner)의 전통적인 실험방법에 기초하여(Landsteiner and Chase, 1942), 면역원성이 낮은 항원을 면역원성 담체 단백질에 공유 결합시킴으로써 성공적으로 면역 반응을 증강시킬 수 있었다. 예를 들면, 강글리오사이드 이외의 탄수화물에 대하여 이것을 적절한 담체 단백질에 접합시킴으로써 반응을 일으킬 수 있었다. 면역원성 단백질에 세균의 캡슐 다당류를 결합시키면 면역 반응과 방어 작용이 현저히 증강된다(Eskola et al., 1990). 최근에, 난소암 환자에게 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin)에 접합시킨 합성 톰슨 프렌덴레이히(Thompson Friendenreich) 종양 항원을 투여하여 백신화함으로써 체액성 IgM 및 IgG 반응을 유발하였다(MacLean et al., 1992). 이들 연구에서 공통적인 중요한 발견사항은 지속 기간이 짧은 IgM 반응에서 오랜기간동안 유지되고 친화력이 높은 IgG 반응으로 이소타입 전환이 이루어진다는 것이며, 이는 탄수화물에 대항하여 T-세포 의존성 경로의 활성화가 발생할 수 있다는 것을 시사하는 것이다. 이러한 접근법을 이제 흑색종 종양 항원 GD3에 적용하여 강글리오사이드-단백질 접합체 백신을 합성하는 방법을 개발하고 생쥐에서 여러 다양한 GD3-단백질 접합체의 면역원성을 검사하였다.
[발명의 요약]
본 발명은 백신을 투여 받은 개체 내에서 강글리오사이드를 인식하는 항체의 생성을 자극 또는 증강시키는 백신으로서, 면역원성 단백질에 접합되어 있으며, 피투여 개체 내에서 항체 생성을 자극하거나 증강하기에 유효한 양의 강글리오사이드 또는 그의 올리고당 부위, 유효량의 보조약 및 제약학적으로 허용되는 부형제를 함유함을 특징으로 하는 백신을 제공한다.
본 발명은 또한 백신을 투여 받은 개체 내에서 강글리오사이드를 인식하는 항체의 생성을 자극 또는 증강시키는 백신으로서, 면역원성 단백질에 접합되어 있으며, 피투여 개체 내에서 항체 생성을 자극하거나 증강하기에 유효한 양의 강글리오사이드 또는 그의 올리고당 부위, 유효량의 보조약 및 제약학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 백신을 유효 용량으로 개체에 투여함을 특징으로 하는, 백신을 투여받은 개체 내에서 강글리오사이드를 인식하는 항체의 생성을 자극 또는 증강시키는 방법을 제공한다.
[도면의 간단한 설명]
제1도 : 오존 분해(ozone cleavage) 및 환원성 아민화 반응 후의 GD3 단백질 접합체의 합성. 삽입물(Insert)은 분해 전(A)과 분해 후(B)의 GD3의 HPTLC를 나타낸다.
제2(a)도 및 제2(b)도 : GD3-KLH 항혈청 IgM(a) 및 IgG(b) 항체의 시간경과도. 도면에 표시한 각 부호는 생쥐를 표시한다.
제3(a)도 및 제3(b)도 : GD3-KLH를 이용한 백신화 후의 세 종류의 생쥐 항혈청의 면역 박막 크로마토그래피. IgG(a) 및 IgM(b) 항체의 반응성을 A, 인간 뇌 강글리오사이드, B, 신경아세포종 강글리오사이드, C, 흑색종 강글리오사이드, 그리고 D, GD3 항원에 대하여 검사하였다.
제4도 : 면역 반응의 특이성을 입증하기 위한 4종류의 서로 다른 생쥐의 면역블롯 실험. 정제된 강글리오사이드를 도트-블롯팅하고 생쥐에서 얻은 혈청과 함께 배양하였다.
제5도 : 흑색종 세포주 SK-MEL-28에 대해 시험한 GD3-KLH 및 QS-21에 의한 면역화 전(피크 3), 그리고 면역화 후(피크 50)의 생쥐 혈청 반응성의 대표적인 FACS 분석.
제6(a)도 및 제6(b)도 : GM2-KLH 항혈청 IgM(a) 및 IgG(b) 항체의 시간경과도. 도면에 표시한 각 부호는 환자를 표시한다.
제7도 : GM2 접합체 백신 + 보조약을 이용하여 백신화한 환자로부터 얻은 혈청내의 GM2 항체를 도트 블롯 면역 염색법에 의해 검출한 결과. 강글리오사이드 표준시료를 니트로셀룰로스 스트립에 스포팅하고(수직축에 표시), 개개의 환자에게서 얻은 백신화 전, 그리고 최고 역가가 얻어진 백신화 후의 혈청, 그리고 퍼옥시다제-표지화 염소 항-인간 IgM 또는 IgG 항체와 반응시켰다. 스트립에 0에서 3+까지 눈금을 매기고, MAb 696을 GM2의 양성 대조물질로 사용하였다.
제8(a-1)도 및 제8(a-2)도 : 기존에 설명되어 있는 방법대로 (세번째 실험법의 참고문헌, 3) GM2-KLH + QS-21 백신으로 면역화한 환자에게 얻은 최고 역가 혈청의 특이성을 면역 박막 크로마토그래피로 측정. GM2 (A)와 흑색종 조직 강글리오사이드 추출물 (B)을 TLC 판에 바르고, 개개의 환자에게서 얻은 혈청과 함께 배양한 후 퍼옥시다제-표지화 염소 항-인간 IgM 또는 IgG 항체로 염색하였다. GM2의 양성 대조물질로는 MAb 696을, 그리고 강글리오사이드의 양성 대조물질로는 레조르시놀 염색을 사용하였다
제8(b)도 : GM2와 GD2에 대한 환자 혈청의 IgG 반응성의 억제. GM2(A)와 흑색종 조직 강글리오사이드 추출물(B)을 HPTLC 판에 바르고, 번호 2의 환자에게서 얻은 혈청과 함께 배양한 후 퍼옥시다제-표지화 염소 항-인간 IgM 또는 IgG 항체로 염색하였다 면역 염색을 실시하기 전에, 1:50 희석배율의 환자 혈청 3㎖를 150㎍ GM2 또는 150㎍ GD2 와 함께 예비 배양하였다.
제9(a)도 및 제9(b)도 : GM2-KLH +QS-21 백신에 의한 면역화 후와 흑색종 환자에서의 IgM 및 IgG 항체 반응. 100㎍의 QS-21을 투여받은 6명의 환자에 대한 결과를 제9(a)도에, 그리고 200㎍을 투여받은 6명의 환자에 대한 결과를 제9(b)도에 차례대로 나타내었다. 각 그룹에 있어서 한 명의 환자는 백신을 4회만 투여 받았으며 질병의 진행 때문에 도중에 연구에서 탈락되었다. 화살표는 시클로포스파미드(Cy)와 GM2-KLH +QS-21 백신 투여 시간을 표시한다.
제10(a)도 및 제10(b)도 : GM2-KLH를 이용하여 백신화한 10명의 환자로부터 얻은 혈청을 이용하는 도트 블롯 면역 염색법에 의해 GM2 항체를 검출한 결과. 강글리오사이드 표준시료를 니트로셀룰로스 스트립에 스포팅하고(왼쪽에 표시한 대로), 먼저 혈청과 함께, 그리고 이어서 세척한 후 퍼옥시다제-표지화 염소 항-인간 IgM 또는 IgG 항체와 함께 배양하였다. 각각 서로 다른 용량(꼭대기에 표시함)의 QS-21을 투여받은 5개로 나누어진 각 군의 환자 2명씩으로부터 채취한 혈청에 대한 결과를 나타내었다. 각 환자에 대해서, 면역화 전(a), 그리고 면역화 후(b)의 혈청을 대상으로 실험을 행하였다. 생쥐 단 클론성 항체 696과 3F8은 (각각) GM2와 GD2에 대한 IgM과 IgG 항체이다. GM1에 대한 IgM 항체는 백신 투여 전후의 거의 모든 환자의 혈청에서 검출되었다. GM2에 대한 IgM 및 IgG 항체는 이들 환자 중 어느 누구에게서도 백신 투여 전에는 검출되지 않았다. 백신 투여 후에는, 모든 환자의 혈청에서 GM2에 대한 IgM 및 IgG 항체가 검출되었다. 반응은 0, 1+, 2+, 또는 3+로 등급을 매겼다. 이 분석에서의 반응 등급을 예시하면 다음과 같다: 환자 1 (100㎍ QS-21) IgM (백신투여 전/후) : KLH 1+/2+, GM3 0/0, GM2 0/3+, GM1 1+/1+, GD3 0/0, GD2 0/l+, GD1b 0/0.
제11(a)도 및 제11(b)도 : GM1/BCG 백신에 의한 면역화 후의 흑색종 환자에서의 IgM 항체 반응. 프로토콜의 전반기 4개월 동안 치료를 받은 5명의 환자(그룹 A)에 대한 결과 및 프로토콜의 후반기 4개월 동안 치료를 받은 5명의 환자(그룹 B)에 대한 결과를 차례대로 나타내었다. 화살표는 시클로포스파미드(Cy)와 GM2/BCG 백신 투여 시간을 표시한다.
제12도 : GM1/BCG를 이용하여 백신화한 10명의 흑색종 환자로부터 얻은 혈청중에 있는 GM2 항체를 도트 블롯 면역 염색법에 의해 검출한 결과. 강글리오사이드 표준시료를 니트로셀룰로스 스트립에 스포팅하고(왼쪽에 표시한 대로), 먼저 혈청과 함께, 그리고 이어서 세척한 후 퍼옥시다제-표지화 염소 항-인간 IgM 항체와 함께 배양하였다 GM2-MEL은 흑색종 생검 시료에서 추출한 정제된 GM2를 의미하고, 다른 모든 GM2-함유 강글리오사이드는 소의 뇌에서 유래된 것이다 환자의 번호(6-58)을 표시하였으며, 각 환자에 대해서, 면역화 전(a), 그리고 면역화 후(b)의 혈청에 대한 실험 결과를 나타내었다. 항체 696과 3G6은 각각 GM2와 GD2에 대한 IgM 쥐 단클론 항체이다. GM2 항체는 10명의 환자의 백신 투여 후 혈청에서 모두 검출되었다. GM1 항체는 53번 환자의 처리 전 및 처리 후 혈청에서 검출되었고, 57번 환자의 처리 후 혈청에서 검출되었다. 반응은 0, 1+, 2+, 또는 3+로 등급을 매겼다. 이 분석에서의 반응 등급을 예시하면 다음과 같다: 환자 8 GM2-MEL 2+; 환자 54 : GM2 3+, GM2-MEL 1+ 및 환자 57 GM2 3+, GM2-MEL 3+. 백신 투여 후의 혈청에서는 GM2-MEL에 대한 반응성이 GM2에 대한 반응성에 비해 낮게 나타났으며, 쥐 단클론 항체 696은 스트립에 도포된 GM2-MEL 강글리오사이드의 양이 적은 것을 반영하는 것이다.
제13도 : 백신 투여 후에 GM2 항체를 생성하는 환자의 무질병 및 총 생존율에 대한 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 도표. a) ELISA 역가가 ≥ 1/20인 도트 블롯에 의한 GM2 반응성이 2+ 또는 3+이거나, 또는 b) ELISA 역가가 ≥ 1/80인 도트 블롯에 의한 GM2 반응성이 1+ 이면 환자를 양성으로 분류한다.
제14도 : 무작위적으로 BCG를 투여받은 59명의 환자, 및 무작위적으로 GM1/BCG를 투여받은 57명의 환자(면역화 이전에 GM2 항체를 생성했던 6명의 환자, 즉 BCG 그룹에서 5명, 그리고GM1/BCG 그룹에서 1명)의 무질병 및 총 생존율에 대한 카플란-마이어 도표.
제15도 : 무작위적으로 BCG를 투여받은 64명의 환자, 및 무작위적으로 GM1/BCG를 투여받은 58명의 환자의 무질병 및 총 생존율에 대한 카플란-마이어 도표.
제16도 ; 무작위적으로 BCG를 투여받은 GM2 항체-음성의 환자 59명(△ 또는 ▲), 및 무작위적으로 GM1/BCG를 투여받은 GM2 항체-음성의 환자 57명(□ 또는 ■)을 비교한 무질병 및 총 생존율에 대한 카플란-마이어 도표. 환자를 2개의 그룹으로 나누었다 즉, 단일 양성 임파절을 갖는 환자 (△ 또는 □)와 두개 또는 그 이상의 양성 임파절을 갖는 환자(▲ 또는 ■).
[발명의 상세한 설명]
본 출원 서류의 전반에 걸쳐 각종 참고문헌을 괄호 안에 표시하여 인용하였다. 이들 간행물의 전체로서의 기재 내용은 본 발명이 속하는 기술 분야의 현 상태를 보다 상세하게 설명하기 위하여 본 명세서에 참고로 삽입된 것이다. 이들 참고문헌의 완전한 서지적 사항은 특허청구의 범위 바로 앞에, 본 명세서의 마지막 부분에 기록하였다.
본 발명은 백신을 투여받은 개체(subject) 내에서 강글리오사이드를 인식하는 항체의 생성을 자극 또는 증강시키는 백신으로서, 면역원성 단백질에 접합되어 있으며, 피투여 개체 내에서 항체 생성을 자극하거나 증강하기에 유효한 양의 강글리오사이드 또는 그의 올리고당 부위, 유효량의 보조약 및 제약학적으로 허용되는 부형제를 함유함을 특징으로 하는 백신을 제공한다.
강글리오사이드의 올리고당 부위(oligosaccharide portion)는 강글리오사이드를 절단하여 얻거나 또는 직접 합성하여 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용된 면역원성 단백질(immunogenic protein)이란 강글리오사이드 또는 그의 올리고당 부위에 접합되었을 때 개체 내에서 항체 생성을 자극하거나 또는 증강시키는 단백질을 말한다.
본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 개체는 인간이다.
본 발명은 또한 강글리오사이드 또는 그의 올리고당 부위가 키홀 림펫 헤모시아닌(Keyhole Limpet Hemocyanin) 또는 키홀 림펫 헤모시아닌의 유도체에 접합되어 있는 상기 백신을 제공한다.
키홀 림펫 헤모시아닌은 주지의 단백질이다. 키홀 림펫 헤모시아닌의 유도체는 모노포스포리피드 A 또는 비이온성 블록 공중합체 또는 시토킨과 같은 적어도 하나의 면역학적 보조약을 키홀 림펫 헤모시아닌에 직접 결합시킴으로써 제조할 수 있다. 시토킨은 당업자에게 주지되어 있다 시토킨의 한 예는 인터류킨-2이다. 당업계에는 키홀 림펫 헤모시아닌의 유도체를 형성하기 위하여 키홀 림펫 헤모시아닌에 결합시킬 수 있는 다른 종류의 인터류킨도 알려져 있다.
본 발명에 따른 백신의 한 구현예에서는, 상기 보조약은 QS-21이다.
본 발명에 이용될 수 있는 많은 다른 보조약이 알려져 있다. 본 발명에 따라 유사하게 사용될 수 있는 QS-21 또는 QS-21 유사 화학물질 군이 있을 수 있다.
본 발명은 또한 강글리오사이드가 GM2, GM3, GD2, GD3, GD3 락톤, 0-아세틸 GD3 및 GT3로 이루어진 군에서 선택된 것인 상기 백신을 제공한다.
본 발명의 한 바람직한 구현예에 있어서, 강글리오사이드는 GM2이다. 다른 구현예에 따르면, 강글리오사이드는 GD3이다. 또다른 구현예에서는, 강글리오사이드는 GD2이다.
본 발명에 따르면, 여러 다양한 유효량의 접합된 강글리오사이드 또는 그의 올리고당 부위를 사용할 수 있다. 당업계에서 통상의 지식을 가진 자라면 유효한 면역화에 필요한 유효량이 얼마인지를 결정하기 위하여 간단한 적정 실험을 행할 수 있다. 이러한 적정 실험의 한 예는 여러 가지 양의 접합된 강글리오사이드 또는 그의 접합된 올리고당 부위를 개체에 투여한 후 면역 반응을 검사하는 것이다
본 발명의 한 구현예에 따르면, 접합된 강글리오사이드 또는 접합된 그의 올리고당 부위의 유효량은 약 1㎍ 내지 약 200㎍의 범위 내에 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 접합된 강글리오사이드 또는 접합된 그의 올리고당 부위의 유효량은 약 50㎍ 내지 약 90㎍의 범위 내에 있다. 한 구현예에서는, 접합된 강글리오사이드 또는 접합된 그의 올리고당 부위의 유효량은 약 70㎍이다.
본 발명의 한 구현예에서는, 접합된 강글리오사이드 또는 접합된 그의 올리고당 부위의 유효량은 약 1㎍ 내지 약 10㎍의 범위 내에 있다 보다 구체적인 한 구현예에 있어서는, 접합된 강글리오사이드 또는 접합된 그의 올리고당 부위의 유효량은 약 7㎍ 내지 약 10㎍의 범위 내에 있다. 한 구현예에서는, 접합된 강글리오사이드 또는 접합된 그의 올리고당 부위의 유효량은 약 7㎍이다.
덧붙여, 보조약의 유효량도 비슷하게, 즉 어떠한 양이 유효한 지를 결정하기 위하여 접합체와 함께 여러 다양한 양의 보조약을 투여한 후 면역반응을 검사함으로써 결정할 수 있다. QS-21을 보조 약으로 사용하는 경우, QS-21의 유효량도 비슷하게 결정할 수 있다.
바람직한 한 구현예에서는, QS-21의 유효량은 약 10㎍ 내지 약 200㎍의 범위내에 있다. 다른 구현예에서는, QS-21의 유효량은 약 100㎍이다. 또다른 구현예에서는, QS-21의 유효량은 약 200㎍ 이다.
본 발명은 또한 백신을 투여받은 개체 내에서 강글리오사이드를 인식하는 항체의 생성을 자극 또는 증강시키는 백신으로서, 면역원성 단백질에 접합되어 있으며, 피투여 개체 내에서 항체 생성을 자극하거나 증강하기에 유효한 양의 강글리오사이드 또는 그의 올리고당 부위, 유효량의 보조약 및 제약학적으로 허용되는 부형제를 함유하며, 상기 개체가 암으로 고생하고 있으며, 백신의 투여에 의해 생성된 항체가 암을 효과적으로 치료(treat)함을 특징으로 하는 백신을 제공한다.
본 발명은 또한 백신을 투여받은 개체 내에서 강글리오사이드를 인식하는 항체의 생성을 자극 또는 증강시키는 백신으로서, 면역원성 단백질에 접합되어 있으며, 피투여 개체 내에서 항체 생성을 자극하거나 증강하기에 유효한 양의 강글리오사이드 또는 그의 올리고당 부위, 유효량의 보조약 및 제약학적으로 허용되는 부형제를 함유하며, 상기 개체가 암에 걸리기 쉬우며(susceptible to cancer), 백신의 투여에 의해 생성된 항체가 암을 효과적으로 예방함을 특징으로 하는 백신을 제공한다.
본 발명은 또한 세포의 표면에 강글리오사이드를 갖고 있는 암세포를 위한 백신을 제공한다.
본 발명은 또한 암의 기질(基質) 내에 강글리오사이드가 존재하는 암세포를 위한 백신을 제공한다
본 발명은 또한 상피세포, 중배엽 또는 신경외배엽에서 유래된 암을 위한 백신을 제공한다. 상피 암세포의 예는 유방암과 자궁내막암이다. 중배엽에서 유래된 암의 예는 육종(sarcoma)이다. 신경외배엽에서 유래된 암의 한 예는 흑색종이다.
본 발명은 또한 백신을 투여받은 개체 내에서 강글리오사이드를 인식하는 항체의 생성을 자극 또는 증강시키는 백신으로서, 면역원성 단백질에 접합되어 있으며, 피투여 개체 내에서 항체 생성을 자극하거나 증강하기에 유효한 양의 강글리오사이드 또는 그의 올리고당 부위, 유효량의 보조약 및 제약학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 백신을 유효 용량으로 개체에 투여함을 특징으로 하는, 백신을 투여받은 개체 내에서 강글리오사이드를 인식하는 항체의 생성을 자극 또는 증강시키는 방법을 제공한다.
상술한 방법의 한 구현예에서, 강글리오사이드는 GM2이다.
본 발명은 나아가 백신을 투여받은 개체 내에서 강글리오사이드를 인식하는 항체의 생성을 자극 또는 증강시키는 백신으로서, 면역원성 단백질에 접합되어 있으며, 피투여 개체내에서 항체 생성을 자극하거나 증강하기에 유효한 양의 강글리오사이드 또는 그의 올리고당 부위, 유효량의 보조약 및 제약학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 백신을 유효 용량으로 개체에 투여하며, 상기 개체는 암으로 고생하고 있고, 백신의 투여에 의해 개체내에서 생성된 항체가 암을 효과적으로 치료함을 특징으로 하는, 암으로 고생하는 개체내의 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 나아가 백신을 투여받은 개체 내에서 강글리오사이드를 인식하는 항체의 생성을 자극 또는 증강시키는 백신으로서, 면역원성 단백질에 접합되어 있으며, 피투여 개체내에서 항체 생성을 자극하거나 증강하기에 유효한 양의 강글리오사이드 또는 그의 올리고당 부위, 유효량의 보조약 및 제약학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 백신을 유효 용량으로 개체에 투여하며, 상기 개체는 암에 걸리기 쉽고, 백신의 투여에 의해 개체내에서 생성된 항체가 암을 효과적으로 예방함을 특징으로 하는, 암에 걸리기 쉬운 개체내의 암을 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 강글리오사이드 또는 그의 올리고당 부위가 키홀 림펫 헤모시아닌 또는 키홀 림펫 헤모시아닌 유도체에 접합되어 있는 상기 백신을 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 나아가 보조약이 QS-21인 상기 백신을 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명은 덧붙여 암세포가 그의 표면에 강글리오사이드를 갖고 있는 암을 치료 또는 예방하기 위하여 상기 백신을 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 암의 기질(基質) 내에 강글리오사이드가 존재하는 암을 치료 또는 예방하기 위하여 상기 백신을 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상피세포 또는 신경외배엽에서 유래된 암을 예방 또는 치료하기 위하여 상기 백신을 사용하는 방법을 제공한다. 신경외배엽에서 유래된 암의 한 예는 흑색종이다.
본 발명의 목적을 위하여, “제약학적으로 허용되는 부형제(pharmaceutically acceptable veHicles)”는 표준적인 제약학적 부형제의 모든 것을 의미한다. 적절한 부형제의 예는 당업계에 주지되어 있으며, 인산염 완충 염용액, 폴리소르브(Polysorb) 80을 함유하는 인산염 완충 염용액, 물, 오일/물 에멀젼과 같은 에멀젼, 및 각종의 습윤제(wetting agent)와 같은 표준적인 제약학적 부형제중 어느 것이든 무방하지만, 이들에만 국한된 것은 아니다.
본 발명의 백신은 피부내, 피하 및 근육내 경로를 통하여 투여될 수 있다. 당업자에게 주지된 다른 방법도 물론 사용할 수 있다.
바람직한 한 구현예에서는, 본 발명은 백신을 투여받은 개체내에서 강글리오사이드를 인식하는 항체의 생성을 자극 또는 증강시키는 백신으로서, 면역원성 단백질에 접합되어 있으며, 피투여 개체내에서 항체 생성을 자극하거나 증강하기에 유효한 양의 강글리오사이드 또는 그의 올리고당 부위, 유효량의 보조약 및 제약학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 백신을 유효 용량으로 개체에 투여하며, 상기 투여는 유표 용량을 두곳 또는 그 이상의 부위에 대해 행해짐을 특징으로 하는, 강글리오사이드를 인식하는 항체의 생성을 자극 또는 증강시키는 방법을 제공한다. “유효 용량을 두곳 또는 그 이상의 부위에 대해 행한다(administering the effective dose at two or more sites)”라고 하는 것은 유효 용량을 둘 또는 세개의 분획으로 나누고 각 분획을 서로 다른 부위에 투여함을 의미한다. 구체적인 구현예에서는, 투여는 세곳의 부위에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 후술하는 실험예에 의해 보다 잘 이해될 것이다. 그러나, 당업자라면 본 명세서에 기술되어 있는 특정의 방법과 결과는 단지 본 명세서에 이어지는 특허청구의 범위에 보다 상세히 기재된 것과 같은 본 발명의 예시에 불과하다는 것을 쉽게 이해할 것이다.
[실험예]
[첫번째 실험]
[실험방법]
GD3 접합체 백신의 증강된 면역원성: 각종의 담체 단백질의 비교 및 추가적인 시험을 위한 GD3-KLH의 선택.
종양과 관련된 강글리오사이드는 암에 대항하는 면역 공격을 위한 적절한 표적으로 알려져 있지만, 면역원성이 약한 결점이 있다. 능동면역을 실시하면 역가가 낮고 지속기간이 짧은 항체인 IgM이 생성된다. 면역원성이 낮은 항체를 면역원성 담체 단백질에 공유적으로 결합시키는 것은 체액성 반응을 증강시키는 강력한 방법이다. 악성 흑색종의 주요 강글리오사이드인 GD3을 두가지 방법에 의해 담체 단백질에 결합시켰다. GD3 올리고당의 글루코스에 의해 결합시켰지만, 항원성이 소실되고, 흑색종 GD3 또는 GD3를 발현하는 흑색종 세포와는 반응하지 않는 항체의 생성을 유도하였다. 두번째 방법에서는, 세라미드 골격에 있는 이중결합을 오존으로 절단하여 GD3을 변형시키고, 알데히드기를 도입한 후, 이 기를 환원성 아민반응에 의해 단백질의 아미노리실기에 결합시켰다. 이 방법을 이용하여, 말라리아 T-세포 에피토프, 수막염균(Neisseria meningitidis)의 외막 단백질(OMP), 양이온화시킨 소 혈청 알부민(CBSA), 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 및 폴리리신의 반복단위를 발현하는 합성 다중 항원성 펩티드(MAP: multiple antigenic peptides)를 갖는 접합체(conjugate)를 제작하였다. 이 접합체의 항원성은 각종 항체와의 반응성에 의해 확인하였고, 면역원성은 생쥐를 이용하여 시험하였다. 면역 혈청중의 항체 농도는 ELISA 및 정제된 강글리오사이드에 대해 도트 블롯 면역 염색을 실시하여 분석하였다. 혈청 반응성의 특이성은 종양 조직 추출액을 이용하는 면역 박막 크로마토그래피에 의해 분석하였다. GD3 접합체 백신은 특히 GD3-KLH 접합체에 있어서, 현저히 증강된 항체 반응을 나타내었다. GD3에 대하여 높은 역가의 IgM 및 IgG 반응이 유도되었다. 이 방법은 다른 종류의 강글리오사이드에 대해서도 적용할 수 있으며, 강글리오사이드가 풍부한 각종의 인간 암에 대한 강글리오사이드 백신을 제작하는데 적절할 수 있다.
[재료 및 방법]
[글리코리프드]
GM3, GM2 및 GD1b, 소 뇌로부터 얻은 추출액은 Fidia Research Laboratory(Abano Ternle, Italy)로부터 공급받았다. GD2는 GD1b를 β-갈락토시다제(Cahan et al., 1982)에 의해 처리하여 얻었다. GD3(mel)은 인간의 흑색종 조직으로 부터 분리하였고(Hitter et al., 1991), GD3(bbm)(백신의 제조에 사용) 및 GT3은 소의 버터밀크로부터 분리한 것으로서 친절하게도 R.K. Yu(버지니아주 리치몬드에 소재하는 메디칼 칼리지 오브 버지니아) 박사가 제공하였다(Hitter et al., 1990a). 디시알릴락토스(GD3 올리고당)는 기존에 설명되어 있는 대로 소의 초유(初乳)로부터 분리하였다(Nicolai et al., 1978).
[화학약품]
HPTLC 실리카 겔 플레이트는 E. Merck(Darmstadt, FRG)로부터; Sep-Pak C18 카트리지는 Wirers Associates(Mildford, MA)로부터, 4-클로로-1 나프톨, p-니트로페닐 포스페이트 디소듐염, 시안화붕소수수화 나트륨은 Sigma Chemical Co., (St. Louis, MO)로부터; 시클로포스파미드(Cytoxan)은 Mead Johnson(Syracuse, NY)로부터; 사포닌 퀼 A 성분을 포함하는 QS-21은 Cambridge Biotech(Worcester, MA)로부터 구입 하였다.
단백질. 폴리-L-리신 히드로브로마이드(분자량 (vis) 3800)는 Sigma로부터; 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)은 Calbiochenl(Lajolla, CA)로부터, CBSA-Imject 수퍼케리어 임뮤노모듈레이터는 Pierce(RocHort, IL)로부터 구입하였으며, 수막염균의 외막 단백질(OMP)은 M. S. Blake(Rockefeller University, New York, NY) 박사가 제공하였다. 4개의 말라리아 T-세포 에피토프 반복단위를 포함하는 다중 항원성 펩티드(MAP) YAL-IV 294-I는 J.P. Tam(Rockfeller University, New York, NY) 박사가 제공하였다.
단클론 항체. ITLC에 사용되는 양고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 토끼 항-생쥐 면역글로불린, 그리고 ELISA에 사용되는 알칼리성 포스파타제에 접합된 토끼 항-생쥐 IgM 및 IgG는 Zynled(San Francisco, CA)로부터 구입하였으며; 항-GD3 mAb R24는 제작하였다(Houghton et al., 1985).
혈청학적 분석. 면역-연결 면역흡수 분석법(ELISA; Enzume-linked Immunosorbent Assays)는 기존에 기술된 방법(Livingston et al., 1989)에 따라 수행하였다. 비특이적인 “부착(stickiness)”을 조절하기 위하여, 동일하게 가공처리를 했지만 강글리오사이드는 첨가하지 않은 플레이트 상에서도 면역 혈청을 시험하고, 얻어진 값을 강글리오사이드 존재하에 얻은 값으로부터 뺐다. 역가는 보정된 흡광도가 0.1 또는 그 이상이 얻어지는 최고 희석율로 정의하였다. 강글리오사이드를 단클론 항체 또는 생쥐 혈청으로 면역염색하는 것은 기존에 설명되어 있는 방법대로 고성능 박막 크로마토그래피(HPTLC) 실리카 겔 유리 플레이트상에서 분리를 행한 후(Hanlilton et al., 1993) 수행하였다. 전개는 용매 1 : 클로로포름/메탄올/물 (0.25% CaCl2) 50:40:10 (v/v) 또는 용매 2 : 에탄올/n-부탄올/피리딘/물/아세트산 100:10:10:30:3 (v/v)를 이용하여 실시하였으며, 레조르시놀/HCl 시약을 이용하여 가시화(可視化)하였다.
[변역화(immunizaion)]
6주령의 자성 BALB/c ×C57BL76 F1 생쥐(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에게 시크로포스파미드(15㎎/㎏)를 첫번째 면역화를 실시하기 3일 전에 복강내 주사하고 무작위적으로 처리군에 할당하였다. 4마리 또는 5마리로 된 군에게 별도의 지시가 없으면 2주일 간격으로 세종류의 백신을 피하 주사하였다. 각 백신은 총 0.1㎖ PBS/생쥐에 대하여 20㎍ GD3 또는 15㎍ 디시알릴락토스 + 10㎍ QS-21을 포함한다. 다른 언급이 없는 한, 백신 투여 전에, 그리고 투여 후 2주일 후에 생쥐를 후안와동(retroorbital sinus)으로부터 출혈시켰다.
[GD3 접헙체의 제조]
GD3(2mg)을 2㎖의 메탄올에 초음파를 이용하여 용해시키고 에탄올/드라이아이스 욕 중에서 -78℃에서 냉각시켰다. 오존발생기(Del Industries, San Luis Obispo, CA)를 이용하여 오존을 발생시키고 격렬한 교반하에 30분간 시료에 통과시켰다 (Criegee, 1957; Wiegandt and Baschang, 1965), 과량의 오존은 질소를 이용하여 10분간 정화시켰다. 100㎖의 5(CH7)2를 가하고(Poppas et al., 1966), 시료를 -78℃에서 30분간 보존한 후, 실온에서 90분간 격렬한 교반하에 보존하였다. 시료를 질소 기류하에서 건조시키고 HPTLC로 모니터하였다. 건조 시료에 2㎖의 n-핵산을 첨가한 후 5분간 초음파 처리, 그리고 2000g 에서 15분간 원심분리하는 공정에 의해 장쇄 알데히드를 분리 해내었다 n-핵산을 조심스럽게 배출시켜 버리고, 시료를 질소 기류하에서 건조시켰다. 절단된 GD3과 본래의 GD3를 C18 역상컬럼(10 ×250㎜, Rainin Instruments, Ridgefleld, NJ)을 이용하는 HPLC(Waters, System 501, Milford, MA)에 의해 서로 분비하였다. 메탄올을 이용하여 강글리오사이드를 용출시키고, 214nn에서 모니터한 후 분획을 HPTLC에 의해 분석하였다. 절단된 GD3을 함유하는 분획을 합하고 37℃에서 로타리베이퍼(Buchi, Switzerland)를 이용하여 증발을 행하였다. 절단된 GD3, PBS에 용해시킨 단백질 담체 및 20 시안화붕소수소 나트륨을 37℃에서 48시간동안 온화한 교반하에 보온하였다. 16시간 후에, 1㎎의 NaCNBH3을 첨가하였다. 결합반응의 과정을 HPTLC로 모니터하였다. 용매 1과 용애 2에서는 GD3-단백질 접합체가 이동하지 않고 원래 위치에 레조르시놀 양성 밴드의 형태를 나타내었다. 4℃에서 48시간동안씩 각각 4ℓ의 PBS를 3회 이용하여 100 MWCO 투석관을 통과시켜 혼합물을 투석하고, 엑스트랙티겔 세정제 제거용 겔(Pierce)에 통과시켜 접합되지 않은 GD3을 최종적으로 정제하였다. 이 시료를 동결건조하고, Svennerholm(1957)에 따른 뉴라민산 결정법 및 Biorad 단백질 분석법에 의해 강글리오사이드 및 단백질을 측정하였다.
기존에 설명되어 있는 방법에 따라(Nocolai et al., 1978) 디시알릴락토스를 소의 초유로부터 분리하였다. 환원성 아민화 반응에 의해(Gray, 1974) 탄수화물을 단백질에 결합시키고, 10㎎의 디시알릴락토스를 2㎖ PBS에 용해시킨 2㎎ 단백질과 함께 37℃에서 14일간 배양하였다. 처음에 2㎎ 시안화붕소수소화 나트륨을 첨가하고 1㎎씩을 매 3일마다 더 첨가하였다. 결합반응은 용매 2중에서 HPTLC에 의해 모니터하였다. 1000 MWCO 투석막에 통과시켜 투석을 행함으로써 디시알릴락토스 접합체를 정제한 후 동결건조하였다. 단백질과 뉴라민산 함량을 상술한 방법대로 측정하였다. 디시알릴락토스도 Roy와 Laferriere (1990)의 방법에 따라 단백질에 접합시켰다. 이 과정중에, 올리고당의 N-아크로로일화 글리코피라노실아민(acroloyled glycopyranosylamine) 유도체를 먼저 형성시킨 후 마이클 (Michael) 첨가반응에 의해 단백질의 아미노기에 접합시켰다. 정제 및 단백질과 뉴라민산 함량의 측정은 상술한 방법대로 수행하였다.
[IgG 서브클래스의 결정]
IgG 서브클래스의 결정은 서브클래스-특이적 이차 Mabs를 이용하는 ELISA를 이용하여 수행하였다 이차 Mabs는 예비혈청(presera) 또는 음성 대조 혈청에 대해 반응성을 나타내지 않는 최저 농도로 사용한다. 염소 항-생쥐에 접합된 알칼리성 포스파타제를 1:200로 희석하여 삼차(3차) 항체로 사용하였다.
[생쥐 항혈청의 FACS 분석]
흑색종 세포주 SK-MEL-28을 PBS에 용해시킨 0.1% EDTA로 처리한 후 26½게이지 니들에 통과시킴으로써 그의 단일 세포 현탁액을 준비하였다. 세포(3×105)를 1:20배 희석된 면역화 후 또는 면역화 전의 혈청 40㎕와 함께 얼음위에서 30분간 보온하였다. 세포를 PBS에 용해시킨 3% 태내송아지 혈청을 이용하여 3회 세척하였다. 희석된(1:50) 플루오레세인 이소티오시아네이트-표지화 염소 항-생쥐 IgG(Southern iotechnology Associates Inc., Birmingham, AL) 30㎕를 이차 항체로서 첨가한 후, 얼음 위에서 30분간 보온하였다. 세포를 상기와 같이 3회 세척하고 PBS에 용해시킨 3% 태내 송아지 혈청 500㎕에 재현탁시키고 유동 세포측정기(FACScan, Becton Dickinson, San Jose, CA)에 의하여 분석하였다.
[결과]
[GD3 백신의 제조 및 특성결정]
소의 버터밀크로부터 얻은 GD3을 오존을 이용하여 세라미드 부위에 존재하는 C4-C5 이중결합 위치에서 선택적으로 결단하였다. 메탄을 중에서는 메톡시퍼옥시드가 중간 산물 중에 나타나는데, 이 중간 산물은 디메틸설파이트에 의해 쉽게 환원된다. 이 절단반응의결과로서 세라미드 부위에 존재하던 예전의 이중 결합의 위치에 알데히드 기능기를 갖는 GD3 유도체가 생성되며, 장쇄 알데히드가 제거된다(제1도). 성공적으로 절단된 GD3은 본래의 GD3보다 아래 쪽으로 이동하며, 동시에 같이 절단된 불포화 지방산 때문에 HPTLC 상에 이중 밴드의 형태로 나타난다(HPTLC 참조, 제1도의 삽입물). HPTLC의 농도결정분석법에 의한 측정은 소의 버터밀크로부터 분리된 GD3의 70% 이상이 절단되었음을 보여준다. 오존 처리 시간을 길게 한 최초의 실험에서도 상기 비율은 변화하지 않는데, 이는 상기 분리 원으로부터 얻은 GD3의 -30%가 스핑가닌 또는 피토스핑고신 유사체로 이루어져 있음을 시사하는 것이다. GD3의 사용량에 따라 결정되는 1시간 미만의 반응시간동안 -78℃에서 GD3을 절단하는 것이 최적인 것으로 밝혀졌다. 절단된 GD3은 산성 및 중성의 인산염 완충액 내에서만 72시간 미만동안 유지되지만 부산물의 양이 점점 증가된다. B-제거반응 때문에, GD3의 올리고당 부위가 시간경과에 따라 점점 더 많이 방출된다. 이러한 현상이 염기성 pH에서 쉽게 일어난다는 것은 이미 보고되어 있는 바와 같다(Wiegandt and Baschang, 1965). GD3로부터 방출된 탄수화물 부위는 용매 1에서는 이동되지 않고, 올리고당류의 분리(도시 안됨)를 위해서 사용된 용매 2에서는 소의 초유로부터 분리된 디시알릴락토스와 함께 공동으로 이동된다. 원래의 GD3에 비하여 절단된 GD3의 소수성이 감소됨으로 인하여 C18 역상 컬럼 상에서의 HPLC에 의해 분리가 가능해진다.
메탄올을 이용하여 균등하게(isucratic) 용출시키면, 절단된 GD3와 단백질이 변형된 강글리오사이드와 ε-아미노리실기 사이에서 쉬프-염기(Schiff-base)가 형성된다. 이들은 시안화붕소수소화 나트륨을 이용하여 환원시키면 강글리오사이드와 단백질 사이에 안정한 이차 아민 결합을 형성한다(Borch et al., 1971). 환원제는 선택적이며, 알데히드는 pH=6.5 - 7.5의 인산염 완충액내 에서는 환원되지 않는다. 반응은 HPTLC에 의해 모니터되며, 절단된 GD3와 원래 위치에서 나타나는 레조르시놀 양성 밴드 사이의 비율이 변화하는 것이 관찰된다 이 밴드는 네오-글리코접합체의 형성을 시사하는 것이다. 반응은 정상적으로는 37℃에서 48시간 보온한 후에 완결된다. 디시알릴락토스는 투석에 의해 쉽게 제거되며, 과량의 절단된 GD3은 세정제 제거 컬럼에 통과시켜 제거할 수 있다. 결합도는 시알산과 단백질 측정에 의해 결정할 수 있다. 접합체중의 GD3와 단백질의 중량비는 여러 다양한 단백질내에 존재하는 리신기의 접근 가능성에 의해 결정되는데, 표 1에 나타내었다. 단백질에 결합된 GD3의 평균수율은 총 30%이었다.
GD3의 탄수화물 부위인 디시알릴락토스는 두가지의 다른 방법을 이용하여 단백질에 결합시켰다. 디시알릴락토스의 접합은 환원성 아민화반응에 의해 수행하였는데, 그 결과로서 단백질에 접합된 글루코스가 개환된 고리형태가 얻어진다(Gray et al., 1978). 이 방법은 긴 시간동안 올리고당류와 단백질을 보온하는 것이 요구되며, 수율도 20% 미만이다. 두번째의 올리고당 접합 방법(Roy and Laferrere 1990)은 단백질에 접합된 폐쇄된 말단 글루코스 고리를 생성시킨다.
[표 1]
aKLH : 키홀 림펫 헤모시아닌, cBSA : 양이온화 소 혈청 알부민
OMP : 수막염균의 외막단백질, MAP : 다중 항원성 펩티드
폴리리신 폴리 L-리신
bn.d. : 측정 안함
c개환 고리(open ring)
d폐쇄 고리(closed ring)
GD3-단백질 접합체 백신을 이용한 백신화 이후의 GD3에 대한 혈청학적 반응
혈청을 예비면역화한 경우에는 GD3에 대하여 IgM이나 IgG 반응성이 관찰되지 않았다. 20㎍ GD3를 단독으로 또는 10㎍의 보조약 QS-21과 혼합하여 이용하여 면역화를 실시하면 GD3 항체가 생성되지 않는다(표 1). 단백질에 접합된 20㎍의 GD3 +10㎍ QS-21을 이용하여 면역화한 일부 군의 생쥐들은 GD3에 대하여 증강된 면역 반응을 나타내었다. 높은 농도의 GD3 에피토프를 나타내는 GD3-폴리-L-리신 접합체는 중간정도의 역가의 IgM 반응(1/20 - 1/320)을 유도하였으며 IgG 반응은 유도하지 않았다. 수막염균의 외막단백질에 접합된 GD3-접합체(GD3-OMP)도 역시 중간정도의 역가의 IgM(1/20 - 1/320)과 낮은 역가의 IgG(1/20 - 1/8O)를 유도하였다. 한 마리의 생쥐 만이 GD3-OMP를 이용한 백신화 이후에 1/1280이라고 하는 높은 역가의 IgM 반응 및 1/2560이라고 하는 높은 역가의 IgG 반응을 나타내었다. 양이온화 BSA에 접함된 GD3(GD3-cBSA)는 ELISA에 의하면 낮은 역가의 IgM(1/20 - 1/8O) 반응과 높은 역가의 IgG(1/20 - 1/2560) 반응을 나타내었다. 말라리아 T-세포 에피토프를 함유하는 합성 MAP 펩티드는 아미노 말단에 8개의 유리 아미노기를 갖는데, 이중 4개만이 GD3에 접합될 수 있다. GD3-MAP는 낮은 역가의 IgM (1/20 - 1/160) 반응을 유도하고, 오직 한 마리의 생쥐만이 1/20이라고 하는 낮은 역가의 IgG 반응을 나타내었다. KLH에 접합된 GD3(GD3-KLH)는 다른 접합체에 비하여 가장 높은 반응을 나타내었는데, IgM 역가가 1/20 - 1/2560 으로서 가장 높은 값을, 그리고 IgG 역가도 1/40 - 1/10240 으로서 가장 높은 값을 나타내었다. 두가지 형태의 디시알릴락토스 단백질 접합체에 의한 면역화에 의해서는 GD3 강글리오사이드에 대해 교차반응을 나타내는 낮은 역가의 IgM 반응(1/20 - 1/160)을 나타내었고 IgG 반응은 유의적인 값을 나타내지 않았다.
면역 박막 크로마토그래피에 의한 GD3 반응성 혈청의 특이성
면역 박막 크로마토그래피(ITLC)를 이용하여 인간 조직 강글리오사이드 추출액에대하여 GD3 항혈청을 시험할 수 있으며, 종양에서 유래된 강글리오사이드에 대한 특이성을 결정할 수 있다. 인간 조직 추출액, 그리고 GD3-KLH를 이용한 면역화반응에 의해 유도된 높은 역가의 19M 및 IgG 혈청을 이용한 ITLC의 예를 제3(a)도 및 제3(b)도에 나타내었다. 혈청을 1/150배로 희석하여 인간의 뇌, 신경섬유아세포종, 흑색종, 그리고 소의 버터밀크로부터 유래된 면역원 GD3(bbm)에 대하여 혈청을 시험하였다. ITLC 상에서의 반응성을 레조르시놀로 염색된 HPTLC의 결과와 비교하였다. HPTLC는 이들 조직에서 발견되는 총 강글리오사이드 성분을 보여준다. 정상적인 뇌는 주로 GM1, GD1a, GD1b 및 GT1b를 포함하고 있는 반면, 신경섬유아세포종 추출액은 이들 이외에도 주요 강글리오사이드 성분으로서 GD2와 GM2를, 그리고 흑색종 추출액은 주로 GM3와 GD3를 포함한다. IgG 항혈청은 대조물질인 mAb R24와 마찬가지로 이들 세 종류의 조직 추출액 모두에서 GD3에만 반응하였다(제3(a)도). 한편, IgM 항혈청은(제3(b)도) 구조적으로 관련된 강글리오사이드 및 뇌 추출액 중의 설파이드와 어느 정도의 교차 반응성을 나타내었다. 다른 종류의 GD3 접합체를 이용한 백신화 반응에 의해 유도된 면역 반응은 동일한 특이 반응성을 나타내었지만, 보다 약하였고, 보다 농도가 높은 항혈청을 사용하여야만 하였다(도시 안함). GD3-cBSA를 이용하여 면역화한 생쥐로부터 ELISA에 의해 확인된 고역가 항혈청은 ITLC에 의해서는 높은 배경반응을 나타내었다. 이들 항혈청과 함께 각종의 다양한 차단제를 사용한 시도는 성공적이지 못하였다. 조직 추출액에서는 GD3와의 특이적 반응성이 검출되지 않았다.
도트 블롯 면역 염색에 의한 GD3 반응성 혈청의 특이성
소의 뇌 또는 버터밀크로부터 분리된 정제 강글리오사이드 GM3, GB2, GD1b, GD3 및 GT3, 그리고 인간의 흑색종 조직에서 분리한 GD3를 이용하여 모든 종류의 고역가 IgM 및 IgG 항혈청 (ELISA에 의한 역가가 1/160 이상)의 특이성을 연구하였다. 이들 조직적으로 관련된 강글리오사이드를 비슷한 양으로 니트로셀룰로스 스트립에 스폿팅한 후에 면역 혈청과 반응시켰다. GD3-KLH 및 GD3-OMP를 이용하여 생쥐를 면역화시키기 전후에 얻은 혈청을 이용한 도트 블롯 면역 염색 실험의 시료를 제4도에 나타내었다. 항혈청은 이들 강글리오사이드에 대하여 전혀 반응성을 나타내지 않았다. GD3-KLH로 면역화시킨 후에 얻은 혈청은 소의 버터밀크로부터 얻은 GD3(면역원) 뿐만 아니라 인간 흑색종 조직으로부터 분리한 GD3에 대해서도 특이적인 IgM 및 IgG 반응성을 나타내었다. 경우에 따라 GT3에 대한 교차 반응성이 나타났으며, 양성 대조물질인 mAb R24(Houghton et al., 1985)에 대하여도 반응이 관찰되었다. GD3-cBSA에 의해 면역화된 생쥐로부터 얻은 고역가 혈청은 배경 반응성을 나타내고 어떤 종류의 강글리오사이드에 대해서도 특이적인 반응성은 나타내지 않았다 (도시 안함). 다른 GD3 접합에 의해 유도된 도트 블롯 반응성은 GD3에 대해서 특이적 이었다 (도시 안함). 이러한 결과는 GD3-단백질 접합체를 이용하여 생쥐에게서 특이적인 고역가 IgM 및 IgG 반응을 유도시킬 수 있다는 것과, 또 가장 강력한 반응성은 GD3-KLH 접합체에 의해서 유도된다는 것을 의미한다. 접합체 방법은 GD3-올리고당 사슬상에 존재하는 중요한 에피토프를 그대로 보존하는 것으로 보이며, GD3-접합체는 구조적으로 관련된 강글리오사이드에 대해서 교차 반응성을 유도하지 않는다.
FACS 분석법에 의해 결정한 면역 혈청의 세포 표면 반응성:
세포 표면 GD3를 생산하는 것으로 알려진 세포주인 흑색종 세로주 SK-MEL-28의 세포에 생쥐에서 유래된 혈청이 결합하는 지를 시험하였다. 플루로레세인 이소티오시아네이트-표지화 이자 염소 항-생쥐 항체를 이용하는 FACS 분석의 대표적인 예를 제5도에 나타내었다. GD3-KLH 및 QS-21에 의해 면역화시키기 전후에 얻은 혈청을 시험 하였다. 면역화 전의 혈청은 표적 세포의 8%를 염색하고, 면역화 후의 혈청은 92%의 혈청을 염색하였다.
[논의]
1) 여러 다른 종류의 강글리오사이드에 대해 적용할 수 있는 단백질과의 결합반응을 확립하기 위하여, 2) 흑색종과 관련된 주요 강글리오사이드인 GD3의 면역원성을 증강시키기 위하여, 그리고 3) 가장 효과적인 단백질 담체를 정의하기 위하여 강글리오사이드 접합체 백신을 제작하는 접근법을 설명한다. 강글리오사이드 접합반응은 주요 면역원 부위인 탄수화물 부위를 변화시키지 않고 행해져야 한다. GD3의 탄수화물 부분을 변화시키면, 예를 들면 카르복실기를 아미드기로 변환시키면 합성 항원의 면역원성은 증가하지만 원래의 GD3에 대해서 유의적인 교차 반응 항체 반응이 유도되지 않는다(knitter et al., 1990b). 따라서, 본 접근방법은 탄수화물 부분을 변화시키지 않으면서 세라미드 부위를 통해 GD3를 결합시키는 것을 목표로 한다. 모든 강글리오사이드에 대해 특징적인 성분인 세라미드를 오존을 이용하여 스핑고신 염기의 C4 위치에서 절단하고 관능성 알데히드기를 도입하였다. 단백질에 결합된 것은 환원성 아민화 반응을 실시하여 강글리오사이드와 단백질의 ε-아미노리실기 사이에 안정한 아민 결합이 혈성되는 것을 관찰하여 확인하였다. 오존분해에 의한 강글리오사이드의 절단 및 그 이후의 접합 반응은 지금까지 보고되거나 기술된 바 없으며, 강글리오사이드의 알데히드 중간체는 불안정할 것으로 추측된다. 알칼리 조건하에서 히드록시 이온으로 공격하여 반응을 개시하면 이중결합이 이동하고 β-제거반응에 의해 올리고당 부위가 제거된다고 하는 단편화반응은 보고되어 있다(Kanfer and Hakomori, 1983; Wiegandt and Baschang, 1965). 알데히드 관능기는 중성 pH에서는 충분히 안정한 것으로 밝혀졌으며, 단백질의 아미노기와의 쉬프 염기 형성은 쉽게 이루어지고, β-제거반응은 조금만 일어난다. 총수율 30%는, 강글리오사이드가 리소-유도체로 전환되는 것과 관련하여 기술된 공지기술과 비교하면 상당히 효과적인 것이다 (Neuenhofer et al., 1985). GD3의 알데히드 유도체는 면역 박막 크로마토그래피(ITLC)에서 더이상 mAb R24와 반응하지 않는다. GM3에 대한 mAb M2590의 반응성과 관련하여 이미 비슷한 현사이 보고된 바 있으며, 반응성은 아실 사슬의 길이에 의존적이다(Itonori et al., 1989). 한편, GD3 단백질 접합체는 TILC 및 웨스턴 블럿반응에서 mAb R24와 반응성을 나타내었는데, 이는 면역 우성 에피토프가 GD3 네오글리코접합체에 보존되어 있음을 시사하는 것이다.
일단 강글리오사이드 백신을 생산하기 위한 접합방법이 확립되면, 절절한 담체 단백질을 선정하여야만 한다. 로웰 등(Lowell et al., (1988))은 합성 소수성 푸트(foot)를 통하여 세균 탄수화물과 펩티드 항원을 수막염 균의 외막 단백질(OMP)과 반응시켜 복합체를 형성함으로써 별도의 보조약이 필요없는 우아한 백신 시스템을 설명하고 있다.(Donnelly 1991). 이 시스템은 그의 양쪽성 성질 때문에 직접 강글리오사이드에 적용할 수 있다. 종래의 실험에서, 본 출원인은 소수성 상호작용에 의해 강글리오사이드를 이들 단백질에 흡수시켜서 높은 고역가 IgM 만용을 유도할 수 있었다(Livingston et al., 1993b). 공유결합을 이용하였지만, GE3-OMP 접합체는 가끔씩만 IgG 반응을 유도하였으며, IgM 반응에 있어서는 GD3 접합 반응 없이 행한 종전의 실험의 결과에 비해 나아진 것이 없었다. 단백질 항원에 대한 강력한 면역 조절물질인 것으로 보고된(Apple et al., 1988) 양이온화 BSA는 전합화후에 면역원성이 약한 단백질에 대한 특이적 면역 반응을 증강시킬 수 있었다. GD3-cBSA 접합체는 중간 정도의 IgM 반응을 유도하였을 뿐아지만, ELISA에 의해서는 고역가의 IgG 항체가 분석되었다. ITLC 또는 도트 블롯 면역 염색법에 의해서 이들 고역가 항혈청을 더 실험한 결과는 이들의 반응이 GD3에 대해 특이적인 것이 아니라는 것을 시사하고 있다. 백신을 제작하기 위한 또다른 매력적인 접근방법은 다중 항원성 펩티드 시스템(MAP)으로서 J. Tam 등(Tam, 1988; Tam and Lu, 1989)에 의해 보고된 바 있다. 올리고머 측쇄를 갖는 리신 로어에 근거를 두면, MAP는 B-세포 및 T-세포 에피토프를 포함하는 4개 또는 8개의 나뭇가지 형태의 펩티드 사슬로 이루어져 있다. 펩티드에 대한 면역반응은 이들 구조물을 사용하였을 때, B-세포 또는 T-세퍼 에피토프만을 갖는 펩티드에 비교하여 극적으로 증가된다. 말라리아 롤-세포 에피토프를 포함하는, MAP 구조물의 아미노 말단에 GE3을 겹합시키면, GE3에 대하여 중간정도의 IgM 반응을 나타내고 IgG 반응은 나타내지 않는다. 이러한 접근법이 합성 펩티드에 대해서는 매우 표과적이기는 하지만, 강글리오사이드 백신에 대해서는 그다지 쓸모가 없어 보인다. 항 강글리오사이드 항체는 GM3에서 유래된 종양과 정상적인 조직에 존재하는 GM3가 서로 다른 세포 표면 밀도를 갖기 때문에 이들을 서로 구별할 수 있다고 보고 되어 있다(Nores et al., 1987). 폴리리신에 GD3을 접합시키는 것은 단일 분자에 결합된 고밀도의 GD3 에피토프를 대표하는 것으로 생각되어 왔다. GD3-폴리리신에 대한 반응은 중간정도의 것이며, 겨우 중간정도의 IgM 반응이 검출될 뿐이고 IgG 반응은 검출되지 않는다. 최종적으로, 키홀 림펫 헤모시아닌과 접합된 GD3(GD3-KLH)로 면역화시킨 생쥐는 가장 높은 역가의 IgM과 IgG 반응을 일으킬 수 있으며, 종래의 백신에 의해 일어나는 반응보다 현저히 높은 반응을 일으킨다.
이들 혈청들은 면역 염색 분석법에 의해 분석하였을 때, 인간 조직 추출액에 있어서 GD3에 대해 매우 특이적인 것으로 밝혀졌다. IGM 면역 반응의 시간경과 실험은 종래의 실험에서 관찰되었던 것과 유사한 특성을 시사한다 (제2도). IgM 피크 역가는 2주간격으로 투여했을 때 세번째의 백 신화반응 후에 달성되었다. 반응은 빠르게 감소하며, 계속적인 백 신화처리를 하여도 항체 반응에 있어서 유의적인 증강반응 (boost)은 유도되지 않는다. 강글리오사이드 백신을 이용하여 고역가 IgG 반응을 유도하였음을 최초로 보고한다. 이 반응은 IgM 반응에 비해 현저히 오랜 기간동안 지속되며, 계속적인 백신화처리에 의해 증강반응을 일으키지만, 단백질 항원에서 종종 관찰되는 기하급수적으로 증강되는 반응과는 비교할 수 없다. 서브클래스는 주로 IgG1인 것으로 결정되었으며, T-세포 의존적 경로가 강글리오사이드 접합체 백신에 의해 활성화되었는 지는 확실하지 않다. B-세포 성숙에 있어서의 T-세포의 도움이 중요하다는 것은 의심할 여지가 없지만, 항체 클래스의 조절은 다양하게 이루어지며 이소타입 변환(isotype switch)은 T 헬퍼 세포 활성에 의해서도 가능하다고 하는 것이 여러 보고에 의해 입증되고 있다 (Tsale and Abraham, 1987). GD3의 올리고당 부분만을 포함하는 접합체는 mAb R24와 반응을 하지 않는 것으로 밝혀졌으며, GD3 강글리오사이드에 대해 유의적인 면역 반응을 유도하지 못하였다. 접합반응 도중에 올리고당 사슬의 환원 말3단에 있는 글루코스를 변형시키거나 또는 세라미드를 소실시키면 적절한 에퍼토프 발현과 면역 시스템에 의한 검색에 영향을 줄 수 있다. 접합을 위해 사용된 이들 두가지 방법은 모두 덜 효과적이며 수율이 낮았다. 덜 효과적인 백신을 이용하여 환자에게서 종양과 관련된 강글리오사이드에 대해 특이적인 면역 반응을 유도하면 미리 면역 반응이 유도되고 이는 보다 나은 예후와 관련되어 있다. 강글리오사이드 접합체 백신은 생쥐에게서 장기간 지속되며 특이적인 IgG 반응을 유도할 수 있으며, 특히 GD3-KLH 접합체는 곧 흑색종 환자에 사용할 수 있는 종양 백신으로서 유용하다는 것이 입증될 수 있음을 시사한다.
두번째 실험
KLH에 공유적으로 결합된 강글리오사이드 GM2를 이용하여 백신화처리한 흑색종 환자에 대해 면역학적 보조약 QS-21의 제 1단계 임상실험을 행하였다.
목적 : GM2에 대항 항체의 유도에 있어서 면역학적 보조약인 QS-21의 최적의 안전한 용량을 결정하기 위한 것이다.
배경
AJCC 3기의 흑색종 환자는 2년 째의 재발율과 3년 째의 사망율이 60-70%이다(Hilal et린m 1981; Eilbet et al., 1976). 제 4기 흑색종 환자로서 수술후에 질병을 앓지 않는 환자는 더 나쁜 예후를 나타낸다. 이러한 비율을 변화시킬 만한 어떠한 처리법도 알려져 있지 않다. 수술 후의 제 3기 흑색종을 치료하는 표준적인 방법은 면밀하게 관찰하는 것이다.
흑색종 환자는 경우에 따라 혈청 내에 항체를 갖고 있는데, 이들 항체는 매우 제한된 흑색세포 분화 항원에 반응하는 것으로 알려져 있다. 경우에 따라서는, 이들 항체의 존재가 예측할 수 없었던 유리한 경과와 관련되어 있다는 것이 밝혀졌다(Livingslfn et al., 1987). 오직 몇몇의 환자만이 혈청 중에 이러한 항체를 갖고 있기 때문에, 관련 항원을 포함하는 흑색종 백신을 이용하여 환자를 면역화시킨으로써 항체 형성을 유도하고자 하는 시도가 있어왔다. 전세포(全細胞; whole cell)로부터 제조된 백신은 이러한 점에 있어서는 효과가 없다(Livingston et al., 1982). 지금은 흑색종의 전세포 보다는 정제된 항원이 백신 제조에 이용되고 있다. 최근에 완결된 실험에서, BCG-GM2에 의해 백신화시킨 환자 44명중 33명이 생존기간이 팝은 IgM 항체를 생성해냈지만(Livingston et al, 1989; Livingston, 1989), IgG 항체 만용은 거의 발견할 수 없었다.
GM2와 같은 강글리오사이드의 면역원성을 증강시키기 위하여, 특히 IgG 반응을 유도시키기 위하여 강력한 보조약 또는 다른 접근방법이 지속적으로 추구되어 왔다. 키홀 림펫 헤모시아닌에 공유적으로 결합시킨 강글리오사이드에 대하여 쥐에게서 가장 성공적인 IgG 반응이 유도되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과의 기본 개념은 분할 내성(split tolerance)이다. 면역학적 내성 및 이것을 극복하는 방법에 대한 연구들은 여러 실험에 있어서 B세포의 무반응성에 비하여 롤 세포 무반응성이 매우 빠르게 유도되고 또한 보다 쉽게 유지된다는 것을 보여준다(Romball et al. 1984; Weight 1977). T 세포 내성을 유지하기에 적합한 순환성 항원의 농도에서는 자주 B세포 내성이 유지되지 않는다. 결과적으로, (목적하는 면역원에 공유적으로 결합된 KLH와 같은 강력한 무관한 항원에 의한 경우와 같이) T 세포의 도움이 제공되는 경우, 내성을 갖게 된 T 세포 의존성 항원에 대하여 항체가 유도될 수 있다. 이러한 접근법은 실험 동물에게서 각종의 다양한 탄수화물 항원에 대한 IgG 항체를 유도시키는데 성공적으로 사용되었고(Kundu et al. 1980; Gray 1978; Chang and Rittenberg, 1981; Longenecker et al., 1987), 최근에는 영아에게서 H. 인플루엔자 다당류 항원에 대한 IgG 항체를 유도시키는데 성공적으로 이용되었다.
KLH의 분자량은 매우 다양하지만, 대략 2 ×105 달톤이다. 여러 연구자들(Berd et al., 1982)에 의해 상기 화합물은 1㎎의 용량으로 환자에게 피부내로 주사되어 지연형 과민반응(DTH, delayed type hypersensitivity)을 유도하였다. Bionura Inc.(Edmonton, Canada)에 의해서는 발열원을 포함하지 않는 KLH가 제조되어 있으며, 높은 에피토프 밀도 (1000/1)로 GM2에 공유적으로 결합되었다. 면역학적 보조약과 혼합된 이들 제제를 이용하여 쥐에게서 GM2에 대한 고역가 IgG 반응을 유도시키기도 하였다.
T-항원-KLH와 같은 KLH-접합체 백신을 이용한 전(前) 임상학적 단계에서 시험된 면역학적 보조약 중에서 QS-21이 가장 효과적이었다. 대부분의 생쥐에 있어서, IgG 항체 역가는 1/4000을 초과하고 강력한 DTH가 발견되었다. T-KLH 단독으로는 1/160의 중간 정도의 역가를 얻을 수 있었고, DTH는 형성되지 않았다. QS-21은 남아메리카의 나무인 뮐라자 사포나리 아 몰리나(Quillaja saponaria Moline)의 껍질로부터 추출된 탄수화물이다. 이들 사포닌 계통의 화합물의 단당류 조성, 분자량, 보조약으로서의 효과 및 독성은 이미 기술되어 있다(Kensil et al., 1991). QS-21은 보조약으로서의 유효성 및 무독성 때문에 선정된 것이다. QS-21은 고양이에게서 ReLV 서브유니트 백신의 면역원성을 증강시키는데 (Marciani et al., ), 그리고 레서스 원숭이(Rhesus monkey)에게서 Hnr-1 재조합 백신의 면역원성을 증강시키는데 있어서 매우 효과적이며 독성이 없다는 것이 입증되어 있다.
덧붙여, 몇몇 흑색종 환자들이 면역화반응을 방해할 수 도 있는 억제 세포를 갖고 있으며 이들 세포들이 낮은 용량의 시클로포스파미드에 의해서 억제될 수 있다는 것이 입증되어 있기 때문에(Livingston et al., 1987b), 각 환자에게 첫번째의 백신주사 이전에 낮은 용량의 시클로포스파미드를 투여한다. 이러한 복합적인 접근방법은 실험동물 및 흑색종 환자에 있어서 글리코리피드 및 다른 항원의 면역원성을 증강시킨 것으로 밝혀져 있다(Livingsen et al., 1987a; Livingston et at., 1989).
연구 집단
외과적 시술을 받은 지 2-8개월이 경과한 AJCC 3단계 또는 4단계 악성 흑색종의 위험성이 높은 환자들로서 그의 병리학적 슬라이드를 메모리알 호스피탈 디파트먼트 오브 패쏠로지(Memorial Hospital Department of Pathology)에서 검토한 바 있고, 임상학적으로 질병이 없는 환자들이 자격을 갖는다. 이들은 80이상의 수행능력을 가져야 하고(Kamofs17y) (흑색종을 제외한) 예상 생존기간이 최소한 5년이 되어야만 한다. 임신중인 여성, 해물류에 대해 알레르기가 있는 환자, 그리고 크레아틴 또는 빌리루빈이 >2.0인 환자는 제외되었다. 환자들은 그 이전에 방사선 조사, 화학요법 또는 면역요법을 받았어도(백신주사 투여가 있기 8주전에 완결된 것이면) 문제가 없다.
치료 평가
환자들은 메모리알 호스피탈에서 철저한 신체적 검사를 받고, 흉부 X-레이, CBC, 혈청 크레아티니 및 간 기능 검사를 치료 3주 전에 받았어 야만 한다. 비정상적인 LFT 또는 흉부 X-레이 결과가 나타난 환자는 추가적인 시험(예를 들면, CTT, 토모그램 등)에서 흑색종 종양이 나타나지 않으면 무방하다.
백신의 제조
화학 및 제작
약제
명칭과 출처
적절한 명칭
GM2-KLH 합성된 종양 관련 글리코접합체(S-TAG)
- 능동 특이적 면역요법에 사용
GM2-HSA 합성된 종양 관련 글리코접합체(S-TAG)
- GM2-KL펴릉 이용한 능동 특이적 면역요법을 받는 환자의 피부 검사에 사용.
화학명칭 :
113NeuAc-GgOSe3Cer-키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)
실험실 코드 :
GM2-KLH 로트 #5
GM2-HSA 로트 #1
제작자 : Biondra Inc. REsearch Centre One, Demonton Research and Developmetn Park, 9411-20 Avenue 36monton, Alberta T6N 1E5 Canada
GM2햅텐을 제조하는데 사용된 재료들
접합공정에 사용되 자료들
발달 화학 (Development Chemistry)
GM2 및 GM2 알데히드에 대한 데이타:
GM2 및 GM2 알데히드의 구조는 Biomira Ine.에서1H NMR, 박막크로마토그래피(TLC), FAB-MS 및 FT-IR에 의해 확인하였다.
구조식, 분자식 및 분자량은 다음과 같다.
구조식, 분자식, 분자량 및 물리화학적 특성은 다음과 같다:
GM2-알데히드(화합물 번호 #2), C53H93O27N3,1204.29 크림계 흰색, 무취, 다공성 고체
KLH, GM2-KLH, HSA 및 GM2-HSA의 데이타
키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)은 많은 수의 저분자량 서브유니트로 이루어진 크고 복잡한 단백질이다. KLH는 키홀 림펫 몰루스크(Megathura crenelate)로부터 추출되고 정제된다. KLH, HSA 및 접합체는 Biomira Inc.에서 세파로스 CL-4B 겔 여과 크로마토그래피, 등전점 포커싱(IEF) 및 색차계 레즐르시놀-염산 법(1)에 의해 특성을 결정하였다.
1. L. Svennerbolm, Biochimca et Biophysica Acta, 24, (1957), 604-611
2. 세파로스 CL-4B 겔 여과법을 이용하여, 총 KLH 단백질 분자를 보이드 볼륨 내에 용출시켰다.
KLH의 분자량을 나타내는 컬럼의 부피는 > 2 x 106이었다. 이 값은 이 단백질에 관한 문헌에 나와 있는 분자량의 범위와 일치한다.
GM2-KLH 제작 유통도
단계 1-GM2의 정제 :
GM2-KLH 접합체의 제조방법
ASI를 위한 GM2-KLH 반합성 글리코접합체를, 그리고 피부 시험을 위한 GM2-HSA반합성 글리코접합체를 다음 5단계로 제조하였다:
1. 도입되는 GM2(소에서 유래) (화합물 #1)의 정제
2. 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)의 정제
3. GM2 알데히드(화합물 #2)의 합성
4. GM2 햅텐을 KLH에 접찹시킴
5. 접합체의 투석여과.
단계 1 : GM2(화합물 #1)의 정제
명칭 : GM2 강글리오사이드
약칭명 : II3NeuAc-GgOSe3Cer
FIDIA에서 공급받은 GM2(소에서 유래) 출발물질 시료를 바이러스 테스트를 위하여 송부하였다(BCFR 프로토콜). 모든 유리그릇은 중류 아세톤으로 세척후 증류 에탄올로 다시 세척하고 사용전에 18시간동안(130℃에서) 철저히 건조시킨다. 실리카 겔(30.5g, Kieselgel 60H Art 7736, E. Merck)의 컬럼(Nickel-Miller S 795-10)을 75 Psi(SSI Model 300 Lo pump)에서 65:35 클로로포름:메탄올을 용매로 사용하여 패킹하였다. GM2 (200mg)를 65:35클로로포름:메탄올 용액 농축액으로서 가한 후, 상기 용매 및 65:35:4 클로로포름:메탄올-물을 차례로 이용하여 용출을 행하였다. 분획들을 TLC(Rf 0.6, 5:4:1 클로로포름:메탄올-0.2% 수성 CaCl2)에 의해 분석하였다. GM2 함유 분획들을 모으고 증발시켜 크림계통의 흰색의 무정형 고체를 얻었다.
이 물질(화합물 #1)에 대한 7-Process 시험법은 IH NMR 및 이 강글리오사이드의 동정 및 순도를 확인하기 위한 박막 크로마토그래피를 포함한다. In-process 시험의 결과는 후술하는 발달 화학의 조건(specification)에 부합되어야만 한다. 이 재료가 순수하지 않은 것으로 밝혀지면, 상기 정제공정을 반복한다.
단계 2 : 발열원을 포함하지 않는 멸균된 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)의 제조
KLH의 제조
이 과정의 모든 절차는 클래스 100 생물학적 안전 캐비넷 안에서 실시한다. 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)은 Calbiochem으로부터 공급받아 사용하였으며, 이를 100m1의 발열원을 포함하지 않는 멸균된 인산염 완충 염용액에 용해시킨다. 이 용액을 2-6℃에서 18시간동안 보온하여 KLH가 이 용액내로 용해되도록 한다. 이어 용액을 200rpm에서 30분간 원심분리하고, 상충액을 모아 시료들을 세파로스 CL-4B겔 컬럼에 통액시켜 가공 전의 KLH의 분자량 프로필을 결정한다.
KLH을 투석하기 전에, 아미콘 멸균 한외여과 셀을 주사용 등급의 멸균수(WFI)로 4회 세척하고 이어 95% 에탄올을 채워넣은 후 2시간동안 교반함으로써 발열원을 포함하지 않고 멸균되도록 한다. 이 유너트를 다시 WFI물로 헹구어낸 후 오토플레이브한다.
KLH를 함유하는 상충액을 발열원을 포함하지 않는 멸균된 400mL 아미콘 투석여과 단위(YM 30, 한계 분자량 30,000)에 넣었다. 총 부피의 KLH를 다음의 발열원을 포함하지 않거나 또는 적게 포함하는 멸균된 완충액을 차례로 변화시켜가면서 350mL로 만든다:
1. PBS pH 7.5(발열원을 포함하지 않는 멸균된 것) 1 complete change
2. TRIS-HCI, EDTA pH 7.75(저함량의 발열원을 포함, 멸균된 것) 3 complete change
3. 0.5% 데옥시콜린산(DOC)를 포함하는 TRIS-HCI, EDTA pH 7.75(저함량의 발열원 포함, 멸균된 것) 2 complete change
4. TRIS-HCl, EDTA pH 7.75(저함량의 발열원 포함, 멸균된 것) 4 complete change
5. PBS pH 7.5(발열원을 포함하지 않는 멸균된 것) 3 complete change.
각 완충액을 바꾸는 것은 아미콘 유너트의 부피른 50mL 이하로 되게 한 다음 완충액을 가하여 부피가 다시 350mL로 되게 하는 것이다.
(발열원을 포함하지 않는 멸균된 PBS는 180- 185℃에서 4.5시간동안 구운 화학물질들을 이용하여 제조한다. 화학물질을 주사용 등급의 멸균수(WFI)에 가하고 발열원을 포함하지 않는 멸균된 용기내에서 혼합한다. 구울 수 없는 다른 환충액 또는 화학물질들은 상기와 같은 높은 온도에서 용융됨으로써 발열원이 제거되게 되므로, 이들 완충액은 발열원을 포함하지 않는 멸균된 용기내에서 멸균된 WFI 수에 용해시켜 제조한 다음 0.22㎛ 필터를 이용하여 멸균 필터한다. PBS 및 TRIS-HCI완충액의 PH는 발열원을 포함하지 않는 멸균된 2N수산화나트륨을 이용하여 목적하는 pH로 조정한다.
TRIS, EDTA pH 7.75 완충액에 포함된 DOC는 발열원 물질을 저분자량의 여덟개의 서브유니트로 분해하여 KLH 단백질은 아미콘 유니트(8.9)에 남아 있는 반면 상기 분해된 서브유니트들은 통과하도록 한다.
KLH 용액을 무균적으로 아미콘 유니트로부터 꺼내어 2000rpm에서 30분간 원심 분리하였다. 이어 용액을 발열원을 포함하지 않는 멸균된 눈금이 매겨진 실린더에 옮기고 발열원을 포함하지 않는 멸균된 PBS pH 7.5를 이용하여 75m1로 조정한다.
0.22㎛ 단백질 결합이 낮은 필터를 이용하여 상충액을 멸균 여과시켰다. KLH 시료를 세파로스 CL-4B 컬럼에 통액시켜서 KLH를 완충액(특히 DOC)으로 처리한 것에 의해 KLH 분자량 프로필이 미처리 KLH에대한 최초의 컬럼 크로마토그래피 결과와 비교하여 변화가 있었는 지의 여부를 결정한다. 프로필은 유의적인 정도로 변화해서는 안된다. KLH 부분표본을 취하여 BioRad 단백질 분석을 행하여 표준곡선을 얻는다. KLH 용액의 최종부피를 발열원을 포함하지 않는 멸균된 PBS pH 7.5를 이용하여 무균적으로 조절함으로써 최종 단백질 농도를 10mg/mL로 조정 하였다.
LAL 시험을 행하여 정제된 KLH에 존재하는 발열원의 농도를 결정하였다. 접합 공정에 사용하기 위한 KLH의 경우에 발열원의 농도는 10 EU/mg 미만이어야 한다.
KLH의 순도와 동일성을 체크하기 위하여 등전점 포커싱(IEF)을 행하였다. 표준물질로서 이전의(past lots) KLH를 이용하여 동시에 등전점 포커싱을 행하였다.
KLH 용액을 발열원을 포함하지 않는 멸균된 30 mL 혈청 바이알에 10 mL씩 분배하고 발열원을 포함하지 않는 멸균된 부틸 마개로 입구를 봉하였다. 이어 KLH을 다음에 햅텐에 접합시킬 때까지 -20±5℃에서 동결시킨다.
단계 3: GM2 알데히드(Gem Dio형, 화합물 # 2)의 제조
모든 유리그릇은 사용전에 증류 메탄올로 헹구어내고(130℃)에서 건조하였다. 정제된 GM2 강글리오사이드(화합물 #1) (40mg)를 중류 메탄올(10mL)에 용해시켜 얻은 용액을 -15℃(드라이 아이스-에탄올)에서 교반하고 오존기체(Orec 03V10개 오존발생기)를 그 용액에 7분동안 통과시켰다. 반응을 TLC(5:4:1 클로로포름-메탄올-02% 수성 CaCl2)로 체크하면서 아르곤 기체를 용액에 통과시켰다. 이어 용매를 감압하에 제거하고 생성된 물질을 증류 메탄올에 용해시켰다. 이 용액에 메틸설파이드(200m1)를 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 1시간동안 교반하였다. 용매를 제거하고 잔류물을 에틸 에테르(4 ×25 mL)를 이용하여 연마하였다.
생성된 백색 고체(화합물 #2)를 진공중에서 15분간 건조시켜 남아있는 용매를 모두 제거하고 그 다음의 접합 단계에 직접 이용하였다.
생성된 알데히드가 불안정하기 때문에 (β-제거반응), 화합물 #2를 TLC에 의해서만 통상적인 기준에 따라 동정하였다. 전형적인 조건하에서 실시된 TLC 결과는 일반적으로 적은 양의 스핑가닌 또는 피토스핑고신 유사체(화합물 #1과 동일한 Rf),그리고 소량의 환원 당(Rf 0.32)가 존재함을 나타내었다.
단계 4: GM2 햅텐과 KLH(또는 HSA)의 접합
모든 조작은 클래스 100 생물학적 안전 캐비넷내에서 실시하였다.
각각 10mL의 발열원을 포함하지 않는 멸균된 동결 KLH(10 mg/mL)을 함유하는 두개의 바이알을 사용 직전에 실온에서 해동시켰다.
KLH 단백질(16mL)을 무균적으로 측정하고 동결건조된 GM2 햅텐과 마그네틱 교반 막대가 있는 플라스크에 넣었다. 햅텐이 모두 용액으로 녹아들어갈 때 까지 용액을 실온에서 3분간 온화하게 진탕하였다.
시안화붕소수소화 나트륨(NaBH3CN) (40 mg)을 햅텐/KLH 용액에 첨가하고 플라스크의 입구를 멸균 여과 니들이 장착된 마개를 이용하여 밀봉하였다. 용액을 조심스럽게 진탕한 후 실온에서 밤새 보온하였다. 용액을 이어 40℃에서 4일간 보온하였다.
단계 5 : 글리코접합체(GM2-KLH)의 투석여과
햅텐/KLH 반응 바이알의 내용물을 무균적으로 발열원을 포함하지 않는 멸균된 아미콘 한외여과 유니트(YM-30 필터 장착)으로 옮겼다. 여과된 질소를 공급하여 아미콘 유니트의 조작압력이 16 psi가 되도록 하였다. 접합체를 다음의 발열원을 포함하지 않거나 또는 발열원 함량이 낮은 멸균된 완충액을 차례로 이용하여 투석 여과하였다:
1. PBS pH 7.5(발열원을 포함하지 않는 멸균된 것) 1 complete change
2. TRIS-HCI, EDTA pH 7.75(저함량의 발열원을 포함, 멸균된 것) 3 comp1ete change
3. 0.5% 데옥시콜린산(DOC)를 포함하는 TRIS-HCI, EDTA pH 7.75(저함량의 발열원 포함, 멸균된 것) 2 complete change
4. TRIS-HCl, EDTA pH 7.75(저함량의 발열원 포함, 멸균된 것) 4 complete change
5. PBS pH 7.5(발열원을 포함하지 않는 멸균된 것) 3 complete change.
글리코접합체를 여과 유나트에서 무균적으로 꺼내어 200rpm에서 30분간 원심분리하였다. 상충액을 이어 단백질 결합능이낮은 0.22mm 필터를 이용하여 멸균 여과하였다.
글리코접합체 시료를 얻고 다음과 같은 In-process QC 시험을 행하였다:
1. BioRad 단백질 분석
2. 세파로스 겔 여과
3. 등전점 포커싱 (IEF)
단백질 분석의 결과에 기초하여, 글리코접합체의 최종 부피를 발열원을 포함하지 않는 멸균된 완충용액 pH 7.5를 이용하여 단백질 농도가 1 mg/mL로 되도록 조정하였다.
클래스 100 생물학적 안전 캐비넷 내부에서, 발열원을 포함하지 않는 멸균된 투명 붕소실리케이트 혈청 바이알(빨간색 고무 마개 장착, 1 mL 용량)에 총 오버필(oversfill) 부피가 0.1 mL씩이 되도록 최종 글리코접합체를 0.5mL씩 분배하고, -2O℃에서 동결하였다. 바이알에 시료를 채우는 과정 중에, 작업 공간의 내부에 있는 공기를 모니터하였다. 공기의 모니터는 후드 내부의 작업 지역 근처에 있는 공기중에 두개의 혈액 한천 플레이트를 최하 30분간 노출시킴으로써 행한다. 이들 플레이트를 이어 37℃ 배양기에 넣어 1-2일간 배양한다. 그리고 플레이트에 대해 세균 또는 진균이 서식하는 지를 관찰한다.
바이알을 제품의 명칭, 로트 번호 및 바이알의 번호가 표시된 라벨이 붙어있는 상자의 내부에 놓아두었다. 이어 상자를 밀봉하고 동일한 정보가 수록된 라벨을 밀봉 상자의 외부에도 붙여놓는다. 상자를 냉장장치의 검역실(격리실)에 라벨을 붙일 수 있을 때까지 1-2일간 보관하였다. 일단 최종 QC 시험이 완결되면, 라벨이 요구된다. 제작자가 라벨을 제품에 붙이고, 라벨을 품질관리부 또는 조절과에서 보증한다. 이어 최종 제품 파일에 조절과의 부서장 및 면역요법 부서의 부사장 및 COO이 서명을 하도록 한다. 이어 제품을 반출하고, “반출제품” 냉동고에서 -20℃에서 보관한다.
각 로트의 GN2-KLH 및 GM2-HSA는 다음의 최종 품질관리 시험을 거친다:
1. 표소면역분석법(EIA)
2. LAL 발열원 시험
3. BioRad 단백질 분석
4. 레조르시놀-HCI 분석
5. 토끼 발열원 시험
6. 일반적인 안전성 시험
7. 멸균성 시험
8. 시아나이드에 대한 불순물 시험
GM2-KLH는 Biomira Inc.(Edmonton,Alberta)에서 제작하였으며 미국 FDA의 IND하에 사용되었다. GM2/KLH 몰비율은 800/1(실제로는 200-1400)이고, 접합체는 0.5 ml 인산염 완충 염용액(PBS)에 대해 0.57mg 접합체의 농도로 공급된다. 이것은 0.5ml PBS당 대략 70㎍의 GM2 및 500㎍의 KLH가 포함되어 있는 것을 표시한다. 최초의 5회의 면역화 실험에 대한 백신주사일에는, 각 주사기에 0.5ml를 넣어 주사실에 옮긴다. 이는 GM2 용량이 70㎍ 임을 시사하는데, 이 용량은 GM2 + 각종의 보조약을 이용한 이전의 연구에서 유효한 것으로 판명된 값이다. 마지막(여섯번째) 면역화실험에서는 이 용량의 반, 즉 35㎍의 GM2와 250㎍의 KLH을 이용한다.
QS-21은 이미 공지되어 있는 방법에 따라 (16) Cambridge Bioscince Inc.(Worcester, MA)에 의해서 퀼라자 사포나리아 몰리나 나무의 수피로부터 실리카 및 역상 크로마트그래피를 이용하여 추출하였다. 정제된 GM2-KLH 접합체 및 QS-21에 대해 세균학 실험실에서 표준 배양 기술에 의해 그의 멸균도를 검사하고, 또 토끼에서의 발열원성을, 그리고 토끼와 생쥐에게서 안전성을 검사하였다. 이들을 각 부분표본으로 나누어 -15 - -25℃에서 보존하였다. 백신주사를 행하는 날, 570㎍의 GM2-KLH(또는 여섯번째의 백신주사에서는 285㎍의 GM2-KLH)를 QS-21과 혼합하고, 별개의 주사기에 넣고 라벨을 붙이고 임상실로 가져간다.
네가지 용량, 즉 10.50.100 및 200㎍의 QS-21을 사용하는데, 각각은 PBS에 용해시켜 총 부피가 0.25m1로 되도록 한다. 3명의 환자로 된 첫번째 그룹에게는 10㎍의 QS-21을 포함하는 6개의 백신을 주사하고. 그 다음의 3명의 환자에게는 50㎍의 QS-21을, 그 다음의 3명의 환자에게는 100㎍의 QS-21을, 그리고 마지막 3명의 환자에게는 200㎍의 QS-21을 주사하였다. 그 전의 용량을 투여받은 3명의 모든 환자가 적어도 두번의 백신을 주사받기 전까지는 아무도 그 다음의 용량을 투여받지 못한다. 200㎍ 투여 군에서 독성이 관찰되지 않고 또 GM2 항원과 KLH에 대하여 면역학적 반응성이 50-200㎍ 범위에 결쳐 정체성을 나타내지 않으면, 3명의 다른 환자에게 400㎍의 용량을 투여할 수 있다. 일단 안전하고 최고로 면역원성을 나타내는 용량이 확인되면, 6명의 다른 환자들을 그 용량으로 면역화하여 더 나은 항체 반응을 일으킬 수 있다.
GM2-KLH + QS-21의 사용을 위한 IND는 MSKCC가 갖고 있다.
치료
첫번째 면역화 실험을 하기 3-5일 전에, 200 mg/M2의 시클로포스파미드를 IV 투여하였다. 이것은 종래의 백신 임상실험에서 성공적으로 채택된 용량과 스케줄이다. 모든 알려진 질병을 외과적으로 수술한 후 2 - 30주후부터 시작하여 2주 간격으로 4회의 백신주사를 투여하였다. 2달 간격으로 2회의 백신주사를 더 투여 하였다.
평가
혈청학적 반응 : 이 임상실험의 주요 최종 포인트는 혈청학적 만용이다. 각 백신주사 직전에 30m1씩 말초 혈액을 채혈하고, 4회째, 5회째 및 6회째 백신주사시에는 2주 및 5주 후에 채혈하였다. 그 후에, GM2에 대한 항체가 검출되는 한 계속하여 3개월 간격으로 채혈을 할 수 있다. 4회째, 5회째 및 6회째의 백신주사 후 2주후에 모든 환자로부터 수집한 혈청에 대해서는 GM2 및 관련 강글리오사이드에 대한 항체의여부를 확인하기 위하여 ELISA 시험을 한다. ELISA 및 각종 특이적 반응성의 글리코리피드를 이용한 면역박막 크로마토그래피에서 1/80 이상의 역가를 나타낸 환자는 혈청학적 반응자로 간주하고, 이들로부터 수집한 혈청에 대하여 백신주사에 대한 항체 반응을 보다 더 잘 정의하기 위한 실험을 행할 수 있다. 만약 환자들이 고역가의 IgG 항-GM2 항체 유도를 나타내는 증거를 보이면, 임상학적 수준에서 GM2에 대한 면역반응을 연구하기 위한 연구에 있어서 4회째의 백신주사가 있은 지 2주후에 말초 혈액 60ml를 더 채혈할 수 있다. EVB-형질전화 임파아세포로부터 얻은 상충액과 그 이후에 얻은 하이브리도마를 이 목적을 위해 사용할 수 있다.
지연된 과민성 반응 : KLH, GM2 및 인간 혈청 알부민에 결합된 GM2에 대한 지연된 과민성을 검사하기 위한 피부 시험을 5회째의 면역화 실험 시에 행한다. 48시간째에 5mm 이상의 경화부를 나타내는 반응은 양성으로 간주하고, GM2의경우에 있어서는 각종 강글리오사이드를 이요한 피부 시험을 더 행한다.
임상학적 경로: 4회 및 6회째의 백신주사 시에 환자들은 메모리알 호스피탈에서 평가를 받고, 흉부 X-레이 및 스크리닝 프로필을 6회째의 백신주사시에 수행하여야 한다. 부가적 이거나 그 이후의 계속된 평가는 그들의 종양학자에 의해 수행된다.
치료 중단의 기준
만약 환자가 계속 질병을 알지 않는다면, 국부적 치료법 (수술 또는 병변부위 내에로의 주사)에 의해 통상적으로 처치되는 국부적 재발은 치료 중단의 이유가 되지 않는다. 환자가 전신 치료 또는 방사능 요법을 필요로 하는 정도의 질병이 재발된 경우에는 치료를 중단한다.
통계학적 고려사항
이 실험은 백신주사 이후에 GM2 및 KLH에 대한 IgG 반응과 독성으로 평가하는 것에 관련된 제1기 예비 연구이다. 4단계로 용량을 증강시키면서 각 용량의 QS-21를 이용하여 3명의 환자에게 백신주사를 투여한다. 각 단계별로 용량을 늘릴때마다 IgG 반응이 계속하여 증가하면: 등급 1의 전신 독성 또는 등급 2의 국부 독성을 넘지 않는 정도의 독성을 나타내는 가장 많은 양의 용량을 선정하고, 만약 독성이 나타나지 않으며 5회째 단계의 용량을 시험한다. 생쥐에서의 실험결과를 토대로 하면, IgG 반응은 2 단계 또는 3 단계째의 용량 이후에 피크에 다다르거나 또는 안정기(plateau)에 도달한다. 일단 면역원성을 나타내는 안전한 용량 범위가 확립되면, 3-6명의 추가적인 환자들에게 가장 면역원성이 높은 용량, 그리고 독성과 면역원성의 정도에서 신뢰할 수 있는 그보다 높은 용량과 낮은 용량을 이용하여 면역화시킨다.
위험:
GM2-KLH: 200㎍ GM2를 포함하는 백신을 투여받은 100명의 환자에게서 GM2에 의거한 독성은 전혀 관찰되지 않았다. 50명의 환자를 면역화시키고 그들의 면역 상태를 시험하기 위하여(독성이 없이), KLH는 1mg의 용량으로 사용하였다(15). GM2-KLH를 포함하는 백신을 이용하여 18명의 환자를 면역 화시켰다. 한 명의 환자는 주사 부위에서 GM2-KLH에 근거한 48시간동안 지속되는 통증과 만지면 아픈 증세를 나타내었는데, 이는 KLH에 대한 지연형 민감성 반응이라고 추측된다. 용량을 약하게 하여야할 필요는 없었다. GM2-KLH에 대해 예측되는 오직 한 가지의 부작용은 며칠간 지속되는 백신 부위에서의 염증중세이다. 38℃를 넘는 열이 나거나 또는 정상적인 활동을 방해하는 여러군데의 지역적인 독성이 발생하면, 그 이후의 백신중의 GM2-KLH 용량을 3의 인자만큼 감소시킨다.
사포닌은 아직 사람에게 사용된 적이 없다. 이들은 용혈작용을 갖는 것으로 알려져 있지만, QS-21은 생쥐, 고양이 및 레서스 원숭이에게서 125㎍의 높은 용량에서도 확실하게 독성을 나타내지 않았기 때문에 선정되었다. 면적(M2) 또는 체중(Kg)을 기준으로 할 때, 이는 본 발명에서 제안한 최고 용량의 수천배에 이르는 양이다.
백신의 성분이나 피부 시험에서의 항원에 대한 자가면역 또는 과민성 반응은 이론적인 것일 뿐이고 실제로는 가능성이 매우 희박하다.
독성의 기준 : 독성은 국립암연구소(NCI)에 의해 개발된 보통의 독성기준에 따라 등급을 매긴다. 이들 기준은 IRB로 파일되어 있다.
연구의 중요성
암에 대한 면역 반응을 증강시키는 것은 두가지의 기본적인 접근방법에 의해 시도될 수 있다 - 비특이적인 면역증강법으로서 이는 과거와 현재에 이르기까지 암의 면역치료법에서 주류를 이루고 있는 것이며, 또하나는 특이적 면역화법으로서 이는 암의 치료법에서는 아직 제대로 평가가 이루어지고 있지는 않지만 감염성 질명의 통제에는 많은 공헌을 하고 있다. 감염에 대하여 성공적인 특이적 면역화를 개발시킬 수 있도록 한 미생물 항원에 대해서는 잘 알려져 있다. 한편, 인간의 암 항원에 대한 지식의 결여는, 정의된 암에만 국한된 항원성을 나타내는 백신을 이용하여 암 환자에게서의 이들 백신의 면역원성을 입증하여야만 하는 암과 관련한 특이적 면역화법의 개발을 방해하여 왔다. 흑색종 세포 표면 항원에 대한 정의와 관련된 최근의 진전은 특이적 면역화법의 연구를 가능케 하고 있다.
결과
QS-21을 이용한 제 1기 임상실험에서 GM2-KLH를 항원으로 사용하였다. 모든 질병을 외과적 절제에 의해 제거한 후 질병을 앓지 않는 AJCC 제 3기 및 제 4기 흑색종 환자를 각 3명씩으로 이루어진 그룹에 대하여 10, 50, 100 또는 200㎍의 QS-21과 함께 500㎍의 GM2-KLH(GM2/KLJ 비율은 200-1400/1, GM2 용량은 760㎍)를 이용하여 면역화를 실시하였다. 모든 환자들은 환전한 6회에 걸친 백신주사를 투여받는다. 10 또는 50㎍의 QS-21 용량과 관련된 독성은 관찰되지 않았다. 100㎍의 용량도 문제가 없었지만, 이 용량으로 처치를 받은 3명의환자는 각각 6회에 걸친 백신주사 투여 중 적어도 한번은 24-48시간동안 손으로 만져지는 덩어리와 만지면 아픈 중세를 나타내었으며, 이들 환자중 2명은 6회에 걸친 백신주사 투여 중 2번에 걸쳐 이런 증세를 나타내었다.
전신에 걸친 부작용은 검출되지 않았다. 매 백신당 200㎍을 투여받은 3명의 환자는 주사 부위에서 만지면 아픈 중세를 2 - 10일간 경험하였고, 또 낮은 등급의 열과 약간의 두통, 몸살 및 통증을 포함한 독감과 유사한 중세를 대부분의 백신주사 이후에 경험하였는데, 이러한 중세는 8-24시간 지속되는 것이었다. 이들 12명의 환자에게서의 GM2와 KLH에 대한 혈청학적 반응을 표2의 아래부분에 요약하였다. 200㎍ 용량에서의 독성이 진정으로 최고로 허용되는 용량은 아니지만, 이것은 유의할만한 독성이며 이것이 100㎍ 용량과 비교하여 증가된 보조약 효과(adjuvanticity)와 관련된 것이라고 하는 증거는 없다. 9명의 환자를 현재 면역화시켰는데, 독성과 면역원성과 관련된 결과를 확인하기 위하여 50, 100 또는 200㎍ 용량에 대해 3명씩 할당하여 실시하였다. 100 또는 200㎍의 QS-21과 함 께 GM2-KLH를 투여받은 6명의 환자의 IgG 및 IsM 역가를 제6도에 나타내었다. GM2-KLH + QS-21(100㎍)은 역가의 면에서나 IgM 및 IgG 항체의 지속기갈의 측면에 있어서 GM2/BCG 또는 GM2-KLH + DETOX 또는 BCG 보다 현저하게 우수한 혁신적인 면역 백신임이 드러났다.
GM2-KLH와 GD3-KLH +QS-21 백신이 종래의 강글리오사이드/BCG 백신에 비하여 현저히 증강된 면역원성을 갖는다는 것을 입증하면서, 이들의 새로운 접합체 백신에 있어서 GD2, GD3 및 GD3 락톤의 면역원성을 임상실험에서 시험할 것이다.
흑색종에서 이들 강글리오사이드를 면역원 물질로 선정한 것은, 흑색종 및 각종의 전상적인 조직에서의 이들 강글리오사이드류의 양을 정량하기 위해 실시한 면역 박막 크로마토그래피를 이용한 20본의 흑색종 생검표본을 정량 분석한 결과를 토대로하여 이루어졌다.
일단 제조한 후 KLH에 공유적으로 결합시킨 이들 강글리오사이드 접합체 각각을 6 - 12명의 흑색종 환자에게 백신주사한다. 이들 파일롯 실험에서 면역원성을 나타내는 것으로 밝혀진 접합체를 모으고, 일정하게 면역원성을 갖는 다가(polyvalent) 흑색종 강글리오사이드 백신이 재발율과 생존율에 미치는 충격을 결정하는 것을 목표로 한 대규모의 다중심(多中心) 임상실험을 위한 예비실험으로서 12명으로 된 군에 대해 상기 접합체를 이용하여 추가적으로 실험을 행하였다.
[표 2]
세번째의 실험
세포 표면의 강글리오사이드 GM2, GD2 및 GD3는 악성 흑색종 세포에서 종종 과발현된다. 출원인은 종래에 이미 흑색종 환자를 GM2와 BCG로 면역화시키면 대부분의 환자에게서 IgM 항체 반응이 유도되며, 고역가 GM2 항체를 갖는 환자들은 생존기간이 연장된다는 것을 입증한 바 있다. 탄수화물 항원 (이들은 T-의존적이다)에 있어서, IgM 반응은 단기간 지속되며, IgG 반응은 거의 관찰되지 않는 것이 통상적인 일이다. 면역원성을 증가시키기 위해서, 본 출원인은 GM2를 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 공유적인 결합을 통해 접합시켰다. GM2-KLH 백신을 세종류의 보조약, 즉 -BCG, DETOX 및 QS-21중의 어느 하나와 함께 흑색종 환자에게 투여하였다. 가장 효과적인 백신은 QS-21을 포함하는 GM2-KLH이었다. 이 백신은 보다 강력한 역가를 갖고 오래 지속되는 IgM GM2 하체 반응을 유도하였으며, 일정한 IgG 반응(이소타입 IgGl 및 IgG3)을 유도하였다. 이 백신은 또한 가장 강력한 역가를 갖는 항 KLH 반응을 유도하였다, 이러한 결과는 접합체 GM2-KLH + QS-21 백신이 유의적인 T 세포의 도움을 유발함을 시사하는 것이다. 심각한 독성도 없기 때문에, 이 백신 접근법은 GD2와 GD3 같은 다른 강글리오사이드의 면역원성을 증강시키는데 있어서, 그리고 흑색종의 발달과정에 미치는 강글리오사이드 항체의 영향을 결정하는데 있어서 매력적인 수단이다. 덧붙여, QS-21은 GM2-KLH의 면역원성을 현저히 증가시키는 것을 발견하였는데, 이는 현재 보조약 없이 사용되고 있는 다른 접합체 백신에 있어서도 마찬가지 일 것이라는 것을 시사한다.
서론
악성 형질전환의 과정 중에 발생하는 변화중의 하나는 악성 흑색종을 비롯한 특정한 종류의 암세포에서 세포 표면 강글리오사이드의 발현 패턴이 변화하는 것이다(1). 정상적인 흑색세로에서는, GM33이 많이 발견되는 강글리오사이드이다. GD3, GD2, GD1a 및 GT1b와 같은 다른 종류의 강글리오사이드류는 전체의 10% 미만에 불과하다(2). 악성 흑색종에서는, 글리코실화 효소의 활성화에 의해 GD3, GD2, GM2 및 9-0-아세틸 GD3의 발현이 증가된다 (3,4). 이러한 과발현된 강글리오사이드들은 강글리오사이드 백신을 이용한 능동 면역화법을 비롯한 면역요법에 있어서 매력적인 표적이 된다. 악성 흑색종을 갖는 환자에게서 행한 GM2 백신을 포함한 일련의 연구에서, 출원인은(낮은 용량의 시클로포스파미드 및 보조약으로서 BCG를 투여한 후에) 백신주사를 투여하면, 대부분의 환자에 있어서 GM2에 대한 IgM 항체를 유도하며(5), 고역가 GM2 항체를 생성하는 환자에 있어서 질병에 걸리지 않는 기간과 생존율이 연장되는 것을 입증한 바 있다(6, 7). 그러나, GM2에 대해 유도된 항체 반응은 T-의존적 반응의 특성(주로 IgM이 생성됨, 짧은 지속기간, 일관성 없는 IgG 반응, 증강작용(booster effect)의 결여 등)을 가지며, 다른 강글리오사이드, 즉 GD3와 GD2는 동일한 방법으로 투여하였을 때 면역원성을 나타내지 않는다(8). 관련된 에피토프가 탄수화물이기 때문에, 본 출원인은 세균 감염에 대한 탄수화물 백신이 성공적으로 개발된 것에 착안하여, 면역원성을 증가시키는 접근 방법을 개발하게 되었다. 본 출원인은 생쥐에게서, GD3를 키홀 림펫 헤모시아닌에의 공유결함시킴으로써 그의 면역원성을 현저히 증가시킬 수 있다는 것과, GD3-KLH 접합체와 QS-21에 의해 면역화된 생쥐가 고역가 IgM 반응을 나타내고 그에 이어 강력하고 오래 지속되는 IgG 반응을 나타내는 것을 입증하였다(9). 본 출원인은 7l제 임상에서 강글리오사이드 접합체 백신을 시험하기 시작하였으며, 이제 악성 흑색종 환자를 GM2-KLH 접합체 백신으로 면역화시킨 초기 결과를 보고 한다.
재료 및 방법
환자
최근 4개월 이내에 모든 전이성 질환의 징표가 부인되어 왔다면, 악성 흑색종 제 III기 환자들을 적격으로 간주하였다. 환자들 중 누구도 이전에 화학요법 또는 방사요법을 받은 적이 없다.
백신 제조 및 투여
GM2-KLH 백신: GM2-KLH 백신은 상기 GD3-KLH 콘쥬게이트 백신(9)에 대하여 기술한 바와 같이 바이오미라사(Biomira Inc., EdHmonton, Alberta)에 의해 제조되었다. 간단히 말하면, 접합 절차는 GM2의 세라마이드 이중 결합의 오존 절단, 알데히드 그룹의 도입, 및 환원적 아민화에 의해 KLH의 아미놀리실 그룹의 접합을 포함한다. GME/KLH의 몰비는 약 800/1이고, 백신은 규정 식염수 0.5㎖ 중의 콘쥬게이트 0.57㎎의 농도로 제공되었다. 상기 분량은 환자 1명의 투여량이고, GM2 70㎍ 및 KLH 500㎍을 함유하였다. 6명의 환자로 이루어진 그룹들에 각각 보조제 없는 GM2-KLH 콘쥬게이트, 디톡스(DETOX)가 포함된 GM2-KLH, 비시지(BCG)가 포함된 GM7-KLH 및 QS-21이 포함된 GM2-KLH를 투여하였다.
2주의 간격을 두고 무상 임파구 배액으로 4회의 백신 주사를 사지에 피내주사하고, 8주의 간격을 두고 추가의 2회 백신 접종을 하였다. 최초의 백신 접종 4 내지 6일 전에 모든 환자들에 개 사이클로포스파미드(Cytoxan, Mead Johnson and Ce., Evansville, IN) 200mg/㎡을 정맥주사하였다.
면역학적 보조제: DETOX는 바이켐 리서치 사(Biochem Research Inc., HaHllton, MT)에 의해 동결건조된 유적형 유화액으로서 제조되고 제공되었다. 상기는 바실 칼메트-구린(bacille CaIHette-Guorin)으로 부터의 세포벽 골격(CWS) 및 살모넬라 미네소타(Samonella ninesota)로 부터의 모노포스포릴 리피드 A(MPLA) R595로 이루어진다. 백신 접종일에 DETOK(250㎍ CWS 및 25㎍MPA) 0.25㎖을 GM2-KLH 제재와 혼합하였다. 백신(최종 부피 0.75㎖)를 2 내지 3분 동안 볼텍싱하고 15분 이내에 환자에게 투여하였다. BCG는 바이오데틱스 리서치 사(Bionetics Research Inc., Rockville, MD)로부터 구입하였다. 백신 접종일에, 개별 시린지중의 GM2-KLH 백신에 규정 식염수 0.1㎖ 중의 107 백신 생존가능 단위(viable unit)를 가하였다(최종 부피 0.6㎖). 내용물을 혼합하고 15분 이내에 환자에게 투여하였다. QS-21 보조제(퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja aaponarla Mollna)의 껍질로부터 정제된 균질한 사포닌) (10,11)은 케임브리지 바이오텍(Cambridge Biotech Inc. Worcester, MA)의 호의로 제공되었다. QS-21 100㎍ 내지 200㎍를 규정 식염수 0.25㎖에 희석시키고, GM2-KLH과 혼합하였다. 백신(최종 부피 0.75㎖)를 2 내지 3분 동안 볼텍싱하고 15분 이내에 투여하였다.
강글리오사이드
소의 뇌로부터 유래된 GM2 및 GD1b는 피디아 연구소(fidia Research Laboratory, Abano Terre, Italy)로부터 제공받았다. 소의 뇌로부터 유래된 GM3, GM1 및 GD1a 는 시그마 케미칼사(SigHa Chemical Co., St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 아시알로(Asialo)-GM2는 GM2를 0.1M 트리플루오로아세트산과 100℃에서 처리하고, Sep-Pak C18 역상 컬럼(Waters, Milford, MA) 상에서 분리하여 제조하였다. GD2는 β-갈락토시다제로 처리함으로써 GD1b로부터 제조하였다(12). GD3는 소의 버터밀크로부터 분리하며 유 박사(Dr, R. K. Yu, Medical Collage of Virginia, RichMond, UA)로 부터 제공받았다.
시약 및 단클론성 항체
HPTLC 실리카겔 플레이트는 메르크사(E. Merck, Darnstadt, Germany)로부터, 4-클로로-1-나프톨 및 p-니트로페닐 포스페이트 디소디움은 시그마사로부터 입수하였다. 알칼라인 포스파타제-결합된 염소 항-인간 IgM(Kierkegaard and Perry Labs,eaithersburg, MD) 및 정제된 마우스 항-인간 IgG(Southern Blotech, Birninghan, AL) 및, 그 후 알칼라인 포스파타제-결합된 염소 항-마우스 IgG(Southern Biotech)가 ELISA를 위해 사용되었다. TAGO(Burlingame, CA)로부터 구입한 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)-결합된 염소 항-인간 IgM 또는 IgG가 도트 블럿 면터 염색(dot blot imMune stain) 및 면역 박막 크로마토그래피를 위해 사용되었다. ITLC를 위해서는 양고추냉이 과산화효소에 결합된 토끼 항-마우스 면역글로볼린을, ELISA를 위해서는 알칼라인 포스파타제에 결합된 토끼 항-마우스 IgM 또는 IgG를 대조 단클론성 항체와 함께 사용하였으며, 이등은 지메드(ZyHed, San francisco, CA)로부터 입수하였다. 항-GM2 mAb 696은 교와 하꼬 공업(Kyowa Hakko Kogyo, Tokyo, Japan)으로부터 입수하였고, 항-GD3 mAb R24는 생성시켰다(13).
혈청학적 분석
ELISA는 상기 언급한 바와 같이 수행하였다(6). 비특이성 “끈적거림(stickiness)”을 제어하기 위해, 강글리오사이드가 첨가되지 않고 동일하계 처리된 플레이트 상에서 면역 혈청을 시험하고, 측정 값을 항체의 존재하에 얻은 값으로부터 제하였다. 역가는 0.1 이상의 보정된 흡광도를 내는 최고 희석으로서 정의하였다. 단클론성 항체 또는 인간 혈청을 이용한 강글리오사이드의 면역 염색은 상술한 바와 같이 니트로성를로스 스트립상에 스포팅(14) 또는 상술한 바와 같이 HPTLC 실리카 겔 유리 플레이트 상에서 분리한 후 수행하였다. 플레이트는 클로로포름/메탄올/물(0.25%: CaCl2)로 전개시키고, 강글리오사이드는 레소르시놀/HCl 시약 또는 단단클로성 항체로 염색시켜 가시화시켰다.
IgG 아강의 결정
IgG 아강의 결정은 아강-특이성 2차 마우스 항-인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 MAB를 사용하여 ELISA에 의해 수행되었다. 상이한 공급처(표 4)로부터의 2하 mAB가 사용되었다. 염소 항-마우스 IgG에 접합된 알칼라인 포스파타제(Southern Biotech, Birmingham, AL)을 1:200으로 희석하여 제 3항체로서 사용하였다.
보체-매개된 세포독성 분석
보체-매개된 세포독성 분석은 4h 51Cr 방출 시험에 의해 수행되었다. GM2-양성 흑색종 세표계 SK-MEL-173으로 부터의 세포가 목표 세포로서 사용되었다. 2×106 세포클 CO2인큐베이터 중에서 37℃에서 1시간 동안 10% FCS RPMI 중의 100μCi Na251CRO4(New England Nuclear, Boston, MA)로 표지시켰다. 세포를 2회 세척하고, 96-웰 등근 바닥 플레이트(Corning, Hew York, NY) 중의 104 세포/웰이 표지되었고, 1:5로 희석된 백신 접종 이전 또는 이후의 혈청과 함께 또는 CO2인큐베이터 중에서 37℃에서 1시간 동안 매질 단독으로 배양하였다. 새포를 세척하고, 37℃에서 4 시간 동안 1:4로 희석한 인간 보계(SigHa)와 함께 배양하였다. 플레이트를 500g에서 5분동안 스피닝(spinning)시키고, 각 웰의 상등액 125㎕의 부분표본을 방출된 51Cr을 결정하기 위하여 수확하였다. 모든 분석은 3중으로 수행하였고, 1% NP-40(Sigma) 중의 최대 방출 및 보체가 없는 경우의 자발적인 방출에 대한 대조 웰을 포함하였다. 특이적 용해의 백분율은 하기와 같이 계산되었다:
결과
백신 투여 및 부작용
24명의 환자들을 GM2-KLH으로 면역시켰다. 6명의 환자로 이루어진 그룹들에 각각 면역학적 보조제가 없는 GM2-KLH 콘쥬게이트, 디톡스(DETOX)가 포함된 GM2-KLH, 비시지(BCG)가 포함된 GM2-KLH 또는 QS-21이 포함된 GM2-KLH를 투여하였다. GM2-KLH율 단독으로 투여한 후, 국소적 또는 전신적 독성이 감지되지 않았다. DETOX를 함유하는 백신은 6명의 환자중 4명에게 백신 접종 부위에서 2 내지 10 주 동안 지속되는 작은 혹을 발생시켰다. 4명의 환자들에개는 3 내지 10㎝의 홍반 및 경화가 나타났고, 최소의 민감만이 나타났다. 한 환자는 1회의 면역 이후에 25㎝의 홍반 및 경화가 나타났고, 두번째 환자는 최초의 면역 후에 72 시간 동안 약간의 열 및 불쾌감이 나타났다. 이 환자에게는 후속 면혁시에 DETOX 투여량을 50㎍ CWS 및 5㎍ MPLA로 감소시켰다. BCG는 모든 환자들에계서 치료 2 내지 12 주 후에 국부 발열 및 부분적으로 속발진(crust)를 야기시켰다. 상기 증상이 발생하는 경우, BCG의 투여량을 1X107 생존가능 단위에서 최종 투여량이 4명의 환자에서 3×106, 한 환자에서는 1X106으로 감소시켰다. 6번째 환자는 결핵에 노출된 병력이 있었고, PPD 시험에서 양성이었다. 따라서, 그는 1x106에서 시작하여 최종적으로는 1x105 단위로 감소시켰다. QS-21는 투여량 100㎍에서 모든 환자에게서 24 내지 48 시간 동안 지속되는 가벼운 국부적 홍반 및 민감을 야기시켰다. QS-21 투여량 200㎍은 모든 면역에서 2 내지 10일 동안 지속되는 국부적 민감 및 발열 뿐 아니라 18 면역의 3 후 8 내지 24 시간 동안 지속되는 가벼운 열(＜38.5℃), 두통 및 불쾌감을 비롯한 가벼운 열 밀 인플루엔자와 유사한 중상과 관련되었다. 신경병이학적 이산 또는 기타 부작용은 관찰되지 않았다.
GM2-KLH 콘쥬게이트 백신에 대한 항체 반응
백신 접종에 앞서서, GM2에 대한 IgG 항체는 발견되지 않았고, 19M 항체는 3명의 환자들에게서만 발견되었는데, 두명의 환자에서는 역가가 1:80이었고, 한명의 환자에서는 1:320 이었다. 나머지 21명의 환자들은 벽신 접종이전에는 GM2에 대한 반응성을 보이지 많았다. 면역이전 및 이후에 얻은 혈청의 ELISA 및 도트 블럿 면역 염색(dot blot immune stain) 결과는 표 3에 나타나 있다. GM2-KLH, 또는 GM2-KLH 및 BCG 또는 GM2-KLH 및 DETOX로 면역시킨후의 IgM 항체 역가는 매우 유사하였다(증간 역가 1:80-1:160). 반년에, GM2-KLH 및 QS-21로 면역시킨 6명의 환자들 중 5 명이 1:1280 이상의 IgM 항체 역가를 보였는데, 이는 다른 그룹들 또는 접합되지 않은 GM2 및 BCG 백신(6)으로 미리 면역시킨 환자들에서 보다 훨씬 높은 값이다. 또한, GM2-KLH 및 QS-21로 면역시키는 것은 모든 환자들에서 1회에 일관된 반응을 일으켰다. GM2-KLH 백신을 맞은 다른 18명의 환자들 중 2명 만이 이에 필적하는 EgG 역가를 나타내었다.
GM2-KLH 및 QS-21을 맞은 환자들 중의 GM2에 대한 후속 IgM 및 IgG 항체 역가는 제6도에 나타내었다. IsM 최고 역가는 3회 또는 4회 백신 접종 후에 나타났고, 대부분의 환자들에서 20 주 이상 유지되었다. 14주 및 22 주의 증폭 면역(booster immunization)은 IgM 역가를 더이상 증가시키지 않았다. 1:160 이상의 IgG 역가는 6명의 환자중 5명에서 4회 백신 접종 2주일 후에 나타났다. 역가는 1:40 이하로 감소되나, 증폭 백신 접종으로 원래의 수준으로 다시 급속히 증가하였고(중간 1:160), 11 주 이상 상기 수준을 유지하였다. 두번째 증폭 백신 접종은 대부분의 경우 항체 역가에 뚜렷한 효과를 보이지 않았다. 따라서, 증폭 백신 접종에 대한 반응은 고전적 2차 면역 반응의 2가지 특징 중 하나만을 보인다. 만용은 보다 급속하게 발생하나, 항체 역가는 최초의 면역 이후에서 보다 높아지지 않는다.
KLH 항체는 치료전 혈청에서는 검출되지 않았다. 백신 접종 이후에는 모든 환자들의 혈청이 표 3에 나타낸 바와 같이 KLH와의 반응성을 보인다. IgG 항체의 최고의 역가는 QC-21로 투여한 후에 나타났고, 이는 모든 다른 그룹들보다 현저하게 높은 값은 나타내며, 다음 그룹은 GM2-KLH 및 BCG로 백신 접종한 그룹이다(P＜0.005). QS-21 그룹에서는 GM2 반응의 강도와 KLH 반음의 강도 사이에 아무런 상관관계도 없었다.
GM2 항체 반응의 특이성 분석
면역 전과 후의 환자들의 혈청 중의 강글리오사이드 항체의 특이성은 강글리오사이드 표준 GM3, 아시알로(asialo)-GM@, GM@, GM!, GD2, GD3, GD1a 및 GD1b을 사용하여 도트 블럿 면역 염색에 의해 결정되었다(제7도). 대부분의 환자들로부터의 면역 전의 IgN 및 IgG 항체는 아시알로-GM2과 약한 반응성으로 보였고, 어떤 환자들은 또한 GM1 및 GD1b에 대한 IgM 항체를 또한 가진다. 이들 강글리오사이드와의 반응성은 면역에 의해 변경되지 않았다. 유일한 백신-유도된 변화는 GM2와의 강한 반응성 및 GO2와의 약한 반응성이었다. 도트 블럿 면역 염색은 0, 1+, 2+, 또는 3+으로 등급을 나뉜다. GM에 대한 IgM 항체의 반응성은 GM2-KLH 및 QS-21로 면역시킨 6명의 환자 중 5명, GM2-KLH 및 BCG로 치료한 6명의 환자 중 1명, 보조제 없는 GM2-KLH 또는 GM2-KLH 및 DETOX로 치료한 6명의 환자 중 2명에서 나타났다. IgG 항체의 3+ 반응성은 GM2-KLH 및 QS-21로 면역시 6명의 환자중 5명에서 보였으며, 다른 처리 그룹들 중의 환자들은 아무도 나타내지 않았다.
GM2-KLH 및 QS-21로 면역시킨 환자로 부터의 백신 접종후의 혈청은 면역 박막 크로마트그래피(표 8A)에 의해서 GM2 및 흑색종 조직 추출물의 기타 강글리오사이드와의 반응성에 대하여 또한 시험되었다. 대부분의 환자들의 혈청은 소뇌 또는 흑색종으로 부터 단리된 GM2에 대하여 강한 IgG 및 IgM 반응성을 보였다. 반응성은 흑색종 추출물 중에서 보다 느린 이동 속도 밴드(정제된 GD2 표준과 Rf 값은 비교하면 GD2로 여겨진다)에서도 또한 보인다(보이지 않음).
IgG 항체의 GD2 상호반응성을 확인하기 위하여, 2번 환자로 부터의 백신 접종후 혈청을 면역 염색을 수행하기에 앞서서 GM2 또는 GD2로 미리 배양시켰다(제8도). GM2, 및 흑색종 강글리오사이드 추출물 중의 GD2와의 반응성은 GM2로 미리 배양시킴으로써 완전히 억재된다. 한편, 같은 혈청을 GD2와 미리 배양시키면 GO2 반응성만을 억제시키고, GM2와의 반응성은 변화시키지 않는다. 이들 결과들은 하나는 GM2와만 반응하고, 다른 하나는 GM2 및 GD2와 반응하는 2가지 집단의 항체가 존재함을 시사한다.
IgG 항체의 아강 결정
GM2-KLH 및 QS-21로 면역된 6명의 환자들로 부터의 고 역가의 IgG 혈청은 IgG-아강 특이성 2차 항체의 패널(Panel)을 사용하여 ELISA에 의해 시험되었다. 결과는 표 4에 요약하였다. 모든 6가지의 혈청 중의 IgG 항체는 IgG1 및 IgG3 아강이었다.
보체-매개된 세포독성 성분
GM2-KLH 및 QS-21(1:5로 희석)로 백신 접종된 환자의 혈청중의 항 GM2의 효과 작용은 보체-매개된 세포독성 분석으로 시험되었다. 표 5에 보인 바와 팔이, 모든 5명의 환자들의 백신 접종후 혈청은 인간 보체의 존재하에 GM2-양성 SK-MEL-173 흑색종 세포를 용해시킨다. 백신 접종전 혈청은 보체의 원가에 따라 세포독성을 보이지 않고, 백신 접종후 혈청은 GM2 음성 흑색종 세포와 또는 보체를 첨가하지 않은 경우에 세포독성이 없다. 명백히, 이들은 예비적인 결과에 불과하고, 백신 유도된 항체의 세포 표면 결합 및 세포 독성 효과 작용, 이들의 아강에 대한 보다 자세한 연구는 현재 진행중이다.
토의
흑색종 환자들을 대상으로 한 일련의 실험에서, 목적은 흑색종에서 종종 과발현도는 3가지 강글리오사이드, GM2, GD2 및 GD3에 대한 항체의 생산을 유도하는데 효과적인 백신을 구성하는 것이다. 최초의 접근은 BCG에 흡착된 접합되지 합은 강글리오사이트로 백신 접종하는 것이다. 이러한 방법에서 GM2(5,6)에 대한 항체를 유도할 수 있었으나, GD2 또는 GD3에 대한 항체는 유도되지 않았다. GM2-BCG 백신에 의해 유도된 GM2 항체는 대부분 IgM 과였고, 항체 반응은 짧은 주기였으며, 증폭 면역은 1차 반응과 유사하게 IgM 항체 생산의 주기를 짧게 하는데, 이들은 모두 기타 탄수화물 항원의 연구에서 공지된 바와 같이, T-세포 독립적 면역 반응의 특징이다. 그러한 경우에도, 수술후의 III기 흑색종 환자에 의한 백신-유도된 GM2 항체의 생산은 생존율의 증가와 관련있다(6,7). 상기 관찰은 흑색종 강글리오사이드가 백신 제조에 적합한 후보이고, 면역생성성이 증가된 흑색종 강글리오사이드 백신이 우수한 임상적 효과를 나타낼 것임을 시사하였다. 흑색종 강글리오사이드의 관련된 이항원 결정 부위가 탄수화물이므로, 기타 탄수화물 백신, 명백하게 특정 박테리아성 감염에 대한 백신의 면역생성성을 증가시키는 것을 목표로 하는 연구를 고려하는 것이 도움이 된다.
탄수화물 항원에 대한 면역 반응의 중요한 특징은 단백질 항원과는 반대로 총선에 의존하지 않는다는 것이다. 탄수화물 항원이 흉선-독립적(TI)이라는 개념은 흉선이 있는 마우스 뿐 아니라 흉선 절제 수술을 받은 직후의 마우스가 박테리아성 다당류에 대하여 손상되지 많은 면역 반응을 보이는 것의 관찰에 기초한 것이다. TI 항원에 반응하는 B-세포는 몇가지 특징을 보인다. 그들은 종양 형성의 후기에 나타나고, 수명이 길고, 적어도 생체내 에서는 활성화를 위하여 T-세포를 필요로 하지 않는다. 실험실에서는 B-세포가 TI 항원에 반응하는데 T-세포가 필요하지만, T-세포 효과의 본질은 잘 알려져 있지 않고, 단백질 항원에 대한 T-의존성 항체 반응에서의 MHC-제한된 T-세포 조력과는 명확하게 다르다. T-세포가 TI 항원에 대한 생체내 항체 반음에 대하여 필수적인 것이 아닌 반면, 항체 수준은 T-세포가 존재하는 경우 보다 놓고, 이는 미지의 메카니즘에 의한 T-세포의 일반적인 활성 증대를 시사한다.
탄수화물 항원의 면역 생성력을 증가시키려는 시도로서 다양한 접근이 행해져 왔다. 이들은 화학적변경(17), 보조제의 투여, 단백질과의 비-공유 착물 형성, 면역생성 단백질 운반체에의 공유결합(18) 및 단백질 복제 또는 신합성된 펩티드(소위 “미모토프(mimotope)”) 또는 항-유전성 항체로 탄수화물 이항원 절정부위를 치환하는 것을 포함한다(20). 이들 대부분의 접근은 탄수화물 특이성 항체 반응에 대한 T-의 조력의 증가를 야기시켰다. 이들은 각각 최초의 실험시에 전망을 보였지만, 처음에는 햅탄(haptan)(21), 이어서는 이당류(22)에 대하여 제안된 면역 생성 T-의존성 단백질 운반체에 탄수화물 항원에 공유결합되는 것은 가장 활발하게 수행되는 개념이며, 어떤 경우에 있어 최근의 임상 시험에서 매우 효과적인 것으로 보이는 백신을 제공한다.
우수한 예는 H. 인플루엔자 형 b(Hib) 다당류 단백질 콘쥬게이트 백신이다. 과거 수년 동안에 걸쳐서 개발되어온 4가지 백신은 탄수화물 성분, 단백질 운반체 및 탄수화물 핀 단백질 사이의 결합에 있어서 다르다(23-27). 아동에 있어서의 대조 실험에서, 콘쥬게이트 백신은 접합되지 않은 Hib 포스포리보실/리비톨포스페이트 다당류(PRP) 백신 보다 강력한 항체 반응을 유도한다. 특별한 흥미에서, 처음에 Hboc(올리고사카라이드-비독성 디프테리아 독소) 또는 PRP-OMPC(네이세리아 메닝기티디스(Neisseria neningitidis)형 B) 백신으로 면역시키고, 나중에 접합되지 합은 PRP 백신으로 챌린지된 아동의 경우는 비접합된 백신의 1차 면역에 대해 반응하지 않는 연형에서 챌린지 시키더라도 병력상의 IgG 반응을 보인다(29,30). T-세포가 어떻게 관련되고, Hib PRP-반응성 B-세포와 상호작용하는지는 아직 명백하지 않다. 면역 생성성 및 T-의존성이 증가하는데 PRP 및 단백질 사이에 공유 결합이 필요하다는 사실은 단백질 및 PRP 사이의 근접이 적어도 항원 과정의 초기에는 방해되어서는 안된다는 것을 시사한다. Hib PRP 및 HIb PRP 콘쥬게이트에 의해 유도된 항체의 이소타입(isotype) 및 생체 활성은 동일하므로, 콘쥬게이트-유도된 T-세포 신호에 대해 반응하는 B-세포는 정성적으로 Hib PRP 단독에 의해 관련된 것들과 동일하게 나타난다.
박테리아성 감염에 대한 탄수화물 백신의 개발에서 축적된 실질적인 경험을 끌어내어 본 출원인은 과거 몇년 동안 흑색종 갈글리오사이드의 면역생성을 증가시키기 위해 유사한 접근을 탐색하였다. GD3의 화학적 으로 변경시켜 아미드, 라톤 또는 강글리오사이드 형태를 얻거나 또는 O-아세틸화에 의해 흑색종 환자에서 항체를 유도 하는데 매우 효과적인 유도체를 제조하였다. 그러나, 이들 GD3 유도체에 의해 유도된 항체는 GD3과 상호 반응하지 않는다(31,32). GD3의 유사체인 항-유전성 항체 BEC-2는 마우스를 GD3를 인지하는 단클론성 항체 R24로 면역시켜 개발하였다. BEC-2로 면역된 토끼는 항-GD3 항체를 생산하였고(33), 인간 환자에서의 BEC-2의 면역 생성의 초기 연구가 진행중에 있다.
콘쥬게이트 백신에 대해, 마우스에서 GD3를 사용한 초기 연구는 결합 방법의 개발, 담체 단백질의 선별 및 보조제의 선택이라는 세 가지 문제와 관련되어 있었다(7). 최적 결합 절차는 세라미드 뼈대에 있는 GD3의 이중 결합의 오존 절단, 알데히드 그룹의 도입 및 환원적 아민화에 의한 단백질 아미노라이실 그룹에 대한 결합을 포함 하였다. 5개의 시험된 담체들, 즉, 폴리-1-라이신, 키이홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 양이온화원 우형 혈청 알부민, 네이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis) 외막 단백질 복합체(OMPC), 및 분지된 폴리라이신 코어(core) 상의 4개의 반복된 말라리아 T-세포 에피토프를 포함하는 다중 항원성 럽타이드 구조물증에서, KLH가 가장 효과적인 것으로 밝혀졌다. 비공유성 GD3/KLH 복합체는 면역 원성이 아니었다. 가장 종은 보조제는 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja saponaria Molina)의 수피로부터 정제된 균질한 사포닌 분획인 QS-21 이었다.
GD3-KLH 콘쥬게이트 및 QS-21을 이용한 면역에 대한 항체 반응의 특징은 a) 높은 초기 IgM 항체 역가, b) 촉진(booster) 면역 후 IgM 항체 역가의 급속한 2차 상승, c) 촉진 면역 후 10주 까지의 IgM 항계 역가의 유지, 및 d) 2주 동안의 초기 지연을 제외하고는 IgM 항체 생산에 필적하는 높은 항체 역가로 일정한 IgG 항체 생산을 포함한다. 상기 발견들은 이제 동일한 결합 절차를 사용하여 다른 강글리오사이드 콘쥬게이트 백신인 GM2-KLH로 면역함으로써 인간 흑색종 환자에서 재생된다. 마우스 연구에서와 같이, QS-21은 허용할만한 독성을 가지면서 OETOX 나 BCG보다 훨씬 더 효과적인 보조제로 입 증되었다.
GM2 항체 반응은 T 세포 의존성 반응의 많은 특징들을 가졌다. 이것은 오래 지속되고,(일반적으로 T 세포 의존성 면역 반응과 관련된) IgG1 및 IgG3 서브클래스의 항체들이 유도되었다. Hib-PRP 백신에서 밝혀진 바와 갈이 상기 아이소타입들은 결합되지 않은 GME/BCG 백신에서 가끔 낮은 역가로 유도되는 것들과 동일하였다. 초기 시리즈의 3내지 5개월 후의 백신 후 지속된 고 역가 IgM 및 IgG 반응에서의 뚜렷한 촉진 효과의 결여는 환자가 초기에 2주 간격으로 면역되었다는 사실이 의해 설명될 수 있다. 단백질 항원에 대한 7차 반응을 보여주는 고전적인 실험에서, 항원의 7차 주사는 1차 주사한지 4주 후에 주어진다. 1차 면역후 항체 수준은 주사 후 1 내지 2 주 사이에 더 높고 4주 후에 촉진 주사가 주어지기 전에 매우 낮은 수준까지 감소한다. 본 출원인들이 선택한 면역 예정표에서, 초기 항체 반응은 감지하지 않고 7주 간격의 최초 4회의 백신접종에 반응하여 단계적으로 증가하면서 고전적인 실험에서 더욱 극적인 양상으로 나타난 7차 반응을 예견한다.
대부분의 단백질 항원에 대한 항체 반음과 달리, IgM 반응은 오래 지속되고, 탄수화물 항원에 특징적인 바와 갈이, 반복된 촉진 면역 후에도 IgH 항체들은 IgG 항체보다 높은 역가로 남아 있었다. 따라서 지질 뼈대에 연결된 비교적 짧은 올리고당 사슬을 포함하고 자가항원인 강글리오사이드에 대한 면역 반응은 Hib-PRP 및 다른 세균성 탄수화물에 대한 면역 반응과 많은 공통점을 보인다.
GM2-콘쥬게이트 백신의 개발은 더 긴 기간동안 지속되는, GM2에 대한 고수준의 IgM 및 IgG 항체가 결합되지 않은 GM2로 면역된 환자에서 더 짧은 기간동안 존재하는 낮은 수준의 대부분의 IgM 항체보다 흑색종의 재발을 지연시키는데 더 효과적인지의 여부를 결정할 수 있게 할 것이다. 또한, 본 출원인들은 이제 면역원성 단백질 담체와의 결합이, 결합되지 않은 백신으로서 주어질 때 흑색종 환자에서 항체 반응을 일으키지 않았던 주요 강글래오사이드인 GB3 및 GD2에 면역원성을 역시 부여할 수 있는지의 여부를 시험할 수 있다. 이것이 환수될 수 있다면, 다가 흑색종 강글리오사이드 백신의 구성 및 시험이 매력적인 다음 단계일 것이다.
[표 3]
[표 3(계속)]
[표 4]
[표 5]
4차 시리즈의 실험
일정한 투여량의, 키이홀 림펫(keyhole limpet) 헤모시아닌(KLH)에 공유적으로 결합된 흑색종 강글리오사이드 GM2와 함께 증가하는 투여량의 사포닌 분획 QS-21을 면역학적 보조제로서 단계 I시험에서 투여하였다. 수술 후 질환이 없어진 AJCC 111 기 또는 IV기 흑색종 환자 28명을 5개월의 기간에 걸쳐 6회의 백신주사를 피하투여함으로써 처리하였다. 국소적 및 전신적 반응들은 QS-21 투여량과 관련되어 있다. 100㎍ 이하의 투여량은 백신접종 부위에 2-4일간 지속되는 가벼운 국소적 민감 및 염증, 및 가끔의 간단한 미혈 및 불쾌감을 유도하지만, 심각한 무혁화는 유도되지 않았다. 200㎍ 의 투곡량은 30%의 백신접종 후의 미열 및 불쾌감을 야기하였고, 5-10일 동안 주사된 사지의 제한된 사용을 야기하는 직경 약 20cm 정도의 국소적 반응들이 모든 환자에서 관찰되었다. GM2에 대한 IgM 및 IgG 항체, 및 KLH에 대한 IgG 항체의 역가는 100 및 200㎍의 QS-21 투여량에서 가장 높았다. QS-21에 대한 항체는 검출되지 않았다. 본 시험은 100㎍ 투여량의 QS-21이 흑색종 환자에서 GM2 및 KLH에 대한 항체의 유도를 위한 적정한 만족스럽게 허용되는 투여량임을 증명한다.
도입
출원인 및 다른 사람들은 다양한 당단백질 및 강글리오사이드 항원의 발현을 위해 선택된 일련의 흑색종 전세포 백신을 흑색종 환자들에게 접종하였다(1,2). 백신접종 후 혈청에서 항체에 의해 가장 빈번하게 인지된 항원은 강글리오사이드 GM2 였다. GM2 강글리오사이드는 인간 악성 흑색종의 세포 표면에 과다발현된 분화 항원이다. 홀로 주사된 GM7는 면역원성이 아닌 것으로 밝혀졌으므로 다양한 면역학적 보조제를 포함하는 GM2 백신이 시험되었다(3,4). BCG(Bacillus Calmette-Guerin)에 부착된 정제된 GM2 강글리오사이드를 이용한 면역법은 대부분의 흑색종 환자에서 GM2에 대한 IgM 항체의 생산을 유도하였고 항체를 생산하는 환자는 항체를 생산하지 않은 환자에 비해 더 긴 질환이 없는 휴지기를 가지며 더 오래 생존한다(4,5). 수술 후 질환이 없어진 122명의 흑색종 환자들을 이용한 무작위 연구에서, GM2/BCG 백신을 맞은 환자의 대부분(86%)은 항체를 생산하였다(6). 항-GM2 항체를 생산한 환자들은 항체 음성 환자보다 상당히 더 긴 질환이 없는 휴지기를 가지며 더 오래 전반적으로 생존한다. 두 부문의 시험들을 비교하면, 비록 통계적으로 의미 있는 차이는 아니지만, GM2/BCG 백신을 맞은 환자들은 BCG 대조군과 비교할 때 질병이 없는 휴지기는 18%, 생존 기간은 11% 개선되었다. 면역 반응은 지속기간이 짧고, 주로 IgM에 의한 것이며, 중간 정도의 역가였다 환자들에게 다른 흑색종 강글리오사이드인 GD2, GD3 및 9-0-아세틸 GD3/BCG 백신을 사용한 유사한 접근 방법들은 가끔의 저역가 항체 반음만을 야기하였다(T). 더욱 효과적인 백신의 필요성이 분명해졌다.
햅튼(haten) 담체 콘쥬게이트를 이용한 랜스타이터(Landsteiner)의 고전적인 실험은 유아에서 세균성 캡슐형 다당류를 포함하는 다양한 항원에 대한 백신 주사에 성공적으로 적용되었다(8). 상기 배경을 기초로 하여, 수개의 상이한 탄수화물 종양 항원이 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 결합되었고, 이전에 비-콘쥬게이트 백신을 이용하여 나타낸 것보다 더 높은 역가의 IgM 및 IgG 항체 반응을 이끌어 낸다는 것이 밝혀졌다(9-11). 출원인들은 다양한 담체 분자에 연결된 GD3의 항원성을 마우스에서 시험하였고, KLH를 최적 담체로서 확인하였다(12). GM2-KLH 콘쥬게이트 백신이 홀로 또는 면역학적 보조제인 BCG 및 DETOX와 혼합하여 흑색종 환자에서 시험되었으나, 면역 반응은 GM2-BCG 백신에 의해 유도된 것과 크게 다르지 않고, 중간 역가의 IgM 항체만이 유도되었다(13). 더욱 강력한 면역학적 보조제가 요구되었다.
QS-21은 퀼라자 사포나리아 몰리나의 수피로부터 거의 군질하게 정제되고 높은 보조제 효과 및 낮은 독성에 의해 선택된 사포닌 분획이다(14, 15). 사포닌은 다양한 환경에서 면역학적 보조제로서 사용되어 왔다(15에서 개관됨). QS-21은 대장균 다당류에 대한 항체 반응(16), 및 HIV-1 외피 단백질(IT), 오발부민(18) 및 고양이 백혈병 바이러스(19)에 대한 항체 및 T 세포 반응을 증가시키기 위해 사용되어왔다. 세포독성 T 세포는 단백질QS-21 혼합물을 이용한 면역법에 의해 HIV 감염된 세포 및 오발부민 형질감염된 세포에 대해 유도되어 왔다(17, 18). 본 출원인들은 다양한 탄수화물 항원-KLH 콘쥬게이트 백신을 이용하여 다양한 새로운 면역학적 보조제를 시험하였고, 면역학적 보조제 QS-21 및 SAFm이 IgM 및 IgG 항체 역가를 가장 효과적으로 증가시키는 것으로 밝혀졌다(9).
QS-21이 가장 독성이 적고 콘쥬게이트 백신을 이용한 시험을 위해 입수가능한 것이었으므로 실험은 QS-21에 집중되었다. 마우스에서 GD3 강글리오사이드-KLH+QS-21 백신은 일정하게 높은 역가의 IgM 및 IgG 항체 반응을 유도하며(12), 흑색종 환자에게 본 접근방법을 시험하기 위한 근거를 제공하였다.
본 원에 기술된 것은 일정 투여량의 GM2-KLM + 증가하는 투여량의 QS-21을 사용한 단계 I 시험의 결과이다. 정제된 QS-21 또는 Quil A와 같은 부분적으로 정제된 사포닌은 이전에는 인체에서 사용된 적이 없고, 목표는 반복된 환자외의 투여와 일치하는 최대 허용 투여량 및 GM2에 대한 항체 반응을 증가시키기 위한 최적 투여량을 결정하는 것이다.
재료 및 방법
강글리오사이드
소의 뇌로부터 유래된 GM2 및 GD1b는 피디아 연구소(Fidia Research Laboratory, Abano Terme, Italy)로부터 제공받았다. 소의 뇌로부터 유래된 GM3, GM1 및 GD1a 는 시그마 케미칼사(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)로부터 구입하였다. GD2는 β-갈라토시다제로 처리함으로써 GD1b로부터 제조하였다. GD3는 소의 버터밀크로부터 분리하며 유 박사(Dr, R. K. Yu, Medical College of Virginia, Richmond, VA)로부터 제공받았다.
시약 및 단클론성 항체
HPTLC 실리카겔 플레이트은 메르크사(E. Merck, Oarmstadt, Germany)로부터, 4-클로로-1-나프톨, p-니트로페닐 포스페이트 디소디움은 시그마사로부터 입수하였다. 알랄라인 포스파타제-결합된 염소 항-인간 IgM(Kierkegaard and Perry Labs,Gaithersburg, MB) 및 정제된 마우스 항-인간 IgG(SoutHern Biotech, BirminghaM, AL) 및, 그 후 알칼라인 포스파타제-결합된 염소 항-마우스 IgG(Southern Biotech)가 ELISA를 위해 사용되었다. TAGO(Burlingame, CA)로부터 구입한 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)-결합된 염소 항-인간 IgM 또는 IgG가 도트 블럿 면역 염색(dot blot imHHne stain) 및 면역 박막 크로마토그래피를 위해 사용되었다. ITLC률 위해서는 향고추냉이 과산화효소에 결합된 토끼 항-마우스 면역글로볼린을, ELISA를 위해서는 알칼라인 포스파타제메 결합된 토끼 항-마우스 IgM 또는 IgG를 대조 단클론성 항체와 함께 사용하였으며, 이들은 지메드(Zymed, San Francisco, CA)로부터 입수하였다. 항-GM2 mAb 696은 교와 하꼬 공업(Kyowa Hakko Kogyo, Tokyo, Japan)으로부터 입수하였고, 항-GD3 mAb R24는 생성시켰다(21).
환자
최근 8개월 이내에 모든 전이성 질환의 징표가 부인되어 왔다면, AJCC III기 또는 lV 기 흑색종 환자들을 적격으로 간주하였다. 환자들중 누구도 이전에 화학요법 또는 방사요법을 받은 적이 없다. 환자들은 각 백신접종시에 독성에 대해 평가받았다. 또한, 환자들은 국소적 반응을 측정하고 그들의 체온을 측정하도록 지시받았다. 상기 결과들은 다음의 통원시 회수하여 검토하였다. 4명의 환자(4개의 투여량 수준에 각 1명)는 다른 치료를 필요로 하는 질환의 진행으로 인해 단지 4회의 면역만을 받았다.
백신 제조 및 투여
GM2-KLH 콘쥬게이트 백신은 바이오미라 사(Biomira lac., Edmonton, Alberta)에 의해 제조되었다. GME/KLH 몰비는 대략 800/1이고, 규정 식염수 0.5㎖ 중의 콘쥬게이트 0.57mg의 농도로 제공되었다. 이 양은 환자 1명의 투여량이고, GM2 70㎍, KHL 500㎍ 및 규정 식염수 0.5㎖를 함유하였다. 퀼라자 사포나리아 몰리나 나무의 수피로부터 분리된 사포닌 성분을 함유하는 QS-21 보조제는 캠브리지 바이오텍사(Cambridge Biotech Corp., Worcester, MA)에 의해 제공되었다 QS-21의 순도는 분석적 역상 HPLC에 의해 98%이상으로 결정되었다. 10, 50, 100 또는 200㎍의 QS-21을 0.25㎖의 규정 식염수에 희석하고 GM2-KLH와 혼합하였다. 백신(최종 부피 0.75㎖)은 2-3분 동안 볼텍스로 혼합하고 15분 내에 투여하였다. 2주의 간격을 두고 4회의 백신 접종을 피내주사로 투여한 후 8주 간격으로 2회 더 접종하였다. 초기에 4개의 QS-21 투여량 각각에 3명씩 12명의 환자들을 처리하였다. 이어서 추가로 한 명의 환자를 10㎍ 투여량으로 처리하고, 추가로 3명의 환자를 3가지의 더 높은 투여량으로 처리하였다. 1차 백신접종 3-5일 전에 모든 환자들에게 사이클로포스파미드(Cycloehosphamide, cytoxan, Mead Johnson and Co., Evansville, IN) 200㎎/M2를 투여하였다.
혈청학적 및 지연형 과민성(DTH) 분석
상술한 바와 같이 강글리오사이드에 대해 효소-결합 면역흡착제 분석법(Enzyme-linked IHHunosorbent Assays, ELISA)을 수행하였다(5). QS-21에 대한 ELISA 분석법을 위해, QS-21:에틸렌디아민(QS-21 글루쿠론산 카복실 그룹에 대한 에틸렌 디아민의 연결에 의해 재조됨)을 글루타르알데히드 처리된 이뮬론 4 플레이트(Immulon 4 plates, Dynatech Labs, Chantilly, VA)에 입혔다. 비특이성 “끈적거림”을 제어하기 위해, 강글리오사이드 KLH 또는 QS-21이 첨가되지 않고 동일하게 처리된 플레이트 상에서 면역 혈청을 시험하고, 측정값을 항체의 존재하에 얻은 간으로부터 제하였다 역가는 0.1 이상의 보정된 흡광도를 내는 최고 희석으로서 정의하였다. 단클론성 항체 또는 인간 혈청을 이용한 강글리오사이드의 면역 염색은 상술한 바와 같이 니트로셀룰로스 스트립상에 스포팅한 후 수행하였다(22). 환자들은 5회 백신접종시 GM2, GM2-HSA 및 KLH를 이용하여 피부 시험을 받았다. 각 25㎍을 0.05㎖의 PBS에 희석하고 피내 투여하였다. 결과는 상술한 바와 갈이 해석하였다(6).
결과
독성
GM2-KLH을 단독으로 또는 다양한 투여량의 QS-21과 함께 포함하는 투여된 백신의 횟수 및 상기 백신접종과 관련된 국소적 및 전신적 반응이 표 6에 나타나 있다. GM2-KLH 단독 또는 10㎍의 QS-21좌의 혼합은 가끔의 경미한 국소적 홍반 및 경화를 야기하였고, QS-21 투여량의 증가는 국소적 반응의 빈도 및 중증도를 증가시켰다. 10 및 50㎍ 투여량에서는 이는 약한 민감 및 2-4 cm의 홍반 및 24-48 시간 동안 지속되는 경화와 관현되었다(1 등급보다 심한 독성은 검출되지 않음). 더 높은 투여량에서 상기 반응들은 더욱 현저해져서 대부분의 반응들은 직경 8-10 cm 만큼 크고, (200㎍ 투여량에서) 몇몇은 직경 20 cm를 넘였다. 상기 반응들은 100㎍ 투여량에서는 일반적으로 2-4 일간 지속되고, 한 경우에는 7일간이나 지속되었으며, 200㎍ 투여량에서는 일반적으로 7 일간 지속되고, 한 경우에는 10일간이나 지속되었다. 어느 경우에도 타이레놀 보다 강력한 진통제는 필요하지 않았으며, 10, 50 및 100㎍ 투여량에서 환자들은 그들의 정상적인 활동을 계속하였다. 백신접종된 사지의 사용은 200㎍ QS-21을 함유하는 대부분의 백신의 투여 후 5-8일 동안 제한되었으나, 환자들을 재천하였을 때 국소적 반응의 모든 흔적들은 2주만에 사라졌다. 궤양 및 배액(drainage) 또는 피하 노듈(대부분의 다른 보조제를 사용할 때 나타나는 바와 같은 것)은 검출되지 않았다. 가끔의 짧은 경미한 미열 또는 근통이 낮은 3가지 투여량의 QS-21을 함유하는 백신접종 후 나타났고, 200㎍의 QS-21을 함유하는 백신접종의 약 3분의 1은 상기 중상들과 관련되었다. 일반적으로, 전신적 중상은 2차 면역 후에 가장 뚜렷하였다. 증가하는 국소적 및 전신적 반응에 대한 염려로 인해 200㎍ QS-21 그룹의 모든 환자들은 그들의 3차 및 4차 면역의 경우 100㎍ 또는 50㎍ QS-21로 점점 감소시켰다(상기 감소된 투여량 면역에 대한 부작용은 표 6에서 100㎍ 및 50㎍ 하에 기재되었다). 상기 투여량들은 잘 허용되므로 모든 5명의 환자들(한 환자는 질환이 진행되어 4회 면역후에 프로토콜에서 제외함)은 5차 면역을 위해서 200㎍으로 다시 증가시켰다. 5회의 5차 면역중 둘은 열 및 인플루엔자와 유사한 증상과 관련되고 그중 하나는 20㎍의 국소적 홍반 및 경화와 역시 관련되었다. 이 환자의 QS-21 투여량은 6차 면역에서는 100㎍으로 감소되었고, 전신적 중상은 나타나지 않고 국소적 반응은 가벼웠다(3-4cm 홍반 및 경화). 200㎍ QS-21을 사용한 나머지 4회와 6차 면역중 어느 것도 전신적 중상과 관련되지 않았다. 전체적으로 전신적 증상은 매우 가벼웠지만, 국소적 홍반, 경화 및 민감은 200㎍ 투여량의 경우 충분히 뚜렷하여 출원인들은 QS-21의 더 높은 투여량을 이용한 실험은 진행하지 않기로 하였다.
백신접종 후 GM2에 대한 항체 반응(표 7참조)
GM2-KLH 만을 사용한 면역은 BCG의 표면에 부착된 GM2를 함유하는 백신을 사용한 상기 연구에서 나타난 것들과 매우 유사한 항체 역가를 야기한다. 6명의 환자중 다섯은 IgM 항체를 생산하고 단 1명의 환자만이(낮은 역가의 ) IgG 항체를 생산하였다. IgM 항체의 역가는 QS-21 투여량의 증가에 따라 증가하였다. GM2-KLH만으로 면역한 후의 상호 중간의 IgM 항체 역가는 80 이고, 10 또는 50 ㎍의 QS-21로 면역한 후는(각각) 480 및 240 이며, 700 또는 200 ㎍의 QS-21로 면역한 후는 1280이었다. IgG 항체 역가는 GM2-KLH만을 맞은 환자에서의 0으로부터 10, 50, 170 및 200㎍의 QS-21을 각각 맞은 환자에서의 10, 60, 270 및 640 으로, 투여량의 증가와 함께 점진적으로 증가하였다. (ELISA 및 도트 블럿 면역 염색에 의한) 현저한 IgM 및 검출가능한 IgG 항체는 GM2-KLH + QS-21을 맞은 모든 환자에서 나타났다. 100 및 200㎍ QS-21 투여량을 맞은 6명 환자의 그룹을 위한 연속적인 IgM 및 IgG항체 역가는 제9도에 나타내었다. IgG ELISA 역가는 200㎍ 투여량의 경우가 약간 높지만, 전반적으로, 항체 반음은 두 그룹에서 매우 유사하다. GM2에 대한 도트 블럿 면역 염색은 GM2에 대한 특이성 및 100 및 200 ㎍ 투여량에서의 반응의 유사성을 확인하였다(표 7 및 제10도 참조). GM2에 대한 증간 IgM 도트 블럿 반응은 GM2-KLH 만을 맞은 환자에서 2+로부터 10 또는 50㎍의 QS-21을 맞은 환자에서 2+ 내지 3+로, 100 또는 200㎍의 QS-21을 맞은 환자에서 3+로 증가하였다. IgG 반응은 QS-21을 맞지 않은 환자에서의 0으로부터 10 또는 50㎍의 QS-21을 맞은 환자에서 2+로, 100 또는 200㎍의 QS-21을 맞은 환자에서 3+로 증가하였다.
GM2 항체 반응의 특이성 분석
5개 처리군 각각의 2명의 대표적인 환자에 대한 면역 전 및 후에 얻은 결정을 이용한 도트 블럿 면역 염색은 제10도에 나타나 있다. 면역전에, GM1에 대한 IgM 반응성은 출원인들이 상슬한 바와 같이 많은 환자들의 혈청에서 증명되었지만, GM2 또는 다른 강글리오사이드에 대한 반응성은 검출되지 않았다. 면역 후 GM1 반응성은 영향 받지 않았으나 GM2에 대한 IgM 및 IgG 항체가 모든 환자들에서 발견되었다. 본 출원인들이 상술한 바와 칼이(13), 상기 유도된 GM2 항체들은 때때로 GD2 와의 교차 반응성을 보였다(환자 1, 100㎍ 투여량).
KLH 및 QS-21에 대한 혈청학적 반응
표 7에 나타낸 바와 같이, KLH에 대한 반응성은 면역 전에는 보이지 않았고 QS-21의 투여량의 증가에 따라 점진적으로 증가하였다. 50, 100 및 200㎍ 투여량의 QS-21이 0 또는 10㎍ 투여량보다 상당히 높은 역가의 KLH에 대한 IgG 항체를 유도하지만, 50, 100 및 200㎍ 투여량에서 유도된 혈청학적 역가 사이에는 큰 차이가 없었다. QS-21에 대한 항체 역가는 4회 면역 후 ELISA 에 의해 분석 하였다. 면역전 또는 면역후의 혈청 시료사이에 QS-21에 대한 항체의 큰 증가는 없었다(데이타는 나타내지 않음).
GM2 및 KLH에 대한 DTH 반응
GM2 또는 GM2-HSA 피부 시험 부위에서 홍반 또는 경화는 검출되지 않았다. 현저한 홍반성 반응이 24 및 48 시간에 대부분의 KLH 피부 시험 부위에서 검출되었고 상기 반응은 200㎍ 투여량을 맞은 환자에서 가장 컸다(중간 직경 4.0 ×6.0 cm). 이는 단지 최소 경화와 관련되며 OTH와 항체에 의해 매개된 반응임을 의미하고 (집에 있는 환자에 의한) DTH 반응의 정밀한 정량을 어럽게 만든다.
추가의 임상적 시험
상기와 동일한 백신(BioHira, Inc.)의 투여량을 사용하여 진행된 질환을 가진 6명의 환자들을 처리하였다. 진행된 질환을 가진 추가의 6명의 환자들을 다시 100㎍ QS-21과 함께 1/10의 GM2-KLH 투여량으로 처리하였다. 두 그룹에서의 항체 역가는 초기 질환을 가진 환자에서 나타난 것보다 낮지만 7㎍ GM2 투여량은 IgM 및 IgG 항체 역가를 유도할 때 70㎍ 투여량과 동등하게 효과적인 것으로 나타났다.
다른 연구에서는, 초기 질환을 가진 6명의 환자를 GM2-KLH 구조물로 처리하였다. IgM 항체 역가는 약간 낮은 것으로 나타났지만, IgG 항체 역가는 바이오미라 구조물의 투여 후 나타난 것과 비슷했다. 그렇지만, 모든 환자들은 면역 후 항체를 만들었고 백신은 만족스럽게 허용되었다.
더 이상의 연구는 초기에 1주일 간격으로 GM2-KLH 의 백신접종을 맞은 18명의 환자를 포함할 것이다(예정표는 마우스 연구에서 우수한 것으로 나타남). 환자들은 무작위화되어 몇몇은 낮은 투여량의 사이클로포스파미드로 예비처리를 받지 않고, 다른 환자들은 낮은 투여량의 사이클로포스파미드로 예비처리를 받는다. 이 때 10명의 환자들은 자연 발생하였고 사이클로-또스파미드를 맞은 환자와 맞지 않은 환자 사이에는 아무런 차이가 없는 것으로 보이며, 이때 나타난 새로운 예정표를 가진 항체 역가는 동일한 콘쥬게이트를 이용한 상기 시험에서보다 우수한 것으로 나타났다.
토의
상기는 환자의 환경에서 사용하기 위한 QS-21의 최대 허용 투여량(WFD) 및 최대의 면역 증강 효과를 제공하는 QS-21의 투여량을 확인하기 위해 고안된 단계 I 시험이었다. 가능한 MTD는 면역당 200㎍ QS-21이었다. 200㎍ 투여량에서의 미열 및 불쾌감, 및 큰 국소적 염증 반응은 고투여량 IL2 또는 병용 화학요법의 맥락에서는 MTD를 진행된 흑색종을 가진 입원 환자에서 사용되는 것으로 간주할 수 없지만(23,24), 보조제 환경에서 암환자의 환자외 치료의 맥락에서는 중요하며, 정상적인 수용체에서의 감염성 질환에 대한 면역을 위해서는 허용될 수 없다. 그렇지만, 100㎍ 투여량에서는 44회의 주사에서 2건의 미열만이 야기되고 국소적 염증 반응은 일상 활동을 방해하지 않으며 일반적으로 2-4일로 제한된다. 이는 임상 시험의 환자군에서는 잘 허용된다. 100㎍ 투여량에서 200㎍ 투여량으로 진행하면서 본 출원인들이 투여량을 계속 증가시키기를 주저하게 만드는 국소적 및 전신적 독성의 분명한 증가가 있었다. 최고 투여량에서의 열 및 불쾌감은 BCG 나 DETOX와 같은 다른 면역학적 보조제에서 때때로 나타나는 것들과 유사하지만(15,25), 국소적 반응은 완전히 달랐다. 피하주사된 200㎍ 투여량의 QS-21은 직경 10-20 cm 영역의 홍반 및 뜨겁고 접촉에 민감한 경화를 야기하였다. 상기 국소적 반응은 동등한 전신적 중상을 유도하는 DETOX 또는 BCG의 투여량에서 일반적으로 나타나는 반응보다 더 퍼져 있었다. 상기 반응의 놀랄만한 특징은 수일 후(또는 길어야 10일 후) 상기 반응들이 완전히 감소되고 백신이 그 부위에 투여되었던 흔적이 얼어졌다는 것이다. 주사 부위에서의 궤양, 배액 또는 노듈 형성은 어느 환자에서도 검출되지 않았다.
본 연구에서의 두 번째 놀라운 발전은 사용된 어떠한 투여량에서도 QS-21이 GM2 강글리오사이드에 대한 질적으로 다른 면역 반응을 야기한다는 것이었다. 10㎍ 투여량에서조차 모든 환자들은 GM2에 대한 도트 블럿 면역 염색에 의해 검출될 수 있는 IgG 항체를 생산하였다. GM2-KLH 백신 단독 또는 최적 농도의 BCG 또는 DETOX, 또는 BCG의 표면에 부착된 GM2, 살모넬라 미네소타 변이체(salmonella Minnesota mutant) R595 또는 프로테오좀(proteosomes)과의 배합은 6명의 면역된 환자당 1 이상의 검출가능 한 IgG 반응을 거의 야기하지 않았다(2,4,5). GM2 에 대한 IgM 및 IgG 항체 역가는 QS-21의 투여량의 증가에 따라 증가를 계속하지만, 100 및 200㎍ 투여량 사이에서 평탄역에 이른다. KLH에 대한 IgG 항체도 유사하계 QS-21의 투여량의 증가에 따라 증가한다. 피크 IgG 역가는 50, 100 및 200㎍ 투여량에서 0 또는 10㎍ 투여량 보다 상당히 높지만, 세 가지 높은 투여량에서의 역가는 서로 크게 다르지 않다. 결과는 QS-21의 100 및 200㎍ 투여량이 GM2에 대한 최적 항체 반응을 유도하고 100㎍ 투여량이 더 잘 허용됨을 증명한다. GM2-KLH 단독으로 또는 GM2-KLH + 다양한 투여량의 QS-21로 면역된 한자에서 KLH에 대한 주요 홍반성 피부 시험 반응은 예상되지 않았다. 이는 항체 매개된 arthus-like 및 DTH 반응의 조합을 나타낼 것이다. 또한 다른 사람들에 의해 연구에 사용된 것(26)보다 낮은 투여량의 피부 시험에서의 KLH(100㎍ 에 대해 25㎍)가 강한 검출가능한 DTH 반응을 산출하기에 불충분하거나, 백신중의 KLH상의 GM2 강글리오사이드의 높은 에피토프 밀도가 KLH에 대한 전형적인 DTH 반응을 유도하기 위해 요구되는 정상적인 항체 가공(processing) 및 표시(presentation)를 허용하지 않을 수도 있다.
실험동물 및 수의학적 관행에서의 QS-21 및 다른 사포닌 함유 보조제의 광범위란 용도에도 불구하고(14-19), 그들의 작용 기전은 알려지지 않고 있다. 본 연구로부터 QS-21의 작용기전에 대한 약간의 추정을 할 수 있다. 주사 부위에서의 촉진할 수 있는 노듈의 결여는 육아종 형성을 수반하는 데포(depo) 효과가 일어나지 않음을 암시한다. 보조제로서 QS-21의 유력성에도 불구하고, 이는 빈약한 면역원으로 보인다. 반복된 면역 후에도, 검출가능한 항체 반응은 야기되지 않았다. C parvum, BCG 및 프로인트씨의 환전 보조제와 같은 다른 보조제와는 달리 QS-21의 면역원성은 그의 보조제 효과에 기여하지 않을 것이다. 200㎍ 투여량에서 나타난 미열 및 불쾌감, 및 주사 부위에서의 확산 홍반 및 경화는 사이토카인 방출이 관여되어 있음을 암시한다. IL-2의 피내 주사는 생체 검사시 매우 유사한 반응을 야기하였는데 이는 고전적인 DTH 반응의 특징이다(27,28). GM2 항체로부터 IgG 반응으로의 부분적 전환은, 아마도 상기 사이토카인 유도의 결과로서, T 세포 원조의 유도를 암시한다.
본 출원인들은 최근 강글리오사이드 면역원성의 증가를 위해 시험된 다른 합체들을 능가하는 KLH의 우수성을 증명하였고(12), 본원에서는 상기 효과의 더 이상의 증가를 위한 QS-21의 최적 투여량을 입증하였다. 본 출원인들은 AJCC 제III기 흑색종 환자에서 강글리오사이드 백신의 대단계 III시험을 마련하였으므로, 시험되어야 할 다수의 변형들이 남아 있다. 본 출원인들은 현재 상기 강글리오사이드-KLH + QS-21 백신 + 수개의 다른 면역학적 보조제를 사용한 임상전 연구를 수행하고 있다. 또한, 다른 예정표의 면역 및 다른 투여량의 GM2-KLH를 사용한 임상 시험도 계획하고 있다. 본 원에 기술된 단계 I 시험에서의 놀라운 발견은 1) 어떠한 투여량의 QS-21에서도 흑아종 형성의 증거가 검출되지 않았고, 2) 100㎍의 만족스럽게 허용되는 투여량에서, GM2에 대한 혈청학적 반응이, 정량적으로 및 정성적으로, 이전에 시험된 GM2 백신에서 보였던 것보다 훨씬 우수하다는 것이다.
[표 6]
*7(1) : 10㎍의 QS-21을 함유하는 22회의 백신접종중 7회후에 국소통증 또는 압통이 느껴졌다. 괄호안의 숫자는 NCI 공통독성기준(NCI Common Tox icily Criteria)에 의한 메디안 심각도를 나타내며, 이 경우에는 가벼운 국소 압통을 나타낸다.
국소독성의 경우, (1)최소압통 및 홍반, (2)보통의 홍반 및 경결 ＜ 10cm, 마취성 진통약을 필요로 하지 않는 통증, (3)홍반 및 경결 ≥ 10cm, 마취성 진통약을 필요로 하는 통증(미발견).
[표 7]
[표 7(계속)]
* 한 환자가 1/20의 처치전 피크 타이터 ELISA 반응을 나타냈다.
괄호안의 수는 소정의 반응을 보인 환자의 수를 나타낸다. 이 경우에는, 5명의 환자가 GM2 항체를 전혀 검출할 수 없었다.
제5계열의 실험
도입부
지난 10년동안 악성 흑색종의 발생율이 급격히 증가하였다. 1992년에만도, 미국에서 32,000명 이상이 흑색종에 걸렸고, 흑색종으로 인한 사망만도 6700건이 기록되었다(1). 원발성 흑색종을 적절하게 절제하면, 5년 동안의 생존율은 두께가 0.75mm이하인 원발종양을 가진 환자의 경우 95%보다 크고 두께가 4.0mm보다 큰 원발종양을 가진 환자의 경우에는 50%인 범위내로 된다(2). 소속림프절을 가진 환자들(AJCC단계 3)은 선택적 또는 치료적 절개후에 25-35%가 5년간 생존한다(3). 합병요법은 재발율을 전혀 감소시키지 못하고 또 이들 환자들을 외과적으로 처치한 후에 생존율을 전혀 증가시키지 못하는 것으로 나타났다. 이들 합병요법에서 화학요법, 비특이적 면역자극제, 인터페론, 및 다양한 유령의 흑색종 백신과 같은 매우 다양한 약제들이 시험되었다(참고문헌 4, 5에 논평이 나와있음). 흑색종 백신의 경우, 얻어지는 면역 응답의 강도, 및 특이성면에서 백신의 면역원성을 추적할 수 있는 방법을 개발하는 것이 난제였다. 백신에 대한 체액성 면역 반응은 세포성 면역반응에 대해서는 겨우 이제사 가능해지고 있는 정도의 정밀도로 정량 및 분석할 수 있기 때문에, 본 출원인들은 체액성 면역을 일으키는 흑색종 항원에 음정을 맞추었다. 혈청학적으로 규정된 이들 항원 중, 특히 GM2가 능동면역을 위한 매력적인 타겟으로 떠올랐다(5-8). 최근 본 출원인들은, 저음량의 Cy로 전처리한 후, B7에 부착하는 정제된 GH2로 면역 접종하면 흑색종 환자에게서 높은 백분율로 IgM 항체가 유도되었다는 것을 밝혔다(8, 9). 이 GH2 항체 응답은 T-세포로 부터 독립적인 패턴을 보여주었다.
즉, 지속기간이 짧았고, IgG 응답이 없었고, 또 반복된 백신접종의 부스터 효과도 없었다. 유도된 항체는 인간보체의 존재하에서 GM2-발현 흑색종 세포에 세포독성을 나타내었고, 그리고 면역접종후에 GM2 항체를 생산한 환자들은 그럴지 못한 환자들보다 상당히 더 긴 무병간격 및 생존기간을 보여 주었다(9). 본 연구의 목적은 무작위로 제어되는 시험에서 백신에 의해 유도된 GM2 항체 생산의 이점을 확인하는 것이었다.
재료 및 방법
환자
피부전이 또는 소속 림프절의 완전 절개후 2주간 내지 13주간의 기간동안에는 국소 피부 및 소속 림프철로 한정된 병리학적으로 증명된 흑색종 전이를 가진 환자들이 적격이었다. 그밖의 적격성 기준은 다음과 같았다: 나이 > 15년: 카르노프스키 성능상태 ≥ 9: 혈청 크레아틴 ＜ 2.5㎎/dl, 혈청 빌리루빈 ＜ 2.5㎎/dl; 기타 암은 전무; 백신접종전의 8주간의 기간동안에는 화학요법이나 방사선 치료는 전혀 시행치 않음. 임산부는 배제하였다. 무작위화전 2주이내에, 모든 환자들을 조사하여 적격 여부를 결정하였다.
그뒤의 임상 추적검사는 환자의 1차 종양 유전자 학자가 수행하였다.
무작위화 및 추적검사
모든 환자로 부터 고지에 입각한 동의를 얻었고, 이들을 양성 림프절의 수(1, 2-4, 고5), 인트랜지트(Intrunsit)질병의 존재, 및 외과수출과 백신접종사이의 간격(2-6주, 7-13주)에 의해 분류하였다. GM2/BCS 또는 BCG만을 접종할 환자들을(양팔에 상당히 대등한 수를 보장하기 위하여 블록크기를 적합하게 할당하면서)컴퓨터로 무작위 화하였다. 최종 백신접종후 2주가 경과할때까지는 투여되는 백신의 종류에 관하여 환자에게도 의료진에게도 전혀 알리지 않았다. 모든 환자에 대한 추적검사 정보는 매 4-6달마다 1주간에 걸쳐 그들의 1차 진료담당의사에게 전화로 물어 구하였다.
라디오그라피에 의하거나 또는 병리학적으로 증명된 재발일을 사용하여 무병간격을 결정하였다. 이 백신접종방법의 두개의 비특이적 성분인 BCG와 저용량 시클로포스파미드는 실연가능한 항-종양 활성을 나타낼 수 있기 때문에(10, 11, 17), 이들은 대조 팔(control arm)에 아무런 치료를 하지 않은 경우보다 더 적절한 것으로 생각되었다.
GM2/BCG 백신
백신생산에 사용한 갱글리오사이드 GM2는 다음의 두가지 공급원, 즉, 테이삭스병에 걸린 고양이(테이삭스병은 이들 고양이에서 상연색채 열성렬질로 전파된다)의 뇌조직, 및 집암소의 뇌로부터 제조한 GM1(PA, BellefGnte소재의 Supelco로 부터 구입)으로 부터 구하였다. (NY, New York, Mt. Sina j 병원의 Mario RataBi 박사가 제공한) 테이삭스병에 걸린 고양이 뇌의 절편을 클로로포름/메탄올로 추출한 후, 추출물을 퍼아세틸화하고, 플로리실크로마토그라피를 수행하여 인지질을 제거하고 디아세틸화하고, 주석한 다음, DEAE-세파멕스 컬럼 크로마토그라피를 수행하였다(13). 투석후에, 주요 분격인 GM2를 분리용 박층 크로마토그라피에 의해 분리하였다. 앞서 기술한 것처럼(14), ε-갈락토시다제를 사용하여 말단 갈락토스를 절단하여 소뇌 GM1으로 부터 GM2를 제조하였다. 상기의 두가지 공급원으로 부터 제조한 GM2는 박층 크로마토그라피(TLC) 및 GM2를 인지하는 마우스 모노 클로날 항체를 사용한 면역 TLC로는 구별할 수 없었다(13).
각 GM2 배치는, 박층 크로마토그라피와 비중주사에 의할 경우 순도가 98% 이상이었다. 이 배치들을 표준적인 시험방법에 의해 무균성 및 기니아 피그미 및 마우스에서의 안정성에 대해 시험하였다.
정제된 GM2는 건조하여 4℃에 보관하였다. Tice균주 BCG(IL, Chicago소재의 Vni-veralty of llllnols), 107생단위(또는 PPD 시험에서 양성반응을 나타내는 환자에게 사용할 경우에는 3 ×106생단위)를 건조된 정제된 GM2 200㎍과 함과 증류수에 넣고 초음파처리에 의해 현탁하였다. 이 현탁액을 동절 건조한 후 -80℃에 보관하였다. 잔사는 백신투여직전에 인산 완충 생리식염수(PBS) 0.5ml에 재현탁하였다. 이러한 조건하에서, GM2는 BCG에 부착하는 것으로 밝혀졌고, 이는 아마도, 본 출원인이 전제 보고한 것처럼(8), 소수성 결합에 의한 것으로 생각된다.
대조군에서 사용하기 위해 BCG를 PBS에 현탁하였다. 상기 GM2/BCG군의 모든 환자들에게 매 백신접종당 200㎍을 투여하였다. 이들 백신 및 백신 접종 프로토콜은 메모리얼 병원 제도 조사록(the Memorial Hosfital Inatit utional Review Board)의 승인을 받았고 미국 식량 및 의향기구(U.S. Food and Drug AdHiniatration)의 IND에 따라 사용하였다. 초기에는 환자들에게 고양이 뇌 유래의 GM2를 투여하였다. 그 후에는, GM1에서 유래한 GM2의 비율을 늘려서 사용하였는데 그 이유는 고양이 뇌 GM2가 더 이상 이용할 수 없었기 때문이었다. 모든 환자들에게 림프역의 배액이 온전한 단의 6-10군데에서 피내 백신주사를 시행하였으며, 이 과정을 매번 다른 단을 사용하여, 7주 간격으로 두번 반복하였다. 초기의 일련의 백신접종후 두 달 및 다설달후에 부스터 면역접종을 행하였다.
Cy투여
제1 및 제4백신주사에 앞서 5내지 7일전에 200㎍/M2Cy(Cytoman: Mead Jo hnson and Cp., Evansville, In)의 1회량을 모든 환자에게 정맥내 투여하였다.
갱글리오사이드 시약
GD2는 발표된 방법(14)에 따라 GD1b를 7-갈라토시다제(G.W. Jnu·dian, Unlv eraity of Michigan, Ann Arbor, Ml)로 처리하여 제조하였다. GM1은 Su pelco(Bellefo-nte, PA)로 부터 구입하였다. GD3는 Fidia Reaedrch lab oratories(Abano Terme, Italy)로 부터 얻었고, GD1b는 같은 회사로 부터 구매하였다. GM3는 개 적혈구로부터 정제하였다(13), 도트블로트 면역염색(dot blot immune stain)을 GM2는 앞서 기술했듯이 GM1을 7-갈락토시다제로 처리하여 제조하거나 또는 인간 흑색종 생점재료로 부터 추출하였다(13).
혈청학적 방법
백신주사를 할때마다, 백신 3, 4 및 5는 주사후 2주 및 6주후에, 그리고 백신 5는 주사후 3달후에 혈청을 얻었다. 판자의 혈청과 토끼 항-인간 IgM 또는 항-인간 IgG제2항체, 또는 알카라인 포스파타제로 컨쥬게이견된 프로테인 A(Kirkegaard and Perry Laba, Gaithersburg, MD)를 가지고 GM2 또는 BCG 항체(9)에 대해 ELISA를 수행하였다. GM2 반응성이 없는 공여자의 정상 혈청에 대하여 구한 판독값을 상기 환자의 혈청에 대하여 구한 판독값에서 제하였다. 항체가(antibody t-iter)는 전에 기술한 것처럼(9) 0.10＜의 보정된 흡광도값을 나타내는 최고 혈청 희석배수로 정의하였다. 도트 블로트 면역염색은 전에 기술한 것처럼(8, 9) 수행하였고, 그리고 제11도에 나와있는 것처럼 0, 1+, 2+ 또는 3+로 등급을 매겼다. 혈청은, (H2반응성이 도트블로트에 의할 경우 2+ 또는 3+이고 ELISA타이터가 ≥1/20 이거나 또는 도트블로트에 의해 1+이고 ELISA 타이터가 ≥ 1/80 이면 양성으로 분류하였다. 정상 인간 혈청(⅓ 희석)을 보체의 공급원으로 사용하여 전에 기술된 것처럼 보체의존 세포독성 분석을 수행하고 김자염색(GieHsa Stain)법에 의해 생육불능 세포를 시각적으로 정량화하였다(8, 15).
지연형 과민증(DTH) 측정용 피부시험
에그 포스파티닐 콜린으로 부터 유리라벨라 리포좀을 제조하고, 0.1 미크론 필터속으로 10회 통과시켰다. 피부시험을 하는 날(네번째 백신 주사후 2주후) 포스파티딜 콜린리포좀 1.5㎎과 GM2 25㎍을 PBS에 혼합하고 Branson 1200수조 소터케이터(shelton, CT)로 초음파처리하였다. 전에 기술된 대로 a)25㎍ GM2와 b)25㎍/1.5㎎ GM2/리포좀을 사용한 피부시험(0.1ml 부피)을 수행하고 48시간째에 판독하였다.
결과
환자의 특징
1987년 3월 10일과 1989년 3월 17일사이에 총 123명의 환자를 등록시켰다.
재조사시에, 한 환자가 AJCC 단계 II질병에 걸린것으로 밝혀졌기 때문에(양성 림프절은 전무)분석대상에 포함시키지 않았다. 투여받은 백신의 수에 관계없이 122명의 유자격 환자 모두를 본 분석에 포함시켜 무작위화하였다.(각 군에서 한명씩) 2명의 환자가 1회 면역접종후예 본 연구에서 탈퇴하기로 하였는데 그 이유는 그들에게 있어 실험요법과 무작위화의 불확실성에 대처하는 것이 너무 힘들었기 때문이었다. BCG군에 속하는 한 환자는 질병의 진행이 탐지되었을때 겨우 두번밖에 면역접종을 받지 않은 상태였고, 따라서 치료는 중단되었다. 다른 환자들은 모두 적어도 초기에 일련의 세번의 면역접종을 받았고 실험이 끝날때 까지 실험에 참여하거나 또는 질병이 진행될때까지 실험에 참여하였다. BCG군에 속하는 한 환자가 다섯번째의 백신주사에서 우연히 GM2/BCG를 주사받았다(이 환자는 GM2 항체를 생산하였고 계속하여 무병상태로 남았다). 메디안 추적검사는 예비 무작위화 외과술후 5년 3개월이며, 최소 추적검사는 4년 3개월이다. 상기의 122명의 무작위화원 환자들의 특징을 제8도에 나타내었다. 단계 III 흑색종을 가진 환자들의 단일의 가장 중요한 예후 징후 지표는 양성 림프절(3)의 수이다. 나쁜 예후와 관련된 다른 인자들은 두부와 목 또는 몸통을 1차 부위로 포함하고, 그리고 인트래지트 흑색종을 포함한다(3).
상기 CM2/BCG군 및 BCG군 및 BCG군들은 이들 예후징후 지표에 관하여 동등했다.
[표 8]
부작용
Cy로 예비 처치한 경우 가끔 가벼운 메스꺼움 또는 느글거림이 2-24시간동안 있었으나 대개는 잘 참았다. BCG를 피내 주사한 경우 세번내지 그 보다 많은 회수로 면역접종을 받은 모든 환자에게는 염증이 방생하고 농이 흐르면서 딱지가 형성되었다. 이 염증 반응을 허용 가능한 수준으로 유지하기 위하여, 딱지 형성이나 배농이 처음으로 발견되었을때, BCG의 투여량을 1/1000로 줄였다. 그 결과 최종 면역접종시의 메디안 BCG 투여량은 양 처리군에서 3 ×106생단위였다. 107단위의 투여량은·환자의 10%에서만 유지하였고, 그리고 일부 환자들은 투여량을 106단위로 추가로 줄일 필요가 있었다. GM2는 BCG에 대한 염증반응에 전혀 영향을 미치지 않았고 또한 부가적인 부작용을 전혀 일으키지 않았다.
GM2에 대한 혈청학적 반응
GM2/BCG에 의한 백신접종 전후의 연속적인 IgM 항-GM2 항체가가 전계열의 GM2/BCG면역 접종을 받은 첫번째로 처치된 5명의 환자(1987년)와 마지막으로 처치된 5명의 환자에 대해 제10도에 나와있다. 전의 연구에서와 마찬가지로(9), 항체 반응은 주로 IgM 타잎의 것이었고, 그리고 종종 매면역접종 후에 타이터의 증가를 보여주었으며 이 타이터 증가는 건망성 2차 반응(anti estic secondary response)이 아니고 반복성 1차 반응(repetitive primary response)를 닳았다. 또한 모든 환자의 면역접종-전혈청 및 피크 타이터의 면역접종후 혈청을 도트블로트 면역 염색으로 시험하여 ELISA에 의해 검출된 항체들의 특이성을 확인하였다. 제10도에 나타낸 혈청을 사용한 도트 블로트 면역염색이 제11도에 나와있다. 때로 전에 기술된 것처럼(8, 9) GM1에 대한 저-타이터의 전처리 반응성이 탐지되었다.
백신에 의해 유도된 반응성은 GM2로 국한되었고; GM3, GD2, GD1b 또는 GB3의 경우에는 반응성을 전혀 볼 수 없었다. GM2항체들은, 인간보체를 가지고 GM2 발현 종양세포에서 시험할때 보체의 존성 세포독성을 매개할 수 있었다(표 9). 환자가 증가한 2년간의 기간에 걸쳐 이 항체 반응 및 특이성의 패턴에는 아무런 변화가 없었다.
분석결과가 요약되어 있다. BCG팔의 64명의 환자중 7명이 ELISA(메디안 타이터 1/40) 및 도트블로트 면역 염색(메디안 2+) 양자에 의해 GM2항체를 발현하는 것으로 나타났다. 이 항체들은 5가지 경우에서는 미리 존재하고 있었고 2가지 경우에서는 BCG 백신 접종후에 처음으로 검출되었다. BCG 접종전에 GM2 항체를 보유한 5명의 환자중 3명에서는 BCG 접종후에 GM2 항체의 타이터가 4배 또는 그보다 높게 증가하였다. 이와 대조적으로, GM2/BCG를 투여받은 58명의 환자중 단 1명만이 면역접종전에 상기 양 분석에 의해 GM2 반응성을 나타내었고 그리고 58명의 환자중 50명이 면역접종후에 그들의 혈청에 GM2항체를 나타내었고(메디안 ELISA타이터 1/160), 이것은 도트 블로트 면역 염색법(메디안 타이터 3+)로도 확인되었다. 상기의 양군에서 전체적인 IgM항-GM2 혈청학적 반응율(2+ 또는 3+ 도트 블로트 및 ELISA 타이터 ≥ 1/20 또는 1+ 도트 블로트 및 ELISA 타이터 ≥ 1/80)은 BCG 단독의 경우에는 11%, GM2/BCG의 경우에는 86%였다.
면역접종전의 어떠한 환자의 혈청에서도 IgG 항체가 검출되지 않았고 BCG 면역접종에 의해 어느 환자에게서도 IgG 항체가 유도되지 않았다(표 10).
GM2/BCG메 의한 백신주사결과 8명의 환자에게서 양성 IgG 항체반응이 유도되었다(메디안 ELISA 타이터 1/80 메디안 도트 블로트 2+). 이들 반응은 수명이 짧았고(메디안 지속기간 8주)대개 추가로 면역접종해도 증가 하지 않았다. 모든 경우에 있어서 IgG 반응성은 GM2로 국한되었다(데이타 미제시). 또한 모두 8명의 환자에게서 IgG 항체보다 항체 타이터가 더 높고 수명이 더 긴 IgM 항체가 나타났다.
[표 9]
[표 10]
GM2에 대한 DTH 반응
초기 계열의 세번의 백신접종후예 GM2 및 다른 항원들에 대한 DTM의 피부시험을 행하였다. 세번 또는 그보다 많은 회수로 면역 주사를 받은 환자들은 모두 BCG에 대하여 강한 DTH 반응을 나타냈다. 8명의 환자들(BCG 백신접종을 받은 4명과 GM2/BCG 접종을 받은 4명의 환자들)이 GM2를 피부시험 부위에 존속시키기 위해 사용된 GM2 및 GM2 리포솜에 대해 양성 DTH 반응을 나타내었고 10에서 33mm의 경결을 나타내었다. 추가 시험결과 이들 8명의 환자는 갱글리오사이드가 없는 리포좀과 다른 갱글리오사이드에 대해 유사한 반응성을 보이는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 어느 환자에게서도 GM2 특이성 DTH에 대한 증거는 없었다.
BCG에 대한 혈청학적 반응
모든 환자의 혈청을 갱글리오사이드에 대해 기술한 바와같이 ELISA 플레이트상에 건조된 103개의 생유기체/웰 BCG에 대한 IgG ELISA반응성에 대하여 시험하였다. 백신 접종전 에는 전혀 반응성이 보이지 않았다. 백신 접종 후의 혈청은 양처치군에서, 환자들이 GM2 항체를 생산하든 그렇지 않든지에 관계없이, 1/40-l/80의 BCG 항체 타이터를 나타냈다.
항체 반응 및 면역접종과 무병(diseaase-free)간격 및 생존기간간의 상관관계
두가지 분석법(ELISA 타이터 ≥ 1/180과 도트블로트 1+ 또는 ELISA 타이터) 1/20과 도트블로트 ≥2+)으로 기록한 GM2 항체를 생산하는 모든 환자들에 대한 무병간격 및 총생존기간과 GM2 항체를 생산하지 않은 환자들의 그것들을 제12도에 비교하여 도시하였다. 무병간격 및 총생조니간 양자에서 상당한 차이가 나타났다(로그랭크시험에 의할 경우, 각각 P = 0.04 및 0.02). 면역접종전에 GM2 항체를 생산한 6명의 환자들(5명은 BCG 접종을 받았고 1명은 GM2/BCG 접종을 받았다), 단 1명(BCG군에 속하는 환자)만이 재발성 질병을 나타냈으며, 이는 흑색종을 가진 환자들에게서 자연적으로 GM2 항체가 생산되는 현상은 양호한 예후와 관련이 있다는 것을 암시한다.
반대로, GM2/BCG 백신 접종후에 GM2항체를 생산하지 않은 8명의 환자들중, 6명이 재발성 흑색종을 나타내어 죽었는데, 이는 백신접종후 GM2 항체를 생산하지 못하는 것은 예후가 불리하다는 것을 나타낸다는 것을 암시한다. 천연의 GM2항체를 생산하는 6명의 환자들의 메디안 BCG항체 타이터는 GM2/BCG 팔내의 8명의 GM2 항체-음성 환자들의 타이터와 같았는데, 이것은 이들 환자는 무관계한 항원에 대해 혈청학적 반응을 보일 능력에 있어서 다르지 않다는 것을 나타낸다.
무작위화전에 GM2 항체를 생산하는 6명의 환자들(BCG 팔에 5명, GM2/BCG팔에 한명)을 본 분석에서 배제했을때, GM2/BCG군의 무병간격은 BCG군의 그것보다 상당히 길였고(로그랭크 시험에 의할 경우 P = 0.02), 또한 GM2/BC7군에 대해 총생존기간이 더 길어지는 경향이 관찰되었다(제13도).
이 곡선들은 40-52달에 고평부에 달하고, 무병간적과 총 생존기간에 있어서 각기 23%와 14%의 차이를 나타낸다. 면역접종후에 GM2에 반음성인 IgG 항체를 생산하는 환자들의 수가 적어서 GM2에 대한 IgM과 IgG 항체의 상대적인 이점에 관하여 결혼을 이끌어내는 것은 볼 가능하다. IgG GM2 항체에 양성인 8명의 환자중 5명은 이 시점에 질병이 없는 채로 남아있다.
무작위화된 상기의 두 처치군을 제14도에 비교하여 도시하였다. 이 곡선들은 40 내지 52달에 고평부에 달하고 무병간격에서는 11% 차이를 보이고 총 생존기간에서는 11%의 차이를 보이는데, 이것은 GM2/BCG에 의한 백신접종을 지지한다. 이들 차이는 통계학적으로는 의미가 없었다. BCG군내에서 51월째에 무병간격(30%)과 총 생존기간(46%)율은 무작위로 BCG 접종을 하거나 아무런 처치도 하지 않은 환자들내에서 본 출원인들이 이보다 앞서 관찰한 비율에 유사하였다(28). 제14도에 도시된 것처럼, 상기 두 처치군을 양성질의 수로 분류했을때(1 대 2 또는 그 보다 큰 수)면역접종의 이 점이 뚜렷했다. 단 하나의 절만을 가진 환자들에서는 면역접종은 무병간절비율에 영향을 덜 끼쳤다. 이와 대조적으로, GM2/BCG를 투여받은 2 또는 그보다 많은 수의 양성절을 가진 환자들의 무병간격은 BSG만을 면역 접종한 환자들의 그것보다 상당히 길었다(로그랭크시험에 의할 경우 P = 0.02).
생존에 대해서도 유사한 경향이 관찰되었다(로그랭크시험에 의할 경우 P = 0.08).
디스커션
1) 갱글리오사이드는 흑색종 세포의 주요 세포표면 성분이고(14, 20-25),
2) 흑색종을 가진 환자로 부터 갱글리오사이드에 대해 특이성을 가진 인간 모노클로날 항체를 비교적 높은 빈도로 분리할 수 있고(14, 25-28) 그리고
3) 갱글리오사이드 항원을 발현하는 인간 종양세포를 인간 보체의 존재하에서 항-갱글리오사이드 항체로 용해할 수 있기 때문에(13, 79), 본 출원인들은 혈청항체를 높은 수준으로 유도하는 갱글리오사이드 백신을 개발하기 위해 상당한 노력을 경주하였다(18, 19). GM2 갱글리오사이드는 인간에게서 특히 면역원성이 있는 것으로 밝혀졌고, 그리고 GM2와 BCG를 아주반트로 함유하는 백신들은 저용량의 시클로포스파미드로 전처치한 흑색종 환자들에게서 GM2 항체를 유도하는 것으로 밝혀졌다(8, 9). 여기에 보고하는 연구는 다음의 두가지 문제, 즉, GM2/BCG백신을 접종하면 흑색종 환자에게서 높은 비율로 GM2 항체 생성이 유도되는가 하는 문제와 GM2 항체의 유도는 모든 알려진 종양을 완전히 절제해낸 후에 단계 III 흑색종을 가진 환자에게서 이 질병의 경로를 변화시키는가 하는 문제에 답하기 위한 것이다.
GM2 항체의 유도에 관하여 말하자면, GM2/BCG에 의한 면역은 대부분의 환자에게서 분명히 효과적이었다. GM2/BCG 백신을 투여받은 58명의 환자들 중, 50명이 ELISA와 도트블로트 면역 염색분석법으로 검출된 GM2 항체를 생산하였다.
앞서의 경험(9)에서와 마찬가지로, 유도된 GM2항체는 대개 IgM류였고, IgG 항체는 더 낮은 회수로 검출되었다. 또한 GM2 항체 생산과 더 유리한 임상경로사이의 상관관계(9)가 여기에서 확인되었고 더 균질적인 무병 AJCC 단계 III 흑색종 환자들의 집단으로 확장되었다(자연적으로 발생하는 형태의 것이든 아니면 백신에 의해 유도된 것이든)GM2 항체를 생산하는 환자들은 전혀 항체 반응을 나타내지 않은 환자들보다 상당히 더 긴 무병간격 및 총 생존을 보여주었다.(백신접종에 앞서)미리 존재하고 있던 GM2 항체는 이 계열의 6명의 환자에게서 관찰되었고 특히 양호한 예후와 관련된 것 같았다. 자연적인 GM2 항체 생성의 빈도는 전체 집단과 흑색종 환자에게서 비슷한 것 같고(10%), 이들과 흑색종 발달 및 성장과의 관계는 미지로 남아 있다. 미리 존재하고 있던 GM2 항체의 타이터는 9개월간의 추적 검사기간중 변하지 많은 반면, 백신에 의해 유도된 GM2 항체는 대개 면역접 종후 8-12주 동안만 검출가능한채 였다는 것은 주목할 만하다. 이러한 관찰 결과는 항체 생산의 지속이 양호한 임상결과에 중요할 수도 있다는 가능성을 제기하며 또한 오래동안 지속되는 GM2 항체 반응을 일으키는 GM2 백신을 개발할 필요성을 시사한다.
GM2 항체를 생산하는 백신접종을 받은 환자들과 달리, GM2/BCG로 면역 접종한 후 GM2 항체를 생산하지 않은 8명의 환자들은 특히 빠른 질병진행을 보였으며, 대개 환전한 계열의 5번의 면역접종전에 재발이 탐지되었다. 이 환자들에게서 다른 예후징후인자는 GM2 항체 양성 환자들에게서 보다 덜 유리하지도 않았고, 또 이 환자들의 BCG에 대한 항체 반응도 GM2 항체 양성 환자들에서 보다 멀 격렬하지도 않았으며, 이것은 일반 면역억압이 하부 기구가 아님을 암시한다.
여러 흑색종에 의해 발현되는 세포 표면 항원 시스템인, OFA-I로 명명된 항원의 연구(31)에서도 GM2 항체 생산과 예후의 개선사이의 관련성이 시사되었다.
OFA에 대한 항체 반응성은 주로 GM2 갱글리오사이드를 향한 것이라는 것을 나타내는 여러 증거들이 있다(30, 35). 미리존재하고 있거나 또는 방사선을 조사한 흑색종 세포로 면역조치한 후의 OFA-I에 대한 IgM 타이터가 증가된 환자들은 연장된 생존을 보여주었다(31).
흑색종을 가진 환자들에서 GM2 항체가 양호한 예후와 관련이 있다는 주장에 힘을 더 해주기는 하지만, 또한 본 연구는 무작위차편 백신시험을 디자인할 때 나타나는 문제들을 보여준다. GM2/BCG균의 1명의 환자와 반대로 대조군의 5명의 환자에게서의 미리 존재하는 GM2 항체 생산 및, GM2/BCG군의 8명의 백신접종을 받은 환자들에게서의 GM2 항체 반응의 결여는 GM2/BCG군에서의 치료-효과가 의미가 얼을 정도로까지 상기의 두개의 무작위 화된 처치군 사이의 경계를 무디게 하는데 기여하였다. 분명히, GM2에 대한 미리 존재하고 있는 항체들을 가진 환자들은 추후 연구에서는 배제하거나 적어도 분류할 필요가 있다. 똑같이 중요한 것은 이 백신의 면역원성을 증가시킬 필요성이다. 이점에 관해서는, 본 출원인들은 세균감염용 탄수화물 백신의 개발과정에서 성공적으로 사용되었던 접근법(32에 논평이 나와있다)을 사용하였으며, 이에는 밀접하게 관련된 콘게너(congener)를 생산하기 위한 갱글리오사이드의 화학적 수식(33, 34), 면역원성 단백질 담체와의 갱글리오사이드 컨쥬게이션(35), 및 더 강력한 아주반트의 사용(36)등이 포함된다.
본 출원인들은 GM2를 키홀 림페트 헤모시아닌(Keyhele Limpet Hemocyanin : KLH)와 컨쥬계이션하고 QS-21(사포나리아 퀼라자로 부터의 추출물)과의 GM2-KLH 컨쥬게이트를 아주반트로 투여하는 것이 가장 효과적인 접근법임을 알아내었다. 흑색종을 가진 환자들을 대상으로 한 예비실험에 의하면, 이 백신을 투여한 결과 IgM GM2 항체 타이터가 GM2/BCG후에 관찰된 것보다 훨씬 더 높았고, 더욱 더 중요하게는 IgG류에 속하는 GM2 항체가 안정적으로 생산되었고, 따라서 겉보기에 T-독립적 항체반음이 T-의존성 반응으로 전환되었다(37).
여기에서 기술한 GM2-BCG 백신의 임상적 유효도를 향상시키는 또 하나의 접근법은 이 백신에 면역원성 흑색종 갱글리오사이드를 추가로 삽입하는 것일 것이다. 마우스에서의 실험은 KLH와의 컨쥬게이션 및 QS-21 아주반트의 사용이 또한 지금까지 흑색종을 가진 환자들에게서 매우 낮은 면역원성을 보인 더 고수준으로 발현되는 흑색종 갱글리오사이드인 GD3(35)의 면역원성을 증폭시킨다는 것을 암시한다.
이들 관찰결과가 인간을 대상으로 한 연구에서 확연될 수 있다면, 본 출원인들은 여러개의 주요 흑색종 갱글리오사이드를 가진 다가 갱글리오사이드 핀쥬게이트 백신을 제조할 수 있는 기초를 갖게되고, 따라서 인간 흑색종에서 나타나는 갱글리오사이드 발현의 이질성을 극복할 수 있는 기초를 가질 수 있다. 본 출원인들은 여기에 보고하는 연구의 결과들이 이 접근법을 더 진척시키는 것을 정당화해 준다고 믿는 바이다.
Claims (22)
- a) (ⅰ)변환되지 않은 올리고당 부분 및 변환된 세라미드 부위를 포함하는 강글리오까이드 유도체, 및 (ii)면역원성 단백질계 담체의 접합체; b) 퀼라자 사포나리 아 몰리나(Quillaja saponaria hfolina) 나무의 수피로부터 유래가능한 사포닌; 및 c) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하며, 상기 접합체 및 사포닌의 상대량은 개체내에서 항체 형성을 자극하거나 증진시키기에 유효하며 , 상기 면역원성 단백질계 담체는 말라리아 T-세포 에피토프, 수막염균(Neisseria meningitidis)의 외막 단백질, 양이온화된 소 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole Limpet Hemocyanin) 또는 그의 유도체. 폴리리신 및 인간 혈청 알부민으로 이루어진 군에서 선택되는 단백질이며, 상기 접합체에서의 강글리오사이드 유도체는 면역원성 단백질계 담체로의 강글리오까이프 유도체의 세라미드-유래 탄소를 통해 면역원성 단백질계 담체에 접합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 세라미드 부위는 스핑고신 염기를 포함하며, 접합체에서의 강글리오사이드 유도체는 면역원성 단백질계 담체로의 강글리오사이드 유도체의 세라미드 부위의 스핑고신 염기의 C-4 탄소를 통해 면역원성 단백길계 담체에 접합되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 면역원성 단백질계 담체는 ε-아미노리실기이며, 상기 접합체에서 강글리오사이드 유도체는 면역원성 단백질계 담체의 ε-아미노리실기를 통해 면역원성 단백질계 담체에 접합되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물 .
- 제1항에 있어서, 상기 세라미드 부위는 스핑고신 염기를 포함하며, 상기 면역원성 단백질계 담체는 ε-아미노리실기를 가지며, 상기 접합체에서의 강글리오사이드 유도체는 면역원성 단백질계 담체의 ε-아미노리실기로의 강글리오사이드 유도체의 세라미드 부위의 스핑고신 염기의 C-4 탄소를 통해 면역원성 단백질계 담체를 접합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 퀼라자 사포나리아 몰리나 나무의 수피로부저 유래가능한 사포닌 유도체는 QS-21인 것을 특징으로 하는 조성물.
- a) (ⅰ)올리고당 및 (ⅱ)키홀 림펫 헤모시아닌의 접합체; b) 퀼라자 싸포나리아 몰리나 나무의 수피로부터 유래가능한 사포닌; 및 c) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하며, 상기 접합체 및 상기 사포닌의 상대량은 개체내에서 항체 형성을 자극하거나 증진시키기에 유효한 조성물.
- 제6항에 있어서 , 상기 퀼라자 사포나리아 몰리나 나무의 수피로부터 유래가능한 사포닌은 QS-21인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 강글리오사이드 유도체는 키홀 림펫 헤모시아닌과 집합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 강글리오사이드 유도체는 GM2, GM3, GD2, GD3, GD3 락톤, 0-아세틸 GD3 및 GT3로 이루어진 군으로부터 선택되는 강글리오사이드의 유도체인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 강글리오사이드 유도체는 GM2 또는 GD2의 유도체인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 강글리오사이드 유도체는 GM2의 유도체인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 강글리오사이드 유도체는 GD2의 유도체인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항 내지 제4항, 및 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접 상기 접합체의 양은 약 1㎍ 및 약 200㎍ 사이의 양인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 접합체의 양은 약 50㎍ 및 약 90㎍ 사이의 양인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제14항에 있어서, 상기 접합체의 양은 약 70㎍인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 접합체의 양은 약 1㎍ 및 약 10㎍ 사이의 양인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제16항에 있어서, 상기 접합체의 양은 약 7㎍인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항 내지 제4항, 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사포닌의 야은 약 10㎍ 및 약 200㎍ 사이의 양인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제18항에 있어서, 상기 사포닌의 양은 약 100㎍인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제18항에 있어서, 상기 사포닌의 양은 약 200㎍dls 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항 내지 제4항, 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 단백질계 담체에 대한 강글리오사이드 유도체의 몰비율은 약 200 및 약 1400 사이인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 키홀 림펫 헤모시아닌에 대한 올리고당의 몰비율은 약 200 내지 약 1400사이인 것을 특징으로 하는 조성물.
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