KR100301796B1 - 면역억제능이 있는 항-씨디40 리간드 모노클로날 항체 - Google Patents

면역억제능이 있는 항-씨디40 리간드 모노클로날 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인체 CD40 리간드(ligand)에 대해 특이성을 갖는 모노클로날 항체에 관한 것으로, 본 발명의 모노클로날 항체는 생체내에서 체액성 면역 반응을 장기적으로 억제하므로, 자가면역질환 및 알러지의 치료를 위한 면역억제적 키메라 또는 인간화 항-CD40L 항체를 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

면역억제능이 있는 항-씨디40 리간드 모노클로날 항체
T 세포는 B 세포의 분화를 위해 필요한 사이토카인을 분비할 뿐만 아니라 몇 쌍의 공자극성 분자(costimulatory molecules)를 통해 접촉-의존성 방식으로 B 세포를 활성화시킨다(Vercelli, D., et al.,J. Exp. Med., 169: 1295-1307(1989)). 이들 공자극성 분자사이의 상호작용은 적절한 면역 반응을 위해 매우 중요하며, 공자극성 분자들의 가장 중요한 쌍중 하나는 B 세포상의 CD40과 활성화된 T 세포상의 CD40 리간드(CD40L)로 이루어진 것이다(Armitage, R. J., et al.,Nature, 357: 80-82(1992); Noelle, R. J., et al.,Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89: 6550-6554(1992); Hollenbaugh, D., et al.,EMBO J., 11: 4313-4321(1992); Graf, D., et al.,Eur. J. Immunol., 22: 3191-3194(1992); 및 Fanslow, W., et al.,J. Immunol., 149: 655-660(1992)).
인체 CD40L은 일반적으로 30-39 kD의 분자량을 갖는 것으로 알려져 있다(Armitage, R. J., et al., 상기 문헌; Hollenbaugh, D., et al., 상기 문헌; Noelle, R. J. et al.,Immunol. Today, 13: 431-436(1992); 및 Yellin, M. J. et al.,J. Exp. Med., 182: 1857-1864(1995)). 활성화된 인체 말초 혈액 T 세포의 mRNA로부터 클론된 CD40L 단백질은 261개의 아미노산으로 이루어져 있고 이로부터 계산된 분자량은 29.3 kD 이다(Graf, D. et al.,Eur. J. Immunol., 22: 3191-3194(1992)). 구조적 특징에 있어서, CD40L은 활성화된 CD4+T 세포, 활성화된 비만 세포(mast cells) 및 호염기구(basophiles)상에 발현되는 타입 II 막 당단백질이지만, 세포내 아미노말단 꼬리(intracellular amino-terminal tail) 및 막통과 영역(transmembrane region)이 결여된 분비 형태로서도 역시 존재할 수 있다(Noelle, R. J., et al., 상기 문헌; Graf, D. et al., 상기 문헌; 및 Gauchat, J. F., et al.,Nature, 365: 340-343(1993)). 당단백질의 경우, 면역침강법(immunoprecipitation) 및 SDS-PAGE로 분석된 겉보기 분자량은 일반적으로 다양한 인자들에 의해 영향을 받는 당화(glycosylation) 상태 및 발현 형태에 따라 변한다. 최근의 연구에서, 인체 CD40L 분자는 정상적인 생리적 상태하에서 이종다중체성 복합체(heteromultimeric complexes)로서 존재하며, 이들 복합체는 전장 CD40L 및 이의 단편들로 구성되어 있다는 것이 보고되었다(Hsu, Y. M. et al.,J. Biol. Chem. 272: 911-915(1997)). 또한, 활성화된 혈소판이 CD40L을 발현하는 것으로 밝혀져 CD40L이 생체내에서(in vivo) 보다 다양한 기능을 가질 것으로 추측된다(Volker, H., et al.,Nature, 391: 591-594(1998)).
CD40L은 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor; TNF)군에 속하며, 그의 대향 수용체(counter-receptor)인 CD40은 종양 괴사 인자 수용체(tumor necrosis factor receptor; TNFR)군에 속한다(Stamenkovic, I., et al.,EMBO J., 8: 1403-1410(1989)). CD40은 B 세포, 단핵구(monocytes), 마크로파지(macrophages) 및 내피 세포(endothelial cells)에 상시적으로 존재한다(Stamenkovic, I., et al., 상기 문헌; 및 Galy, A.H.M. and Spits, H.,J. Immunol., 149: 775-782(1992)). B 세포상의 CD40에 모노클로날 항체(monoclonal antibody, MAb) 또는 CD40L이 결합하면 B 세포의 활성화, 증식, 응집 및 면역글로불린 이소타입 전환이 야기된다(Armitage, R. J., et al., 상기 문헌; Hollenbaugh, D., et al., 상기 문헌; Jabara, H.H., et al.,J. Exp. Med., 172: 1861-1864(1990); 및 Lane, P., et al.,J. Exp. Med., 177: 1209-1213(1993)). CD40/CD40L 상호작용의 기능적 중요성은 활성화된 T 세포에 의해 유도되는 B 세포의 폴리클로날 증식 및 면역글로불린 분비가 항-CD40L MAb에 의해 차단됨을 보여주는 연구들로부터 입증된다(Noelle, R. J., et al., 상기 문헌). 다른 연구에서, 항-CD40L MAb의 투여는 마우스에서 흉선-의존성 항원에 대한 1차 및 2차 항체 반응을 감소시켰다(Foy, T.M.,J. Exp. Med., 178: 1567-1575(1993)). 항-마우스 CD40L MAb의 면역억제 효과는 CD40L-발현 세포의 불활성화 또는 제거에 의해서가 아니라, CD40L-CD40 상호작용의 차단에 의해 매개된다는 것이 입증되었다.
T 및 B 세포 공자극(costimulation) 및 체액성 면역의 발생에 있어서 CD40/CD40L의 중요성은 분명하지만, 특히 인체내 시스템에서의 몇몇 문제들은 해결되지 않은채 남아 있다. 체액성 면역에서 CD40/CD40L이 수행하는 역할에 대한 유일한 인체내 연구는 흉선-의존성 체액성 면역 반응을 일으키지 못하는 것을 특징으로 하는 면역부전 질환인 과다-IgM 증후군(hyper-IgM syndrome, HIM)을 가진 환자를 연구한 것이다. HIM 환자는 CD40L의 기능에 결함을 가지고 있다(Allen, R.C., et al.,Science, 259: 990-993(1993); Aruffo, A., et al.,Cell, 72: 291-300(1993); 및 Disanto, J.P., et al.,Nature, 361: 541-543(1993)).
인체 면역 반응에 대한 연구는 비교적 제한적인 생체내(in vivo) 실험, 및 단기간의 연구만이 가능하고 소수의 항원에 대한 반응만이 재현되는 몇몇 생체외(in vitro) 시스템으로 한정되어 있다(Mosier, D. E., et al.,Nature, 335: 256-259(1988)). 인체 내에서의 연구는 실용적 문제 및 윤리적 문제들에 의해 제한되고, 생체외 연구로부터의 결론은 생체내의 상황을 반드시 그대로 반영하는 것은 아니다. 중증 복합 면역부전증(severe combined immunodeficiency; SCID) 마우스는 그의 면역부전증으로 인해 이식된 인체 세포를 수용할 수 있으므로 SCID 마우스에 인체 PBL을 이식하면 기능성 인체 면역 시스템의 안정적인 장기적 재구성이 가능하다. 따라서, SCID 마우스는 인체내 면역 반응을 조사하기 위한 매우 유용하고 간편한 수단으로서 사용될 수 있다. 이식된 인체 PBL은 마우스의 생체 환경을 이종으로 인식하고 이식편 대 피이식체(graft-versus host, GVH) 면역 반응을 활성화시킨다. 몇몇 기능성 인체 세포들은 이식후 적어도 20주 동안 생존하며, 재구성된 SCID 마우스는 자체내에서 인체 면역글로불린을 분비한다(Mosier, D. E. et al., 상기 문헌; 및 Yellin, M. J., et al.,J. Immunol., 153: 666-674(1994)).
본 발명자들은 인체 면역 반응에서 CD40L의 정확한 기능을 밝히고 원치않는 면역 반응을 조절하기 위한 면역억제제를 개발하기 위해 연구를 계속한 결과, 인체 CD40L에 특이성을 갖는 모노클로날 항체를 개발하고 그의 특성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 인체 CD40 리간드(ligand)에 대해 특이성을 갖는 모노클로날 항체를 제공하는 것이다.
도 1a 내지 1d는 PMA(phorbol-13-myristate-12-acetate)와 이오노마이신(ionomycin)으로 활성화된 인체 말초 혈액 T 세포에 대한 본 발명의 모노클로날 항체(MAb 2B2)의 결합을 나타낸 것이다.
도 2a 및 2b는 PMA와 이오노마이신으로 활성화된 인체 T 세포 종양 주르캣(Jurkat) 세포에 대한 MAb 2B2의 결합을 나타낸 것이다.
도 3은 활성화된 인체 말초 혈액 임파구(PBL)상의 35 kD 및 28 kD 단백질에 대한 MAb 2B2의 결합을 SDS-PAGE로 확인한 것이다.
도 4a 내지 4c는 MAb 2B2가 중증 복합 면역부전증(SCID)/인체 말초 혈액 임파구(hu-PBL) 키메라형 마우스에서 인체 말초 혈액 임파구의 인체 IgG 생산을 강하게 억제하는 것을 확인한 결과이다.
도 5a 및 5b는 MAb 2B2의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 및 그로부터 추론된 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
본 발명에서는 인체 CD40 리간드(CD40L)에 대해 특이성을 갖는, MAb 2B2로 명명된 마우스의 모노클로날 항체가 제공된다.
MAb 2B2는 SCID 마우스에 이식된 인체 B 세포의 IgG 생산을 강하게 억제하며, 면역침강법에 따른 분석에서 PMA(phorbol-13-myristate-12-acetate) 및 이오노마이신으로 자극된 인체 말초 혈액 임파구(PBL) 상의 분자량 35 kD 및 28 kD인 단백질을 면역침강시킨다.
MAb 2B2의 중쇄 가변 영역(VH) 유전자는 하기 서열 1의 염기 서열을 갖고, 112개 아미노산으로 이루어진 전형적인 마우스 면역글로불린 VH영역(염기 번호 1 내지 336) 및 11개 아미노산으로 이루어진 중쇄 불변 영역의 일부(염기 번호 337 내지 369)를 코드하며, 서브그룹 III(D)에 속한다:
GAG GTG ATG GTG GTG GAA TCT GGA GGA GGC TTA GTG AAG CCT GGA 45
GGG TCC CTG AAA CTC TCC TGT GCA GTC TCT GGA TTC ACT TTC AGT 90
CGC TAC GCC ATG TCT TGG GTT CGC CAG ACT CCG GAG AAG GGG CTG 135
GAG TGG GTC GCG ACC ATT AGT AGT GGT GGT AGT TAC ATC TAC TAT 180
CCA GAC AGT GTG AAG GGG CGA TTC ACC ATC TTC AGA GAC AAT GCC 225
AAG AAC ACC CTG TAC CTG CAA ATG AGC AGT CTG AGG TCT GAG GAC 270
ACG GCC ATG TAT TAC TGT GCA GGG GTG GAC TCC TGG GGT CAA GGA 315
ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA GCC AAA ACG ACA CCC CCA TCT GTC 360
TAT CCA CTG 369
상기 서열 1의 염기서열로부터 추론된 아미노산 서열은 다음의 서열 2와 같다:
Glu Val Met Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly 15
Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser 30
Arg Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Gly Leu 45
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr 60
Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 90
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Gly Val Asp Ser Trp Gly Gln Gly 105
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val 120
Tyr Pro Leu 123
또한, MAb 2B2의 경쇄 가변 영역(VL) 유전자는 하기 서열 3의 염기 서열을 갖고, 112 개 아미노산으로 이루어진 전형적인 마우스 면역글로불린 VL영역(서열번호 1 내지 336) 및 14개 아미노산으로 이루어진 경쇄 불변 영역의 일부(서열번호 337 내지 378)를 코드하며, 서브그룹 V에 속한다:
GAC ATT GTG ATG ACT CAG ACT CCA CTC ACT TTG TCG GTT ACC ATT 45
GGA CAA CCA GCC TCC ATT TCT TGC AAG TCA AGT CAG AGC CTC TTA 90
GAT AGT GAT GGA AAG ACA TAT TTG AAT TGG TTG TTA CAG AGG CCA 135
GGC CAG TCT CCA AAG CGC CTA ATC TAT CTG GTG TCT AAA CTG GAC 180
TCT GGA GTT CCT GAC AGG TTC ACT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT 225
TTC ACA CTG AAA ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT TTG GGA GTT 270
TAT TAT TGC TGG CAA GGT ACA CAT TTT CCT CAG ACG TTC GGT GGA 315
GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT GTA 360
TCC ATC TTC CCA CCA TCC 378
상기 서열 3의 염기서열로부터 추론된 아미노산 서열은 다음의 서열 4와 같다:
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile 15
Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu 30
Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro 45
Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp 60
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 75
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val 90
Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly 105
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val 120
Ser Ile Phe Pro Pro Ser 126
인체 CD40L에 대한 모노클로날 항체 MAb 2B2는 인체 CD40L과 인체 IgG1의 Fc 영역의 융합단백질(CD40L-Fc)을 면역원으로 사용하여 통상적인 모노클로날 항체 제조 방법에 따라 제조할 수 있다. 즉, CD40L-Fc 융합단백질을 마우스에 주사하여 마우스를 면역시키고, 면역된 마우스의 비장 세포를 SP2/0와 같은 골수종(myeloma) 세포와 융합시킨 후 하이브리도마 세포를 선별하고 이를 배양함으로써 인체 CD40L에 대한 모노클로날 항체를 얻을 수 있다. 본 발명자들에 의해 제조된, 인체 CD40L에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포 2B2는 1998년 9월 17일자로 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁번호 제 KCTC 0522BP호로서 기탁되었다.
MAb 2B2는 이를 투여함으로써 장기적으로 생체내에서 체액성 면역 반응을 억제할 수 있으므로, 자가면역 질환 및 알러지를 치료하기 위한 면역억제성의 키메라 또는 인간화 항-CD40L 항체를 개발하기 위해 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명을 실시예 및 참조예에 의거하여 설명하면 다음과 같다. 하기 실시예 및 참조예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명이 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
참조예: SCID/hu-PBL 키메라 마우스의 제조
(1) SCID 마우스
6주령의 암컷 CB-17/IcrCR1scid/scid마우스를 찰스 리버 연구소(Charles River Laboratory, Japan)로부터 구입하였다. SCID 마우스를 멸균 마이크로아이솔레이터 우리(Techniplast, Italy)에 넣었다. 모든 사료, 음료 및 깔짚 등은 사용전에 오토클레이브로 멸균하였으며, 모든 조작은 무균작업대(laminar flow hood)에서 수행하였다.
(2) SCID 마우스에 대한 인체 PBL 이식 및 항체 처리
건강한 사람의 말초 혈액으로부터 피콜-하이파크 농도구배 원심분리에 의해 인체 PBL을 분리하였다. 인체 PBL을 멸균 PBS로 3회 세척하고, 1×108/㎖로 PBS에 재현탁시킨 후, 마우스당 5×107PBL을 즉시 복강내 주사하여 SCID/hu-PBL 키메라 마우스를 제조하였다.
실시예 1: 항-CD40L 모노클로날 항체의 생산
(단계 1) 가용성 CD40L-Fc 단백질의 제조
CD40L의 세포외 도메인을 코드하는 cDNA 분절을 인체 IgG1의 힌지(hinge), CH2 및 CH3 도메인을 코드하는 게놈 DNA 분절의 3'-말단에 유전학적으로 융합시킴으로써 가용성 인체 CD40L-면역글로불린 Fc 영역 융합 단백질(CD40L-Fc)을 제조하였다. 구체적으로, 문헌(Graf, D., et al., "Cloning of TRAP, a Ligand for CD40 on Human T Cells",Eur. J. Immunol.,22(12), 3191-3194(1992))에 기술된 바에 따라 PCR 방법으로 제조된 CD40L cDNA를 CD5 시그날 리더 서열 및 인체 IgG1 Fc 도메인-코딩 서열을 포함하는 진핵세포 발현 벡터인 pCDM-SPEG1(미국 보스턴의 Messachusettes General Hospital의 Brian Seed 박사로부터 얻음)에 클로닝하였다. 제작된 플라스미드를 DEAE-덱스트란 방법(Sambrook et al.,Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA, 1989)에 의해 COSm6 세포(상기한 Brian Seed 박사로부터 얻음)에 일시적으로 형질감염(transfection)시켰다. 원심분리에 의해 CD40L-Fc 융합 단백질을 포함하는 상층액을 모으고, 프로틴G-세파로즈(ProteinG-sepharose) 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden).
(단계 2) 항-CD40L 모노클로날 항체의 생산
달리 언급되지 않는 한 모든 세포 배양 배지 및 보충물은 Gibco BRL(Tsuen Wan, Hong Kong)로부터 구입하였다. 모든 세포는 달리 언급되지 않는 한 10% 열-불활성화된 우태아 혈청(FBS), 100 U/㎖ 페니실린, 및 0.1 ㎎/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 5주령의 암컷 BALB/c 마우스(Charles River Laboratory, Osaka, Japan)를 (단계 1)에서 제조된 CD40L-Fc 단백질을 3회 복강내 주사함으로써 면역시켰다. 1차 면역에는 프로인트 완전 보조액(Complete Freund's Adjuvant, Sigma Chemical Co, St Louis, U.S.A)을 사용하였고, 2차 및 3차 면역에는 프로인트 불완전 보조액(Incomplete Freund's Adjuvant, Sigma)을 사용하였다.
3차 주사 3일 후, 면역된 마우스의 비장세포(splenocytes)를 Galfre, G. 등에 의해 개시된 방법(Nature, 266: 550-552(1977))에 따라 SP2/0 세포와 융합시켰다. 생성된 하이브리도마 세포들을 효소면역측정법(ELISA) 및 유동세포분석법(flow cytometry)에 의해 조사하고, 양성 클론들을 2회 서브클론하였다. 마우스의 복수로부터 CD40L에 대해 특이성을 갖는 항체를 프로틴A-세파로즈(ProteinA-sepharose) CL-4B (Pharmacia) 친화성 크로마토그래피로 정제하여 MAb 2B2로 명명하였다.
또한, MAb 2B2를 생산하는 하이브리도마 세포 2B2를 1998년 9월 17일자로 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁번호 제 KCTC 0522BP호로서 기탁하였다.
실시예 2: 항-CD40L 모노클로날 항체의 특성 확인
(단계 1) 효소면역측정법(ELISA)
항-CD40L 모노클로날 항체를 검출하기 위해, 맥시솝 면역평판(Maxisorp Immunoplate, Nunc InterMed, Denmark)을 0.1㎖의 2㎍/㎖ CD40L-Fc 단백질 또는 인체 IgG로 4℃에서 하룻밤동안 피복하였다. 피복된 면역평판을 1% BSA 용액으로 차단한 후, 하이브리도마 배양 배지(10% 열-불활성화된 FBS, 100 U/㎖ 페니실린, 0.1 ㎎/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 배지)를 웰당 100㎕씩 가하였다. 면역평판을 실온에서 2시간 동안 배양하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하였다. 100 ng/㎖의 알칼라인 포스파타제-표지된 염소 항-마우스 Ig를 각 웰에 가하고 면역평판을 실온에서 2시간 동안 배양하였다. PBS로 세척하고, ρ-니트로페닐 포스페이트를 웰에 가한 후, 405 nm에서 광학밀도(O.D.)를 측정하였다.
SCID 마우스의 혈청중 인체 IgG의 농도를 측정하기 위해, 맥시솝 면역평판을 0.1㎖의 2㎍/㎖ 염소 항-인체 IgG로 피복하였다. 피복된 웰을 1% BSA 용액으로 차단한 후, 희석된 SCID 마우스 혈청(참조예에서 제조된 SCID/hu-PBL 키메라 마우스에서 채혈하여 얻은 것)을 웰당 100㎕씩 가하였다. 이후의 절차들은 알칼라인 포스파타제-표지된 염소 항-마우스 Ig 대신에 알칼라인 포스파타제-표지된 염소 항-인간 IgG를 사용하는 것을 제외하고는 CD40L-특이적 모노클로날 항체를 선별하기 위한 상기 절차와 동일하게 진행하였다. 인체 세포에 결합력이 없고 면역 억제효과를 갖지 않는, HIV gp120에 특이성을 갖는 마우스 모노클로날 항체인 MAG 49(Kang, C. Y. et al.,J. virol., 68: 5854-5862(1994))를 음성 대조군으로서 사용하였다.
실시예 1에서 제조된 MAb 2B2는 CD40L-Fc 단백질의 Fc 부분 또는 CD40L 부분에 결합할 것으로 예상되었으며, 이를 확인하기 위한 상기 ELISA 결과는 다음의 표 1에 나타나 있다.
CD40L-Fc에 대한 MAb 2B2의 특이적 결합 활성
항체(0.1㎍/㎖) 결합 활성(OD 405 nm)
CD40L-Fc 인체 IgG
2B2 0.730 0.092
MAG49 0.074 0.043
상기 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, MAb 2B2는 상당한 친화도로 CD40L-Fc에 결합하였으나, 인체 IgG에는 결합하지 않았다. 이 결과는 MAb 2B2가 CD40L-Fc에 특이적으로 결합한다는 것을 보여준다.
(단계 2) 유동세포분석법(flow cytometry)
MAb 2B2는 비-천연 형태의 항원을 이용하여 생성된 것이므로, MAb 2B2가 활성화된 T 세포상의 천연 CD40L 분자에 결합하는지를 확인하기 위해 다음과 같이 FACStarplus유동세포분석기(Beckton Dickinson Immunocytometry Systems, CA, USA)를 사용하여 유동세포분석법을 실시하였다.
활성화된 CD4＋or CD8＋T 세포에 결합하는 MAb 2B2의 2색 분석을 위해, 건강한 사람의 말초혈액으로부터 피콜-하이파크 농도구배 원심분리(Ficoll-Hypaque gradient centrifugation)에 의해 분리된 인체 PBL을 20 ng/㎖ PMA(Sigma) 및 0.5μM 이오노마이신(Sigma)으로 37℃에서 6 시간 동안 자극하였다. 활성화된 PBL을 수집하고, 염색 완충액(PBS, 0.02% NaN3, 및 1% BSA)으로 세척하고, MAb 2B2 및 염소 항-마우스 IgG-피코에리트린(phycoerythrin, PE)으로 염색하였다. 그 후, 세포를 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC)-표지된 항-인체 CD4 모노클로날 항체 또는 항-인체 CD8-FITC 모노클로날 항체로 이중 염색하고, 1% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 용액으로 고정시켰다. 염색된 세포는 염색 후 12 시간내에 분석하였다.
활성화된 인체 T 세포 종양 주르캣(Jurkat) 세포(ATCC TIB-152)상의 CD40L 분자에 대한 MAb 2B2의 결합양상을 분석하기 위해, 20 ng/㎖ PMA 및 0.5μM 이오노마이신으로 자극된 주르캣 세포를 자극 후 0 및 6 시간에 수집하였다. 세포를 염색 완충액으로 세척하고, MAb 2B2와 4℃에서 1시간 동안 배양하고, 다시 세척한 후, 항-마우스 IgG-FITC로 염색하였다. 염색된 세포를 세척하고, 고정시키고 4℃에서 분석시까지 저장하였다. 염색된 세포는 염색 후 12 시간내에 분석하였다.
그 결과, MAb 2B2는 PMA 및 이오노마이신에 의해 활성화된 인체 CD4＋T 세포 상당수에 결합하였지만, 활성화된 CD8＋T 세포에는 단지 소수에만 결합하였다(도 1a 내지 1d).
또한, MAb 2B2는 PMA 및 이오노마이신으로 자극된 주르캣 세포에 결합하였지만, 자극되지 않은 주르캣 세포에는 결합하지 않았다(도 2a 및 2b).
(단계 3) 면역침강법(immunoprecipitation)
인체 PBL을 500μCi/㎖35S-메티오닌(Amersham Life Science, Buckinghamshire, England), 20 ng/㎖ PMA, 0.5μM 이오노마이신, 5 % 투석된 FBS, 100 U/㎖ 페니실린, 및 0.1 ㎎/㎖ 스트렙토마이신이 함유된 37℃의 메티오닌-결핍 RPMI 1640 배지에 5×107세포/㎖로 현탁시켰다. 표지된 PBL을 PBS로 1회 세척하고, 0.6 ㎖ 용해 완충액(0.01M Tris·Cl, 0.14M NaCl, 0.02M NaN3, 1% Triton X-100, 0.2 U/㎖ aprotinin, 1 mM PMSF, 및 0.1% BSA)에 재현탁시킨 다음, 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
세포 용해물을 3,000×g로 10분 동안 원심분리한 후, 상층액을 10,000×g로 30 분동안 다시 원심분리하여 단백질 분획을 수집하였다. 예비세정을 위해, 단백질 용액을 30㎕의 프로틴G-세파로즈 현탁액과 함께 4℃에서 4 시간 동안 반응시켰다. 동시에, 15 ㎍ MAb 2B2를 30㎕의 프로틴G-세파로즈 슬러리와 함께 4℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 예비세정된 단백질 용액을 MAb 2B2-프로틴G-세파로즈 겔과 함께 4℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 면역침강물을 세척하고, 여기에 SDS 로딩(loading) 완충액(100 mM Tris·Cl, 4% 소듐 도데실 설페이트, 0.2% 브로모페놀 블루, 20% 글리세롤) 10㎕를 가한 후, 100℃에서 5 분 동안 끓였다. 면역침강물을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하고 자가방사기록법(autoradiography)으로 검출하였다.
그 결과, 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, MAb 2B2는 PMA 및 이오노마이신으로 자극된 인체 PBL 상에는 나타나지만 자극되지 않은 인체 PBL에는 나타나지 않는 분자량 35kD 및 28kD인 단백질을 침강시켰다. 이러한 35 kD 단백질은 완전한 CD40L 단백질의 모노머 형태로 추정되고, 28 kD 단백질은 MAb 2B2 결합과 관련되지 않은 영역이 결여된 불완전한 CD40L 단백질로 추정된다.
본 실시예의 결과는 MAb 2B2가 활성화된 인체 CD4＋T 세포 및 주르캣 세포상에 발현된 천연형의 CD40L 분자에 실제로 결합한다는 것을 나타낸다.
실시예 3: SCID/hu-PBL 키메라 마우스에서 인체 PBL의 체액성 면역 반응에 대한 MAb 2B2의 억제 작용
인체 면역 반응에서 MAb 2B2의 생물학적 효과를 확인하기 위해, 참조예와 같이 SCID/hu-PBL 키메라 마우스 모델을 확립하고, 생체 내에서 CD40L의 기능을 조사하기 위해 T 세포-의존성 항체 생산을 확인하였다.
즉, 참조예와 같이 SCID/hu-PBL 키메라 마우스를 제조하되, 항-인체 CD40L MAb 2B2, 항-인체 CD4 MAb 1F3 및 대조군 MAb MAG 49를 마우스당 0.5 ㎎의 투여량으로 PBL 이식전 2일(-2일), PBL 이식후 13일(13일) 및 27일(27일)에 동등하게 복강내 주사하였다. MAb 1F3(Newman, R. et al.,Biotechnology, 10: 1455-1460(1992))는 항-인체 CD4 항체로서 면역억제제로서 사용되었고, HIV gp120에 특이성을 갖는 MAb MAG 49(Kang, C. Y. et al.,J. virol., 68: 5854-5862(1994))는 음성 대조군으로서 사용되었다. SCID/hu-PBL 키메라 마우스의 혈청중 인체 Ig를 정량하기 위하여, 3일, 17일 및 33일에 마우스의 안와동(orbital sinus)으로부터 말초 혈액 시료를 채취한 후, ELISA에 의해 분석하였다.
그 결과, MAb 2B2는 SCID 마우스에 이식된 인체 임파구의 인체 IgG 생산을 강하게 억제하였다(도 4a 및 4b). PBL 이식 후 3일에, SCID 마우스에서의 인체 IgG 농도는 모든 처리군에서 매우 낮았다(도 4a). 이식 후 17일에, 이식된 인체 세포는 상당량의 인체 IgG를 생산하였으며, MAb 2B2는 인체 IgG 생산을 강하게 억제하였다(도 4b). 이러한 면역억제 효과는 적어도 33일까지 지속되었고(도 4c), MAb 2B2의 면역억제효과는 MAb 1F3과 동등하였다(도 4b, 4c). PBL 이식 후 3일에 SCID 마우스에서 인체 IgG 농도가 매우 낮았다는 사실은 이후 17일 및 33일에 검출된 인체 면역글로불린이 인체 세포의 예비 활성화(pre-activation)에 의한 것이 아니라, SCID 마우스에 이식된 후의 인체 세포들에 의한 면역반응의 결과임을 의미한다.
MAb 2B2 처리는 또한 이식된 인체 세포의 IgM 생산도 억제하였고, 이러한 면역억제 효과 역시 적어도 33일까지 지속되었다.
따라서, MAb 2B2가 활성화된 T 세포의 기능을 효과적으로 억제하여 인체 면역글로불린의 생산을 극적으로 감소시킴을 알 수 있다.
실시예 4: DNA 서열 분석
1×1082B2 하이브리도마 세포로부터 구아니듐 이소티오시아네이트(guanidium isothiocyanate)-CsCl 구배법(Chirgwinet al.,Biochemistry,18, 5294(1979))에 의해 총 RNA를 분리하였다. RNA 펠릿(pellet)을 디에틸피로카보네이트(diethylpyrocarbonate)로 처리된 물에 용해시키고 RNase-결핍 DNase (Boehringer-Mannheim Co, Germany)로 처리하였다. 퀵프렙 마이크로(QuickPrep Micro) mRNA 정제 키트(Pharmacia)를 사용하여 mRNA를 단리하였다. 바이오니어사(Bioneer, Inc.)에 의해 제작된 하기 표 2 기재의 Cγ 프라이머 또는 Cκ 프라이머 및 슈퍼스크립트(SuperscriptTMII) RNase H-역전사효소(Gibco BRL)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 mRNA로부터 cDNA를 제조하고, 이를 페놀/클로로포름으로 추출한 후 에탄올 침전에 의해 정제하였다.
2B2 VH 및 VL유전자의 클로닝에 사용된 프라이머
이름 서열(5'→3') 그룹
Cγ CCA GTG GAT AGA C(C/A/T)G ATG GGG(G/C)TG T(T/C)G TTT GGC IgG γ중쇄,불변영역
Cκ GGA TGG TGG GAA GAT GGA TAC AGT TGGTGC IgG 중쇄 N-말단,그룹 Ⅲ A,C,D*
N4 GAC ATT GTG ATG (T/A)C(T/A) CAG TCT CCA IgG 경쇄 N-말단,그룹 Ⅰ*
N5 GAY ATC CAG ATG AC(C/A) CA(G/A) (A/T)CT(C/A)CA TCY IgG 경쇄 N-말단,그룹 Ⅴ*
N6 (G/A)A(C/A) ATT GTG CTG AC(C/A) CA(G/A)TCT CC(T/A) IgG 경쇄 N-말단,그룹 Ⅴ*
N7 (G/C)AG GTG CAG CT(T/G) (C/A)AG GAG TCAGGA IgG 경쇄 N-말단,그룹 Ⅲ*
HN1 (G/C)AG GTG CAG CT(T/G) (C/A)AG GAG TCAGGA IgG 중쇄 N-말단,그룹 IB,ⅡA*
HN2 (G/C)AG GT(C/T) CA(G/A) CTG CA(G/A) CAG(T/C)CT GG IgG 중쇄 N-말단,그룹 ⅡA,B,C,ⅤA*
HN3 GA(G/A) GTG (A/C)AG CT(C/G) GTG GA(G/A)TCT GGA IgG 중쇄 N-말단,그룹 ⅢA,C,D*
HN4 GAG GTG AAG CTT CTC GAG TCT GGA IgG 중쇄 N-말단,그룹 ⅢB*
*Kabat 등에 의해 기술된 마우스 카파쇄 그룹을 나타냄.
VH유전자의 cDNA는 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 증폭시켰다. PCR용 프라이머로서는 γ쇄 유전자의 불변영역(Cγ)의 서열에 상보적인 Cγ 프라이머, 및 Cγ 쇄의 N-말단의 DNA 서열에 상보적인 HN1 내지 HN4 프라이머를 사용하였다. PCR 증폭 후, 약 369 염기쌍의 DNA 단편을 얻었다.
VL유전자의 cDNA는 VH유전자의 경우와 같은 조건하에 35 사이클동안 증폭되었다. PCR 프라이머로서는 프라이머, 및 Cκ 쇄의 N-말단의 DNA 서열에 상보적인 N4 내지 N7 프라이머를 사용하였다. PCR 증폭 후, 약 380 염기쌍의 DNA 단편을 얻었다.
PCR 산물들을 pGEM-T 벡터(Promega Biotec, Madison, WI, U.S.A)에 클로닝하고, 시쿼네이즈 2.0 시약 키트(Sequenase version 2.0 reagent Kit, Amersham)를 사용하여 디데옥시 사슬 종결법(dideoxy chain termination method)에 의해 서열을 분석하였다. DNA 서열은 PCGENE 소프트웨어 및 문헌(Kabat, E. A., et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed., U. S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892, 1991)의 방법을 사용하여 분석하였다.
그 결과, 369 bp의 VHDNA 단편의 서열분석 결과로부터 추론된 아미노산 서열은, 모든 보존된 아미노산 잔기를 포함하면서, 전형적인 마우스 VH영역(112 아미노산) 및 중쇄 불변영역의 일부를 나타내었다(도 5a). MAb 2B2 VH영역의 아미노산 서열을 열 개의 마우스 VH그룹의 서열과 비교한 결과, 2B2의 VH절편은 서브그룹 III(D)에 속하는 것으로 밝혀졌다.
상류(upstream)의 프라이머 Cκ 및 하류(downstream)의 프라이머 N4 또는 N7을 사용하여 VLcDNA로부터 생성된 PCR 산물들은 아가로즈 겔 상에서 약 380 bp의 DNA 밴드를 나타내었으며, 두 PCR 산물의 서열분석 결과, N4 또는 N7 프라이머를 사용한 PCR로부터 얻은 DNA 단편은 378 bp 였으며, 서로 동일하였다. VLDNA 단편으로부터 추론된 아미노산 서열은 마우스 면역글로불린 VL영역의 모든 구조(112 아미노산) 및 경쇄 불변영역의 일부(14 아미노산)를 나타내었다(도 5b). 상기 MAb 2B2의 VL절편들은 서브그룹 V에 속한다.
MAb 2B2의 VH및 VL유전자는 N-말단의 프라이머를 사용한 PCR에 의해 클로닝되었으므로, 이 유전자들의 처음 24 뉴클레오티드는 프라이머로부터 유래된 것으로서 진짜가 아닐 수도 있다. 따라서, 아미노산 서열분석에 의해 MAb 2B2의 처음 8개 아미노산 잔기의 서열을 확인한 결과, 뉴클레오티드 서열로부터 추론된 아미노산 서열과 일치하는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 모노클로날 항체는 생체내에서 체액성 면역 반응을 장기적으로 억제하므로, 자가면역질환 및 알러지의 치료를 위한 면역억제적 키메라 또는 인간화 항-CD40L 항체를 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (2)

  1. 하기 서열 1의 염기서열에 의해 코드되는 중쇄 가변영역 및 서열 3의 염기서열에 의해 코드되는 경쇄 가변영역을 갖는, 인체 CD40 리간드(ligand)에 대해 특이성을 갖는 마우스 모노클로날 항체:
    서열 1
    GAG GTG ATG GTG GTG GAA TCT GGA GGA GGC TTA GTG AAG CCT GGA 45
    GGG TCC CTG AAA CTC TCC TGT GCA GTC TCT GGA TTC ACT TTC AGT 90
    CGC TAC GCC ATG TCT TGG GTT CGC CAG ACT CCG GAG AAG GGG CTG 135
    GAG TGG GTC GCG ACC ATT AGT AGT GGT GGT AGT TAC ATC TAC TAT 180
    CCA GAC AGT GTG AAG GGG CGA TTC ACC ATC TTC AGA GAC AAT GCC 225
    AAG AAC ACC CTG TAC CTG CAA ATG AGC AGT CTG AGG TCT GAG GAC 270
    ACG GCC ATG TAT TAC TGT GCA GGG GTG GAC TCC TGG GGT CAA GGA 315
    ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA GCC AAA ACG ACA CCC CCA TCT GTC 360
    TAT CCA CTG 369
    서열 3
    GAC ATT GTG ATG ACT CAG ACT CCA CTC ACT TTG TCG GTT ACC ATT 45
    GGA CAA CCA GCC TCC ATT TCT TGC AAG TCA AGT CAG AGC CTC TTA 90
    GAT AGT GAT GGA AAG ACA TAT TTG AAT TGG TTG TTA CAG AGG CCA 135
    GGC CAG TCT CCA AAG CGC CTA ATC TAT CTG GTG TCT AAA CTG GAC 180
    TCT GGA GTT CCT GAC AGG TTC ACT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT 225
    TTC ACA CTG AAA ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT TTG GGA GTT 270
    TAT TAT TGC TGG CAA GGT ACA CAT TTT CCT CAG ACG TTC GGT GGA 315
    GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT GTA 360
    TCC ATC TTC CCA CCA TCC 378
  2. 제1항에 있어서,
    하이브리도마 세포 2B2(KCTC 0522BP)에 의해 생산되는 것임을 특징으로 하는 모노클로날 항체.
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