JP3308534B2 - 新規なサイトカイン - Google Patents

新規なサイトカイン

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は、新規なサイトカイン（cytokine）に関す
る。より具体的には、本発明は、ヒトCD40に結合し、ア
ゴニスト及びアンタゴニスト活性の両方を有する可溶性
で膜結合型のマウス及びヒトサイトカインのクローニン
グに関する。
発明の背景 “インターロイキン”の呼称を有するサイトカイン
は、免疫エフェクター細胞に影響を及ぼすタンパク質因
子である。インターロイキン−１からインターロイキン
−12までで呼ばれているサイトカインが報告されてお
り、インターロイキンと命名されている。他の既知のサ
イトカインには、腫瘍壊死因子（TNF）、顆粒球−マク
ロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）、顆粒球コロ
ニー刺激因子（Ｇ−CSF）、マスト細胞成長因子（MG
F）、表皮成長因子（EGF）、血小板由来成長因子（PDG
F）、神経成長因子（NGF）、エリスロポイエチン（EP
O）、γ−インターフェロン（γ−IFN）等が含まれる。
２種の異なるTNFレセプター（タイプＩ及びタイプI
I）のDNAがクローン化されている（スミス（Smith）ら,
Science 248:1019,1990;及びシャル（Schall）ら,Cell
61:361,1990）。両方の型のTNFレセプターは互いに関連
していて、そのメンバーに神経成長因子レセプター（ジ
ョンソン（Johnson）ら,Cell 47:545,1986）、Ｂ細胞抗
原CD40（スタメンコビック（Stamenkovic）ら,EMBO J.
8:1403,1989）、Ｔ細胞抗原OX40（マレット（Mallett）
ら,EMBO J.9:1063,1990）、ヒトFas抗原（イトウ（Ito
h）ら,Cell 66:233,1991）及びマウス４−1BBレセプタ
ー（クォン（Kwon）ら,Cell Immunol.121:414,1989〔ク
ォンらＩ〕及びクォンら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1
963,1989〔クォンらII〕）が含まれるレセプターのファ
ミリーに属している。
ヒトCD40タンパク質（CD40）は、30,600の分子量、及
び疎水性アミノ酸を主として含む19アミノ酸分泌シグナ
ルペプチドを有する277アミノ酸のペプチドである（ス
タメンコビックら）。成熟ヒトCD40タンパク質の分子量
（グリコシル化は除く）は28,300である。ヒトCD40をコ
ードするcDNAは、バーキットリンパ腫細胞系ラージから
調製されたcDNAライブラリーから単離された。CD40cDNA
によりコードされる推定上のタンパク質は、推定上のリ
ーダー配列、膜貫通ドメイン及び膜結合レセプタータン
パク質に共通の幾つかの他の特徴を含む。CD40は、Ｂリ
ンパ球、上皮細胞及び幾つかのカルチノーマ（carcinom
a）細胞系上で発現されることが見出されている。
CD40に対して向けられたモノクローナル抗体（mAb）
は、ヒトＢ細胞の種々の機能的作用を媒介することが示
されている。これら作用には：（ａ）同型付着（ゴード
ン（Gordon）ら,J.Immunol.140:1425,1988〔ゴードンら
Ｉ〕）；（ｂ）細胞の大きさの増加（ゴードンらＩ及び
バーレ（Valle）ら,Eur.J.Immunol.19:1463,1989）；
（ｃ）抗IgM、抗CD20mAb、フォルボールエステル単独
（クラーク（Clark）ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:44
94,1986;及びパウリー（Paulie）ら,J.Immunol.142:59
0,1989）、又はインターロイキン−４と組み合わせたフ
ォルボールエステル（ゴードンら,Eur.J.Immunol.17:15
35,1987〔ゴードンらII〕）で活性化されたＢ細胞の増
殖；及び（ｄ）インターロイキン−４（IL−４）刺激Ｔ
−除去培養物からのIgE（ジャバラ（Jabara）ら,J.Exp.
Med.172:1861,1990;ザング（Zhang）ら,J.Immunol.146:
1836,1991）及びIgM（ガスカン（Gascan）ら,J.Immuno
l.147:8,1991）の産生が含まれる。
バンチェレイア（Banchereau）ら,Clin.Immunol.Spec
trum 3:8,1991〔バンチェレイアらＩ〕によりmAb89と呼
ばれるかかる抗体の１つが、比較的低い抗体濃度（30ng
/ml又は約10-10M）でヒトＢ細胞増殖を誘発することが
見出されている。増殖は２〜３週間続いて10倍に拡大し
たヒトＢ細胞個体群が得られた。CD40表面分子がIgMに
より架橋された場合は、Ｂ細胞の最高の刺激が起こっ
た。もう１つの抗CD40mAbのFab断片は、弱い増殖応答を
誘発しただけであった。更に、バンチェレイアら,Scien
ce 251:70,1991〔バンティレイアらII〕は、ヒトFcレセ
プターで形質移入したマウス線維芽細胞のLtk-細胞系及
びヒトCD40に特異的なモノクローナル抗体の両方と共に
インキュベートすると、休止期のヒトＢ細胞が持続した
増殖の状態に入ることを報告した。バンチェレイアらII
は、架橋CD40がＢ細胞のクローン拡大に必要であること
を見出した。
CD23は、Ｔ細胞ではなく殆どのIgM-/IgD-成熟Ｂ細胞
上で発現されることが見出されている低親和性IgEレセ
プターである。CD23は配列決定されており、その配列は
キクタニ（Kikutani）ら,Cell 47:657,1986に記載され
ている。可溶性CD23（sCD23）は、ウサギにおいて発熱
反応を誘発し、この反応はヒトIgEの投与によって阻害
されることが見出された（ガーデリ（Ghaderi）ら,Immu
nology 73:510,1991）。従って、CD23は可溶性CD40又は
CD40−Ｌ作用の適切なマーカーであると言える。
本発明がなされる以前にCD40のリガンドは知られてい
ない。従って、当該技術分野において、CD40リガンド
（CD40−Ｌ）を同定しかつその特性を明らかにする必要
が存在する。
発明の概要 新規なサイトカイン（以下“CD40−L"という）を単離
してその特性を明らかにした。代表的なマウスCD40−Lc
DNAのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を配列番
号:1及び図１に開示し、そのアミノ酸配列も配列番号:2
に掲げる。代表的なヒトCD40−LcDNAのヌクレオチド配
列及び推定アミノ酸配列を配列番号:11及び図２に開示
し、そのアミノ酸配列も配列番号:12に掲げる。本発明
は、更に、温和な又は苛酷なストリンジェント条件下
（under moderate or severe stringency conditions）
で、配列番号:11によって規定されるプローブ（ヒトCD4
0−Ｌのコーディング領域）に、配列番号:11のヌクレオ
チド46からヌクレオチド828までに及ぶ該配列の断片
に、又は図２（配列番号:11）に相補的なDNA又はRNA配
列又はそれらの断片にハイブリダイズするヌクレオチド
配列によってコードされる他のCD40−Ｌポリペプチドも
含む。本発明は、更に、遺伝子コードの縮重により、上
記の核酸配列によってコードされるポリペプチドに実質
的に同一又は実質的に類似のポリペプチドをコードする
核酸配列、及びそれらに相補的な配列を含む。
CD40−Ｌは、そのＣ−末端で細胞外領域を有し、Ｎ−
末端で膜貫通領域と細胞内領域を有するタイプII膜ポリ
ペプチドである。マウスCD40−Ｌの可溶体は、EL−４細
胞からの上澄み液の中に見出されており、EL−４細胞
は、ここに記載したビオチニル化CD40/Fc融合タンパク
質に基づいて選別したものである。可溶性CD40−Ｌは、
CD40−Ｌの細胞外領域又はその断片を含む。マウスCD40
−Ｌのタンパク質配列は図１及び配列番号:2に記載され
ており、ヒトCD40−Ｌのタンパク質配列は図２及び配列
番号:12に記載されている。マウスCD40−Ｌの細胞外領
域は、図１及び配列番号:2のアミノ酸47からアミノ酸26
0に及んでおり、ヒトCD40−Ｌの細胞外領域は、図２及
び配列番号:12のアミノ酸47からアミノ酸261に及んでい
る。CD40−Ｌの生物活性は、このサイトカインのCD40と
の結合によって媒介されており、Ｂ細胞増殖及びIgE分
泌を含む抗体分泌を含む。
本発明は、更に、配列番号:1及び配列番号:11に及び
図１及び２に記載したCD40−Ｌのヌクレオチド配列又は
CD40−Ｌの該ヌクレオチド配列に相補的なDNA又はRNA配
列から選ばれる少なくとも約12ヌクレオチドの配列に対
応するアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチド（デ
オキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）を提供
する。かかるアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチ
ドは、CD40−LmRNAの転写又はポリペプチドの翻訳を阻
止する。
より更には、本発明は、CD40−Ｌ免疫原に特異的な抗
体を生ずる免疫原として働くことのできる、配列番号:1
又は配列番号:11によりコードされるアミノ酸配列から
選ばれる少なくとも10アミノ酸のタンパク質配列に対応
するCD40−Ｌペプチド断片を提供する。かかるCD40−Ｌ
免疫原断片は、CD40−Ｌに特異的なモノクローナル抗体
を供給する際に、抗原決定基として役立ち得る。
本発明は、また、ヒトCD40の細胞外領域を含むヒトCD
40/Fc融合タンパク質及び可溶性CD40タンパク質（sCD4
0）も提供する。sCD40及びCD40/Fc融合タンパク質の両
方は、CD40−Ｌ又は抗CD40mAb誘導Ｂ細胞刺激、Ｂ細胞
内でのIL−４誘導IgE刺激及びIL−４誘導CD23誘発を阻
害することができる。
図面の簡単な説明 図１は、マウスCD40−Ｌに対応するヌクレオチド及び
アミノ酸配列を示す。このタンパク質は、その細胞内ド
メインとしてそのＮ−末端、それに続く膜貫通領域、及
び該ポリペプチドのＣ−末端において細胞外ドメインを
有するタイプIIポリペプチドである。細胞内ドメイン及
び膜貫通領域のいずれよりも長い細胞外ドメインは、１
つのＮ結合グリコシル化部位及び４つのシステイン（Cy
s）残基から見て２つのジスルフィド結合を含有し得
る。
図２は、ヒトCD40−Ｌに対応するヌクレオチド及びア
ミノ酸配列を示す。このタンパク質は、その細胞内ドメ
インとしてそのＮ−末端、それに続く膜貫通領域、及び
該ポリペプチドのＣ−末端において細胞外ドメインを有
するタイプIIポリペプチドである。細胞内ドメイン及び
膜貫通領域のいずれよりも長い細胞外ドメインは、１つ
のＮ結合グリコシル化部位及び５つのシステイン（Cy
s）残基から見て２つのジスルフィド結合を含有し得
る。
図３は、アミノ酸レベルで77.7％相同性を示すヒト及
びマウスCD40−Ｌのタンパク質配列の比較を示す。
図４は、完全長マウスCD40−LcDNA（配列番号:1）で
形質移入したCV1細胞と共にインキュベーションするこ
とによって生じたＴ細胞除去ヒト末梢血単核細胞（PBM
C）の増殖を示す。このCV1細胞は、空ベクター（HAVE
O）で形質移入したCV1細胞と比較した場合に結合型CD40
−Ｌ（CD40−L+CV1細胞）を発現するが結合型マウスCD4
0−Ｌを発現しない。７日増殖結果は、CD40−L+CV1細胞
が、インターロイキン−４（IL−４）の存在下又は不存
在下で、Ｔ細胞除去PBMCの増殖を有意に高めることを示
している。
図５は、結合型マウスCD40−Ｌ及び10ng/mlのIL−４
を添加したＴ細胞除去PBMC増殖の二次測定値を示す。こ
れらデータは、IL−４は協同***促進作用（co−mitoge
nic effect）がないが、結合型CD40−Ｌは強力な***促
進作用を維持することを示している。
図６は、結合型CD40−ＬがIgE分泌を増加させること
を示す。
図７は、IL−４の存在下で膜結合CD40−ＬがCD23脱落
を刺激することを示す。
図８は、膜結合マウスCD40−Ｌ又はヘルパーＴ細胞ク
ローンである7A1細胞により生ずるマウス脾臓Ｂ細胞の
増殖を示す。
図９は、抗ヒツジ赤血球（SCBC）によるプラーク形成
細胞（PFC）により示される抗原特異性応答の誘発につ
いてのマウスEL−40.9細胞、つまりマウスCD40−Ｌの発
現に基づいて選別した選別細胞系とＴ細胞7A1との比較
を示す。
図10は、膜結合CD40−Ｌと、異なるcDNAで形質移入さ
れた他の細胞タイプとのＢ細胞増殖活性の比較を示す。
膜結合CD40−Ｌは、ヘルパー細胞クローン又は他のコン
トロール細胞よりも有意に大きいＢ細胞増殖活性を示し
た。
図11は、7C2細胞（ヘルパーＴ細胞クローン）及びマ
ウスCD40−LcDNAで形質移入されたCV1細胞が、抗SCBCプ
ラーク形成細胞を誘発することを示す。
図12は、マウスＢ細胞増殖の誘発についての、２つの
ヘルパーＴ細胞クローンと膜結合CD40−Ｌを発現する細
胞との比較を示す。
図13は、添加したインターロイキン−２（IL−２）の
存在下又は不存在下での膜結合CD40−Ｌ及びヘルパーＴ
細胞クローンによる抗原特異性プラーク形成細胞の誘発
を示す。
図14は、Ｂ細胞増殖及びIgE分泌を刺激する膜結合CD4
0−Ｌの作用を示す。膜結合CD40−Ｌの作用はTNFレセプ
ターによってではなくCD40レセプターによって阻害され
た。
発明の詳細な説明 マウス及びヒトCD40のリガンドとして働くことのでき
る新規なポリペプチドを単離して配列決定した。より詳
しくは、これらリガンドをコードするcDNAをクローン化
して配列決定した。更に、組換えCD40−Ｌポリペプチド
の発現方法も提供する。CD40−Ｌポリペプチドには、ヒ
ト又はマウスCD40−Ｌの誘導体又は類縁体の如き、他の
型の哺乳動物CD40−Ｌが含まれる。マウス及びヒトCD40
−Ｌは、完全長のＣ−末端においてそれぞれ214及び215
アミノ酸細胞外領域、つまり膜結合ポリペプチドを含
む。該細胞外領域は、CD40に結合するドメインを含有す
る。マウス及びヒトCD40−Ｌは、更に、いずれかの側に
荷電したアミノ酸により描写される相同な疎水性24アミ
ノ酸膜貫通領域及びそれらのＮ−末端において22アミノ
酸細胞内領域を含む。本発明は、更に、該細胞外領域の
全部若しくは一部分又は該細胞外領域の誘導体を含む完
全長CD40−Ｌポリペプチド又はその断片、及びマウス又
はヒトCD40−ＬをコードするcDNAで形質移入され、膜結
合タンパク質としてヒト又はマウスCD40−Ｌを発現する
哺乳動物細胞を包含する。
本発明は、CD40−Ｌポリペプチドをコードする単離さ
れたDNA配列及びかかる単離されたDNA配列に相補的なDN
A又はRNA配列を含む。該単離されたDNA配列及びそれら
の相補体は、（ａ）図２（配列番号:11）に記載したDNA
配列のヌクレオチド184から828、ヌクレオチド193から8
28又はヌクレオチド193から762及びそれらの相補体、
（ｂ）温和なストリンジェント条件下で、（ａ）のDNA
配列又はそれらの相補体とハイブリダイズし、CD40−Ｌ
ポリペプチド、その類縁体又は誘導体をコードするDNA
配列、及び（ｃ）遺伝子コードの縮重により、前述のDN
A配列又はそれらの相補体のいずれかによってコードさ
れるCD40−ＬポリペプチドをコードするDNA配列からな
る群から選ばれる。加えて、本発明は、CD40−Ｌポリペ
プチド及びその類縁体をコードするDNA配列を含むベク
ター、及びかかるベクターで形質移入された宿主細胞を
包含する。
ここに開示した新規なサイトカインは、CD40、つまり
TNFレセプタースーパーファミリーのメンバーであるレ
セプター、のリガンドである。従って、CD40−Ｌは、例
えば、Ｂリンパ球によって発現されることが知られてい
る、CD40を介するシグナルの変換を司っているようであ
る。完全長CD40−Ｌは、そのＣ−末端において細胞外領
域、膜貫通領域、及びそのＮ−末端において細胞内領域
を有する膜結合ポリペプチドである。CD40−Ｌの可溶体
は、該細胞外領域又はその断片から作ることができ、可
溶性CD40−Ｌは、CD40−Ｌの膜結合体を発現する細胞か
らの培養上澄み液中に見出された。マウスCD40−Ｌの細
胞外領域のタンパク質配列は、図１及び配列番号:2のア
ミノ酸47からアミノ酸260に及ぶ。ヒトCD40−Ｌの細胞
外領域のタンパク質配列は、図２及び配列番号:12のア
ミノ酸47からアミノ酸261に及ぶ。CD40−Ｌの生物活性
は、CD40又はその種特異的同族体と結合することによっ
て媒介され、Ｂ細胞の増殖及び活性化Ｂ細胞のからのイ
ムノグロブリン分泌の誘発を含む。CD40−Ｌ（可溶性モ
ノマー型及びオリゴマー型並びに膜結合型を含む）は、
添加IL−４の存在なしにＢ細胞増殖及びイムノグロブリ
ン分泌（IgE分泌は除く）をもたらすことができ、活性
を媒介するためにIL−４及び架橋を必要とする抗CD40抗
体とは対照的である。
CD40−Ｌとは、CD40又はCD40の哺乳動物同族体に結合
することのできるポリペプチドのことをいう。ここで用
いる場合、“CD40−L"という用語には、膜貫通及び細胞
内領域を欠く可溶性CD40−Ｌポリペプチド、ヒトCD40−
Ｌの哺乳動物同族体、ヒト又はマウスCD40−Ｌの類縁
体、又はヒト又はマウスCD40−Ｌの誘導体が含まれる。
CD40−Ｌは、CD40−Ｌポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列の突然変異によっても得ることができる。
ここで言うCD40−Ｌ類縁体は、ヒト又はマウスCD40−Ｌ
の配列に実質的に相同性のポリペプチドであるが、１又
は２以上の欠失、挿入又は置換の故に、天然配列のCD40
−Ｌ（ヒト又はマウス種）ポリペプチドとは異なるアミ
ノ酸配列を有する。CD40−Ｌの類縁体は、オリゴヌクレ
オチド合成及び連結により又は部位特異的突然変異誘発
により調製したDNA構築体から合成することができる。
グリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基等の如き他
の化学部分と共有結合性又は集合性複合体を形成するこ
とによって、又はアミノ酸配列突然変異体を作り出すこ
とによって、ヒト又はマウスCD40−Ｌの一次アミノ酸構
造を修飾し、CD40−Ｌ誘導体を作り出すことができる。
CD40−Ｌの共有結合性誘導体は、特定の官能基をCD40−
Ｌアミノ酸側鎖又はCD40−ＬポリペプチドのＮ−末端若
しくはＣ−末端又はその細胞外ドメインに連結すること
によって調製する。本発明の範囲に入るCD40−Ｌの他の
誘導体には、例えば、Ｎ−末端又はＣ−末端融合のよう
な組換え培養物中での合成によるCD40−Ｌと他のタンパ
ク質又はポリペプチドとの共有結合性又は集合性複合体
又はその断片が含まれる。例えば、該複合体は、翻訳と
同時に又は翻訳後に該複合体の移動をその合成部位から
細胞膜若しくは細胞壁の内側若しくは外側へと行う、CD
40−ＬポリペプチドのＮ−末端領域又はＣ−末端領域に
おけるシグナル又はリーダーポリペプチド配列を含んで
もよい（例えば、サッカロミセス属のα−因子リーダ
ー）。CD40−Ｌポリペプチド融合体は、CD40−Ｌの精製
及び同定を容易にするために付加したポリペプチド（例
えば、ポリ−His）を含んでもよく、又、新規な多官能
性存在物を提供するために他のサイトカインとの融合体
を含んでもよい。他のサイトカインには、例えば、イン
ターロイキン−１から13までのいずれか、TNF（腫瘍壊
死因子）、GM−CSF（顆粒球−マクロファージコロニー
刺激因子）、Ｇ−CSF（顆粒球コロニー刺激因子）、MGF
（マスト細胞成長因子）、EGF（表皮成長因子）、PDGF
（血小板由来成長因子）、NGF（神経成長因子）、EPO
（エリスロポイエチン）、γ−IFN（γ−インターフェ
ロン）、４−1BB−Ｌ（４−1BBリガンド）及び免疫細胞
成長、分化又は機能に影響を及ぼす他のサイトカインが
含まれる。
本発明の範囲内の核酸配列には、温和な又は苛酷なス
トリンジェント条件下で、配列番号:1又は配列番号:11
のヌクレオチド配列にハイブリダイズするDNA及び／又
はRNA配列又は相補的な配列が含まれる。温和にストリ
ンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、例え
ば、サムブルーク（Sambrook）ら,Molecular Cloning:A
Laboratory Manual,2 ed.Vol.1,pp.1.101−104,ColdSp
ring Harbor Laboratory Press,（1989）に記載されて
いる条件をいう。サムブルークらによって定義された温
和でストリンジェントな条件には、５×SSC、0.5％SD
S、1.0mM EDTA（pH8.0）の予備洗浄溶液の使用及び50℃
で一晩の５×SSCでのハイブリダイゼーションが含まれ
る。苛酷でストリンジェントな条件には、より高温での
ハイブリダイゼーション及び洗浄が含まれる。
CD40−Ｌの生物活性は、例えば、CD40のリガンド結合
ドメインへの結合の競合により測定することができる
（即ち、競合結合測定法）。マウスCD40−Ｌ及びヒトCD
40−Ｌの両方がヒトCD40に結合する。ヒトCD40について
のマウスCD40−Ｌ（選別したマウスEL−40.9細胞上で発
現したもの）の結合親和性は、約1.74×109M-1であっ
た。同じく、ヒトCD40についてのマウスCD40−Ｌ（選別
していないマウスEL−46.1細胞上で発現したもの）の結
合親和性は、約2.3×109M-1であった。両方の結合親和
性測定値は、サイトカイン／サイトカインレセプター結
合の通常の範囲内である。
CD40−Ｌポリペプチドについての競合結合測定法の１
つの形は、放射標識した可溶性の図１（配列番号:1）に
よるマウスCD40−Ｌ又は図２（配列番号:11）によるヒ
トCD40−Ｌ、及びCD40を発現する無傷細胞（例えば、ヒ
トＢ細胞）を用いる。無傷細胞の代わりに、プロテイン
Ａ又はプロテインＧ相互作用を介してそのFc領域で固相
に結合した（CD40/Fc融合タンパク質の如き）可溶性CD4
0と置き換えてもよい。競合結合測定法の第２の形は、C
D40/Fc融合タンパク質の如き放射標識した可溶性CD40、
及びCD40−Ｌを発現する無傷細胞を用いる。また、可溶
性CD40−Ｌを固相に結合してもよい。
競合結合測定法は、標準的な方法を用いて行うことが
できる。例えば、放射標識マウスCD40−Ｌを用いて推定
上のCD40−Ｌ同族体と競合させ、表面結合CD40に対する
結合活性を測定することができる。競合的オートラジオ
グラフプレート結合測定法により定量的結果を得ること
ができ、又定量的結果を得るためにスキャッチャードプ
ロットを用いることもできる。
CD40を発現する無傷細胞での競合結合測定法は、２つ
の方法で行うことができる。第１の方法では、懸濁液中
で又は組織培養プレートへの粘着によるかのいずれかで
Ｂ細胞を成育させる。粘着細胞は、37℃で10分間、5mM
EDTAで処理することによって剥がすことができる。第２
の方法では、膜結合CD40を発現する形質移入COS細胞を
用いることができる。COS細胞又は他の哺乳動物細胞を
適当なベクター中のヒトCD40cDNAで形質移入して、細胞
外領域を有する完全長CD40を細胞外に発現させることが
できる。
また、可溶性CD40を、カラムクロマトグラフィーマト
リックス、又は試験管又は125Iの如き検出可能な部分の
存在についての分析に適する類似の支持体の如き固相に
結合してもよい。固相への結合は、例えば、CD40/Fc融
合タンパク質を得て、それをプロテインＡ又はプロテイ
ンＧ表面に結合させることによって行うことができる。
CD40−Ｌ及びその同族体の生物活性を測定する他の手
段は、複合化した可溶性CD40（例えば、125I−CD40/F
c）を上記と類似の競合測定法において用いることであ
る。しかしながら、この場合は、CD40−Ｌを発現する無
傷細胞、又は固体支持体に結合した可溶性CD40−Ｌを用
いて、推定上のCD40同族体を含有するサンプルに複合化
した可溶性CD40のCD40−Ｌへの結合についての競合を測
定する。
CD40−Ｌは、Ｂ細胞増殖検定法で生物活性を測定する
ことによって分析してもよい。ヒトＢ細胞は、デフラン
ス（Defrance）ら,J.Immunol.139:1135,1987により記載
された陰性選択法及びパーコール（Percoll）密度沈降
法による精製により、ヒト扁桃腺から得ることができ
る。バーキットリンパ腫細胞系を用いて、CD40−Ｌに応
答する細胞増殖を測定してもよい。バーキットリンパ腫
細胞系の例には、例えば、ラージ（ATCC CCL86）、ダ
ウジ（Daudi）（ATCC CCL213）及びナマルワ（Namalw
a）（ATCC CRL1432）が含まれる。膜結合CD40−ＬはＢ
細胞増殖を刺激した。オリゴマー、好ましくはダイマー
のCD40−Ｌは、Ｂ細胞増殖を刺激することができる。CD
40（レセプター）は、Ｂ細胞のCD40−Ｌ増殖に対抗す
る。
CD40−Ｌ生物活性を測定するための他の分析法は、CD
40−Ｌ又はその誘導体又は類縁体による活性化に応答し
てＢ細胞により産生されるイムノグロブリンを測定する
ことである。例えば、培養液中５×105細胞/mlのＢ細胞
と共に少なくとも７日間インキュベートすることによっ
て、ポリクローナルイムノグロブリン分泌を測定するこ
とができる。イムノグロブリン（Ig）産生は、マリスゼ
ウスキー（Maliszewski）ら,J.Immunol.144:3028,1990
〔マリスゼウスキーらＩ〕又はマリスゼウスキーら,Eu
r.J.Immunol.20:1735,1990〔マリスゼウスキーらII〕に
記載された如きELISA分析法により測定することができ
る。マウスＢ細胞は、例えば、マウスから採取して、グ
ラブシュタイン（Grabstein）ら,J.Exp.Med.163:1405,1
986〔グラブシュタインらＩ〕、マリスゼウスキーらＩ
及びマリスゼウスキーらIIに記載された操作に従って培
養することによって得ることができる。
CD40−Ｌを、CD40を発現する細胞を検出するための結
合分析に用いることもできる。例えば、図１（配列番
号:1）によるマウスCD40−Ｌ若しくは図２（配列番号:1
1）によるヒトCD40−Ｌ、又はその細胞外ドメイン又は
断片を、125Iの如き検出可能部分と複合化させることが
できる。125Iでの放射標識は、高い特異的活性に標識さ
れた機能性125I−CD40−Ｌ分子を生成する多くの標準的
方法のいずれかにより行うことができる。また、比色定
量又は蛍光定量反応を触媒することのできる酵素の如き
他の検出可能部分、ビオチン又はアビジンを用いてもよ
い。CD40を発現する細胞を複合化CD40−Ｌと接触させる
ことができる。インキュベーション後に未結合複合化CD
40−Ｌを除いて、検出可能部分を用いて結合を測定す
る。
CD40−Ｌポリペプチドは、ダイマー又はトリマーの如
きオリゴマーとして存在してもよい。オリゴマーは、異
なるCD40−Ｌポリペプチド上のシステイン残基間で形成
されるジスルフィド結合により連結される。また、２つ
の可溶性CD40−ＬドメインをGly4SerGly5Serリンカー配
列、又は米国特許第5,073,627号に記載された他のリン
カー配列で連結することができる。なお、米国特許第5,
073,627号は参照によりここに組み入れられるものとす
る。CD40/Fc融合タンパク質について記載したようにし
て、可溶性CD40−ＬのＣ−末端（細胞外ドメイン）をIg
G1のFc領域（例えば、配列番号:3）に融合させることに
よって、CD40−Ｌポリペプチドを作り出してもよい。CD
40−L/Fc融合タンパク質は、その組み立てが抗体分子の
Ｈ鎖に非常に似ており、二価のCD40−Ｌを形成してい
る。融合タンパク質が抗体のＨ鎖とＬ鎖の両方でできて
いるなら、４つのCD40−Ｌ細胞外ドメインだけでCD40−
Ｌオリゴマーを形成することが可能である。
融合タンパク質は、望ましい配列からの断片の酵素切
断及び連結の慣用技術を用いて調製してもよい。合成オ
リゴヌクレオチドを用いるPCR法を用いて目的の断片を
調製及び／又は増幅することができる。目的の配列に該
当する合成オリゴヌクレオチドのオーバーラッピングを
使用して、融合タンパク質をコードするDNA構築体を調
製することもできる。融合タンパク質は、CD40−Ｌと、
リーダー（又はシグナルペプチド）配列、Fc領域、リン
カー配列、及び融合タンパク質を容易に精製できかつ速
やかに検出できる手段を提供する高度に抗原性の部分を
コードする配列を含む２又は３以上の付加的な配列を含
むこともできる。
シグナルペプチドは、細胞からのタンパク質の分泌を
促進する。代表的はシグナルペプチドは、ヒトインター
ロイキン−７（IL−7;グッドウィン（Goodwin）ら,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 86:302,1989;図2B）のリーダー配
列のアミノ末端25アミノ酸である。他のシグナルペプチ
ドを用いてもよい。例えば、IL−７リーダー配列内の一
定のヌクレオチドを、アミノ酸配列を変化させることな
く変化させることができる。更に、IL−７配列がリーダ
ー配列として働く能力に影響を及ぼさないアミノ酸変化
を行うことができる。
Flag（登録商標）オクタペプチド（Asp−Tyr−Lys−A
sp−Asp−Asp−Asp−Lys）は、融合タンパク質の生物活
性を変化させず、高度に抗原性であって特異的モノクロ
ーナル抗体により可逆的に結合されるエピトープを提供
し、発現された融合タンパク質の検出と迅速にしかつ精
製を容易にする。Flag（登録商標）配列も、Asp−Lys対
合の直後の残基においてウシ粘膜エンテロキナーゼによ
り特異的に切断され、このペプチドでキャップされた融
合タンパク質は、大腸菌内での細胞内分解に対して抵抗
性であり得る。Flag（登録商標）配列に結合するマウス
モノクローナル抗体を、受託番号HB9259でATCCに寄託し
た。Flag（登録商標）配列を含む融合タンパク質の精製
において該抗体を使用する方法は、米国特許第5,011,91
2号に記載されており、参照によってここに組み入れら
れるものとする。
適当なFc領域は、プロテインＡ又はプロテインＧに結
合でき、また別に、該Fc領域を含む融合タンパク質の精
製又は検出に用いることのできる抗体によって認識され
るFc領域として定義される。好ましいFc領域には、ヒト
IgG1又はマウスIgG1のFc領域が含まれる。１つの例は、
配列番号:3に示したヒトIgG1 Fc領域であり、もう１つ
の例は、鋳型としてヒトcDNAを用いる、配列番号:9及び
配列番号:10からのオリゴヌクレオチドプライマーから
のPCRにより得られるcDNAによりコードされるFc領域で
ある。適当なFc領域の一部分も用いることができ、例え
ば、プロテインＡへの結合を司っているアミノ酸の配列
を欠失した結果、生じたFc領域がプロテインＡにではな
くプロテインＧに結合するようになったヒトIgG1のFc領
域がある。
〔Gly4Ser〕３繰り返し配列は、CD40−Ｌがその第二
及び第三構造に正確に折り重なるのを確実にするのに充
分な距離だけ、CD40−Ｌの細胞外領域を融合タンパク質
のFc部分から離すリンカー配列を提供する。適するリン
カー配列は、（１）柔軟に延びたコンフォメーションに
適合し、（２）融合タンパク質の機能性ドメインと相互
作用するおそれのある整然とした第二構造を形成しよう
とする傾向を示さず、そして（３）機能性タンパク質ド
メインとの相互作用を助長するおそれのある疎水性又は
荷電性が最小のものであろう。柔軟なタンパク質領域内
の典型的な表面アミノ酸には、Gly、Asn及びSerが含ま
れる。事実上、Gly、Asn及びSerを含有するアミノ酸配
列のあらゆる組み合わせが、リンカー配列についての上
の規準を満足すると考えられる。Thr及びAlaの如き他の
殆ど中性のアミノ酸をリンカー配列に用いてもよい。リ
ンカー配列の長さは多様に変化してもよいが、該融合タ
ンパク質の生物活性に有意な影響を与えてはならない。
融合したタンパク質が、機能性ドメインを離して立体的
干渉を防ぐのに用いることのできる必須ではないＮ−又
はＣ−末端アミノ酸領域を有する場合は、リンカー配列
は不要である。
CD40−Ｌポリペプチドは、図１（配列番号:1）及び図
２（配列番号:11）に示したCD40−Ｌの細胞外ドメイン
を含む可溶性ポリペプチドとして又はマウス及びヒト配
列についてそれぞれ図１（配列番号:1）及び図２（配列
番号:11）に示した該細胞外ドメイン、膜貫通領域及び
短い細胞内ドメインを含む膜結合ポリペプチドとして存
在してもよい。更に、本発明は、ジスルフィド相互作用
により連結されるか、又はスペーサーアミノ酸連結基を
有するか若しくは有しない融合ポリマーとして発現され
るCD40−Ｌ細胞外ドメインのオリゴマー又はその断片を
包含する。例えば、ダイマーCD40−Ｌ分子は、IgG Fc領
域連結基により連結され得る。
理論に拘束されることないが、膜結合CD40−Ｌ及びオ
リゴマーCD40−Ｌは、従来はIL−４の存在下で架橋抗CD
40抗体によって達成されたに過ぎなかったIg形成及びＢ
細胞の増殖を刺激する活性をもたらすことができる。更
に、CD40−Ｌの細胞外ドメインだけを含み、CD40レセプ
ターに結合できるモノマー可溶性CD40−Ｌは、膜結合及
びオリゴマーCD40−Ｌ及び／又は架橋抗CD40抗体の活性
に対抗するのに役立つと考えられる。更に、膜結合CD40
−ＬとCD40との相互作用が、抗原特異性抗体産生及びポ
リクローナルIg分泌の両方へのＢ細胞成長及び分化のＴ
細胞接触依存性誘発を司る主要な分子相互作用であると
考えられる。この点で、完全長CD40−Ｌ（即ち、膜結合
性であり、細胞内ドメイン、膜貫通領域及び細胞外ドメ
イン又はそれらの断片を有する）をコードするcDNAで形
質移入された哺乳動物細胞は、Ｂ細胞成長、分化及び抗
原特異性抗体産生の刺激を誘発するＴ細胞の能力に関
し、Ｔ細胞を真似ることができる。オリゴマー可溶性CD
40−Ｌ、好ましくは細胞外領域のダイマーの活性は、膜
結合CD40−Ｌの生物活性を真似ることができると考えら
れる。更に、可溶性モノマーCD40−Ｌ（該細胞外ドメイ
ン又はその断片を含む）は、CD40レセプターに結合して
Ｔ細胞とＢ細胞の相互作用を阻止し、従って、それ自体
モノマー型又はオリゴマー型であってもよいCD40（レセ
プター）細胞外ドメインに類似する活性を有することが
できる。また、CD40−Ｌは、Ｂ細胞成長、分化及び抗原
特異性抗体産生の刺激を誘発できる可溶性因子として働
くために、オリゴマー（好ましくはダイマー）であるこ
とができる。従って、膜結合CD40−Ｌ及びオリゴマーCD
40−Ｌは、CD40アゴニストとして働く一方で、可溶性
（モノマー）CD40−Ｌ及び可溶性CD40は、シグナルを有
意に伝達することなくCD40レセプター部位を遮断するこ
とにより又はＢ細胞及び他の標的細胞上のCD40部位にCD
40−Ｌが結合するを阻止することにより、CD40アンタゴ
ニストとしても働くと考えられる。
CD40アゴニスト及びCD40アンタゴニストの両方は有用
な治療活性を有するであろう。例えば、CD40アゴニスト
（即ち、膜結合CD40−Ｌ及びオリゴマーCD40−Ｌ）は、
ワクチンアジュバントとして及びハイブリドーマ細胞か
らのmAb産生を刺激するのに有用である。CD40アンタゴ
ニスト（即ち、CD40レセプター、CD40/Fc及びできるだ
け可溶性のモノマーCD40−Ｌ）は、アレルギー、狼瘡、
慢性間接リウマチ、インシュリン依存真性糖尿病（IDD
M）、対宿主性移植片病（GVHD）等の如き高レベルの抗
原抗体複合体の存在を特徴とする自己免疫疾患の治療に
有用である。
ヒトＢ細胞からのIgE分泌は、Ｔ細胞存在下でIL−４
により誘発され得る（ベルセリ（Vercelli）ら,J.Exp.M
ed.169:1295,1989）。更に、IgE産生は、抗CD40mAbの添
加によって、Ｔ細胞除去PBM（末梢血単核細胞）から誘
発され得る（ジャバラら,J.Exp.Med.172:1861,1990及び
ザングら,J.Immunol.146:1836,1991）。本発明は、更
に、Ｔ細胞存在下のIL−４により又はCD40−Ｌ（好まし
くは、膜結合CD40−Ｌ）により活性化された活性化Ｂ細
胞からのIgE産生を阻害する方法であって、ここに記載
したCD40/Fc融合タンパク質又は配列番号:3に記載したc
DNA配列によりコードされる可溶性CD40を有効量投与す
ることを含む方法を包含する。同様に、CD40レセプター
及びできるだけ可溶性のCD40−Ｌ（モノマーだけ）も、
他の抗体アイソタイプの分泌を遮断することができる。
本発明は、更に、天然パターンのグリコシル化を伴う
か又は伴わないCD40−Ｌポリペプチドを包含する。酵母
又は哺乳動物発現系（例えば、COS−７細胞）内で発現
されたCD40−Ｌは、何を発現系に選ぶかに依存して、分
子量及びグリコシル化パターンに関し、天然CD40−Ｌポ
リペプチドと類似していても有意に異なっていてもよ
い。大腸菌の如き細菌発現系でのCD40−Ｌポリペプチド
の発現により、グリコシル化されていない分子が得られ
る。
生物活性又は結合に必要ではない、アミノ酸残基若し
くは配列の種々の付加体若しくは置換体、又は末端若し
くは内部残基若しくは配列の欠失体をコードするDNA構
築体を調製することができる。例えば、細胞外CD40−L
N−グリコシル化部位を修飾してグリコシル化を前もっ
て排除し、酵母発現系を用いて同種の炭水化物減少類縁
体を発現させることができる。真核性ポリペプチドにお
けるＮ−グリコシル化部位は、アミノ酸三連体Asn−Ｘ
−Ｙにより特徴付けられる。ここで、ＸはProを除くい
ずれかのアミノ酸であり、ＹはSer又はThrである。この
三連体をコードするヌクレオチド配列を適当に修飾する
と、Asn側鎖における炭水化物残基の結合を妨げる置
換、付加又は欠失をもたらすであろう。他の例では、タ
ンパク質の復元の際の正しくない分子内ジスルフィド橋
の形成を防ぎながら、Cys残基をコードする配列を変化
させて、Cys残基を欠失又は他のアミノ酸と置換させる
ことができる。ヒトCD40−Ｌは、その細胞外ドメイン内
に５つのCys残基を含む。かくして、タンパク質三次構
造又はジスルフィド結合形成に影響を及ぼさずに、該５
つのCys残基のうち少なくとも１つを他のアミノ酸で置
換するか又は欠失させることができる。
突然変異誘発への他のアプローチは、KEX2プロテアー
ゼ活性が存在する酵母系における発現を増進するために
二塩基性アミノ酸残基をコードする配列の修飾を包含す
る。末端又は内部残基又は配列をコードする配列を欠失
させることにより、CD40−Ｌポリペプチドのサブユニッ
トを構築してもよい。
CD40−Ｌポリペプチドは、多エクソン遺伝子によりコ
ードされる。本発明は、更に、転写後の異なるmRNAスプ
ライシングを原因とすることができる別のmRNA構築体、
及びここに開示したcDNAと同一性又は類似性を有する領
域を共有する別のmRNA構築体を包含する。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、標的
CD40−LmRNA（センス）又はCD40−L DNA（アンチセン
ス）配列に結合できる一本鎖核酸配列（RNA又はDNAのい
ずれか）を含む。本発明によるアンチセンス又はセンス
オリゴヌクレオチドは、配列番号:1若しくは配列番号:1
1の、又は配列番号:1若しくは配列番号:11に相補的なDN
A又はRNAの断片を含む。かかる断片は、少なくとも約14
のヌクレオチドを含む。好ましくは、かかる断片は、約
14〜約30のヌクレオチドを含む。CD40−ＬのcDNA配列に
基づいてアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを
作り出す能力は、例えば、シュタイン（Stein）及びコ
ーエン（Cohen）,Cancer Res.48:2659,1988及びファン
・デル・クロール（Van der Krol）ら,BioTechniques
6:958,1988に記載されている。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核
酸配列への結合により、二重鎖の形成がもたらされ、こ
の二重鎖形成が、該二重鎖の分解の増進、転写又は翻訳
の早期終結を含む幾つかの手段のうちの１つ又は他の手
段により翻訳（RNA）又は転写（DNA）を遮断する。適す
るポリメラーゼプロモーターには、あらゆるRNAポリメ
ラーゼについてのプロモーター、又はあらゆるDNAポリ
メラーゼについてのプロモーターが含まれる。アンチセ
ンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、更に、修飾され
た糖−ホスホジエステル主鎖（又はWO91/06629に記載さ
れたものの如き他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチ
ドを含む。この場合、かかる糖結合は内因性ヌクレアー
ゼに耐性である。耐性糖結合を有するかかるオリゴヌク
レオチドは、in vivoで安定である（即ち、酵素分解に
対して抵抗できる）が、標的ヌクレオチド配列に結合で
きる配列特異性を保持している。センス又はアンチセン
スオリゴヌクレオチドの他の例には、WO90/10448に記載
されたものの如き有機部分、及びポリ（Ｌ−リシン）の
如き標的核酸配列についての該オリゴヌクレオチドの親
和性を高める他の部分に共有結合したオリゴヌクレオチ
ドが含まれる。更になお、エリプチシン（ellipticin
e）の如き挿入剤（intercalating agent）、及びアルキ
ル化剤又は金属錯体をセンス又はアンチセンスオリゴヌ
クレオチドに付けて、標的ヌクレオチド配列に対する該
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの結合特異
性を変えてもよい。アンチセンス又はセンスオリゴヌク
レオチドは、例えば、CaPO4媒介DNA形質移入、エレクト
ロポレーションを含むあらゆる遺伝子移入法、又はエプ
スタイン・バー・ウィルスの如き他の遺伝子移入ベクタ
ーによって標的核酸配列を含有する細胞の中に導入する
ことができる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオ
チドは、好ましくは、該アンチセンス又はセンスオリゴ
ヌクレオチドを適当なレトロウィルスベクターの中に挿
入し、次いで、細胞と該挿入した配列を含有するレトロ
ウィルスベクターをin vivo又はex vivoのいずれかで接
触させることによって、標的核酸配列を含有する細胞の
中に導入される。適するレトロウィルスベクターには、
マウスレトロウィルスＭ−MuLV、N2（Ｍ−MuLV由来のレ
トロウィルス）、又はDCT5A、DCT5B及びDCT5C（PCT出願
US90/02656を参照のこと）と呼称される二重コピーベク
ターが含まれるがこれらに限定されない。また、他のプ
ロモーター配列を用いて該オリゴヌクレオチドを発現し
てもよい。
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ま
た、WO91/04753に記載されたようなリガンド結合分子を
有する複合体の形成によって、標的ヌクレオチド配列を
含有する細胞の中に導入してもよい。適するリガンド結
合分子には、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイ
トカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガ
ンドが含まれるがこれらに限定されない。リガンド結合
分子の複合化が、該リガンド結合分子がその対応する分
子又はレセプターに結合する能力を実質的に妨害しない
か、又は該センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド
若しくはその複合体が細胞の中に入り込むのを遮断しな
いのが好ましい。
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド
を、WO90/10448に記載されたようなオリゴヌクレオチド
−脂質コンプレックスの形成によって、標的核酸配列を
含有する細胞の中に導入してもよい。該センス又はアン
チセンスオリゴヌクレオチド−脂質コンプレックスは、
好ましくは内因性リパーゼによって細胞内で解離され
る。
マウスCD40−LcDNAの配列を直接発現法によって得
た。ヒトCD40−Ｌの配列は、マウスCD40−LcDNAをプロ
ーブとして用いて種間交叉ハイブリダイゼーション法に
よって得た。
本発明者らは、まず、スタメンコビック（Stamenkovi
c）らに公表された配列（配列番号:4）に基づくプライ
マーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法により、
ヒトCD40の細胞外領域のクローン（そのレセプター）を
得ることによってマウスCD40−Ｌをクローン化した。上
流のオリゴヌクレオチドプライマー5'−CCGTCGACCACCAT
GGTTCGTCTGCC−3'（配列番号:5）が、CD40のイニシエー
ターメチオニンから上流にSal I部位を導入し、下流の
オリゴヌクレオチドプライマー5'−CCGTCGACGTCTAGAGCC
GATCCTGGGG−3'（配列番号:6）は、CD40のアミノ酸192
の後ろに終結コドンを挿入し、そのあとにXba1及びSal
I部位が続く。増幅したcDNAをSal Iで消化し、pDC406
（マクマハン（McMahan）ら,EMBO J.10:2821,1991）に
クローン化してpDC406/sCD40を構築した。
第２のCD40レセプター断片（配列番号:4）を、ヒトIg
G1（配列番号:3）のFcドメインへの融合用にPCR法によ
り得た。簡単に説明すると、上流のオリゴヌクレオチド
プライマー（配列番号:5）及び融合鋳型（配列番号:4）
は前と同じであった。下流のオリゴヌクレオチドプライ
マーは、CD40のアミノ酸193の後ろにアミノ酸Tyr Val G
lu Pro Arg（配列番号:8）を挿入する5'−ACAAGATCTGGG
CTCTACGTATCTCAGCCGATCCTGGGGAC−3'（配列番号:7）で
あった。Glu及びProは、ヒトIgG1の蝶番部の最初の２つ
のアミノ酸であり、そのあとにBgl II制限部位が続く。
該Bgl II制限部位は、CD40の細胞外ドメインをヒトIgG1
Fc領域の残りに融合するのに用いた。
他のレセプターからのリガンド結合ドメインを含む他
の融合タンパク質は、レセプターのリガンド結合ドメイ
ンのDNA配列を得て、プロテインＡ若しくはプロテイン
Ｇ、又はアフィニティ精製のできる他のポリペプチド、
例えば、アビジン又はストレプトアビジンに結合する抗
体分子のFc領域をコードするDNA配列にこの配列を融合
させることによって作ることができる。得られる遺伝子
構築体を哺乳動物細胞の中に導入して、融合タンパク質
の一過性発現を行うことができる。レセプター/Fc融合
タンパク質は、プロテインＡ又はプロテインＧアフィニ
ティ精製により精製することができる。レセプター／ア
ビジン融合タンパク質は、ビオチンアフィニティクロマ
トグラフィーにより精製することができる。その後、高
濃度の塩溶液又は他の適当な緩衝液で溶出することによ
って、該融合タンパク質をカラムから分離することがで
きる。
本発明者らは、ヒトの細胞からのcDNAを鋳型として用
い、上流のオリゴヌクレオチドプライマー5'−TATTAATC
ATTCAGTAGGGCCCAGATCTTGTGACAAAACTCAC−3'（配列番号:
9）及び下流のオリゴヌクレオチドプライマー5'−GCCAG
CTTAACTAGTTCATTTACCCGGAGACAGGGAGA−3'（配列番号:1
0）を用いるPCR増幅法により、ヒトIgG1Fc領域をコード
するcDNAを得た。該PCR増幅cDNAは、蝶番部の開始部位
の近くにBgl IIを導入した。これは、CD40の細胞外ドメ
インを連結してsCD40/Fc融合cDNAを構築するのに用い、
この融合cDNAは、pDC406内に連結してpDC406/CD40/Fcを
構築した。他の適するFc領域は、高い親和性でプロテイ
ンＡ又はプロテインＧと結合できるあらゆる領域として
定義され、ヒトIgG1又はマウスIgG1のFc領域が含まれ
る。１つの例は、配列番号:3に示したヒトIgG1Fc領域又
はヒトcDNAを鋳型として配列番号:9及び配列番号:10か
らのオリゴヌクレオチドプライマーからのPCRにより得
られるcDNAである。
レセプター/Fc融合分子は、好ましくは、組換え哺乳
動物細胞の培養で合成される。というのは、それらは原
核細胞発現法により合成するには一般にあまりに大きく
かつ複雑過ぎるからである。レセプター/Fc融合タンパ
ク質の発現に適する哺乳動物細胞の例には、CV−１細胞
（ATCC CCL70）及びCOS−７細胞（ATCC CRL1651）が
含まれ、両方共サルの腎臓由来のものである。
DNA構築体pDC406/CD40/Fcをサル腎臓細胞系CV−1/EBN
A（ATCC CRL10478）内に形質移入した。pDC406プラス
ミドは、SV40、ヒト免疫不全ウィルス（HIV）、及びエ
プスタイン・バー・ウィルス（EBV）由来の調節配列を
含む。CV−1/EBNA細胞系は、エプスタイン・バー・ウィ
ルス核抗原−１（EBNA−１）をコードし、ヒトCMV即時
−初期（immediate−early）エンハンサー／プロモータ
ー由来のEBNA−１を構成的に発現する遺伝子でCV−１細
胞系を形質移入することにより得られた。EBNA−１遺伝
子は、pDC406の如きEBV複製起点を含有する発現ベクタ
ーのエピソーム複製を可能にする。
CD40/Fc融合タンパク質を発現する形質移入体は、初
めに、ドットブロット法又はウェスタンブロット法を用
いて同定される。次いで、上澄み液をドットブロット又
はゲル電気泳動に付してから、G28−5mAb（ヒトCD40レ
セプターに結合する抗体）と結合させるために該電気泳
動したタンパク質を移す。次いで、ブロットしたタンパ
ク質を放射標識125I−プロテインＡと共にインキュベー
トし、洗浄して未結合標識を除き、そしてFcの発現につ
いて検査した。モノクローナル抗体G28−５は、クラー
ク（Clark）らの前記文献に従って作った。
該融合構築体を発現する細胞を同定したので、形質移
入細胞の大規模培養を行って、CD40/Fcを発現する細胞
からの上澄み液を蓄積した。上澄み液中のCD40/Fc融合
タンパク質をアフィニティ精製により精製した。簡単に
説明すると、哺乳動物細胞上澄み液を（例えば、0.45μ
フィルターで）濾過し、濾液をプロテインA/G抗体アフ
ィニティカラム（シュライハー（Schleicher）及びシュ
エル（Schuell），キーン（Keene）,NH）に４℃で1.5cm
×12.0cmカラムについて80ml/hの流速で適用することに
よって、CD40/Fc融合タンパク質を含有する１リッター
の培養上澄み液を精製した。フリーのタンパク質が洗浄
緩衝液中に検出されなくなるまで、カラムをPBS中の0.5
M NaClで洗浄した。最後に、PBSでカラムを洗浄した。
結合した融合タンパク質をpH2.8の25mMクエン酸緩衝液
でカラムから溶出させ、pH9.1の500mM HEPES緩衝液でpH
7にした。該溶出したCD40/Fc融合タンパク質の銀染色SD
Sゲルにより、＞98％純度であることが分かった。
ここに記載したようにして、可溶性CD40（sCD40）及
びCD40/Fc融合タンパク質を作った。形質移入CV−1/EBN
A細胞により発現されたsCD40をアフィニティ精製するた
めに、該上澄み液をG28−５（抗CD40mAb）アフィニティ
カラムに通して精製した。タンパク質含有画分をプール
し、G28−５結合測定及び還元剤として1mMジチオスレイ
トールの存在下でのSDS−PAGE（ナトリウムドデシルサ
ルフェート・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）による
分析のためにアリコートを取った。分子量28,100ダルト
ンの１本のバンドが見られた。還元剤なしでは、sCD40
のSDS−PAGE分析は２本のバンドを示し、大きいバンド
の分子量は56,000であり、小さい方のバンドの分子量は
28,000であった。該バンディングパターンは、sCD40の
大部分は溶液中でジスルフィド結合ホモダイマーとして
存在することを示している。28,000のバンドはフリーの
モノマーである。
銀染色によりCD40タンパク質を可視化した。サンプル
タンパク質濃度は、超純粋ウシ血清アルブミンをスタン
ダードとするマイクロBCA測定法（ピアス（Pierce））
を用いて測定した。可溶性CD40純度及びタンパク質濃度
は、アミノ酸分析により確認した。精製した可溶性CD40
をPVDFペーパーに吸収させ、アプライド・バイオシステ
ムズ・モデル477Aタンパク質配列分析装置で、Ｎ−末端
タンパク質配列分析についてのメーカーの説明書に従っ
て、該ペーパーを自動エドマン分解に付した。この操作
は、sCD40のタンパク質配列を点検した。
可溶性CD40及びCD40/Fc融合タンパク質は、抗CD40mAb
（G28−５）の不存在下でヒトＢ細胞応答を調節するこ
とができた。精製した扁桃腺Ｂ細胞を抗IgM及びヒトIL
−４と一緒に培養して、sCD40又はCD40/Fc融合タンパク
質のいずれかを添加した。どの型のCD40も、（トリチウ
ム標識チミジン取り込みにより測定して）Ｂ細胞増殖へ
の阻害作用を有さなかった。対照的に、IL−４レセプタ
ーは、濃度に依存して、IL−４誘導Ｂ細胞増殖を阻害し
た。
２ドナーMLC（混合リンパ球培養）系でIL−４誘導IgE
分泌を阻害する能力について可溶性CD40及びCD40/Fcを
試験した。３実験において、CD40の濃度が増加するにつ
れて、IgE産生のレベルが減少した。10μg/mlの濃度で
添加した可溶性CD40は、アレルギーのこのモデルにおけ
るIgE分泌を完全に阻害することができた。更に、CD40/
Fcもその可溶性等価物と類似の作用を有した。しかしな
がら、IL−７レセプター・Fc融合タンパク質（公表され
たIL−７レセプター配列で類似の操作により作った）の
添加は、このモデルにおけるIgEの分泌に影響を及ぼさ
なかった。
CD23のレベルもsCD40又はCD40/Fc融合タンパク質に対
応して同じMLCで測定した。可溶性CD40は、IL−４単独
で刺激した培養物に比較して、６日目で小さいが再現性
よくsCD23レベルを低下させたが、12日目に同じ培養物
においてより強い阻害作用を示した。IL−４刺激Ｔ除去
PBM（末梢血マクロファージ）E-細胞による可溶性CD23
の誘発もsCD40の添加により同じく影響を受け、６日目
でsCD23レベルが小さく低下し、12日目でより著しい阻
害作用を示した。各培養系において、CD40/Fc融合タン
パク質での結果は、sCD40での結果と実質的に同じであ
った。
CD40−ＬのcDNAを単離するために、市販の固相剤（IO
DO−GEN,ピアス）を用いて、精製したCD40/Fc融合タン
パク質を125Iで放射標識した。この操作において、５μ
ｇのIODO−GENを10×75mmガラス試験管の底にプレート
し、75μｌの0.1Mリン酸ナトリウム（pH7.4）及び20μ
ｌ（2mCi）Na125Iと共に４℃で20分間インキュベートし
た。次いで、45μlPBS（リン酸塩緩衝液）中に５μｇの
CD40/Fcを含有する第２ガラス試験管に該溶液を移し
て、この反応混合液を４℃で20分間インキュベートし
た。2ml充填容量のセファデックス（登録商標）Ｇ−25
（シグマ）でゲル濾過することによってこの反応混合物
を分画してから、2.5％（v/v）ウシ血清アルブミン（BS
A）、0.2％（v/v）ナトリウムアジド及びpH7.4の20mM H
EPES結合培地を含有するRPMI1640培地中で平衡化した。
最終プールの125ICD40/Fcを結合培地中１×10-7Mの作業
ストック溶液に希釈して、レセプター結合活性の検出し
得る損失なしに４℃で１ヵ月まで貯蔵した。
ビオチニル化CD40/Fc融合タンパク質の結合に基づい
て、FACS（蛍光活性化細胞分離）により選別したEL−４
細胞系からcDNAライブラリーを調製した。選別したEL−
４細胞によるCD40のリガンドの発現に基づく蛍光強度の
有意な変化があるまで、細胞を５回選別した。該５回選
別細胞をEL−4 0.5細胞と呼び、EL−4 0.5mRNAからのcD
NAライブラリーを作成するためにこれら細胞を培養し
た。簡単に説明すると、cDNAを合成し、空のpDC406ベク
ターの中に挿入して大腸菌に中に形質転換した。形質転
換体をプールし、該プールからのDNAを単離し、CV1−EB
NA細胞の中に形質移入して発現クローニングライブラリ
ーを作成した。形質移入CV1−EBNA細胞をスライド上で
３日間培養してCD40−Ｌを一過性発現させた。次いで、
該形質移入細胞を含有するスライドを放射標識CD40/Fc
と一緒にインキュベートし、洗浄して未結合CD40/Fcを
除き、そしてグルタルアルデヒドで定着した。該定着ス
ライドを液状写真乳剤に漬けて暗所で露光した。該スラ
イドを現像した後、顕微鏡でそれらを別々に検査して、
明るいバックグランドに対するオートラジオグラフの銀
粒子の存在によりCD40−Ｌを発現する細胞を同定した。
EL−4 0.5細胞からの発現クローニングライブラリー
をスクリーニングし、約2000の別々のクローンを含有す
る１つのプールを、125I標識CD40/Fc融合タンパク質と
の結合について陽性であると同定した。このプールを約
200コロニーのより小さなプールに分割した。該小さな
プールを上記のようにしてスクリーニングした。該小さ
なプールのうちの１つがCD40−Ｌについて陽性であっ
た。
１つのクローンを単離して標準法により配列決定し、
図１及び配列番号:1に示したマウスCD40−ＬのcDNA配列
及び推定アミノ酸配列を得た。
ヒト同族CD40−LcDNAを種間交叉ハイブリダイゼーシ
ョン法により見出した。簡単に説明すると、CD3（10ng/
ml）及びインターロイキン−２（IL−2,10ng/ml）に結
合するOKT3抗体（ATCC,ロックビル,MD）で６日間処理し
た末梢血リンパ球から、ヒト末梢血リンパ球（PBL）cDN
Aライブラリーを作った。該PBL細胞を洗浄し、次いで10
ng/ml PMA（フォルボールミリステートアセテート，シ
グマ，セントルイス）及び500ng/mlイオノマイシン（カ
ルバイオケム（Calbiochem））で４時間刺激した。刺激
したPBL細胞からmRNAを単離し、cDNAを生成させてcDNA
をEcoR Iリンカーに連結した。連結したcDNAを、メーカ
ーの説明書に従って、λgt10ファージクローニングビヒ
クル（ギガパック（登録商標）ストラタジーン，サンデ
ィエゴ,CA）のEcoR I部位に挿入した。ファージを増幅
し、15cmプレート当たり約20,000ファージの密度でプレ
ートして、マニアチス（Maniatis）ら,Molecular Biolo
gy:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laborato
ry,NY,1982,pp.316−328に記載されているようにして、
ファージリフトを行った。配列番号:1及び図１のヌクレ
オチド13からヌクレオチド793までのマウスCD40−Ｌの
コーティング領域に対応するマウスプローブを構築し
た。このプローブは、温和または苛酷なストリンジェン
ト条件で、PBLライブラリーファージリフトとハイブリ
ダイズした。簡単に説明すると、ハイブリダイゼーショ
ン条件は、６×SSC、１×デンハルツ溶液、2mM EDTA、
0.5％Np40（ノニデットＰ−40洗浄剤）で63℃で一晩行
うものであった。これに続いて、３×SSC、0.1％SDS
中、55℃で３時間洗浄し、Ｘ線フィルムに一晩露光し
た。1000プラーク当たり約１プラークの頻度で陽性プラ
ークを同定した。陽性プラークを２回精製して増幅した
培養物からcDNAを調製した。
ここに開示したマウス又はヒトCD40−LcDNA配列は、
種間交叉ハイブリダイゼーション法によりマウス又はヒ
トCD40−Ｌの他の哺乳動物同族体をコードするcDNAを得
るために用いることができる。簡単に説明すると、図１
（配列番号:1）に記載したマウスCD40−Ｌ又は図２（配
列番号:11）に記載したヒトCD40−Ｌの細胞外領域のヌ
クレオチド配列からオリゴヌクレオチドプローブを作成
する。このプローブは、マニアチスらの前記文献に記載
されたものの如き標準法によって作ることができる。マ
ウス又はヒトプローブを用いて、温和なストリンジェン
ト条件で、哺乳動物cDNAライブラリー又はゲノミックラ
イブラリーをスクリーニングする。哺乳動物cDNAライブ
ラリー又はゲノミックライブラリーの例には、cDNAにつ
いて、哺乳動物の末梢血リンパ球から作られるライブラ
リーが含まれる。また、種々の細胞系から単離した種々
のcDNAライブラリー又はmRNAをノーザンハイブリダイゼ
ーションによりスクリーニングして、哺乳動物CD40−L
DNA又はmRNAの適当な供給源を確認することができる。
組換えDNA法によるCD40−Ｌの発現のための組換え発
現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウィルス、又は昆虫
遺伝子由来のものの如き適当な転写又は翻訳調節ヌクレ
オチド配列に機能できるように連結された、CD40−Ｌポ
リペプチドをコードする合成又はcDNA由来のDNA断片を
含むCD40−L DNA配列を含む。調節配列の例には、遺伝
子発現において調節の役割を有する配列（例えば、転写
プロモーター又はエンハンサー）、任意要素である転写
を制御するためのオペレーター配列、mRNAリボソーム結
合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の開始及び
終結を制御する適当な配列が含まれる。ヌクレオチド配
列は、調節配列がCD40−L DNA配列に機能的に関係する
場合は、機能できるように連結される。かくして、プロ
モーターヌクレオチド配列がCD40−L DNA配列の転写を
制御する場合は、該プロモーターヌクレオチド配列はCD
40−L DNA配列に機能できるように連結される。更に、
リボソーム結合部位がベクター内で翻訳を促進する位置
にある場合は、該リボソーム結合部位はCD40−Ｌポリペ
プチドのための配列に機能できるように連結していると
いえる。加えて、シグナルペプチドをコードする配列を
発現ベクターの中に組み込むことができる。例えば、シ
グナルペプチド（分泌リーダー）のためのDNA配列をCD4
0−L DNA配列に機能できるように連結してもよい。該シ
グナルペプチドは、酵母宿主細胞により翻訳される融合
ポリペプチドの細胞外分泌を向上させることができる前
駆体アミノ酸配列として発現される。
CD40−Ｌポリペプチドの発現に適する宿主細胞には、
原核細胞、酵母又は高等真核細胞が含まれる。原核細胞
には、グラム陰性又はグラム陽性微生物、例えば、大腸
菌又は杆菌が含まれる。形質転換に適する原核宿主細胞
には、例えば、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、並び
にシュードモナス属、ストレプトミセス属、及びブドウ
球菌属に属するいろいろな他の種が含まれる。高等真核
細胞には哺乳動物器官の株化細胞系が含まれる。ここに
開示したDNA構築体由来のRNAを用い、無細胞翻訳系を用
いてCD40−Ｌポリペプチドを産生することもできるかも
知れない。細菌、菌類、酵母、及び哺乳動物細胞宿主で
用いるのに適切なクローニング及び発現ベクターは、例
えば、パウエルスら、Cloning Vectors:A Laboratory M
anual,Elsevier,New York,（1985）に記載されている。
大腸菌の如き原核宿主細胞においては、CD40−Ｌポリ
ペプチド又は類縁体は、該原核宿主細胞内での該組換え
ポリペプチドの発現を促進するために、Ｎ−末端メチオ
ニン残基を含んでもよい。該Ｎ−末端Metを、発現した
組換えCD40−Ｌポリペプチドから切断してもよい。原核
宿主細胞は、広範囲なタンパク質分解又はジスルフィド
プロセシングが必要でないCD40−Ｌポリペプチドの発現
に用いることができる。
組換えCD40−L DNA配列を保持する発現ベクターを適
した宿主微生物又は哺乳動物細胞系の実質的に均質な培
養液に形質移入又は形質転換する。形質転換された宿主
細胞は、CD40−Ｌポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列で形質転換又は形質移入された細胞で、CD40−Ｌ
ポリペプチドを発現する。発現されたCD40−Ｌポリペプ
チドは、宿主細胞の性質及び該宿主細胞内の挿入された
遺伝子構築体に依存して、該宿主細胞内と止まりかつ／
又は培養上澄み液内に分泌されるであろう。
原核宿主細胞内に形質移入された発現ベクターは、一
般に、１又は２以上の表現型選択可能マーカー（phenot
ypic selectable markers）を含む。表現型選択可能マ
ーカーは、例えば、抗生物質耐性を与えるか又は独立栄
養要求性を満たすタンパク質をコードする遺伝子、及び
該宿主内での増幅を保証するために該宿主により認識さ
れる複製起点である。原核宿主細胞に有用な他の発現ベ
クターは、市販のプラスミド由来の細菌起源の選択可能
マーカーを含む。この選択可能マーカーは、クローニン
グベクターpBR322（ATCC37017）の遺伝子要素を含むこ
とができる。pBR322はアンピシリン及びテトラサイクリ
ン耐性のための遺伝子を含有するので、形質転換細胞を
同定する簡単な手段を提供する。pBR322“バックボー
ン”部分は、適当なプロモーター及びCD40−Ｌ DNA配
列と連結している。他の市販のベクターには、例えば、
pKK223−３（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ，ウ
プサラ，スウェーデン）及びpGEM1（プロメガ・バイオ
テック，マジソン,WI,USA）が含まれる。
プロモーター配列は、普通、組換え原核宿主細胞発現
ベクターに用いられる。普通のプロモーター配列には、
β−ラクタマーゼ（ペリシリナーゼ）、ラクトースプロ
モーター系（チャン（Chang）ら,Nature 275:615,1978;
及びジョデル（Goeddel）ら,Nature 281:544,1979）、
トリプトファン（trp）プロモーター系（ジョデルら,Nu
cl.Acids Res.8:4057,1980;及びEP−Ａ−36776）及びta
cプロモーター（マニアチスら,Molecular Cloning:A La
boratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,p.41
2,1982）が含まれる。特に有用な原核宿主細胞発現系
は、ファージλPLプロモーター及びcI857ts熱不安定性
リプレッサー配列を用いる。該λPLプロモーターの誘導
体が組み込まれているアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクションから入手できるプラスミドベクターに
は、プラスミドpHUB2（大腸菌株JMB9（ATCC37092）内の
レジデント）及びpPLc28（大腸菌RR1（ATCC53082）内の
レジデント）が含まれる。
CD40−Ｌを酵母宿主細胞内で、好ましくはサッカロミ
セス属（例えば、サッカロミセス・セレビシエ）から発
現してもよい。ピチア（Pchia）属又はクルイベロミセ
ス（Kluyveromyces）属の如き他の酵母の属を用いても
よい。酵母ベクターは、２μ酵母プラスミドからの複製
起点配列、autonomoosly replicating sequence（AR
S）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配
列、及び転写終結のための配列を含有することが多いで
あろう。好ましくは、酵母ベクターは、複製起点配列及
び選択可能マーカーを含む。酵母ベクターに適するプロ
モーター配列には、メタロチオネインのためのプロモー
ター、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ヒッツェマン
（Hitzeman）ら,J.Biol.Chem.255:2073,1980）又は他の
解糖酵素（ヘス（Hess）ら,J.Adv.Enzyme Reg.7:149,19
68;及びホーランド（Holland）ら,Biochem.17:4900,197
8）、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−
ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピル
ビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルコトキナーゼ、
グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホス
ホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオ
ースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソ
メラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。酵母発現に
用いるのに適する他のベクター及びプロモーターは、ヒ
ッツェマン,EP−Ａ−73,657に更に記載されている。
大腸菌内での選択及び複製のために、例えば、pBR322
からのDNA配列（Ampr遺伝子及び複製起点）を用いて酵
母ベクターを組み立てることができる。酵母発現構築体
内に含まれることができる他の酵母DNA配列には、グル
コース抑制可能ADH2プロモーター及びα−因子分泌リー
ダーが含まれる。該ADH2プロモーターは、ラッセル（Ru
ssell）ら（J.Biol.Chem.258:2674,1982）及びベイヤー
（Beier）ら（Nature 300:724,1982）に記載されてい
る。酵母α−因子分泌リーダー配列は異種ポリペプチド
の分泌を行う。α−因子分泌リーダー配列は、プロモー
ター配列と構造遺伝子配列の間に挿入されることが多
い。例えば、カーヤン（Kurjan）ら,Cell 30:933,1982
及びビター（Bitter）ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:5
330,1984を参照のこと。酵母宿主からの組換えポリペプ
チドの分泌を促進するのに適する他のリーダー配列は、
当業者に知られている。リーダー配列の3'末端の近傍を
修飾して１又は２以上の制限部位を含有させてもよい。
これは、構造遺伝子へのリーダー配列の融合を促進する
であろう。
酵母形質転換の手順は当業者に知られている。かかる
手順の１つは、ヒネン（Hinnen）らにより、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 75:1929,1978に記載されている。ヒネン
らの手順は、選択培地中でTrp+形質転換体を選択してお
り、該選択培地は、0.67％酵母窒素原基礎培地、0.5％
カザミノ酸、２％グルコース、10μg/mlアデニン及び20
μg/mlウラシルからなる。
ADH2プロモーター配列を含有するベクターにより形質
転換された酵母宿主細胞は、発現を誘発するために“富
（rich）”培地内で成育させてもよい。富培地の例は、
80μg/mlアデニン及び80μg/mlウラシルを補充した１％
酵母エキス、２％ペプトン、及び１％グルコースからな
るものである。ADH2プロモーターの抑制解除は、グルコ
ースが培地から使い尽くされたときに起こる。
哺乳動物又は昆虫宿主細胞培養系を用いて組換えCD40
−Ｌポリペプチドを発現することもできるかも知れな
い。適する哺乳動物宿主細胞系の例には、サル腎臓細胞
のCOS−７系（ATCC CRL1651）（グルツマン（Gluzman）
ら,Cell 23:175,1981）、Ｌ細胞、C127細胞、3T3細胞
（ATCC CCL163）、チャイニーズハムスター卵巣（CH
O）細胞、ヒーラー細胞、及びBHK（ATCC CRL10）細胞系
が含まれる。適する哺乳動物発現ベクターは、複製起
点、プロモーター配列、構造遺伝子に連結したエンハン
サー、リボソーム結合部位の如き他の5'又は3'フランキ
ング非転写配列、ポリアデニル化部位、スプライス供与
体及び受容体部位、及び転写終結配列等の非転写（nont
ranscribed）要素を含む。
哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写及び翻訳
制御配列をウィルスゲノムから切り取ってもよい。例え
ば、普通に用いられる哺乳動物細胞プロモーター配列及
びエンハンサー配列は、ポリオーマウィルス、アデノウ
ィルス２、シミアンウィルス40（SV40）、及びヒトサイ
トメガロウィルスから誘導される。SV40ウィルスゲノム
由来のDNA配列、例えば、SV40起点、初期及び後期プロ
モーター、エンハンサー、スプライス、及びポリアデニ
ル化部位を用いて、哺乳動物宿主細胞内の構造遺伝子配
列の発現に必要な他の遺伝子要素を供給してもよい。ウ
ィルス初期及び後期プロモーターは、その両方がウィル
ス複製起点も含有することができる断片としてウィルス
ゲノムから容易に得られるので、特に有用である（ファ
イアス（Fiers）ら,Nature 273:113,1978）。SV40ウィ
ルス複製起点部位内に位置するHind III部位からBgl I
部位に及ぶ約250bp配列が含まれていることを条件とし
て、より小さい又はより大きなSV40断片も用いることが
できる。
代表的な哺乳動物発現ベクターは、オカヤマ（Okayam
a）及びバーグ（Berg）（Mol.Cell.Biol.3:280,1983）
により開示されているようにして構築することができ
る。コスマン（Cosman）らによりNature 312:768,1984
に記載された有用な高発現ベクター、つまりPMLSV N1/N
4をATCC39890として寄託した。追加の有用な哺乳動物発
現ベクターは、EP−Ａ−0367566及び1991年５月16日に
出願された米国特許出願第07/701,415号に記載されてい
る。これらは、参照によりここに組み入れられるものと
する。CD40−Ｌの如きタイプIIタンパク質細胞外領域の
発現のためには、米国特許第4,965,195号に記載された
インターロイキン−７（IL−７）についてのシグナル配
列、又は1984年７月２日に出願された米国特許出願第06
/626,667号に記載されたインターロイキン−２レセプタ
ーについてのシグナル配列の如き異種のシグナル配列を
加えるべきである。
ヒト又はマウスCD40−Ｌは、細胞内及び膜貫通領域が
含まれている場合には膜結合型で、又細胞外領域だけの
場合は可溶型で作ることができる。本発明者らは、膜結
合マウスCD40−Ｌを発現する細胞を産するために、哺乳
動物細胞内で完全長マウスCD40−Ｌを発現させた。本明
細書中の実施例６に記載した方法を用いて、HAVEOベク
ター内の図１（配列番号:1）に示したcDNAで又はHAVEO
空ベクターでCV−１細胞を形質移入した。これは、膜結
合マウスCD40−Ｌを発現する形質移入CV−１細胞を産し
た。これら細胞を、以下の実施例10〜13に報告した一連
の実験用に、膜結合マウスCD40−Ｌの供給源として用い
た。
組換えCD40−Ｌポリペプチドの精製 CD40−Ｌポリペプチドは、CD40−Ｌポリペプチドを発
現するのに必要な培養条件下で、形質転換した宿主細胞
を培養することによって調製することができる。次い
で、生成した発現ポリペプチドを培養培地又は細胞抽出
物から精製することができる。所望により、市販のタン
パク質濃縮フィルター、例えば、アミコン（Amicon）又
はミリポア・ペリコン（Millipore Pellicon）超濾過装
置を用いて、CD40−Ｌポリペプチドを濃縮してもよい。
濃縮工程後、ゲル濾過媒質の如き精製マトリックスに適
用することができる。また、例えば、ペンダントのジエ
チルアミノエチル（DEAE）基を有するマトリックス又は
支持体、等のアニオン交換樹脂を使用することができ
る。該マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、
デキストラン、セルロース又はタンパク質精製に普通に
用いられる他のタイプであってもよい。また、カチオン
交換工程を採用してもよい。適するカチオン交換体に
は、スルホプロピル又はカルボキシメチル基を含む種々
の不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が
好ましい。
最後に、疎水性RP−HPLC媒質（例えば、ペンダントの
メチル又は他の脂肪族基を有するシリカゲル）を用いる
１又は２以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（RP−
HPLC）工程を採用して、CD40−Ｌを更に精製することが
できる。実質的に均質な組換えタンパク質を得るため
に、前述の幾つか又は全ての精製工程を組み合わせて採
用することもできる。
CD40リガンド結合ドメインを含むアフィニティカラム
を利用して、発現したCD40−Ｌポリペプチドをアフィニ
ティ精製することも可能である。CD40−Ｌポリペプチド
は、高い塩濃度の溶出用緩衝液でアフィニティカラムか
ら分離することができ、次いで、使用するために低い塩
濃度の緩衝液で透析することができる。
細菌培養で産生した組換えタンパク質は、通常、最初
に宿主細胞を崩壊させ、遠心分離し、不溶性ポリペプチ
ドの場合には細胞ペレットから抽出し、可溶性ポリペプ
チドの場合には上澄み液から抽出した後、１又は２以上
の濃縮、塩析、イオン交換、アフィニティ精製又はサイ
ズ排除クロマトグラフィー工程を行うことによって単離
される。最後に、最終精製工程のためにRP−HPLCを採用
してもよい。微生物細胞は、凍結融解の繰り返し、音波
破砕、機械的崩壊、又は細胞溶解剤を用いる方法を含
む、あらゆる慣用的方法によって崩壊することができ
る。
形質転換酵母宿主細胞は、好ましくはCD40−Ｌをポリ
ペプチド分泌物として発現させるために用いる。これは
精製を簡単にする。酵母宿主細胞醗酵から分泌された組
換えポリペプチドは、ウルダル（Urdal）ら（J.Chromat
og.296:171,1984）により開示された方法と類似の方法
により精製することができる。ウルダルらは、分取HPLC
カラムでの組換えヒトIL−２の精製に、２つの逐次（se
quential）逆相HPLC工程を記載している。
CD40−Ｌ組成物の投与 本発明は、適当な希釈剤又は製剤上の担体中に有効量
のCD40−Ｌを含む治療用組成物及び該組成物を用いて哺
乳動物を治療する方法を提供する。治療用途には、症状
に適する方法で治療するために、精製したCD40−Ｌ又は
生物学的に活性なその類縁体を、患者に、好ましくはヒ
トに投与する。かくして、例えば、目的の治療効果を得
るために投与される（例えば、可溶性細胞外ドメイン又
はその断片の形の）CD40−Ｌ医薬組成物を、濃縮塊注
射、継続的点滴、徐放型移植、又は他の適当な方法によ
って与えることができる。典型的には、CD40−Ｌ治療剤
は、生理学的に許容できる製剤上の担体、補助剤又は希
釈剤と混合した精製CD40−Ｌポリペプチドを含む医薬組
成物の形で投与されよう。かかる担体は、採用する投与
量及び濃度で患者に対して非毒性であろう。通常は、か
かる組成物の製剤は、CD40−Ｌポリペプチドを、緩衝
剤；アスコルビン酸の如き酸化防止剤；低分子量（約10
残基未満）ポリペプチド；タンパク質；アミノ酸；グル
コース、スクロース又はデキストランを含む炭水化物;E
DTAの如きキレート剤；グルタチオン及び他の安定剤及
び補助剤と混合することを伴う。中性緩衝食塩水又は同
種の血清アルブミンと混合した食塩水は、非常に適した
希釈剤である。CD40−Ｌセンス又はアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドを、コードする核酸配列及び有効なセンス
又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する有効量
のベクターを投与することによってin vivoで投与して
もよい。更に、CD40−L DNA又はmRNAを含有する細胞を
個体から取り、遺伝子移入技術を用いて該細胞内にアン
チセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを組み込み、そ
して該細胞を該個体内に再注入することにより、CD40−
Ｌセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドをex viv
oで投与してもよい。
以下の実施例は特定の態様を説明しすることを意図し
ており、本発明の範囲を限定することを意図するもので
はない。
実施例１ この実施例は、CD40リガンドをコードするcDNAクロー
ンの検出に用いる可溶性CD40−L/Fc融合タンパク質を発
現するCD40−L/FcDNA構築体の構築を説明するものであ
る。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を用い、スタメン
コビックらの前記文献に公表された配列に基づいて、完
全CD40ヒトレセプター配列の細胞外領域又はリガンド結
合ドメインのcDNA配列を得た。CD40プラスミド（CDM8）
をPCR増幅の鋳型として用いた。CDM8は、スタメンコビ
ックらの文献に記載されており該著者から得たものであ
る。5'（上流）及び3'（下流）オリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いるPCR法（サルキ（Sarki）ら,Science 23
9:487,1988）を用いて、CD40細胞外リガンド結合ドメイ
ンをコードするDNA配列を増幅した。上流のオリゴヌク
レオチドプライマー5'−CCGTCGACCACCATGGTTCGTCTGCC−
3'（配列番号:5）は、CD40のイニシエーターメチオニン
から上流にSal I部位を導入し、下流のオリゴヌクレオ
チドプライマー5'−ACAAGATCTGGGCTCTACGTATCTCAGCCGAT
CCTGGGGAC−3'（配列番号:7）は、CD40のアミノ酸193の
後ろにアミノ酸Tyr Val Glu Pro Arg（配列番号:8）を
挿入する。Glu及びProは、ヒトIgG1の蝶番部の最初の２
つのアミノ酸であり、そのあとにBgl II制限部位が続
く。該Bgl II制限部位は、CD40の細胞外ドメインをヒト
IgG1Fc領域の残りに融合するのに用いた。
DNA構築体pDC406/CD40/Fcをサル腎臓細胞系CV−1/EBN
A（ATCC CRL10478）内に形質移入した。pDC406プラス
ミドは、SV40、ヒト免疫不全ウィルス（HIV）、及びエ
プスタイン・バー・ウィルス（EBV）由来の調節配列を
含む。CV−1/EBNA細胞系は、エプスタイン・バー・ウィ
ルス核抗原−１（EBNA−１）をコードし、ヒトCMV即時
−初期（immediate−early）エンハンサー／プロモータ
ー由来のEBNA−１を構成的に発現する遺伝子でCV−１細
胞系を形質移入することにより得られた。EBNA−１遺伝
子は、pDC406の如きEBV複製起点を含有する発現ベクタ
ーのエピソーム複製を可能にする。
該融合構築体を発現する細胞を同定したので、形質移
入細胞の大規模培養を行って、CD40/Fcを発現する細胞
からの上澄み液を蓄積した。上澄み液中のCD40/Fc融合
タンパク質をアフィニティ精製により精製した。簡単に
説明すると、哺乳動物細胞上澄み液を（例えば、0.45μ
フィルターで）濾過し、濾液をプロテインA/G抗体アフ
ィニティカラム（シュライハー（Schleicher）及びシュ
エル（Schuell），キーン（Keene）,NH）に４℃で1.5cm
×12.0cmカラムについて80ml/hの流速で適用することに
よって、CD40/Fc融合タンパク質を含有する１リッター
の培養上澄み液を精製した。フリーのタンパク質が洗浄
緩衝液中に検出されなくなるまで、カラムをPBS（リン
酸塩緩衝液）中の0.5M NaClで洗浄した。最後に、PBSで
カラムを洗浄した。結合した融合タンパク質をpH2.8の2
5mMクエン酸緩衝液でカラムから溶出させ、pH9.1の500m
M HEPES緩衝液でpH7にした。該溶出したCD40/Fc融合タ
ンパク質の銀染色SDSゲルにより、＞98％純度であるこ
とが分かった。
市販の固相剤（IODO−GEN,ピアス）を用いて、精製し
たCD40/Fc融合タンパク質を125Iでヨウ素化した。この
操作において、５μｇのIODO−GENを10×75mmガラス試
験管の底にプレートし、75μｌの0.1Mリン酸ナトリウム
（pH7.4）及び20μｌ（2mCi）Na125Iと共に４℃で20分
間インキュベートした。次いで、45μlPBS中に５μｇの
CD40/Fcを含有する第２ガラス管に該溶液を移して、こ
の反応混合液を４℃で20分間インキュベートした。2ml
充填容量のセファデックス（登録商標）Ｇ−25（シグ
マ）でゲル濾過することによってこの反応混合物を分画
してから、2.5％（v/v）ウシ血清アルブミン（BSA）、
0.2％（v/v）ナトリウムアジド及びpH7.4の20mM HEPES
結合培地を含有するRPMI1640培地中で平衡化した。最終
プールの125ICD40/Fcを結合培地中１×10-7Mの作業スト
ック溶液に希釈して、レセプター結合活性の検出し得る
損失なしに４℃で１ヵ月まで貯蔵した。
約50〜60％の標識取り込みが認められた。放射性ヨウ
素化は、１×1015〜５×1015cpm/nmolの範囲の比活性を
もたらした。（タンパク質の分子当たり放射性ヨウ素原
子0.42〜2.0）。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
（SDS−PAGE）により、予想値と一致する単一の標識ポ
リペプチドの存在が明らかとなった。該標識融合タンパ
ク質は、98％トリクロロ酢酸（TCA）より大きい沈澱性
であった。これは、125Iが該タンパク質に共有結合した
ことを示している。
実施例２ この実施例は、CD40−Ｌを発現すると推定される細胞
系の選択を説明するものである。実施例１に記載した放
射標識CD40/Fc融合タンパク質を用いて幾つかの細胞系
をスクリーニングした。簡単に説明すると、標準法に従
って定量的な結合性研究を行い、種々の細胞系について
スキャッチャードプロットを得た。クローン細胞系（EL
−4,ATCCカタログTIP39）マウス胸腺腫細胞系を同定し
て選別した。選別に先立って、EL−４細胞が細胞当たり
約450分子のCD40−Ｌを発現することを見出した。７回
選別細胞をEL−4 0.7と呼び、これを成育させると細胞
当たり約10,000分子のCD40−Ｌを発現することが見出さ
れた。最後に、９回選別細胞をEL−4 0.9と呼び、これ
を成育させると細胞当たり約15,000分子のCD40−Ｌを発
現することを見出された。
実施例３ この実施例は、マウスCD40−Ｌの発現クローニングの
ためのcDNAライブラリーの調製を説明するものである。
該ライブラリーは、EL−4 0.5と呼ぶマウス胸腺腫細胞
系EL−４（ATCC TIP39）の５回選別クローンから調製し
た。EL−4 0.5細胞は、FACS（蛍光活性化セルソータ
ー）中、ビオチニル化CD40/Fc融合タンパク質で５回選
別したEL−４細胞であった。米国特許第4,968,607号に
本質的に記載されたEL−4 0.5から得たRNAからcDNAライ
ブラリーを作った。なお、この開示内容は参照によりこ
こに組み入れられるものとする。簡単に説明すると、EL
−4 0.5細胞系から抽出したトータルRNAから単離したポ
リ（Ａ）+mRNAの逆転写によりcDNAライブラリーを構築
した。該ライブラリー構築法は、オウスベル（Ausube
l）ら編,Current Protocols In Molecular Biology,Vo
l.1,（1987）に記載された方法と実質的に同じであっ
た。ポリ（Ａ）+mRNAは、オリゴdTセルロースクロマト
グラフィーにより単離し、二本鎖cDNAは、実質的にガブ
ラー（Gubler）ら,Gene 25:263,1983に記載された通り
に作った。ポリ（Ａ）+mRNA断片を、ランダムヘキサヌ
クレオチドをプライマーに用いて逆転写酵素によりRNA
−cDNAハイブリッドに転化した。次いで、RNアーゼＨを
DNAポリメラーゼＩと組み合わせて用いて、該RNA−cDNA
ハイブリッドを二本鎖cDNA断片に転化した。生成した二
本鎖cDNAをT4DNAポリメラーゼでブラントエンド型にし
た。
Sal Iアダプター 5'−TCG ACT GGA ACG AGA CGA CCT GCT−3' GA CCT TGC TCT GCT GGA CGA−5' を、ヘイマーレ（Haymerle）ら,Nucleic Acids Res.14:
8615,1986に記載されているようにして、生成したブラ
ントエンド型cDNAの5'末端に連結した。68℃でのゲル濾
過クロマトグラフィーにより未連結アダプターを除い
た。これは、24ヌクレオチド非自己相補的（non−self
−complementary）オーバーハングをcDNA上に残した。
同じ操作を用いて、哺乳動物発現ベクターpDC406の5'Sa
l I末端を、cDNAに付加したものと相補的な24ヌクレオ
チドオーバーハングに転化した。アダプター化ベクター
とcDNAの最適割合をT4ポリヌクレオチドキナーゼの存在
下で連結した。透析した連結混合物を大腸菌株DH5α内
にエレクトロポレーションで取り込ませ、アンピシリン
プレート上で形質転換体を選択した。
プール当たり約2,000クローンの形質転換大腸菌から
なる複数のプールからプラスミドDNAを単離した。DEAE
−デキストランを用いて、単離したDNAをCV1−EBNA細胞
の不完全集密層内に形質移入し、続いてルスマン（Luth
man）ら,Nucl.Acids Res.11:1295,1983及びマクカッチ
ャン（McCutchan）ら,J.Natl.Cancer Inst.41:351,1986
に記載された操作に実質的に従ってクロロキン処理を行
った。
CV1−EBNA細胞を完全培地（10％（v/v）ウシ胎児血
清、50U/mlペニシリン、50U/mlストレプトマイシン、及
び2mM L−グルタミンを含有するダルベッコ修飾イーグ
ル培地）中に維持し、１ウェル有室スライド（chambere
d slides）（Lab−Tek）に約２×105細胞／ウェルの密
度でプレートした。該スライドを1mlヒトフィブロネク
チン（10μg/mlPBS）で30分間前処理し、続いてPBSで１
回洗浄した。１層に成育している粘着細胞から培地を除
いて、66.6μＭクロロキンサルフェートを含有する1.5m
l完全培地に置き換えた。約0.2mlのDNA溶液（クロロキ
ンを含有する完全培地中に２μgDNA、0.5mg/mlDEAE−デ
キストラン）を該細胞に加えて、該混合物を37℃で約５
時間インキュベートした。インキュベーション後、培地
を除いて10％DMSO（ジメチルスルホキシド）を含有する
完全培地を添加することによって、該細胞に2.5〜20分
間衝撃を与えた。衝撃を与えた後、溶液を新たな完全培
地と置き換えた。細胞を２〜３日間培養して成育させ
て、挿入したDNA配列を一過性発現させた。これら条件
により、生存するCV1−EBNA細胞中、30〜80％の形質移
入頻度がもたらされた。
実施例４ この実施例は、実施例１で作った標識CD40/Fc融合タ
ンパク質での実施例３で作った発現クローニングライブ
ラリーのスクリーニングを説明するものである。48〜72
時間後、実施例１で調製した放射性ヨウ素化CD40/Fc融
合タンパク質を用いて、実施例３で作ったCV1−EBNA細
胞の形質移入単層を、CD40−Ｌの発現についてスライド
オートラジオグラフィーにより分析した。形質移入CV1
−EBNA細胞を結合培地（25mg/mlウシ血清アルブミン（B
SA）、2mg/mlナトリウムアジド、pH7.2の20mM HEPES、
及び50mg/ml脱脂粉乳を含有するRPMI1640）で１度洗浄
し、１×10-9M125I−CD40/Fc融合タンパク質を含有する
結合培地中で４℃で２時間インキュベートした。インキ
ュベーション後、該有室スライド内の細胞を結合培地で
３回洗浄し、続いてPBS（pH7.3）で２回洗浄して未結合
放射標識融合タンパク質を除いた。
PBS中の10％グルタルアルデヒド中でインキュベート
（室温で30分間）することによって該細胞を定着させ、
PBS中で２回洗浄して風乾した。該スライドをコダックG
TNB−２写真乳剤（水で６倍希釈）中に漬け、そして光
遮断ボックス内の暗所で２〜４日間室温で露光した。該
スライドをコダックD19現像液中で現像し、水で濯いでA
gfa G433C定着剤中で定着した。該スライドを25〜40×
の倍率の顕微鏡で個別に検査した。明るいバックグラン
ドに対するオートラジオグラフィーの銀粒子の存在によ
り、CD40−Ｌを発現する細胞を示す陽性のスライドを特
定した。
約2000の別々のクローンを含有する１つのプールが、
CD40/Fc融合タンパク質との結合について強い陽性と同
定された。このプールを力価測定してプレートし、それ
ぞれ約200コロニーを含有するプレートを得た。各プレ
ートを掻き取って、上記と同じ操作に従ってCV1−EBNA
細胞内に形質移入するためにプールしたプラスミドDNA
を得た。先に記載したスライドオートラジオグラフィー
により該より小さなプールをスクリーニングした。該小
さなプールのうちの１つについて、CD40/Fc融合タンパ
ク質に結合できる発現遺伝子産物が存在することが示さ
れ、これがCD40−Ｌについて陽性であるクローンを含有
した。
この陽性の小さなプールを力価測定してプレートし、
別々のコロニーを得た。約400の別々のコロニーを採取
して96ウェルプレートの別々のウェル内の培養培地に接
種した。行及び列毎にプールすることにより培養物を混
合し、該混合した培養物を用いて最終ラウンドの形質移
入及びスクリーニング用のDNAを調製した。陽性行及び
陽性列の交叉部分が強い陽性コロニーであることを示し
た。10の強い陽性コロニー（即ち、候補クローン）を同
定した。それぞれの候補クローンからDNAを単離して、
形質移入及びスクリーニングを行った。５候補クローン
がCD40/Fcへの結合により陽性であった。５陽性候補ク
ローン全てが1468ヌクレオチドのcDNA挿入体を含有する
ことが、ジデオキシヌクレオチド配列決定法により確認
された。該CD40−ＬクローンのcDNAコーティング領域
は、図１及び配列番号:1の配列に対応する。
pDC406−mCD40−Ｌと命名した、マウスCD40−Ｌ配列
を含有するクローニングベクターを、1991年12月６日に
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション，ロッ
クビル,MD（ATCC）に、受託番号68872で寄託した。この
クローンのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を配
列番号:1及び図１に示した。
実施例５ この実施例は、マウスCD40−Ｌの配列からデザインし
たプローブを用いてヒトCD40−Ｌ同族体を単離するのに
用いた種間交叉ハイブリダイゼーション法を説明するも
のである。マウスCD40−ＬクローンpDC406−CD40−Ｌか
らコーティング領域（ヌクレオチド13からヌクレオチド
793まで）を切り取り、ランダムプライマー（ベーリン
ガー・マンハイム）を用いて該断片を32P標識すること
によって、マウスCD40−Ｌプローブを作った。
λgt10アームを用いて、ヒト末梢血リンパ球（PBL）c
DNAライブラリーをλファージベクター内に構築し、市
販のキット（ギガパック（登録商標）ストラタジェン，
サンディエゴ,CA）を用い、メーカーの説明書に従ってi
nvitroでパッケージングした。該PBL細胞は、正常なボ
ランティアから得、10ng/mlのOKT3（抗CD3抗体）、及び
10ng/mlのヒトIL−２（イムネックス，シアトル,WA）で
６日間処理したものである。該PBL細胞を洗浄し、500ng
/mlイオノマイシン（カルバイオケム）及び10ng/mlPMA
（シグマ）で４時間刺激した。該刺激したPBL細胞からm
RNA及びcDNAを得て、メーカーの説明書に従ってλgt10
ファージベクター（ギガパック（登録商標）ストラタジ
ェン）内にパッケージングした。
該マウスプローブを、６×SSC（15mMクエン酸トリナ
トリウム、及び165mM塩化ナトリウム）、１×デンハル
ツ溶液、2mM EDTA、0.5％Np40中、63℃で一晩、ファー
ジcDNAにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーショ
ンに続いて、３×SSC、0.1％SDSで、約55℃で３時間洗
浄した。オートラジオグラフィーにより、特異的なバン
ドを可視化した。
hCD40−Ｌと命名した、ヒトCD40−Ｌ配列を含有する
クローニングベクターを、1991年12月６日にアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション，ロックビル,MD
（ATCC）に、受託番号68873で寄託した。このクローン
のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を配列番号:1
1及び図２に示した。
実施例６ この実施例は、CV1−EBNA細胞内での膜結合マウスCD4
0−Ｌの発現を説明するものである。マクマハン（McMah
an）ら,EMBO J.10:2821,1991に記載され、本明細書の実
施例３に記載した方法の如き標準法を用いて、HAVEOベ
クター内のマウスCD40−LcDNA又は空のHAVEOベクターを
CV1−EBNA細胞内に形質移入した。簡単に説明すると、1
0％ウシ胎児血清を補充した10mlのダルベッコ最小必須
培地（メディアム）に、10cm培養皿当たり２×106細胞
の密度でCV1−EBNA細胞をプレートした。細胞を37℃で
一晩粘着させた。該メディアムを、66.7μＭクロロキン
及びmCD40−Ｌをコードする５μｇのcDNAを含有するDNA
混合物を含有する1.5mlのメディアムと置き換えた。175
μｌ及び25μｌのDEAEデキストラン（PBS中4mg/ml）を
含む培地も該細胞に添加した。該細胞とcDNAを37℃で５
時間インキュベートした。該cDNA混合物を除いて、10％
DMSOを含有する1mlの新たなメディアムで該細胞に2.5分
間衝撃を加えた。該メディアムを新たなメディアムと置
き換えて、細胞を少なくとも３日間成育させた。
実施例７ この実施例は、CD40−Ｌに対するモノクローナル抗体
の調製を説明するものである。精製マウスCD40−Ｌ又は
ヒトCD40−Ｌの試料を、ここに記載したCOS細胞発現及
びCD40/Fcアフィニティ精製により調製する。精製CD40
−Ｌは、慣用法、例えば、米国特許第4,411,993号に記
載された方法を用いて、CD40−Ｌに対するモノクローナ
ル抗体を生成することができる。簡単に説明すると、CD
40−Ｌを免疫原として完全フロインドアジュバント中に
乳化し、10〜100μｇの範囲の量を皮下又は腹腔内注射
してマウスを免疫感作する。10〜12日後、免疫感作した
該動物に、不完全フロインドアジュバント中に乳化した
CD40−Ｌを追加注射する。その後、週１回から週２回の
免疫スケジュールでマウスを周期的に注射する。CD40−
Ｌ抗体についてドットブロット分析又はELISA（酵素結
合免疫吸着検定法）により試験するために、眼縁後部か
らの採血又は尾の先端の切除により、血清サンプルを周
期的に採取する。
適当な抗体力価の検出に続いて、食塩水中のCD40−Ｌ
を陽性マウスに最後に１回静脈内注射する。３〜４日後
に、該動物を殺して、脾臓細胞を採取し、そして脾臓細
胞をマウスミエローマ細胞系（例えば、NS1又はAg8.65
3）と融合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が生
成し、これをHAT（ハイポキサンチン、アミノプテリン
及びチミジン）選択培地中でマルチプルマイクロタイタ
ープレートにプレートして、未融合細胞、ミエローマハ
イブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害す
る。
エングバル（Engvall）ら,Immunochem.8:871,1971及
び米国特許第4,703,004号に開示された方法を適用し
て、精製CD40−Ｌに対する反応性について、このハイブ
リドーマ細胞をELISAによりスクリーニングする。陽性
ハイブリドーマ細胞を同系BALB/cマウスに腹腔内注射し
て、高濃度の抗CD40−Ｌモノクローナル抗体を含有する
腹水を得ることができる。また、種々の方法により、ハ
イブリドーマ細胞をフラスコ又は回転容器中でin vitro
で成育させることができる。マウス腹水中に生成したモ
ノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈澱をしてから
ゲル排除クロマトグラフィーに付することによって精製
することができる。また、CD40−Ｌへの結合に基づくア
フィニティクロマトグラフィーができるので、プロテイ
ンＡ又はプロテインＧへの抗体結合に基づくアフィニテ
ィクロマトグラフィーを用いることもできる。
実施例８ この実施例は、sCD40及びCD40/Fc融合タンパク質の抗
アレルギー治療作用を説明するものである。可溶性CD40
及びCD40/Fcを、２ドナーMLC系におけるIL−４（5ng/m
l）誘導IgE分泌を阻害するそれらの能力について試験し
た。３実験からのデータを表１に示す。
培養12日後にIgEレベルをELISA法により測定した。簡
単に説明すると、PBS（リン酸塩緩衝液）で1:500に希釈
したマウスmAb抗ヒトIgE（ジメド（Zymed））で平底96
ウェルマイクロタイタープレート（コーニング）をコー
ティングした。３回洗浄した後、５％脱脂粉乳を用いて
遮断工程を行い、続いてヒトIgEスタンダード又は試験
上澄み液を滴定した。３回洗浄した後、ビオチニル化ヤ
ギ抗ヒトIgE（キルケガード（Kirkegaard）及びペリー
（Perry））を1:500の希釈度で添加した。この後、更に
洗浄し、次いで、1:500の希釈度でストレプトアビジン
−HRP（ジメド）を添加した。更に洗浄した後、TMB基質
（キルケガード及びペリー）を用いて反応を行い、520n
mで吸光度を測定した。全ての洗浄工程は、PBSプラス0.
05％ツィーン中で行った。全てのインキュベーション工
程は、100μl/ウェルの容量で室温で１時間行った。こ
の測定法の感度は、100pg/mlである。
実施例９ この実施例は、可溶性CD23がIL−４（5ng/ml）刺激Ｂ
細胞から脱落するのを阻害するsCD40及びCD40/Fc融合タ
ンパク質の作用を説明するものである。可溶性CD40及び
CD40/Fcを、２ドナーMLC系におけるIL−４誘導sCD23脱
落を阻害するそれらの能力について試験した。３実験か
らのデータを表２に示す。
培養６及び12日後に市販のsCD23ELISA検出キット（ビ
ンディング・サイト，サンディエゴ,CA）により可溶性C
D23レベルを測定した。その感度限界は500pg/mlであっ
た。約１×105細胞／ウェルを、平底96ウェルマイクロ
タイタープレート（インターマウンテン・サイエンティ
フィック，バウンチファル,UT）で、表２に示した時
間、示した添加物の存在下又は不存在下で３重に培養し
た。結果はsCD40の抗アレルギー作用を示している。sCD
40の代わりにCD40/Fcを用いて類似の研究を行い（デー
タは示していない）、類似の結果が得られた。従って、
実施例８及び９のこれらデータは、CD40についての抗ア
レルギー特性を示すものである。
実施例10 この実施例は、ヒトＢ細胞についての膜結合マウスCD
40−ＬのＢ細胞増殖活性を説明するものである。ヒスト
パクー（Histopaque）（登録商標）（シグマ，セントル
イス,MO）での密度勾配遠心分離により、正常なボラン
ティアからの末梢血からヒト末梢血単核細胞（PBMC）を
単離した。臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム処
理SRBC（ヒツジ赤血球）でのロゼッティング及び更にヒ
ストパクーでの密度勾配遠心分離によりＴ細胞を除くこ
とによって、細胞（E-）のＴ細胞除去試料を得た。10％
熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）を加えたPRMI培地中、3
7℃、10％CO2雰囲気下で、Ｂ細胞増殖分析をE-試料で行
った。約１×105E-細胞／ウェルを、平底96ウェルマイ
クロタイタープレート（コーニング）で、７日間、形質
移入CV1−EBNA細胞（実施例６に記載した）の存在下で
３重に培養した。該CV1−EBNA細胞は、マウスCD40−LcD
NA又は空ベクターで形質移入されたものである。培養の
最終８時間、該細胞を１μCi/ウェルのトリチウム標識
チミジン（25Ci/nmole,アマシャム，アーリントンハイ
ト,IL）でパルスした。自動細胞採取装置でグラスファ
イバーディスク上に細胞を採取し、取り込まれたcpmを
液体シンチレーションスペクトロメトリにより測定し
た。
図4aは、空ベクター（HAVEO）又はHAVEOベクター中の
マウスCD40−LcDNAで形質移入されたCV1−EBNA細胞のヒ
トＢ細胞増殖の比較を示している。これらデータは、膜
結合CD40−Ｌが、協同***促進因子の不存在下でヒトＢ
細胞増殖を刺激することを示している。図4bは、培養物
中に10ng/mlのヒトIL−４を添加した以外は同じ実験を
示している。この実験では、IL−４が膜結合マウスCD40
−ＬのＢ細胞***促進活性を僅かに増進している。図５
は、図4bに示した実験を繰り返したものである。しかし
ながら、該実験を繰り返した場合には、IL−４協同***
促進活性の形跡はなかった。CD40−Ｌの***促進活性の
形跡はあった。従って、膜結合CD40−ＬはヒトＢ細胞の
増殖を刺激する。
実施例11 この実施例は、実施例10で単離したE-細胞からのIgE
産生及びCD23脱落を刺激する膜結合マウスCD40−Ｌの作
用を説明するものである。約１×105細胞／ウェルを平
底96ウェルヌンクマイクロタイタープレート（インター
マウンテン・サイエンティフィック，バウンチファル,U
T）で、イスコフ（Iscove,s）修飾ダルベッコ培地（IMD
M）プラス10％FCS中、10％CO2の加湿雰囲気下で３重に
培養した。培地には、50μg/mlヒトトランスフェリン
（シグマ）、0.5％ウシ血清アルブミン（シグマ）及び
それぞれ１μg/mlのオレイン、リノレイン及びパルミチ
ン酸（シグマ）を補充した。5ng/mlヒトIL−４の存在下
で、E-細胞を10日間培養した。マウスCD40−Ｌ又は空ベ
クターで形質移入したある力価のCV1−EBNA細胞を添加
した。10日後、実施例８に記載したELISA法によりIgEを
又は実施例９に記載した方法によりCD23脱落を分析し
た。
図６は、E-細胞と空ベクター（HAVEO）又はCD40−Ｌ
で形質移入されたCV1−EBNA細胞の培養物について、上
澄み液中のIgE産生（ng/ml）の比較を示している。3000
CV1−EBNA細胞までは差が見られないが、10000又は3000
0のCD40−Ｌ形質移入CV1−EBNA細胞の添加で、有意なIg
E産生がもたらされた。比較として、E-細胞を培地単独
で又は5ng/mlIL−４と共に又は5ng/mlIL−４プラス500n
g/mlG28−５抗体と共にインキュベートした場合、IgE産
生はそれぞれ4.7、2.9及び＞600ng/mlであった。図７に
おいて、CD23脱落を測定した場合、CD40−Ｌで形質移入
された10000又は30000のCV1−EBNA細胞は、空ベクター
コントロールCV1−EBNA細胞に比較して、増加したCD23
脱落を示した。比較として、E-細胞を培地単独で又は5n
g/mlIL−４と共に又は5ng/mlIL−４プラス500ng/mlG28
−５抗体と共にインキュベートした場合、CD23脱落はそ
れぞれ＜0.1、2.4及び11.2ng/mlであった。これらデー
タは、IgE産生及びCD23脱落の両方が膜結合CD40−Ｌに
付随する生物活性であることを示している。
実施例12 この実施例は、Ｂ細胞増殖活性、ポリクローナルイム
ノグロブリン（Ig）産生、抗原特異性抗体形成及び膜結
合及び可溶性CD40−Ｌを臨床応用に用いる種々の方法を
説明するものである。本発明者らは、前記のグラブシュ
タインらＩ、前記のマリスゼウスキーらＩ及び前記のマ
リスゼウスキーらIIに記載された操作に従って、マウス
脾臓Ｂ細胞を得た。簡単に説明すると、Ｔ細胞抗血清及
び補体を用いるＴ細胞除去及び、セファデックス（登録
商標）G10カラムに通すことによる粘着細胞除去、及び
ヤギ抗マウスIgMでコーティングしたペトリ皿上でのパ
ンニングによるＢ細胞陽性選択により、細胞の混合培養
物を精製した。精製したＢ細胞を、RPMI、ウシ胎児血清
（Ｂ細胞増殖分析用に５％及びプラーク形成細胞分析又
はポリクローナル抗体分析用に20％）、２−メルカプト
エタノール、抗生物質、アミノ酸、及びビルベート中で
培養した。Ｂ細胞増殖は、実施例10及び前記のグラブシ
ュタインらＩ、前記のマリスゼウスキーらＩ及び前記の
マリスゼウスキーらIIに記載された測定法に従って測定
した。抗原特異性抗体形成は、グラブシュタインら,J.M
ol.Cell.Immunol.2:199,1986〔グラブシュタインらII〕
に記載された操作に従って測定した。簡単に説明する
と、抗原特異性抗体形成は、抗原としてヒツジ赤血球
（SRBC）（0.03％v/v）を1ml当たり１×106マウスＢ細
胞の培地2.0ml中で用いた。該Ｂ細胞培養物を５日間イ
ンキュベートして、前記のグラブシュタインらIIに記載
されたイエルネ溶血プラーク測定法により、プラーク形
成細胞を測定した。細胞数はコールタカウンター（coul
ter counter）で計数した。ポリクローナルIg分泌は、
前記のマリスゼウスキーらＩ及び前記のマリスゼウスキ
ーらIIに記載されたようにして、2.0ml培地当たり１×1
06B細胞の７日目培養物中で、アイソタイプ特異的ELISA
分析法により測定した。
CD40−Ｌ若しくは空ベクターで形質移入されたCV1−E
BNA細胞、又は7A1細胞（Ｔ細胞ヘルパークローン）によ
るＢ細胞増殖の結果を図８、10及び12に示す。これらデ
ータは、CD40−Ｌにより最も大きいＢ細胞増殖が生じた
ことを示している。Ｔ細胞ヘルパー細胞7A1及び7C1は、
Ｂ細胞増殖に小さな作用しか有さなかった。
抗原特異性抗体形成に関する種々の細胞の作用を図９
及び11に示す。図９は、プラーク形成細胞を、Ｔ細胞ヘ
ルパークローン7A1と可溶性CD40−Ｌを分泌するマウスE
L−4 0.9細胞とを比較しながら示している。EL−4 0.9
細胞は、抗原特異性抗体形成に関して阻害的作用を有し
ているようである。図11は、Ｔ細胞ヘルパー細胞7C2及
び空ベクター又はCD40−Ｌのいずれかで形質移入された
CV1−EBNA細胞についてのPFC（プラーク形成細胞）を示
す。7C2細胞及び膜結合CD40−Ｌの両方が、抗原特異性
抗体形成（PFC）を刺激した。図13は、10ng/mlインター
ロイキン−２（IL−２）の存在下又は不存在下でのCD40
−Ｌ及び7A1細胞の抗原特異性抗体形成を比較してい
る。IL−２は、7A1細胞についてPFCを増加したが、膜結
合CD40−Ｌにより生ずるPFCを増加しなかった。
マウスＢ細胞によるポリクローナルIg産生を、刺激又
は阻害について、サイトカインIL−４（10ng/ml）及びI
L−５（COS細胞上澄み液の1:40希釈液）の存在下で又は
サイトカインを添加せずに、膜結合CD40−Ｌ、コントロ
ールCV1−EBNA細胞及びヘルパーＴ細胞7A1で比較した。
IgA、IgG3、IgE、IgG2b、IgM及びIgG1の量をそれぞれ表
３〜８に示す。
これらデータは、CD40とそのリガンドとの相互作用
が、抗原特異性抗体産生及びポリクローナルIg分泌の両
方へのＢ細胞成長及び分化のＴ細胞接触依存性誘発を司
る主要な分子性相互作用であることを示している。そう
いうことであるから、これらデータは、可溶性CD40、CD
40/Fc融合タンパク質及びできるだけ可溶性のCD40−Ｌ
（モノマー）によるこの相互作用のアンタゴニストが、
抗体応答の発生を有意に防げることを示唆している。従
って、CD40、CD40/Fc融合タンパク質及び可溶性CD40−
ＬがCD40アンタゴニストとして有用な臨床的状況には、
アレルギー、狼瘡、慢性間接リウマチ、インシュリン依
存真性糖尿病、及び自己免疫抗体又は抗原／抗体複合体
がその疾患の臨床病理学上の原因である他のあらゆる疾
患が含まれる。更に、膜結合CD40−Ｌ又はオリゴマー可
溶性CD40−Ｌは、Ｂ細胞増殖及び抗体産生を刺激するの
に有用であろう。そういうことであるから、CD40−Ｌの
これら形態は、ワクチンアジュバントに及びハイブリド
ーマ細胞からのmAb分泌のための刺激剤として最も有用
である。
実施例13 この実施例は、末梢血単核細胞（E-）の増殖及びそれ
からのIgE分泌への膜結合CD40−Ｌの作用を説明するも
のである。実施例10に記載した操作に従ってE-細胞を得
て、空ベクター又はmCD40−LcDNAで形質移入されたCV1
−EBNA細胞の存在下で７又は10日間インキュベートし
た。更に、CD40/Fc融合タンパク質（実施例１に記載）
又はTNFレセプター/Fc融合タンパク質（WO91/03553に記
載）を図14に示した幾つかの試料に添加した。IgE分泌
は実施例８に記載した操作に従って測定し、Ｂ細胞増殖
は実施例10に記載した操作に従って測定した。
Ｂ細胞増殖及びIgE分泌についての結果を、形質移入C
V1−EBNA細胞の５種の異なる濃度について図14に示す。
膜結合CD40−Ｌの存在下で、Ｂ細胞増殖及びIgE分泌の
両方が増加した。CD40/Fc融合タンパク質の添加は、Ｂ
細胞増殖及びIgE分泌の両方を失わせた。TNFレセプター
/Fc融合タンパク質は何の作用も有さなかった。IgE分泌
についての比較として、コントロール物質（形質移入CV
1−EBNA細胞なし）としてのIL−４の添加はこの分析でI
gEを産生せず、IL−４プラスG28−５抗CD40mAbの添加
は、この分析で29.7ng/mlのIgEをもたらした。
実施例14 この実施例は、CD40−L/FC2構築体という可溶性CD40
−L/Fc融合タンパク質を発現するCD40−L/FcDNA構築体
の構築を説明するものである。CD40−L/FC2をコードす
るDNAは、リーダー（又はシグナル）ペプチド、ホップ
（Hopp）ら（ホップら,Bio/Technology 6:1204,1988）
により記載された８アミノ酸の親水性配列（Flag（登録
商標）という）、イムノグロブリンの適当なFc領域、
〔Gly4Ser〕３繰り返し配列（参照によりここに組み入
れられる米国特許第5,073,627号に記載）又は他の適当
なリンカー配列、及びアミノ酸50からアミノ酸261（配
列番号:11）のヒトCD40−Ｌの細胞外領域をコードする
配列を含む。リーダー配列、Flag（登録商標）、及びヒ
トIgG1Fcをコードする断片の酵素切断及び連結の慣用法
を用いて、リーダー配列、Flag（登録商標）、及びヒト
IgG1Fcを含有するpDC406発現ベクターを調製し、Nsi1及
びNot1で消化した。
5'（上流）及び3'（下流）オリゴヌクレオチドプライ
マーを用いるPCR法（サルキ（Sarki）ら,Science 239:4
87,1988）を利用して、ヒトCD40−Ｌ（ATCC68873;配列
番号:11）を含有するクローニングベクターからのCD40
細胞外リガンド結合ドメインをコードするDNA配列を増
幅し、PCR断片を形成した。上流オリゴヌクレオチドプ
ライマー（配列番号:13）は、リンカー配列（〔Gly4Se
r〕3SerSer）から上流にNsi1部位を導入し、この後にCD
40−Ｌの細胞外領域の21ヌクレオチド（配列番号:11の
アミノ酸51から57まで）が続いた。下流オリゴヌクレオ
チドプライマー（配列番号:14）は、CD40−Ｌの終止コ
ドンのすぐ下流にNot1部位を導入した。次いで、リーダ
ー配列、Flag（登録商標）、及びヒトIgG1Fcを含有する
pDC406発現ベクター内に該PCR断片を連結した。そのヌ
クレオチド配列及びCD40−L/FC2の推定アミノ酸配列を
配列番号:15及び配列番号:16に示した。生成したDNA構
築体（CD40−L/FC2）をサル腎臓細胞系CV1/EBNA（ATCC
CRL10478）内に形質移入した。該構築体は、CD40に結
合できる可溶性CD40−Ｌをコードした。このことは、CD
40を発現する細胞を用いる蛍光活性化細胞選別（FACS）
分析で認められる結合により証明された。
CD40−L/FC2をコードする構築体で形質移入したヒト
胚性腎臓293細胞（ATCC CRL1573）の大規模培養物を成
育させて、CD40−L/FC2を含有する上澄み液を蓄積し
た。293細胞系、つまりヒトアデノウィルス5DNAにより
形質転換された一次ヒト胚性腎臓の永久系は、pDC406ベ
クター内に連結された組換えタンパク質の発現を可能に
する。上澄み液中のCD40−L/FC2融合タンパク質をアフ
ィニティ精製により精製した。簡単に説明すると、哺乳
動物細胞上澄み液を濾過（例えば、0.45μフィルター
で）し、ストレプトアビジン−アガロース（ピアスケミ
カル，ロックフォード,IL,USA）に結合したビオチニル
化ヤギ抗ヒトIgG（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボ
ラトリーズ社，ウエストグローブ,PA,USA）を含む抗体
アフィニティカラムに濾液を４℃で1.5cm×12.0cmカラ
ムについて約60〜80ml/hの流速で適用することによっ
て、CD40−L/FC融合タンパク質を含有する培養上澄み液
を精製した。フリーのタンパク質が洗浄緩衝液中に検出
されなくなるまで、カラムの約20倍容量のPBS（リン酸
塩緩衝液）でカラムを洗浄した。結合した融合タンパク
質をpH2.8の12.5mMクエン酸緩衝液,75mM NaClでカラム
から溶出させ、pH9.1の500mM HEPES緩衝液でpH7にし
た。精製したオリゴマーCD40−L/FCペプチドは、協同刺
激物質の不存在下でヒトＢ細胞増殖を誘発し、（適当な
サイトカインと協力して）膜結合CD40−Ｌについて実施
例12に記載したようにIgG、IgE、IgA及びIgMの産生をも
たらした。
実施例15 この実施例は、トリマーCD40−Ｌという可溶性CD40−
Ｌ融合タンパク質を発現するCD40−L DNA構築体の構築
を説明するものである。トリマーCD40−Ｌは、リーダー
配列、“ロイシンジッパー”という33アミノ酸配列（配
列番号:17）、及びホップら（ホップら,Bio/Technology
6:1204,1988）により記載された８アミノ酸の親水性配
列（Flag（登録商標）という）、続いてアミノ酸50から
アミノ酸261のヒトCD40−Ｌ（配列番号:11）の細胞外領
域を含有する。リーダー配列及びFlag（登録商標）配列
の有用性は、詳細な説明の欄に記載した。配列番号:17
で示される33アミノ酸配列は、溶液中で自然に三量化す
る。かくして、この33アミノ酸を含む融合タンパク質
は、自然にトリマー又はマルチマーを形成すると考えら
れる。
リーダー配列、上記の33アミノ酸配列、及びFlag配列
に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、次いで実施例
14に記載したようにして調製した配列番号:11のアミノ
酸51からアミノ酸261をコードするDNA断片に該最終産物
を連結することにより、該構築体を調製する。
発現ベクターpDC406内の生成連結産物をサル腎臓細胞
系CV1/EBNA（ATCC CRL10478）内に形質移入した。pDC4
06プラスミドは、SV40、ヒト免疫不全ウィルス（HI
V）、及びエプスタイン・バー・ウィルス（EBV）由来の
調節配列を含む。CV1/EBNA細胞系は、エプスタイン・バ
ー・ウィルス核抗原−１（EBNA−１）をコードし、ヒト
CMV即時−初期（immediate−early）エンハンサー／プ
ロモーター由来のEBNA−１を構成的に発現する遺伝子
で、CV−１細胞系を形質移入することにより得られた。
EBNA−１遺伝子は、pDC406の如きEBV複製起点を含有す
る発現ベクターのエピソーム複製を可能にする。
一旦、該融合構築体を発現する細胞を同定すると、形
質移入細胞の大規模培養を行ってトリマーCD40−Ｌを発
現する細胞からの上澄み液を蓄積する。実質的に米国特
許第5,011,912号に記載されたアフィニティ精製によ
り、上澄み液中のトリマーCD40−Ｌ融合タンパク質を精
製する。溶出したCD40−Ｌ融合タンパク質の銀染色SDS
ゲルを調製して純度を測定することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ファンスロウ，ウィリアム・シー アメリカ合衆国ワシントン州98023，フ ェデラル・ウェイ，トゥエンティセカン ド・アベニュー・サウスウエスト 32204 (72)発明者 スプリッグス，メラニー・ケイ アメリカ合衆国ワシントン州98119，シ アトル，トゥエルブス・アベニュー・ウ エスト 2256 (72)発明者 スリニヴァッサン，サブハッシニ アメリカ合衆国ワシントン州98034，カ ークランド，ノースイースト・ハンドレ ッドトゥエンティナインス・ストリート 11325 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 A61K 38/00 A61K 39/395 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】CD40に結合するCD40−Ｌポリペプチドをコ
    ードする単離されたDNAであって、下記の （ａ）配列番号:11のヌクレオチド46から828、184から8
    28、又は193から828、及び配列番号:1のヌクレオチド１
    から780又は139から780、並びにそれらの相補鎖を含むD
    NA; （ｂ）配列番号:12のアミノ酸１ないし261をコードする
    DNA; （ｃ）配列番号:12のアミノ酸47ないし261をコードする
    DNA; （ｄ）配列番号:12のアミノ酸51ないし261をコードする
    DNA; （ｅ）配列番号:2のアミノ酸１ないし260をコードするD
    NA; （ｆ）配列番号:2のアミノ酸47ないし260をコードするD
    NA; （ｇ）配列番号12:のアミノ酸１ないし261、47ないし26
    1及び51ないし261、並びに配列番号:2のアミノ酸１ない
    し260及び47ないし260のいずれかの断片をコードするDN
    A、ここにおいて当該断片はCD40に結合する； （ｈ）ストリンジェントな条件下（6xSSC、63℃で一晩
    ハイブリダイゼーション;3xSSC、55℃で洗浄）で（ａ）
    のDNAにハイブリダイズするDNAの相補鎖であるDNA;およ
    び （ｉ）遺伝子コードの縮重により、上記DNAのいずれか
    によりコードされるポリペプチドをコードするDNA より選択される、上記DNA。
  2. 【請求項２】配列番号:12のアミノ酸47−261又は配列番
    号:2のアミノ酸47−260を含むポリペプチドの生物学的
    に活性なCD40−Ｌ可溶性断片をコードする単離されたDN
    A。
  3. 【請求項３】さらに、ロイシンジッパーペプチドをコー
    ドするDNAを含む、請求項２に記載の単離されたDNA。
  4. 【請求項４】前記ロイシンジッパーペプチドが、配列番
    号17で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである、
    請求項３に記載の単離されたDNA。
  5. 【請求項５】請求項１−４のいずれか１項に記載のDNA
    を含む、組換え発現ベクター。
  6. 【請求項６】請求項５に記載の発現ベクターで形質転換
    又は形質移入された宿主細胞。
  7. 【請求項７】CD40−Ｌポリペプチドの発現を促進する条
    件下で請求項６に記載のの宿主細胞を培養することを含
    む、CD40−Ｌポリペプチドの製造方法。
  8. 【請求項８】請求項１に記載のDNAによってコードされ
    るアミノ酸の配列を含む、CD40−Ｌポリペプチド。
  9. 【請求項９】以下の： （ａ）配列番号:12のアミノ酸１−261を含むポリペプチ
    ド； （ｂ）配列番号:12のアミノ酸47−261を含むポリペプチ
    ド； （ｃ）配列番号:12のアミノ酸51−261を含むポリペプチ
    ド； （ｄ）配列番号:2のアミノ酸１−260を含むポリペプチ
    ド； （ｅ）配列番号:2のアミノ酸47−260を含むポリペプチ
    ド； （ｆ）配列番号:12のアミノ酸47から51（47および51を
    含む）までの配列中の１つのアミノ酸で始まり、アミノ
    酸239から261（239および261を含む）までの配列中の１
    つのアミノ酸までを含むアミノ酸配列を含むポリペプチ
    ド からなるグループから選択されるポリペプチド。
  10. 【請求項１０】配列番号:12のアミノ酸51ないし261又は
    配列番号:2のアミノ酸47ないし260を含むポリペプチド
    の可溶性断片を含む、生物学的に活性なCD40−Ｌポリペ
    プチド。
  11. 【請求項１１】配列番号:12のアミノ酸51ないし261又は
    配列番号:2のアミノ酸47ないし260を含む、可溶性の生
    物学的に活性なCD40−Ｌポリペプチド。
  12. 【請求項１２】請求項11のCD40−Ｌポリペプチドおよび
    ロイシンジッパーを含むオリゴマー。
  13. 【請求項１３】前記ロイシンジッパーが、配列番号17で
    表されるアミノ酸配列を含む、請求項12のオリゴマー。
  14. 【請求項１４】生物学的に活性なポリペプチドを含むオ
    リゴマーであって、 （ａ）配列番号:12のアミノ酸47−261又は配列番号:2の
    アミノ酸47−260を有するポリペプチドの可溶性断片；
    および （ｂ）配列番号:17のアミノ酸を含むポリペプチド を含む、前記オリゴマー。
  15. 【請求項１５】In vitroでハイブリドーマ細胞を刺激
    してモノクローナル抗体分泌を増加させるための方法で
    あって、請求項８−11のいずれかのペプチドおよび請求
    項12−14のいずれかのオリゴマーからなる群から選択さ
    れるポリペプチドを含む、CD40−Ｌポリペプチドの有効
    量をin vitroで適用することを含む、前記方法。
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