KR100260542B1

KR100260542B1 - 광학활성 노르보르네올의 제조방법

Info

Publication number: KR100260542B1
Application number: KR1019930702312A
Authority: KR
Inventors: 분지 가게야마; 마사노리 나까에; 다까야스 소노야마; 교죠 가와따
Original assignee: 시오노 요시히코; 시오노기 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 1991-12-06
Filing date: 1992-12-04
Publication date: 2000-07-01
Also published as: EP0570593A1; AU3094792A; JP3231325B2; US5459067A; ES2120454T3; DE69226942T2; DK0570593T3; NZ246087A; WO1993011256A1; DE69226942D1; EP0570593A4; EP0570593B1; CA2101945A1; CA2101945C; ATE170926T1; AU655698B2

Abstract

식(I)로 표시되는 (±)-엑소-노르보르난형 에스테르에 슈도모나스속, 아세토백터속, 아스로벡터속, 로도토울라속 및 사카로미세스속에 속하는 미생물로부터 선택되는 미생물 또는 그 균체처리물을 접촉시키는 공정을 포함하는 광학활성 노르보르네올의 제조방법이 제공된다. 본 발명에 의하면 간단한 후처리에 의하여 (+)-및/또는 (-)-엑소-노르보르난형 알코올을 고수율, 고순도로 얻을 수가 있다.

Description

[발명의 명칭]

광학활성 노르보르네올의 제조방법

[기술분야]

본 발명은 미생물에 의하여 엑소-노르보르난형 에스테르를 처리함으로써, 광학활성 노르보르네올을 제조하는 방법에 관한 것이다.

[배경기술]

노르보르네올의 제조방법중 화학합성에 의한 방법으로서는, 노르보르넨올 출발원료로 하여 유기산과 작용시켜 노르보르나 에스테르체를 형성한 후, 이 에스테르체를 화학적으로 탈아세틸화하여 노르보르네올을 얻는 방법이 알려져 있다. 이와 같은 화학합성에 의한 방법으로는, 4종류의 입체이성질체((+,-)-(엔도, 엑소)-노르보르네올)가 생성되므로 광학활성인 노르보르네올을 화합합성적으로 얻기 위해서는 번거로운 반응공정을 필요로 한다.

노르보르네올을 생물학적으로 제조하는 방법으로는, 노르보르난 에스테르체를 미생물과 접촉, 혹은 효소와 반응시켜 에스테르를 가수분해하는 방법이 알려져 있다. 최근, 오버하우저 등(Th. Oberhauser et al., Tetrahedron, 43, 3931-3941, 1987)은 칸디다 시린드라세아에(Candida cylindraceae) 유래의 리파아제를 사용하여 (±)-노르보르닐아세테이트로부터 (-)-노르보르네올을 제조하는 방법을 보고하고 있다. 또한, 오리타니 등(T. Oritani et al., Agr. Biol. Chem., 38(10), 1961-1964, 1974)은, 트리코데르마·에스피이(Trichoderma sp), 트리코데르마 코닝기(Trichoderma koningi), 바실루스 서브틸리스 니가-주(Bacillus subtilis var. Niger) 및 압시디아 히아로스포라(Absidia hyalospora)의 배양액을 사용하여 (±)보르닐아세테이트 및 (±)이소보르닐아세테이트로부터 (-)보르네올 및 (-)이소보르네올을 제조하는 방법을 보고하고 있다. 그러나, 모두 선택성이 낮고, 광학순도가 낮은 것만이 얻어질 수 있다. 일본국 특개평 2-273196호에는 일반적으로 라세미 화합물의 광학분할을 목적으로 하여 실시하는 생물적 촉매반응으로, 거울상 이성질체의 한쪽만의 반응을 선택적으로 저해하는 저해제를 첨가하는 광학분할방법이 개시되어 있는데, 이와 같은 방법을 광학활성 노르보르네올의 조제에 사용하는 것도 가능하다. 그러나, 광학활성 노르보르네올의 선택에 유효한 저해제를 스크리닝에 의하여 얻을 필요가 있고, 또, 반응후의 분취작업에 있어서 저해제를 제거해야만 하기 때문에 조작이 번거롭게 되는 결점을 갖는다. 상기와 같은 배경에서, 광학활성 노르보르네올을 얻기 위하여, 에스테르 가수분해시에 입체선택성이 높은 미생물 또는 효소와 접촉시키는 생물학적인 방법의 개선이 요망되고 있다.

[발명의 개시]

본 발명은 미생물을 이용하여 엑소-노르보르난형 에스테르를 처리함으로써 고순도의 광학활성 노르보르네올을 얻는 방법을 제공한다.

본 발명의 광학활성 노르보르네올의 제조방법은, 하기식(I):

(상기 식중에서, R은 아실기를, A 및 B는 각각 수소를 나타내거나 또는 함께하여 결합손을 나타낸다)

으로 표시되는 (±)엑서-노르보르난형 에스테르에 슈도모나스속, 아세토백터속, 아스로백터속, 로도토울라속 및 사카로미세스속에 속하는 미생물중에서 선택되는 미생물 또는 그 균체처리물을 접촉시키는 공정을 포함한다.

본 발명에 의하면, 상기 (I)식의 (±)-엑소-노르보르난형 에스테르류를 상기한 미생물 또는 그 균체처리물과 접촉시킴으로써, (2S)-엑소-노르보르난형 에스테르가 선택적으로 가수분해된다. 이렇게 함으로써 대응하는 광학활성인 알코올과 미변화의 (2R)-엑소-노르보르난형 에스테르가 분리된다.

상기 방법에 의하여, 반응액으로부터 (2S)-엑소-노르보르난형 알코올 또느 (2R)-엑소-노르보르난형 에스테르가 분취된다.

본 발명에 사용되는 (±)-엑소-노르보르난형 에스테르는 하기식(I)으로 표시된다.

식(I)에 있어서, 아실기는 탄소수 2 내지 10개의 지방족 아실기이고 바람직하게는 탄소수 2 내지 7개의 지방족 아실기, 예를들면 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 이소부티릴, 펜타노일, 헥사노일, 특히 바람직하게는 포르밀, 아세틸, 프로피오닐 또는 이소부티릴이다. 이 아실기는 탄소수 4 내지 10개의 시클로알킬카르보닐기이어도 좋고, 바람직하게는 탄소수 4 내지 7개의 시클로알킬카르보닐기, 예를 들면, 시클로프로판 카르보닐, 시클로부탄카르보닐, 시클로펜탄카르보닐, 시클로헥산카르보닐이다. 혹은 아릴카르보닐기이고, 바람직하게는 탄소수 7 내지 11개의 아릴카르보닐기 예를 들면 벤조일, p-톨루오일, 나프토일을 들 수 있다.

이와 같은 화합물은 시판되는 것을 사용할 수 있고, 또는 화학합성에 의해서도 간단하게 제조할 수 이다. 예를 들면 노르보르넨을 산촉매의 존재하에서 적당한 유기산(예를 들면 포름산, 아세트산, 프로피온산, 락트산 등)과 반응시키거나 또는 적당한 유기산의 비닐에스테르와 시클로펜타디엔을 딜스-알더(Diels-Alder) 반응에 적용시켜, 목적하는 (±)-엑소-노르보르난형 에스테르(I)를 높은 수율로 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서는, 슈도모나스속, 아세토백터속, 아스로벡터속, 로도토울라속 또는 사카로미세스속에 속하는 미생물이 사용될 수 있고 바람직하게는, 슈도모나스·에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 아세토벡터·파스트리아누스(Acetobacter pasteurianus), 아스로백터·에스피이(Arthrobacter sp.), 로도토울라·파리다(Rhodotorula pallida), 로도토울라·루브라(Rhodotorula rubra) 또는 사카로미세스·에스피이(Saccharomyces sp.)가 사용될 수 있다. 특히 바람직하게는 아세토백터 파스트리아누스(Acetobacter pasteurianus) 및 아스로백터 에스피이(Arthrobacter sp.)가 사용된다.

구체적으로는 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) IFO 12582, 아세토백터 파스트리아누스(Acetobacter pasteurianus) ATCC 9432, 아세토백터 파스트리아누스(Acetobacter pasteurianus) ATCC 12873, 아스로백터 에스피이(Arthrobacter sp.) SHS-0145 미공연조기 제4060호(FERM BP-4060), 로도토울라 파리다(Rhodotorula pallida) IFO 0715, 로도토울라 루브라(Rhodotorula rubra) IFO 1101, 로도토울라 루브라(Rhodotorula rubra) ATCC 2510 및 사카로미세스 에스피이(Saccaromyces sp.) SHS-20030(FERM BP-4061) 등의 균주가 사용된다. 상기 아스로백터 에스피이(Arthrobacter sp.) SHS-0145 및 사카로미세스 에스피이(Saccharomyces sp.) SHS-20030은 각각 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약에 따라 일본국 통상산업성 공업 기술원 미생물 공업 기술연구소에 1992년 11월 2일부로 기탁번호 제미공연조기 제4060호(FERM BP-4060) 및 동 제4061호(FERM BP-4060)로 기탁되어 있다.

상술한 미생물은 글루코오스, 자당(蔗糖), 폐당밀(廢糖密), 폴리펩톤, 육(肉)엑기스, 효모엑기스, 돈육분, 대두분, 인산, 마그네슘, 철 등 통상 미생물 생육에 사용되는 영양원을 포함하는 배지에 생육시킨다.

본 발명의 방법에 있어서는, (±)-엑소-노르보르난 에스테르에 상기 미생물균체 또는 균체처리물을 접촉시킨다. 구체적으로는 예를 들면, 상기 미생물의 배양액에 직접 (±)-엑소-노르보르난형 에스테르(I)를, 0.5~10%의 농도가 되도록 첨가하고 배양을 실시함으로써, 이 에스테르가 가수분해되어 노르보르난형 알코올 2S-(II)과 노르보르난형 에스테르 2R-(I)를 얻을 수가 있다. 이 가수분해에는 상기 배양액 대신에 균체현탁액, 균체추출액도 사용할 수 있다. 균체현탁액은 배양액으로부터 원심분리 여과등의 방법으로 균체를 모으고, 반응에 적합한 pH가 되는 완충액이나 유기용매를 포함하는 완충액에 현탁시킴으로써 얻어진다. 균체추출액은 집균한 균체를 세포용해효소를 사용하거나 또는 초음파·플렌치프레스, 또는 그 이외에 일반적으로 사용되는 균체파쇄기를 사용하여 파쇄한 후, 원심분리등의 방법으로 균체파쇄잔사를 제거하여 조제할 수 있다.

본 명세서에 있어서, (±)-엑소-노르보르난형 에스테르에 미생물을 접촉시킨다는 것은 배양액에 직접 (±)-엑소-노르보르난형 에스테르를 첨가하는 것을 의미하고, 균체처리물을 접촉시킨다는 것은 배양액 대신에 균체현탁액 또는 균체추출액을 사용한다는 것을 의미한다.

반응을 효율적으로 실시하기 위해서는, 첨가하는 (±)-에스테르(I)를 10~75%가 되도록 n-헥산등의 소수성 용매나 디메틸술폭시드, 메탄올, 에탄올 등 친수성 용매에 용해하여 사용할 수도 있다.

본 발명에 의한 상기 가수분해의 반응공정을 하기 반응공정도 a로 표시한다:

상기 공정도 중에서 R, A 및 B는 각각 상기에 정의한 바와 같다.

상기 공정도로 표시한 바와 같이, 엑소-노르보르난형 에스테르중 2S-(I)만이 선택적으로 가수분해되어 엑소-노르보르난형 알코올 2S-(II)로 변환된다. 노르보르난형 에스테르 2R-(I)는 거의 미반응인 상태로 반응액 중에 남아 존재한다. 이와 같이, 노르보르난형 알코올 2S-(II)과 노르보르난형 에스테르 2R-(I)의 혼합물을 포함하는 반응액이 얻어진다.

얻어진 알코올 2S-(II)와 미반응채로 남아 있는 엑소-노르보르난형 에스테르 2R-(I)는 공지의 방법에 따라 분리할 수 있다. 예를 들면 크로마토그래피에 의하여도 분리 가능하다. 또한 알코올 2S-(II)을 적당한 방법(무수프탈산 등과 같은 유기산과 반응시켜 하프에스테르를 형성하는 방법등)에 의하여 수용성으로 만든 후, 추출조작에 의하여 분리하면, 간단히, 목적하는 광학활성인 노르보르난형 화합물을 얻을 수가 있다.

이하 (±)-엑소-노르보르닐아세테이트를 사용한 경우를 예로 들어, 본 발명을 설명한다.

상기 반응공정도 b에 표시한 바와 같이, 본 발명의 처리에 의하여 얻어진 반응액에 적당한 용매를 0.1~2배량 가하고 노르보르네올(-)-2과 노르보르아세테이트(-)-1를 추출한다. 용매로써는 클로로포름, 디클로로메탄, 아세트산 에틸, n-헥산등의 용매를 단독 혹은 혼합하여 사용하면 좋다. 추출된 노르보르네올(-)-2과 노르보르닐아세테이트(-)-1는 적당히 농축한 후 생성된 노르보르네올(-)-2에 대하여 1~2배량의 무수말레산이나 프탈산 등과 같은 무수유기산을 첨가하고, 노르보르네올(-)-2과 유기산(말레산, 프탈산 등)과의 수용성 부가물을 형성시키고, 이 반응액에 탄산수소 나트륨과 같은 염기성 화합물의 수용액을 첨가하여, 중화시키면 노르보르네올(-)-2과 같은 유기산 부가물은 수용액층에, 노르보르닐 아세테이트(-)-1는 유기용매층으로 각각 이행한다. 수층을 분리하고 알칼리 처리를 행한 후, 디클로로메탄등과 같은 적당한 유기용매로 추출 농축하면 광학순도가 높은 노르보르네올(-)-2가 얻어진다. 수층과 분액하여 얻어진 유기용매층의 노르보르닐아세테이트(-)-1는 용매층을 농축함으로써 회수할 수 있다. 회수 후, 시판하는 리파아제라든가 에스테라제와 접촉시키거나 또는 화학적으로 탈아세틸화 함으로서 광학순도가 높은 노르보르네올 (+)-2이 간단히 얻어진다.

이와 같이하여 얻은 (-)-엑소-노르보르네올 또는 (+)-엑소-노르보르네올은 목적하는 바에 따라, 문헌기재의 방법(Irwin A., Jones J.B.:J. Am. Chem. Soc. 98, 8476-8481(1976))등의 공지의 방법에 따라 정제하면 용이하게 고순도의 광학활성체가 얻어진다. 예를 들면 이들 화합물을 상기의 방법으로 수용성 화합물로 변환한 후, 이들 각각에 (-)- 또는 (+)-페네틸아민을 첨가하여, 각각의 페네틸아민염을 형성시킴으로써 98%ee 함량 이상의 고순도 광학활성체를 얻을 수가 있다. 또한, 통상적으로 사용되는 컬럼크로마토그래피 처리를 실시하여 정제할 수도 있다.

이하의 모든 실시예 및 참고예는 본 발명을 더욱 상세히 설명하기 위한 것일뿐 본 발명이 이들에 의하여 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

Acetobacter pasteurianus ATCC 9432를 5ℓ 용량의 소형 쟈파멘타에 미리 준비한 3ℓ의 GPBY배지(D-글루코오스 4%, 폴리펩톤 2%, 육(肉)엑기스 2%, 효모엑기스 2%, 제1인산칼륨, 0.2%, 황화마그네슘 0.2%, 탄산칼슘 2%, pH 7.0)에 식균하여 28℃에서 24시간 배양하였다. 배양액을 1,000G, 10분간 원심분리를 실시하여 고형물을 제거한 후, 20,000G, 15분간 고속원심분리를 실시하여 균체를 모으고, 이 균체를 생리식염수로 2회 세정하였다. 이 조작으로 19.8g의 습균체를 얻었다. 이 습균체를 600ml의 인산 완충액(0.1M, pH 6.5)에 첨가하여 현탁시키고, 이 현탁액에 12.0g의 (±)-엑소-노르보르닐아세테이트((±)-1)를 첨가하고 교반하면서 30℃에서 1시간 반응시켰다. 반응중, 0.1N 수산화나트륨을 소량씩 첨가하고, 반응액의 pH를 6.5±0.2로 유지하였다. 반응 종료후, 반응액 1ml을 취하여 클로로포름 1ml를 첨가하고, 반응생성물 노르보르네올 (-)-2 및 노르보르닐아세테이트 (-)-1를 추출하여, 가스크로마토그래피(J & W사 제품 광학분할용 컬럼 CDX-B형(φ 0.25mm×30m), 컬럼온도 50℃~210℃)로 분석한 결과, 엑소-노르보르닐 아세테이트, (-)-(1S,2S,4R)-엑소-노르보르네올 (-)-2, (+)-(1R,2R,4S)-엑소-노르보르네올 (+)-2이 각각 8.5mg/ml, 5.2mg/ml, 0.3mg/ml으로 검출되었다. 이 반응액에 톨루엔을 첨가하고, 2회 추출(300ml, 100ml) 조작을 실시하였다. 2회 추출로 얻은 톨루엔층을 합하여 380ml의 톨루엔용액을 얻었다. 이 톨루엔 용액을 약50ml까지 농축하고, 농축한 액에 무수말레산 4.2g을 가하고 115℃에서 4시간 반응을 실시한 후, 포화탄산수소나트륨액을 300ml 첨가하고, 5분간 교반한 후, 10분간 방치하였다. 반응후, 수층과 톨루엔층을 분액하고 수층 약 300ml와 톨루엔층 약 50ml를 얻었다.

얻어진 수층 200ml에 진한 염산을 가하여 산성으로 한 후, 디클로로메탄 100ml로 추출하고, 농축시켜 말레산 화합물 5.9g을 얻었다. 얻어진 말레산 화합물을 메탄올 50ml에 용해시키고, 여기에 수산화칼륨 4.0g을 50ml의 물에 용해한 수산화칼륨을 적하시키고 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응종료 후, 디클로로메탄을 가하여 추출 농축시켜 무색결정의 (-)-(1S,2S,4R)-엑소-노르보르네올(-)-2을 얻었다. 수량 2.8g(수율 64%),-3.01°

(c=1.46, CHCl₃), 광학순도 90%ee.

[실시예 2]

실시예 1과 유사한 방법으로 실시하여 얻어진 균체현탁액과 (±)-엑소-노르보르닐아세테이트((±)-1)과의 반응액 400ml에서, 실시예 1과 유사하게 노르보르닐아세테이트 및 노르보르네올을 톨루엔 300ml로 추출하고, 이 추출액을 약 50ml까지 농축했다. 이 농축한 액에 4.2g의 무수프탈산을 가하고 115℃에서 4시간 반응시킨 후, 포화탄산수소나트륨 용액 200ml을 첨가하여 실온에서 약 5분간 교반한 후, 10분간 방치하여 톨루엔층과 수층을 분액하여 톨루엔층 50ml와 수층 200ml를 얻었다. 얻어진 수층 200ml에 진한염산을 가하여 산성으로 한 후, 디클로로메탄 100ml를 가하여 추출하고, 디클로로메탄을 제거하여 프탈산 모노에스테르체 7.3g을 얻었다. 얻어진 프탈산 모노에스테르체를 75m의 아세트산에틸로 용해시킨 후, (-)-페네틸아민 3.4g을 적하하여 프탈산 모노에스테르체의 페네틸아민염 9.0g을 얻었다. 이 아민염에 에탄올 45ml를 사용하여 2회 재결정하고, 얻어진 결정에 다시 톨루엔과 물을 가하고, 다시 8.3m의 7.3% 염산용액을 적하한 후, 톨루엔층을 분액했다. 이 톨루엔층을 농축시킨 후, 메탄올 20ml에 용해시키고, 17.4%의 수산화나트륨액을 적하하여 50℃에서 2시간 반응을 행하였다. 이 반응액으로부터 디클로로메탄으로 추출하고 농축시켜 1.3g의 (-)-(1S,2S,4R)-엑소-노르보르네올 (-)-2를 무색결정으로 얻었다.

수율 50%,:-3.20°(c=1.30,CHCl₃], 광학순도 98%ee.

[실시예 3]

실시예 1에서 얻어진 톨루엔층 50ml를 감압농축시켜 4.9g의 오일상의 노르보닐아세테이트 (-)-1를 얻었다. 이 노르보르닐아세테이트를 50ml의 메탄올에 용해시키고 8%의 수산화나트륨 50ml를 적하하여 50℃에서 2시간 반응을 행한 후, 디클로로메탄으로 추출했다. 얻어진 추출액을 감압농축시켜 석출시켰는바, 3.1g의 (+)-(1R,2R,4S)-엑소-노르보르네올 (+)-2를 무색결정으로 얻었다. 수율 71%, 광학순도 95%ee 이상.

[실시예 4]

실시예 1에 기재한 GPBY 배지 1ℓ을 2ℓ 용량의 쟈파멘타에 넣고 Acetobacter pasteurianus ATCC 9432를 접종하여 30℃에서 24시간 배양시켰다. 배양후, 10.0g의 (±)-엑소-노르보르닐아세테이트를 첨가하여 4시간 배양을 속행하였다. 이 배양액에 40ml의 클로로포름을 가하여 추출하고, 추출액을 가스크로마토그래피에 적용하여, 함유된 화합물의 함량을 측정한 결과, 엑소-노르보르닐아세테이트 10.3mg/ml, (-)-(1S,2S,4R)-엑소-노르보르닐아세테이트 (-)-2 6.2mg/ml 및 (+)-(1R,2S,4S)-엑소-노르보르네올 (+)-2 0.5mg/ml이었다.

[실시예 5]

실시예 2과 유사한 방법으로 실시하여 얻어진 Acetobacter pasteurianus ATCC 9432의 습균체 10g에 20ml의 0.1M 트리스염산 완충액(pH 7.2)를 첨가하여 균체현탁액을 조제하여 플렌치프레스로 균체를 파쇄했다. 얻어진 균체파쇄액 약 30ml에 0.3mg의 데옥시리보누클레아제를 가하여 얼음물 중에서 20분간처리한 후, 30,000G, 15분의 원심분리를 행하여, 균체 및 그 파쇄물을 제거하여 약 22ml의 세포추출액을 얻었다.

이 세포추출액 10ml에 100mg의 (±)-엑소-노르보르닐아세테이트를 첨가하여 30℃ 인큐베이터 중에서 완만하게 교반하면서 1시간 반응을 행하였다. 반응종료 후, 10ml의 클로로포름을 가하여 추출하고, 추출액을 가스크로마토그래피에 적용하여, 함유하는 화합물의 함량을 측정했다. 그 결과, 이 추출액중의 엑소-노르보르닐아세테이트, (-)-(1S,2S,4R)-엑소-노르보르네올 (-)-2 및 (-)-(1R,2S,4S)-엑소-노르보르네올 (+)-2의 농도는 각각 4.6mg/ml, 3.0mg/ml 및 0.3mg/ml이었다.

[실시예 6]

실시예 1에 기재한 GPBY 배지 50ml를 500ml 용량의 플라스크에 넣어 멸균하고, 표 1에 나타낸 미생물을 접종하여 30℃, 24시간 배양했다. 이 배양액에 (±)-엑소-노르보르닐아세테이트 500mg을 첨가하고, 다시 고무마개로 밀봉한 후, 16시간 배양을 행하였다. 이 배양액의 노르보르닐아세테이트, 노르보르네올을 실시예 1과 마찬가지로 가스크로마토그래피로 분석한 결과를 표 1에 나타난다.

[표 1]

[실시예 7]

실시예 1에 기재한 BPBY 배지 1ℓ을 2ℓ 용량의 소형 쟈파멘타에 넣고 Pseudomonas aeruginosa IFO 12582 및 Saccharomyces sp. SHS-20030(FERM BP-4061)을 각각 접촉하여 30℃에서 24시간 배양했다. 각각의 배양액을 실시예 1에 기재한 바와 같이 원심분리조작에 의해 집균·세균(集菌·洗菌)하고, 각각의 균체광학탁도(Potical Density; 660nm)가 10이 되도록 pH 7.0의 0.05M의 인산완충액에 현탁시켰다. (±)-엑소-노르보르닐아세테이트는 미리 50중량% 농도가 되도록 디메틸술폭시드로 용해하여 두었다.

각 균체의 현탁액 100ml를 500ml 용량의 플라스크에 넣고 50% (±)-엑소-노르보르닐아세테이트 용액을 2.0ml 첨가하고 고무마개로 밀봉한 후, 30℃에서 반응을 행하였다. 반응의 진행은 pH 7.0을 유지하는데 필요한 0.1N 수산화나트륨의 첨가량으로 모니터하고, 종점부근에서는 소량의 반응액(0.5ml)을 취하여 실시예 1에서 기술한 바와 같이 가스크로마토그래피로 반응물을 확인했다. 첨가한 노르보르닐아세테이트가 약 70%까지 분해된 시점에서 반응을 정지하고, 100ml의 톨루엔을 가하여 노르보르닐아세테이트 및 노르보르네올을 추출했다. 이 추출액을 약 25ml까지 농축시키고, 0.4g의 무수말레산을 첨가하여 115℃, 4시간 반응을 행하였다. 포화탄산수소 나트륨을 25ml 첨가하여 실온에서 5분간 교반시킨 후, 약 10분간 방치시켜 수층과 톨루엔층으로 분액했다. 톨루엔층을 농축하면 오일상의 (-)-엑소-노르보르닐아세테이트 (-)-1를 얻을 수 있다. 이 노르보르닐아세테이트를 10ml의 메탄올에 용해시키고 8%의 수산화나트륨을 적하하여 알칼리하에서 50℃, 2시간 반응을 행하였다. 이 반응액에서, 디클로로메탄 10ml을 가하여 추출하고, 추출액을 농축시켜 (+)-(1R,2R,4S)-엑소-노르보르네올 (+)-2를 석출시켰다. 이 결정을 가스크로마토그래피로 분석하여, 표 2에 나타낸 바와 같은 결과를 얻었다.

[표 2]

[실시예 8]

D+ifco사제 Antibiotic medium 3 배지 50ml를 500ml 용량의 플라스크에 넣고 아스로백터·에스피이(Arthrobactor sp.) SHS-0145(FERM BP-4060)을 접종하여 30℃에서 20시간 배양했다. 배양후, 100mg의 (±)-엑소-노르보르닐 아세테이트를 첨가하여 다시 8시간 동안 배양을 속행하였다. 이 배양액에 20lm의 클로로포름을 가하여, 노르보르닐아세테이트, 노르보르네올을 추출하고, 추출액 중에 함유된 (-)-(1S,2S,4R)-엑소-노르보르네올(-)-2, (+)-(1R,2S,4S)-엑소-노르보르네올 (+)-2를 실시예 1과 유사한 방법으로 가스크로마토그래피로 함량을 각각 측정했다. 그결과, 추출액 중에는 1.02mg/ml의 (-)-(1S,2S,4R)-엑소-노르보르네올 (-)-2, 0.11mg/ml의 (+)-(1R,2R,4S)-엑소-노르보르네올 (+)-2가 함유되어 있다.

이하에 본 실시예에서 사용한 아스로백터·에스피이(Arthrobacter sp.) SHS-0145(FERM BP-4060)의 균학적 성상을 나타낸다.

1. 형태학적 특징

본 균은 그람양성의 간균(稈菌)으로서 균형(菌形) 크기는 변화가 많다. 미숙한 배양사상(육즙한천배지, 30℃, 8~12시간 배양)에서는 1.0~1.1×3.0~4.6μm 크기의 간균상이지만, 배양이 진행되면 균은 단소화하여(육즙한천배지, 30℃, 24~48시간 배양) 마침내 배양이 정지기에 들어가면 구균상(직경 1.0~1.1μ, 육즙한천배지, 30℃, 72~96배양)으로 된다. 포자의 형성은 확인되지 않는다. 운동성을 갖는다.

2. 배양상의 성상

육즙한천평판상의 생육(30℃, 7일 배양):24시간 이내에 1.4~1.6mm 평활한 표면에서 융기가 적고 광택이 있음, 담황색에서 담황백색의 원형의 군체(Colony)를 형성한다.

육즙경사면 배양상의 생육(30℃, 7일 배양):접종화선을 따라 사선상으로 양호하게 우락질(牛酪質)로 생육한다.

육즙고층한천 배양에서의 생육(30℃, 7일 배양):표면에 양호하게 생육하고, 돌자선(突刺線)의 상부에만 생육이 확인된다.

육즙액 정치 배양(30℃, 7일 배양):배양액 표층에 두꺼운막상으로 생육하고, 액전체에 중정도로 탁해지고, 침전물의 양은 미량이다. 특히 악취는 확인되지 않는다.

3. 생육

생육온도:생육가능온도(10~37℃, 최적생육온도는 24~32℃(펩톤수).

내열성:탈지유 중 63℃, 30분에서 생존할 수 없다.

생육 pH:생육가능 pH 5.2~10. 최적생육 pH는 6.0~9.0(펩톤수).

산소에 대한 거동:호기적, 혐기하에서의 생육(가스팩, 육즙한천평판)은 확인되지 않음.

4. 세포벽조성:meso-DAP(메소-디아미노피멜산)은 검출되지 않는다.

5. DNA의 G+C 함량:57%

6. 주된 생리학적인 여러 성질

OF 테스트:산화성(D-글로코오스)

산의 생성:D-글루코오스, 갈락토오스, D-만노오스, 슈크로오스, 트레할로오스, 프락토오스(약), 만니트(약)에서 산을 생성하나, L-알비노오스, D-키시로오스에서는 거의 산의 생성은 확인되지 않는다. 락토오스, 리보오스, 솔보오스, 람노오스, 이노시톨, 셀로비오스, 말토오스에서의 산의 생성도 확인되지 않는다.

리트머스 우유:음성

젤라틴 액화:음성

VP 반응:음성

MR 반응:음성

황화수소의 생성:음성

구연산의 이용성:양성(크리스텐센 배지, 시몬즈 배지)

무기 N원의 이용성:암모늄염, 질산염 모두 이용한다.

우레아제:양성

카탈라아제:양성

옥시다아제:양성

DN 에이스:음성

메틸렌블루우의 환원:양성

7. 분리원:일본의 토양

다음에 실시예 6 및 7에서 사용한 사카로미세스·에스피이(Saccharomyces sp.) SHS-20030(FERM BP-4061)의 균학적 성상을 나타낸다.

1. 형태적 특징

균의형상:본균은 구형 내지 타원형의 3.5~4.5×5~6μm의 효모균으로서 증식은 주로 출아에 의하여 증식한다. 출아는 세포표면으로부터 다극으로 확인된다(맥아 엑기스 한천배지, 28℃, 3일간 배양). 균사는 확인되지 않는다.

자양(子養)포자:세포내에 1~4개의 구형내지는 대략 타원형의 포자를 형성(Gorodokowa 한천배지, 28℃, 10일간 배양).

2. 당의 발효성과 동화성

글루코오스, 가락토오스, 슈크로오스, 말토오스, 라피노오스를 동화하고, 발효성이 확인되나, 락토오스, 셀로비오스, 스타아치는 동화나 발효 어느 것도 확인되지 않는다.

3. 그 밖의 생리시험

파라핀의 동화:음성

아세트산 칼륨의 동화:음성

알부틴의 분해:음성

비타민 요구성:없음

[산업상의 이용가능성]

본 발명에서 얻은 광학활성의 노르보르난형 알코올의 이용방법을 이하의 참고예에 나타낸다.

[참고예 1]

실시예 1에서 얻은 (-)-(1S,2S,4R)-엑소-노르보르네올 2.8g(0.025몰)을 염화메틸렌 56ml에 용해시키고, 클로로크롬산 피리디늄(PPC) 8.1g(1.5몰비) 몰레큘라시이브 4A 1g을 가하여 25~30℃에서 1시간 반응했다. 반응액을 톨루엔 56ml로 희석시킨 후, 실리카겔 28g의 컬럼을 통하여 불용물을 제거하였다. 유출액을 농축·건조시켜 조제(粗製)의 (+)-노르캄퍼가 백색의 결정성분말로 얻어진다. 얻어진 (+)-노르캄퍼를 테트라히드로푸란 45ml에 용해시키고, LDA(1.1몰비)의 테트라히드로푸란 30ml 용액중에 -10~-15℃에서 적하시켰다. 동 온도에서 20분간 반응시킨 후, 브롬화알릴 3.3g(1.1몰비)을 0℃ 이하에서 적하시키고, 실온에서 3시간 반응시켰다. 반응액을 얼음물 70ml 중에 유입하여 묽은 염산수용액으로 산성으로 한 후, 톨루엔 50ml로 2회 추출을 행하였다. 톨루엔층을 수세한 후, 용매를 감압하에 제거하여 조제의 (+)-엑소-3-(2-프로펜일)-비시클로[2,2,1] 펩탄-2-온이 유상잔사로 얻어진다. 이것을 감압증류로, 비점범위 92~103℃/10~12mmHg의 잔유분을 모음으로써, 정제했다. 수량 3.07g(수율 82%), 화학순도(GC) 98.6%, 엔도이성질체 0.4% 광학순도(HPLC) 90%ee, 비선광도:84.6°[c=1.0, CHCl₃].

[참고예 2]

실시예 2에서 얻은 (-)-(1S,2S,4R)-엑소-노르보르네올을 이용하여 참고예 1과 완전히 같은 방법으로 반응후 처리를 행하였다.

조(粗)생성물을 감압증류하여 정제하고, 비점범위 74~86℃/3~4mmHg의 잔유분을 모아, 목적하는 (+)-엑소-3-(2-프로펜일)-비시클로(2,2,1)펩탄-2-온을 얻었다. 수량 1.38g(수율 78%), 화학순도(GC) 98.8%, 엔도이성질체 0.9%, 광학순도(HPLC) 98%ee.

상기 참조예에 의하여 얻어진 화합물은 예를 들면, 문헌기재의 방법(J. Med. Chem. 31(9), 1847-1854(1988))에 의하여 의약으로서 유용한 TXA₂수용체 길항제에 도입할 수 있다.

Claims

하기 식(I)

[상기 식 중, R은 아실기를, A 및 B는 각기 독립적으로 수소를 나타내거나 또는 함께 결합손을 나타낸다]로 표시되는 (±)엑소-노르보르난형 에스테르에, 슈도모나스 에루기노사, 아세토백터 파스트리아누스, 아스로백터 에스피이. SHS-0145(FERM No.4060), 로도토울라 파리다, 로도토울라 루브라 및 사카로미세스 에스피이. SHS-20030(FERM No. 4061)로 이루어진 그룹에서 선택되는 미생물 또는 그 균체처리물을 접촉시키는 단계를 포함하여 이루어지는, 광학활성 노르보르네올의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 광학활성 노르보르네올이 (2S)-엑소-노르보르난형 알코올인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 광학활성 노르보르네올이 (2R)-엑소-노르보르난형 에스테르인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, R이 아세틸기인 것을 특징으로 하는 제조방법.
아스로백터 에스피이 SHS-0145(FERM No. 4060)