KR100234930B1

KR100234930B1 - 2-0-알파-d글루코피라노실-l-아스코르브산고 함유물의 제조방법

Info

Publication number: KR100234930B1
Application number: KR1019920019428A
Authority: KR
Inventors: 만다이다까히꼬; 요네야마마사루; 사까이슈우조오
Original assignee: 도시오 미야께; 가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조
Priority date: 1991-10-23
Filing date: 1992-10-22
Publication date: 1999-12-15
Also published as: ES2071441T3; TW212183B; US5468850A; JP3134235B2; EP0539196A1; DE69201371D1; DE69201371T2; JPH05117290A; EP0539196B1; KR930007966A

Abstract

본 발명은 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산과 직접 환원성을 나타내는 L-아스코르브산의 당 유도체를 함유하는 용액을 산화 처리하고 수득한 혼합물을 강산성 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피 처리한 다음 이 용출액의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유 획분을 회수함을 특징으로 하는 순도가 향상된 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유물의 신규 공업적 제조방법에 관한 것이다. 따라서 본 발명의 제조방법은 산업분야에 있어서 큰 중요성을 가지고 있다.

Description

2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유물의 제조방법

본 발명은 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유물의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산과 직접 환원성을 나타내는 L-아스코르브산 당 유도체를 함유하는 용액으로부터의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유물의 제조방법에 관한 것이다.

2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산은 일본국 특허 공개 평(平)3-135992호 공보, 특허 공개 평(平)3-139288호 공보등에 개시(開示)되어 있는 바와 같이 구조식 1로 나타내어지는 화학구조를 가지며 직접 환원성이 전혀 없고 안정성이 우수하며, 더욱이 생체내에서 용이하게 가수 분해되어 L-아스코르브산 본래의 생리활성을 발휘하는 L-아스코르브산의 신규 당 유도체이다.

[구조식 1]

그 공업적 제조방법은 일본국 특허 공개 평 3-183492호 공보에 개시되어 있는 바와 같이, 예컨대 L-아스코르브산과 α-글루코실 당 화합물을 함유하는 용액에 당전이 효소 또는 당전이 효소와 글루코아밀라아제를 작용시켜 제조되는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산과 더불어 그 이외의 협잡물을 함유하는 용액을 원료용액으로 하고 강산성 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피를 하여 이 용출액의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유 획분(劃分)을 채취함으로써 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유물 함유 용액을 제조하고, 더욱이 이것을 농축하여 과포화로 해서 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산을 제조하는 방법이 개시되어 있다.

그러나 본 발명자등은 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유물의 제조방법에 대하여 연구를 계속한 결과 원료용액인 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산과 더불어 그 이외의 협잡물을 함유하는 용액은, 강산성 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피에 있어서, L-아스코르브산, 글루코오스등과 같이 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산의 분리가 비교적 용이한 협잡물이외에 분리가 곤란하여 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유 획분의 순도향상을 방해하고, 더욱이 과포화 용액으로부터 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산의 석출을 저해하는 비교적 소량의 미지의 협잡물이 혼해하고 있음을 확인하였다.

또한 이 미지의 물질은 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산을 분리 제거한 모액중에 축적되어 모액으로부터의 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산의 석출을 저해하여 2차 결정화 단계와 3차 결정화 단계에서의 결정의 석출량을 현저하게 저하시킨다는 것을 확인하였다.

당전이 반응에 의하여 제조된 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 함유 용액에 혼재하는 미지의 협잡물을 해명함과 아울러 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산과 함께 협잡물을 함유하는 용액으로부터 그 협잡물을 용이하게 제거하여 보다 순도가 높은 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유물을 공업적으로 보다 고수율로 대량 생산하는 방법의 확립이 요망되고 있다.

본 발명자등은 당전이 반응에 의하여 제조된 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산과 함께 그 이외의 협잡물을 함유하는 용액을 사용하여 강산성 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피에 의하여 보다 고순도의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유물을 공업적으로 용이하게 제조하는 방법을 확립할 목적으로 예의 연구를 거듭하였다.

그 결과, 강산성 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피에 있어서, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산과의 분리가 곤란하고, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유 획분의 순도향상을 방해하며, 더욱이 과포화 용액으로부터 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산의 석출을 저해하는 협잡물로서 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산과 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산을 발견하였다.

5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산은 문헌에 기재되어 있지 않은 신규 물질이고, 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산은 일본국 특허 공고 소 48-38158호 공보에 개시되어 있는 공지물인데, 이들은 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산의 경우와는 달리 직접 환원성을 나타내는 L-아스코르브산 당 유도체인 것이 판명되었다.

그리고 직접 환원성을 나타내지 않은 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산과 직접 환원성을 나타내는 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산등의 L-아스코르브산 당 유도체의 성질이 다르다는데 착안하여 연구를 계속한 결과, (가) 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산과 직접 환원성을 나타내는 L-아스코르브산 당 유도체를 함유하는 용액을 산화처리하여 직접 환원성을 나타내는 L-아스코르브산 당 유도체만을 산화시킨 다음, 강산성 양이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피 처리를 함으로써 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산과 직접 환원성을 나타내는 L-아스코르브산 당 유도체의 산화물을 용이하게 분리할 수 있음을 발견함과 아울러, (나) 보다 고순도의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유물을 공업적 규모로 보다 고수율로 제조할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 또한 이와 같이 하여 제조되는 보다 고순도의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유물의 과포화 용액은 결정 석출이 용이하고 수율도 높아 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산의 공업적 제조 방법으로서 극히 유리함이 판명되었다.

본 발명은 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유물의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산과 직접 환원성을 나타내는 L-아스코르브산 당 유도체를 함유하는 용액으로부터 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 사용하는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산과 직접 환원성을 나타내는 L-아스코르브산 당 유도체를 함유하는 용액에 속하는 것으로는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산과 직접 환원성을 나타내는 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산, 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산등의 L-아스코르브산 당 유도체를 함유하는 용액들이 있는데, 이러한 용액의 예로서는 L-아스코르브산과 α-글루코실 당 화합물을 함유하는 용액에 당전이 효소 또는 당전이 효소와 글루코아밀라아제를 작용시켜 수득되는 용액(I), 이 용액(I)을 강산성 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피로 처리하여 수득되는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유 용액(II) 및 이 용액 (II)을 농축하여 과포화 용액으로 한 후 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산을 석출시켜 분리하여 수득되는 모액등을 들 수 있다.

본 명세서에서 "직접 환원성을 나타낸다"라는 말은 L-아스코르브산의 경우와 마찬가지로 그대로 2,6-디클로로페놀인도페놀을 환원, 탈색하는 것을 의미한다.

또한 본 발명에서 사용되는 L-아스코르브산이란 것은 유리(遊離)형태의 L-아스코르브산뿐만 아니라 L-아스코르브산의 알칼리 금속염 혹은 알칼리 토류 금속염등의 L-아스코르브산, 또는 이들의 혼합물을 의미한다.

따라서 당전이 반응에 사용되는 L-아스코르브산으로서는 통상 유리형태의 L-아스코르브산 뿐만 아니라 필요에 따라서는 L-아스코르브산 나트륨, L-아스코르브산 칼슘등을 적절히 사용할 수 있다.

또한 본 명세서에서 말하는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산, 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산, 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산, α-글리코실-L-아스코르브산등에 대해서도 특히 불편이 생기지 않는한 유리산 뿐만 아니라 이들 염도 의미한다.

2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산과 직접 환원성을 나타내는 L-아스코르브산 당 유도체를 함유하는 용액을 산화 처리할 경우에 있어서 될 수 있는 한 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산에 작용하지 않고 직접 환원성을 나타내는 L-아스코르브산 당 유도체를 우선적으로 산화하는 조건을 선택해야 하는데, 예를 들자면 통기교반(通氣攪拌) 등의 호기적(好氣的) 조건에 용액을 폭로시키는 방법을 유리하게 채용할 수 있다.

이 경우에 있어서 pH를 약산성 내지 알칼리성으로 하거나 구리염, 제 1 철염등, 제 2 철염 등의 금속염 및 수증기탄, 염화 아연탄 등의 활성탄등과 같은 산화촉진제 존재하에 산화를 촉진하는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 필요하다면 과산화 수소, 과망간산 칼륨 등의 산화제를 첨가하여 요액을 산화 시키는 것도 유리하게 실시할 수 있다.

이와 같이하여 제조되는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산과 직접 환원성을 나타내는 L-아스코르브산 당 유도체의 산화물(이하,간단히 "L-아스코르브산당 유도체 산화물"이라 함)을 함유하는 용액을 강산성 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피에 의하여 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산과 L-아스코르브산 당 유도체 산화물을 용이하게 분리할 수 있음이 판명되었다.

이하 본 발명에서 이용되는 강산성 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼 크로마토 그래피에 대하여 보다 구체적으로 설명한다.

강산성 양이온 교환수지는 공지의 예컨대, 술폰산기를 결합한 스티렌-디비닐벤젠 가교 공중합체 수지의 Na⁺형, K⁺형등의 알칼리 금속염형, 또는 Ca⁺⁺형, Mg⁺⁺형 등의 알칼리 토금속염형, 또는 H⁺형 등을 적절히 사용한다. 시판품의 예를들자면 미합중국의 Dow Chemical 사 제조의 DOWEX 50W-X8(상품명), 미합중국의 Rohm & Haas 사 제조의 Amberlite CG-120(상품명), 일본국의 東京有機化學工業社 제조의 XT-1022E(상품명), 일본국의 三菱化成工業社 제조의 Diaion SK104(상품명)등이 있다.

이들 수지는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유 획분의 분획이 우수할 뿐만 아니라 내열성, 내마모성등이 우수하고 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유물의 공업적인 대량 생산에 극히 유리하다.

원료 용액으로서, 예컨대 목적으로 하는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산과 L-아스코르브산 당 유도체 산화물, D-글루코오스 등의 협잡물을 함유하는 용액을 사용할 경우에는 강산성 양이온 교환수지를 충전한 칼럼에 원료용액을 통해준 다음, 칼럼에 물을 공급하여 분획(용출)함으로써 L-아스코르브산 당유도체 산화물 고함유 획분, L-아스코르브산 당 유도체 산화물과 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유 획분, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유 획분, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산과 D-글루코오스 고함유 획분, D-글루코오스 고함유 획분 등의 순서로 복수의 획분으로 분획하고, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유 획분을 채취회수 함으로써 용이하게 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유물을 제조할 수 있다.

또한 원료용액을 칼럼속을 통과시켜 분획할 경우에 있어서, 이미 수득한 L-아스코르브산 당 유도체 산화물과 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유 획분과, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산과 D-글루코오스 고함유 획분등의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 함유 획분을 원료용액의 공급 전후에 또는 원료용액과 함께 칼럼에 공급함으로써 분획에 필요로하는 물의 사용량을 감소시키고, 원료용액으로부터 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산을 고농도 및 고수율로 제조하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 분획방식은 고정상 방식, 이동상 방식 및 의사(擬似)이동상 방식중 어느것이라도 좋다.

이와 같이 하여 제조된 본 발명의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유물, 바람직하게는 순도 70% 이상의 고함유물을 용액상이어도 또는 농축하여 시럽상으로 한 것이어도 극히 안정하고 그 취급도 용이하다.

다음에는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유물과 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산의 제조방법에 대하여 설명한다.

본 발명에서 사용하는 결정화용의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유물은 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 석출을 저해하는 직접 환원성을 가진 L-아스코르브산 당 유도체를 실질적으로 제거한 것이기 때문에 그 결정의 석출은 극히 용이하고 결정수율도 높다.

결정화 방법은 통상 20~60℃의 비교적 고온의 과포화 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 용액을 결정화 장치에 넣고, 여기에 씨결정(seed drystal)을 바람직하게는 0.1~10 w/w%공존시켜 완만하게 교반하면서 서서히 냉각시킴으로써 결정 석출을 촉진하여 매스키트(massecuite)로 하면 좋다.

이와 같이 본 발명의 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산은 과포화 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 용액에 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산을 씨결정으로 하여 가함으로써 용이하게 결정으로 석출시킬 수가 있다.

본 발명에서 사용하는 석출된 매스키트로부터 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산을 제조하는 방법은 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산을 채취할 수 있으면 좋은데, 예컨대 분밀(分蜜)방법. 블록 분쇄방법, 유동 조립(造粒)방법, 분무건조 방법등 공지의 방법을 이용하면 좋다.

이와 같이 하여 제조되는 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산도 그순도와 결정 석출율등에 따라 다소 변동이 있겠으나 실질적으로 비흡습성 또는 난흡습성이고 유동성이며 고착(固着)의 우려도 없는데, 우수한 특징은 다음과 같다.

(1) 직접 환원성을 나타내지 아니하고 극히 안정하다.

L-아스코르브산과는 달리 메일라아드 반응(Maillard reaction)을 일으키기가 어렵다. 따라서 아미노산, 펩티드, 단백질, 지질, 당질, 생리활성 물질 등이 공종하더라도 불필요하게 반응을 일으키지 아니하며 오히려 이들 물질을 안정화한다.

(2) 가수분해를 받아 L-아스코르브산을 생성하여 L-아스코르브산과 마찬가지의 환원 작용과 항산화 작용을 나타낸다.

(3) 체내의 효소에 의하여 쉽사리 가수 분해되어 L-아스코르브산과 D-글루코오스를 생성하여 L-아스코르브산 본래의 생리활성을 나타낸다. 또한 비타민 E 및/또는 비타민 P 등과 병용함으로써 그 생리활성을 증강시킬 수 있다.

(4) L-아스코르브산과 α-글루코실 당화합물등을 경구 섭취함으로써 생체내에서 생성되어 대사되는 물질이기 때문에 그 안정성은 극히 높다.

(5) 실질적으로 비흡습성 또는 난흡습성임에도 불구하고 물에 대하여 큰 용해도와 용해속도를 가지고 있고, 분말, 과립, 정제등의 비타민제, 크리임 필링(cream filling), 초콜렛, 츄우잉 검, 즉석 쥬우스, 즉석 조미료 등의 음식물의 비타민 C 강화제, 맛부여제, 산미제(酸味劑), 안정제등으로서 유리하게 이용할 수 있다.

(6) 실질적으로 비흡습성 또는 난흡습성이고, 고결(固結)하지 않기 때문에 유동성이며, 그 취급은 용이하므로 비결정질의 경우와 비교하여 포장, 수송, 저장등에 요하는 물적, 인적 경비를 크게 절감할 수 있다.

이하 본 발명을 실험에 따라 상세하게 설명한다.

[실험 1]

[미지물질의 생성과 분리]

덱스트린 [덱스트로오스 당량 (DE) 약 6] 30중량부를 물 40중량부에 가열 용해하고 환원 조건하에 L-아스코르브산 7 중량부를 가하여 pH5.6 및 60℃로 유지하면서 여기에 시클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제 [일본국의 株式會社林原生物化學硏究所판매) 를 덱스트린 g당 250 단위 가한 다음 40시간 반응시켰다.

반응액을 고속 액체 크로마토그래피(HPLC) [펌프 : 일본국의 島津製作所제의 LC-6A, 칼럼 : 일본국의 Wako Pure Chemical Industries 제의 Wakopak WB T-330, 용리액 : 0.01w/v% 질산, 유속 : 매분 0.5ml, 검출 : 시차(示差)굴절계 RI-7520(일본국의 Eluma Optical Works 사제), UV 검출기 : 875-UV (일본국의 Japan Spectroscopic Co, Ltd 제)]로 분석한 결과, L-아스코르브산의 약 65%가 α-글리코실-L-아스코르브산으로 변환해 있었다.

이 반응액을 UF 막으로 여과하여 효소를 회수 제거한 후 50℃, pH5.0으로 조정하고, 여기에 글루코아밀라아제를 덱스트린 g당 100 단위 가한후 6시간 반응시켰다.

이 반응액을 가열하여 효소의 활성을 비활성화한 다음 활성탄으로 탈색 여과하고 여액을 농축한 다음 일본국 특허 공개 소 58-23799호 공보에 개시되어 있는 칼럼 크로마토그래피 방버에 준하여 강산성 양이온 교환수지[미합중국의 Dow Chemical 사 제조의 DOWEX 50W-X4, (Ca⁺⁺형), (상품명)] 을 충전한 칼럼을 사용하여 칼럼 크로마토그래피를 함으로써 이 용출액의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유 획분으로 채취하고, 이것을 양이온 교환수지(H⁺형)가 충전된 칼럼에서 탈미네랄 처리(demineralization)하여 정제한 후 감압 농축하여 농도 약 77w/w%로 하였다. 이것을 결정화 장치에 넣고 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 씨 결정을 가하여 40℃로 조정한 다음 완만하게 교반하면서 서서히 냉각하여 2일 동안에 걸쳐 20℃까지 온도를 내린후 바스켓형 원심 분리기에서 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산을 분리제거 하였다. 이와 같이하여 1번 모액을 원료인 L-아스코르브산에 대하여 고형물당 약 50%의 수율로 얻었다.

이 모액을 마찬가지로 감압 농축하여 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산의 결정을 재차 석출시키고 이것을 분리 제거함으로써 2번 모액을 원료인 L-아스코르브산에 대하여 고형물당 약 25%의 수율로 얻었다. 이 2번 모액을 고속 액체 크로마토그래피로 분석한 결과, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산이 18.7분 위치에서 검출되었고 L-아스코르브산이 29.7분 위치에서 검출된 반면 그 중간인 21.7분과 23.1분 위치에서는 미지물질의 피이크가 검출되어 이들 미지물질을 각각 물질 X및 물질 Y로 임시로 명명하였다. 2번 모액에서의 물질 X와 물질 Y의 함량은 각각 고형물당 약 10w/w이었고 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산의 함량은 약 65w/w이었다.

이어서 2번 모액으로부터 물질 X와 물질 Y를 분리하기 위하여 대량으로 공존하는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산을 제거해야 할 필요가 있었다.

여기서 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산을 제거하는 조건에 대하여 여러가지로 검토한 결과, 강산성 및 고온 조건하에서 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산이 물질 X와 물질 Y보다 가수 분해를 받기 쉽다는 것을 확인하고 이 방법을 이용하여 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산을 제거하였다.

즉, 2번 모액을 농도 25w/w%로 하여 이것을 염산으로 pH1.7로 조정한 후 100℃로 유지하여 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산을 우선적으로 가수 분해한 다음 냉각하고 음이온 교환수지(OH^-형)를 충전한 칼럼에 공급하여 물질 X와 물질 Y를 흡착시키고 물로 세척하고 나서 0.5N 염산으로 용출하여 물질 X와 물질 Y를 함유하는 용액을 얻었다.

이어서 수득한 용액을 고속 액체 크로마토그래피 [펌프 : Model 510(일본국의 Japan Waters 사제), 칼럼 : D-ODS-5(일본국의 YMC 사제), 용리액 : 0.01M NaH₂PO₄-H₃PO₄(pH 2.0), 유속 : 매분 4.5ml, 검출 : UV 검출기]로 처리하여 물질 X 또는 물질 Y의 고함유 획분을 회수하고, 탈염장치(일본국의 旭化成株式會社의 Micro acylizer Gl, Cartridge AC-110 사용) 에서 탈염한 후 농축, 동결 건조하여 분말상 물질 X와 물질 Y를 원료 모액에 함유되는 각각에 대하여 약 20%의 수율로 얻었다.

이것을 앞에 나온 고속액체 크로마토그래피로 분석한 결과, 물질 X 는 순도 약 98%이었고,물질 Y는 순도 약 97%의 고순도품이었다.

[실험 2]

[물리화학적 성질]

실험 1에서 제조한 고순도의 물질 X 및 물질 Y를 사용하여 다음과 같은 물리화학적 성질을 조사하였다.

(a) 원소 분석 : C₁₂H₁₈O₁₁로서

이론치 C = 42.6% H = 5.36%

물질 X 실측치 C = 42.4% H = 5.37%

물질 Y 실측치 C = 42.5% H = 5.37%

(b) 글루코오스와 L-아스코르브산의 구성비

이론치 ; 글루코오스 : L-아스코르브산 = 1 : 1

물질 X 실측치 ; 글루코오스 : L-아스코르브산 = 1.00 : 1.05

물질 Y 실측치 ; 글루코오스 : L-아스코르브산 = 1.00 : 0.99

(주) 글루코오스 함량은 안트론-황산법으로 측정하였고 L-아스코르브산 함량은 인도페놀-크실렌법으로 측정하였다.

(c)자외선 흡수 스펙트럼

물질 X와 물질 Y 모두 pH2.0의 용액중에서 243nm에서, 그리고 pH7.0의 용액중에서는 265nm에서 흡수 극대를 나타내었다.

(d)소장(小腸)점막효소에 의한 가수분해

일본국 罔田 등이 日本(榮養·食糧學會誌, 제 43권, 제 1 호 23~29페이지(1990년)에서 보고한 방법에 따라 소장 점막효소에 의한 물질 X와 물질 Y의 가수 분해 시험을 한 결과, 물질 X는 가수 분해가 용이한데 대하여 물질 Y는 거의 가수 분해되지 않았다.

(e) NMR 스펙트럼

핵자기 공명분석(¹³C-NMR)에 의하여 12 개의 시그날이 나타났는데, 이 물질의 12개의 탄소는 모두 상이한 화학 시프트(shift)를 나타내었다. 나타난 각 시그날을 표준 물질인 α-D-글루코피라노오스 및 L-아스코르브산으로 귀속시켜 양 표준 물질의 화학 시프트와 물질 X 및 물질 Y 의 화학시프트를 모두 표 1에 나타내었다.

(주) A는 L-아스코르브산 잔기를 뜻하고 B는 α-D-글루코파라노오스 잔기를 뜻함.

표 1의 결과로부터 물질 X는 아래의 구조식 2로 나타내어지는 신규 물질인 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산이고, 물질 Y는 아래의 구조식 3으로 나타내어지는 공지 물질인 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산이라는 것을 판단할 수 있다.

[구조식 2]

[구조식 3]

[실험 3]

[산화처리]

실험 1의 방법으로 제조한 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산, 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산, 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 및 2번 모액을 각각 농도 10 w/w 및 pH5.0으로 조정하고, 각 용액에 수증기탄을 고형물당 5w/w% 가하여 27℃에서 24시간 동안 통기교반한 결과, 직접 환원성을 나타내는 L-아스코르브산 당 유도체인 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산, 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 및 2번 모액중에 함유된 직접 활성을 나타내는 L-아스코르브산 당 유도체는 산화되어 이들이 가진 특유의 자외선 흡수가 소실되었다.

이에 대하여 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산은 단독 용액중에서나 2번 모액중의 어느 경우에 있어서도 안정하였고 양적으로나 질적으로도 변화가 없었다.

[실험 4]

[강산성 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피]

실험 1의 방법으로 제조한 2번 모액의 미처리액 또는 이 모액을 실험 3의 방법으로 산화 처리한 후 수증기탄을 제거하고 강산성 양이온 교환수지(H⁺형)로 탈미네랄 처리한 용액을 원료용액으로 하여 일본국 특허 공개 소 58-23799호 공보에 개시되어 있는 강산성 양인온 교환수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피 방법에 따라 강산성 양이온 교환수지(일본국 東京有機化學工業 제조의 상품명 XT-1016, H⁺형) 를 충전한 칼럼을 사용하여 칼럼 크로마토그래피를 하였다.

미처리액의 경우에는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산과 비교적 소량 함유되어 있는 직접 환원성을 나타내는 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산은 동일한 크로마토그래피 패턴을 나타내었기 때문에 이들을 분리하기가 곤란하였다.

이에 대하여 산화처리된 2번 모액의 경우에는 용출액이 L-아스코르브산 당유도체 산화물 고함유 획분, L-아스코르브산 당 유도체 산화물과 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유 획분, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유 획분의 순서로 용출하였다. 따라서 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산과 L-아스코르브산 및 L-아스코르브산 당 유도체 산화물의 분리를 할 수 있었고, 공업적으로 용이하게 실시 할 수 있음이 판명되었다.

이하 본 발명의 실시예에 대하여 설명한다.

[실시예 1]

덱스트린(DE 약 6) 30 중량부를 물 40 중량부에 가열 용해하고 환원 조건하에서 L-아스코르브산 7 중량부를 가하여 pH5.6 및 60℃로 유지하면서 여기에 시클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제를 덱스트린 g당 250 단위 가한 다음 40시간 반응시켰다.

이 반응액을 UF막으로 여과하여 잔존하는 효소를 회수제거한 후 50℃, pH5.0으로 조정하고 여기에 글루코아밀라아제를 덱스트린 g당 100단위 가하고 6기간 반응시켰다.

이 반응액을 가열하여 잔존하는 효소를 비활성화하여 활성탄으로 탈색 여과하였다. 여액을 농축한 다음, 강산성 양이온 교환수지 [미합중국의 Dow Chemical 사 제조의 DOWEX 50W-X4(Ca⁺⁺형)(상품명)]를 충전한 칼럼을 사용하여 칼럼 크로마토그래피를 하여 이 용출액의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유 획분을 회수하였다.

이 획분을 고속 액체 크로마토그래피로 분석한 결과, 고형물당 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 90w/w%, 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 2.5w/w% 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 2.5w/w%를 함유하는 용액이었다.

이 용액을 농도 약 36w/w%, pH4.0으로 조정하고 여기에 황산 제 2철을 고형물당 0.1w/w%가하여 30℃에서 20시간 통기교반하여 산화처리한 다음 수득한 혼합물을 앞서 나온 방법과 마찬가지로 하여 강산성 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피를 하여 이 용출액의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유 획분을 회수하였다.

이렇게 하여 수득한 획분을 강산성 양이온 교환수지(H⁺형)로 탈미네랄 처리하여 정제하고, 여액을 감압 농축하여 농도 약 77w/w%로 한 다음 이것을 결정화 장치에 넣고 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산을 씨결정으로 하여 2w/w% 가한후 40℃로 가열하고, 완만히 교반하면서 서서히 냉각하여 2일 동안에 20℃까지 온도를 내린 다음, 바스켓형 원심분리기에서 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산을 원료인 L-아스코르브산에 대하여 약 50%의 수율로 얻었다.

이 제품은 직접 환원성을 나타내지 않고 안정성, 생리활성도 충분하여 비타민 C강화제로서뿐만 아니라 맛부여제, 산미제, 안정제, 품질 개량제, 항산화제, 생라활성제, 자외선 흡수제, 의약원료, 화공약품 등으로 하여 음식물, 항감수성 질환제, 화장품등에 유리하게 이용할 수 있다.

[실시예 2]

덱스트린(DE 10)9 중량부를 물 20 중량부에 가열 용해하여 환원조건하에서 L-아스코르브산 3 중량부를 가하고, pH5.5 및 65℃로 유지하면서 여기에 시클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제를 덱스트린 g당 150단위 가하고 40시간 반응시켰다.

이 반응액을 고속 액체 크로마토그래피로 분석한 결과, L-아스코르브산의 약 65w/w%가 α-글루코실-L-아스코르브산으로 변환하여 있었다.

이 반응액을 가열하여 잔존하는 효소를 비활성화한 후 55℃ 및 pH4.5로 조정하고 여기에 글루코아밀라아제를 덱스트린 g당 50단위 가하여 24시간 반응시켰다.

수득한 반응액을 가열하여 잔존하는 효소를 비활성화하고 활성탄으로 탈색 여과하였다. 여액을 양이온 교환수지(H⁺형) 의 칼럼에 공급하여 탈미네랄 처리한 다음 음이온 교환수지(OH^-형)의 칼럼에 공급하여 음이온을 수지에 흡착시킨후, 음이온 교환수지의 칼럼을 물로 세척하여 D-글루코오스 등을 제거하고 0.5N염산용액으로 용출하였다. 용출액을 농축하고, 이 농축액을 원료 용액으로 하여 강산성 양이온 교환수지(H⁺형)를 충전한 칼럼을 사용하여 칼럼 크로마토그래피를 함으로써 이 용출액의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유 획분을 회수하였다. 이어서 이 획분 농도 약 75w/w% 로 감압 농축하고 결정화 장치에 넣어 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산을 씨결정으로 하여 1w/w%가한 다음 40℃로 가열하고 완만히 교반하면서 서서히 냉각하여 2일 동안에 걸쳐 20℃까지 온도를 내렸다. 수득한 혼합물을 바스켓형 원심분리기에서 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산을 분리함으로써 모액을 건조 고형물 기준으로 약 55%의 수율로 얻었다.

이 모액을 고속 액체 크로마토그래피로 분석한 결과, 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 약 80w/w%, 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 약 5 w/w% 및 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 약 5 w/w%을 함유하고 있었다.

이 모액을 농도 18w/w% 및 pH5.0으로 조정하고, 여기에 염화 아연탄을 건조 고형물당 0.5w/w%가하고 50℃에서 20시간 통기 교반하여 산화 처리한 다음 앞서 나온 방법과 마찬가지로 하여 강산성 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피를 함으로써 이 용출액의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유 획분을 회수하였다. 이 획분을 이온교환수지로 탈미네랄 처리하고 감압농축한 다음 실시예 1의 방법에 따라 결정화하고 분리함으로써 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산을 모액 고형물당 약 55%의 수율로 얻었다.

이 제품은 실시예 1의 경우와 마찬가지로 음식물, 항감수성 질환제, 화장품등에 유리하게 이용할 수 있다.

[실시예 3]

실시예 2의 방법으로 제조한 모액을 농도 20w/w% 및 pH7.5로 조정하고 50℃에서 48시간 통기교반하여 산화처리한 다음 실시예 2의 방법에 따라 강산성 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피를 함으로써 이 용출액의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유 획분을 채취하였다. 이 획분을 이온 교환수지를 탈미네랄 처리하고 감압 농축하여 실시예 1의 방법에 따라 결정화 한후 분리함으로써 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산을 모액 건조 고형물당 약 53%의 수율로 얻었다.

위에서 설명한 바와 같이 본 발명에 있어서 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산과 직접 환원성을 나타내는 L-아스코르브산 당 유도체를 함유하는 용액을 산화 처리한 다음 강산성 양이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피를 함으로써 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산과 L-아스코르브산 당 유도체 산화물을 용이하게 분리할 수 있기 때문에 제조되는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유 획분의 순도를 향상시킬 수 있고 결정 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산의 석출이 용이하게 되어 그 수율도 향상시킬 수 있다.

따라서 본 발명은 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유물의 제조 방법으로서의 공업적 의의가 극히 크다.

Claims

2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산과 직접 환원성을 나타내는 L-아스코르브산 당 유도체를 함유하는 용액으로부터 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유물을 회수함에 있어서, (가) 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산과 직접 환원성을 나타내는 L-아스코르브산 당 유도체를 함유하는 용액을 산화 처리하고, (나) 수득한 용액을 강산성 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피로 처리한 다음, (다) 이 용출액의 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유 획분을 회수함을 특징으로 하는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유물의 제조방법.
제1항에 있어서, L-아스코르브산 당 유도체가 5-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산과 6-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산으로부터 선택되는 직접 환원성을 1종 이상의 나태는 L-아스코르브산 당 유도체임을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서 (가) 단계의 산화처리를 호기적 조건하에서 실시함을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, (가) 단계의 산화처리를 약산성 내지 알칼리성 pH 조건하에서 실시함을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 산화처리를 산화 촉진제 존재하에 실시함을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 고함유물의 순도가 건조 고형물 중량기준으로 70 w/w% 이상임을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, (다) 단계에는 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산 함유 분획물을 농축하여 과포화 용액을 제조함으로써 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산의 결정을 석출시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 제조방법.
제7항에 있어서 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산의 결정화를 20~60℃ 범위의 온도에서 실시함을 특징으로 하는 제조방법.