KR100226231B1 - 개선된 발광검정방법 및 장치 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 관심있는 전극에서 전기화학발광을 근거로하여 샘플내 존재하는 관심있는 분석물에 대한 결합 검정을 수행하기 위한 방법, 장치, 시료, 및 키트에 관한 것이다. 방법에서, 예컨대 중력, 원심분리 또는 자기인력에 의해 전극표면 상에 정착시키기 위해 시료 및 키트입자를 사용할 수 있다. 장치는 전극에 인접한 부근에 자장을 생성하기 위한 자석을 포함할 수 있다.

Description

[발명의 명칭]
개선된 발광 검정 방법 및 장치
[기술분야]
본 출원은 전반적으로 결합 검정을 수행하기 위한 방법 및 장치, 보다 구체적으로 분석 시스템의 하나이상의 라벨된 성분에 의해 방출된 발광을 측정하여 관심있는 분석물의 존재를 측정하는 것들에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 전기화학발광이 일어나기 전에 분석 조성물내의 발광성 성분이 집중되고 감지 시스템상에 수집된, 개선된 민감성의, 정밀한, 재현성의 정확한 균질 또는 불균질 특이 결합 검정에 관한 것이다.
[배경기술]
생화학적 및 생물학적 물질에서 관심있는 분석물의 감지 및 정량화를 위한 무수한 방법 및 시스템을 개발했다. 미량의 미생물, 호르몬, 비루스, 항체, 헥산, 및 기타 단백질을 측정할 수 있는 방법 및 시스템은 연구자 및 임상의에게 큰 가치가 있다.
매우 실질적인 기술품을 널리 공지된 결합 반응, 예컨대 항원-항체 반응, 헥산 혼성체화 기술, 및 단백질-리간드 시스템을 근거로 하여 개발하였다. 많은 생화학 및 생물학적 결합 시스템에서 연구 및 진단에 가치있는 많은 분석 방법 및 시스템의 원인은 고도의 특이성이었다. 전형적으로, 관심있는 분석물의 존재는 하나 이상의 결합 물질에 부착된 관찰가능한 라벨의 존재 또는 부재에 의해 표시된다. 특히 관심있는 것은 광화학, 화학 및 전기화학 장치를 통해 발광하도록 할 수 있는 라벨이다. 광발광은 물질이 전자기 방사선을 흡수할 때 발광을 나타내도록 유도되는 방법이다. 형광 및 인광은 광발광의 유형들이다. 화학발광 방법은 에너지의 화학적 전이에 의한 발광성 종의 생성을 수반한다. 전기화학발광 은 전기화학적으로 발광성 종의 생성을 수반한다.
관심있는 분석물을 함유하는 표본을 화학발광성 라벨로 라벨된 반응물과 혼합하는 화학발광 분석법을 개발하였다. 반응성 혼합물을 항온처리하고 라벨된 반응물중 약간의 분량이 분석물에로 결합한다. 항온 처리한 후에, 혼합물중 결합된 획분과 결합안된 획분을 분리시키고, 어느 하나 또는 두 획분내 라벨의 농도를 화학발광 기술로 측정할 수 있다. 하나 또는 두 획분에서 측정된 화학발광의 수준은 생물 샘플내 관심있는 분석물의 양을 나타낸다.
전기화학발광 (ECL) 검정 기술은 화학발광 기술에 대한 개선이다. 이것은 관심있는 분석물의 존재 및 농도의 민감하고 정밀한 측정을 제공한다. 상기 기술에서는 발광을 개시하기 위해 항온 처리된 샘플을 전압전류 작업 전극에 노출시킨다. 적당한 화학적 환경에서, 특정 시간에 및 특정방식으로 작업 전극상에 가한 전압에 의해 상기 전기화학발광이 개시된다. 라벨에 의해 생성된 광을 측정하고 이는 분석물의 존재 또는 양을 나타낸다. 상기 ECL 기술에 대한 더 완전한 설명을 위해 PCT 공개 출원 US 85/01253(WO86/02734), PCT 공개 출원 번호 US 87/00987, 및 PCT 공개 출원 US 88/03947을 참고로 한다. 상기 출원의 명세서를 참고문헌으로 삽입한다.
정밀하고 민감한 측정을 하기 위하여 검정 절차중에 별도 단계를 필요로 하지 않고 전기화학발광 분석을 수행하고 상이한 농도의 분석물에서 신호 변조를 최대화하는 것이 바람직하다. 비분리 검정을 위한 선행 기술 방법중에 검정하는 하나이상의 결합 성분에 결합하는, 검정샘플에 현탁된 소미립자 물질을 사용하는 것들이 있다.
미합중국 특허 제 4,305,925호는 비탁계 및 탁도계 방법에 의한 임상적으로 관련된 단백질 및 펩티드의 감지 및 측정에 관한 것이다. 공개된 방법들은 광 산란 또는 흡수의 기능을 수행하는 라텍스 입자에 항원 또는 항체를 결합시키는 것을 수반한다.
미합중국 특허 제 4,480,043호는 외각-중심 입자로 구성되는 입자 시료를 사용하는 기술에 관한 것이다. 외각은 생물학적 관심이 있는 화합물이 공유 결합될 수 있어 높은 민감성을 야기한다. 이 기술은 다양한 방식으로 감지되는/되거나 측정될 수 있는 응결물을 생성하는 관심있는 다가 항원과 이가 항체의 반응으로부터 유래하는 점착 반응에 근거한다. 또한 미합중국 특허 제 4,419,453호는 항체 및 임뮤노겐 같은 면역화학약품의 존재를 감지하는데 유용한 착색 라텍스 점착 시험 방법의 이용에 관한 것이다.
상기 기술을 근거로 하여, 발광 현상이 측정되는 검정에서 소미립자 물질을 사용하는 것이 가능하다고 생각되지는 않았다. 혹자는 유리화학발광 또는 전기화학발광 부분으로부터의 발광을 흡수하고, 산란하거나 그렇지 않으면 소미립자 물질로부터 간섭을 받는다고 예측했을 것이다.
상기 예측에 반하여, 미합중국 출원 일련 번호 539,389 (PCT 공개출원 US 89/04919)는 불활성 소미립자 물질이 검정 시스템의 결합반응물 중 하나에 특이적으로 결합되는 발광 현상에 근거한 민감한, 특이결합 검정 방법을 지도한다. 이 검정은 불균질 (하나 이상의 별도 단계들) 검정법 형태로 수행할 수 있고 가장 이롭게 균질(비분리) 검정형태로 사용할 수 있다.
미합중국 89/04919는 발광 현상의 측정을 위해 결합 반응을 근거로한 검정을 위한, 검정 혼합물의 성분에 결합할 수 있는 표면을 갖는 다수의 현탁된 입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또다른 측면에서, 그것은 샘플내 관심있는 분석물을 감지하거나 정량화하기 위한 시스템에 관한 것으로, 상기 시스템은 그 발명의 검정 조성물을 사용하여 검정법을 수행할 수 있다. 이 시스템은 검정 매질 내 라벨화합물을 발광하도록 유도시키기 위한 수단, 및 샘플내에 관심있는 분석물의 존재를 감지하는 발광을 측정하기 위한 수단을 포함한다.
현탁된 소미립자 물질에 대한, 전기화학발광성 부분이 결합된 검정 시스템의 성분의 결합은 성분에 결합된 전기화학발광성 부분에 의해 발생된 발광 신호의 강도를 크게 변화시켜 검정 시스템의 특이적 결합반응을 감지하는 수단을 제공함을 발견했다. 더욱 놀랍게도, 현탁된 입자가, 현탁된 소미립자 물질에 결합되지 않은 채 남아있는 시스템의 성분에 결합된 전기화학발광성 부분에 의해 발생한 발광 신호의 강도에 거의 영향을 미치지 않거나 영향을 미치지 않음을 발견했다.
따라서, 미합중국 89/04919는 샘플내 관심있는 분석물의 감지방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (i) (a) 관심있는 분석물을 함유한다고 추정되는 샘플, (b) (i) 관심있는 분석물 또는 관심있는 분석물의 유사물, (ii) 관심있는 분석물 또는 그의 상기 유사물의 결합 파트너, 및 (iii) (i) 또는 (ii)와 결합할 수 있는 반응성 성분으로 구성되는 군으로부터 선택된 검정 수행-물질, 이때 상기 물질들 중 하나는 발광하도록 유도될 수 있는 화학적 부분을 갖는 라벨화합물에 결합되며, 및 (c) 분석물 및/또는 (b), (i), (ii) 또는 (iii)에 정의된 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 현탁된 입자를 형성하고, (2) 조성물을 항온처리하여 입자 및 상기 레벨 화합물을 포함하는 복합체를 형성하고 ; (3) 라벨 화합물을 발광하도록 유도시키고 ; (4) 조성물에 의해 방출된 발광을 측정하여 샘플내 관심있는 분석물의 존재를 감지하는 단계들로 구성된다. 이와 동일한 방법을 사용하여 검정 조성물의 발광과 공지된 양의 분석물을 함유하는 조성물의 발광을 비교하므로써 샘플내 분석물의 양을 정량할 수 있다.
천연 또는 합성물일 수 있는, 관심있는 분석물의 유사물은 분석물에 필적하는 결합 성질을 가지는 화합물이나, 또한 더 높은 또는 더 낮은 결합능력의 화합물을 포함한다. 본 발명에 사용하기 적합한 결합 파트너는 잘 알려져 있다. 실례는 항체, 효소, 헥산, 렉틴, 보조인자 및 수용체이다. 분석물 또는 그의 유사물과 및/또는 그의 결합 파트너와 결합할 수 있는 반응 성분은 두번째 항체 또는 단백질 예컨대 단백질 A 또는 단백질 G일 수 있거나 아비딘 또는 비오틴 또는 결합 반응에 참여하는 당업계 공지된 또다른 성분일 수 있다.
이롭게, 발광은 특이적 결합 파트너에 결합되거나 결합되지 않거나, 라벨화합물을 전압전류 작업 전극에 노출시켜 유도되는 전기화학발광 (ECL)로 부터 발생한다. ECL 반응성 혼합물은 특정 시간에 및 광을 발생하는 특정 방식으로 작업 전극 상에 가한 전압에 의해 광을 방출하도록 제어가능하게 개시된다. 가시 광선의 방출이 이로운 특징이지만, 상기 조성물 또는 시스템은 다른 유형의 전자기 방사선, 예컨대 적외선 또는 자외선 X-선, 마이크로파 등을 방출할 수 있다.
용어 전기화학발광, 전기화학발광성 , 발광, 발광성, 발광하다의 이용은 광 및 전자기 방사선의 다른형태의 방출을 포함한다.
미합중국 89/04919에서는 연구 및 임상 환경에서 수행되는 다양한 검정에서 극소량의 분석물을 감지하고 정량화하는 방법을 지도한다. 연구자 및 임상의의 요구는 이들 검정의 민감성을 증가시키고 검정을 수행할 수 있는 속도로 증가시키므로써 이들 방법에 의해 수행된 검정법의 감지 한계를 낮추기를 절박하게 한다.
라벨된 종으로부터의 신호를 증가시키기 위해 그들을 측정 단계에 적용시키기 전에 농축시키는 다양한 방법들이 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, 미합중국 특허 제 4,652,333호에서는 형광성, 인광성 또는 원자형광성 라벨로 라벨된 입자를 측정 단계를 수행하기 전에 미소여과에 의해 농축한다.
또한 당업계에는 측정 단계에 앞서, 예컨대 측정 용기의 표면에 자기 반응성 라벨된 입자를 끌어당기므로써 라벨된 면역화학 종을 농축시키는 것이 공지되어 있다. 미합중국 특허 제 4,731,337호, 제 4,777,145호 및 제 4,115,535호에서는 예컨대, 상기 입자를 용기 벽에 끌어당긴 다음 방사시켜 광의 형광인광성 방출을 여기시킨다.
미합중국 특허 제 4,945,045호에서는 입자를 자기 전극상에 농축한다. 전기화학적 반응은 라벨된 화학적 중개자에 의해 촉진된 전극에서 일어난다. 면역화학적 결합 반응은 결합이 일어났을 때 변조신호를 초래하는 중개자의 효율을 변경한다.
이들 선행 기술 방법은 본 발명의 표면 선택적 여기 방법과 관련없다. 표면 여기의 임의 특정한 기계적 설명에 의해, 예컨대 전기화학 발광에 구애받지 않는 한편, 고체-상 복합체 상의 라벨이 전극에서 산화되어야만 한다고 생각한다. 이는 전자가 라벨에서 전극으로 이동할 것을 요구한다. 전자가 위치 에너지 장벽을 넘을 필요없이 공간(그의 위치에너지가 매우 높은 영역, 예컨대 용액)을 통과하는 터널링으로 공지된 현상에 의해 전자가 이 점프를 한다고 생각된다. 그것이 에너지 장벽을 통과하여 부가적인 에너지 유입없이 한 분자로부터 또다른 분자에로 또는 한 분자로부터 전극으로 이동할 수 있다. 그러나, 이 터널링 현상은 매우 짧은 거리에서만 작업할 수 있다. 터널링 현상의 확률은 두 종 사이의 거리가 증가하면 지수적으로 떨어진다. 두 종사이에 발생하는 터널링 현상의 확률은 거리가 25Å (2.5nm)미만이라면 매우 높고 거리가 더 크면 매우 낮다. 25Å의 거리는 당업자에 의해 사용된 경험의 법칙이나 절대적 한계는 아니다.
따라서, 25Å의 전극 표면을 갖는 이들 ECL 라벨만이 ECL 방법에 참여한다고 예측할 수 있다. 전극 표면의 25Å 내에 있는 입자 영역은 전형적으로 극히 작다.
따라서, 입자 표면으로부터의 ECL을 임의 유의한 정도로 측정할 수 있는지 예측할 수 없다. 또한, ECL 방법에 의해 생성된 광은 광증폭기에 이르도록 입자를 통과해야 한다. 입자가 근본적으로 불투명하므로 (그들의 농축 현탁액은 검정색이다) 유의한 양의 광이 ECL 에 의해 생성될 수 있더라도 광이 입자를 통과할 수 있고 광증폭기에 의해 측정할 수 있다고 예측할 수 없다.
[발명의 목적]
따라서 본 발명의 제 1 목적은 균질(비-분리) 및 불균질 (분리) 방법, 결합 검정을 수행하기 위한 시료 및 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 부가적인 목적은, 소미립자 물질을 함유하는 검정 조성물로부터 방출된 전기화학발광의 측정에 근거한, 비-분리, 특이적 결합검정법, 시료 및 장치를 제공하는 것이다.
부가적인 및 관련된 목적은 이전에 성취된 것들 보다 개선된 민감성, 더 빠른 검정시간, 더 큰 특이성, 더 낮은 감지 한계 및 더 큰 정밀도를 갖는 검정법, 시료 및 장치를 제공하는 것이다.
[발명의 상세한 설명]
[용어의 정리]
용어 ECL 부분, 금속-함유 ECL 부분, 라벨, 라벨 화합물, 및 라벨 물질은 서로 바꿔쓸 수 있다. 분석물 또는 그의 유사물, 분석물 또는 그의 유사물의 결합 파트너, 및 부가적으로 상기 언급된 결합 파트너의 결합파트너, 또는 분석물, 그의 유사물 또는 상기 언급된 바와 같은 결합파트너와 결합할 수 있는 반응성 성분에 결합되는 ECL 부분, 금속-함유 ECL 부분, 유기-금속, 금속 킬레이트, 전이 금속 킬레이트, 희토 금속 킬레이트, 라벨 화합물, 라벨 물질 및 라벨로 불리는 종들은 본 발명의 영역내에 있다. 또한 상기 언급된 종들은 하나 이상의 결합 파트너 및/또는 하나 이상의 반응성 성분의 조합물에 결합될 수 있다. 부가적으로, 상기 언급된 종들은 또한, 결합 파트너, 반응성 성분 또는 하나 이상의 결합 파트너 및 / 또는 하나 이상의 반응성 성분에 결합된 분석물 또는 그의 유사물에 결합될 수 있다. 또한 분석물 또는 그의 유사물에, 직접 또는 상기 논의된 바와 같이 다른 분자를 통하여 결합되는 다수의 상기 언급된 종들도 본 발명의 영역내에 있다. 간단히, 이들 리간드는 검정-수행-물질로 언급한다.
용어 감지 및 정량화는 측정으로 언급되고, 정량하는 기준 조성물의 제조 및 계산이 필요함은 물론이다.
용어 복합체의 수집 및 농도는 검정 조성물내 복합체의 농도 및 예컨대 전극 표면에서 복합체의 수집을 서술하기 위해 서로 바꿔 사용할 수 있다.
[발명의 간단한 설명]
그의 넓은 실시양태에서, 본 발명은 표본내에 존재하는 관심있는 분석물에 대한 결합 검정을 수행하기 위한 방법이다.
이 단계는:
(a) 하기 (i)-(iii)를 함유하는 조성물을 형성하고 (i) 상기 샘플 (ii) 발광하도록 유도될 수 있는 라벨 화합물에 결합된 성분을 함유하는 검정 -수행물질, 및 (iii) 분석물 및/또는 상기 검정-수행-물질과 특이적으로 결합 할 수 있는 다수의 입자; (b) 상기 조성물을 항온처리하여 입자 및 상기 라벨 화합물을 함유하는 복합체를 형성하고; (c) 측정구역에 상기 복합체를 수집하고 ; (d) 상기 복합체내 라벨화합물을 표면 선택적 여기에 의해 발광하도록 유도시키고; (e) 방출된 발광을 측정하여 샘플내 관심있는 분석물의 존재를 측정하는 단계들로 구성된다.
복합체는 전극 상에 전압을 가해 여가되고 전기화학발광하도록 유도되는 전극 표면 상에 수집될 수 있거나 표면상에 수집된 후에 하기에 서술된 바대로 표면여기에 의해 형광을 나타내도록 유도될 수 있다. 라벨을 여기하고 감지하기 위한 표면 민감성 기술로서 전체-내부-반사-형광(TIRF)를 서술했고 전체-내부-반사는 라벨의 존재를 측정하기 위한 또다른 표면-민감성 기술로서 RAMAN 및 적외선 흡수를 사용했다. 표면 플래즈몬 공명은 표면상의 라벨을 측정하기 위한 본 발명의 방법에 따라 사용할 수 있는 광학 기술이다. 따라서 본 발명은 표면 여기 기술에 의해 발광을 여기시키기 위한 방법에 관한 것이다.
바람직하게 본 발명은 측정 영역에서, 즉 발광하도록 야기될 수 있는 표면 상에서 수행할 수 있으며, 또한 본 발명은 복합체를 측정 구역 외부에서 수집한 다음 수단을 측정구역으로 또는 발광을 유도하고 측정하기 위해 취한 다른 단계들로 가져가는 방법을 포괄한다.
중합체의 수집은 중력 정착, 여과, 원심분리 및 복합체의 일부를 형성하는 자기 반응성 입자의 자기 인력을 포함하는 몇몇 상이한 방법으로 수행할 수 있다. 몇몇 실시양태는 하기에 부가적으로 상세히 서술된다.
이롭게 전극 표면에서 전기화학 발광의 측정에 근거한 검정법은 하기 (a)-(f)에 의해 중력을 사용하여 수행한다.
(a) 하기 (i)-(iii)을 함유하는 조성물을 형성하고 (i) 상기 샘플 (ii) 전기화학발광하도록 유도될 수 있는 라벨 화합물에 결합된 성분을 함유하는 검정-수행-물질, 및 (iii) 상기 조성물의 나머지보다 더 큰 밀도를 갖고 분석물 또는 상기 검정-수행-물질과 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 현탁된 입자 ; (b) 상기 조성물을 항온 처리하여 입자 및 상기 라벨 화합물을 포함하는 복합체를 형성하고 ; (c) 상기 조성물을 검정 셀내로 도입시키고 ; (d) 입자를 중력에 의해 상기 전극 표면상에 정착시키기에 충분한 시간동안 상기 전지내에 상기 조성물을 잔류시켜 상기 검정셀의 용적물 중 적어도 실질적인 부분 아래에 위치한 전극 표면에 상기 복합체를 수집하고 ; (e) 상기 전극에 전압을 가해 상기 수집된 복합체내 라벨 화합물을 발광하도록 유도시키고 ; (f) 전극 표면에서 방출된 발광을 측정하여 샘플내 관심있는 분석물의 존재를 측정한다.
뱃치 검정을 수행할 수 있으며, 연속 또는 반-연속 검정법을 유동 셀에서 수행할 수 있다. 유동 셀에서, 고체-상은 측정 셀내에 잔류하는 반면 용액은 통과하여 흐르고 셀을 빠져 나간다. 고체-상 (예컨대, 입자)이 물보다 더 진하다면, 즉 물보다 더 큰 밀도를 갖는다면 (1.0g/mL이상), 입자에 대한 중력은 그들을 셀의 바닥으로 떨어뜨릴 것이다. 셀은 유체가 셀을 통하여 흐르듯이 입자가 바닥에 정착하도록 구성할 수 있고 또는 샘플의 대부분이 ECL 시스템의 작업 전극위의 컬럼형 구획내 셀에 함유되도록 구성할 수 있다. 셀에서 충분한 정지시간은 ECL을 유발하기 전에 전극의 표면상에 입자를 정착시키도록 제공되어야 한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 검정 조성물의 나머지보다 더 큰 밀도를 갖는 현탁된 입자를 함유하는 검정 조성물은 입자를 그들이 순차적으로 예컨대 전극과 접촉되거나 원심분리 단계에서 전극과 직접 접촉되는 측정구역으로 옮기기 위하여 원심분리에 적용할 수 있다.
이 실시양태에서, 측정 셀에 샘플 및 샘플 동봉물을 신속하게 회전시키는 수단을 장치한다. 원심력은 샘플내 입자를 샘플 동봉물의 회전축으로부터 외부로 이동시키고 샘플 동봉물의 외부 표면 상에 수집시킨다. 상기 샘플 동봉물의 외부 표면은 ECL 측정 시스템의 작업 전극을 구성할 수 있다.
세번째 실시 양태에서, 입자는 검정 조성물로부터 여과에 의해 제거할 수 있다. 이 실시양태에서 입자가 검정 조성물의 나머지보다 더 큰 밀도를 가질 필요는 없다. 본 발명에서, 입자를 용액으로부터 분리하고 예컨대 필터의 표면상에 입자를 펌핑 및 수집하여 필터를 통해 용액을 끌어들여 농축한다. 필터의 상기 표면은 예컨대 얇은 금속 필름으로 피복되고 이는 ECL 감지 시스템에서 작업 전극으로 작용할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 현탁된 입자는 자기적으로 반응성이고, 예컨대 그들은 상자성 또는 강자성일 수 있고 측정 구역에 또는 바람직하게 전극 표면에 직접, 입자에 자장을 부과하여 수집한다. 측정 셀에 자석을 장치한다. 자석의 자장이 그것들이 뱃치 셀내에 있을때 또는 유동셀에서 통과할때 입자상에 힘을 주어 자석에 가장 인접하게 있는 셀표면 상으로 대부분의 용액으로부터 입자들을 분리시킨다. 자석이 적당한 배향으로 및 ECL 감지 시스템의 작업 전극에 근접하게 위치하면 입자들은 작업 전극의 표면상에 집중할 것이다.
몇몇 상이한 불균질 및 균질형 결합 검정법은 전극 표면상에 복합체를 모으고 집중시키는, 상기 서술된 방법을 사용하여 보충할 수 있다.
불균질 결합 검정법에서 라벨로부터의 발광을 측정하기 전에 조성물로부터 복합체를 분리한다. 균질 검정법에서는, (고체 상에) 결합된 및 결합되지 않은 라벨된 시료의 분리가 없다.
불균질 검정법에서, 복합체가 작업 전극 표면에 집중될 때, 라벨로부터 측정된 신호는 수집 단계가 없을때보다 매우 크다. 반면에, 복합되지 않은 라벨된 시료로부터의 신호는 변하지 않는다. 따라서, 측정 셀내에 복합안된 라벨된 시료의 존재에도 불구하고 수집된 복합체로부터의 신호는 복합체가 없는 검정에서 보다 더 강하다. 수집 절차의 결과로서 검정 분석에 있어 감지 한계가 크게 개선된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 현장 분리 단계는 균질 결합 검정 절차에 포함된다. 검정 조성물, 즉 시료, 검정 수행 물질 및 입자를 측정셀에 펌핑시키고 작업 전극 상에 복합체를 포획한 후에 두번째 유체를 라벨 또는 라벨된 시료가 없는 셀을 통하여 펌핑시켜 검정 조성물의 결합안된 성분과 복합체의 분리 또는 현장에서의 세척을 수행한다. 이 검정 절차는 기술적으로는 불균질 결합 검정법이다. 그러나 측정 셀 내부에서 분리를 수행하는 능력은 부가적인 분리장치가 필요하지 않고 전반적으로 절차가 외부 분리 방법보다 매우 빠르다는 점에서 이롭다.
불균질 결합 검정법은 본 발명을 사용하여 검정 조성물의 성분들을 혼합하고 예정된 시간 길이 동안 성분을 반응시켜 수행한다. 그 다음이 검정 조성물을 용액이 입자로부터 분리되는 분리 단계에 적용한다.
그 다음 전기화학발광을 복합체 또는 용액으로부터 측정한다. 농축 단계 후에 복합체로부터 ECL의 측정은 농축하지 않고 가능한 것보다 더 우수한 정밀도로써 및 그보다 더 낮은 감지 한계로써 분석물을 측정한다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명, 및 이의 다른 목적 및 특징은 특정 바람직한 구체예의 하기 설명으로부터 보다 분명히 및 충분히 이해될 것이다.
본 발명은 결합 반응에 도입될 수 있는 흥미로운 분석물에 적용된다. 이들 반응은 예를 들어 항원-항체, 리간드 수용체, DNA와 RNK 상호 작용, 및 다른 공지된 반응을 포함한다. 본 발명은 다중성분 샘플내 상기 흥미로운 분석물의 존재를 정성적으로 및 정량적으로 감지하기 위한 상이한 방법 및 검정에 관한 것이다.
[샘플]
고체, 유탁액, 현탁액, 액체, 또는 기체 형태일 수 있는 흥미로운 분석물을 함유할 수 있는 샘플이 예를 들어 세포 및 세포 -유도된 생성물, 물, 음식, 혈액, 혈청, 모반, 땀, 오줌, 배설물, 조직, 타액, 기름, 유기용매 또는 공기로부터 유도될 수 있다. 샘플은 더욱이 예를 들어 물, 아세토니트릴, 디메틸 설폭시드, 디메틸 포름아미드, n-메틸 -피롤리돈 또는 알콜 또는 이의 혼합물로 구성될 수 있다.
[분석물]
흥미로운 전형적 분석물은 전체 세로 또는 표면 항원, 아세포 입자, 비루스, 프리온, 비로이드, 항체, 항원, 합텐, 지방산, 헥산, 단백질, 지방단백질, 다당류, 지질다당류, 당단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 세포 대사물, 호르몬, 약리학제제, 합성 유기 분자, 유기 금속 분자, 정신안정제, 바르비투르산염, 알칼로이드, 스테로이드, 비타민, 아미노산, 당, 렉틴, 재조합 또는 유도 단백질, 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 도는 샘플내에 존재하는 무기 분자이다. 전형적으로 관심 분석물은 10-3몰 이하, 예를 들어 10-2몰 이하와 같이 낮은 농도로 존재한다.
[검정-수행-물질]
흥미로운 분석물을 함유하는 샘플과 조합되는 검정-수행-물질은
(i) 상기 정의된 바와 같은 첨가된 흥미로운 분석물 또는 이의 유사물,
(ii) 관심 있는 분석물 또는 이의 상기 유사물의 결합 파트너, 및(iii) 상기 정의된 바와 같이 (i) 또는 (ii)를 결합할 수 있는 반응 성분으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분을 함유하고, 이 때 상기 물질 중 하나는 화합물 또는 부분, 예를 들어 발광하도록 유도될 수 있는 ECL 부분에 연결된다. 라벨링된 물질은 전체 세포 또는 표면 항원, 아세포 입자, 비루스, 프리온, 비로이드, 항체, 항원, 합텐, 지질, 지방산, 헥산, 다당류, 단백질, 지방단백질, 지방다당류, 당단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 세포 대사물, 호르몬, 약리학 제제, 정신 안정제, 바르비투르산염, 알칼로이드, 스테로이드, 비타민, 아미노산, 당, 비생물학적 중합체(바람직하게 가용성), 렉틴, 재조합 또는 유도 단백질, 합성 유기 분자, 유기 금속 분자, 무기 분자, 비오틴, 아비딘 또는 스트렙타비딘일 수 있다. 한가지 구체예로, 시료는 항체, 항원, 헥산, 합텐, 작은 누클레오티드 서열, 올리고머, 리간드, 효소 또는 비오틴, 아비딘, 스트렙타, 비딘, 단백질 A, 단백질 G 또는 이의 복합체, 또는 단백질 상호작용을 통해 일차 결합 파트너에 결합될 수 있는 다른 이차 결합 파트너에 접합된 전기 화학 발광 부분이다.
자연 또는 합성일 수 있는 흥미로운 분석물의 유사물은 분석물에 비견할 만한 결합성질을 갖는 전형적인 화합물이나 또한 보다 높거나 낮은 결합 능력의 화합물일 수 있다. 분석물 또는 이의 유사물, 및/또는 이의 결합 파트너와 결합할 수 있고 ECL 부분이 이를 통해 분석물에 결합될 수 있는 반응 성분은 적합하게 제 2항체 또는 단백질 A 또는 단백질 G와 같은 단백질, 또는 아비딘 또는 비오틴 또는 결합 반응에 참여하는 당 분야에 공지된 다른 성분이다.
[라벨]
유리하게, ECL 부분은 금속 킬레이트이다. 상기 킬레이트의 금속은 적합하게 금속 킬레이트가 본 반응 시스템에 부과되는 전기 화학 조건 하에 발광할 임의의 금속이다. 상기 금속 킬레이트의 금속은 예를 들어 전이금속(d-블럭 전이 금속과 같은) 또는 희토류 금속이다. 금속은 바람직하게 루테늄, 오스뮴, 레늄, 이리듐, 로듐, 플라티늄, 인듐, 팔라듐, 몰리브데늄, 테크니튬, 구리, 크롬 또는 텅스텐이다. 특히 바람직한 것은 루테늄 및 오스뮴이다.
상기 킬레이트 내 금속에 결합되는 리간드는 대개 성질상 헤테로시클릭성 또는 유기성이고 금속 킬레이트가 수성 분위기, 또는 유기 또는 다른 비수성 분위기에 가용성인지를 결정하는데 역할한다. 리간드는 폴리덴테이트일 수 있고 치환될 수 있다. 폴리 덴테이트 리간드는 방향족 및 지방족 리간드를 포함한다. 적합한 방향족 폴리덴테이트 리간드는 방향족 헤테로시클릭 리간드를 포함한다. 바람직한 방향족 헤테로시클릭 리간드는 질소-함유, 예를 들어 비피리딜, 비피라질, 터피리딜, 및 페난트로일이다. 적합한 치환체는 예를 들어, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, 카르복스알데히드, 카르복스아미드, 시아노, 아미노, 히드록시, 이미노, 히드록시카르보닐, 아미노카르보닐, 아미딘, 구아니디늄, 우레이드, 황-함유기, 인 함유기, 및 N-히트록시숙신이미드의 카르복실레이트 에스테르를 포함한다. 킬레이트는 하나 이상의 모노덴테이트 리간드를 가질수 있고 광법위하게 다양한 이들이 당 분야에 공지되어 있다. 적합한 모노덴테이트 리간드는 예를 들어 일산화탄소, 시아나이드, 이소시아나이드, 할라이드, 및 지방족, 방향족 및 헤테로시클릭 포스핀, 아민, 스틸벤 및 아르신을 포함한다.
적합한 킬레이트의 예는 비스[(4,4' - 카르보메톡시) -2,2'-비피리딘] 2-[3(4-메틸-2,2'-비피리딘-4-일)프로필] -1,3 - 디옥솔란 루테늄 (Ⅱ) ; 비스 (2,2'비피리딘) [4-(부탄-1-알) -4' -메틸 -2,2' -비피리딘] 루테늄(Ⅱ) ; 비스(2,2-비피리딘) [4-(4'-메틸-2,2'-비피리딘-4'-일)-부티르산] 루테늄(Ⅱ) ; 트리스(2,2'-비피리딘)루테늄(Ⅱ) ; (2,2'-비피리딘) [비스 - 비스 (1,2'-디페닐포스피노) 에틸렌] 2-[3-(4-메틸 -2,2' - 비피리딘-4-일) 프로필]-1,3-디옥솔란 오스뮴(Ⅱ) ; 비스(2,2'비피리딘) [4-(4'-메틸-2,2'-비피리딘)-부틸아민]루테늄(Ⅱ) ; 비스(2,2'-비피리딘)[1-브로모-4(4'-메틸-2,2'-비피리딘-4-일)부탄]루테늄(Ⅱ) ; 비스(2,2'-비피리딘) 말레이미도헥산산 4-메틸-2,2'-비피리딘-4' -부틸아미드 루테늄(Ⅱ) 이다. 다른 ECL 부분은 PCT 공개 출원 US 87/00987 및 PCT 공개 출원 88/0394 에 기재되어 있다.
ECL 부분의 기능은 전기 화학 에너지의 반응 시스템으로의 도입결과로 전자기 방사를 방출하는 것이다. 이를 실행하기 위해, 이들은 여기된 에너지 상태로 자극되고, 또한 상기 여기 상태로부터 강하시 광양자와 같은 전자기 방사를 방출시킬 수 있어야 한다.
전기 화학 발광 반응에 있어 ECL 부분의 참여 메카니즘의 이론적 분석에 얽매이지 않기를 바라나, 이는 반응 시스템으로 전기 화학 에너지의 도입에 의해 산화된 후 시스템 내에 존재하는 환원제와의 작용을 통해 여기 상태로 전환된다고 여겨진다. 이 상태는 비교적 불안정하고 금속 킬레이트가 신속히 보다 안정한 상태로 간다. 그렇게 되면, 킬레이트는 광양와와 같은 전자기 방사를 방출하며, 이는 감지 가능하다.
본 발명에 따라 혼입되는 금속 킬레이트 또는 다른 금속 함유 ECL 부분의 양은 시스템에 따라 다양한 것이다. 일반적으로, 이용된 상기 부분의 양은 상기 언급된 조성물 또는 시스템으로부터 감지 가능한, 및 필요하면 정량 가능한 전자기 에너지의 방출을 결과시키기 충분한 양이다. 관심 분석물의 감지 및 / 또는 정량은 전형적으로 관심 분석물 및 ECL 부분으로 전개된 보정 표준에 의해 방출된 발광과의 비교로부터 이루어진다. 이는 균질 포맷을 가정한다. 비균질 양상에서는, ECL 분석 전에 상기 논의된 바와 같은 분리가 실시된다.
당 분야의 일반 업자에 의해 이해될 수 있는 바, 금속-함유 ECL 부분의 성질 및 양은 유력한 조건에 따라 시스템별로 변화한 것이다. 원하는 결과를 얻기 적당한 금속 - 함유 ECL 부분, 및 이의 충분한 양은 과도한 실험 없이 본 발명에 조예가 있는 당분야의 일반 업자에 의해 실험적으로 결정될 수 있다.
[입자]
입자는 유리하게 직경 0.001 내지 200㎛, 예를 들어 0.05㎛ 내지 200㎛, 바람직하게 0.1㎛ 내지 100㎛, 가장 바람직하게 0.5㎛ 내지 10㎛ 를 갖는 미소 미립 물질, 및 분석물 및 / 또는 상기 정의된 하나 이상의 다른 물질들에 결합할 수 있는 표면 성분으로 구성된다. 예를 들어, 미소미립 물질은 가교된 녹말, 덱스트란, 셀룰로스, 단백질, 유기 중합체, 스티렌 공중합체, 예를 들어 스티렌 / 부타디엔 공중합체, 아크릴로니트릴 / 부타디엔 / 스티렌 공중합체, 비닐아세틸 아크릴레이트 공중합체 또는 비닐 클로라이드 / 아크릴레이트 공중합체, 불활성 무기 입자, 이산화크롬, 철, 실리카, 실리카 혼합물의 산화물, 및 단백질성 물질, 또는 이의 혼합물일 수 있다. 바람직하게, 입자는 ECL 시스템에 부유된다. 입자는 자기적 반응 입자일 수 있거나 포함할 수 있다.
[검정 매체]
전극이 전기 화학 에너지를 생성하는 시스템을 작동하기 위해, 전극이 함침되고 ECL 부분을 함유하는 전해질을 제공하는 것이 필요하다. 전해질은 이를 통해 전하가 이온에 의해 운반되는 상이다. 일반적으로, 전해질은 액체상이며 물, 유기 액체 또는 유기 액체의 혼합물, 또는 물 및 하나 이상의 유기 액체의 혼합물 내 하나 이상의 염 또는 다른 종들의 용액이다. 그러나, 다른 형태의 전해질이 또한 본 발명의 특정 구체예에 유용하다. 예를 들어, 전해질은 유체, 예, 액체, 증기 또는 초임계 유체 내 하나 이상의 물질들의 현탁액일 수 있거나 고체, 증기 또는 초임계 유체 내 하나 이상 물질들의 용액일 수 있다.
전해질은 적합하게 물 내 염 용액이다. 염은 바람직하게 나트륨염 또는 칼륨 염일 수 있으나 양이온이 전기화학 발광 작용 서열을 방해하지 않는 한 본 발명의 특정 구체예에서 다른 양이온의 혼입이 또한 적합하다의 음이온은 예를 들어 인산염이나 선택된 음이온이 전기화학 발광 작용 순서를 방해하지 않는 한 본 발명의 특정 구체예에 다시 한번 다른 음이온의 사용이 또한 허용될 수 있다.
조성물은 또한 비수성일 수 있다.
특정 예에 초임계 유체가 유리하게 사용될 수 있으나, 비수성 조성물내 유기액체로 구성되는 전해질을 사용하는 것이 보다 전형적이다. 수성 전해질과 같이, 비수성 전해질도 또한 이를 통해 전하가 이온에 의해 운반되는 상이다. 일반적으로, 이는 염이 유기 액체 매체에 용해됨을 의미한다. 적합한 유기 액체의 예는 아세토니트릴, 디메틸설폭시드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 메탄올, 에탄올 및 상기한 것의 둘 이상의 혼합물이다. 예시적으로, 유기 액체에 용해될 수 있는 테트라부틸암모늄 테트라플루오로보레이트와 같은 테트라알킬암모늄염이 이들과 사용되어 비수성 전해질을 형성할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서 전해질은 완충된 시스템이다. 인산염 완충액이 종종 유리하다. 예는 인산 나트륨 / 염화 나트륨의 수용액, 및 인산 나트륨 / 불화 나트륨의 수용액이다.
[다른 검정 성분]
아민-유도된 환원제를 이용한 전기 화학 발광 반응으로 표제된 PCT 공개 출원 U.S. 89/04859에 기재된 바와 같이, 산화되고 즉각 분해되어 이를 고 환원 종으로 전환시킬 수 있는 환원제, 전형적으로 아민 또는 (큰 분자의)아민 부분을 포함하는 것이 바람직하다. 아민 또는 아민 부분은 또한 반응 시스템에 도입된 전기 화학 에너지에 의해 산화된다고 여겨진다. 아민 또는 아민 부분은 전자 하나를 잃은 후 탈양자화하거나 그 자체를 강환원제로 재배열한다. 이 제제는 산화된 금속-함유 ECL 부분과 작용하여 이것이 상기 논의된 여기 상태를 취하도록 한다. 그 역할을 실행하기 위해, 아민 또는 아민 부분은 바람직하게 상기 탄소로부터 공여받을 수 있는 전자를 갖고, 그리고나서 알파 탄소가 환원제를 형성하기 위해 탈양자화 도중 양성자 공여체로 역할할 수 있는 상기 탄소-중심 라디칼을 갖는다. 아민-유도된 환원제는 금속-함유 ECL 부분을 이로부터 감지가능한 전자기 방사가 방출되는 이의 여기 상태로 전환시키기 위한 필요한 자극을 제공한다.
본 발명을 실행하는데 광범위한 아민 및 상응하는 아민 부분들이 사용될 수 있다. 일반적으로, 아민 또는 아민 부분은 전기 화학 발광적으로 분석될 시스템의 pH를 맞추기 위해 선택된다. 다른 관련된 인자는 아민 또는 아민 부분이 분석 도중 그 내에서 작용할 분위기와 상용성이어야 하며, 즉 경우에 따라 수성 또는 비수성 분위기와 상용성이어야 한다는 것이다. 또다른 고려는 선택된 아민 또는 아민 부분이 시스템내 산화된 금속-함유 ECL 부분을 환원시키기에 충분히 강한, 일반 조건하의 아민-유도된 환원제를 형성해야 한다는 것이다.
본 발명에 유리하게 사용되는 아민(및 이로부터 유도된 상응하는 부분)은 각각 알킬기가 1개 내지 3개의 탄소원자를 갖는 일차, 이차 및 삼차 알킬 아민과 같은 지방족 아민, 및 치환된 지방족 아민이다. 트리프로필아민이 비교적 말하자면, 특별한 고강도 전자기 방사방출을 결과하여 이것이 사용되는 구체예의 감지 및 정량의 감도 및 정확도를 증가시키므로 특히 바람직한 아민이다. 또한 적합한 아민은 히드라진과 같은 디아민, 및 폴리(에틸렌이민)과 같은 폴리민이다. 본 발명을 실행하는데 적합한 다른 아민의 예는 트리에탄올 아민, 트리에틸 아민, 1,4-디아자비시클로(2,2,2)-옥탄, 1-피페리딘 에탄올 1,4-피페라진-비스-(에탄-설폰산), 트리-이소프로필 아민 및 폴리(에틸렌이민)이다.
전형적으로, 본 발명에 사용되는 금속-함유 ECL 부분은 반응-제한성분이다. 따라서, 이에 대해 화학양론적 과량으로 아민 또는 아민부분분이 제공되는 것이 또한 전형적이다. 예시적으로 아민 또는 아민 부분이 50-150mM의 농도로 사용된다. pH 대략 7에서의 사용을 위해, 100mM의 농도가 종종 유리하다. 특정 구체예에서 아민 또는 아민 부분 농도에 대한 상한선은 이것이 사용되는 분위기, 예를 들어 물 내 아민 또는 아민 부분의 최대 용해도로 결정된다. 일반적으로, 사용된 아민 또는 아민 부분의 양은 산화된 금속-함유 ECL 부분의 그 여기 상태로의 전이를 실시하여 발광이 일어나도록 하기 충분한 양이다. 본 발명에 조예가 있는 당 분야의 일반 업자들은 과도한 실험 없이 분석되는 특별 시스템에 대해 유리하게 사용되는 아민 또는 아민 부분의 양을 실험적으로 결정 할 수 있다.
강화된 전기화학 발광 반응으로 표제된 ECT 공개 출원 US 89/04915 에 기재된 바와 같이, 본 발명의 검정은 바람직하게 강화제, 전형적으로 하기 일반식의 화합물의 존재하에 실행된다.
식에서 R 은 수소 또는 CnH2n+1이고, R' 은CnH2n이고, X 는 0 내지 70이며, n 은 1 내지 20이다. 바람직하게, n 은 1내지 4일수 있다. 특정 예는 명칭 Triton X-100 하에 상업적으로 구입가능한 하기 일반식의 물질
(식에서 X는 9-10이다.) 및 명칭 Triton N-401(NPE-40) 하에 상업적으로 구입가능한 하기 일반식의 물질이다.
(식에서 X 는 40이다.)
강화제는 일반적으로 그 존재하에 전자기 방사의 방출에 있어 원하는 증가가 일어나도록 하기 충분한 양으로 사용된다. 전형적으로, 그 양은 0.01% 내지 5.0% 보다 구체적으로 0.1% 내지 1.0%, v/v이다.
본 발명에 따라 사용된 ECL 부분은 이를 여기 상태로 자극시킴으로써 전자기 방사를 방출토록 유도한다. 이는 ECL 부분이 혼입된 시스템을 전기 화학 에너지에 노출시킴으로써 이루어진다. ECL 부분 및 강환원제를 형성하는 종의 산화가 일어나는 전위는 이의 정확한 화학 구조, 및 시스템의 pH 및 전기 화학 에너지를 생성하는데 사용되는 전극의 성질과 같은 인자에 좌우된다. 전기 화학 발광 시스템의 최적 전위 및 방출 파장의 측정 방법은 당분야의 일반 업자에게 잘 알려져 있다. ECL 시스템을 자극하는 특정의 바람직한 방법이 PCT 공개 출원 US 89/01814에 기재되어 있다.
[전기화학 발광 측정 장치]
본 발명의 검정을 실행하기 위한 장치가 제 1 및 2 도에 기재되어 있고, 제 1 도는 유리한 ECL 장치를 나타내나 본 발명의 방법은 장치(10)의 사용에 제한되지 않고, 전기 화학 에너지를 제공하여 ECL 부분이 전기화학 발광하도록 개시하는 작업 전극 또는 다른 개시면을 포함하는 다른 유형의 ECL 장치에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법이 고정 또는 병류 방식으로 실행될 수 있으나, 장치(10)는 유동 셀을 포함하고, 이는 결합 검정 샘플을 포함하는 다수 유형의 샘플에 대해 뚜렷한 잇점을 제공한다. 본 발명의 ECL 검정을 실행하기 위한 장치의 부가적 설명은 공개된 PCT 출원 US 89/04854 및 U.S. 90/01370에 나타나 있다.
장치(10)는 전기 화학 셀(12), 광 감지/측정 장치(14)를 포함하며, 이는 유리하게 광전 증배관(PMT), 광 다이오드, 전하 연결 장치, 사진 필름 유제 등, 및 셀 (12)로, 셀을 통해 및 셀로 부터 유체 이동을 제공하기 위한, 유리하게 연동 펌프인 펌프(16)일 수 있다. 대안적으로 양변위 펌프가 사용될 수 있다. 셔터 메카니즘(18)이 셀(12)와 PMT(14)사이에 제공되고 ECL 측정 시간 동안 PMT(14)를 셀(12)에 노출시키는 한 개방되도록 조절가능하게 작동된다. 예를 들어 셔터 메카니즘은 지속 도중 폐쇄될 수 있다. 또한 장치(10)에 포함되나 제 1 도에 예시되어 있지 않은 것은 다양한 부품들이 그 내에 설치되고 ECL 측정 도중 임의의 외부 광으로부터 PMT(14)를 차단시키도록 한 차광 외장이다.
셀(12) 자체는 이를 통해 유입관(22) 및 유출관(24)이 통과하는 제 1 설치 블럭을 포함하며, 이는 유리하게 스테인레스 스틸로 구조될 수 있다. 설치 블럭(20)은 제 1 외면(26), 및 셀(12)이 장치(10)의 상응하는 작동 도중 세척 및 1 또는 조절 및 / 또는 측정 용액을 그내에 보유하는 셀(12)의 샘플-보유 용적물(30)의 한쪽편을 형성하는 제 2 내면(28)을 갖는다. 유입 및 유출관(22), (24)은 외면(26)에서 내면(28)으로 설치 블럭(20)을 통과하고 샘플-보유 용적물(30)에 개방된다. 유리하게 스테인레스 스틸로 구조된 제 2 설치 블럭(32)은 또한 제 1 외면 (34) 및 제 2 내면(36)을 갖는다. 제 2 설치 블럭(32)은 제 1 설치 블럭으로부터 환상 스페이서(38)에 의해 떨어져 있고, 유리하게 테플론 또는 다른 오염불능 물질로 구조된다. 그러므로, 설치 블럭(32)의 외면(34)은 샘플-보유 용적물(30)의 제 2 면부를 형성한다. 스페이서(38)는 외부부분(40) 및 중심 개구(42)를 갖고, 그 내부 모서리(44)가 샘플-보유 용척물(30)의 측벽을 형성한다. 바깥부분(40)은 제 1 설치 블럭(20)의 내면 (28)에서 제 2 설치 블럭(32)의 외면(34)까지 밀봉하여 임의의 용액이 샘플-보유 용적물(30)로 부터 두 표면(28),(34)사이로 나오는 것을 막는다. 설치 블럭(32)은 창(48)이 밀봉-장착되어 외면(34)의 연속으로서 샘플-보유 용적물(30)의 제 2 면의 나머지를 형성하는 중심 개구(46)를 더 갖는다. 창 (48)은 ECL 부분에 의해 방출되는 전기화학 발광 광의 파장에 실질적으로 투명한 물질로 형성된다. 창(48)은 그러므로 유리하게 유리, 플라스틱, 석영 등으로 형성된다.
유입관(22)은 스페이서(38)에 인접한 그 첫번째 말단(50)에서 샘플-보유 용적물(30)교차하고 유출관(24)은 스페이서(38)에 인접한 그 두번째 말단(52)에서 샘플-보유용적물과 교차한다. 유입관(22), 샘플-보유용적물(30) 및 유출관(24)의 결합은 이리하여 셀(12)로, 셀을 통해 및 셀로부터의 용액의 협소한, 실질적인 층류에 대한 연속 유로를 제공한다. 화살표 A 및 B는 각각 유입관(22)및 유출관(24)으로 및 에서의 흐름을 나타낸다.
제 1 설치 블럭(20)의 내면(28)에 설치된 것은 예시된 구체예에서 제 1 및 제 2 작업 전극(56) 및 (58)을 포함하는 작업전극 시스템(54)이다. 다른 구체예에서는, 단일 작업 전극이 유리하게 제공될 수 있거나, 전극 (56)만이 작업전극일 수 있다. 흥미있는 전기 화학 및 ECL 반응이 일어날 수 있는 곳이 작업 전극 (56),(58)에 각각 접속된 전선 접속기(60),(62)는 각각 제 1 설치 블럭(20)을 통과해 나온다.
접속기(60),(62)는 제 2 도에 예시된 전압조절기(66)의 제 1 작업전극단자(64)에 접속된다. 접압 조절기(66)는 유리하게 작업전극 (56),(58)에 전압 신호를 공급하고 임의로 ECL 측정 도중 이로부터의 전류흐름을 측정하기 위해 일정 전위기 방식으로 조작된다. 대안적으로, 접속기(60),(62)는 개별적 조작을 위해 전압 조절기(66)의 별도의 단자에 접속될 수 있다.
전압 조절기(66)의 일정 전위기 조작은 반대 전극(68) 및, 임의로 그러나 유리하게 기준 전극(70)을 통해 더 실시된다. 예시된 구체예로, 설치 블럭(32)은 스테인레스 스틸로 제조되고 반대 전극(68)은 설치 블럭(32)의 노출면(72),(74)에 존재한다. 반대 전극(72),(74)및 작업 전극 (56),(58)은 인터페이스를 제공하여 샘플-보유 용적물(30)내 용적물(30)내 용액에 전위를 가해 샘플 내 화학 반응을 촉진하고 전기 화학 발광을 개시하거나 셀(12)의 표면을 세척하고 조절하기 위한 에너지를 공급한다. 반대 전극(72),(74)은 전선 접속기(76)에 의해 전압 조절기(66)의 제 2 의 반대전극단자(78)에 접속된다.
기준 전극(70)은 작업 전극(56),(58)에 의해 가해진 전압이 예를 들어 +1.2볼트 대 기준으로 언급되는 기준 전압을 제공한다. 기준 전극(70)은 유리하게 셀(12)에서 떨어져 있는 위치(80)에서 유출관(24)내에 위치하고 전선 접속기(82)를 통해 전압 조절기 (66)의 제 3 기준전극 단자(84)에 연결된다. 세 전극 방식에서, 전류는 기준 전극(70)을 통해 흐를 수 없다. 기준 전극(70)은 균형 잡힌, 공지된 및 안정한 전압을 제공하기 위해 작동하는 세 전극 방식에 사용될 수 있으므로 유리하게 은/염화 은(Ag/AgCl)으로 구조될 수 있거나 포화 칼로멜 전극(SCE)이다. 전압 조절기 (66)는 작업전극(56), 및 반대/기준 전극으로서 전극(58)만을 사용하는 두 작동 전극방식으로 작동 될 수 있다. 작동되는 이 두 전극 방식에서 반대/ 기준전극(58)은 전압 조절기(66) 상의 전압 조절 단자(78)및 (84)에 전기적으로 접속된다. 이 경우 전압 조절기(66)는 필수적으로 배터리로 작동한다. 전압 조절기(66)는 작업 및 반대 전극(56)및 (58)에 전압 신호를 공급하고 임의로 각각의 전극을 통해 흐르는 전류를 측정한다. 기준 전극(70)은 대안적으로 플라티늄, 금, 스테인레스 스틸 또는 다른 물질로 구조된 소위 준-기준 전극일 수 있으며, 이는 덜 안정하나 접촉되는 용액에 대해 측정 가능한 전압을 제공한다. 두 전극 및 세 전극 방식에서, 기준 전극(70)또는 (58)은 작업 전극(56)에 가해진 전압이 이에 대해 측정되는 기준을 제공할 목적을 만족시킨다. 균형 잡힌 전압 기준이 현재보다 유리한 것으로 여겨진다. 일정 전위기 작동의 전압 조절기(66)는 작업 전극(56),(58)과 반대 전극(72),(74)사이의 전류를 측정하는 동안 기준 전극(70)에 대하여 작업 전극(56),(58)에 공지된 전압을 제공 함으로써 다양한 전극을 조절한다. 이 목적을 위한 일정 전위기가 잘 알려져 있으므로, 전압조절기(66)의 내부구조가 상기한 기능을 하고 본 발명의 그 자체 일부를 형성하지 않는 임의의 통상적인, 구입가능한 일정 전위기에 부합할 수 있다. 실제로, 장치(10)는 내부 전압 조절기(66) 없이 구조될 수 있고 원하는 전압 신호를 전극(56),(58),(72),(74)및(70)에 제공하기 위해 별도로 조절되는 외부 일정 전위기에 접속되도록 적용할 수 있다. 하기된 바와 같은 특정방법에 적용되는 이들 전압 신호는 작업 전극(56)(58)의 표면을 위한 및 유리하게 전체적인 셀(12)의 표면에 대해 반복 가능한 초기 조건을 제공하며 이 특징은 ECL 측정에 있어 개선된 정확성에 유의하게 기여한다.
펌프(16)는 유리하게 요액을 샘플 용적물로부터 유입관(22)내로 화살표 A 방향으로 끌기 위해 유출관 (24)에 위치한다. 용액은 유입관(22), 샘플-보유 용적물(30)및 유출관(24)을 통해 기준 전극(70)을 지나 화살표 B 방향으로 흐를 것이다. 대안적으로, 펌프(16)는 장치(10)를 통해 용액을 밀기위해 유입관(22)에 위치할 수 있다. 유리하게, 유입관(22)샘플-보유 용적물(30)및 유출관(24)을 통하는 이 동일한 유로가 셀(12)를 통과하는 모든 용액 및 유체를 위해 사용되어, 각각의 유체가 선행 유체를 셀(12)밖으로 밀어 내는데 있어 유체역학적 세척 작용을 수행한다. 펌프(16)는 임의의 시간동안 셀(12)내에 특별한 용액을 보유하기 위해 그 작동을 중지하도록 조절될 수 있다.
장치(10)의 병류 구조는 작업 전극(56),(58)(또는 반대 및 기준 전극 (72),(74),(70)이 공기에 노출되지 않고 연속적으로 하나 이상의 용액에 노출되는 동안 작업 전극에 다양한 전압이 가해지거나 작동 이전 전위에서 연속적으로 유지되도록 할 수 있다. 회로를 기준 전극(70)에 개방하는 공기에의 노출은 작업전극(56),(58)상의 표면 조건의 재생가능성을 파괴하는 공지되지 않은 무작위한 전압 변동을 허용한다. 병류 구조는 전극 시스템(54)이 세정되고 조건화되는 개시 단계와 하나 이상의 측정파가 개시 ECL을 형성하거나 제거하는 측정 단계 사이의 신속한 변환을 허용한다.
제 23 도 및 24 도는 유리하게 전극 표면(56),(58)의 판에 대해 널리 평행인 자력선을 부과하는 자석 시스템이 장치된 셀 및 자석(27/37)을 도식적으로 제시한다. 자석 시스템은 자석(27/37)의 북극 및 남극이 더미내에서 교호되도록 축적되고 배향되는 다수의 개별적인 영구자석 또는 전자적으로 구성된다. 자석들(27/37)의 개별적인 자석은 공기 또는 임의의 자기적으로 반응하지 않는 물질에 의해 분리되어 있다. 제 23및 24 도에 제시된 바와 같은 배열은 유리하게, 전극판에 거의 수평인 작업 전극위의 영역에 자력선을 부여한다. 이는 입자가 자극 표면 위에 놓이고 전극에 의해 공급된 전기 화학 에너지에 쉽게 접근가능한 자기적 반응성 입자의배향을 유도한다. 제 20 도 참조.
제 23 및 24 도에 제시된 자석 시스템(27/37)은 또한 자기장선이 자석 구조물로부터 장거리로 뻗어 있지 않다는데 있어 유리하다. 그러므로 상기 자석 시스템으로부터의 자기장은 전극 장치 근처에 영구 자기 행동 또는 강자성 물질을 유도하지 않을 것같고 유동 셀 장치 근처의 광전증배관의 작동에 심히 영향을 미치지 않을 것이다. 제 25도에 예시된 장치는 제 1 및 2도에 제시된 바와 같고, 제 25 도에서 수평으로 배향된 전극(56)또는 전극(56),(58) 아래에 수직으로 위치된 것이 제 23및 24 도에 나타난 바와 같이 북-남 배향인 다수의 자석(27/37)인 것을 제외하고는 제 1및 2 도에 대해 상기된 바와 같다.
본 발명은 또한 시료 조성물에 대한 것이다. 널리, 시료 조성물은 본 발명의 검정 시스템 성분들, 즉(a)전해질, (b)ECL 부분을 함유하는 라벨 화합물, (c)자기적으로 반응성인 입자를 포함하는 입자. (d) 관심 분석물 또는 관심 분석물의 유사물, (e)관심 분석물 또는 그 유사체의 결합 파트너, (f)(d) 또는 (e)와 반응할 수 있는 반응 성분, (g) 환원제, 또는 (h) 전기화학 발광-반응 강화제중 어느 하나일 수 있다. 시료는 사용의 편리를 위해 서로 결합되어, 즉 2 성분, 3 성분, 및 보다 다수의 성분 혼합물이 제조될 수 있으나, 단 성분들은 저장 도중 서로 반응하지 않아 의도하는 검정에서 그들의 기능을 손상시키지 않도록 한다. 바람직하게 시료는 입자들 및 하나 이상의 다른 성분들을 함유하는 2-성분 또는 다성분 혼합물이다.
본 발명은 또한 킷트에 대한 것이다. 킷트는 상기된 하나 이상의 성분(a)~(h)을 함유하는 용기를 포함할 수 있거나, 킷트는 모두 본 발명의 검정 방법 및 시스템에 사용하기 위한 상기 성분들의 혼합물로 구성되는 상기한 바와 같은 하나 이상의 시료 조성물을 함유하는 용기를 함유할 수 있다.
[발명의 바람직한 구체예의 설명]
본 발명의 입자-기재 검정에 광범위한 입자들이 사용될 수 있으나, 일반적으로 입자들은 밀도 1.0 내지 5.0g/ml 및 바람직하게 밀도 1.1 내지 2g/ml를 갖는다. 최적 밀도의 선택은 당 분야의 기술내에 있고, 중력-구동 검정의 침강 속도는 검정 속도와 전극 표면상에 균일한 복합체 층을 형성하려는 의도 사이의 절충이 된다.
광범위한 평균 직경을 갖는 입자가 또한 사용될 수 있다. 평균 직경 0.001 내지 200㎛, 예를 들어 0.05 내지 200㎛ 갖는 입자가 사용될 수 있고 ; 바람직하게 입자는 평균 직경 0.01 내지 10㎛를 갖는다.
검정 조성물내 광범위한 입자 농도가 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 농도는 1 내지 10,000 ㎍/ml 내지 바람직하게 5 내지 1000㎍/ml일 수 있다. 바람직하게, 입자의 밀도, 이의 크기 및 이의 농도는 입자가 적어도 0.5mm/분의 속도 및 바람직하게 보다 빠른 속도로 침강하도록 선택된다.
본 발명을 수행하는 여과 방식에서 여과 수단은 바람직하게 평균 직경으로 측정하여 널리 입자 평균 직경의 0.01 내지 90% 및 바람직하게 상기 직경의 10% 내지 90%인 구멍 크기를 갖는다.
당 분야는 본 발명의 검정에 사용될 수 있는 다수의 자기 입자를 기재하였다. 예를 들어 U.S 특허 제 4,628,037호, 4,695,392호, 4,695,393호, 4,698,302호, 4,554,088호, U.K. 특허 출원 GB 2,005,019A호 및 EP 0,180,384호는 성공적으로 사용될 수 있는 다양한 자기 입자를 기재한다. 입자는 상자성 또는 강자성일 수 있고, 결합 화합물이 커플링되는 다양한 물질로 코우팅되어 자기 입자가 면역 검정에 사용될 수 있도록 할 수 있다. 바람직하게 본 발명에 사용된 자기 입자는 적어도 0.001cgs 단위의 자화율을 갖고, 바람직하게 자화율은 적어도 0.1cgs 단위이다. 자기 입자는 광범위한 밀도, 즉 실질적으로 물 보다 적은, 0.01내지 5g/ml 및 바람직하게 0.5 내지 2g/ml의 밀도를 가질수 있다. 입자 크기는 0.001내지 200, 예를 들어 0.01 내지 200 또는 0.05 내지 200㎛ ; 및 바람직하게 0.1 내지 10㎛일 수 있다. 입자의 농도는 광범위하게 1내지 10,000 ㎍/ml 일수 있고, 바람직하게 5내지 1000㎍/ml이다.
바람직하게 사용되는 자기 입자는 예를 들어 EP 0,180,384에 기재된 바와 같이 저자기 공명을 가져 자극 표면으로부터 자기장이 제거된 후, 입자가 탈자기화하고 검정 셀로부터 제거될 수 있도록 한다. 바람직하게 자기 입자의 밀도, 농도 및 입자 크기는 침강 시간이 적어도 0.5mm/분이고 바람직하게는 그 속도 이상이 되도록 선택된다. 자기 셀의 작동에 있어, 광전 증배관의 작동을 방해하지 않도록 전기화학발광을 유도하기 전에 전극 표면으로부터 자석 수단을 제거하는 것이 바람직하다.
[검정]
다양한 검정이 본 발명의 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
제 3 도에 제시된 바와 같이 검정이 수행되었다. 반응으로부터 초래된 PCR 생성물이 비오틴 및 ECL 라벨(트리스(2,2'비피리딘) Ru II, Ru(bpy)3 2+로 라벨링되었다. 스트렙타비딘 비드는 비오틴 스트렙타 비딘 결합을 통해 이관능화된 DNA를 포획하였고 세척이 후속되었다. 그리고 나서 생성물이 결합된 비드는 ECL 라벨을 감지하는 분석을 받았다.
제 4 도에 제시된 바와 같이 검정이 수행되었다. 비오틴화된 PCR 생성물이 스트랩타비딘 비드에 포획되었고 비오틴화디니 않은 스트랜드는 제거되었다. 그리고나서, PCR 생성물이 결합된 비드는 ECL 라벨링된 (Ru(bpy)3 2+)-올리고누클레오티드와 교잡되었다. 라벨을 감지하기 위해 ECL 분석이 이에 후속되었다.
제 5 도에 제시된 바와 같이 검정이 수행되었다. 스트렙타비딘 비드에 혼성체가 포획되었다. 세척없이 ECL 분석이 이에 후속되었다. 검정이 수행되었고 결과가 제 6도에 제시되어 있다. 검정은 두비루스 유형 HPV16 및 18에 대해 양성인 세포 계통 SiHa 및 HeLa로부터 분리된 DNA 샘플 및 각각의 비루스 유형에 대해 특이한 올리고누클레오티드를 사용한, HPV16 및 18의 존재에 대한 것이었다. 프라이머 2PV16, 2PV18 은 비오틴화되었고 3PV16, 3PV18은 ECL-라벨링된 올리고누클레오티드였다. 결과된 ECL 라벨이 포획된 비드가 제 1 도에 기재된 바와 같은 분석기를 사용하여 분석되었다. 결과는 각각의 샘플 프라이머 조합에 대한 ECL 계수로 플롯팅되었다.
검정이 수행되었고 결과가 제 7 도에 제시되어 있다. 결과된 비드결합된 ECL 라벨이 제 1 도에 기재된 바와 같이 분석기를 사용하여 ECL 에 대해 분석되었다. ECL 피크 광자계수가 증가하는 LHPV16 DNA농도에 대해 플롯팅되었고 비루스 복사물 대 총 세포 DNA 복사물의 비로 표현되었다. HPV 16에 대한 이 분석에 사용된 프라이머는 1 PV 16 (비오틴라벨)및 2 PV 16 ( ECL라벨) 이었다. 각각의 PCR에 사용된 DNA는 송아지 흉선 DNA를 사용하여 일정한 1㎍으로 유지되었다.
검정이 수행되었고 결과가 제 8 도에 제시되어 있다. 라벨링되지 않은 HRP 1을 갖는 비오틴화된 HRP2 (프로브 1T 24 및 1 CHR을 위한) 및 라벨링되지 않은 HRP 2을 갖는 비오틴화된 HRP 1(프로브 2T 24 및 2 CHR을 위한)을 사용하여 교잡을 위한 단일 스트랜드 표적이 결합된 비드를 생성하여 PCR이 수행되었다. DNA 샘플은 일반적인(태반) Ha-ras유전자 및 돌연변이 (NIH 3T3-T24) Ha-ras 유전자였다. DNA가 결합된 비드와 ECL 라벨-1T 24(1T 24), ECL 라벨-2T 24(2T 24), ECL 라벨-1 CHR(1 CHR) 및 ECL 라벨-2 CHR(2 CHR) 교잡 후 TEMAC 세척이 후속되었다. 결과되는 ECL 라벨 결합된 비드가 제 1 도에 기재된 분석기를 사용하여 ECL에 대해 분석되었다. 결과는 각각의 샘플 프로브 조합에 대한 ECL 계수로 플롯팅되었다.
검정이 수행되었고 결과가 제 9 도에 제시되었다. 라벨링되지 않은 HRP 1을 갖는 비오틴화된 HRP 2(프로브 1R 24 및 1 CHR 을 위한) 만을 사용하여 제 8 도에 기재된 바와 같이 PCR을 수행하였다. 사용된 프로브는 ECL 라벨의 효과를 측정하기 위해 P32를 함유하는 1T 24 및 1CHR (1T 24-P, 1CHR-P)를 대조표준으로하고, P32및 ECL 라벨 둘다를 함유하는 1T 24 및 1 CHR 이었다. 샘플은 TEMAC로 보다 먼제 세척되었다. 결과 되는 P32결합된 비드가 섬광 계수기내 섬광 칵테일의 첨가시 분석되었다. 결과는 각각의 샘플 프로브 조합에 대한 초당 P32계수로 플로팅되었다.
검정이 수행되었고 결과가 제 10 도에 제시되어 있다. 제 4 도에 기재된 바와 같이 검정이 수행되었다. 샘플은 태반 DNA였고 라벨링 되지 않은 HRP1을 갖는 비오틴화된 HRP2(프로브 1T 24 및 1 CHR을 위한)를 사용하여 증배가 수행되었다. 그리고 나서 상이한 양의 생성물을 함유하는 샘플 셋트를 제공하기 위해 결과 PCR 생성물이 샘플링되었다. 그리고 나서, 이 샘플 셋트는 P32(1T 24-P32 및 1 CHR-P32)또는 ECL 라벨(1T 24-ECL 및 1CHR-ECL)의 어느 하나로 표지된 프로브와 교잡되었다. 그리고 나서, 각각의 연구로부터의 결과가 90㎕ 샘플에 대해 각각의 라벨으로부터의 평균 피이크값을 사용하여 일반화되었다. 이들 일반화된 도면은 신호대 배경의 보다 효과적인 비교 및 두 방법의 비교 반응을 허용한다. 삽입 도면은 희석 커브의 보다 낮은 수준에서의 반응을 예시한다. 샘플은 상기된 바와 같이 조작되었다. (제 6 도 및 8 도)
검정이 수행되었고 결과가 제 11 도에 제시되어 있다. 비오틴화된 2PV 18 및 라벨링되지 않은 1PV 18을 사용하여 HeLa DNA (세포당 400개 복사물)을 사용하여 제 3 도에 예시된 PCR 포맷을 사용하여 PCR이 수행되었다. 그리고 나서 결과 PCR 반응물이 특이 프로브 ECL 라벨 -3PV 18과 교잡되었다. 그리고 나서 교잡 혼합물이 스트렙타비딘 코우팅된 비드에 첨가되고 결과되는 ECL 라벨 결합된 비드가 제 1 도에 기재된 ECL 분석기를 사용하여 ECL에 대해 직접 분석되었다. 결과는 ECL 계수 대 PCR에 첨가된 HPV 18 복사물로 플롯팅되었다.
하기 비-제한 실시예가 주어져 있고 본 발명의 제한으로 여겨져서는 안되며, 이의 다수의 분명한 변화가 그 범주 또는 영역을 벗어나지 않고 가능하다.
[실시예]
기계설치, 재료, 및 방법
(1) 기계 설치
제 1 및 2 도에 서술된 바와 같이, 세개의 전극을 사용하는, 병류장치를 사용했다
작업전극 -- Au 원판, 3mm직경
반대전극 -- Au원판, 3mm직경
기준전극 --Ag/AgCl
테플론 가스켓(0.15두께)
플렉시글라스 면판
입구 관재료 = 0.042 상기 언급된 바와 같은 폴리프로필렌
에스피레이션 속도 : 0.01 으로부터 5ml/분까지 가변
일정전위기 : 마이크로프로세서 조절됨
하마마트수 R374 PMT(저 증량 적색 민감성관)을 사용하는 발광측정계
: 0-1400V 가변성 PMT 전위
(2) 재료
(a) ECL 표지 : Ru(bpy)32+
(b) ECL 완충용액 : 112mM KH2PO4,88mM K2HPO4·3H2O, 50μM NaCl,
6.5mM NaN3,0.8㎛ 트리톤 X-100, 0.4mM 트윈 20,
H2O 내 100mM 트리프로필아민
(c) ECL 희석제 : 37.5mM KH2PO4, 109.2mM K2HPO4·3H2O,
151.7mM NaCl, 0.65mM NaN3, H2O 내 0.43mM
소 혈청 알부민
(d)Ru(bpy)3 2+-NHS : Ru(2,2'-비피리딜)2(4-[3-(1,3-디옥소란-2-일)
피리딜]-4'-메틸-2,2-비피리딘)2+
(e) 디날입자:
(i) 4.5㎛ 직경 과상자성입자, 30㎎/㎖ 디날 M-450 디나비드는 NY11021,그레이트 넥, 45 노오드 스테이션 플라자, 디날로부터 얻는다.
(ii) 2.8㎛ 직경 과상자성입자, 10㎎/㎖ 디날 M-280 디나비드는 NY11021, 그레이트 넥, 45 노오스 스테이션 플라자, 디날로부터 얻는다.
(3) ECL 측정 사이클 (3 전극 셀 작동)
ECL 측정 사이클은 3 단계로 구성된다.
(1) 예비조절, (2) 측정, 및 (3) 세정 예비조절 단계는 2.0V/초로 0.0V 내지 +2.2V 내지 -1.0V 내지 +0.6V의 전위 삼각파의 적용을 포함한다. 측정 단계는 1.0V/S로 +0.6V 내지 +2.8V 내지 +2.0V 삼각 파형의 적용을 포함한다. 세정 단계는 +0.0V 내지 +3.0V 내지 -0.5V 내지 0.0V 전위 사각파의 적용을 포함한다. 모든 전위는 Ag/AgCl 기준 전극에 관련된다.
[실시예 1]
중력에 의한 미세입자의 수집 장치 및 방법
측정은 제 12 도에서 보는 바와 같이 셀내에서 수행된다. 중력의 힘을 사용하는 검정을 수행하기 위한 장치를 묘사한 제 12 도가 참고된다.
장치의 성분은 참조번호(48)에 보이는 투명한 창, 참조 번호 (222)에 보이는 가스켓, 입구(22), 작업전극(56/58)반대전극(72/74) 및 축구(24)를 포함한 블럭 (20)을 포함한다. 셀 블럭의 평면은 수평, 즉, 지구중력장 방향에 수식이다. ECL 완충용액내 표지된 미세입자(디날)은 연동 펌프에 의해 셀내로 유입된다. 펌프는 입자가 셀에 도달한 후 끈다. 셀 챔버내 미세입자는 작업 전극 표면위로 떨어진다. 미세입자의 낙하속도는 제 13 도에서 보는 바와 같이, 10mm 거리 이상의 대략 0.5mm/분에서 일정하도록 결정된다. 정착하는 입자의 수는 낙하 속도 및 시간의 함수이다. ECL 강도는 작업전극위로 정착하는 입자의 수에 비례한다. 표면에 이른 입자의 수 및 그에 의한 ECL 강도는 작업전극 위 액체 샘플의 고도에 의해 제한된다. 제 14 도는 ECL 강도를 각각 0.015및 0.075 인치의 다른 가스켓 두께의 두 셀에 대한 침전 시간의 함수로 보인다. 두 셀은 미세입자의 유사한 침전 속도를 가지나 더욱 두꺼운 가스켓을 가진 셀은 5개 더큰 최고 읽기를 준다. AFP(알파 태아 단백질) 검정 결과는 두 셀을 비교하여, 제 15 도에 제시된다. 또, 더욱 두꺼운 가스켓을 가진 셀은 5배의 ECL 신호강도를 생산한다.
[실시예 2]
미세 입자의 침전에 대한 ECL 장치 및 방법
침강 셀을 사용한 자기 수집
미세입자가 정착하도록 야기시키는 자기력을 사용한 검정의 수행을 위한 셀은 제 16 도에 제시된다. 참조 번호(48)은 투명창을 언급하고, 참조 번호(122)는 가스켓을 언급하고, 참조 번호(22)는 셀 블럭내 입구를 언급하고, 참조번호(56/58)은 작업전극을 언급하고, 참조 번호(20)은 셀 블럭 그 자체를 언급하고 참조 번호(27)은 전자석을 언급한다.
전지 블럭의 평면은 수평으로 위치시킨다. ECL 완충욕액내 표지된 미세입자(디날)은 연동 펌프에 의해 셀내로 유입된다. 펌프는 미세입자가 셀에 이른 후 끈다. 셀 챔버내 미세입자를, 12볼트 및 1.5amps 에서 작동하는 전자석(27)을 사용하여 생성되는 자기장에 의해 작업전극으로 끌어들였다. 전자석의 적용에 의해, 미세입자의 침전속도는 단지 중력에 기인하여 미세입자가 정착할 때 관찰되는 것에 비해 크게 증가된다. 이는 제 17 도에 제시된다.
[실시예 3]
미세입자의 침전을 위한 ECL 장치 및 방법
수집 셀을 사용한 자기 수집
제 18 도에서 서술한 바와 같은 셀내에서 검정을 수행했다.
제 18 도를 참고로, 참조 번호(48)은 투명 창을, 참조 번호(132)는 가스켓을, 참조번호(22)는 셀 블록내 유입구를, 참조번호(56)/(58)은 작업 전극을 참조 번호(20)은 셀 블록 자체를, 참조번호(24)는 샘플 배출구를, 및 참조번호(37)은 영구 자석을 말한다.
셀 블록의 평면을 수평으로 배향했다. ECL 완충액내 라벨링 된 미세입자(Dynal)를 연동 펌프에 의해 전기화학적 셀로 끌어들였다. 샘플 도입전에, 영구자석(37)을 0.035인치의 거리에서 작업 전극/용액 경계바로 아래에 위치시켰다. 샘플을 셀로 끌어들일때, 미세입자는, 자석 영역에 의해 한정된 바와 같이, 작업 전극전체 영역상에 침전했다. 전체 샘플이 침전된 후에 펌프를 끄고, 자석을 끌어냈다. 수집시간이 더 길수록, 더 많은 입자가 침전된다. 제 19 도에서 보이는 바와 같이 작업 전극상에 입자의 농도의 증가는 증가된 ECL 강도를 초래한다.
[실시예 4]
미세입자의 침전을 위한 자석의 농축
자기장 배향
영구 자석이든 전자석이든 자석(27)/(37)에 부착된 미립자(96)(96')는 자기장(98)및 (98')를 묘사한 제 20 도에서와 같이 자기장(98)(98')의 배향 및 표면의 근처에서 작업 전극(56)/(58)의 표면에 평행한 (A)및 직각인 (B) 결과된 입자 배열(96)및 (96')으로 정렬했다.
[실시예 5]
여과에 의한 입자 수집 및 농축
자기적으로 반응성이고, 비자기적으로 반응성이고, 및 광범위한 밀도를 가지는 미세입자는 유리하게 막 여과기의 표면상에 여과에 의해 수집될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 입자의 직경보다 작지만, 바람직하게 실질적으로 입자 직경보다 작은 구멍 크기를 가지는 여과기 막의 일부를 통해, 및 입자의 수집이 구멍의 차단을 일으키지 않도록 충분히 높은 표면 밀도에서 입자를 펌핑했다. 입자로부터 ECL 을 유발하고 입자상에 ECL 라벨의 양을 측정하기 위한 발광을 측정하려는 목적으로 입자의 수집 후에 여과기가 작업 전극의 표면상에 놓여진 수 있도록, 여과기는 유리하게 주로 투명하다.
다른 실시양태에서, 상기 서술된 바와 같은 구멍 크기를 가지는 막여과기를, 모세관 현상, 또는 위킹(wicking)이 여과기를 통한 유체의 유동을 유발하기 위한 임의 장치의 요구없이 막 여과기를 통해 미세입자를 함유하는 유체를 자동적으로 끌어들이도록 흡수성 물질의 표면상에 부착하거나 놓았다.
바람직한 실시양태에서, 상기 서술된 바와 같은 구멍 크기를 가지는 막 여과기를, 막의 표면이 ECL 장치내 작업 전극으로서 작용할 수 있도록 얇은 필름의 금속 또는 다른 전자적으로 전도성 물질로 코우팅했다. 극소전자 장치, 예컨대 열 증발 또는 스퍼터링의 제작에 일반적으로 사용되는 방법에 의해 전도성 필름을 막의 표면에 쉽게 적용시켰다. 상기 여과기-전극을, 유체에 대한 유동 경로가 여과기-전극을 통해서이도록 유동 셀내에 쉽게 장치했다. 스트림내 입자를 여기-전극에 의해 트래핑하고, 임의 외부 세척 장치없이 불균질 검정을 수행하기 위한 빠르고 간단한 장치를 현장에서 제공하면서 쉽게 세척했다.
[실시예 6]
원심분리 방법에 의한 입자 수집 및 농축
제 21 도에서 보인 회전 유동 셀은, 발광을 측정하기 위해 작업 전극의 표면상에 복합체를 포획하는 다른 장치를 제공한다. 검정 용액은 유입구(261)를 통해 장치로 들어가고, 화살표 R에 의해 지시되는 바와 같이 회전운동을 셀에 가하는 동안 회전 시일(263)을 통해 셀 (262)로 펌핑시켰다. 복합체의 밀접한 입자를 작업전극(264)의 표면상에서 농축시켰다. 셀을 여전히 회전시키면서, 용액을 배출구(268)을 통해 셀 밖으로 내보냈다. 셀 창(267)를 통해 통과한 빛 출력을 광정 증배관(265)에 의해 측정했다. 광 출력은 셀의 중심에 위치한 굽은 거울 표면 (266)으로부터 반사하는 수직의 작업 전극 표면으로부터 지적된다. ; 계수기 전극(269)이 또한 제시된다. 그리고나서, 셀을 다음 순환을 위해 플러싱하고 세척했다. 이는 셀을 멈추거나 회전시켜 성취할 수 있다. 이리하여, 제 21 도는 입자를 포획하기 위한 본 발명의 원심분리 방법 및 장치뿐 아니라. 본 발명의 원심분리 유동 셀을 보인다.
[실시예 7]
적당한 표면 농도에서 라벨링된 비특이성 단백질로의 입자의 코우팅
30㎎ (1㎖)의 4.5㎛ 비코우팅된 자기적으로 반응성인 폴리스틸렌 M-450 DYNABEADS (DYNAL Oslo, Norway)를 2㎖/세척을 사용하여 150mM 인산염 완충액 pH 7.5 용액으로 자기 분리에 의해 세척했다. 0.05% 티메라 솔과 함께 인산염 완충액 살리(PBS) 1 ml 내 150㎍ 의 Ru (bpy)3 2+- 라벨링된 생쥐 IgG (Jaskson Immuno chemicals)를 입자를 첨가했다. 이 혼합물을 회전하면서 실온에서 밤새 항온처리했다. 그리고나서, 용액을 입자로부터 자기적으로 분리하고 제거했다. 블록 비반응된 부위에, 0.05% 나트륨 아지드와 함께 1㎖의 3% BSA/PBS 를 입자에 첨가하고, 결과된 용액을 실온에서 2 시간 항온처리했다. 입자를 5번 (2㎖/세척) 세척하고 나서, 최종적으로 저장을 위해 같은 완충액 6㎖ 내에 재현탁시켰다.
[실시예 8]
자기 반응성 입자를 사용한 전기화학 발광성(ECL)측정
균일한 및 불균일한, 중합체성 및 비중합체성, 자기 반응성 입자(Dynal, Oslo, Norway ; Polysciences, Warrington, PA 18976 ; Cortex Biochem, San Leandro, CA 94577 ; Aldrich, Milwaukee, WI 53201)를 실시예 7에 기술된 바와 같이 라벨링 단백질로 코우팅하였다. 코우팅된 입자들을 ECL 완충액으로 3회 세척하였고 300㎍/㎖ 를 만들었다. 연동 펌프를 사용하여, 입자 현탁액 500㎕ 를 유동 셀내로 끌어들였다.(실시예 3) 입자들이 작업전극으로 흐를때, 그들을 자석에 의해 작업 전극 표면상에 끌어당기고 농축시킨다. 자기 입자를 사용한 전기화학발광을 입자들이 작업전극 표면에 집중되었던 유동 셀 상의 중심에 놓여진 Hamamatsu R 374 광전자증배관을 사용하여 측정하였다. 표 I 은 라벨 - 단백질로 코우팅된 자기 반응성 입자들로 부터 얻어진 ECL 광전자방출량을 제시한다.
[실시예 9]
비자기 입자를 사용한 전기화학 발광성(ESL) 측정
균일한 및 균일한, 중합체성 및 비중합체성, 비-자기 반응성 입자 (Aldrich, Milwaukee, WI 53201 ; Duke Scientific, Palo Alto, CA 94303) 를 실시예 7에 기술된 바와 같이 라벨링 된 단백질로 코우팅하였다. 코우팅된 입자들을 ECL 완충액으로 3회 세척하였고, 300㎍/㎖ 현탁액 2㎖를 만들었다. 연동 펌프를 사용하여, 입자 현탁액 500㎕ 를 유동 셀내로 끌어 들였다. 그런다음 코우팅된 입자들을, 실시예 1 에 기술된 바와 같이 중력 수단에 의해 작업 전극 상에 집중시켰다. 비자기 입자를 사용한 전기 화학 발광을 입자들이 작업 전극 표면에 집중되었던 유동 셀 상 중심에 놓여진 Hamamatsu R 374 광전자증배관으로 측정하였다. 표 Ⅱ는 코우팅된 비자기 입자로부터 얻어진 ECL 광전자 방출량을 제시한다.
[실시예 10]
중력 수집에 의한 비-자기 반응성 입자로부터의 ECL 측정
입자의 표면에 -OH 잔기를 가진, 4.5㎛ 코우팅되지 않은 자기성, 폴리스티렌 입자(DYNAL, DUNABEADS M-450, DYNAL A. S. Oslo, Norway) 1㎖를, 150mM 나트륨 카르보네이트 / 비카르보네이트 pH 9.6 용액 2㎖/세척을 사용하여 자기 분리에 의해 세척하였다. 카르보 / 비카르보 용액 1㎖ 내 HCG스크러빙된 항체(CIBA), 친화 정제된 양의 항 - TSH 0.5㎎ 을 입자에 첨가했다. 상기 혼합물을 혼합하면서 실온에서 밤새 항온처리 하였다. 그런다음 용액을 입자로부터 자기적으로 분리하였고 제거하였다. 3% BSA/PBS W/0.05% 아지드나트륨 1㎖ 를 첨가했고 블록 미반응 부위까지 교반하면서 실온에서 2시간 항온처리 했다. 입자를 5회 (2㎖/세척) 세척한다음 최종적으로 저장을 위해 동일한 완충액 1㎖ 내에 재현탁시켰다. 비드시약 I 의 최종농도는 3중량% 였다.
[실시예 11]
와바인 - BSA 컨쥬게이트의 제조
[시약 11]
와바인의 활성화 :
탈이온화 (di) H2O 6㎖ 내 와바인 옥타히드레이트 (Aldrich Cat #14, 193-3) 60.4㎎ (호일에 싸여짐)을 메타과요오드산 나트륨 (Mallinckrodt Cat #1139) 87㎎ 과 혼합하였고 혼합물을 회전시키면서 2시간 동안 실온에서 항온처리 하였다. diH2O 를 가진 Dowex 1 x 8 - 50 이온 교환수지 (Aldrich Cat #21, 740-9)를 통해 반응 혼합물을 통과시킴으로써, 반응을 종결시켰다. 1M 나트륨 포스페이트 pH 7.2, 200㎕ 를 첨가하여 용액의 pH 를 7.0 으로 조정하였다.
BSA 에 대한 활성화 와바인의 컨쥬게이션 :
그런 다음 활성화 와바인 (4.6㎖) 50㎎ 을 0.15M PBS pH 7.8 5㎖ 내소 혈청 알부민 (BSA, Miles Fraction V) 108㎎ 에 적가 하였다. 상기는 40 : 1(와바인 : BSA)비율이다. 반응물을 혼합하면서, 실온에서 2시간동안 항온처리한 후, 혼합하는 동안 나트륨 시아노보로히드라이드 30mg을 신속히 첨가한다. 유리 와바인 및 여분의 나트륨 시아노보로히드라이드를 0.15M PBS W/0.05% 아지드나트륨 pH 7.8 내 4℃에서 투석에 의해 제거하였다. 와바인 - BSA 컨쥬게이트 시약 Ⅱ를 4℃에서 저장하였다.
[실시예 12]
물리적으로 흡착된 와바인 - BSA 코우팅된 다이날 입자의 제조
(시약 Ⅲ)
표면에 -OH 잔기를 가진, 4.5㎛ 코우팅되지 않은 자기성,폴리스티렌 입자(DYNAL DYNABEADS M -450, DYNAL A. S. Oslo, Norway) 5㎎을 150mM나트륨 카르보네이트 / 비카르보네이트 pH 9.6 용액 10㎖/세척을 사용하여 자기 분리에 의해 세척하였다. 카르브 / 비카르브 용액 5㎖ 내 와바인 - BSA 컨쥬게이트(컨주게이트 시약 Ⅱ) 3㎎ 을 입자에 첨가했다. 상기 혼합물을 회전시키는 동안 실온에서 밤새 항온 처리 하였다. 그런 다음 용액을 입자로부터 자기적으로 분리하였고 제거하였다. 3% BSA/PBS W/0.05% 아지드나트륨 5㎖ 를 첨가하였고 블록 미반응 부위까지 회전시키면서, 실온에서 2시간 항온 처리하였다. 입자를 5회 (10㎖/세척) 세척한 다음 최종적으로 저장을 위해 동일 완충액 1㎖ 내에 재현탁시켰다. 비드시약 Ⅲ의 최종 농도는 3 중량 % 였다.
[실시예 13]
Ru(bpy)3 2+-라벨 생쥐 항 - 디곡신의 제조
(시약 Ⅳ)
생쥐 항-디곡신 (Cambridge Medical Technologies Cat #200 -014 Lot A3575) 1㎎ 을 Ru(bpy)3 2+로 라벨링 하였다. 단일분지계 항체 (MAb)항 디곡신 항체를 센트리콘 30 마이크로콘센트레이터즈(Amicon)을 사용하여 0.15M Nacl pH 7.8, 0.15M 인산칼륨 완충액으로 완충액 교환하였으며 최종 부피는 0.5㎖ 였다. 사용직전에 Ru(bpy)3 2+ -NHS 0.5㎎ 을 무수디메틸 설폭시드(Aldrich) 125μL 로 용해시켰다. Ru(bpy)3 2+대 각각 1057 및 150,000의 분자량을 기준으로한 단백질의 몰비 25:1을 이루기 위해, Ru(bpy)3 2+- NHS(4㎕) 0.18㎖ 을 교반하는 동안 단백질 용액에 첨가하였다. 반응관을 교반하는 동안, 실온의 암실에서 30분 항온 처리 하였다. 반응을 1M 글리신 25μL의 첨가에 의해 종결시키고 10분동안 항온처리하였다. 반응 혼합물을 세파덱스 G- 25 컬럼 (0.05% 아지드나트륨을 가진 0.15M NaCl, 0.15M 인산칼륨 pH 7.2내 1 x 20cm)을 통해 통과시킴으로써 정제하였다. Ru(bpy)3 2+-라벨 생쥐 항 -디곡신 획분들을 수집하였고 공동계산하였다. 라벨 단백질 (시약 Ⅳ)을 단백질 분자당 12라벨을 갖도록 결정하였다.
[실시예 14]
Ru(bpy)3 2+-라벨 생쥐항 - 갑상선 자극 호르몬(TSH)의 제조
(시약 Ⅴ)
생쥐 항 - TSH (CIBA) 0.5㎎ 을 Ru(bpy)3 2+로 라벨링하였다. MAb 항 TSH 항체를 센트리콘 30 마이크로콘센트레이터(Amicon)를 사용하여 0.15M 인산칼륨 완충액, 0.15M NaCl pH 7.8로 완충액 교환하였고, 최종 부피는 0.35㎖ 였다. 사용직전에, Ru(bpy)3 2+- NHS 0.5㎎을 무수 디메칠 설폭시드 (Aldrich) 75㎕ 에 용해시켰다. Ru(bpy)3 2+라벨대 각각 1057 및 150,000 의 분자량을 기준으로한 단백질의 몰비 50:1을 이루기 위해, Ru(bpy)3 2+- NHS (26.4μL) 0.176㎎ 을 단백질 용액에 첨가하면서 교반하였다. 반응관을 실온의 암실에서, 30분 항온처리 하면서 교반하였다. 반응을 1M 글리신 25μL 의 첨가에 의해 종결시키고 10분 동안 항온처리하였다. 반응 혼합물을 세파덱스 G-25 컬럼 (0.05% 아지드나트륨을 가진 0.15M NaCl, 0.15M 인산칼륨 pH 7.2 내 1x20cm ) 을 통해 통과시킴으로써 정제하였다. Ru(bpy)3 2+-라벨 생쥐 항 - TSH 획분들을 수집하였고 공동계산 하였다. 라벨 단백질 (시약 Ⅴ)을 단백질 당 14라벨을 갖도록 결정하였다.
[실시예 15]
갑상선 자극 호르몬(TSH)에 대한 1단계 분리 샌드위치 검정
혈청 캘리브레이터(London Diagnostics TSH LumiTAG Kit) 100 μL, ECL 완충액내 Ru(bpy)3 2+- 라벨 생쥐항 - TSH (시약 Ⅴ) 25μL 및 ECL 완충액내 양 항 - TSH -DYNAL 입자 (시약 I) 25μL 를 합하고 혼합하면서, 15분 동안 실온의 폴리프로필렌 관에서 항온처리하였다. 그런 다음 입자를 자기 분리 및 ECL 완충액 500μL 내 입자의 재현탁에 의해 세척하였다. 상기 세척 과정을 2회 더 반복하였다. 최종적으로, 입자를 ECL 1mL에 재현탁 시켰다. 각 샘플에 대한 전기화학 발광(ECL)을 실시예 3에 기술된 바와 같이 읽었다. ECL 계수는 샘플에 존재하는 분석물의 농도에 정비례한다. (분석물의 농도가 증가할 수록 계수 증가) 표 Ⅲ 은 대표적인 검정 곡선을 증명한다.
[실시예 16]
갑상선 자극 호르몬(TSH)에 대한 1 단계 비분리 샌드위치 검정
혈청 캘리브레이터(London Diagnostics TSH LumiTAG Kit) 100μL, ELC 완충액내 Ru(bpy)3 2+-라벨 생쥐항 - TSH(시약 Ⅴ) 25μL 및 ECL 완충액 내 양 항 - TSH - DYNAL 입자(시약 I) 25μL 를 합하고 혼합하면서, 15분 동안 실온의 폴리프로필렌 관에서 항온처리하였다. 결과를 읽기 전에, ECL 완충액 1㎖ 를 첨가하였다. 각 샘플에 대한 전기화학 발광 (ECL)을 실시 예 3에 기술한 바와 같이 읽었다. ELC 계수는 샘플에 존재하는 분석물의 농도에 정비례한다. (분석물의 농도가 증가할 수록 계수 증가), 표 Ⅳ는 대표적인 검정 곡선을 증명한다.
[실시예 17]
디곡신에 대한 2 단계 분리 경쟁 검정
혈청 캘리브레이터 (TDx Assay, Abbott Labs, Chicago, IL) 50μL 및 ECL 완충액내 Ru(bpy)3 2+- 라벨 생쥐항 - 디곡신 (시약 Ⅳ) 25μL를 합하고 혼합하면서 실온에서 20분 항온처리하였다. ECL 완충액내 와바인 - BSA - DYNAL 입자 (시약 Ⅲ) 25μL를 첨가하고, 혼합하면서 실온에서 20분 더 항온하였다. 그런 다음 자기 분리 및 ECL 완충액 500μL 내 입자의 재현탁에 의해 세척하였다. 상기 세척 과정을 2회 더 반복하였다. 최종적으로, 입자를 ECL 완충액 1㎖ 에 재현탁시켰다. 각 샘플에 대한 전기화학발광(ECL)을 실시예 3에 기술된 바와 같이 읽었다. ECL 계수는 샘플에 존재하는 분석물의 농도에 반비례한다. (분석물의 농도가 증가할수록 계수 감소). 표 Ⅴ는 대표적인 검정 곡선을 증명한다.
[실시예 18]
디곡신에 대한 2 단계 비분리 경쟁 검정
혈청 캘리브레이터 (TDx Assay, Abbott Labs, Chicago, IL) 50μL 및 ECL 완충액내 Ru(bpy)3 2+- 라벨 생쥐 항 -디곡신 (시약 Ⅳ) 25μL 를 합하고 혼합하면서 실온에서 20분 항온처리하였다. ECL 완충액내 와바인 - BSA - DYNAL 입자 (시약 Ⅲ) 25㎕ 를 첨가하고, 혼합하면서 실온에서 20 분 더 항온처리하였다. 읽기 전에, 입자를 ECL 완충액 1㎖ 에 재현탁시켰다. 각 샘플에 대한 전기화학 발광(ECL)을 실시예 3에 기술된 바와 같이 읽었다. ECL 계수는 샘플에 존재하는 분석물의 농도에 반비례한다.(분석물의 농도가 증가할수록 계수 감소). 표 Ⅵ는 대표적인 검정 곡선을 증명한다.
[실시예 19]
전극 상의 최종반응 샘플의 부가적 세척이 있는 리드 사이클을 사용하는 디곡신
에 대한 2 단계 비 분리 경쟁 검정
혈청 캘리브레이터 (TDx Assay, Abbott Labs, Chicago, IL) 50μL 및 ECL 완충액내 Ru(bpy)3 2+-라벨 생쥐항 - 디곡신 (시약 Ⅳ) 25μL를 합하고 혼합하면서 실온에서 20분 항온처리하였다. ECL 완충액내 와바인 - BSA - DYNAL 입자 (시약 Ⅲ) 25μL를 첨가하고, 혼합하면서 실온에서 20분 더 항온처리하였다. 읽기 전에, 입자를 ECL 완충액 1㎖ 에 재현탁 시켰다. 각 샘플에 대한 전기화학 발광(ECL)을 실시예 3에 기술된 바와 같이 읽었다. ECL계수는 샘플에 존재하는 분석물의 농도에 반비례한다.(분석물의 농도가 증가할수록 계수 감소). 표 Ⅶ는 대표적인 검정 곡선을 증명한다.
[실시예 20]
올리고누클레오티드 합성
올리고누클레오티드를 β-시아노에틸 포스포르아미다이트(1)를 사용하여 응용 생체계 자동화 올리고누클레오티드 합성기 상에서 제조하였다. 5' 말단에 대한 올리고누클레오티드 아미노 변형은 마지막 커플링 단계에서 일어났고, 3'말단에서는 변형 고체 상(相)(조절된 구멍 유리)를 사용함으로써 일어났다. 클론테그(San Diego CA)는 아미노 변형인자를 공급하였다. 결과의 5' 변형 올리고누클레오티드 모두 지정된 아미노기 (C6, NH2)에 6 탄소 스페이서 아암을 함유한다. 3'변형 올리고누클레오티드 모두 아미노기에 대한 3 탄소 스페이서를 함유한다. 구성된 올리고누클레오티드, 그들의 변형물 및 이용을 하기에 기술한다.
HPV 연구를 위한 올리고누클레오티드는 먼저 기술된 바와 같이 E6 영역에 지정된다. 올리고누클레오티드 서열은 하기와 같다 :
HPV 16; 1PV16 5' (C6, NH2)TTAGTGAGTATAGACATTATTGTTATAGTT ;
2PV16 5' (C6, NH2) CAGTTAATACACCTAATTAACAAATCACAC ;
3PV16 5' (C6, NH2) ACAACATTAGAACAGCAATACAACAAACCG ;
HPV18; 1PV18 5' (C6, NH2) TTAGAGAATTAAGACATTATTCAGACT ;
2PV18 5' (C6, NH2) CACCGCAGGCACCTTATTAATAAATTGTAT ;
3PV18 5'(C6, NH2) GACACATTGGAAAAACTAACTAACACTGGG .
상기 올리고 누클레오티드는 다양한 단편들의 PCR 발생을 가능하게 하는데 ; 3PV16 또는 3PV18 와 2PV16 또는 2PV18 이 각각 62bp 단편을 형성하고 ; 1PV16과 2PV16이 100bp 단편을 형성하며 ; 1PV18과 2PV18 이 103bp 단편을 형성한다. 3PV16 및 3PV18 올리고누클레오티드도 PCR 내에서 올리고누클레오티드 2PV16 및 2PV18에 의해 의해 생산된 가닥에 혼성체화될 뿐만 아니라, 1PV16과 2PV16 및 1PV18과 2PV18의 PCR 반응으로부터의 생성물에 혼성체화하는 프로브로서 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다. Ha-ras 지점 돌연변이 검정을 위한 올리고누클레오티드는 하기와 같다 :
HRP1 5' (C6, NH2) GCGATGACGGAATATAAGCTGGTGGTGGTG ;
HRP2 5' (C6, NH2) TTCTGGATCAGCTGGATGGTCAGCGCACTC ;
상기 2개의 올리고투클레오티드 프라이머들은 80bp 단편의 PCR 합성을 지정한다. 상기 지점 돌연변이 연구를 위해 사용된 프로브의 서열은 하기와 같다 :
1T24 5' (C6, NH2) GGCGCCGTCGGTGTGGGCAA ;
1CHR 5' (C6, NH2) GGCGCCGGCGGTGTGGGCAA ;
2T24 5' (C6, NH2) TTGCCCACACCGACGGCGCC ;
2CHR 5' (C6, NH2) TTGCCCACACCGCCGGCGCC.
또한 상기 서열이외에, 5' 아미노 변형은 없지만 3' 아미노기를 가진 상기 1CHR 및 2T24서열을 합성하였다. 상기 3' 아미노 변형 올리고누클레오티드를 ECL 라벨로 라벨링하였고 혼성체화에 사용하였다. 돌연변이 / 부정합 부위는 굵은 문자의 누클레이드에 의해 지적된다. 프로브 1T24 및 1CHR은 PCR내에서 올리고누클레오티드 HRP2에 의해 생산된 가닥에 혼성체화한다. 프로브 2T24 및 2CHR은 PCR 내에서 올리고누클레오티드 HRP1에 의해 생산된 가닥에 혼성체화 한다.
입자에 커플링하기 위한 올리고누클레오티드 JK8 및 JK8C :
JK8 5' (C6, NH2) GTCCAATCCATCTTGGCTTGTCGAAGTCTGA
JK8C 5' (C6, NH2) TCAGACTTCGACAACCCAAGATGGATTGGA1C.
상기 두 서열은 에어쿼린 (aequorin) 서열로부터 유래되고 서로에 대해 상보적이다.
JK7 5' TCAGACTTCGACAA(NH2)CCCAAGATGGATTGGA :
상기 올리고누클레오티드를, 그 서열내에서 아미노 변형을 하게 하는, 클론테크 (San Diego CA)로부터의 아미노 변경인자를 사용하여 아미노 변형시켰다. JK7 을 Ru(bpy)3 2+- 라벨을 사용하여 라벨링하였다. 시험관내 전사에 의해 발생된 에어쿼린 RNA에 대한 올리고누클레오티드프로브 :
T35 5' (NH2) GATTTTTCCATTGTGGTTGACATCAAGGAA;
상기 올리고를 비오틴 및 Ru(bpy)3 2+-라벨로 라벨링하였다. 대장균 DNA 의 검출을 위해 하기와 같은 게놈(3)의 Trp E/D 영역에 특이성인 올리고 누클레오티드를 합성하였다. :
TRP.CO3 5' (C6, NH2) GCCACGCAAGCGGGTGAGGAGTTCC(NH2) ;
상기 서열을 Ru(bpy)3 2+- 라벨로 및
TRP.CO4 5' (C6, NH2) GTCCGAGGCAAATGCCAATAATGG 을 비오틴으로 하기 기술된 바와같이 라벨링하였다.
[실시예 21]
올리고누클레오티드 라벨링하기
모든 합성 올리고누클레오티드를 바이오겔 P6(BioRad Labs) 컬럼상에서 겔 여과에 의해 정제하여 임의의 오염 아미노기를 제거하였다. NHS-비오틴 (Clontech, San Diego CA)를 사용하여 PCR 프라이머의 5' -아미노기를 경유하여 비오틴을 도입하였다.(4). Ru(bpy)3 2+-NHS 를 하기와 같은 변형 올리고누클레오티드의 아미노기를 경유하여 도입하였다. PBS(pH 7.4) 100㎖ 내 올리고누클레오티드 (0.1 μmole)을, 실온의 암실에서 밤새 DMSO에 용해된 Ru(bpy)3 2+-라벨 0.5μmole과 반응시켰다. 올리고누클레오티드를 에탄올 침전에 의해 상기 라벨링 반응물로부터 회수하였다. 최근의 연구는 Ru(bpy)3 2+-라벨 0.5μmole 을 사용하여 효과적으로 라벨링시키는 능력(80%)을 증명하였다. (자료는 제시되지 않았음)
라벨 올리고누클레오티드를, A) 100mM 테트라에틸암모늄 아세테이트 pH 7.0 및 B) A) 50%및 아세토니트릴 50%의 이동상을 가진 역상 Vydac C-18 반침전 컬럼 상의 HPLC에 의해 부가 정제하였고, B 20% 내지 40% 구배를 작업하였다.
또한 프로브 1CHR 및 1T24를 77,000cpm/ng 의 특이활성을 가진 프로브를 발생키기는 확증된 방법을 사용하는 T4 폴리누클레오티드 키나이제를 사용하여 32p로 라벨링하였다.(5)
[실시예 22]
누클레인산 자기 입자의 제조
다이날 M 450 입자를 표준 과정 (6)을 사용하여 2-플루오로-1-메틸피리디늄 톨루엔-4-설포레이트로 활성화하였다. 그런다음 활성화 입자를 올리고누클레오티드 JK8 및 JK8C와 반응시켰다. 0.1M NaHCO3650㎕ 내 올리고누클레오티드 33 nmol을 활성화 다이날 입자 100mg에 첨가한 후 혼합하면서 3시간 동안 항온처리하였다. 입자를 에탄올아민 (4mL, 0.1M)의 첨가에 의해 블로킹하였다. 커플링된 입자를 ECL 완충액내 단일가닥의 연어정자DNA 0.5㎎/㎖과 혼합하였고, ECL 완충액내로 4-5회 세척하였으며 단일 가닥의 연어 정자 DNA 100㎍/㎖를 함유한 ECL 완충액내 100㎎/㎖ 에서 재현탁시켰다.
[실시예 23]
스트렙타비딘 자기 입자 I의 제조
다이날 M 450 입자를 표준과정(6)을 사용하여 2-플루오로-1-메틸피리디늄 톨루엔-4-설포네이트로 활성화하였다. 그런다음 활성화 입자를 스트렙타비딘 (Sigma Ltd)와 반응시켰다. 활성화 입자(50㎎)를 0.1M NaHCO3로 세척한 후 스트렙타비딘 (1.5㎎)을 첨가하였으며 밤새 반응시켰다. 입자를 에탄올아민 (4㎖, 0.1M) 의 첨가에 의해 블로킹하였다. 커플링된 입자를 ECL 완충액내 단일 가닥의 연어정자 DNA 0.5㎎/㎖ 와 혼합하였고, ECL 완충액내로 4-5회 세척하였으며 단일 가닥의 연어 정자 DNA 100㎍/㎖를 함유한 ECL 완충액 내 10㎎/㎖에서 재현탁시켰다. 또한 다이날 M-280으로부터의 스트렙타비딘 입자는 가치있다고 판명되었지만 지금의 검정 서열에 있어서 보다 낮은 신호를 산출하였다. 면역 검정에 적용시키기 위해 입자를, 수동 코우팅에 사용된 완충액을 사용한 항원 또는 커플링후 BSA로 블로킹 하였다.
[실시예 24]
스트렙타비딘 자기 입자 Ⅱ의 제조
비오틴 -x-NHS (Clontech, San Diego CA. 5002-1) 50㎎/㎖를 함유한 디메틸설폭시드 105㎕를 BSA(PSB 2-3㎖내) 15㎎ 에 첨가한 후 실온에서 30분 동안 혼합 및 항온처리하였다. 반응을 1M 글리신 30㎕를 첨가함으로써 정지시키고 실온에서 10분동안 항온처리하였다. 반응 믹스를 겔여과 크로마토그래피 (Biorad, Bio-Gel P6)에 의해 정제하였다. 상기 비오틴 - BSA를 0.2㎕ 주사기를 사용하여 여과시켰다. 0.2M 나트륨 카르보네이트 / 비카르보네이트 완충액 pH 9.6 (카르보네이트 / 비카르보네이트) 완충액 10㎖ 내 비오틴 - BSA 5㎎을 카르보네이트/비카르보네이트 (Dynal 14002)로 세척된 다이나비드(Dynabeads) 300㎎에 첨가하였다. 상기 혼합물을 와동시켰고, 혼합하면서 밤새 실온에서 항온처리하였다. 상기 입자를 자기적으로 분리한 후 10㎖ ECL 희석액 및 100㎕ tRNA (10㎎/㎖)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 혼합하면서 실온에서 3-4시간 동안 항온처리하였다. 상기 입자를 ECL희석액 10㎖로 1회 세척하였고 ECL 희석액 및 100㎕ tRNA(10㎎/㎖)에 재현탁시켰다.
상기 혼합물을 혼합하였고 2-6℃에서 밤새 항온처리하여 입자상 단백질을 안정화하였다. 입자를 자기적으로 분리하였고 스트랩타비딘(Scripps S1214) 15㎎을 함유한 PBS 10㎖ 에 현탁시킨후 1시간 동안 혼합하였다. 입자를 ECL 희석액 10㎖ 에 4회 세척하였으며, 각 세척 당 5분 혼합하였다. 입자를 최종적으로 ECL 희석액 및 300㎕ tRNA(10㎎/㎖) 29.7㎖ 에 재현탁시켜 최종농도 10㎎/㎖ 입자 +100㎎/㎖ tRNA로 하였다.
[실시예 25]
ECL DNA 프로브와의 혼성체화에 의한 입자에 고정된 DNA의 검출
ECL을 입자에 혼성체화한 후 검출하는 능력을, Ru(bpy)3 2+-라벨 올리고누클레오티드 JK7 을 가진 JK8 및 JK8C (실시예 22)에 커플링된 입자의 혼성체화에 의해 증명되었다. ECL 완충액 내 개별적인 입자 로트 (300㎎)을 라벨링된 JK7 12.5, 6.3, 3.01 및 1.5fmol 을 함유한 ECL 완충액 50㎕ 와 혼합하였다. 상기 혼합물을 50℃에서 4시간 동안 혼성체화한 후 ECL 완충액 1㎖ 로 세척하였으며 ECL 완충액 830㎕에 재현탁시켰다. 상기 시료를 실시예 1에 기술된 바와 같이 분석하였다. 프로브 JK7은 JK8 서열에 상보적이지만 JK8C 서열에는 상보적이 아니다.
표 Ⅷ에 제시된 결과는 ECL에 의해 입자의 표면에 직접 고정된 특정 서열의 존재를 특정 혼성체화에 의해 검출하는 능력을 증명한다.
[실시예 26]
비스 결합 ECL을 기준으로 한 RNA 검정
다이날 M 450 입자를 표준 절차(실시예 10) 에 따른 RNA / DNA 항체 (7)에 특이성인 항체로 코우팅하였다. 특정 RNA종을, 우리가 클로닝한 에어쿼린 유전자(8)로부터 유래된 플라스미드를 사용하여 발생시켰다. 간단한, 플라스미드 pA5'을, 정제된 EcoRI으로 자르고 T3-RI RNA(음성 RNA)를 발생시키는 T3 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사를 받게 하였다. 또한 플라스미드 pA5'을, 정제된 BamHI로 자르고 T7-Bam RNA(양성 RNA)를 발생시키는 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사를 받게 하였다. 그 결과 상기 두 RNA 종은 두개의 상보적인 RNA 종을 나타낸다. 상기 RNA 종을 동량의 페놀 : 클로로푸름 (50:50)으로의 추출에 이어서 클로로포름 추출 및 에탄올 2.5vols을 사용한 상청액의 침전에 의해 정제한다. RNA의 양을 겔 전기영동 및 분광측광법을 사용하여 결정하였다. 상기 방법들은 잘 입증되고 당업자에게 공지된다.(9) 스트렙타비딘을 초과량의 Ru(bpy)-라벨 대 스트렙타비딘 25:1을 사용한 입증된 방법을 사용하여 Ru(bpy)-라벨로 라벨링하였다(실시예 13). 상기 라벨링된 스트렙타비딘을 입증된 방법(10)에 따른 이미노비오틴 컬럼을 사용하여 정제하였다. 스트렙타비딘은 스트렙타비딘 테트라머 당 10개의 Ru(bpy)-라벨을 함유한다고 추정되었다. 그런다음 상기 라벨링된 스트렙타비딘을 비오틴화된 T35로 복합체를 만들었으며, 이를 올리고 누클레오티드 대 라벨링된 스트렙타비딘 1:1 믹스를 사용하여 성취하였다. 특히 각각의 20pmoles을 ECL 완충액 15㎕의 최종 부피에 혼합하였고 4℃에서 밤새 항온처리하여 라벨링 된 스트렙타비딘 - 올리고누클레오티드 (SA-T35) 복합체를 형성하였다. 양성 및 음성 RNA (10 ng)의 샘플을 SA-T35 복합체 2㎕ 1단계 검정) 또는 비오틸닐화된 T35 25ng(2단계 검정)에 혼성체화하였다. 샘플을 50㎕ 까지 제조하였고 50℃에서 3시간 동안 혼성체화한 후 PBS 0.1% BSA 20㎕ 내 항 DNA/RNA 항체 코우팅 입자 200㎕을 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 1시간 동안 혼합한 후 ECL 완충액에서 2회 세척하였다. SA-T35 복합체와의 혼성화로부터의 샘플을 ECL 완충액 530㎕에 재현탁시켰고 실시예 1에 기술된 바와 같이 분석하였다. 그런다음 비오틴화 T35만의 혼성체화로부터의 샘플을 라벨링된 스트렙타비딘 50pmole로 항온처리하였고 혼합하면서 1시간 동안 항온처리한 후 ECL 완충액에서 2회 세척하였다. 혼성체화로부터의 샘플을 ECL 완충액 530㎕에 재현탁시켰고 실시예 1에 기술된 바와 같이 분석하였다. 결과를 표 Ⅸ에 제공한다.
[실시예 27]
폴리머라제 사슬 반응
폴라머라제 사슬 반응을 기술된 바 (11, 12, 13)와 근본적으로 같게 실행하였다. 반응물은 달리 언급이 없는 한 전형적으로 100㎕ 이었다. 비오틴화 올리고누클레오티드 5pmole을 사용하여, Ru(bpy)-라벨 오리고 누클레오티드 50pmole을 사용하여, Ru(bpy)-라벨의 비대칭 방식 지정 혼입으로 PCR을 실행하였다. 동일한 조건이지만 Ru(bpy)-라벨 올리고누클레오티드가 없는 조건하에서 Ha-ras 지점 돌연변이에 대한 검정작업을 하였다. 또한, 비대칭적으로 비-분리 HPV 검정 작업을 하였지만 10배 초과량의 비오틴화 올리고누클레오티드 전형적으로 40pmole을 사용하였다. 열순환기 조건은 하기와 같고, 직접적인 혼입 HPV 18 및 16 검정의 경우, 프로필은 93℃ 1초, 50℃ 1초, 60℃ 2분 ; Ha-ras 지점 돌연변이 검정의 경우 93℃ 1초, 69℃ 2분 ; 비-분리 HPV 검정의 경우 93℃ 10초, 50℃ 30초, 60℃ 2분이다. 상기 PCR 작업을 위한 순환수는 검정 및 요구되는 감도에 따라 30내지 40이다.
[실시예 28]
DNA-프로브 검정 형식 I 효소적 혼입에 의한 사람유두종 비루스 PCR 생성물의 검출 및 정량
직접적인 Ru(bpy)-라벨 올리고누클레오티드의 혼입을 사용한 PCR에 따라, 전 반응 혼합물(90-100㎕)를 스트렙타비딘 커플링된 자기입자 I 600㎕ 에 첨가한 후, 교반하면서 실온에서 20분 동안 항온처리하였다. 상기 샘플내 고체상을 자기성 랙을 사용하여 분리하였고, ECL완충액으로 2회 세척하였고, ECL 완충액 530㎕에 재현탁시킨 다음 실시예 1에 기술된 바와 같이 전기화학 발광에 관하여 분석하였다. 제 3 도는 상기 검정 형식을 도해한다. 상기 검정 형식에 대한 결과를 사람유두종 비루스 샘플(2, 14)로 증명하였다. 비오틴화 PCR 생성물내로 직접적인 Ru(bpy)-라벨-올리고누클레오티드의 혼입의 특이성 연구는 밀접하게 관련된 비루스타입 HPV16 및 HPV 18을 사용하였다. HPV16 및 18의 존재에 대한 검정은, 두 비루스 타입에 양성인 DNA 샘플 및 각각의 비루스 타입에 특이성인 올리고 누클레오티드를 사용하였다. 프라이머는 하기와 같으며, 2PV16, 2PV18을 비오틴화하였고 3PV16, 3PV18 은 Ru(bpy)-라벨-올리고누클레오티드였다. 2/3PV 16및 2/3PV18 올리고누클레오티드는 각각 HPV16 및 HPV18에 특이성이었다. 결과의 비드 - 포획 Ru(bpy)-라벨을 실시예 1에 기술된 바와 같이 ECL에 대하여 분석하였다. 결과를 각 샘플 프라이머 조합물에 대한 ECL 계수로서 플롯팅하였다. ; 제 6 도 참조.
우리의 검정 형식의 양적 본질을 증명하기 위해, HPV16 PCR 생성물내로 직접 혼입된 Ru(bpy)-라벨 및 비오틴화 올리고누클레오티드의 표준 곡선을 만들었다. 결과의 비드-결합Ru(bpy)-라벨을 실시예 1에 기술된 바와 같이 ECL에 대하여 분석하였다. 비루스성 복사물 대 총 세포성 DNA 복사물의 비로서 표현된, HPV 16 DNA 농도 증가와 대비해서 ECL 피이크 광자 계수를 플롯팅하였다. 상기 분석에 사용된 프라이머 HPV16는 1PV16(비오틴 라벨) 및 2PV16 (Ru(bpy)-라벨)이었다. 각각의 PCR에 사용된 DNA를 송아지 흉선 DNA를 사용하여 일정한 1mg에서 유지하였다. 상기 표준곡선에 대한 결과는 제 7 도에 제시된다. 상기 형식에 대한 특이성 및 정량의 결과는 단순하고 빠른 DNA기재 검정을 생산하는 ECL 라벨의 능력을 증명한다. 그것은 또한 효소적 공정에서 방해없이 효소 반응에 쉽게 접촉하는 라벨의 능력을 증명한다.
[실시예 29]
DNA-프로브 검정 형식 Ⅱ. 사람 Ha-ras 종양유전자 PCR 증폭
생성물에 있어서 지점 돌연변이의 검출 및 결정
올리고스 HRP 1 및 HRP 2를 사용하여 Ha-ras 유전자의 PCR 반응을 실행하였다. 라벨링 되지 않은 HRP2를 가진 비오틴화 HRP1을 사용한 결과의 PCR생성물을 Ru(bpy)-라벨 프로브, 2CHR및 2T24에 혼성체화 할 수 있다. 반대로 라벨링되지 않은 HRP1을 가진 비오틴화 HRP2를 사용한 결과의 PCR생성물은 Ru(bpy)-라벨 프로브, 1CHR 및 1T24에 혼성체화할 수 있다. 사용된 DNA는 방광암 T 24 (15)부터의 돌연변이체 Ha-ras 유전자로 트랜스펙팅된, 사람 태반(정상) 및 생쥐 NIH3T3 세포 DNA였다.
검정 프로토콜은 하기와 같은데 ; PCR 반응 혼합물 90㎕를 스트렙타비딘 커플링 자기 입자 I 600㎕ 에 첨가한 후, 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 상기 샘플내 고체상을 자기랙을 사용하여 분리하였고, 50mM NaOH로 세척하였고, 혼성체화 완충액 (0.9 M NaCl, 50mM NaPO, pH 7.7, 5mM EDTA, 0.1% w/w 피콜, 0.1% w/v 폴리비닐피롤리돈, 0.1% w/v 소의 혈청알부민)으로 세척하였으며 Ru(bpy)-라벨 올리고누클레오티드 10㎍/㎖ 를 함유한 혼성체화 완충액에 재현탁시켰다. 샘플을 66℃에서 15분 동안 혼성체화하였다.
고체상을 자기 랙을 사용하여 분리하였고, 0.9M NaCl, 50mM NaPO pH 7.7, 5mM EDTA 로 2회 세척하였고, 3M 테트라메틸암모늄 클로라이드, 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 2mM EDTA, 0.025% 트리톤 X-100으로 실온에서 1회 및 66℃에서 2회 각각 20분 동안 세척하였다. 고체 상을 ECL 완충액 으로 3회 세척하였고, ECL완충액 530㎕에 재현탁하였으며 실시예 1에 기술된 바와 같이 전기화학발광을 검출하였다. 제 4 도는 상기 검정 형식을 도해한다.
P 라벨 프로브를 사용한 Ha-ras PCR 생성물에 대한 검정은 고체상을 최종적으로 ECL 완충액 250㎕ 에 재현탁시키는 것을 제외하고는 Ru(bpy)-라벨을 사용한 것과 유사하였다. 그런 다음 현탁 시료를 신틸레이션 유체 5㎖로 옮겼고 베크만 LS-100C 액체 신틸레이션 계수기에서 계수하였다.
제 8 도에서 Ha-ras 종양유전자에 대한 지점 돌연변이 검정으로부터의 자료를 제시한다. PCR을 라벨링되지 않은 HRP1을 가진 비오틴화 HRP2(프로브 2T24 및 2CHR의 경우)및 라벨링되지 않은 HRP2를 가진 비오틴화 HRP1 (프로브 1T24 및 1CHR의 경우)을 사용하여 제 4 도에 도해된 바와 같이 실행하였으며, 혼성체화를 위한 비드 - 결합 단일 가닥 표적물을 발생시켰다. DNA 샘플은 정상(태반) Ha-ras 유전자 및 돌연변이체 (NIH 3T3-T24) Ha-ras 유전자였다. TEMAC 세척전에 비드-결합 DNA를 Ru(bpy)-라벨-1T24(1T24), Ru(bpy)-라벨 -2T24(2T24), Ru(bpy)-라벨 - 1CHR(1CHR)및 Ru(bpy)-라벨 - 2CHR(2CHR)로 혼성체화 하였다. 결과의 비드-결합 Ru(bpy)-라벨을 실시예 1에 기술된 바와 같이 ECL에 관하여 분석하였다. 결과를 각 시료 프로브 조합물에 대한 ECL에 관하여 분석하였다. 결과를 각 시료 프로브 조합물에 대한 ECL에 계수로서 플롯팅하였다. 결과(제 8 도)는 정상 DNA에 잘 혼성체화하는 정상 프로브(CHR 프로브참조)및 돌연변이 유전자에 혼성체화하는 돌연변이 프로브 (T24프로브 참조)로 예상된 바와 같았다. 상기 프로브들이 모두 동등하게 실행하지 않았다는 것이 흥미있었다. 상기 명백한 변칙을 조사하기 위해, 부가로 Ru(bpy)-라벨 유무의 P 라벨 프로브를 사용하여 상기 프로브들을 연구하였다. Ha-ras 종양유전자에 대한 P 라벨 프로브를 사용하는 Ru(bpy)-라벨 프로브의 특이성 평가를 하기와 같이 실행하였다. PCR을 라벨링되지 않은 HRP1(프로브 1T24 및 1CHR의 경우)을 가진 비오틴화 HRP2 만을 사용하여 제 8 도에 기술된 바와 같이 실행하였다. 사용된 프로브는 : 대조군으로서 P를 함유한 1T24 및 1CHR (1T24-P, 1CHR-P) ; Ru(bpy)-라벨의 효과를 결정하기 위해 P 및 Ru(bpy)-라벨 모두를 함유한 1T24 및 1CHR였다. 샘플을 TEMC로 보다 빠르게 세척하였다. 결과의 비드 - 결합 P를 신틸레이션 계수기 내 신틸레이션 칵테일의 첨가에 대해 분석하였다. 결과를 각각의 샘플 프로브 조합물에 대한 초 당 P 계수로서 플롯팅하였다.(제 9 도 참조). 상기 결과는, P 프로브 및 Ru(bpy)-라벨 프로브가 동등하게 기능한다는 것과 프로브 특이성에서의 문제점은 사용된 특정 프로브 서열에 기인하다는 것을 증명한다. 우리의 Ru(bpy)-라벨 및 P의 상기 동등성을 부가 증명하기 위해 상기 라벨링된 프로브들을 비교하였다. 라벨링 되지 않은 HRP1을 가진 비오틴화 HRP2 (프로브 1T24 및 1CHR의 경우)를 사용한, 태반 DNA를 사용하여 선술된 바와 같이 증폭을 실행하였다. 그런다음 결과의 PCR 생성물을 샘플링하여 서로 다른 양의 생성물을 함유한 한 세트의 샘플을 산출하였다. 그런다음 상기 샘플 세트를 P로 또는 라벨링된 프로브 (1T24-P및 1CHR-P)또는 Ru(bpy)-라벨 (1T24-Ru(bpy)및 1CHR -Ru(bpy))로 혼성체화 하였다. 그런다음 각 연구로부터의 결과를, 시료 90㎕에 대한 각각의 라벨로부터의 평균값을 사용하여 정규화하였다. 정규화 도면은 배경에 대한 신호의 더욱 효과적인 비교 및 그 두가지 방법의 비교 반응을 허용한다. 제 10 도에 삽입한 도면은 희석 곡선의 보다 낮은 수준에서의 반응을 도해한다. 샘플을 더 먼저 기술된 바 (제 8 도 및 제 9 도)와 같이 취급하였다. 제 10 도의 결과는 우리의 Ru(bpy)-라벨 프로브로부터의 보다 나은 반응의 지적을 가진 두 라벨들의 동등성을 증명한다. 상기 연구는 샘플 DNA의 단일 염기 변화를 식별할 수 있는 P 라벨 프로브와 마찬가지로 기능할 수 있는 Ru(bpy)-라벨 프로브의 능력을 증명하였다. 상기 증거는, Ru(bpy)-라벨이 혼성체화 반응에서 라벨 프로브의 성질에 거의 영향을 미치지 않는다는 것을 지적한다.
[실시예 30]
DNA - 프로브 검정 형식 Ⅲ. 비-분리 검정에서 사람 유두종 비루스 PCR 생성물의 검출 및 정량
HPV18에 대한 비-분리 검정을 위해, 초과량의 비오틴화 프라이머를 가지고 비대칭 PCR 반응을 실행하였다. 상기 PCR 반응은 Ru(bpy)-라벨-프로브에 의한 직접적인 혼성체화에 현재 유효한 초과량의 비오틴화 단일-가닥 DNAs를 발생한다. 혼성체화를 위해, 증폭완료후 증폭된 HPV 유전자에 특이성인 Ru(bpy)-라벨 - 올리고누클레오티드(~ 2ng)의 1000ECL 계수를 PCR 15㎕에 첨가한 후 50℃ 에서 15분동안 항온처리 하였다. 상기 혼성체화 혼합물에 스트렙타비딘이 커플링된 자기 입자 I 600㎍을 함유한 ECL 완충액 60㎍를 첨가하였고 15분 동안 실온에서 교반하면서 항온처리하였다. 샘플부피를 ECL 완충액 첨가에 의해 530㎕로 증가시킨 후 실시예 1에 기술된 바와 같이 전기화학발광을 검출하였다. 제 5 도는 상기 검정 형식을 도해한다. 상기 비-분리 검정을 증명하기 위해, HPV18 DNA 의 표준 곡선을 그렸다. HeLa DNA(14)를 사용한 라벨링되지 않은 1PV18 및 비오틴화 2PV18을 사용하여 PCR을 실행하였다. 그런다음 결과의 PCR 반응물을 특이적 프로브 Ru(bpy)-라벨 - 3PV18과 함께 혼성체화하였다. 그런다음 혼성체화 혼합물을 스트렙타비딘 코우팅 입자에 첨가하였고 결과의 비드-결합 Ru(bpy)-라벨을 실시예 1에 기술된 바와 같이 ECL에 관하여 직접 분석하였다. 결과를 ras 올리고누클레오티드 포로브의 대조군과 함께 PCR에 첨가된 HPV 18 복사물 대 ECL 계수로서 플롯팅하였다. (제 11 도 참조). 상기 결과는 ECL 검정 시스템의 성질을 기준으로 누클레인선 서열에 대한 신속한 비-분리 검정을 할수 있는 능력을 증명한다.
[실시예 31]
특이적 게놈 DNA 서열에 대한 검정
본 명세서에 기술된 검정 형식은 2개의 올리고누클레오티드를 사용하며, 이들 모두 서로 근처에 있는 동일한 DNA 가닥에 혼성체화하고, 한 프로브는 포획할 수 있게 하고 다른 하나는 복합체를 라벨링한다 (샌드위치 혼성체화). 상기 검정을 trp E/D 유전자 영역에 특이성인 이. 콜리 DNA및 프로브를 사용하여 증명하였다. 이. 콜리 DNA를 표준 프로토콜(16)을 따라 제조하였다. 연어 정자 대조군 DNA를 Sigma Ltd로 부터 구입하였다. 혼성체화 완충액 (10 x PBS, 10mM EDTA 및 0.7% SDS)14㎕, 비오틴-라벨 TRP. CO 2ng 및 Ru(bpy)-라벨 TRP. CO5ng 을 DNA 시료에 첨가했다. 상기 시료에 물을 넣어 100㎕ 가 되게 하였다. 시료를 97℃까지 가열시키고 97℃에서 10분 동안 항온처리하고, 50℃로 냉각시켰으며 2시간 동안 혼성체화하였다. 스트랩타비딘 코우팅 자기 입자 Ⅱ 20㎕ 를 상기 시료에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 혼합하였다. 그런다음 입자를 ECL 완충액에서 4회 세척하였고, ECL 완충액 500㎕ 에 재현탁시키고 실시예 3에 기술된 바와 같이 분석하였다. 양성 DNA 는 이. 콜리이고 음성 DNA 는 연어정자 이다. 결과는 표 Ⅹ에 제시된다.
상기 결과는 비 증폭 DNA에 대한 샌드위치 혼성체화 검정 형식을 사용하는 이. 콜리의 게놈 유전자의 검출에서 기능하는 ECL 검정 시스템의 능력을 증명하였다. 스트렙타비딘 코우팅 자기 입자 I 은, 스트렙타비딘 코우팅 자기 입자 Ⅱ가 상기 실시예에서 사용된 방식과 유사하게 사용될 수 있다.
[실시예 32]
소실성-웨이브 형광 검출기 상의 입자 농도
소실성 웨이브 검출기를 사용하는 검정의 감도를 증가시키기 위해 검출표면 상의 라벨 복합체의 농도를 사용할 수 있다. 그러한 검출기는 광원으로부터 유체 환경으로 빛(310)을 운반하기 위해 광학섬유(들) 또는 평면광학 도파관(들)(300)을 사용할 수 있다. 입사광선이 고굴절지수(n1)의 유전 매질 및 보다 낮은 굴절 지수(n2)의 것 사이의 접촉면을 칠때 일어나는 총 내부반사(TIR)(310')에 의해 도파관 또는 광학섬유를 통해 빛을 반사시킨다. 광선의 입사각이 θ(수선(300') 및 빛의 경로(310') 사이에 제시된 각) 즉 θ = Sin(n/n)인 임계각 (315) 보다 크다면, 빛을 접촉면에서 100% 내부로 반사시킨다. 광학 도파관 및 광학 섬유에서, 빛은 상기 임계각보다 큰 입사각을 따라 전해지고, 총 내부 반사에 의해 매질을 통과하여 전달한다. 제 22 도는 도파관 또는 광학 섬유에서 TIR 전달을 나타낸다.
광선은 접촉면과의 각각 상호작용에서 전부 반사되지만, 전자기장은 매질 외부에서 영이 아니다. 접촉면을 통과하는 연속적인 물리적 요구는 외부 환경내로 섬유 또는 도파관 외부를 관통함에 따라 전자기장은 지수적으로 감소할 것을 요구한다. 상기 장(場)은 소실성 장(320)이라 불리고 형광단을 흥분시켜 형광을 발할 수 있게 한다. 소실성 장의 감소율은 입사파장, 굴절률 n 및 n, 및 입사각에 따라 결정한다. 수중에서 석영 도파관 및 가시광선을 사용하여, 소실성 장(320)은 도파관 / 용액 접촉면으로부터 100nm 의 거리이내에서 대략 90% 정도 감소한다. 제 22 도에서 주변 매질(330)은 굴절률 n 를 갖고 광학 섬유(들) 또는 도파관(들) (300)은 굴절률 n 을 갖는다.
도파관 또는 광학 섬유에 빛을 전달하기 위해 소실성 장을 창출하는 동일한 원리는, 형광단이 발광할 때 발생되는 빛이 광학 원소를 유효하게 다시 포획하게 한다. 부가적으로, 소실성 구역 (320) 외부에서 생성된 임의의 빛을 유효하게 반사하여 광학 원소가 들어가는 것을 막는다. 상기 효과들의 조합은 광학 섬유 또는 도파관이 수중에서 그들 표면 상에 또는 근처에 형광단 수준의 존재 및 농도를 측정하기에 유효한 광학원소로서 사용되게 한다. 본 명세서에 참조문헌으로 첨부된 미합중국 특허 제 4,447,546호는 라벨링된 면역반응물로부터 소실성 구역 형광을 흥분시키고 측정하기 위해 광학 섬유를 이용한 형광면역 검정을 수행하기에 적당한 방법 및 기구를 기술한다.
본 발명은 광학 섬유 또는 도파관을 사용하여 형광 결합 검정의 감도를 개선시키도록 적용될 수 있다. 형광성분으로 라벨링된 시약을 사용한 검정을 실행한다. 입자, 샘플 및 시약의 항온처리후, 입자를 도파관 또는 광학섬유의 표면 상에 집중시킨다. 입자의 표면적이 도파관 또는 광학 섬유의 기하학적 면적보다 크기 때문에, 보다 많은 형광단이 광학 원소 주위의 소실성 구역에 수집될 수 있다. 따라서, 입자로부터의 발광 신호는 더 클 것이고 분석물의 정량은 보다 민감할 것이므로, 개선된 검출 한계를 결과시킨다.
본 발명의 바람직한 구체예에 상세히 기술되었으므로, 첨부된 특허청구 범위에 의해 한정된 본 발명은 상기 설명에서 설명하는 특정 세부사항에 의해 제한되지 않을 것이며 본 발명의 정신 또는 범위를 벗어나지 않으면서 이들의 많은 명백한 변형이 가능하다는 것이 자명하다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 본 발명의 소미립자 -기재 비분리 및 분리 검정법을 수행하기 위한 셀의 개략도이다.
제2도는 제1도의 셀을 사용하기 위한 전압 조절 장치의 개략도이다.
제3도는 프라이머로서 전기화학발광성 라벨된 올리고누클레오티드 및 비오틴 전기화학발광성 라벨된 올리고누클레오티드를 사용하는 직접 가입 PCR 형의 도식적 표현이다.
제4도는 비오틴기화 PCR 생성물을 생성시키기 위해 비오틴기화 프라이머를 사용하는 정상 PCR형의 도식적 표현이다.
제5도는 전기화학발광성 라벨된 올리고누클레오티드에 대한 다음 혼성체화를 위해 단일 가닥 비오틴기화 DNA를 생성하는 비대칭형 PRC 검정형의 도식적 표현이다.
제6도는 비오틴기화 PCR 생성물내로 전기화학발광성 라벨된 올리고누클레오티드를 직접 가입하는 특이성 연구를 나타내는 그래프이다.
제7도는 HPV16 PCR 생성물내로 직접 가입된 전기화학발광 라벨 및 비오틴기화 올리고누클레오티드의 표준 곡선이다.
제8도는 Ha -ras 발암유전자에 대한 점 돌연변이 검정을 나타내는 그래프이다.
제9도는 Aa-ras 발암유전자에 대한 p32 전기화학발광성 라벨된 프로브를 사용하여 전기화학발광성 라벨된 프로브의 특이성의 평가를 나타내는 그래프이다.
제10도는 Ha-ras 발암유전자에서 점 돌연변이의 측정을 위해 p32 전기화학발광성 라벨에서 전기화학발광 라벨의 상대값의 측정을 나타내는 그래프이다.
제11도는 HPV18에 대한 신속한 세척하지 않은 혼성체화 검정의 표준 곡선이다.
제12도는 복합체를 정착시키는 중력에 의존하여 검정을 수행하는데 사용된 검정법의 도식적 표현이다.
제13도는 중력의 영향 하에 시간의 함수로서 복합체가 정착하는 거리를 나타내는 그래프이다 ; 즉 다이날 입자의 침전속도(y = -0.28+0.48 X ; 속도 = 분당 0.5mm).
제14도는 전극 상에 상이한 높이의 검정 조성물을 갖는 중력 셀에서 시간의 함수로서 전기화학발광의 강도, 즉 두개의 가스켓 두께에 대한 강도-시간 관계의 비교를 나타내는 그래프이며, 흰 원으로 표시된 값은 0.015 가스켓에 대한 것이고 검은 원으로 표시된 값은 0.075 가스켓에 대한 것이다.
제15도는 알파 태아 단백질의 측정을 위한 검정에서 측정된 바와 같이 전극 표면 상에 상이한 높이를 갖는 중력 셀에서 전기화학발광의 강도, 즉 AFP 검정법에 대한 셀의 비교를 나타내는 그래프이며, 흰 원으로 표시된 값은 0.015 가스켓에 대한 것이고 검은 원으로 표시된 값은 0.075 가스켓에 대한 것이다.
제16도는 전극 표면 상에 복합체를 정착시키는 전자석을 사용하는 침전 검정 셀의 도식적 표현이다.
제17도는 각각 자장과 중력의 영향 하에 소미립자 복합체의 상대적 정착속도, 즉 자장으로 유도된 정착 및 중력 정착사이의 소미립자 정착시간의 비교를 나타내는 그래프이며, 자장 정착에 대한 값은 흰 원으로 표시하고 중력 정착에 대한 값은 검은 원으로 표시한다.
제18도는 영구 자석을 포함하는 수집 셀의 도식적 표현이다.
제19도는 제18 도의 셀로써 수행된 검정에서 시간의 함수로서 ECL 강도의 증가, 즉 ECL 강도에 대한 수집시간의 효과를 나타내는 그래프이다.
제20도는 전극 표면 아래 자석 배향의 함수로서 전극 표면의 부근에 자력선의 도식적 표현이다.
제21도는 복합체가 원심분리 ; 입자를 포획하기 위한 본 발명의 원심분리 방법 및 장치 ; 본 발명의 원심분리 유동 셀에 의해 전극의 표면에 부착되는 회전 유동 셀의 도식적 표현이다.
제22도는 소실성-파 형광 감지의 도식적 표현이다.
제23도 및 24도는 본 발명의 자기 소미립자-기재 분리 또는 비- 분리 검정법을 수행하기 위한 다수의 자석 및 셀을 나타내며 ; 전극 자석시스템의 다수의 자석은 표면의 평면에 아주 평행한 자장선을 부여한다.
제25도는 본 발명의 소미립자-기재 비-분리 및 분리 검정법을 수행하기 위한 셀의 도식적 도면이고 ; 셀은 제23 및 24도에서 처럼 작업전극 및 다수의 전극을 사용한다.
[참조문헌]
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Claims (23)

  1. 하기(a)-(e)의 단계들로 구성되는, 샘플내에 존재하는 관심있는 분석물에 대한 결합 검정을 수행하기 위한 방법 : (a)하기 (i)-(iii)를 함유하는 조성물을 형성하고 (i) 상기 샘플 (ii) 발광하도록 유도될 수 있는 라벨 화합물에 결합된 성분을 함유하는 검정-수행-물질, 및 (iii) 분석물 및 / 또는 상기 검정-수행-물질과 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 입자 ; (b) 상기 조성물을 항온처리하여 입자 및 상기 라벨 화합물을 함유하는 복합체를 형성하고 ; (c) 측정 구역에서 상기 복합체를 수집하고 ; (d) 상기 복합체내 라벨화합물을 표면 선택적 여기에 의해 발광하도록 유도시키고 ; (e) 방출된 발광을 측정하여 샘플내 관심있는 분석물의 존재를 측정한다.
  2. 제1항에 있어서 상기 복합체가 발광을 유도하고 상기 발광을 측정하기 위한 수단의 표면 상에 수집되는 방법.
  3. 하기(a)-(e)의 단계들로 구성되는, 전극 표면에서 전기화학 발광의 측정을 근거로 하여 샘플내에 존재하는 관심있는 분석물에 대한 결합 검정을 수행하기 위한 방법 : (a) 하기 (i)-(iii)를 함유하는 조성물을 형성하고 (i) 상기 샘플 (ii) 전기화학 발광하도록 유도될 수 있는 라벨 화합물에 결합된 성분을 함유하는 검정-수행-물질, 및 (iii) 분석물 또는 상기 검정-수행-물질과 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 입자; (b) 상기 조성물을 항온처리하여 입자 및 상기 라벨 화합물을 함유하는 복합체를 형성하고 ; (c) 상기 복합체를 수집하고 ; (d) 수집된 복합체를 전극표면과 접촉되게 하고 상기 전극 상에 전압을 가해 상기 복합체내 라벨 화합물을 발광하도록 유도시키고 ; (e) 전극 표면에서 방출된 발광을 측정하여 샘플내 관심있는 분석물의 존재를 측정한다.
  4. 하기 (a)-(f)의 단계들로 구성되는 전극 표면에서 전기화학 발광의 측정을 근거로 하여, 샘플내에 존재하는 관심있는 분석물에 대한 결합 검정을 수행하는 방법 : (a) 하기 (i)-(iii) 를 함유하는 조성물을 형성하고 (i) 상기샘플 (ii) 전기화학발광하도록 유도될 수 있는 라벨 화합물에 결합된 성분을 함유하는 검정-수행-물질, 및 (iii) 상기 조성물의 나머지보다 더 큰 밀도를 갖고 분석물 또는 상기 검정-수행-물질과 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 현탁된 입자 ; (b) 상기 조성물을 항온 처리하여 입자 및 상기 라벨 화합물을 포함하는 복합체를 형성하고 ; (c) 상기 조성물을 검정 셀내로 도입시키고 ; (d) 입자를 중력에 의해 전극 표면상에 정착시키기에 충분한 시간 동안 상기셀내에 상기 조성물을 잔류시켜 상기 검정셀의 부피중 적어도 실질적인 부분 아래에 위치한 전극 표면에 상기 복합체를 수집하고 ; (e) 상기 전극에 전압을 가해 상기 수집된 복합체내 라벨 화합물을 발광하도록 유도시키고 ; (f) 전극 표면에서 방출된 발광을 측정하여 샘플내 관심있는 분석물의 존재를 측정한다.
  5. 제4항에 있어서, 상기 조성물을 상기 전극 표면상에 상기 입자의 적어도 일부분을 정착시키는데 충분히 낮은 속도로 상기 셀을 통하여 흐르게 하는 유동방법으로 수행되는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 입자가 0.1 내지 5g/㎖의 밀도를 가지며, 평균 직경으로 측정된 상기 입자의 크기가 0.01 내지 100㎛ 범위인 검정 방법.
  7. 하기 (a)-(e) 의 단계들로 구성되는, 전극 표면에서 전기화학발광의 측정을 근거로 하여, 샘플내에 존재하는 관심있는 분석물에 대한 결합 검정을 수행하기 위한 방법 ; (a) 하기 (i)-(iii)를 함유하는 조성물을 형성하고 (i) 상기 샘플 (ii) 전기화학 발광하도록 유도될 수 있는 라벨 화합물에 결합된 성분을 함유하는 검정-수행-물질, 및 (iii) 상기 조성물의 나머지보다 더 큰 밀도를 갖고 분석물 또는 상기 검정-수행-물질과 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 현탁된 입자; (b) 상기 조성물을 항온 처리하여 입자 및 상기 라벨 화합물을 함유하는 복합체를 형성하고 ; (c) 원심분리에 의해 상기 복합체를 수집하고 ; (d) 상기 수집된 복합체를 전극 표면과 접촉되게 하고 상기 전극 상에 전압을 가해 상기 복합체내 라벨화합물을 발광하도록 유도시키고 ; (e) 전극 표면에서 방출된 발광을 측정하여 샘플내 관심있는 분석물의 존재를 측정한다.
  8. 제7항에 있어서, 상기 원심분리 단계는 상기 전극의 표면에 상기 복합체를 수집하는 방법.
  9. 하기 (a)-(e)의 단계들로 구성되는, 전극 표면에서 전기화학 발광의 측정을 근거로 하여, 샘플내에 존재하는 관심있는 분석물에 대한 결합 검정을 수행하기 위한 방법 ; (a) 하기 (i)-(iii)를 함유하는 조성물을 형성하고 (i) 상기 샘플 (ii) 전기화학 발광하도록 유도될 수 있는 라벨 화합물에 결합된 성분을 함유 하는 검정-수행-물질, 및 (iii) 분석물 및 / 또는 상기 검정-수행-물질과 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 현탁된 입자 ; (b) 상기 조성물을 항온 처리하여 입자 및 상기 라벨 화합물을 함유하는 복합체를 형성하고 ; (c) 여과에 의해 상기 복합체를 수집하고 ; (d) 수집된 복합체를 전극 표면과 접촉되게 하고 상기 전극 상에 전압을 가해 상기 복합체내 라벨 화합물을 발광하도록 유도시키고 ; (e) 전극 표면에서 방출된 발광을 측정하여 샘플내 관심있는 분석물의 존재를 측정한다.
  10. 제9항에 있어서, 상기 여과단계는 상기 전극의 표면에 상기 복합체를 수집하는 방법.
  11. 하기 (a)-(e)의 단계들로 구성되는, 전극 표면에서 전기화학 발광의 측정을 근거로 하여, 샘플내에 존재하는 관심있는 분석물에 대한 결합 검정을 수행하기 위한 방법 ; (a) 하기 (i)-(iii)를 함유하는 조성물을 형성하고 (i) 상기 샘플 (ii) 전기화학 발광하도록 유도될 수 있는 라벨 화합물에 결합된 성분을 함유하는 검정-수행-물질, 및 (iii) 분석물 및/또는 상기 검정-수행-물질과 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 자기 반응성인 현탁된 입자 ; (b) 상기 조성물을 항온처리하여 입자 및 상기 라벨 화합물을 함유하는 복합체를 형성하고 ; (c) 입자 상에 자장을 가하여 상기 복합체를 수집하고 ; (d) 상기 수집된 복합체를 전극표면과 접촉되게 하고 상기 전극 상에 전압을 가해 상기 복합체의 라벨 화합물을 발광하도록 유도시키고 ; (e) 전극 표면에서 방출된 발광을 측정하여 샘플내 관심있는 분석물의 존재를 측정한다.
  12. 제11항에 있어서, 상기 자장을 가하여 상기 전극의 표면에 상기 복합체를 수집하는 방법.
  13. 하기 (a)-(f)의 단계들로 구성되는, 전극 표면에서 전기화학 발광의 측정을 근거로 하여, 샘플내에 존재하는 흥미있는 분석물에 대한 결합 검정을 수행하기 위한 방법: (a) 하기 (i)-(iii)를 함유하는 조성물을 형성하고 (i) 상기 샘플 (ii) 전기화학 발광하도록 유도될 수 있는 라벨 화합물에 결합된 성분을 함유하는 검정-수행-물질, 및 (iii) 분석물 또는 상기 검정-수행-물질과 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 자기 반응성인 현탁된 입자; (b) 상기 조성물을 항온처리하여 입자 및 상기 라벨 화합물을 포함하는 복합체를 형성하고 ; (c) 상기 조성물을 검정 셀내로 도입시키고 ; (d) 상기 입자상에 자장을 가하여 전극 표면상에 상기 복합체를 수집하고; (e) 상기 전극에 전압을 가해 상기 수집된 복합체내 라벨 화합물을 발광하도록 유도시키고; (f) 전극 표면에서 방출된 발광을 측정하여 샘플내 관심있는 분석물의 존재를 측정한다.
  14. 제13항에 있어서, 상기 자장이 상기 입자를 상기 전극 표면상에 정착시키기에 충분히 낮은 속도에서 상기 조성물이 상기 셀을 통하여 흐르는 유동 방법으로 수행되는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 입자가 적어도 0.01cgs 단위의 대자율을 가지고, 0.5내지 2g/mL의 밀도를 가지며, 평균 직경으로 측정된 상기 입자의 크기가 0.001내지 100㎛인 검정 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 조성물내 입자의 농도가 1내지 10,000㎍/㎖인 검정방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 조성물내 상기 입자의 대자율, 밀도, 크기 및 농도는 상기 입자의 정착 속도가 적어도 0.05mm/분 이도록 하는 정도이고, 상기 전극 표면의 적어도 실질적인 부분이 전기화학발광을 유도하기 전에 상기 복합체의 단층에 의해 덮히며, 상기 자력선이 상기 전극 표면의 부근에서 상기 전극 표면과 실질적으로 평행한 검정 방법.
  18. 하기 (a)-(c)로 구성되는, 전극 표면에서 전기화학 발광의 측정을 근거로하여, 샘플내에 존재하는 관심있는 분석물에 대한 결합 검정을 수행하기 위한 장치: (a) 수직 칼럼구역을 갖고 유입 및 유출 수단을 갖는, 샘플을 함유하는 용적물을 형성하고, 부가적으로 상기 셀 및 상기 칼럼구역의 실질적인 용적물 아래에 위치한, 실질적으로 수평하게 배향된 전극을 포함하는 셀; (b) 상기 전극 상에 전압을 가하는 수단 ; 및 (c) 상기 전극에서 발생된 전기화학 발광을 측정하는 수단.
  19. 하기 (a)-(c)로 구성되는, 전극 표면에서 전기화학 발광의 측정을 근거로 하여, 샘플내에 존재하는 관심있는 분석물에 대한 결합 검정을 수행하기 위한 장치 ; (a) 검정 샘플 함유 용적물을 형성하고, 유입 및 유출 장치, 전극을 갖고 부가적으로 상기 전극 표면상의 상기 복합체의 실질적으로 고른 분포를 얻기 위한 수단을 포함하는 셀 ; (b) 상기 전극 상에 전압을 가하는 수단 ; 및 (c) 상기 전극에서 발생된 전기화학 발광을 측정하는 수단.
  20. 제19항에 있어서, 복합체의 고른 분포를 얻기 위한 상기 수단은, 상기 자력선이 상기 전극 표면 부근에서 상기 전극 표면과 실질적으로 평행하도록 상기 전극에 대해 배향된 자장을 발생하기 위한 수단을 포함하며 자장을 발생하기 위한 그 수단은 상기 전극아래에 수직으로 위치한 북-남 배향인 자석을 포함하는 장치.
  21. 자기적으로 불활성인 입자들 및 자기적으로 반응성인 입자들로 구성된 군으로부터 선택된 입자, 및 하기 (a)-(g) 로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 다른 성분을 포함하는 소미립자-기재 결합 검정에서의 시료로서 사용하기 위한 물질의 조성물: (a) 전해물 ; (b) ECL 부분을 함유하는 라벨 화합물 ; (c) 관심있는 분석물 또는 관심있는 분석물의 유사물 ; (d) 관심있는 분석물 또는 그의 유사물의 결합 파트너 ; (e) (c)또는(d)와 반응할 수 있는 반응성 성분 ; (f) 환원제 ; 및 (g) 전기화학발광성 - 반응 증진제, 단 염의 시료 조성물내 함유된 두 성분은 서로 반응성이어서 저장중에 의도하는 검정에서 그들의 기능을 손상시키기는 않는다.
  22. 하기 (a)-(c)를 포함하는, 결합반응 및 전기화학발광성 현상의 측정을 근거로한 검정을 위한 검정 시료 ; (a) 전해물 ; (b) 검정 조성물의 성분에 결합할 수 있는 표면을 갖는 다수의 자기적으로 반응성인 입자; 및 (c) 결합 성질을 갖는 라벨 물질, 상기 라벨 물질은 전기화학발광 성질을 갖는 화학적 부분을 포함한다.
  23. 하기 (a)-(b)로 구성되는 소미립자 -기재 결합 검정에서 사용하기 위한 시료를 함유하는 키트 : (a) 하기 (i)-(ⅶ) 로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 다른 단일 시료 및 자기적으로 반응성인 입자 : (i) 전해물 ; (ii) ECL 부분을 함유하는 라벨 화합물 ; (iii) 관심있는 분석물 또는 관심있는 분석물의 유사물 ; (ⅳ) 관심있는 분석물 또는 그의 유사물의 결합 파트너 ; (ⅴ) (iii) 또는 (ⅵ)와 반응할 수 있는 반응성 성분 ; (ⅵ) 환원제; 및 (ⅶ) 전기화학발광성-반응 증진제, 또는 (b) 하나 이상의 시료, 이중 적어도 하나는 자기적으로 반응성인 입자를 함유하며, 상기 시료는 상기 성분(i)-(ⅶ)로부터 선택된 성분을 함유하나; 단 상기 혼합된 시료중 둘 이상의 성분은 서로 반응하여 저장 조건하에 의도하는 검정에서 시료들의 기능을 손상하지는 않는다.
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