KR100221762B1 - 에모딘의 항암제로서의 용도 - Google Patents

에모딘의 항암제로서의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 1의 에모딘을 항암제로 사용하는 용도 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 에모딘을 항암제로 사용하는 용도와 이를 천연의 대황(Rhei Rhizoma)으로부터 용이하게 얻는 제조방법에 관한 것으로서, 에모딘이 포함된 대황 추출물은 효과적인 항암제로 널리 이용될 수 있다.

Description

에모딘의 함암제로서의 용도
제1도는 본 발명의 에모딘을 질량 스펙트럼으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
제2도는 본 발명의 에모딘을 양성자핵 자기 공명 스펙트럼으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
제3도는 본 발명의 에모딘을 탄소핵 자기 공명 스펙트럼으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
제4도는 본 발명의 에모딘이 아데노신 삼인산염에 대하여 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ의 활성을 경쟁적으로 억제하는 효과를 나타낸 것이다.
[발명의 목적]
본 발명은 하기 화학식 1의 에모딘을 항암제로 사용하는 용도 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 에모딘을 항암제로 사용하는 용도와 이를 천연의 대황(Rhei Rhizoma)으로부터 용이하게 얻는 제조방법에 관한 것으로서, 에모딘이 포함된 대황 추출물은 효과적인 항암제로 널리 이용될 수 있다.
[발명이 속하는 기술분야 및 그 분야의 종래기술]
인류는 암에 대한 도전을 계속해 오고 있다. 항암제 개발의 역사를 살펴보면, 지금까지는 암세포를 죽이는 물질의 개발에 주력해 왔다. 1954년 스트렙토마이세스(Streptomyces)속에서 분리된 L-아자세린(L-Azaserine)을 백혈병 치료에 사용한 이래, 미토마이신(mitomycin), 블레오마이신(bleomycin), 안트라마이신(anthramycin), 다우노마이신(daunomycin) 등이 개발되어 암치료에 이용되고 있는데, 이러한 항암제들은 세포를 죽이는 물질들로서, 암세포 뿐만 아니라 정상세포에도 독성을 나타내는 것으로 부작용이 심각하였다.
이와 같이 종래의 항암제들은 정상세포까지 죽이는 경우가 많았기 때문에, 최근에는 정상세포에는 작용하지 않고 암세포에만 작용할 수 있는 새로운 기전의 항암제에 대한 연구가 진행되고 있다.
최근에 암의 발생은 세포가 정상적으로 분화되지 못하고 이상적으로 증식을 계속하기 때문인 것으로 밝혀짐에 따라, 항암제의 개발도 종래의 암세포를 죽이는 방법에서 암세포의 분화를 촉진시키거나 세포주기를 조절하여 이상증식을 하고 있는 암세포의 증식을 억제시키는 방향으로 나아가고 있다.
진핵세포는 세포주기에 따라 증식한다. 진핵세포의 증식은 DNA 합성(Synthesis phase; S기)과 세포분열과정(Mitosis phase; M기)이 주기적으로 일어나는 것으로서, S기와 M기 사이에는 G1기와 G2기가 있으며, 진핵세포는 G1 SG2 M기의 주기를 차례로 돌며 증식하게 된다. 세포분열을 끝낸 세포는 다시 G1기로 들어가는데 이 G1기는 세포내 대사가 가장 활발한 시기로 대부분의 세포는 많은 시간을 G1기로 존재하게 된다.
정상세포는 G1기에서 외부에서 신호가 있으면 S기로 진입하며, G2기를 거쳐 세포분열을 일으켜 증식하고, 외부신호가 없으면 세포주기가 중단되어 G1기에서 오래 정지된 상태인 G0기로 존재한다.
반면 암세포는 외부신호와는 상관없이 즉, 외부신호가 없는 경우에도 세포주기를 따라 DNA 합성과 세포분열을 계속하면서 증식한다.
따라서 세포주기를 조절할 수 있다면, 세포주기를 중단시킴으로서 암세포의 증식을 억제할 수도 있는 것이다.
최근 일련의 연구를 통해 이러한 세포주기의 몇몇 지점을 조절하는 효소들이 밝혀졌는데 이들은 모두 단백질인산화 효소(Protein Kinase A, Kinase C, cdc2, Casein Kinase Ⅱ 등)이며 세포주기의 가장 낮은 단계에서 작용하는 효소는 cdc2 단백질인산화 효소이며 이 효소를 직접적으로 인산화하여 조절하는 단백질인산화 효소가 바로 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ이다.
DNA에 있는 유전정보를 단백질로 전환시키는 과정에서 필수적인 첫 단계로 유전자 발현이 조절되는 전사과정이다. 전사과정 그 자체나 조절은 유전자의 증진자(promter)나 강화자(enhancer)부위에 존재하는 선택성이 있는, 짧은 DNA 서열에 의해 조절된다. 이러한 서열은 유전자의 전사과정 속도에 영향을 미치는 전사조절인자로 알려진 특성 단백질이 결합함으로써 그 작용을 나타낸다. 따라서 이러한 전사 조절인자들에 대한 연구를 통해 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
전사 조절인자의 활성은 크게 3가지 방법에 의하여 변화된다. 첫 번째로 전사 조절인자를 인산화시키거나, 세포의 지지 단백질(anchor protein)을 인산화시켜 전사 조절인자를 세포질에 격리시킴으로써, 전사 조절인자의 작용점이 되는 DNA서열로의 접근을 방해하여 그 활성을 조절할 수 있다. 두 번째로, 핵내의 전사 조절인자들의 DNA 결합활성을 인산화를 통해 조절할 수 있다. 세 번째로는 인산화가 전사 조절인자의 전사 활성화 부위와 전사 기구와의 상호작용에 영향을 미쳐 전사과정을 조절할 수 있다. 인산화가 일어나면 정전기적 반발력뿐만 아니라 단백질의 형태가 변하기 때문에 단백질의 활성에 큰 영향을 준다.
최근의 연구에 의하면 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ가 세포성장을 조절하는 전사 조절인자를 인산화시켜 DNA 결합 활성을 변화시킨다는 많은 보고가 이다. 그 예로는 c-Myc(Luscher B. et al., EMBO J. 8, 1111-1119, 1989; Street A. J. et al., Curr. Top. Micro. Immunol. 166, 251-258, 1990), c-Myb(Luscher B. et al., Nature 344, 517-522, 1990), Max(Berberich S. J. and Cole M. D., Genes & Dev. 6, 166-176, 1992; Bousset K. et al., Oncogene, in press), c-Jun(Lin A. et al., Cell, 70, 777-789, 1992), SRF(Gauthier-Rouviere C. et al., EMBO J. 10, 2921-2930, 1992; Manak J.R. et al., Genes & Dev. 4, 955-967, 1990; Marais R.M. et al., EMBO J. 11, 97-105, 1992; Janknecht R. et al., EMBO J. 11, 1045-1054, 1992; Manak J.R. and Prywes R. Oncogene 8, 703-711, 1993) 등이 있다.
카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ는 진핵세포내에 널리 존재하는 세린/스레오닌 단백질인산화 효소로 두 개의소단위체(또는' 소단위체)와 두 개의소단위체로 구성된 효소로 세포의 성장과 증식과정을 조절하는 중요한 인자로서 많은 증거가 보여지고있다. 최근 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ에 대한 관심이 높아지고 있는데 이는 (1) 성장세포의 핵내에서 이 효소의 활성이 축적되어 있음이 보고되었고, (2) 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ가 핵내의 종양 단백질, 전사 조절인자를 포함하여 세포내 중요한 여러 단백질을 인산화하며, (3) 효모에서 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ의 활성을 제거하였을 때 세포가 죽는 것이 관찰되었고 (4)소단위체의 유전자는 종양 단백질인 것으로 제안되었기에 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
특히 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ는 세포성장이 정지해 있는 세포보다는 세포증식이 활발한 세포에서, 비종양 조직에서보다는 종양세포의 조직에서 그 활성이 급격하게 증가되어 있음을 관찰할 수 있다(Prowald K. et al., FEBS Lett 176, 479-483, 1984; Munstermann U. et al., Eur. J. Biochem. 189, 251-257, 1990). 또한 효모인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 연구에서 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ의 촉매 소단위체인소단위체를 코딩하는 CKA1 유전자'소단위체를 코딩하는 CKA2 유전자의 발현을 억제했을 경우 생존력을 상실하는데 여기에 초파리(Drosophila)의 기능적인소단위체를 코딩하는 cDNA를 도입시켰을 경우 생존력이 복구되는 것을 관찰하였다. 반면, 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ의 활성이 결핍된소단위체를 코딩하는 cDNA를 도입시켰을 경우에는 이러한 현상이 관찰되지 않았다. 즉 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ의 단백질인산화 활성은 생존하는데 반드시 필요하다는 것을 알 수 있고소단위체는 서로 다른 유기체들 간에서도 기능적으로 보존되어 있다는 것을 알 수 있다(Birnbaum M. J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 181, 524-528, 1991).
포유동물의 경우에서도 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ가 세포의 증식을 조절하는 신호전달 체계에서 매우 중요한 역할을 한다는 많은 보고가 있었다. 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ의,소단위체의 안티센스(antisense) 올리고 뉴클레오타이드를 일차 인간 상피세포(IMR-90)에 전처리하고 세포증식 촉진인자(mitogen)로 자극하였을 때 세포주기 중 S기로 들어가는 것이 지연되는 것을 관찰하였고(Pepperkok R. et al., Exp. Cell Res. 197, 245-253, 1991; Pyerin W. et al., Ann. NY Acad. Sci. 650, 295-298, 1992), 유사한 실험으로 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ의소단위체의 선택적인 단일 클론 항체를 넣어 주었을 경우 카제인 단백질인산화 효소 II의 핵으로의 전위를 방해함으로써 혈청에 의해 유도되는 세포증식을 억제한다는 실험 보고도 있다(Lorenz P. et al., Biol. J. Chem. 268, 2733-2739, 1993).
또한 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ는 세포주기 조절인자로 알려진 cdc2 단백질인산화 효소의 활성화를 인산화를 통해 조절하고, 세포성장에 필요한 유전자의 발현을 조절하는 전사조절 인자(transcriptiom factor)를 인산화시켜 그 활성을 조절한다. 따라서 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ의 활성을 선택적으로 조절하는 물질은, 정상세포와는 달리 급격하게 증식하고 있는 암세포에서 세포증식 촉진인자의 활성과 전사 조절인자의 활성을 조절함으로써 암치료에 이용될 수 있다.
여뀌과 식물인 대황(Rhei Rhizoma)은 예로부터 잘 알려진 약용식물로 한방에서 사하약, 고혈압 치료제, 해열 소염 진통제, 피부질환 치료제로 보이는 처방(삼황사심탕, 인진호탕, 소승기탕, 조위승기탕, 대황목단피탕 등)에 배합되어 왔다. 더 많은 응용으로는 위장관 출혈 치료제, 조경제, 건위제, 완하약으로 사용하기도 한다.
대황과 같은 여뀌과 식물에 주로 함유되어 있는 화합물인 에모딘은 1911년 대황뿌리에서 처음으로 분리되었으며(Tutin & Clewer, T.Chem. Soc. 99, 946, 1911), 1933년 턱갈매나무 껍질로부터 분리되었고(Bridedel & Caraux, Bull. Soc. Chim. Biol. 15, 648, 1933) 그 외에도 카스카라 사그라다(Cascara sagrada), 기타 다른 여뀌과 식물에서도 분리되었다 1923년에는 3,5-디니트로프탈릭 무수물(3,5-dinitrophthalic anhydride)과 m-크레졸(m-cresol)로부터 처음 합성되었다(Elder & Widmer, Helv. Chim. Acta. 6, 966, 1923).
본 발명자들은 세포주기와 전사 조절인자를 조절함으로서 암세포의 증식을 억제할 수 있는 새로운 기전의 항암제의 개발에 노력한 결과, 약용식물인 대황의 추출물이 뛰어난 항암 효과가 있음을 발견하였으며, 특히 세린/스레오닌 단백질인 산화 효소(serine/threonine kinase)인 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ의 강력한 억제제로 자궁암 세포(HeLa cells. ATCC CCL-2.)의 성장억제 작용이 있다는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 대황 추출물에서 뛰어난 항암 효과를 나타내는 성분이 기지의 안트라퀴논(anthraquinone)류 화합물인 에모딘임을 알아냄으로써 본 발명을 완성하였다.
[발명이 이루고자 하는 기술적 과제]
본 발명은 하기 화학식 1의 에모딘을 유효성분으로 하는 항암제용 약학적 조성물에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 에모딘의 세포주기 조절제, 특히 카제인 단백질 인산화 효소 Ⅱ의 저해제로서의 용도에 관한 것이다.
또한 본 발명은 대황 추출물을 유효 성분으로 하는 항암제용 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명은 대황 추출물의 제조방법에 관한 것으로서, 대황을 아세톤으로 추출한 후 다시, 에틸아세테이트와 물로 추출하여 제조한다.
또한 본 발명은 에모딘의 제조방법에 관한 것으로서, 대황 추출물을 크로마토그라피하여 제조한다.
[발명의 구성 및 작용]
본 발명은 대황을 적절한 용매로 추출하여 대황 추출물을 얻고 이 대황 추출물을 정제하여 에모딘을 제조하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로 대황 추출물은 대황을 아세톤으로 초음파 분해를 통해 추출하여 증류한 다음 이를 다시 물과 에틸 아세테이트로 추출하여 얻는다. 추출 분획들 중 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ에 대한 저해능을 측정하여 가장 높은 저해능을 나타낸 분획을 클로로포름-메탄올 혼합용매를 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그라피를 수행하여 활성 있는 분획을 분리한다. 이 물질을 톨루엔-에테르 혼합용매를 사용하여 박막 크로마토그라피를 행하여 전개시켜 에모딘을 분리하였다.
이 때, 클로로포름-메탄올 혼합용매는 클로로포름이 70％ 이상 90％ 이하인 것이 바람직하고, 80％인 것이 더욱 바람직하다.
또한 이 때 톨루엔-에테르 혼합용매는 톨루엔이 40％ 이상 60％ 이하인 것이 바람직하고, 50％인 것이 더욱 바람직하다.
상기 과정에서 얻은 물질을 가지고 질량 스펙트럼 양성자 핵자기 공명(1H-NMR) 스펙트럼 및 탄소 핵자기 공명(13C-NMR) 스펙트럼을 수행하고 이를 상기 화학식 1의 에모딘으로 확인한다.
또한 본 발명은 에모딘 및 에모딘을 함유하는 대황 추출물의 항암제로서의 용도에 관한 것이다.
대황 추출물 및 이 추출물로부터 분리된 에모딘의 항암제로서의 효과를 알아 보기 위하여, 다음과 같은 실험을 하였다.
카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ의 활성을 억제하는 효과를 조사하기 위하여 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ에 특이적으로 인산화되는 합성 펩타이드를 기질로 이용하여, 에모딘의 농도를 달리 하면서 에모딘이 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ의 활성을 억제하는 정도를 조사하였다. 이때 에모딘은 1.9μM에서 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ의 활성을 50％ 억제하는 것을 확인할 수 있다(표 1 참조).
또한 본 발명은 에모딘의 아데노신 삼인산염(ATP)에 대한 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ활성 억제효과를 조사하였다. 아데노신 삼인산염에 대한 효소동력학(Kinetics)실험 결과 에모딘이 아데노신 삼인산염에 대해 경쟁적으로 작용하여 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ를 저해한다는 것을 알 수 있다(도 4 참조).
또한 본 발명은 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ의 활성화를 억제하는 물질인 에모딘이 세포성장에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT 실험과 티미딘 도입율 실험을 수행하였다. MTT 실험 결과 에모딘이 세포성장을 억제하는 물질임을 확인할 수 있으며, 특히 10μM 농도에서 48시간 처리할 때 50％의 세포성장 억제 현상을 관찰할 수 있다(표 2, 표 3 및 표 4 참조). 티미딘 도입율 실험은 에모딘의 DMA 합성억제능을 알아보기 위한 것인데, 3.4μM 농도에서 50％의 DNA 합성 억제 현상을 관찰할 수 있다(표 5 참조).
따라서 에모딘은 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ의 활성을 저해함으로써 세포의 주기를 조절하여 세포증식을 억제함으로써 항암제로 작용한다는 것을 알 수 있다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예들은 본 발명을 구체적으로 예시하는 것으로서, 본 발명의 내용이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
대황 추출물의 제조
대황(Rhei Rhizoma)을 아세톤으로 1시간 동안 초음파 분해를 통해 추출하여 이를 증류한 다음, 이를 다시 에틸 아세테이트와 물로 추출하여 대황 추출물을 제조하였다.
[실시예 2]
대황 추출물에서 에모딘의 분리
대황의 에틸 아세테이트 분획에서 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ의 저해능을 지닌 물질을 찾기 위하여 실리카겔 박막 크로마토그라피를 클로로포름 : 메탄올=8 : 3(물로 포화)의 용매 조건에서 전개시켜 전개율(Rf값)에 따라 분리하고 각 분획을 메탄올로 추출하여 추출물질의 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ의 저해능을 검색하였고 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ에 대해 높은 저해능을 보여 주었던 분획을 실리카겔 칼럼을 이용하여 클로로포름 : 메탄올= 8.5 : 3(물로 포화시킴)의 용매 조건하에서 활성 있는 분획을 분리하였다. 이 물질을 박막 크로마토그라피로 톨루엔 : 에테르 = 1 : 1의 용매조성에서 전개시켜 분리하여 황갈색 분말인 에모딘을 얻었다. 정제된 에모딘을 질량 스펙트럼, 양성자 핵자기 공명(1H-NMR) 스펙트럼 및 탄소 핵자기 공명(13C-NMR) 스펙트럼을 수행하여 그의 구조를 확인하였다(도 1, 도 2 및 도 3 참조).
[실시예 3]
대황 추출물로부터 분리한 에모딘의 농도에 따른 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ의 활성 억제효과
카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ의 저해능을 측정하는 방법으로 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ에 특이적으로 인산화되는 합성 펩타이드를 기질로 이용한다. 래트(rat)의 간에서 분리하여 정제한 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ(Promega 제품)를 시료당 3U씩 효소로 사용하였다. 이 효소액과 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ의 특이적 기질로 알려진 Arg-Arg-Arg-Glu-Glu-Glu-Thr-Glu-Glu-Glu의 아미노산 서열을 지닌 펩타이드 600μM을 억제능을 측정하고자 하는 물질과 함께 인산화 효소 반응 완충액(25mM 트리스-염산 완충액(pH 7.4), 10mM 염화마그네슘, 200mM 염화나트륨, 100㎍/ml 소 혈청알부민, 100μM 아데노신 삼인산염(ATP), 2.5μCi[-32P] 아데노신 삼인산염]에 넣고 적량의 이차 증류수를 가하여 최종 부피가 50㎕가 되도록 부피를 조절하여 37℃에서 15분간 반응시킨다. 반응조를 얼음에 박아 반응을 정지시키고 반응액의 1/5부피를 P-81용지에 15초 간격으로 점적하여, 2％ 인산액에 넣어 10분씩 3회 수세하여 건조시킨 후 방사능을 액체 섬광 계수기(Liquid Scintillation Counterm Wallac 1409)를 이용하여 측정하였다. 실험결과 에모딘은 1.9μM에서 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ 활성을 50％ 억제하는 것을 확인하였다(표 1참조). 또한 아데노신 삼인산염(ATP)에 대한 효소동력학(Kinetics)실험 결과, 에모딘이 아데노신 삼인산염에 대해 상경적으로 작용하여 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ를 저해한다는 것을 알게 되었다(도 4참조).
실시예 1에서 분리한 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ의 활성을 억제하는 물질이 세포성장에 미치는 영향을 알아보기 위하여 하기 실시예 3 및 실시예 4의 실험을 행하였다.
[실시예 4]
MTT 실험
에모딘은 세포주기를 조절하는 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ의 활성을 억제하므로 암세포 배양상에서 상기 물질에 의해 세포 성장이 억제되는지를 알아보기 위하여 MTT 실험을 실시하였다.
여성의 자궁암 세포(HeLa cell. ATCC CCL-2.)를 웰(well)당 5×103개/180㎕가 되도록 96 웰 플레이트(well plate)에 희석하여 세포를 접종한 후에 37℃, 이산화탄소 가스 5％ 조건에서 24시간 배양하여 세포가 자랄 수 있는 환경을 제공한다. 그런 다음 에모딘을 농도별로 희석하여 시험관에 넣어 주고 24, 48 및 72시간동안 배양한 후 MTT 시약(5㎎/㎖)을 50㎕ 가한 상태에서 4시간 더 배양하였다. 4시간 후 상층액을 완전히 제거한 후 형성된 포마잔(formazan)을 200㎕ DMSO 용액을 넣어 용해시켜 UV 흡광도(MultiskanMCC/340)를 측정하였다. 그 측정 결과를 자궁암 세포의 배양시간에 따라 하기 표 2, 표 3 및 표 4에 나타내었다.
상기 표 2, 표 3 및 표 4에 나타난 바와 같이 에모딘은 세포성장을 억제하는 효능이 있음을 확인할 수 있었다. 특히 10μM 농도의 에모딘으로 48시간 처리하였을 때, 50％의 세포 성장 억제 현상을 관찰할 수 있었다.
[실시예 5]
티미딘 편입 실험
에모딘의 DNA 합성 억제능력을 알아보기 위하여 티미딘 도입율을 실시하였다.
자궁암 세포를 48시간 혈청 결핍에 의해 동조 배양시킨 후 상기 물질을 농도별로 투여하여 24시간에서 트리튬(3H)-티미딘 도입율을 측정하였다. 트리튬-티미딘을 처리한 자궁암 세포를 인산염 완충액 식염수(PBS)로 세척한 후 다시 인산염 완충액 식염수로 수확한 다음 500㎕의 메탄올로 5분 동안 세포를 고정시켰다. 5분후 메탄올을 제거하고 인산염 완충액 식염수로 세척한 후 10％ 트리클로로아세트산을 가하여 얼음 위에서 방치하였다. 0,2N의 수산화나트륨과 5％ SDS 용액을 가하여 37℃에서 30분간 방치하여 용해시킨 후 이 중 1/2용량의 액을 취하여 액체 섬광 계수기를 이용하여 DNA에 편입된 트리튬의 방사능을 측정하였다. 실험결과를 하기 표 5에 나타내었다.
상기 표 5에 나타난 바와 같이 3.4μM의 농도에서 50％의 DNA 합성 억제효과가 관찰되었다.
[실시예 6]
정제된 에모딘(Sigma 제품)의 농도에 따른 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ의 활성 억제효과
상기 실시예 1∼4의 결과에서 알 수 있는 바와 같이 대황으로부터 분리한 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ의 활성물질이 에모딘으로 확인됨에 따라, 에모딘의 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ의 활성 억제작용을 확인하기 위하여 정제된 에모딘(Sigma 제품)을 가지고 실시예 2의 단백질인산화 효소의 저해능을 측정하는 방법에 따라 실험하여, 에모딘의 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ의 저해능을 확인하였다.
상기 표 6에서 나타난 바와 같이 본 발명을 통하여 에모딘은 카제인 단백질 인산화 효소 Ⅱ의 활성을 저해함으로써 세포의 주기를 조절하여 세포증식을 억제함으로써 항암제로 작용한다는 것을 암세포 배양실험을 통하여 인지할 수 있다.
[발명의 효과]
본 발명의 대황 추출물 및 에모딘 화합물은 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ 저해제라는 새로운 개념의 항임제로서 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ를 강력하게 억제하여, 자궁암 세포(HeLa cells, ATCC CCL-2.)의 성장 억제에 매우 효과적이다.
또한 본 발명의 대황 추출물 및 에모딘 화합물은 천연에서 용이하게 얻을 수 있는 대황의 추출물로부터 분리되어 경제적이고, 암세포를 죽임으로써 인체에 독성을 나타내는 기존의 항암제와는 달리 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ의 활성을 억제하여 세포주기를 조절하는 작용에 의해 항암효과를 나타내므로 인체에 대한 부작용을 최소한으로 억제할 수 있다.

Claims (2)

  1. 에모딘을 유효성분으로 하는 카제인 단백질인산화 효소 Ⅱ의 저해제.
  2. 대황(Rhei Rhizoma)을 아세톤으로 추출하여 증류하고 다시 물과 에틸아세테이트로 추출하여 대황 추출물을 얻은 다음 이를 크로마토그라피하여 화학식 1의 화합물인 에모딘을 제조하는 방법.
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