KR100221124B1 - 신규한 카제인 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 종래의 베타-카제인 A2변이체의 아미노산 서열과 비교하여 볼 때, 25번째 아르기닌(Arg)이 시스테인(Cys)으로, 88번째 루신(Leu)이 이소루신(Ile)으로, 117번째 글루타민(Gln)이 글루탐산(Glu)으로, 175번째 글루탐산(Glu)이 글루타민(Gln)으로, 195번째 글루타민(Gln)이 글루탐산(Glu)으로 각각 치환된 새로운 서열을 갖는 카제인에 관한 것이다. 본 발명의 카제인은 그것의 소화관내 무기 이온의 가용화 능력과 관련하여 생체 내에서 무기 이온의 흡수이용률을 높이기 때문에 우유 및 분유를 비롯한 각종 유제품에 첨가될 수 있으며, 특히 골다공증이나 빈혈과 같은 무기 이온의 결핍으로 유발되는 질병에 대한 예방과 치료용 식품 첨가제 및 치석방지 조성물의 첨가제로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 신규한 카제인 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 생체 소화관내에서 칼슘의 가용성을 증대시키는 새로운 카제인 및 그 제조방법에 관한 것이다.
일반적으로 미네랄 성분이 생체 내에서 흡수되기 위해서는 가용성 상태로 소장관내에 존재하는 것이 필수적 조건이다. 그러나, 소장관내에서는 pH가 중성에서 알카리성으로 바뀌기 때문에 미네랄이 침전, 불용화되는 환경이 된다. 칼슘의 경우 소장 내에서 이동할 때 pH가 상승하면 가용성의 비율이 감소하게 되는데, 카제인을 섭취하였을 때는 가용성 칼슘의 비율이 유의할 정도로 높아진다.
칼슘은 소장 상부에서는 능동수송으로, 하부에서는 농도 균배에 의해 수동수송되며, 그 흡수는 비타민 D 및 유당에 의하여 촉진된다. 소장의 각 부위에서의 흡수율은 소장 상부의 십이지장에서 가장 높지만 체류시간이 짧기 때문에 흡수량이 많지는 않으며, 흡수 총량이 가장 많은 부위는 소장 하부의 회장으로서 랫트(rat)의 경우 전체 흡수량의 62 내지 88%에 달하고 사람의 경우 회장을 절제하면 칼슘의 흡수량이 현저하게 감소되므로, 회장이 칼슘의 흡수에 중요한 부위임을 알 수 있다. 칼슘의 가용화에 기여하는 성분으로서 인산기를 포함하고 있는 CPP와 그것을 포함하는 카제인이 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다(佐藤隆一郞 등, "乳製品の Ca吸收に寄與するカゼインホスホペプチド", 化學と生物, Vol. 23, No. 7, p. 418, (1985)).
영양소의 과잉 섭취가 문제로 되고 있는 현대의 식생활에서 미네랄 특히 칼슘과 철의 결핍이 더 큰 문제로 대두되고 있다. 이 대책으로 식품에 미네랄을 강화하는 방법은 오히려 타 미네랄의 이용성을 저해할 우려가 있으며, 따라서 미네랄의 섭취량을 늘리지 않고 미네랄의 흡수효율을 높이는 방법이 필요하다. 이러한 관점에서, 카제인은 아주 중요한 물질로 인식되고 있다.
본 발명자들은 베타-카제인 및 그것의 기능에 관한 연구를 거듭한 결과, 새로운 서열을 갖는 카제인 포스포펩티드(CPP)와 그것을 포함하는 카제인에 관한 발명을 완성하여 1995. 3. 23. 자로 특허출원을 한 바있다(특허출원 제 95-6259).
계속해서 본 발명자들은 종래 카제인의 서열과 새로운 서열을 갖는 카제인 포스포펩티드 및 그 카제인에 관한 연구를 더욱 발전시켜, 종래의 카제인과는 아미노산 서열을 달리하는 새로운 카제인의 아미노산 서열을 완전히 밝히고 그 카제인이 동물의 소화관 내에서 무기 이온을 가용화시키는 능력이 있음을 확인함으로써 본 발명에 도달하였다.
카제인은 우유나 모유와 같은 유즙에 존재하는 단백질로서 α
β,κ형이 있고, 이 중에서 베타 카제인은 다시 A1, A2, A3, B, C 및 D의 변이체가 있으며, 그 일차구조가 보고되어 있다(W. N. Eigel, et al., Nomenclature of Proteins of Cow's Milk(5th Revision), J. Dairy Sci. Vol. 67, No. 8, p. 1604(1984)).
대표적인 베타-카제인 A2변이체의 아미노산 서열은 다음과 같다.
Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-
Glu-Ile-Val-Glu-Ser-Leu-Ser-Ser-Ser-Glu-
Glu-Ser-Ile-Thr-Arg-Ile-Asn-Lys-Lys-Ile-
Glu-Lys-Phe-Gln-Ser-Glu-Glu-Gln-Gln-Gln-
Thr-Glu-Asp-Glu-Leu-Gln-Asp-Lys-Ile-His-
Pro-Phe-Ala-Gln-Thr-Gln-Ser-Leu-Val-Tyr-
Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asp-Ser-Leu-
Pro-Gln-Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-
Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-
Glu-Val-Met-Gly-Val-Ser-Lys-Val-Lys-Glu-
Ala-Met-Ala-Pro-Lys-His-Lys-Glu-Met-Pro-
Phe-Pro-Lys-Tyr-Pro-Val-Gln-Pro-Phe-Thr-
Glu-Ser-Gln-Ser-Leu-Thr-Leu-Thr-Asp-Val-
Glu-Asp-Leu-His-Leu-Pro-Pro-Leu-Leu-Leu-
Gln-Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-
Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-
Ser-Val-Leu-Ser-Leu-Ser-Gln-Ser-Lys-Val-
Leu-Pro-Val-Pro-Glu-Lys-Ala-Val-Pro-Tyr-
Pro-Gln-Arg-Asp-Met-Pro-Ile-Gln-Ala-Phe-
Leu-Leu-Tyr-Gln-Gln-Pro-Val-Leu-Gly-Pro-
Val-Arg-Gly-Pro-Phe-Pro-Ile-Ile-Val
한편, 카제인 변이체 중에서, A1변이체는 상기 서열중에서 67번째 프롤린(Pro)이 히스티딘(His)으로 치환되어 있으며, A3변이체는 106번째 히스티딘(His)이 글루타민(Gln)으로 치환되어 있다.
본 발명의 목적은 새로운 서열을 갖는 카제인으로서, 소화관내 무기 이온의 가용화 능력이 높은 카제인을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 새로운 서열을 갖는 카제인을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 신규 카제인 변이체를 분석한 전기영동사진.
도 2는 본 발명의 신규 카제인을 정제한 크로마토그라피의 분석도.
도 3은 본 발명의 신규 카제인을 코드하는 DNA의 서열도.
상기와 같은 본 발명의 목적은, 하기 서열의 카제인에 의해 달성될 수 있다.
Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-
Glu-Ile-Val-Glu-(p)Ser-Leu-(p)Ser-(p)Ser-(p)Ser-Glu-
Glu-Ser-Ile-Thr-Cys-Ile-Asn-Lys-Lys-Ile-
Glu-Lys-Phe-Gln-Ser-Glu-Glu-Gln-Gln-Gln-
Thr-Glu-Asp-Glu-Leu-Gln-Asp-Lys-Ile-His-
Pro-Phe-Ala-Gln-Thr-Gln-Ser-Leu-Val-Tyr-
Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asp-Ser-Leu-
Pro-Gln-Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-
Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Ile-Gln-Pro-
Glu-Val-Met-Gly-Val-Ser-Lys-Val-Lys-Glu-
Ala-Met-Ala-Pro-Lys-His-Lys-Glu-Met-Pro-
Phe-Pro-Lys-Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe-Thr-
Glu-Ser-Gln-Ser-Leu-Thr-Leu-Thr-Asp-Val-
Glu-Asp-Leu-His-Leu-Pro-Pro-Leu-Leu-Leu-
Gln-Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-
Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-
Ser-Val-Leu-Ser-Leu-Ser-Gln-Ser-Lys-Val-
Leu-Pro-Val-Pro-Gln-Lys-Ala-Val-Pro-Tyr-
Pro-Gln-Arg-Asp-Met-Pro-Ile-Gln-Ala-Phe-
Leu-Leu-Tyr-Gln-Glu-Pro-Val-Leu-Gly-Pro-
Val-Arg-Gly-Pro-Phe-Pro-Ile-Ile-Val
상기 서열에서 (p)Ser은 포스포세린(phosphorylated serine)을 나타낸다.
본 발명에 따른 카제인의 상기 아미노산 서열은 종래의 베타-카제인 A2변이체의 아미노산 서열과 비교하여 볼 때, 25번째 아르기닌(Arg)이 시스테인(Cys)으로, 88번째 루신(Leu)이 이소루신(Ile)으로, 117번째 글루타민(Gln)이 글루탐산(Glu)으로, 175번째 글루탐산(Glu)이 글루타민(Gln)으로, 195번째 글루타민(Gln)이 글루탐산(Glu)으로 각각 치환되어 있다. 또한 22번째 세린은 인산화될 수도 있다. 포스포세린은 칼슘과 철과 같은 무기 이온의 가용화에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
단백질은 칼슘, 철 등과 같은 미네랄과 각종 형태의 결합을 하는 성질이 있다. 이것은 아미노산의 종류, 서열 및 단백질의 2차, 3차의 고차구조에 따라 크게 영향을 받는다고 하였다(內藤博, "カゼインの消化時生成するホスホペプチドのカルシウム吸收促進機構," 日本營養.食糧學會誌, Vol. 39, No. 6, p. 433, (1986)).
따라서 본 발명에 의한 카제인은 아미노산의 종류, 서열 및 고차구조로 볼 때 칼슘의 가용화 능력이 기존의 것보다 우세하여 소장관내에서 칼슘의 흡수를 증가시킬 수 있으며, 이와 같은 효능이 실험적으로 입증되었다.
특히, 세 개의 15 번째와, 17, 18 및 19 번째 포스포세린이 연속된 후 2개의 Glu 잔기가 연결되는 강한 음이온성 영역이 칼슘에 대해 활성을 나타낸다. 즉, N말단으로부터 25번째 Cys잔기에 의해 인접한 카제인과 이량체(dimer)를 형성하거나, 카제인의 소화에 의해 형성된 펩티드(CPP)가 이량체를 형성한다. 이량체의 형성으로 활성부위가 안정화되기 때문에 결과적으로 카제인 또는 펩티드의 안정성이 향상되므로 종래의 CPP보다 우수한 미네랄 가용화 능력을 나타낸다.
카제인은 여러 종류의 변이체가 있으나, 우유를 분비하는 동물(소)은 유전적으로 한 종류의 카제인 변이체를 함유하는 우유를 생산한다. 따라서, 우유를 분비하는 동물의 체액(우유, 혈액, 또는 정액 등)이나 조직으로부터 DNA를 채취하여 염기 서열을 분석하거나, 우유를 채취하여 카제인을 정제한 후 전기영동함으로써 그 동물이 어떤 변이체의 카제인을 생산하는지 판단할 수 있다.
이와 같이 본 발명에 따른 카제인을 분비하는 개체를 확인한 후 그 개체에서 수집한 우유로부터 카제인을 분리함으로써 본 발명에 따른 카제인을 얻을 수 있다.
즉, 우유를 전기영동하여 본 발명의 카제인 변이체를 확인하고, 이렇게 확인된 우유에 산 또는 렌넷을 첨가하여 침전시킨 후, 크로마토그라피하여 본 발명의 카제인을 제조할 수 있다. 본 발명의 방법에서 크로마토그라피는 음이온 교환 크로마토그라피 및 양이온 교환 크로마토그라피를 연속적으로 수행하는 것이 바람직하며, 이 과정을 통하여 본 발명의 순수한 카제인이 얻어진다.
우유에서 카제인을 제조하는 방법은 널리 공지되어 있다. 고돈 등은 우유의 지방을 제거한 후, 염산을 첨가함으로써 용액의 pH를 4.6 으로 조절하여 카제인을 침전시키고, 침전된 카제인을 원심분리한 후 탈수, 동결건조하는 방법을 제안하였다(W. G. Gordon et al, Fundamentals of Diary Chemistry, 2th ed., AVI Publishing Co. (1974)). 또한 염산 대신에 스트렙토코커스 락티스가 생산하는 락트산을 첨가하여 침전시키는 방법(J. R. Spellacy, Casein, Dried and Condensed Whey, Lithotype Process Co. (1953)), 렌넷(rennet)을 첨가하여 침전시키는 방법(K. K. Fox, Byproducts from Milk, 2th ed., AVI Publishing Co. (1970)) 등이 공지되어 있다.
본 발명의 카제인을 대량 생산하기 위해서는 본 발명의 카제인 유전자를 가진 소의 유즙을 대량 생산하게 하는 것이 필요하다. 이를 달성하기 위해서, 본 발명의 카제인의 유전자를 가진 소(예컨대 숫소)를 선별하고, 이 소와 비유량이 많은 소(예컨대 암소)를 교배하여 자손을 얻은 후, 본 발명의 카제인 유전자를 가진 암소를 선별하고, 선별된 암소로부터 우유를 채취하고, 상기 우유로부터 앞에서 설명한 방법에 의하여 본 발명의 카제인을 생산할 수 있다.
본 발명의 다른 양상으로, 전기영동을 하거나 DNA를 분석함으로써 본 발명의 카제인을 생산하는 소를 선별할 수 있다. 즉, 우유를 분비하는 암소의 경우에는 그 소의 우유를 채취하여 전기영동을 함으로써 본 발명의 카제인을 함유하는지 판단할 수 있다. 이 경우에, 공지의 카제인에 대한 전기영동의 패턴은 보고되어 있으며(W. N. EIGEL, Nomenclature of Proteins of Cow's Milk; Fifth Revision, RESEARCH PAPERS, 1607-1608), 이들 패턴과 본 발명의 도 1을 참조하여 본 발명의 카제인을 확인할 수 있다.
또한, 우유를 생산하지 않는 소(숫소, 미경산 암소, 송아지 등)에 있어서는 우유를 분리할 수 없으므로, 동물의 혈액이나 정액 또는 조직과 같이 DNA를 포함하는 시료를 분리하고, 시료에서 DNA를 분리한 후 그 서열을 분석함으로써 본 발명의 아미노산 서열과 대응되는지를 판단한다. 따라서, 대응되는 서열이 확인되면 본 발명에 따른 카제인을 생산하는 소로 확인할 수 있다.
한편, 카제인으로서 25번째 아미노산이 시스테인으로 치환된 카제인은 본 발명에 따른 아미노산 서열을 갖는 것으로 확인되었다. 따라서, 카제인의 25번째 아미노산을 분석하여 Cys로 치환되어 있는지를 판단함으로써 그 동물이 본 발명에 따른 카제인을 분비하는지 선별할 수 있다.
시료의 DNA와 본 발명의 아미노산 서열이 대응되는지 판단하는 방법으로, 시료의 카제인에 관한 DNA 서열을 시팍싱하여 전체 서열을 본 발명의 아미노산 서열과 비교할 수도 있고, PCR에 의해 얻어진 펩티드에 Nis I 효소를 가하여 N말단으로부터 25번째 아미노산이 분해되는 펩티드는 본 발명의 카제인으로, 분해되지 않는 펩티드는 본 발명의 카제인이 아닌 것으로 판단함으로써 본 발명의 카제인을 확인할 수 있다.
이와 같이 전기영동 또는 DNA 분석에 의해 본 발명에 따른 카제인을 분비하는 것으로 확인된 숫소와 비유량이 많은 암소(예컨대, 홀스타인 종)을 교배하고, 얻어진 자손중에서 본 발명의 카제인을 분비하는 소를 선별함으로써 본 발명의 카제인을 대량으로 분비하는 소를 얻을 수 있다.
이하 실시예에 의거하여 본 발명을 상세히 설명한다.
실시예 1: 본 발명에 따른 신규 카제인의 분리
다양한 종류의 소에서 각각 10ml의 우유를 채취하여 5,000RPM에서 20분간 원심분리하여 상층의 지방을 제거한후, 증류수에 100ml의 아세트산와 50ml의 포름산(pH 1.5)를 희석한 산성완충액을 전분 젤용과 전극용으로 사용하였으며 가수분해 전분(Connought Medical Research Lab.)을 젤로 사용하였다. 지방 제거한 우유를 전분 젤에 삽입 후 150Volt의 정전압에서 12시간동안 전기영동하고 10%의 니그로신용액에서 30분간 염색한후 50% 메탄올 용액으로 5시간동안 탈색하여 본 발명의 신규 카제인형을 검출하였다. 그 결과는 도 1에 나타낸다.
이중에서 본 발명의 카제인을 포함하는 우유을 채취하여 지방성분을 제거한 후 카제인 단백질을 침전시켜 동결건조하였다. 본 발명의 카제인 성분을 정제하기 위하여 10g의 카제인을 20mM 이미다졸-HCl(pH 7.0)완충액을 사용하는 음이온 교환 크로마토그라피(칼럼은 Pharmarcia사의 Mono Q 5/5)에 의해 본 발명의 베타 카제인만을 정제하였다(제 2a 도 참조). 이어서, 얻어진 50mM 아세트산 나트륨(pH 5.0)완충액을 사용하는 양이온 교환 크로마토그라피(칼럼은 Pharmacia사의 Mono S 5/5)에 의해 신규 카제인 단백질을 얻었다(제 2b 도 참조). 상기 양이온 교환 크로마토그라피를 다시 반복하여 본 발명의 신규 카제인 단백질 1.5g을 정제하였다(제 2c 도 참조).
실시예 2: 본 발명에 따른 신규 카제인의 화학적 특성분석
실시예 1에서 정제된 신규 베타 카제인의 화학적 특성을 분석하기 위하여 6N 트립신에 의한 가수분해 후 HPLC에 의해 펩티드를 정제하였다. 이어서, 정제된 펩티드를 오토매틱 프로테인 시팍서(Applied Biosystem)에 의해 아미노산 서열을 분석하였다. 얻어진 아미노산 서열에 의하여 본 발명의 신규한 카제인의 아미노산 서열이 확립되었다.
실시예 3: 신규 카제인의 대량 생산
본 발명에 의한 신규 카제인은 비유량이 적은 한우에서 특이적으로 발현되는 형질로서 본 발명의 신규 CPP 및 그것을 포함하는 카제인을 함유한 우유의 생산량을 높이기 위하여 우유의 생산량이 높은 홀스타인과 같은 유용종의 소에 한우 특유의 신규 카제인 유전자를 도입, 발현함으로서 본 발명의 상업적 이용성을 증대시키기 위한 목적으로 다음과 같은 교배실험을 하였다.
실시예 1의 방법으로 본 발명의 카제인을 분비하는 것으로 확인된 한우의 혈액을 채취하여 PCR에 의해 한우의 DNA를 증폭하여 DNA서열을 분석하였다. 이 중 본 발명의 카제인의 유전자(A1H)을 소유한 숫소를 선발하여 5 마리의 홀스타인 암소(A1A1형 2 마리, A1A2형 2 마리, A2A2형 1 마리)와 자연교배 또는 인공수정의 방법으로 교배하여 5두의 송아지(숫 2, 암 3두)를 생산하였다. 생산된 송아지중 암 송아지(A1H) 1 두와 숫 송아지(A2H) 1두가 각각 이형접합체(Heterozygote)로서 본 발명의 카제인을 소유하고 있었다.
상기, 본 발명의 카제인 A1H형인 자손 1 대(F1)을 28개월간 사육한 후 우유를 채취한 결과 1 일 평균 4.5Kg의 신규 카제인을 함유한 우유를 생산하여 종래의 소 1.5Kg에 비하여 3배의 양을 생산하는 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 따른 카제인의 유전형을 갖는 23 가계(family)에 대하여 3대에 걸쳐 유전양식을 조사한 결과, 본 발명의 서열을 갖는 카제인의 유전형을 지배하는 유전자는 공우성으로 유전되는 것으로 확인되었다.
실시예 4: DNA 분석
본 발명의 카제인을 분비하는 한우로부터 20ml의 혈액을 채혈하여 샘브룩(Sambrook 등, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989))의 방법에 의해 DNA를 정제하였다. 본 발명의 카제인 유전자의 CPP 부분 중 아미노산이 치환된 부분을 포함하는 DNA절편을 증폭하기 위하여 보싱(Bonsing 등, Complete nucleotide sequence of the bovine beta-casein gene, Aust, J. Biol. Sci., vol. 41, p. 527, (1988))이 보고한 유전자 배열을 참고로 하여 프라이머(primer)를 제작하였으며 프라이머의 배열은 다음과 같다.
| Primer 5'- CAACAGCCTTATTCAGAAGAGTGG 3'- CAGTGGGATGACAGAAAGTAGTCGTATAGG |
PCR 반응(polymerase chain reaction)에 의해 각각의 DNA 절편을 증폭하기 위해서는 다음에 제시된 조성으로 시료를 혼합한 후 94℃에서 5분간 처리하여 DNA를 변성시킨 후 94℃에서 60초, 57℃에서 60초, 72℃에서 60초의 PCR 사이클을 30회 수행하였다. 반응이 완료된 후 마지막 연장시간(extension time)을 5분간 연장하여 증폭된 DNA절편들이 이중나선을 형성시킨 후, Nis 효소처리를하여 아가로스 전기영동에 의하여 효소에 의해 절단된 본 발명의 카제인과 절단되지 않은 기타의 형으로 분류하였다.
PCR반응액의 조성
| DNA | 5㎕(0.5ug) |
| 프라이머(primer) | 0.5ul each(100pmol/㎕) |
| dNTP | 5㎕ |
| 10X 완충액 | 5㎕ |
| Taq 폴리머라제 | 1㎕(1unit) |
| 증류수 | 33㎕ |
또한, 증폭된 DNA를 정제하기 위하여 2%의 아가로스(Gibco사)로 전기영동하여 증폭된 DNA를 정제하였다． 자동 DNA 분석기(Automatic DNA Sequencer, Applied Bio System사)에 의해CPP의 치환된 부분에 대한 DNA 배열을 분석한 결과는 다음과 같다. 그 분석도는 제 3 도로 표시한다.
intron 4 exon 5
TTTTTTAAAGCTAGACCTGATTTTATTTTTATTTTTCCAAAG GAA TCT ATT
Glu Ser Ile
Nis I 절단위치
↓ intron 5
ACA TGC ATC AAT AAG GTAAAACCCCTCATATTTAAATGTACATTTTTTTAA
Thr Cys Ile Asn Lys
ATTTCATGTTTGATTTTTATAAACAGCATTTATTTATGTATTTTTTTTTTAACCAG
exon 6
AAA ATT GAG AAG TTT CAG AGT GAG GAA CAG CAG CAA
Lys Ile Glu Lys Phe Gln Ser Glu Glu Gln Gln Gln
즉, 엑손(exon) 5의 13번째 염기가 시토신(C)에서 티민(T)으로 치환됨으로써, 아미노산이 Arg에서 Cys으로 치환되었음이 증명되었다.
실시예 5: 칼슘의 가용화에 대한 생체내 실험
평균 체중 120g의 위스터(Wister)계통의 랫트를 이용하여 분석을 실시하였으며 일주일간 합성된 사료(조단백 24%, 전분 60%, 조지방 5%, 조섬유 5%, 무기물 5%, 미타민 1%)를 급여한 후 24시간 절식시켰다.
이들 랫트를 1군당 10마리씩 각각 2개의 군으로 분리하여 1.5시간 동안 1군에는 신규 카제인이 2군에는 기존의 카제인이 각각 10중량% 함유한 합성된 사료를 자유급식하였으며, 급식 종료 1시간 후에 마취된 랫트의 소장을 추출하여 냉각된 식염수로 세척한 후 상층과 하층을 분리하였다.
이어서 소장관내의 내용물을 분리하여 균질화시킨 후, 원심분리하여 상층의 칼슘을 원자흡광분석기(Atomic Absorbtion Spectrometer, Perkin Elmer사)로 3회 측정하였다. 결과를 하기 표 1 에 표시한다.
표 2 : 소장내 가용성 칼슘의 양
| 신규 카제인 (제 1 군) | 기존 카제인 (제 2 군) | 증가비율 (%) | |
| 소장 상부 | 16.25±1.8 | 15.49±1.7 | 4.9 |
| 소장 하부 | 42.23±2.5 | 35.11±2.3 | 20.2 |
* 10수의 랫트에 대한 평균 ppm치 ± 표준편차
상기 표 1 에서 보는 바와 같이, 신규 카제인을 급식한 제 1 군 랫트의 소장관내 가용화 칼슘량은 소장 상부에서 16.25, 소장 하부에서 42.25ppm(평균)이고, 기존의 카제인을 급식한 제 2 군 랫트의 소장관내 칼슘의 양은 소장 상부에서 15.49, 소장 하부에서 35.11ppm(평균)으로 나타났다.
특히 가용화 칼슘의 80%정도가 흡수되는 소장하부에서의 가용화 칼슘량은 제 1 군이 42.23ppm이고 제 2 군이 35.11ppm으로 약 20.2%의 향상을 나타냈다.
이와 같이 칼슘의 대부분이 흡수되는 부위인 소장 하부에서의 칼슘 가용화 기능이 크게 향상되므로, 본 발명에 따른 카제인은 실질적인 칼슘 흡수율의 향상을 가져올 수 있다.
카제인은 그것의 칼슘 가용화 능력과 관련하여 다양한 용도가 제안되었다. 일본 특허 공고 제 91-079979호(1991. 12. 20. 공고)는 CPP를 함유하는 식품 및 음료를 제시하고 있으며, 미국 특허 제 5,015,628호는 치석 방지 조성물로서의 용도를 개시하고 있다.
또한, 렌넷(rennet)처리된 카제인 분해물을 원료로 한 식품첨가제, 약품 및 화장품의 원료로 사용한 예(WO9200017), 트립신과 서브틸리신(subtilisin) 등의 효소처리된 분해물을 피부 및 모발화장품의 원료로 사용한 예(JO1269499), CPP를 함유한 사료를 돼지에 급여하여 칼슘과 철분의 흡수를 촉진시킨 예(FR2674102) 등도 알려져 있다.
본 발명의 카제인은 기존의 것보다 칼슘의 가용화 능력이 훨씬 강력하기 때문에 상기 공지된 용도에 모두 사용되어 기존의 카제인보다 더 강력한 효과를 발휘할 수 있다.
따라서, 본 발명의 카제인은 분유, 우유, 치즈, 요구르트(호상, 액상 또는 프리징 타입), 이유식, 기능성 음료(숙취제거 또는 무기염류(Fe) 공급 등의 기능을 갖는 음료), 등장성 이온음료, 아이스크림, 제과, 제빵, 껌, 두부(연두부), 두유, 사탕, 유과, 카라멜, 초콜릿, 천연 또는 합성 쥬스, 분말차, 어묵 또는 마요네즈 등 음식료품의 첨가제, 미네랄 부족으로 인한 질병의 예방 및 치료의 첨가제, 치석 방지 조성물, 기타 건강식품의 첨가제로 널리 활용될 수 있다. 특히, 본 발명은 소에서 착유한 자연상태로 본 발명의 고 기능 카제인을 함유한 우유를 제공할 수 있으며, 유아용, 임산부용, 노인용 및 기타 무기 이온과 관련된 질병의 예방 및 치료용으로 사용될 수 있다.
본 발명의 카제인은 그 단독으로도 탁월한 효과를 발휘하지만, 가용화된 미네랄(칼슘)의 흡수를 도와주는 비타민 D 및 유당과 혼합하여 사용함으로써 더욱 뛰어난 미네랄 흡수의 효과를 얻을 수 있다. 특히, 유당의 소화기능이 약한 유아에게는 유당을 제거한 조제유를 주지 않으면 안된다. 이와 같은 인공유의 제조에는 칼슘을 흡수 촉진시키는 카제인을 첨가하여야 하며, 본 발명의 카제인은 이러한 용도로서 매우 유용하다.
이상에서 바람직한 실시예에 의거하여 본 발명을 상세히 설명하였으나, 본 발명의 범위내에서 이 분야의 전문가에게 자명한 치환, 변형, 변경은 모두 본 발명의 범위에 속하는 것으로 이해되어야 한다.
Claims (3)
- 하기 아미노산 서열을 갖는 신규한 카제인:Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-(p)Ser-Leu-(p)Ser-(p)Ser-(p)Ser-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Cys-Ile-Asn-Lys-Lys-Ile-Glu-Lys-Phe-Gln-Ser-Glu-Glu-Gln-Gln-Gln-Thr-Glu-Asp-Glu-Leu-Gln-Asp-Lys-Ile-His-Pro-Phe-Ala-Gln-Thr-Gln-Ser-Leu-Val-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asp-Ser-Leu-Pro-Gln-Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Ile-Gln-Pro-Glu-Val-Met-Gly-Val-Ser-Lys-Val-Lys-Glu-Ala-Met-Ala-Pro-Lys-His-Lys-Glu-Met-Pro-Phe-Pro-Lys-Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe-Thr-Glu-Ser-Gln-Ser-Leu-Thr-Leu-Thr-Asp-Val-Glu-Asp-Leu-His-Leu-Pro-Pro-Leu-Leu-Leu-Gln-Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu-Ser-Leu-Ser-Gln-Ser-Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln-Lys-Ala-Val-Pro-Tyr-Pro-Gln-Arg-Asp-Met-Pro-Ile-Gln-Ala-Phe-Leu-Leu-Tyr-Gln-Glu-Pro-Val-Leu-Gly-Pro-Val-Arg-Gly-Pro-Phe-Pro-Ile-Ile-Val상기 아미노산 서열에서 (p)Ser은 포스포세린(phosphorylated serine)을 나타낸다.
- 소에서 DNA를 포함하는 시료를 채취하여 DNA를 분리하고, 그 서열을 분석하여 제 1 항의 아미노산 서열과 대응되는지를 판단함으로써, 제 1 항의 카제인형 유전자를 가진 암소를 선별하고,상기 소와 비유량이 많은 소를 교배하여 자손을 얻은 후, 제 1 항의 카제인형 유전자를 가진 암소를 선별하고,상기 제 1 항의 카제인형의 유전자를 가진 자손 암소의 우유를 채취하고,상기 우유에 산 또는 렌넷을 첨가하여 카제인을 침전시킨 후 이를 회수하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 제 1 항의 아미노산 서열을 갖는 카제인의 제조방법.
- 소에서 DNA를 포함하는 시료를 채취하고,상기 채취된 시료에서 DNA를 분리하고,상기 DNA의 서열을 분석하여 제 1 항의 아미노산 서열과 대응되는지를 판단하는 것을 특징으로 하는 제 1 항의 카제인을 생산하는 소를 선별하는 방법.
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