KR100209072B1 - 숙신이미드함유 중합체로 생물학적 활성 시약을 제조하는 방법, 분석 요소 및 이것의 사용방법 - Google Patents

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캘빈 섯톤 리차드
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알프레드 피. 로렌조우
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Abstract

본 발명은 활성이 매우 큰 숙신이미독시 그룹을 갖는 공중합체 입자로부터 생물학적 활성 시약을 제조하는 방법에 관한 것이다. 생물학적 활성 물질, 예를 들어 항체를 입자 표면상에 있는 활성이 매우 큰 숙신이미드 그룹의 치환에 의해 아미드 그룹으로써 입자에 직접 또는 간접적으로 공유결합시키므로써 상기 시약을 제조한다. 이들 시약은 분석 요소, 특이적 결합 리간드(예를 들어 면역학적 종)의 검출방법, 면역분석법 및 친화 크로마토그래피 같은 정제방법에 유리하게 사용된다.

Description

숙신이미드함유 중합체로 생물학적 활성 시약을 제조하는 방법, 분석 요소 및 이것의 사용방법
본 발명은 중합체 입자를 사용해 생물학적 활성 시약을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 생물학적 활성 시약을 함유하고 있는 분석 요소(analytical elements) 및 이것을 사용한 특이적 결합 물질의 분석방법 및 면역분석법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 시약을 사용한 분석적 정제방법에 관한 것이다. 본 발명은 여러 가지 임상목적, 진단목적, 의학 및 연구목적으로 사용될 수 있다.
의학적인 실행과 연구 및 분석과 진단 과정에서 생물학적 액체같은 여러 액체내에 존재하는 화학적 및 생물학적 물질을 빠르고 정확하게 측정하는 것이 필요하다. 반응물중 최소한 하나가 고체 기판상에 고정화되어 있는 반응물들을 사용하므로써 특이적 결합반응에 의한 방법이 제공된다. 이 방법으로써 일반적으로 수용성의 반응하지 않은 물질을 수불용성의 반응 생성물로부터 분리할 수 있다. 또한, 이러한 고정화된 반응물을 친화 크로마토그래피에 사용하여 이러한 물질의 혼합물로부터 원하는 생물학적 활성 물질을 제거할 수 있다.
어떤 경우에, 특이적 결합반응에 사용된 미립자 기판은 그것의 외부 면상에 활성 그룹이 있도록 만들어진다. 이렇게 하므로써 생물학적 물질이 상기 입자의 외부면과 반응하게 된다. 미립자 기판이 중합체라면, 이것은 적당한 활성 그룹이 있는 단량체들로부터 제조될 수 있다. 미합중국 특허 제5,030,697호는 수용성 공중합체, 이것에 공유결합된 염료 및 중합체 염료를 생물학적 물질과 공유결합시킬 수 있는 기능 그룹을 갖고 있는 중합체가 결합되어 있는 결합가능한 염료에 관한 것이다.
분석적인 진단 방법에서 고체 기판으로서 중합체 물질을 사용함에 직면하게 되는 문제점은 원하지 않는 비특이적 단백질 흡착이 일어나는 것이다. 비특이적 단백질은 바람직하지 않은데 왜냐하면 이것이 불필요한 백그라운드를 일으키며 정확한 결과를 모호하게 만들기 때문이다.
중합체 표면의 친수성이 또한 연구 대상이다. 친수도가 증가하므로써 흑종의 단백질이 흡착이 감소되고 기타 것들의 흡착은 감소되지 않는다.
고체 기판을 만들 수 있는 물질이 본 산업 분야에 필요한데 이 물질은 수불용성이고, 가교결합되지 않으며 비다공성이고 화학적 물질 및 생물학적 물질과 결합할 수 있다.
상기 문제점들은 (Ⅰ) (a) 에틸렌적으로 불포화되고 중합가능하며 소수성을 공중합체에 제공하는 80~99.9 몰%의 하나 이상의 친유성 단량체(단, 단량체 중 어떤 것도 가교결합 단량체가 아님), (b) 에틸렌적으로 불포화되고 중합가능하며 숙신이미독시카보닐 그룹을 갖는 0.1~20 몰%의 하나 이상의 단량체, 및 (c) 0~10 몰%의 하나 이상의 에틸렌적으로 불포화된 중합가능한 친수성 단량체로부터 유도된 반복 단위를 갖는 가교결합되지 않은 공중합체의 수불용성이며 비다공성인 입자를 (Ⅱ) 생물학적 활성 물질과 반응시키는 단계로 구성된, 생물학적 활성 시약의 제조방법으로써 해결되는데, (Ⅰ) 및 (Ⅱ)는 상기 숙신이미독시카보닐 그룹의 숙신이미독시 부분이 치환되므로써 아미드 그룹에 의해 공유결합된다.
본 발명은 또한 액체투과성 기판안에 하나 이상의 반응 구역이 있고 이 구역들중 최소한 하나에 상기된 바와같은 생물학적 활성 시약이 들어있는 것으로 된 분석 요소를 제공한다.
또한, 본 발명은 비다공성 지지체 위에 효소에 대한 분석에서 검출가능한 시그널을 제공하기 위한 하나 이상의 시약을 함유하고 있는 시약층, 생물학적 활성 시약이 들어있는 다공성의 펴져있는 층, 및 상기 비다공성 지지체의 어떤 층에 있는 효소에 대해 라벨링된 유사한 리간드가 놓여져 액체와 접촉하게 되어있는 분석 요소를 제공하는데, 상기 요소는 생물학적 활성 시약이 상기 (Ⅰ)에 기술된 입자 및 숙신이미독시카보닐 그룹의 숙신이미독시 부분의 치환에 의해 아미드 그룹으로써 상기 입자에 공유결합된 리간드에 대한 수용체(receptor)를 포함하는 것을 특징된다.
또한, 본 발명은 A. 수용성의 특이적 결합 리간드를 함유하고 있는 샘플을 생물학적 활성 시약과 접촉시켜 상기 리간드와 상기 수용체와의 수불용성인 특이적 결합 복합체를 형성시키고, B. 상기 샘플내 리간드의 존재 또는 부재 표시로서 상기 복합체의 존재를 검출하는 것으로 구성된, 특이적 결합 리간드의 측정방법을 제공하는데 이 방법은 상기 생물학적 활성 시약이 상기된 바와같은 것으로 특징된다.
또한, 본 발명은 A. 수용성이 특이적 결합 리간드를 함유하고 있는 샘플을 생물학적 활성 시약과 접촉시키고, B. 단계 A전에, 단계 A와 동시에 또는 단계 A에 연속해서, 상기 샘플을 상기 리간드에 대한 수용체와 접촉시켜 수용체와 수용체 리간드와의 수용성인 특이적 결합 복합체 및 수용체와 수불용성 리간드와의 수불용성인 특이적 결합 복합체를 형성시키며, C. 상기 수불용성 복합체를 수용성 물질과 분리시키고, D. 샘플내 리간드의 존재 또는 부재 표시로서 수불용성 복합체의 존재를 검출하는 것으로 구성된, 경합하는 결합 분석을 사용한 특이적 결합 리간드의 측정방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 생물학적 활성 시약이 상기 (Ⅰ) 및 (Ⅱ)에 기술된 바와 같은 것으로 특징된다.
또한, 본 발명은 A. 면역학적 종(species)을 함유하고 있는 샘플을 상기된 바와같은 입자 및 상기 종에 대한 수용체를 포함한 시약과 접촉시켜 상기 종과 상기 수용체, 바람직하게 미소다공성 여과막상에 고정화된 시약과의 수불용성인 면역학적 복합체를 형성시키고, B. 수용성 물질을 바람직하게 여과로 상기 복합체에서 제거하며, C. 샘플내 면역학적 종의 존재 또는 부재 표시로서 상기 복합체의 존재를 검출하는 것으로 구성된, 면역학적 종의 측정방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 입자가 상기 (Ⅰ)에 기술된 바와 같고 상기 수용체가 숙신이미독시카보닐 그룹의 숙신이미독시 부분의 치환으로 아미드 그룹에 의해 상기 입자에 공유결합되는 것으로 특징된다.
본 발명은 또한 A. 생물학적 활성 물질의 혼합물을 함유하고 있는 샘플을 상기된 바와 같은 입자와 특이적 결합 물질을 포함하는 친화 크로마토그래피 시약에 통과시키고, B. 하나 이상의 미리 알고있는 생물학적 활성 물질을 상기 시약상에 수집하는 것으로 구성된, 분석적인 정제방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 입자가 상기 (Ⅰ)에 기술된 바와같고 특이적 결합 물질이 숙신이미독시카보닐 그룹의 숙신이미독시 부분의 치환으로 아미드 그룹에 의해 입자에 공유결합되며 특이적 결합 물질이 생물학적 활성 물질의 샘플 혼합물내 미리 알고 있는 하나 이상의 생물학적 활성 물질에 특이적인 것으로 특징된다.
본 발명은 여러 가지 분석 방법, 진단 방법 및 정제방법에 유용한 시약들을제공한다.
본 발명은 또한 (a) 핵산과 시약간의 수불용성 잡종형성 생성물을 형성시키고, (b) 검출하고자하는 핵산의 존재 표시로서 상기 잡종형성 생성물의 존재를 검출하는 것으로 구성된, 핵산의 검출방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 시약이 활성적인 숙신이미독시카보닐 그룹에 의해 상기 (Ⅰ)에 기술된 바와같은 입자에 공유결합되어 있는 올리고뉴클레오타이드를 포함하고 이 올리고뉴클레오타이드가 실질적으로 검출하고자하는 핵산에 상보적인 것으로 특징된다.
숙신이미드 그룹을 갖고 있는 혹종의 공중합체를 사용하게 되므로써 수불용성 라텍스 입자내로 더 용이하고 더 완전한 함침이 이루어지므로 단백질이나 기타 생물학적 화합물이 더 용이하게 결합되는 것이 본 발명의 장점이다. 또한, 본 발명에 유용한 공중합체는 (1) 수불성이고, (2) 물내 팽창에 대해 저항성이 있으며, (3) 고정화의 생화학 작용에 대한 콜로이드 안정성이 있고, (4) 계면활성제가 없으며, (5) 중합체를 들러싸는 보호 콜로이드가 없고, (6) 비다공성이며, (7) 가교결합되지 않고 (8) 단일분산성을 갖는다.
상기 공중합체는
(a) 상기 공중합체에다 소수성을 제공하는 80.0~99.9 몰%, 더욱 바람직하게는 90~99.9, 가장 바람직하게 95~99.9 몰%의 하나 이상의 에틸렌적으로 불포화된 중합가능한 친유성 단량체(단, 단량체들 중 어느 것도 가교결합 단량체가 아닌데, 즉 단량체들이 2개 이상의 부가 중합가능한 비닐 그룹을 가져 이것이 중합하여 가교결합된 입체적인 중합체 구조를 만들 수 있다).
(b) 숙신이미독시카보닐 그룹을 갖는 0.1~20, 더욱 바람직하게 0.1~10, 가장 바람직하게 0.1~5 몰%의 하나 이상의 에틸렌적으로 불포화된 중합가능한 단량체, 및
(c) 이온성 또는 극성의 친수성 단량체와 같은 0~10, 바람직하게는 0~5, 더욱 바람직하게 0~3 몰%의 하나 이상의 기타 가교결합되지 않고 에틸렌적으로 불포화된 중합가능한 단량체로부터 유도된 기본적인 반복 단위를 갖는다.
바람직하게, 본 공중합체는 다음 구조식으로 표시되는 상기 단량체 (b)를 포함한다.
식중, R은 수소, C1-3알킬 또는 할로, L은 최소한 2개의 탄소원자를 갖는 연결 그룹으로서 C1-8알킬렌, C6-12아릴렌, 이종원자 및 이종원자함유 그룹들중 최소한 두 개로 된 조합 그룹으로 구성되며, m은 0 또는 1, n은 1 또는 2, p는 0 또는 1, 단, n이 2일 때 알킬렌 및 아릴렌중 하나는 필수적으로 3가임.
보다 구체적으로, 상기 구조식에서 R은 수소, C1-3알킬(예를들어 메틸, 에틸, 이소프로필 및 n-프로필), 또는 할로(예를들어 클로로 또는 브로모)이다. 바람직하기로는 R은 수소, 메틸 또는 클로로이다. 더욱 바람직하기로 R은 수소 또는 메틸이다.
또한, L은 연결 사슬내에 최소한 2개의 탄소원자를 갖는 유기 연결 그룹이며 (1) 메틸렌, 에틸렌, 트리메틸렌, 프로필렌, 펜타메틸렌, 또는 2,2-디메틸-1,3-프로필렌 같은 C1-8알킬렌 그룹, (2) 페닐렌, 톨일렌, 크실일렌, 나프틸렌 같은 C6-12아릴렌 그룹 및 (3) 산소(옥시) 및 황(티오) 원자 같은 2가의 이종원자 또는 (4) 카보닐, 설포닐, 이미노, -NR1(R1은 수소 또는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸 및 헥실같은 C1-6의 저급 알킬)같은 이종원자함유 그룹중 최소한 두 개의 조합 그룹이다.
알킬렌 그룹은 1-8개의 탄소원자를 가질 수 있으며 분지되거나 선형이거나 환식일 수 있고 하나 이상의 알킬 그룹(바람직하게 메틸, 에틸, 이소프로필, 헥실 및 옥틸같은 C1-8알킬), 알콕시(바람직하게 메톡시, 에톡시, 프로폭시, t-부톡시 및 옥틸옥시 같은 C1-12알콕시), 시클로알킬(바람직하게 시클로부틸, 시클로헥실 및 시클로펜틸 같은 C4-6시클로알킬), 아릴(바람직하게 페닐, 톨일, 크실일, 나프틸, 4-메톡시페닐 및 클로로페닐 같은 C6-12아릴)로 치환되거나 비치환될 수 있다. 합성 화학 업계의 숙련자들이 이러한 그룹들을 합성하는 것은 어려운 일이 아니다. 아릴렌 그룹은 6-12개의 핵 탄소원자를 가질 수 있으며 상기 알킬렌 그룹에 대해 정의된 바와 같은 치환체를 가질 수 있다.
또한, m은 0 또는 1, n은 1 또는 2, p는 0 또는 1인데 단, n이 2일 때 상기 알킬렌 및 아릴렌중 하나는 필수적으로 3가이다.
가장 바람직하기로는 p 및 m이 0인 것이다.
바람직하게, 단량체 (b)는 스티렌 또는 스티렌 유도체이거나 아크릴산 또는 메타크릴산 에스테르이다. 가장 바람직하게, 이것은 N-아크릴 오일옥시숙신이미드, 4-(2-숙신이미독시카보닐-에틸티오메틸)스티렌, 4-[1, 2-비스(숙신이미독시카보닐)에틸티오메틸]스티렌 또는 4-(2-숙신이미독시카보닐페닐티오메틸)스티렌이다.
상기 기술된 단량체 (b)는 중합되어 단일 중합체를 만들 수 있지만, 바람직하게 이들은 또다른 하나 이상의 에틸렌적으로 불포화된 중합가능한 단량체와의 중합체를 제조하는데 사용된다. 예를들어, 단량체 (a)로서 상기 정의된 치유성 단량체는 결과의 공중합체에다 소수성 또는 수불용성을 제공하기 위해 사용된다. 필요에 따라 이러한 단량체의 혼합물을 사용할 수 있다. (a)를 유도할 수 있는 단량체로는 비닐 방향족 화합물(예를들어, 4-비닐톨루엔, a-메틸스티렌, 2, 5-디메틸스티렌, 4-t-부틸스티렌 및 2-클로로스티렌 같은 스티렌 및 스티렌 유도체), 아크릴산 및 메타크릴산 에스테르 및 아미드(예를들어, 메틸 아크릴레이트, 메틸 메타크릴레이트, n-부틸 아크릴레이트, 2-에틸헥실 메타크릴레이트, 벤질 아크릴레이트 및 N-페닐아크릴아미드), 부타디엔, 아크릴로니트릴, 비닐 아세테이트, 비닐벤질 아세테이트, 비닐 브로마이드, 및 비닐리덴 클로라이드가 있다. 바람직한 (a)단량체는 비닐 방향족 화합물이고 스티렌이 가장 바람직하다.
또한, 단량체(a) 또는 (b)에 대해 상기 기술된 것 이외에 에틸렌적으로 불포화된 중합가능한 단량체(c)가 공중합되어 바람직한 특성을 제공할 수 있다. 예를들어, 이러한 단량체로는 2-아크릴-아미도-2-메틸프로판 설폰산, 3-메타크릴오일옥시프로판-1-설폰산, p-스티렌설폰산 및 이것의 염을 포함해서 설폰산 그룹이나 이것의 염을 함유한 음이온성 단량체가 포함된다. 또한, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, N-이소프로필아크릴 아미드, 2-하이드록시에틸 아크릴레이트, 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트, 펜타에틸렌 글리콜 모노메타크릴레이트 및 N-비닐-2-피롤리돈 같은 비이온성의 친수성 단량체가 단량체(c) 그룹에 포함된다. 또한, 2-아세토아세톡시에틸 메타크릴레이트와 같은 활성적인 메틸렌 그룹을 갖는 단량체들 뿐 아니라 기타 다수의 것들이 사용될 수 있다.
본 발명의 공중합체는 예를들어 Sorenson 등에 의해 Preparative Methods of Polymer Science, 제2판, (1968), Wiley and Sons, New York, 및 Stevens, Polymer Chemistry, An Introduction, Addison Wesley Publishing Co., London, (1975)에 기술된 바와같이 표준 유화중합법 또는 현탁중합법을 사용해 제조된다.
본원에 기술된 공중합체는 본 발명의 시약을 제조하기 위해 미립자 형태로 사용된다. 평균 입자 크기는 사용하는 시약에 따르 크게 달라진다. 일반적으로, 이것은 0.01~20mm, 바람직하게 0.01~10mm, 더욱 바람직하게 0.05~5mm이다.
본 발명의 방법으로 제조된 시약은 상기 입자의 외부면에 있는 활성적인 숙신이미드 에스테르 그룹의 치환으로 아미드 그룹에 의해 중합체 입자에 공유결합되어 있는 하나 이상이 생물학적 활성 물질을 함유한다. 본원에서 생물학적 활성 물질이라 함은 생물에서 발견되거나 세포 물질이나 생물의 진단, 처리 또는 유전자 공학에 유용하고 또다른 생물학적 물질이나 화학적 물질과는 상호작용능을 갖고 있는 혹종의 유기 화합물을 의미한다. 이러한 물질들은 생물학적 액체내에 천연적으로 존재하거나 존재하지 않는다. 이러한 물질은 활성적인 숙신이미독시 그룹의 치환에 의해 상기 입자에 결합할 수 있다. 그러므로, 이것이 의미하는 것은 생물학적 활성 물질이 반응에 이용가능한 아미노 또는 설프하이드릴 그룹을 갖는다는 것이다.
본 시약의 의도된 용도에 따른 생물학적 활성 물질로는 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질(항체, C-활성 단백질 및 아비딘 및 이것의 유도체 포함), 지단백질, 당단백질, 호르몬, 약제(예를들어 디곡신, 페니토인, 페노바비탈, 티록신, 트리요오도티로닌, 젠타마이신, 카바마제핀 및 테오필린), 스테로이드류, 비타민류, 다당류, 당지질, 알카로이드류, 미생물, 바이러스, 원생동물, 진균, 기생체, 리케챠, 곰팡이, 혈액성분, 조직 및 기관성분, 조제약, 합텐, 렉틴, 독소, 핵산(일본쇄(single-stranded) 또는 이 본쇄의 올리고뉴클레오타이드 포함), 아비딘 또는 이것의 유도체, 비오틴 또는 이것의 유도체 및 상기된 물질들중 혹종의 것을 성분이 포함되지만 이것에 국한되지는 않는다.
본 발명의 방법으로 제조된 특히 유용한 시약은 생물학적 활성 물질이 문제의 리간드에 특이적인 수용체 분자인 것들이다. 그러므로, 이러한 시약을 포함한 특이적 결합반응이 여러 방법(이후에 더 상세히 기술됨)에 사용될 수 있다. 리간드-수용액 복합체(즉, 리간드와 수용체의 반응 생성물)의 예로는 항체-항원, 항체-합텐, 아비딘-비오틴, 당-렉틴, 젤라틴-피브로넥틴 및 단백질 A-IgG 복합체가 있지만 이에 국한되지는 않는다. 본 발명의 목적을 위해, 상보적인 핵산(즉, 상보적인 사슬들의 잡종형성 생성물)이 또한 사용될 수 있는 특이적 결합 물질이다. 이러한 상보적인 핵산(최소한 2개의 염기를 갖는 올리고뉴클레오타이드)은 모든 염기쌍에서 상보적일 필요가 없거나 핵산 서열내 모든 위치에 매칭(matching) 염기가 있지 않아도 된다. 즉, 사슬중 하나가 다른 하나보다 더 길거나 하나의 사슬이 상이한 서열에서 이것에 상보적인 다수의 올리고뉴클레오타이드를 가질 수 있다.
가장 유용한 생물학적 활성 물질은 면역활성 종으로 당 업계에 고지된 것인데 이런 것으로는 (1) 면역적격 숙주에 제공되었을 때 이 물질과 결합할 수 있는 특이적 항체를 생성하는 혹종의 물질 또는 (2) 이렇게 생성되어 면역학적 반응에 참여하는 항체가 포함된다. 그러므로, 면역학적 종은 항원 물질 또는 항체(항-항체 및 자가 항체 포함)이다. 단클론(monoclonal) 및 다클론(polyclonal) 항체가 사용될 수 있고 이들이 입자상의 활성 숙신이미독시카보닐 그룹과의 반응에 대한 활성 부위를 최소한 하나 갖는한 이들은 완전 분자 또는 이것의 여러 가지 단편일 수 있다.
특히 유용한 생물학적 활성 물질로는 스트랩토코커스 A, HIV-I, 치근막병과 관련된 미생물, 카바마제핀, 티록신, 사람의 융모막의 고나도트로핀, 페노바비탈, 페니토인, 디곡신 또는 C-활성 단백질에 대한 항체들이 있다.
하나의 구체예에서, 면역학적 종은 결합에 대한 활성 그룹을 갖는 효소이다. 대표적인 효소로는 고추냉이 퍼옥시다제, 글로코스 옥시다제, 우레아제, β-갈락토시다제, 아스파테이트 아미노트랜스아미나제, 알라닌 아미노트렌스아미나제, 락테이트 디하이드로게나제, 크레아틴 포스포키나제, γ-글루타밀 트랜스퍼라제, 알칼리 포스파타제, 산 포스파타제 및 프로스태틴산 포스파타제가 있지만 이것에 국한되지 않는다.
다른 구체예에서, 약제 측정이나 임신에 대한 진단을 위한 경합성 결합 분석에서처럼, 생물학적 활성 물질은 사람의 융모막의 고나도트로핀, 페노바비탈, 페니토인, 또는 디곡신에 대한 항체이다.
필요하다면, 생물학적 활성 물질은 개질되거나 화학적 변형되어 결합용 연결 부분을 포함해서 결합용 활성 그룹을 제공할 수 있다.
본 발명의 시약을 제조하기 위해 생물학적 활성 물질을 중합체 입자에 결합시키는 과정은 일반적으로 다음과 같다.
중합체 입자의 수성 현탁액을 이중 중합체 입자에 공유결합될 생물학적 활성 물질의 현탁액이나 완충액으로 직접 처리하는데 생물학적 활성 물질 대 중합체의 중량비를 0.1:1000 내지 1:1, 바람직하게 1:1000 내지 100:1000으로 하고 pH를 7-10, 바람직하게 8.5~9.5로 한다. 혼합물을 혼합하는데 있어 2~28시간 동안 혼합하는 것이 일반적으로 적당하지만, 반응이 완결되는데 충분한 시간, 즉 몇 시간 동안 혼합한다. 필요하다면, 반응물을 소의 혈청 알부민으로 퀀칭한 다음 미립자를 분리하고(바람직하게 원심분리에 의함) 완충 염류액에 재현탁시킨다. 이러한 분리 및 재현탁 단계를 한번 이상 반복하고 고체 함량이 0.1~40, 바람직하게 1~10 중량%가 되도록 최종 분산액을 제조하여 안정화시킨다(바람직하게 0.02% 머티올레이트를 사용함). 상기 과정은 상당히 변할 수 있는데, 특히 시간, 온도, 완충제, 안정화제, 또는 기타 시약, 분리 또는 퀀칭 방법을 달리하여 동일한 결과를 얻는다.
상기 시약을 제조하는데 있어, 반응 혼합물에서 고체입자의 함량 %는 0.01~40%, 바람직하게 1~10%이다. 생물학적 활성 물질의 양은 0.1:100 내지 1:1, 바람직하게 1:1000 내지 100:1000인 물질 대 공중합체의 중량비로 나타낸다. 그러나, 모든 물질들이 상기 입자에 공유결합되는 것은 아니다. 실제로, 소량이 흡착되고 약간의 것은 전혀 결합되지 않을 수 있다.
생물학적 활성 물질과 입자를 5~50℃, 바람직하게 18℃~40℃에서 2~28시간, 바람직하게 4~24시간 동안 혼합한다. 이러한 혼합 시간은 온도, 생물학적 활성 물질 및 원하는 용도에 따라 달라질 것이다. 적당한 혹종의 완충제가 사용될 수 있지만 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지노프로판설폰산이 바람직하다.
여러 가지 시약을 제조하기 위한 대표적인 과정이 이후의 실시예에 상세히 기술되어 있다.
핵산 시약이 상기된 다른 시약들과 유사하게 제조되지만, 특히 평균 입자 크기가 0.01~10mm인 중합체 입자가 최소한 1%의 고체 함량, 바람직하게 5~25%의 고체 함량으로 현탁액에 존재한다. 이러한 특징으로 인한 장점은 시토메갈로바이러스 DNA를 분석하는데 있어 시그널을 더 많이 제공하는 시약이 생성된다는 것이다.
일반적으로, 핵산 시약을 제조하는 방법은 평균 입자 크기가 0.05~10mm이고 숙신이미드를 함유하는 중합체 입자의 수성 현탁액(입자는 최소한 1% 고체 함량으로 존재함)을 활성 아민 그룹이나 설프하이드릴 그룹을 갖고 있는 올리고뉴클레오타이드와 접촉시키는 것인데 상기 아민 또는 설프하이드릴 그룹은 숙신이미독시카보닐 활성 그룹과 반응하여 입자와 올리고뉴클레오타이드간의 공유결합을 만든다.
올리고뉴클레오타이드가 필요한 활성 아민 그룹이나 설프하이드릴 그룹을 갖고 있지 않을 경우, 이 그룹을 공지의 방법과 반응물을 사용해 부가할 수 있다.
본 발명의 분석 방법 또는 진단 방법에서, 혹종의 특이적 결합 리간드를 검출하기 위해 이것에 대한 수용체 분자가 있는 시약을 사용할 수 있다. 본 발명의 시약내 생물학적 활성 물질은 리간드나 이것의 수용체와 특이적으로 작용할 수 있다. 리간드 검출은 수성 액체(예를들어 생물학적 액체)의 테스트 샘플 또는 조직이나 세포 물질 용액을 사용해 용액 형태 또는 건조 형태(이후에 기술)로 행해지며 정량적으로, 정성적으로 또는 이것 둘다로 행해진다. 특히, 본 발명은 동물, 사람 또는 식물의 생물학적 액체를 분석하는데 사용되며, 바람직하게 완전 혈액, 혈청, 혈장, 임파액, 담즙, 요소, 척수액, 객담, 누액, 땀, 면봉에 채집한 샘플, 조직 배양물, 변, 세포액, 질 분비물 및 정액을 포함해서 사람의 체액을 분석하는데 사용될 수 있다. 또한 골격근, 심장, 신장, 폐, 뇌, 골수 또는 피부와 같은 사람이나 동물 조직의 액체 제제를 분석하는 것이 가능하다.
리간드는 약제, 합텐, 호르몬, 항원 물질(리포폴리사카라이드 또는 단백질) 또는 하나 이상의 동일하거나 상이한 수용체 분자와의 복합화를 위한 하나 이상의 부위를 갖는 항체이다. 본 발명의 면역분석에서, 리간드는 약제(예를들어 디곡신, 페니토인 및 카바마제핀), 호르몬(티로이드자극 호르몬, 사람의 융모막의 고나도트로핀, 루티나이징(leutinizing) 호르몬 및 티록신), 레트로바이러스 성분 또는 이 레트로바이러스에 대한 항체(예를들어 HIV-I 성분 또는 이것의 항체), 박테리아 병원체 또는 이것의 성분 또는 이것에 대한 항체(예를들어 Streptococcus A 항원, Chlamydial 또는 Gonococcal 항원 또는 항체), 바이러스 또는 이것의 성분(예를들어 간염, 시토메갈로바이러스 또는 허피스 항원) 또는 이것에 대한 항체, 암유발제 또는 C-활성 단백질일 수 있다. 이 리간드는 또한 비오틴이나 이것의 유도체이고 수용체는 아비딘이나 이것의 유도체이다.
다른 구체예에서, 리간드는 핵산(보통 일본쇄 형태)일 수 있고 이것은 존재(양)를 수용체 분자로서 상보적인 일본쇄 핵산을 사용해 검출한다. 핵산을 검출하는 여러 가지 분석 형태가 있으며 이들 모두는 당 업자에게 공지되어 있다. HIV-I DNA, β-글로빈 DNA 또는 시토메갈로바이러스 DNA의 검출이 본 발명을 실행하는데 있어 특히 중요하다.
리간드는 바람직하게 항원성 물질, 합텐 또는 약제이다. 수용체는 바람직하게 상기 항원성 물질, 합텐 또는 약제에 대한 항체이다.
전술된 경합성 결합 분석법을 용액 내에서 행할 수 있다. 용액 분석법은 상기 시약을 문제의 리간드를 함유하고 있는 테스트 샘플과 시약의 현탁액으로 사용하는 것이다. 이러한 분석법으로 결합되거나(즉, 복합화되거나) 결합되지 않은(즉, 복합화되지 않은) 물질을 측정할 수 있다. 필요하다면, 적당한 분리 방법을 사용해 결합된 물질과 결합되지 않은 물질을 물리적으로 분리할 수 있다. 분석 요소(이후에 기술)을 사용함에 있어, 수직 분리 또는 수평 분리를 사용할 수 있다. 광 산란법, 탁도 측정법, 방사선 측정법 또는 분광 측정법을 사용해 결합된 리간드를 측정할 수 있다.
경합성 결합 분석에서, 시약은 일반적으로 문제의 리간드 및 중합체 입자상의 면역학적 종(즉, 수용체)의 양에 따라 달라진 농도로 존재한다. 리간드 유사체(검출가능하게 라벨링된 리간드)가 또한 사용되어 양을 알고 있는 반응에 이용되는 수용체에 대해 리간드와 리간드 유사체간에 경합이 일어난다. 상기 분석은 일반적으로 시약, 리간드 유사체 및 테스트 샘플을 적당한 용기에서 물리적으로 접촉 및 혼합시켜 복합화하므로써 행해진다. 복합체 검출에 필요한 혹종의 화학적 반응이나 생물학적 반응(예를들어 발색반응) 및 복합화를 촉진하기 위해 인큐베이팅시킨다.
특히, 리간드는 면역학적 종이다. 일단 수용성(복합화되지 않은) 물질이 예를들어 여과 또는 원심분리에 의해 복합체로부터 제거되면, 리간드와 수용체와의 반응으로 검출가능한 면역학적 복합체가 만들어진다. 이것으로써 상기 샘플내에 상기 종이 존재하는지 부재하는지를 알 수 있다.
또한 건조상태의 분석 요소를 사용해 본 발명의 방법을 실행할 수 있다. 가장 간단한 요소는 액체 투과성의 흡착성 기판, 예를들어 여과지 조각과 같은 자기지지용의 흡착성 또는 흡수성 물질로 된 얇은 시트로 구성될 수 있다. 이 기판은 그 안에서 일어나는 화학적 반응, 생물학적 반응 또는 특이적 결합반응을 위한 하나 이상의 반응 구역을 갖는다. 본 발명의 시약이 상기 반응 구역들중 적어도 하나에 존재한다. 기타 임의의 구역들이 색소, 색소제공 화합물, 포착제, 산화방지제, 효소 기질 또는 완충제 및 기타 당 업자에게 명백한 물질같은 기타 시약들을 포함할 수 있다. 이러한 요소는 테스트 스트립, 분석요소, 슬라이드 또는 침적 스틱으로서 당 업계에 공지되어 있다.
상기 요소를 제조하는데 유용한 흡수성 물질은 셀룰로스 물질(예를들어 다공성 종이), 다공성 중합체 필름, 유리 섬유로 된 매트, 편직물이나 비편직물 및 기타 당 업자에게 공지된 물질들을 포함할 수 있다. 바람직한 기판은 다공성의 펴져있는 층이다.
바람직한 요소는 하나 이상의 겹쳐져 있는 액체투과성을 포함할 수 있으며 이들 모두는 적당한 중합체, 셀룰로스, 또는 금속 물질로 구성된 비다공성의 액체비투과성 지지체(투명하거나 불투명함)상에 겹쳐져 있다. 상기 층은 반응 구역, 보조 구역, 시약 구역, 배리어 구역, 방사-차단 구역 및 기타 당 업계 공지된 용도와 같은 여러 가지 목적에 사용될 수 있다. 필요한 경우, 시약과 완충제를 분석을 행하기 위한 원하는 반응을 위해 상기 층내에서 이동시켜 검출가능한 생성물을 제공하고 결합된 물질과 비결합된 물질을 분리할 수 있다.
본 발명의 시약을 혹종의 요소에 함침시키는 것이 바람직하지만, 이 시약을 분석과 동시에 테스트 샘플과 함께 상기 요소에 부가할 수 있으므로 중요하지는 않다. 그러나, 바람직하게 본 발명의 리간드 유사체 및 시약(적당한 수용체를 함유)이 상기 요소내 상이한 구역에 있게 되어 이들이 미리 복합화되지 않을 것이다.
바람직하게, 리간드 유사체는 이후에 기술될 효소 같은 효소로 라벨링되며 이 리간드는 항원 물질, 호르몬, 합텐 또는 약제이고 수용체는 당해 항체 또는 면역반응물이다. 이러한 요소는 특히 카바마제핀, 티록신, 페노바비탈, 페니토인 또는 디곡신을 측정하는데 유용하다. 가장 바람직하게, 이들은 페노바비탈, 페노토인 또는 디곡신을 측정하는데 유용하다.
분석방법에 따라 달라지는 여러 가지 상이한 요소들을 본 발명에 따라 제조할 수 있다. 이들은 여러 가지 형태, 예를 들어 원하는 너비로 연신시킨 테이프, 시트, 슬라이드 또는 칩 형태로 구성될 수 있다.
본 발명의 용액 분석법이나 건조 분석법은 수동 또는 자동으로 행해진다. 일반적으로, 건조 상태의 요소를 사용하는데 있어, 공급 롤, 칩 묶음 또는 기타 공급원으로부터 요소를 취하여 이것을 테스트 샘플과 물리적으로 접촉시킴으로써 피검물을 측정한다. 또한 상기 방법을 사용하게 되면 요소내 샘플과 시약이 하나 이상의 테스트 구역에서 혼합된다. 이러한 접촉은 혹종의 적당한 방법으로 이루어지는데, 예를들어 상기 요소를 샘플내에 침적 또는 침액시키거나 또는 바람직하게는 한 방울의 샘플을 적당한 분해 수단을 사용해 상기 요소에 도포하므로써 이루어진다. 상기 분석법에 세척액을 또한 사용할 수 있다.
요소내에서 검출가능한 분광광도 변화를 육안으로 관찰하거나 적당한 검출기구를 사용해 관찰하여 분석 결과를 측정한다.
본 발명의 또 다른 구체에는 응집 분석이다. 따라서, 리간드는 본 발명의 시약과 복합화되어 검출가능한 응집 입자를 만든다. 결과하는 이러한 응집을 여러 가지 방법, 예를들어 육안으로 또는 적당한 광산란 검출기구를 사용해 검출할 수 있다.
응집 분석법은 바람직하게 혹종의 방법으로 검출가능하게 라벨링된 본 발명의 시약을 사용해 행해진다. 라벨로는 입자나 또는 이것에 결합된 생물학적 활성 물질내 방사성동위원소 또는 입자에 결합되어있는 비색측정용 또는 형광측정용 염료가 있다. 염료가 입자 내부에 있는 것이 가장 바람직하다. 이것으로써 생물학적 활성 물질의 결합이나 이것의 복합화가 방해되는 것을 막는다. 이러한 입자는 코어(core) 중합체내에 염료가 들어있는 쉘(shell) 공중합체에는 염료가 없는 코어-쉘 입자이다. 코어-쉘 중합체 입자에서, 쉘 공중합체는 필요한 활성 숙신이미독시카보닐 그룹을 함유한 조성물을 갖는다. 그러나, 코어 중합체는 상이하여 활성 그룹을 가질 필요가 없다.
본 발명에 따라서, 면역학적 종은 항원성 물질이고 수용체는 이것에 대한 항체이다. 또한, 면역학적 종이 항체이고 수용체가 이것에 특이체인 항원성 물질일 수 있다.
본 발명의 시약을 면역측정 분석법에 사용할 수 있다. 이 분석법에서, 분석하고자하는 리간드는 두 개 이상의 수용체 분자(동일하거나 상이함)와 복합화되는데 이것중 하나는 불용화되거나 또는 불용화될 수 있고 (예를들어 아비딘-비오틴 결합에 의해), 다른 하나는 수용이며 방사성동위원소, 효소, 화학발광, 부분 또는 기타 당 업계에 공지된 마커같은 것으로 적당하게 라벨링된다. 예를들어, 사람의 융모막의 고나도트로핀같은 리간드에 대한 면역측정 분석을 효소로 라벨링한 고나도트로핀에 대한 항체(시약 항체와는 상이한 에피토프(epitope) 부위에서 복합화함)와 함께 이 호르몬에 대한 항체를 함유한 본 발명의 시약을 사용해 행할 수 있다. 결과의 샌드위치 복합체는 불용성이고 검출가능하며 미소다공성 여과막을 사용해 복합화되지 않은 물질로부터 분리가능하다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 시약은 분석하고자하는 리간드에 대한 수용체를 함유하며 멤브레인(membrane)상에 고정화된다.
샌드위치 분석에서는 바람직하게, 본 발명의 시약과의 수불용성 복합체를 형성시키기전, 형성시킴과 동시에 또는 형성시킨 다음에, 분석하고자하는 리간드를 이것과 특이적으로 작용하는 수용성의 특이적 결합 성분과 반응시킨다.
본 발명에 따라 샌드위치 분석법으로 검출할 수 있는 기타 리간드로는 스트랩토코커스의 항원, 치근막 질환과 관련된 미생물로부터 추출한 항원, 간염 항원, HIV-I 및 기타 레트로바이러스 항원이 있지만 이에 국한되지는 않는다.
샌드위치 분석에서, 본 발명의 시약은 분석하고자 하는 리간드와 직접 반응할 수 있는데, 예를들어 리간드가 항원일 경우 시약은 이것에 대한 항체를 포함한다. 또한 시약은 간접적으로, 즉, 중간 연결부분에 의해 리간드와 복합화된다.
본 발명의 또다른 구체예는 상보적인 프로브(probes)를 사용해 타겟(targeted) 핵산을 검출하는 잡종형성 분석법이다. 프로브종 하나는 적당하게 라벨링되며 다른 하나는 고정화되거나 고정화될 수 있다. 본 발명의 시약을 이러한 분석법에서 고정화된 프로브(포획 프로브로 또한 공지되어 있음)로서 사용할 수 있다. 이들 시약은 예를들어 중합효소 연결반응(polymerase chain reaction)에 의한 증폭(amplification)후에 포획 프로브로서 사용될 수 있다. 증폭된 핵산은 본 발명의 시약과의 잡종형성으로 고정화된다.
바람직한 잡종형성 분석법에서는, 분석하고자하는 핵산을 본 발명의 시약으로 포획하기 전에 적당한 시약(예를들어, DNA 중합효소, dNTPs, 프라이머(primers))을 사용해 중합효소 연결반응으로 증폭시킨다. HIV-I DNA, 시토메갈로바이러스 DNA 및 β-글로빈 DNA를 본 발명에 따른 증폭과 검출로 용이하게 검출한다. 하나의 구체예에서, 프라이머중 하나가 비오티닐화되며 아비딘과 효소의 결합체를 사용해 증폭된 핵산을 검출한다. 독립적인 반응 피우치로된 격실 또는 멤브레인 같은 미소다공성 기판을 포함해서 혹종의 형태의 기판상에 위치하거나 결합될 수 있는 시약을 사용해 잡종형성 생성물을 포획한다.
본 발명의 분석적인 분석법, 샌드위치 분석법, 및 잡종형성 분석법을 적당한 기구와 과정을 사용해 행하여 복합되거나 잡종형성된 생성물을 포획하거나 여과, 원심분리 또는 기타 수단으로 복합되지 않은 물질로부터 분리한다. 바람직하게, 미소다공성 여과막을 갖고 있는 1회용 테스트 장치(예를들어 Pall Corp.에서 시판하고 있는 것, 및 SureCellTM테스트 장치로서 Eastman Kodak Co.에서 시판하고 있는 것들)를 사용해 이러한 분석을 행한다.
본 발명의 분석적인 분리방법을 생물학적 물질의 혼합물로부터 하나 이상의 피검풀을 분리하는데 사용할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 시약(또는 입자에 상이한 물질이 결합되어 있는 몇몇 시약)을 생물학적 물질의 혼합물이 함유되어 있는 액체를 부어 넣을 수 있는 칼럼에 넣으므로써 분리하고자 하는 물질을 액체로부터 추출할 수 있게 된다. 이것은 친화 크로마토그래피로서 공지되어 있으며 핵산, 효소, 탄수화물, 단백질, 지방, 비타민, 스테로이드, 항체, 펩타이드 또는 호르몬이 정제에 유용하다.
친화 크로마토그래피는 정제된 단백질로부터 변형된 형태의 것을 제거하기 위해 묽은 단백질 용액을 농축시키는데 사용되며 특정한 화학적 변형으로 생기 단백질과 펩타이드 성분의 분리 및 분석에 상용될 수 있다.
또한 이 방법은 중합효소 연결반응에 의한 증폭으로 결과된 것과 같은 핵산을 정제하는데 사용된다.
본 발명의 시약은 단일 물질로서 상기된 혹종의 방법에 공급되거나 또는 이것은 상기된 분석 요소에 공급되거나 또는 진단용 테스트 키트내 기타 시약, 테스트 장치 및 기구와 함께 공급될 수 있다. 정제 방법을 위해, 상기 시약을 또한 친화 크로마토그래피 칼럼에 공급할 수 있다.
정제 방법의 하나의 구체예에서, 샘플 혼합물내 미리 알고있는 하나 이상의 생물학적 활성 물질을 본 시약으로 포획한다. 최초의 용리액을 제거해내고 포획된 물질을 이 물질의 결합성을 변화시켜 이것을 복합화되지 않게 하는 용매를 사용해 칼럼으로부터 제거한다. 이러한 용매로서 pH를 변화시키는 완충액, 복합체의 이온성을 변화시키는 염용액 또는 시약과 특이적으로 결합하여 포획된 물질을 원래 상태로 되게 하는 제2종을 함유하는 용액이 있다.
또한, 상기 시약에 의해 포획된 미리 알고 있는 물질을 제거해내고 기타 최초의 용리액에 남아있는 화학적 또는 생물학적 물질을 수집한다.
다른 시가 없는 한 모든 퍼센트는 중량을 기준으로 한다.
[실시예 1]
본 발명의 중합체 비드(bead)상에 항-페노바비탈 항체의 고정화 및 항체 활성의 보유.
다음과 같은 공중합체 비드가 유용하였다.
0.1몰 완충액 #1[N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(3-프로판설폰산)](pH8.5)내 30mg(건조 중량)의 비드 및 0.3mg의 항-페노바비탈 항체를 포함한 반응 분산액을 제조하여 1.5㎖를 튜브에 넣었다. 반응 혼합물이 들어있는 튜브를 마개로 막은 후 상온에서 4시간 동안 회전시켰다. 100mg/ℓ의 소의 혈청 알부민 용액 0.3㎖를 부가하여 반응물을 퀀칭시켰다. 튜브를 상온에서 16시간 동안 더 회전시켰다. 반응 혼합물을 원심분리하고 상등액을 제거하며 비드를 1㎖의 인산염 완충 염용액(pH7.4)에 재현탁시켰다. 이러한 단계를 3번 이상 반복하였다. 최종적으로 1.8㎖의 인산염 완충 염용액(이후로 염용액이라 칭함)에 재현탁시키고 머티올레이트를 최종 농도가 0.2%이도록 부가하였다.
동일한 반응을125I로 라벨링된 소의 감마 글로불린을 사용해 행하였다. 표면에 흡착된 항체의 총 질량을 알아보기 위해 이들 반응을 실행하였다. 다음과 같이 분석하였다. 소의 혈청 알부민이 부가될 0.18㎖의 반응 혼합물을 취하여 방사성에 대해 검사했다. 항체 비드의 경우에서처럼, 비드를 원심분리하고 상등액중 0.18㎖ 샘플을 취해 방사성에 대해 검사하였다. 나머지 상등액을 제거하고 비드를 인산염으로 완충된 1㎖의 염용액에 재현탁시켰다. 비드를 다시 원심분리시킨 다음 1㎖의 1% 소듐 도데실 설페이트에 재현탁시키고 방사성에 대해 검사했다. 세척된 비드의 방사성 대 반응 혼합물의 초기 방사성 비율을 라벨링된 글로불린의 양, 유추해서 비드 표면상에 흡착된 항체의 양을 계산하는데 사용했다. 항체 비드 분산액의 연속적인 희석액들을 두 개의 항원, 즉 페노바비탈-효소 라벨 또는3H-페노바비탈중 고정된 농도의 하나와 혼합시키는 분석법으로 상기 제제내 활성 항체의 상대량을 측정했다. 희석된 항체비드 분산액과 효소 라벨간의 반응물을 0.1% 알부민을 함유한 인산염완충염용액 내에서 일정하게 교반하면서 1시간 동안 상온에서 인큐베이팅시켰다. 인큐베이팅후에, 비드를 원심분리하고 용액내에 남아있는 항원의 농도를 측정하기 위해 상등액에서 샘플을 취하였다. 50%의 항원을 결합시키는데 필요한 항체 결합 부위를 계산하였다. 결과를 다음에 요약하였다.
상기 결과로서 샘플1의 비드상에 고정화된 항체가 더 낮은 고정화 항체 농도에서 페노바비탈-효소 접합체 또는 페노바비탈 약제와 더 많이 결합함을 알 수 있는데 이것은 이 비드상에 고정화된 항체가 다른 비드상에 고정화되었을 때 보다 활성도가 더 많이 보유된다는 것이다.
[실시예 2]
본 발명의 공중합체 비드상에 항-페니토인 항체의 고정화 및 활성 보유.
다음과 같은 공중합체가 유용하였다.
항체의 라이신 잔기와 공중합체 4-7의 카복실산 그룹과의 반응에 대한 활성화제는 1-(1-피롤리디닐카보닐) 피리디늄 클로라이드이며 이후로 이것을 활성화제라 칭할 것이다.
비드 모두를 상기와 동일한 조건하에서 처리하였다. 0.3mg의 항체(항-페니토인 항체 DPH1.2) 및 30mg의 건조 비드를 포함한 반응 분산액 1.5㎖을 제조하였다. 비드 1-3에 대해 완충액 #1(pH8.5)을 사용했다. 비드 4-7에 대해, 완충액 #2(2-(4-모폴리노)에 탄설폰산 0.1몰)을 사용하며 비드 1g당 0.5mmol의 활성화제(0.015mmol)를 사용하였다. 항체를 함유하고 있는 비드를 다음과 같이 제조하였다.
30mg(건조 중량)의 비드를 함유한 중합체 입자 분산액 부분을 2㎖들이 미소원심분리 튜브에 넣었다. 적당한 완충액을 각각의 튜브에 부가하여 부피를 1.5㎖로 만들었다. 이 비드를 13,000rpm에서 10분간 원심분리하고 상등액을 제거해냈다. 비드 1-3을 1,393㎖의 완충액 #1을 사용해 재현탁시켰다. 비드 4-7을 1.093㎖의 완충액 #2을 사용해 재현탁시켰다. 활성화제 용액(완충액 #2 내 0.05몰 용액 0.3㎖)을 튜브 4-7에 부가하고 튜브의 마개를 막은 다음 10분간 교반시켰다. 일부분(2.82mg/㎖ 농도의 것 0.107㎖)의 항-페니토인 항체를 각 튜브에 부가하고, 튜브의 마개를 막은 다음 4시간 동안 교반시켰다.
100mg/㎖의 소의 혈청 알부민 용액 0.3㎖을 부가하여 반응물을 퀀칭시켰다. 튜브를 상온에서 16시간 동안 또 교반시켰다. 반응 혼합물을 원심분리시키고 상등액을 분석용으로서 취해 저장해 두며 비드를 1㎖의 염용액에 재현탁시켰다. 이 단계를 3번 반복했다. 최종적으로는 1.8㎖ 염용액에 재현탁시키며 머티올레이트를 0.02%의 최종 농도까지 부가했다.
반응 혼합물에서 얻은 상등액을 ELISA로 총 항체 농도에 대해 분석하였다. 표면에 결합한 항체의 양을 상기 결과로써 계산하였다.
항체 비드 분산액이 연속적인 희석액들을 세 개의 상이한 항원, 즉3H-페니토인 및 상이한 두 개의 합텐[5,5-디페닐하이단토인-3-1-발레린산(합텐#1) 및 5-에틸-5-페닐하이단토인-3-1-발레린산(합텐 #2)]으로 제조한 합텐-요소 접합체중 고정된 농도의 하나와 혼합시키는 분석법으로 제제내 활성 항체의 상대량을 측정했다. 희석된 항체 비드 분산액과 여러 항원간의 반응물을 0.1% 알부민이 함유된 인산염완충 염용액내에서 일정하게 교반하면서 상온에서 1시간 동안 인큐베이팅했다. 원심분리후 영액에 남아있는 효소-라벨 또는3H 페니토인의 양을 측정하고 50%의 항원을 결합시키는데 필요한 이론적인 결합부위 수를 계산하였다.
결과는 다음과 같다.
샘플 1의 비드상에 고정화된 항체가 흑종의 기타 비드상에 고정화된 항체보다 더 낮은 고정화 결합부위 농도에서 합텐 #2와 결합함을 상기 결과로써 알 수 있다. 이것은 항체를 기타 비드상에 고정화시켰을 때 보다 본 발명의 비드상에 고정화시켰을 때 항체가 합텐 #2와의 결합 부위를 더 많이 보유한다는 것을 나타낸다. 카복실산 그룹을 갖는 혹종의 비드상에 항체를 고정화시켰을 때 보다 샘플 1의 비드상에 고정화시켰을 때 합텐 #1 및3H-페니토인에 대한 항체 활성은 클로로에틸설포닐 그룹을 갖는 형태의 비드상에 고정화된 항체 활성과 유사하다.
[실시예 3]
실시예 1의 샘플 1입자와3H 소의 감마 글로불린과의 반응
15mg(건조 중량)의 중합체를 함유한 실시예 1의 샘플 1(93㎖, 16.2%) 일부분을 10mg/㎖(0.273mg)의 라벨링된(트리티에팅된) 소의 감마 글로불린 27㎖와 결합시키고 원심분리 튜브내에서 완충액 #1(pH8.5)로 최종 부피를 1.5㎖로 되게 했다. 이 튜브를 45。 각도로 끼워진 회전판에 끼우면서 30~35rpm에서 회전시켜 반응을 상온에서 24시간 동안 계속진행시켰다. 반응을 37℃에서 행했던 것을 제외하고 두 번째 부분을 상기와 같이 처리했다.
상기 반응시간이 경과한 후에, 과량의 알부민, 소의 형성 알부민(100mg/㎖ 농도인 것 250㎖)을 부가하여 각각의 반응물을 퀀칭시키고 4시간 동안 더 회전시켰다.
(a) 반응 혼합물 중 250㎖ 부분의 cpm(1분당 수), (b) 반응 혼합물중 1㎖ 샘플을 1400rpm에서 10분간 원심분리해서 얻은 상등액중 250㎖ 부분의 cpm, 및(c) (b)에서 얻은 펠릿을 반복 세척한 후 라텍스에 결합된 물질의 cpm을 측정하므로써 상기 라벨링된 글로불린이 결합된 총량을 측정하였다. 500㎖의 반응한 라텍스를 400㎖ 완충액 #1 및 100㎖의 10% 소듐 도데실 설페이트 존재하 37℃에서 20시간 동안 회전시키면서 인큐베이팅하여 라텍스에 공유결합된 글로불린 부분을 측정하였다. 상기 라벨링된 글로불린의 총 결합양을 측정하기 위한 방법과 동일한 방법을 공유 결합된 양을 측정하는데 사용하였다. 결과를 표 1 및 2에 기록하였다.
대략 동등한 양의 라벨링된 글로불린이 상기 두가지 온도에서 공유결합됨을 상기 반응 결과로써 알 수 있다.

Claims (13)

  1. (Ⅰ) (a) 에틸렌적으로 불포화되고 중합가능하며 소수성을 공중합체에 제공하는 80~99.9 몰%의 하나 이상의 친유성 단량체(단, 단량체중 어떤 것도 가교결합 단량체가 아님), (b) 에틸렌적으로 불포화되고 중합가능하며 숙신이미독시카보닐 그룹을 갖는 0.1~20몰%의 하나 이상의 단량체, 및 (c) 0~10몰%의 하나 이상의 에틸렌적으로 불포화된 중합가능한 단량체로부터 유도된 반복단위를 갖는 가교결합되지 않은 공중합체의 수불용성이며 비다공성인 입자를 (Ⅱ) 생물학적 활성 물질과 반응시키는 단계를 포함하고, 상기 (Ⅰ) 및 (Ⅱ)가 숙신이미독시카보닐 그룹의 숙신이미독시 부분의 치환에 의해 아미드 그룹을 통해 공유결합되는, 생물학적 활성 시약의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 생물학적 활성 물질이 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 지단백질, 당단백질, 호르몬, 약제, 스테로이드류, 비타민류, 다당류, 원생동물, 진균, 기생체, 리케챠, 곰팡이, 혈액 성분, 조직 및 기관성분, 조제약, 합텐, 렉틴, 독소, 핵산, 항원물질, 아비딘 또는 이것의 유도체, 비오틴 또는 이것의 유도체, 및 이것의 성분들로부터 선택되는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 생물학적 활성 물질이 항체인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 단량체(b)가 다음 구조식으로 표시되는 방법.
    식중, R은 수소, C1-3알킬 또는 할로, L은 최소한 2개의 탄소원자를 갖는 연결 그룹으로서 C1-8알킬렌, C6-12아릴렌, 이종원자 및 이종원자함유 그룹들 중 최소한 두 개의 조합으로 구성되며, m은 0 또는 1, n은 1 또는 2, p는 0 또는 1, 단, n이 2일 때 상기 알킬렌 및 아릴렌중 하나는 필수적으로 3가임.
  5. 제1항에 있어서, 단량체(b)가 N-아크릴오일옥시숙신이미드, 4-(2-숙신이미독시카보닐에틸티오메틸)스티렌, 4-(1,2-비스(숙신이미독시카보닐)에틸티오메틸)스티렌, 4(2-숙신이미독시카보닐페닐-티오메틸)스티렌인 방법.
  6. 내부에 하나 이상의 반응구역이 있고 이 구역들 중 최소한 하나에 생물학적 활성 시약이 들어있는 액체투과성 기판을 포함하는 분석 요소에 있어서 상기 생물학적 활성 시약이 (Ⅰ) (a) 에틸렌적으로 불포화되고 중합가능하며 소수성을 공중합체에 제공하는 80~99.9몰%의 하나 이상의 친유성 단량체(단, 단량체중 어떤 것도 가교결합 단량체가 아님), (b) 에틸렌적으로 불포화되고 중합가능하며 숙신이미독시카보닐 그룹을 갖는 0.1~20몰%의 하나 이상의 단량체, 및 (c) 0~10몰%의 하나 이상의 에틸렌적으로 불포화된 중합가능한 단량체로부터 유도된 반복단위를 갖는 가교결합되지 않은 공중합체의 수불용성이며 비다공성인 입자 및 (Ⅱ) 숙신이미독시카보닐 그룹의 숙신이미독시 부분의 치환에 의해 아미드 그룹을 통해 상기 입자에 공유결합되는 생물학적 활성 물질을 포함하는 것으로 특징되는 분석 요소.
  7. 제6항에 있어서, 생물학적 활성 물질이 항체인 분석 요소.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 단량체(b)가 다음 구조식으로 표시되는 분석 요소.
    식중, R은 수소, C1-3알킬 또는 할로, L은 최소한 2개의 탄소원자를 갖는 연결 그룹으로서 C1-8알킬렌, C6-12아릴렌, 및 이종원자 및 이종원자함유 그룹들 중 최소한 두 개의 조합이며, m은 0 또는 1, n은 1 또는 2, p는 0 또는 1, 단, n이 2일 때 상기 알킬렌 및 아릴렌중 하나는 필수적으로 3가임.
  9. 비다공성 지지체 위에 액체와 접촉하면서 차례대로, 효소에 대한 분석에서 검출가능한 시그널을 제공하기 위한 하나 이상의 시약을 함유하고 있는 시약층, 생물학적 활성 시약이 들어있는 다공성 확산 층, 및 상기 비다공성 지지체 상의 어떤 층에 있는 효소에 대해 라벨링되는 리간드 유사체가 놓여져 있는 비다공성 지지체를 포함하는 분석 요소에 있어서, 상기 생물학적 활성 시약이 (Ⅰ) (a) 에틸렌적으로 불포화되고 중합가능하며 소수성을 공중합체에 제공하는 80~99.9몰%의 하나 이상의 친유성 단량체(단, 단량체중 어떤 것도 가교결합 단량체가 아님), (b) 에틸렌적으로 불포화 중합가능하며 숙신이미독시카보닐 그룹을 갖는 0.1~20몰%의 하나 이상의 단량체, 및 (c) 0~10몰%의 하나 이상의 에틸렌적으로 불포화된 중합가능한 단량체로부터 유도된 반복단위를 갖는 가교결합되지 않은 공중합체의 수불용성이며 비다공성인 입자 및 (Ⅱ) 숙신이미독시카보닐 그룹의 숙신이미독시 부분의 치환에 의해 아미드 그룹을 통해 상기 입자에 공유결합된 리간드에 대한 수용체를 포함하는 것으로 특징되는 분석요소.
  10. (a) 수용성의 특이적 결합 리간드를 함유하고 있는 샘플을 생물학적활성 시약과 접촉시켜 상기 리간드와 상기 수용체와의 수불용성인 특이적 결합 복합체를 형성시키고, (b) 상기 샘플내 리간드의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하는 특이적 결합 리간드 검출 방법에 있어서, 상기 생물학적 활성 시약이 (Ⅰ) (a) 에틸렌적으로 불포화되고 중합가능하며 소수성을 공중합체에 제공하는 80~99.9몰%의 하나 이상의 친유성 단량체(단, 단량체중 어떤 것도 가교결합 단량체가 아님), (b) 에틸렌적으로 불포화되고 중합가능하며 숙신이미독시카보닐 그룹을 갖는 0.1~20몰%의 하나 이상의 단량체, 및 (c) 0~10몰%의 하나 이상의 에틸렌적으로 불포화된 중합가능한 단량체로부터 유도된 반복단위를 갖는 가교결합되지 않은 공중합체의 수불용성이며 비다공성인 입자 및 (Ⅱ) 숙신이미독시카보닐 그룹의 숙신이미독시 부분의 치환에 의해 아미드 그룹을 통해 상기 입자에 공유결합된 리간드에 대한 수용체를 포함하는 것으로 특징되는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 리간드가 항원 물질, 합텐 또는 약제이고 상기 수용체가 항원 물질, 합텐 또는 약제에 대한 항체인 방법.
  12. A. 수용성의 특이적 결합 리간드를 함유하고 있는 샘플을 생물학적 활성 시약과 접촉시키고, B. 단계 A전에, 단계 A와 동시에 또는 단계 A에 연속해서, 상기 샘플을 상기 리간드에 대한 수용체와 접촉시켜 수용체와 수용성 리간드와의 수용성인 특이적 결합 복합체 및 수용체와 상기 수불용성 리간드와의 수불용성인 특이적 결합 복합체를 형성시키며, C. 상기 수불용성 복합체를 수용성 물질과 분리시키고, D. 샘플내 리간드의 존재 또는 부재 표시로서 수불용성 복합체의 존재를 검출하는 것을 포함하는, 특이적 결합 리간드 검출 방법에 있어서, 상기 생물학적 활성 시약이 (Ⅰ) (a) 에틸렌적으로 불포화되고 중합가능하며 소수성을 공중합체에 제공하는 80~99.9몰%의 하나 이상의 친유성 단량체(단, 단량체중 어떤 것도 가교결합 단량체가 아님). (b) 에틸렌적으로 불포화되고 중합가능하며 숙신이미독시카보닐 그룹을 갖는 0.1~20몰%의 하나 이상의 단량체, 및 (c) 0~10몰%의 하나 이상의 에틸렌적으로 불포화된 중합가능한 단량체로부터 유도된 반복단위를 갖는 가교결합되지 않은 공중합체의 수불용성이며 비다공성인 입자 및 (Ⅱ) 숙신이미독시카보닐 그룹의 숙신이미독시 부분의 치환에 의해 아미드 그룹을 통해 상기 입자에 공유결합된 리간드 분자를 포함하는 것으로 특징되는 방법.
  13. A. 생물학적 활성 물질의 혼합물을 함유하고 있는 샘플을 입자 및 특이적 결합 물질을 포함하는 친화 크로마토그래피 시약에 통과시키고, B. 하나 이상의 미리 알고 있는 생물학적 활성 물질을 상기 시약상에 수집하는 것을 포함하는 분석 정제방법에 있어서, 상기 입자가 (a) 에틸렌적으로 불포화되고 중합가능하며 소수성을 공중합체에 제공하는 80~99.9몰%의 하나 이상의 친유성 단량체(단, 단량체중 어떤 것도 가교결합 단량체가 아님), (b) 에틸렌적으로 불포화되고 중합가능하며 숙신이미독시카보닐 그룹을 갖는 0.1~20몰%의 하나 이상의 단량체, 및 (c) 0~10몰%의 하나 이상의 에틸렌적으로 불포화된 중합가능한 단량체로부터 유도된 반복단위를 갖는 가교결합되지 않은 공중합체의 수불용성이며 비다공성인 입자를 포함하고 특이적 결합 물질이 숙신이미독시카보닐 그룹의 숙신이미독시 부분의 치환에 의해 아미드 그룹을 통해 입자에 공유결합되며 특이적 결합 물질이 생물학적 활성 물질의 샘플 혼합물내 미리 알고 있는 하나 이상의 생물학적 활성 물질에 특이적인 것으로 특징되는 방법.
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