KR100202052B1 - 보르드텔라 퍼투시스 독소를 해독시키는 방법과 이에 의해 해독된 비. 퍼투시스 독소 - Google Patents

Abstract

4-8및 23

Description

[발명의 명칭]

보르드텔라 퍼투시스 독소를 해독시키는 방법과 이에 의해 해독된 B.퍼투시스 독소

[발명의 상세한 설명]

[기술 영역]

본 발명은 일반적으로 인간 백신 약제로서의 사용을 위해 안전한 형태로 선택된 병원체로부터의 독소 항원을 해독화하거나 무독화시키기 위한 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 퍼투시스 독소를 해독시키고 보르드텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)용 백신 내 성분으로서 결과 톡소이드를 사용하는 방법에 관한 것이다.

[발명의 배경]

백일해는 주로 어린이들이 잘 걸리는 매우 감염성인 질병이다. 백일해는 호흡기 합병증을 일으키는데다가, 특히 낮은 사회경제적 집단의 어린이들에게서, 그리고 어머니의 항 백일해 항체가 없는 신생아에게서, 신경 손상 및 높은 사망률을 초래할 수 있다. 백일해는 병인제는 그람 음성 코코바실러스 보르드텔라 퍼투시스이다. 이 세균은 기관지에 침범하여 세균이 사라진 후까지 잔류하는 독성 상태를 유발한다고 믿어진다.

최근 세계 보건 기구에서 백일해의 발명과 만연을 막기 위해 유아의 면역을 권장하고 있지만, 다양한 백신 형태의 부작용에 대한 많은 염려가 증가해 왔다. 통상적인 B. 퍼투시스 백신 배합물의 독성은 단순한 발열에서부터 영구적인 신경학상의 장애 및/또는 죽음에 이르기까지 다양한 부작용을 야기한다. 이에 따른 B. 퍼투시스 백신의 감소된 사용은 퍼투시스 병종의 발병을 재증가시켰다. 가장 광범위하게 사용되는 백신은 56에서 30분간의 처리 후 불활성화된 B. 퍼투시스 유기체 전체를 함유하는 것이다. 이는 세균이 임의 해독 처리에 적용되지 않았기 때문에, 고온에 견딜 수 있는 독소 물질이 백신 내에 함유되어 부작용의 발생에 기여하게 된다. 상기 유형 백신의 또다른 결과는 투여에 대한 반응으로서 광범위한 스펙트럼의 항체 형성이다. 상기 백신에 의해 유도된 혈청은 예방 또는 요법 치료로서의 사용에 있어서 높은 방지 효능 및 높은 특이성이 결여되어 있고, 진단 물질로서의 가치가 전혀 없다.

백신이 사용되는 경우 병원체 해독에 가장 중요한 방법은 가열 및 포름알데히드 또는 글루타르알데히드로의 화학적 처리이다. 그러나, B. 퍼투스시스 배양 상등물의 배양에 있어서의 변수는 미생물의 최종 조성을 변화시키고, 불활성화제, 글루타르알데히드 또는 포름알데히드는 종종 저장시 응집 물질의 활성 독성 물질로의 전환을 초래한다.

예컨대, Relyveld의 U.S. 특허 제 3,983,229 호는 0.00131M 내지 0.526M사이의 농도에서 1 내지 3시간 동안 비루스를 글루타르알데히드와 접촉시켜 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 35내지 40의 온도에서 수행되며 반응은 글루타르알데히드를 차단시키거나 또는 그의 유리 상태에서 글루타르알데히드와 반응할 수 있는 시약을 첨가하므로써 중단될 수 있다. 차단제는 아미노산 또는 무기염일 수 있다. Relyveld의 U.S. 특허 제 4,070,454 호는 1.5시간 내지 약 5일 동안 비루스를 0.00263M 농도의 글루타르알데히드로 불활성화시키는 것을 포함하는 또다른 비루스 백신 제조 방법을 공개한다.

U.S. 특히 제 4,075,321 호는 전체 세균을 약 0.00131 내지 0.0526M 농도의 글루타르알데히드와 반응시키므로써 세균 독소를 불활성화시키기 위한 상기 방법을 개선한다.

Gupta의 J. Biol. Stand., 15 : 159-164(1987)는 글루타르알데히드 해독 반응의 Relyveld 방법에 의해 얻어지는 것과 전통적인 열처리에 의해 얻어지는 전체 세포 백신을 비교한다. 두 유형의 백신은 분명히, 35에서 30 일 동안 저장시에 그들 효력의 30 내지 50%를 상실한다. 더우기, 이들 제제는 보다 최근에 개발된 비세포 백신 또는 성분 백신과 비교할 때 중요한 단점, 예컨대 낮은 면역원성과 투여시 잔류 독성에 의해 야기되는 심각한 부작용을 갖는다. 이들 백신은 악성 균주로부터 제조된 것들 보다 매우 덜 보호적임이 증명되었다. Wardlaw 일행의 J. Med. Micro. Biol., 9 : 89-100(1976) 참조하라.

전체 비루스 백신에 의해 야기되는 부작용을 피하기 위해, 연구를 비세포 및 성분 백신으로 사용하기 위한 B. 퍼투시스 세균의 독성 성분 탐구로 전환했다. 중요한 B. 퍼투시스 항원 중 하나는 B. 퍼투시스의 독소로서, 백일해의 발병에 중요한 역할을 하는 단백질 외독소인 퍼투시스 독소(PT)이며, 이는 B. 퍼투시스의 주요 보호 항원으로 생각된다[A. A. Weiss 일행, Ann. Rev.Microbiol., 40 ; 661 (1986)]. PT는 단독으로 존재하든 이 유기체로 부터의 다른 항원 요소의 오염균으로서 존재하든 간에, 소량으로 다양한 심각한 생물 병리학적 변화를 유발하므로, 이것이 우수한 수준의 보호를 제공하기에 충분한 양으로의 백신 성분으로서 B. 퍼투시스 세포 또는 세포 추출물을 투여하는 것을 방해한다. 그러므로, B. 퍼투시스 세포 또는 세포 추출물은 백신 제제에 그들을 사용하기 전에 해독시켜야만 한다.

PT(또는 PT를 함유하는 배세포 또는 성분 백신)의 해독을 위해, 세가지 주요 방법이 서술되었다. 유럽 특허 출원 공개 번호 121249 A에서는, B. 퍼투시스를 배양 상등물로부터 정제하고, PT를 함유하는 혈구응집소 단편을 아미노산 존재 하에 포르말린으로 해독시키고, 이어 이를 백신 배합물로 사용했다. 도달된 해독 정도와 면역원성은 탁월했지만, 37에서 30일 동안 백신 제제를 저장한 경우, 독성은 부분적으로 복원됐다.

Munoz, Infect. Immunol., 32 : 243-250 (1981)는 염의 존재 하에, Relyveld의 것과 유사한 해독 방법을 PT에 사용했다. 0.05% 글루타르알데히드의 존재 하에 실온에서 두시간 항온 처리한 후에, 계속하여 0.02M 이하의 리신을 첨가하여 다시 두시간 항온 처리하고, 최종 투석하여 높은 면역원성을 갖는 아나독신을 생성시켰다. 이 아나독신은 안정했고; 그의 독성은 37에서 30일 저장 후 복원되지 않았다.

그러나, 해독 정도는 포르말린/아미노산 방법으로 얻어진 것보다 낮았다.

유럽 특허 출원 공개 번호 202947 A에서, PT 및 PT를 함유하는 B. 퍼투시스 단편의 해독을 위한 유효한 시약으로서 카보디이미드가 제공된다. 그러나, 얻어진 톡소이드는 37에서 30일 저장시 안정하지 않았다. 그러므로 활성을 보유하고 저장시에 독성으로 복귀하지 않는, 백일해에 대항하는 효과적이고 안전한 백신에 대한 계속되는 요구가 당업계에 남아있다.

[발명의 요약]

한 측면으로서, 본 발명은 병원성 미생물로부터 선택된 독성 항원의 해독 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 독성 항원을 함유하는 조성물 또는 선택된 독소를 글루타르알데히드로 부분적으로 해독시키고, 이어 선택된 아미노산의 존재 하에 부분적으로 해독된 독소를 포르말린과 반응시키는 단계들을 포함하여 구성된다. 결과 톡소이드 또는 톡소이드 함유 제제는 약 23이상의 온도, 즉 실온의 영양 하에서 독소로의 복귀에 대하여 안정하다.

상기 방법의 이용을 예시하기 위해 사용된 하나의 전형적인 항원은 B. 퍼투시스 독소이다. 본 발명의 방법에 적용될 수 있는 다른 독소는, 예컨대 파상풍 독소 또는 디프레리아 독소를 포함한다. 상기 방법은 독소, 예컨대 주성분으로서 또는 단지, 예컨대 다른 B. 퍼투시스 항원인 FHA, 비독성 및 응집원과 같은, 단독으로는 비독성인 항원 요소들을 포함하는 제제 내의 오염군으로서 존재하는 퍼투시스 독소(PT)를 불활성화시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 단독으로 또는 동일한 병원균의 다른 항원 요소의 조성물 내에 존재하는 선택된 독소의 존재에 수반하는 독성을, 백신 배합물로서 사용하기에 적합한 수준으로 감소시킬 수 있다.

또다른 측면으로서, 본 발명은 23또는 그 이상의 온도에서 독성으로의 복귀에 대해 안정한 해독된 백일해 독소를 제공한다. 또한, 본 발명의 이와 같은 톡소이드는 항체 중화를 유발하는 톡소이드의 활성에 의해 표현되는 것과 같이, 높은 수준의 면역원성을 특징으로 한다. 중화 항체의 존재는 특별한 검정, 즉, 쥐의 히스타민 감작(感作) 또는 차이니스 햄스터 난소 세포의 균주균 형성에 의해 감지된다. 본 발명의 해독 독소는 37의 불리한 저장 조건 하에서 한달 이상 동안 면역원성을 보존하기에 충분히 안정하다. 상기 톡소이드는 고품질의 B. 퍼투시스 백신 조성물에 대한 유용한 출발 물질이고, 또한 혼합 백신 또는 초면역 혈청의 제조에 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면으로서, 상기 서술된 바와 같은 적어도 미량의 해독된 PT 독소를 함유하고, 유기체에 대한 백신의 제조에 유용한 B. 퍼투시스의 항원 인자들, 예컨대 섬유 혈구응집소(FH미생물로부터의 69K 인자 또는 기타 B. 퍼투시스 응집소 등을 포함하는 저성물이 제공된다.

또다른 측면에 있어서, 56이하의 온도에서 안정한 채로 유지되고, 특별한 냉각 저장 및 운반 조건을 요구하지 않는 B. 퍼투시스 감염에 대항하는 백신이 제공된다. 본 발명의 백신은 최적 이하의 조건에서 용이한 지속성 및 저장을 특징으로 한다. 본 발명의 톡소이드를 사용하여 개발된 백신은, 다른 무독화된 백신의 유지에 일반적으로 요구되는 냉각 저장 조건이 사용될 수 없고 분위기 조건이 극단적인, 고립되거나 불충분하게 개발된 영역에서 백신화 프로그램이 수행될 수 있도록 한다. 상기와 같은 조건에서조차 본 발명의 백신은 안정하고 고품질이 유지된다.

본 발명의 또 다른 측면은 유효량의 본 발명 톡소이드가 함유된 단일 기능 또는 다기능 백신의 제조 방법이다. 본 발명의 다른 측면 및 이점은 하기 그의 상세한 설명에서 더욱 서술된다.

본 발명은 백신 배합물에 사용하기 위한 선택된 병원성 독성 항원, 예컨대 B. 퍼투시스 독소를 해독시키는 방법, 상기 선택된 톡소이드를 함유하는 개선된 백신 배합물 및 무독화된 항원을 함유하는 제제를 제공한다.

본 발명의 방법은 다른 것들 중 예컨대 파상풍 독소 또는 디프테리아 독소와 같은, 백신이 요구되는 다양한 병원성 미생물로부터의 다수의 독성 항원을 무독화할 수 있음이 합리적으로 예측된다. 그러나, 서술 및 실험의 용이함을 위해, 여기서는 상기 무독화 방법의 효과를 예시하기 위해 병원균 보르드텔라 퍼투시스로부터의 퍼투시스 독소를 사용한다.

간단히 설명하면, 본 발명의 무독화 PT는 시약으로서 글루타르알데히드를 사용하여 독소를 부분적으로 해독시키고, 이어 아미노산 존재 하에 포름알데히드와 PT를 반응시키므로써 생성된다.

본 발명에 있어서, PT의 추출물은 보르드텔라 퍼투시스의 배양물 또는 발효 육즙으로부터 얻어진다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 B. 퍼투시스의 다양한 균주는 기술되어 있고, 메릴랜드주 록빌시, American Type Culture Collection와 같은 상업적 기탁 기관으로부터 용이하게 구입 가능하다. 임의 이들 구입 가능한 균주는, 이들이 액체 배양 배지에서 적당한 양으로 원하는 항원 인자, 즉 PT를 생성할 수만 있다면, 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.

본 발명에 사용될 수 있는 균주의 실례는, 제한됨이 없이, B. 퍼투시스 상 I, B. 퍼투시스 상, B. 퍼투시스 상 I CS, B. 퍼투시스 토하마(Tohama), B. 퍼투시스 균주 185-30, B. 퍼투시스 균주 18-323, B. 퍼주시스 균주 134,B. 퍼투시스 균주 509, B. 퍼투시스 균주 웰컴(Wellcome) 28, 및 바이오로직스사무소 B. 퍼투시스 균주 165를 포함한다. 본 발명에 사용하기 바람직한 균주는 기탁 번호 IFO-14073 하에 일본 오사카 발효 협회로부터 구입 가능한 B. 퍼투시스 상 I, 토하마이다.

본 발명에 사용하기 위하여 선택된 B. 퍼투시스 균주는 당업자들에게 공지된 다양한 방법에 의하여 증식될 수 있다. 종균의 양 및 기원 또는 보존 방법에 좌우되는, 상이한 배양 단계, 및 액체 또는 고체 배지를 사용하는 다양한 배양 방법이 공지되어 있다. 그러나, 대규모 생산을 위해 통상적으로 허용 가능한 크기의 접종물을 제공하는 임의의 방업이 본 발명에서 사용하기에 적합할 것이다.

B. 퍼투시스 접종물의 증식에 적합한 배지는 당업자에 의해 선택될 수 있으며, 제한됨이 없이, Gengou 배지 [유럽 특허 제 0 077 646 호] ; N.Andron 일행의 Appl. Microbiol. Biotechnol, 28 : 356-360 (1988) 및 그에 언급된 참고 문헌에 기술된 배지 ; Verway 배지 [U.S. 특허 제 4,784,589 호] ; 합성 배지 B2 [P. Van Hemert, in Prog. Indust. Nicrobiol., (Bull, M.J., ed.), Vol. 13, p. 151, Elsevier Sci., 암스테르담(1977)] 또는 그의 서술된 변형물을 포함한다.

본 발명의 출발 물질인 B. 퍼투시스 배양물의 증식을 위해 접종물을 적합한 액체 배지에 첨가하고, 당업계에 공지된 통상적인 발효법 및 발효조 설계를 사용하여 발효를 수행한다. 당업자들은 특정한 조합의 통상적인 발효조 설계, 발효 배지, 방법 및 매개 변수의 선택에 따라 상이한 결과가 얻어질 수 있음을 알 수 있을 것이다. 본 발명에 사용하기 위해 바람직한 조합은 대규모 생산에 사용하기 적합한 것이다. 상기 방법, 설계 및 배지 조합의 실례는 모두 상기 언급된 유럽 특허 출원 공개 번호 A 077,646 ; 유럽 특허 출원 공개 번호 A 121,249 ; 유럽 특허 출원 공개 번호 A 239,504 ; Ardron 일행, Sato 일행 (1983), Sekura 일행 및 Svoboda 일행에 의해 예시되어 있다. 유럽 특허 출원 공개 번호 A 121,249 ; Andorn 일행의 상기 언급된 것, 및 유럽 특허 출원 번호 A 239,504에 기술된 방법이 가장 바람직하다.

본 발명의 실행에서, 발효의 완료 후 원하는 PT 인자의 변질 및/또는 변성을 피하기 위해 B. 퍼투시스 발효 육즙을 무균 조건에서 유지시킨다. 본 발명의 바람직한 실시 양태에서, 육즙을 1-10로 냉각시키고, 이 온도에서 유지시킨다. pH를 7.0이하로 조정한다. 바람직하게, pH는 인산 또는 아세트산으로 약 pH 6.0의 범위로 조정한다. 임의로 방부제, 예컨대 나트륨 티메로살을 0.2 g/1 이하의 최종 농도로, 또는 2-페녹시-에탄올을 0.5% 내지 1%의 최종 농도 이하로 육즙에 첨가할 수 있다. 원한다면, 또한 방부제는 본 발명의 방법에서 사용되는 완충 용액에 첨가시킬 수도 있다.

본 발명의 방법에서 임의 첫번째 단계로서, 발효 육즙은 주요 입자와 그로부터의 펠릿을 제거하기 위하여, 접촉이 주위로부터의 오염 위험성을 피할 수 있다는 것을 조건으로 하여 여과기를 통과할 수 있다. 결과 육즙을 방법의 하기 단계들에 적용시킬 수 있다. 대안적으로, PT를 함유하는 보다 정제된 용액을 하기 단계들로 처리시킬 수 있다. 설명의 용이함을 위하여, 상기 방법은 PT와 임의로 FHA와 같은 다른 B. 퍼투시스 항원 요소를 함유하는 제제로서 정의되는 항원 요소 용액을 언급할 것이다. 상기 제제는 주로 PT를 함유하는 발효 육즙, 또는 단지 오염 양의 PT를 갖는 다른 B. 퍼투시스 항원을 주로 함유하는 정제 용액을 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 항원 요소 용액은 대략적으로 중성 pH, 즉 pH 5 내지 약 pH 9로 완충된 수성 배지에서, 대략 0.02 내지 2/, 바람직하게는 0.1 내지 0.25/,의 독소 농도로 희석시킨다. 바람직하게, pH의 범위는 7.5-7.7이다. 대표적인 완충액은 50mM 포스페이트와 0.5M NaCl을 함유하고, 여기서 완충액 D로 칭해진다.

희석 후 용액은 예컨대,0.22mcm 살균 막을 통과하는 여과에 의해 임의로 살균될 수 있다. 항원 요소 용액을 25%의 글루타르알데히드 수용액 0.03 내지 0.07 중량%로 처리시킨다. 보다 바람직하게, 상기 처리 단계에서 25% 글루타르알데히드 수용액 0.55%를 함유하는 희석액이 사용된다. 상기 단계를 위해, 바람직하게 글루타르알데히드 0.55 중량%가 상기 서술된 완충액 D에 제공된다.

글루타르알데히드 용액을 대략 1 내지 4시간 동안 항원 요소 용액에 적용시킨다. 보다 바람직하게 1 내지 3시간이 글루타르알데히드 처리 단계에 사용되고, 현재 바람직한 시간은 2시간이다. 글루타르알데히드 처리 단계의 온도는 바람직하게 주변 온도, 즉 대략 20내지 25이다. 임의적으로, 보다 짧은 반응 시간이 주위 보다 높은 온도와 함께 사용되거나, 보다 긴 시간이 주위 보다 낮은 온도와 함께 사용될 수 있다. 또한 불활성화는 상이한 반응 온도 및 적당하게 변형된 접촉 시간에서 성취될 수 있고, 예컨대 10의 온도는 2 내지 8시간 동안, 보다 바람직하게 4시간 동안 사용될 수 있다. 30의 온도가 30분 내지 2시간, 보다 바람직하게 1시간 동안 사용될 수 있다. 대안적으로 37의 온도가 15분 내지 1시간, 보다 바람직하게 30분 동안 사용될 수 있다. 상기 글루타르알데히드 처리 단계는 시약의 농도와 반응 시간에 의존하여 항원 요소의 부분적인 해독을 결과시킬 수 있다. 예컨대, 상기 서술된 농도에서 2 시간 동안 20-25에서의 글루타르알데히드의 처리는 독소 활성의 0.003%를 감소시킨다. 나머지 처리 조건은 보다 큰 독성 활성의 감소를 결과시킬 수 있다.

상기 해독화 단계 후에, 적어도 하나의 선택된 아미노산을 용액 내 부분적으로 해독된 항원 요소에 첨가시킨다. 아미노산을 대갹 0.05 내지 2중량%의 최종 농도로 첨가시킨다. 바람직한 아미노산 농도는 0.8중량%이다.

상기 단계에 사용되는 선택된 아미노산은 트립토판, 글리신, 리신 및 이들의 유도체 또는 단백질 분해 효소에 존재하는 것과 같은 다른 아미노산을 포함할 수 있다. 바람직하게 아미노산은 프립토판, 리신 및 글리신 또는 그의 유도체이다. 아미노산은 바람직하게 용액으로, 예컨대 상기 서술된 완충액 D로 제조되고, 항원 요소 용액에 둘 이상 아미노산의 혼합물로서, 또는 따로 따로 첨가될 수도 있다. 현재 하나의 바람직한 실시 양태에서, 10%(w/v) Tween 80 용액, 57.4mM N-아세틸-트립토판 33ml 및 2.2 M 글리신 11ml를 각각 함유하는 세개의 용액이 완충액 D로 제조된다. 상기 세 개의 용액을 0.22mcm 살균 막을 통하여 여과에 의해 살균시킨다.

포르말린을 1 내지 10 중량%, 및 보다 바람직하게 2-4 중량%의 농도로 항원 요소 및 아미노산 용액에 첨가시켰다. 포르말린은 또한 완충액 D 또는 유사 완충액으로 제조될 수 있다. 포르말린을 3 내지 10일, 보다 바람직하게 7일의 기간에 걸쳐 대략 동들한 양으로 항원 요소/아미노산 용액에 첨가시킨다. 포르말린 처리 동안 독소를 37 내지 45의 온도에서 유지시킨다. 바람직하게, 독소를 또한 상기 기간 동안 주기적으로 교반시키고, 무균 조건하에 유지시킨다. 포르말린/아미노산 처리 단계의 마지막 부분에, 해독된 B. 퍼투시스 톡소이드 용액을 저온, 바람직하게 2-6에서 밤새 저장할 수 있다. 이어 해독화 과정 중 형성된 임의 응집물을, 톡소이드를 초음파 처리시켜 파쇄한다. 예컨대, 용액을 1-30초의 시간 동안 1000와트 이하의 전력을 갖는 약 16-80kHz의 주파수에서 초음파 처리할 수 있다. 바람직하게 초음파 처리는 약 20KHz의 주파수를 수반한다. 보다 바람직하게, 전력 범위는 600 - 800와트이다. 초음파 처리 시간은 바람직하게 5 내지 15초이다. 결과 용액을 바람직하게 50mcm 스크린을 통하여 여과시킨다.

본 발명의 해독화 방법의 마지막 단계로서, 항온 처리된 생성물을 과량의 시약 제거를 위한 통상적인 방식으로 FBS에 대해 투석시킨다. 투석 완충액 및 투석 기간의 변화는 잔류 포르말린 농도를 200ppm 이하로 제공하기에 충분한 횟수로 수행한다. 보다 바람직하게 포르말린 농도를 약 20ppm 으로 유지시켰다. 상기 농도는 불활성화 절차에서 사용된 다른 약제의 농도를 감지 불가능하거나 무의미한 농도로 감소시키는 것이다.

결과 정제된 B. 퍼투시스 독소 또는 본 발명의 방법에 의해 무독화된 PT를 함유하는 다른 B. 퍼투시스 항원 요소의 혼합물은, 독성의 완전하고도 비가역적인 불활성화를 특징으로 한다. 독성 형태로의 전환에 대항하는 상기 안전성은, 온도가 심지어 상온, 즉 23이상인 저장 조건 하에서도 유지된다. 상기 안정성은 56에서 적어도 한주 동안, 37에서 적어도 4주 동안의 실험적 시험에서 증명되었다. 게다가, 본 발명의 톡소이드는 4 내지 8의 차가운 저장 온도에서는 2년 이상 동안 안정한 채로 남아 있을 것으로 예측된다. 상기 결과의 톡소이드 또는 항원 요소는 백신 제제에 분산될 수 있는 B. 퍼투시스 항원 제제 내 또는 백신 배합물 내의 성분으로서 사용될 수 있다.

그러므로, 본 발명은 또한 본 발명의 톡소이드 또는 항원 요소의 면역 보호적 양, 즉 심각한 부작용 없이 무독화된 PT 또는 다른 항원 요소가 투여되어 B. 퍼투시스에 대항하여 보호 항체 반응을 유도하기에 충분한 양을 함유하는 백신을 제공한다. 상기 백신은 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다. 예컨대, 인간 내 B. 퍼투시스 감염에 대항하는 보호를 자극하기 위한 백신은 상기 서술된 안정한 톡소이드와 항원 요소 및 적당한 통상적인 부형제를 함유한다. 본 발명의 하나 이상의 콕소이드와 항원 요소 및 적당한 통상적인 부형제를 함유한다. 본 발명의 하나 이상의 톡소이드 또는 항원 요소는 직접적인 사용을 위해 생리적 pH로 완충된 수성 용액일 수 있다. 대안적으로, 무독화된 항원은 통상적인 보조제, 예켠대 알루미늄 히드록시드 또는 알루미늄 포스페이트와 혼합되거나 여기에 흡착될 수 있다. 또한 상기 B. 퍼투시스 톡소이드는 하나 이상의 항원에 대항하는 보호를 유발할 수 있는 조합물 또는 다기능 백신을 제조하기 위해 다른 면역체들과 조합될 수 있다. 예컨대, New Trends and Developments in Vaccines, eds., Voller 일행, 메릴랜드주 발티모에서, 유니버시티 파이크 프레스(1978)를 참조하라.

상기 백신은 적합한 경로, 예컨대 피하, 정맥 내 또는 근육 내 경로에 의해 투여될 수 있다. 각 백신 투여량에 존재하는 본 발명의 선택된 톡소이드의 양은 환자의 나이, 체중, 성별, 일반적인 생리적 조건 등을 고려하여 수행 의사에 의해 선택된다. 우희한 불리한 부작용 없이 환자에게 면역 보호 반응을 유발하는 양은 사용된 면역원과 보조제의 임의 존재에 의존하여 변화될 수 있다. 일반적으로, 각 투여량은 항원 2 내지 50u/g, 바람직하게 각각의 톡소이드 및 항원 요소 5 내지 25u/g 으로 구성될 것으로 예측된다. 초기 투여량은, 원한다면 임의적으로 반복된 투여로 이어질 수 있다. 하기 실시예는 본 발명의 모범적 톡소이드 제조 방법 및 그의 면역성 및 저장 중 독성으로의 전환 저항성의 평가를 예시한다. 또한 예시된 것은 본 발명의 톡소이드를 사용하는 모범적인 백신 제제이다.

[실시예 1]

[무독화 방법]

참고로 포함된 유럽 특허 출원 공개 번호 EP-A-0 352 250 호에 기재된 바와 같이, 발효조 증식 배지로부터 B. 퍼투시스 독소를 추출하고 정제시켰다. 정제된 PT 독소 1리터를 먼저 실온, 예컨대, 25에서 완충액 D로 제조된 0.55%(w/v) 글루타르알데히드 용액 100ml로 처리하였다. 용액을 중성 pH에서 상기 기술한 완충액 D 내 최종 단백질 농도 0.2mg/ml로 희석시키고, 0.22mcm 살균막을 통하여 여과사키므로써 살균하였다. 글루타르알데히드 처리 단계는 2시간 동안 반응하도록 두었다. 이어서 10% (w/v) Tween 80 용액 4.4ml, 57.4mM N-아세틸-트립토판 33ml 및 2.2M 글리신 11ml를 첨가하였다. 이들 세 용액은 D완충액으로 제조하고 0.22mcm 살균막을 통하여 여과에 의해 살균시켰다. 이어서 포르말린, D완충액 내 3.7% (w/v) 용액을 하기 계획에 따라 세 부분으로 나누어 첨가하였다 :

첫째날, 33ml ; 둘째날 33ml ; 및 셋째날 22ml의 포르말린을 첨가했다. 최종포르말린 농도는 0.26%(w/v)이었다. 7일 간의 포르말린 처리 동안, PT 독소를 교반 및 무균 조건 하 40 1에서 유지시켰다. 과정의 마지막에, 해독된 PT 벌크 용액을 초음파 처리 전에 2-6에서 밤새 저장했다. 용액을 초음파 처리하고 결과 항원 용액을 50mcm 스크린을 통하여 여과시켰다..

[실시예 2]

[백신 성분의 독성 성질]

본 발명의 방법 및 생성물의 이점을 증명하기 위하여, 글루타르알데히드 만으로, 포르말린 및 아미노산 만으로, 그리고 글루타르알데히드 및 포르말린/아미노산으로 무독화시켜 제조된 생성물과 실시예 1의 톡소이드 제제를 여기 기술된 것과 같이 비교하였다.

각 표본을 4또는 37에서 한달 동안 저장시킨 후, 톡소이드의 잔류 독성 연구를 수행했다. 연구는 활성 PT에 노출된 세포가 당업자에 의해 정상적인 증식 세포와 쉽게 구별 가능한 균주군을 형성하는 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포 형태학 시험을 포함한다. 예컨대 Gillenius 일행의 J. Biol.Stand., 13 : 61-66 (1985)를 참조하라. 시험은 시험될 톡소이드 또는 항원 요소의 일련의 희석액을 마크로타이터 판에서 200배양 육즙 내 2 S10⁴CHO 세포의 현탁액과 혼합시키고, 세포를 정착시키고 37에서 2 일 동안 증식시켜 수행했다. 항온 처리의 마지막에, 균주군 수를 현미경 관찰에 의해 기록했다. 이 시험은 약 100피코그램의 활성 독소에 민감하다.

하기 표 1에 예시된 결과는 포르말린/아미노산 만으로의 처리가 완전한 불활성화를 제공하나, 불안정하여 37에서 4주 후에 독성으로 전환됨을 보여준다. 글루타르알데히드 단독 처리는 불완전하나 안정한 불활성화를 산출한다. 글루타르알데히드 및 포르말린/아미노산 처리를 포함하는 본 발명의 방법은 완전하고도 안정한 불활성화를 제공한다.

* 검정의 감지 한계에 상응한다. 1 CPU(세포 변성 단위)는 모든 세포의 형태학적 변화를 유발시키는 항원의 최소 투여량이다. 천연 독소의 경우, 1 CPU는 약 3ng/ml의 농도에 상응한다.

연구는 또한 알루미늄 히드록시드에 흡착된 백신을 사용한 생쥐에서의 히스타민 감응도 시험을 포함한다. 10 마리 생쥐(스위스 O1)의 그룹을 퍼투시스 톡소이드 6및 처리된 FHA 25을 함유하는 1 투여량의 백신으로 정맥 내에 접종시켰다. 4일 후, 생쥐의 복막 내로 완충 염수 내의 히스타민 1mg으로 공격하였다. 공격 후 두 시간이 지난 뒤, 각 그룹의 치사율을 기록했다. 예컨대, Munoz 일행의 Infect. Immunol., 33 : 820-826 (1981)을 참조하라. 히스타민 시험은 생쥐 당 약 30ng의 활성 독소에 대해 민감하다.

상기 검정의 결과는 표 2에 제시되고, CHO 시험과 유사하게, 포르말린/아미노산의 처리는 완전하나, 37에서 한 달 동안 백신을 항온 처리하는 경우 가역적인 불활성화를 제공함을 증명한다. 그러나, 상기 시험은 글루타르알데히드 및 포르말린/아미노산으로 처리된 제제 둘다에서 독성으로의 전환 또는 독성을 감지하지 못했다. 이러한 결과는 CHO시험 결과와 모순되는 것은 아닌데, 그 이유는 히스타민 공격 시험은 CHO 시험 보다 덜 민감하고, 따라서 글루타르알데히드 처리된 표본에서 잔류 독성 함량이 감지되지 않았기 때문이다.

[실시예 3 ; 백신 성분의 항원 성질]

포르말린/아미노산 만으로의 처리, 글루타르알데히드 만으로의 처리, 또는 실시예 1에 서술된 바와 같은 본 발명의 방법에 의한 불활성화에 의해 얻어진 톡소이드 제제를, PT에 대항하여 유도된 특정 토끼 항체를 사용하여 효소 면역 검정법으로 시험했다. 상기 항체는 포르말린/아미노산에 의해 불활성화된 톡소이드로 토끼를 면역화하여 얻었다.

항체를 비오틴과 접합시켜 스트렙타비딘 : 퍼옥시다제 시약에 의해 결합된 항체가 490nm 에서의 흡광도 측정에 의해 감지되도록 하였다.

결과는 표 3에 예시된다. 그들은 천연 독소가 가장 효과적인 것으로 인식됨을 보여 준다. 글루타르알데히드 불활성화만으로 제조된 톡소이드는 가장 낮은 반응성을 보인다. 포르말린/아미노산 처리에 의해, 또는 본 발명의 방법의 처리에 의해 제조된 톡소이드는 중간 반응성을 나타낸다.

[실시예 4 ; 생쥐에서의 무독화된 PT의 보호 효율]

12 마리 생쥐(Balb/c) 그룹을 7일 간격으로 2회, 주어진 톡소이드 제제 2에 의해 면역화시켰다. 두번째 주사 후 14일째 날에, 그들을 초 전염성(hypervirulent) B. 퍼투시스 균주[(18-323 Ac ); 예컨대, Brezin 일행의 FEMS Microbiol. Lett., 42 : 75-80 (1987)을 참조하라]로써 공격하였다. 공격후 6일이 지난 쥐 치사율을 기록했다.

하기 표 4에 예시된 결과는 본 발명의 방법이 가장 우수한 보호 효율을 갖는 B. 퍼투시스 톡소이드를 제공함을 보여준다.

[실시예 5 ; 백신 제제]

백신을 배합하기 위해, B. 퍼투시스 항원은 만족스러운 면역학적 성질을 보유하는 한편 독소 성질이 전혀 없어야 한다. 상기 목적은 무독화 B. 퍼투시스 독소에 의해, 및/또는, 일반적으로 오염 양의 PT 독소를 함유하는 다른 항원에 적용되는 유사 방법에 의해 수행된다. 미합중국 특허 제 4,675,321호에서와 같은 글루타르알데히드로의 처리는 불완전한 불활성화를 초래한다. 유럽 특허 출원 제 121,249 호에서 같이 포르말린만으로의 처리는 완전하나 부분적으로 가역적인 불활성화 및 보존 면역원을 초래한다. 그러나, 본 발명방법의 사용, 예컨대 상기 서술된 바와 같이 글루타르알데히드 및 포르말린/아미노산으로 PT 함유 용액의 처리는, 놀랍게도 완전한 불활성화 및 비가역적 불활성화를 초래한다. 또한 결과 용액은 보존되는 면역원성을 특징으로 한다. 그러므로, 본 발명의 생성물 및 방법은 상기 항원을 함유하는 B. 퍼투시스 백신의 면역원성 및 안전성에 대해 그들의 공헌에 있어서 가치있다.

[실시예 6 ; 백신 제제의 안정성]

실시예 1에 서술된 바와 같은 본 발명의 방법 및 실시예 5에서 서술된 제조 절차의 불활성화에 의해 얻어진 백신 제제를 상이한 열 처리에 적용시켰다 : 56에서 1주, 37에서 4주 또는 4-8에서 1년 동안 유지시킴. 실시예 2에 서술된 바와 같이 생쥐 내에서의 히스타민 감응도 검정에 의해 백신 표본의 활성 PT를 검정했다. 표 5에서 제시된 결과는 상기 처리 후 독성으로의 전환이 없음을 보여준다.

[실시예 7 ; 4-8에서 장기간 저장시 면역원성 및 안정성]

실시예 5에서와 같이 배합된 항원 제제를 4-8에서 저장하고, 다양한 시간에서 실시예 2에 서술된 바와 같은 PT의 히스타민 감응 활성, 및 생쥐의 50% 혈청 전환율을 유발하기에 필요한 불활성화 PT의 투여량 측정인, PT에 대한 스위스 OF1 생쥐의 ED 50 면역 반응을 검정했다. 유사한 시험을 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드 및 비세포 퍼투시스 백신 성분 섬유 비독성, 실시예 1에 서술된 바와 같이 제조된 불활성화된 퍼투시스 독소를 함유하는 흡착된 3가 DPT 백신 상에서 수행했다. 결과(표 6)는 전환의 부재 및 ED 50의 유의한 병화가 없음을 나타낸다.

(1) 불활성화된 PT, 25

(2) 3가 DPT(디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, B. 퍼투시스 섬유 혈구응집소(FHA) 및 불활성화된, PT, 25)

본 발명의 방법은 다른 항원, 예컨대 디프테리아 독소, 파상풍 독소 등에도 적용할 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물에 대한 상기 개선 및 대안은 첨부된 특허 청구 범위의 영영 내에 포함된다.

Claims (9)

1. 보르드텔라 퍼투시스로부터의 퍼투시스 항원 독소를 함유하는 부분적 또는 고도로 정제된 제제로부터 상기 독소를 해독시키기 위한 방법으로서, 상기 제제를 글루타르알데히드로 처리하여 상기 독소를 부분적으로 해독시키고, 상기 부분적으로 해독된 항원을 트립토판, 글리신, 리신 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산의 존재 하에 포르말린과 반응시키는 것을 포함하여 구성되는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 글루타르알데히드로의 처리는 0.02 내지 2mg/ml의 농도로 상기 항원을 함유하는 수용액을 25% 수성 글루타르 알데히드 용액 0.03 내지 0.07 중량%로 처리하는 것을 포함하여 수성되는 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 포르말린 및 아미노산으로의 처리는, 상기 글루타르알데히드 처리된 항원 용액을 37% 내지 45사이의 온도로 유지하면서, 이 용액에 하나 이상의 선택된 아미노산 0.05 내지 2 중량% 및 포르말린 1 내지 10 중량%를 첨가하는 것으로 포함하여 구성되는 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 용액을 초음파 처리하여 해독 중 형성된 응집물을 제거하는 것을 더욱 포함하여 구성되는 방법.
5. 제3항에 있어서, 상기 용액을 투석시켜 과량 반응물을 제거하며, 이때 상기 용액 내 잔류 포르말린의 농도가 항상 200ppm 이하로 유지되도록 하는 것을 포함하여 구성되는 방법.
6. 23이상의 온도 조건 하에서 독성으로의 전환에 대하여 그의 안전성을 보유할 수 있는, 제1항의 방법에 의하여 해독된 B. 퍼투시스 독소.
7. 제6항의 해독된 B. 퍼투시스 독소를 함유하는 B. 퍼투시스 항원 요소들로 구성된 백일해 예방용 조성물.
8. 제6항에 있어서, 37이하의 온도에 노출시 한달 이상 안전함을 특징으로 하는 독소.
9. 37이하 온도에서의 안전성을 특징으로 하는, 제8항의 퍼투시스 독소의 면역원적 양을 함유하는 B. 퍼투시스 백신.