KR100187327B1 - 상보시스템을 저해하거나 또는 면역할성을 억제하는 성분물 - Google Patents

상보시스템을 저해하거나 또는 면역할성을 억제하는 성분물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역반응을 억제하거나 또는 선택적으로 상보시스템을 저해하는 성분물에 관계한다. 이들 성분물은 아로마틱 링을 포함하고 치환된 디하이드로벤퓨란, 스피로벤조퓨란-2(3H)-사이클로알칸과 이들의 오픈 체인 중간물질이다. 본 발명의 성분물과 제약학적 수용가능한 염은 C5의 단백질 분해과정을 저해하여 면역억제 활성을 나타내고, 이들은 상보시스템 또는 면역활성에 의해 중재되는 질환과 질병의 개선에 유용하게 이용될 수 있는 것을 특징으로 한다.

Description

상보시스템을 저해하거나 또는 면역활성을 억제하는 성분물
2.1 상보시스템
상보시스템은 정상 사함 혈청에서 10% 글로블린으로 구성된 단백질 집단이다(Hood, L.E. et al., 1984, Immunology, 2d Edition, The Benjamin/Cummings Publishing Co., Menlo Park, California, p. 339). 상보물(C)는 면역중제와 알레르기 반응에 중요한 역할을 한다(Rapp, H. J., and Borsos, T., 1970, Molecular Basis of Complement Action, Appleton-Century-Crofts(Meredith), New York). C성분물의 활성은 상보체 의존성 질환과 연관된 염증을 중재하는 화학활성 펩티드를 포함한 인자집단의 발생을 유도한다. 상보물의 연쇄활동은 항원-항체 복합물과 연관된 전통적 통로를 경유하여 발생하거나 또는 특정 세포벽 폴리사카라이드의 인지와 연관된 또다른 경로를 경유한다. 활성화된 상보 단백질에 의해 활성에는 표식세포의 용해, 화학주성, 옵소닌작용, 혈관 및 다른 근육세포자극, 유선세포의 과립감소, 소혈관의 침투성증가, 백혈구의 이동, B임파세포, 대식세포 그리고 호중구의 활성(Eisen, H.N., 1974, Immunology, Harper Row, Publishers, Inc., Hagerstown, Maryland, P.512).
단백질 분해 연쇄단계동안에 생물학적 활성 펩티드 단편인 아나필라톡신 C3a, C4a, C5a,(WHO Scientific, Group, WHO Tech. Rep. Ser. 1977, 606,5)는 C3, C4, C5 자연 상보 성분물에서 해리된다(Hugli, T.E., CRC Crit. Rev. Immunol. 1981, 1, 321;Bult, H. and Herman, A.G. Agents Actionsa 1983, 13, 405). C51 소단위의 아미노단부 74개 아미노산에서 유도된 양성펩티드(Tack, B.F. et al., Biochemistry 1979, 18,1490)은 특히 병리적인 연관성이 있다. C5a 할성 조절은 내생 혈장 효소 가복시펩티다제 N(E.C 3.4.12.7)에 의해 C5a에서 카복시 단부 아르기닌이 제거되어 C5a des Arg보다는 활성이 있으나 약한 것이 생성된다. 표 1에는 특이적 면역 반응에서의 C3a와 C5a의 효과를 나타내었다.
C5a에 의해 나타나는 생물학적 다양한 활성 가운데에는 근육수축(Wissler, J.H. Eur, J. Immunol. 1972, 2, 73), 유선 세포의 과립감소(Johnson, A.R. et al., Immunol. 1975, 28, 1067). PMN에서의 아주르호기성 입상 효소분비(Webster, R.O. et al., Immunopharmacol. 1980, 2, 201), FMN의 화학주성(Wissler, J. H. Eur. J. Immunol. 1972, 2, 73;Becker, E.L. Trends Pharmacol. Sci. 1983, 4, 223)(표 2).
생체내에서의 활성 화학주성은 C5a des Arg로 간주된다(Becker, E.L. Trends Pharmacol. Sci. 1983, 4, 223).
C5a 또는 C5a des Arg 단편은 류마티스 관절염에서 PMN 침윤, 사구체신증, 아더스반응과 같은 실험적 맥관염, 실험동물의 폐로 화학적 성분의 주입에 의해 생성되는 급성 폐염으로 인한 루코트린 C-4와 D-4(LTC4와 LTD4)의 해리 등과 복합된다. 또한 C5a와 호중구 사이의 상호작용은 몇가지 임상 상황에서 조직손상과 연결된다. 예로써, 심장 허혈동안에 특히 심장 재산소포화 그리고 재환류 동안에 심장 조직손상을 조절하는 산소유도성 프리라디칼의 역할에 대한 증거로써 존재한다. 이러한 다수의 라디칼 중에는 다핵성 호중구가 제1차 주위가 집중된다. 재환류가 따르는 부분적 허혈동안에 심장조직의 구조에서 호중구의 결실 또는 호중구 기능의 억제에 대한 연구가 활발하다(Simpson, P.J. and Lucchesi, B.R.J. Lab. Clin. Med. 1987, 110(1), 13-30). 개에서 호중구의 제거는 24시간 재환류를 차단 후 90분후에는 상당히 작은 심장 경색이 일어나게된다(Jolly, S.R. et al., Am. Heart J. 1986, 112, 682-690).
한 연구에서는 심폐 측관 동안에 산소유도성 프리라디칼의 발생과 상보물의 활성에 대해 보고하고 있다. 심폐 측관을 통한 프로타아인의 주입은 상보물을 더 활성화시킨다(Cavarocchi, N.C. et al., Circulation 1986, 74, 130-133;Kirklen, J.K. et al., J. Thorac, Cardiovase, Surg. 1983, 86, 845-857). 또한 최근에 급성 심장 경색 환자에서 효과적인 혈정용해제로 판명된 재조합 조직 플라스미노겐 활성인자(r-TPAO는 상보물에 활성이 있는 것으로 나타났다. 약물 주입전에 이들 상보물 펩티드의 양과 비교할 때 r-TPA를 수용한 환자에서 C4a, C3a, C5a의 양이 급격히 증가되었다(Bennett, W.R. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 1987, 10(3), 627-632). Schafer와 동료들은 사람 조직의 경색범위내에 위치한 심장세포에 단부 C5b-9 상보 복합물의 치환이 가능함을 나타내었다(J. Immunol. 1986, 137(6), 1945-1949). 이와 같이 허혈성 개 심장 근육에서 상보물의 제1성분물과 백혈구의 선택적 축적이 나타났다(Rosen, R.D. et al., Circ. Research, 1985, 57, 119-230). 한 연구에서 상보물의 결핍은 허혈성 개 심장에 혈류를 증가시킨다. 또한 이 혈류의 증가는 상보물이 결실된 동물과 표준동물에서의 산소공급과 산소이용이 증가함을 나타내었다(Grover, G. J. and Weiss, H.R. Basic Res. Cardio. 1987, 82(1), 57-65). 상보활성은 성인호흡기 억제 증후군(ARDS)의 개시로 나타난다. 성인 호흡장애, 폐쇼크 미만성 폐포손상 또는 폐외상으로 공지된 이 증상은 산호치료요법으로 힘든 심각한 생명에 위협을 주는 호흡의 장해로 된다(Miescher, P.A. and Muller-Eberhard, H.J., eds., 1976, Text Book of Immunopathology, 2d Ed., Vols. I and Ⅱ, Grune and Stratton, New York;Sandberg, A.L., 1981, in Cellular Functions in Immunity and Inflammation, Oppenheim, J.J. et al., eds. Elsevier/North Holland, New York, p. 373; Conrow, R.B. et al., J. Med. Chem 1980, 23, 242; Regal, J.F.; and Pickering, R.H. Int. J. Immunopharmacol. 1983, 104, 617). C5a 해리에 의해 임상적 증상은 표 Ⅲ에 나타내었다.
2.2 세포중재성 면역반응
상보적 시스템과 독립적인 다양한 면역반응은 특히 활성임파세포에 의해 조절되는 것으로 공지되어 있다. 이들 반응은 자가면역질환, 과인성질환 또는 단순한 알레르기 반응을 일으킨다. 이 반응의 예는 지연성 과민성, 이식거부반응, 이식과 숙주질환, 약물 알레르기 또는 감염에 대한 저항성 등이 포함된다. 자가면역질환에는 위축성 위염, 갑상선염, 알레르기성 뇌척수염, 위점막, 갑상선중독증, 자가면역 용혈성 빈혈과 교감계 안염이 포함된다(Eisen, H.N., 1979, Immunology, Harper and Row, Hagerstwon, Maryland, pp. 557-595).
2.3 상보적, 개량성 염증을 저해하고 면역억제 활성을 가지는 유기 성분물
많은 화학물들은 상보적 조절 활성을 감소시키는 것으로 보고왔다. 이 성분물에는 아미노산(Takada, Y. et al., Immunology 1978, 34, 509); 포스포노네이트 에스테르(Becker, L. Biochem. Biophy. Acta 1967, 147, 289). 다가음성성분물(Conrow, R.B. et al., J. Med. Chem. 1980, 23, 242). 설포닐 플로리드(Hansch, C.; Yoshimoto, M. J. Med. Chem. 1974, 17, 1160); 폴리뉴클레오티드(DeClercq, P.F. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975, 67, 255); 피마르산(Glovsky, M.M. et al., J. Immunol. 1969, 102, 1); 포르핀(Lapidus, M and Tomasco, J. Immunopharmacol. 1981, 3, 137); 몇몇 항염증물(Burge, J.J. et al., J. Immunol. 1978, 120, 1625); 페놀(Muller-Eberhard, H.J. 1979, in Molecular Basis of Biological Degradative Frocesses)와 벤자미딘 등이 포함된다. 이들중 몇몇은 일반적인 프로테아제와 에스테라제의 저해에 의해 활성을 나타낸다. 다른 것들은 상보적 작용의 중간단계에 특별한 성질을 가지지 않고 1단계 상보 작용이상의 저해를 가진다. 후자 성분물에는 C1, C4와 C5 이용을 차단하는 벤자미딘이 포함된다(Vogt, W. et al., Immunol. 1979, 36, 138).
2.4 스피로벤조퓨란-2(3H)-사이클로알칸과 K-76
K-76은 스타키보트리스 컴프리멘티 nov. sp. K-76의 곰팡이 대사물질이다. 대사물 K-76은 스피로퓨란을 통해 결합된 벤젠링과 드리만 구조를 가지고, 6,7-디포르밀-3', 4', 4a, 5', 6', 7', 8', 8a-옥타히드로-4, 6', 7'-트리하이드록시-2', 5', 5', 8a-테트라메틸스피로[1'(2'H)-나프탈렌-2(3H)-벤조퓨란](Kaise, H. et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1979, 726)로써 결정된다.
모노카르복실산 유도체 K-76-COOH K-76을 실버옥시드에 대해 선택적으로 산호된 것에서 얻어진다(Corey, E.J. and Das. J.J. Amer. Chem. Soc. 1982, 104, 5551).
K-76과 K-76 COOH는 C5 단계에서 주로 상보작용을 저해하는 것으로 공지된다(Hong, K. J. Immunol. 1979, 122, 2418;Miyazaki, W. et al., Microbiocl. Immunol. 1980, 24, 1091). 전통적인 용혈반응 시스템에서 기니아 피그 혈청에 의한 양적혈구의 용혈은 K-76에 의해 7.45×10M에서 50% 감소되있고 K-76-COONa에서는 3.41×10M에서 50% 감소되었다 유사한 결과가 또다른 상보활성 경로를 통한 용혈반응 시스템에서 공지되었다.
K-76과 K-76 COOH는 정상 사람 상보물에서 화학반응인자의 발생을 저해한다(Bumpers, H. and Baum, J. J. Lab. Clinc. Meb. 1983, 102, 421). K-76은 신세포독성 사구체 신장염 쥐의 오줌에서 분비되는 단백질량을 감소시키고(Iida, H., et al., Clin. Exp. Immunol. 1987, 67, 130-134). 이는 자발성 시스템 낭창 홍반성 질환의 쥐의 생존을 증가시키고 기니아 피그와 쥐에서 포르스만 쇼크를 억제하는 것으로 보고되었다(Miyazaki, W. et al., Microbiol. Immunol. 1980, 24, 1091). 고농도의 K-76 또는 K-76 COOH에서 C2, C3, C6, C7, C9의 반응의 저해성이 나타났다. 그러나 이들 성분물의 저해 작용은 주로 시험관에서 EAC1, 4b, 2a, 3b, 5b의 생성에 의한 것이거나 EAC1, 4b, 2a, 3b, 5b 중의 분해가 가속되거나 화학주성 펩티드의 차단생성에 의한 것으로 나타난다(Hong, K. et al., J. Immunol 1981, 127, 19;Ramm, L. E. et al. Mol Immunol. 1983, 20, 155).
K-76 COOH는 항-간염제로 보고되었고(서독특허 3,031,788), 항체의존성 세포중재 세포독성과 NK 용해 활성을 저해시키는 능력이 있다(Hudig, D. et al. J. Immunol. 1984, 133, 408-413). K-76 또는 K-76 COOH는 상보시스템의 C3b 비활성물을 저해시키는 것으로 보고되었다(Hong, K. et al., K. Immunol. 1981, 127, 104-108). K-76의 반합성 유도체는 항-알레르기, 항-종양 그리고 항-신장염제로써 특허받았다(벨기에 특허 867,095). K-76의 분리, 자가면역 질환치료에의 이용과 이들 유도체의 제제는 상당수의 특허에서 상술되어 있다(See Japanese Patent Applications(kokai), Publication Nos. 54 092680(published July 23, 1979), 54 106458(published August 21, 1979), 57 083281(published May 25, 1982), by Shinohara, M. et al.; Japanese Patent(Kokoku) No. 85 030289(published March 20, 1979).
스피로벤조퓨란-2(3H)-사이클로알칸의 부구조를 가지는 추가의 성분물도 공지되어 있다. 이 성분물에는 그리세오 풀루빈(Wwinberg, E.D., 1981, in Priniciples of Medicinal Chemistry, 2d Ed., Foye, W.O., ed., Lea Febiger, Philadelphia, PA., p. 813), 이소판나린(Djura, P. and Sargent, M.V. Aust, J. Chem. 1983, 36, 1057), 시포노딕톤 코랄리-파검의 대사물질(Sullivan, B., et al., Tetrahedron 1981, 37, 979) 등이 포함된다.
본 발명의 성분물의 합성에 이용되는 일반적인 합성방법은 레지오셀렉티브 아로마틱 리지에이션 반응이 관계한다. 상당수의 산소함유된 이형사이클은 상기 반응을 이용하여 만들 수 있으나 디하이드로벤조류란의 제조를 상술하였다(Narasimhan, N.S. and Mali, R.S. Synthesis 1983, 957), 이 보고된 K-76은 아로마틱 분자의 테르페노이드 부분의 결합기술을 이용할 수 있으나 아로마틱 링의 통화를 통해 만들 수도 있다.
3. 발명의 요약
본 발명은 면역반응을 억제하거나 또는 상보적 작용을 선택적으로 저해하는 성분물에 관계한다. 구체예에서 이와 같은 성분물은 생활성 성분물에 대한 C5 단백질 분해과정을 차단하거나 C5a의 해리를 차단한다. 본 발명의 성분물은 면역 억제활성을 나타내는데 예로써 NK 활성, 임파세포증식, T세포활성을 저해시키는 능력이 있다. 본 발명의 성분물은 상보작용 그리고/또는 면역활성에 의한 질환과 질병의 개선에 이용되는 치료용도를 가진다. 구체예에서, 상보적 체계의 부적절한 활성과 연관된 많은 질환 또는 자가면역 치료에 이용된다. 특이구체예에서 본 발명의 성분물은 자연발생 K76보다 더 큰 활성을 가진다.
본 발명은 성분물의 제조를 위한 개선된 합성과정을 제공한다.
본 발명의 구체예에서 C5a 해리의 저해에 선택성이 있는 성분물을 제공한다. 특히 이와 같은 성분물은 허혈심장에서 유도된 손산과 성인 호흡장애 증후군의 치료와 예방에 그리고 외상유도된 조직파괴에 한정된다.
다른 구체예에서 면역억제 활성을 나타내는 본 발명의 성분물은 자가면역 질환의 예방 또는 치료 또는 이식된 조직 또는 기관의 거부 등에 이용된다.
본 발명의 구체예에는 본 발명의 성분물과 지속적으로 주입되는 혈전용해성 성분물로 조직 플라스미노겐 활성인자, 스트렙토키나제 또는 뉴로가이네제와 같은 혈전용해제로 치료하는 질환을 동시치료할 수 있다.
본 발명은 이와 같은 성분물 또는 그염으로 구성된 제약학적 성분물에 관계한다.
여기에 사용된 것과 같이 다음의 약어는 하기와 같은 뜻을 가진다.
본 발명에서 사용된 것과 같이, 바이오이소스테릭기는 전체적 분자는 변화하지 않고 전기적 모양의 화학기만 대체되는 것으로 설명된다. 그러나 바이오스테릭기의 크기, 원자수 또는 전극구조 등의 변화는 이들의 다양한 기능에 변화를 주게된다. 바이오이소스테르는 산성(양성자를 해리하여 음전하를 가짐), 염기성(프로톤을 해리하여 양전하를 가짐), 중성(산성 또는 염기성기로써의 정상적인 기능이 없음)이 될 수도 있다.
지적한 것과는 달리 여기에서 알킬기는 메틸, 에틸 그리고 n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸 또는 tert-부틸기를 말한다. 알콕시는 메톡시, 에톡시 n-프로필톡시, 이소프로필톡시, n, iso-, sec와 tert-부톡시, 페녹시, 벤질옥시기를 말한다. 낮은 숫자는 1~4개 탄소원자와 직지 또는 분쇄형 구조가 포함된다.
할로겐은 플로린, 클로린, 브로민, 이오딘이 포함된다.
주어진 구조, 구조식 또는 치환된 디아히드로벤조퓨란 유도체의 명명은 이의 스테레오 이성질체를 포함한다.
본 발명의 최종성분물에 가르복실산은 알칼리와 알칼린 메틸염과 같은 카르복실산의 염이 포함된다.
4. 도면의 설명
제1도는 포타슘 브로마이드에 의해 펠렛화된 성분물을 나타내는 스펙트럼이다.
제2도는 C5a와 C3a 생산의 저해를 성분물 11a 농도에 따른 함수로 나타낸다.
제3도는 6.6.2에서 설명하는 상보물-중재된 용혈의 저해를 성분물 11a 농도에 따른 함수로 나타낸다.
제4도와 제5도 항 CD3 항체 자극된 PBL에 3H-티미딘은 성분물 11a 농도에 따른 함수로 나타낸다.
제6도는 성분물 11a 존재하에 항-CD3 항체에 의해 자극된 PBL 배양물 상층액에 IL-2 량은 효소연결된 면역흡수 검사를 이용하여 측정하고 11a 농도의 함수로 나타낸다.
제7도는 성분물 11a 존재하는 항-CD8 항체에 의해 자극받은 PBL 배양물의 상층액에서 CD8 량은 효소연결된 면역흡수 검사를 이용하여 측정하고 11a 농도의 함수로 나타낸다.
제8도는 저해는 성분물 농도의 함수로 나타낸다.
5. 발명의 상세한 설명
본 발명은 상보시스템을 저해하거나 또는 면역억제활성을 가지는 성분물에 관계한다. 본 발명의 성분물은 아로마틱링을 포함하고, 디하이드로벤조퓨란, 스피로벤조퓨란-2(3H)-사이클로알칸 이들의 사슬 중간매개체들이다. 특히 이와 같은 성분물은 곰팡이 대사물질 K-76의 부분적 유사체일 수 있다.
본 발명의 상보적 저해제는 C5 활성을 저해하는데 즉 이것은 C5에서 상보적 생활성을 가지는 단편 C5a와 C5b의 발생이 된다. 특히 구체예에서, 본 발명의 성분물의 염증성 질환의 치료에 이용된다. 이들은 심장혈관 질환의 치료에 이용될 수도 있다.
본 발명은 면역억제 활성을 가지는 성분물에 관계한다. 특히 이와 같은 성분물은 면역반응을 억제한다. 구체예에서 본 발명의 성분물은 단핵세포의 치사활성 임파세포증식과 활성을 저해한다. 본 발명의 면역억제 성분들은 다양한 면역질환 치료에 가치가 있다.
또한 본 발명의 성분물은 2.4에 상술한 K-76의 활성을 하나이상 가진다.
본 발명의 성분물, 매기물 그리고 이 제조에 이용되는 방법은 아래에 상술한다.
5.1 상보시스템을 저해하거나 면역활성을 억제하는 성분물
본 발명은 상보시스템을 저해하거나 면역활성을 억제하는 유기성분물에 관계한다. 본 발명의 유기성분물은 일반구조식3의 치환된 디하이드로벤조퓨란과 일반구조식 4의 치환된 스피로벤조퓨란-2(3H)-사이클로알칸으로 구성된다. R과 R1-R4를 나타내는 기는 산고 그리고 3.1에서 정의한 1~4개 탄소를 가지는 직쇄 또는 분지쇄 저가알킬기를 포함한다.
또한 R1-R4는 독립적으로 할로겐, 아미노, 아미딕, 하이드록시, 하이드록시알킬, 알킬옥시, 니트로, 포밀, 아세탈, 카르복실산, 트리플로로아세틸, 20개 탄소원소를 가진 비닐 치환된 알킬리덴기, 10개 탄소를 가진 비닐치환된 카르바모빌, 치환된 알리파틱 아실, 알리파틱아실, 아로마틱 아실, 치환된 아로마틱 아실, 설파모밀, 아미노메틸, N-(저가알킬)아미노메틸, N,N-di(저가알킬) 아미노메틸, 질소, 산소 또는 황(테타라졸 또는 옥사졸린기)에서 선택된 적어도 하나이상의 이형원자를 가진 이형사이클링, N-아실카르바모밀, 아미디노 또는 하이드라지드가 될 수 있다. 또한 여기에 부착된 탄소원자와 R1, R2는 프탈릭 안하이드리드유도체와 같은 5개 또는 6개링을 구성하거나 또는 락톤; H치환된 락톤이 될 수 있다.
R3과 R4가 독립적으로 나타낼 수 있는 다른 기에는 중간 또는 긴사슬, 직쇄, 분지쇄, 사이클, 불포화, 포화 치환안된 또는 이형원소 치환된 4 내지 24개 탄소원소의 하이드로카본을 포함한다. 또한 R3, R4와 탄소원자는 5개, 6개 또는 7개 포환 또는 불포환 링을 포함하는 사이클릭 하이드로카본기를 형성한다. 이링은 치환이 안되었거나 또는 엑스트라사이클 이형원소를 포함하거나 또는 하이드로카본 치환제를 포함할 수 있다.
본 발명은 일반식5의 중개물질의 합성 오픈사슬에 관계하는데 이때 R, R1, R2는 식3과 4의 것과 같다. 또한 R5는 수소, 저가알킬기 또는 메톡시메틸, 테트라하이드로피라닐, 2-메톡시프로필, 2-메톡시에토옥시메틸, 트리알릴메틸, 벤질, 메틸티오메틸, 또는 tert-부틸-디메틸실릴기와 같은 적절한 OH보호기를 나타낼 수 있다. R6기는 식3과 4에서 정의한 화학기와 치환제 사이클로헥세닐메틸(5a) 리모메닐(5b), 카르본 유도된 디올아세토니드(5c)기를 나타낼 수도 있다.
다른 성분물은 중간물질 5와 5a-c에서 유도될 수 있고, 또한 다음에서 논의될 일반식 3과 4의 생성물로 전환할 수 있다. 표 5는 본 발명의 식 4로 구성된 성분물을 나타낸다.
본 발명에 따른 일반식 3, 4 일반식5의 합성 중간매개체의 치환된 디하이드로벤조퓨란과 스피로벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산 성분물과 이들의 염은 상보물 매개된 C5a 생산저해와 상보물 매개된 용혈저해에 의해 증명되는 상보시스템 저해를 나타낸다. 본 발명의 성분물의 상보-저해특징은 6.6.1에서 공지된 기술의 변화에 의해 측정할 수 있다.
적절한 염기성 시약과 함께 본 발명 성분물은 제약학적 염으로 제공될 수 있다. 본 발명의 성분물에 가르복실산이 있는 경우 제약학적 수용가능한 에스테르는 적절한 조건하에서 에스테르화기를 처리함으로써 만들 수 있다.
5.2 합성과정
본 발명의 성분물을 합성하기 위한 화학적 단계로 구성된 과정을 제공한다.
본 발명의 과정은 구조 1에 상세히 나타내었다.. 구조1에 묘사된 합성단계는 단순하고 K-76의 합성의 과정보다 유연성이 있다(Corey and Das J. Am. Chem. Soc. 1982, 104, 5551;McMurray et al., J. Am. Chem. Soc. 1985, 107, 2712). 구조식1에 따라 생성되는 최종 생성물의 합성평가에서 두 개의 단편, 알라파틱과 아로마틱 부분이 된다. 이 두 단편은 레지오셀렉티브 오르소-리히테이션과 연속적 알킬화에 의해 결합될 수 있다. 본 발명의 최종생성물을 만드는데는 두 개의 상이한 방법이 이용될 수 있다. 처음에 사이클과 반응과 아로마틱 기능화반을 하거나 이역이 될 수도 있다.
5.2.1. 일반식5의 성분물 제조
본 발명의 일반식5의 매개체는 다양한 치환체에 따른 방법에 의해 제조될 수 있다.
식5의 성분물의 알리파틱 치환체인 R6은 적절한 알킬화 물질에 의해 유도된다. 예로써, 1-브로모메틸사이클로헥센, 6a는 성분물 5a 제조의 시발물질과 이용될 수 있다. 성분물 6a는 공지된 과정에 따라 알킬 사이클로헥센-가르복시레이트에서 직접 유도되거나 또는 사이클로 헥사논에서 만들 수 있다(Wheeler, O.H. and Larner, I. J. Am. Chem. Soc. 1956, 78, 63; Adams, R. and Thai, A. F. Org. Synth. 1932, 1, 270; Lythgoe, B. et al. J. Chem. Soc. 1956, 406). 특정 구체예에서 사이클로헥사논은 시아노하이드린으로 전환되고 탈수소시켜 시아노알켄, 그다음 알콜라이시스를 통해 알킬 사이클로알켄카르복실레이트가 된다. 에스테르의 리듐 알루미늄 하이드리드의 환원과 포스포러스 트리할라이드의 할로겐화에 의해 성분물 6a가 된다.
리모노네일 클로리드 6b는 과포화된 할로겐화 용매에서 트리페닐포스핀의 작용에 의해 리모노네일 알코올에서 수득할 수 있다. 이 전환은 광학 활성있는 리모노네일 알코올에서 광학활성 알릴 할라이드를 제공한다. Crawford에 의해 개발된 유사한 과정이 상업적으로 이용할 수 있는 호모치랄 리모넨의 연속적인 리히에이션에 의해 광학적 활성 알코올을 만들고, 옥시제네이션과 수용성 소듐 설피트와 하이드로퍼옥시드를 환원시킨다.
세 번째 할로매개물인 6c는 광학적 활성 R-(-)- 또는 S-(+)-카르본에서 시작한 다단계 반응에서 유도할 수 있다. 합성단계는 α, β-불포화 케톤의 환원으로 알릴알코올, 에폭시반응, 디올의 환원, 아세톤니드 형성, 불포화 아세토니드를 칼슘 하이포클로라이트의 처리로 알릴 클로리드를 만드는 것이다. 결합반응은 불안정한 알릴 할라이드의 정제후 즉시 실행한다.
일반식5의 성분물에서 아로마틱 부분은 치환된 알콕시페놀 또는 레조르시놀에서 수득한다. 예로써 3-메톡시메토옥시아니졸, 7은 아세토니트릴에 무수 포타슘 카르보네이트의 현탁액에서 클로로메틸 메틸 에스테르와 3-메톡시페놀의 반응으로 얻을 수 있다(Rall, G.J.H et al., Tet. Lett. 1976, 1033). 무수상태와 용매와 기질의 비율이 이 반응의 성공에 중요하다. 5g 이상이 반응시약을 이용한 반응에서 소듐 아릴옥시드, 클로로메틸 메틸에테르 그리고 용매로 디메틸포르아미드를 이용한다.
구조식5와 5a-c의 R기는 보호기 R5를 가수분해하거나 제거하는데 이용되는 조건하에서 절단에 안정하고 구조식1의 3 또는 4단계에 따른 생성된 프리페놀의 사이클화에도 안정하다. 또한 R5는 잠재적인 킬레이팅기로써 식5의 R2와 R6의 치환체를 도입하는데 요구되는 레지오셀렉티브 오르소-메틸화반응을 촉진시킨다. 성분물7은 레조르시놀의 보호기가 적절하다(R은 메틸, R5는 메톡시메틸) 메톡시메틸 또는 MOM 에테르는 메틸에테르 존재하에 용이하게 제거할 수 있고(Narasimhan, N.S. ET AL. SYTHESIS 1979, 906). mom MOM기의 오르소 디렉팅 파워는 메틸에테르보다 큰 것으로 나타났다(Ronald R.C. Tet. Lett. 1975, 3973).
또다른 구체예에서 상업적으로 이용할 수 있는 성분물인 3, 5-디메톡시 벤질 알코올 8은 알릴 할라이드의 결합을 위한 아로마틱 성분으로 이용될 수 있다.
메틸화된 아로마틱 부분과 알리파틱기 사이의 결합반응의 효과는 메틸화 종의 응집정도, 일반적으로 알킬리티움제를 포함한 다양한 인자에 의해 상당히 영향을 받는다(Gschwedn, H.W. Rodriguez, H.R. Org React. 1979, 26, 1). 용매와 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌-디아민 또는 HMFA와 같은 첨가제의 선택은 응집단계에 상당한 영향을 준다. 각각의 기질 결합에 용매, 첨가제, 온도, 반응시간과 시약 등을 적절히 선택해야 한다. 적절한 용매에는 테트라하이드로퓨란, Et20, 디옥산과 디글링과 같은 무수용기용매가 포함된다. 또한 드라이 헥산은 OMOM과 리티오알콕시메틸과 같은 킬레이팅기에 선택적 메틸화반응에 적절한 용매임이 밝혀졌고 THF/TMED용매 혼합물은 일반적으로 8개에서 두 개의 전차 철회성 메톡시기 사이에 열역학적 부위에서의 금속반응을 제공할 수 있다. 구체예에서 THE/TMEDA 또는 헥산/TMEDA에서의 n-BuLi는 알릴 브로마이드 6a와 아로마틱 부분 7의 결합을 허용한다. 그러나 THE/TMEDA는 4위치에서 아로마틱 부분 8과 6a의 결합만을 허용한다. 6a와 8 사이에 결합이 헥산에서 실행되는 경우 리티에이션과 결합은 8의 2위치에서 일어난다.
건조 THF와 같은 용매에서 아로마틱 기질이 용해된다. 그다음 TMEDA를 첨가하고 이때 사용된 RLi의 양은 동농도를 사용하는 것이 적절하다. 구체예에서 RLi를 o℃에서 서서히 첨가하는데 그 양은 성분물7의 동량당 1.1량이 되고 추가의 산성 하이드로겐을 가진 성분물8에 대해서는 약 2.2몰라량이 적절하다. 리듐화된 아로마틱 기질의 동량당 그리염 1.2 동량의 첨가는 결합반응에서의 적절한 생성량을 수득할 수 있다. 구리(I)의 대부분 원료는 코퍼러스 브로마이드 디메틸설파이드, 테트라키스 구리(I) 테트라플로로보레이트와 할로겐 구리 등이 적절하다. 요오드 구리의 이용도 적절하다.
아로마틱 알킬화반응의 성공에는 온도의 신중한 조절이 중요하다. 리듐화 반응은 0℃에서 실온범위에서 실행하는데 연속적인 반응은 낮은 온도에서 실행한다. 구체예에서, 알릴리듐 시약은 -70℃까지 냉각시킨 후 구리(I)염을 첨가한다. 생성된 혼합물은 -40℃에서 교반시키고 아실쿠퍼레이트종은 이온도에서 형성되어 상대적으로 안정하다. 구리시약은 침전기물질을 첨가하기전에 -78℃로 재냉각시킨다. 고온에서의 첨가는 성분물 5와 같은 결합된 생성물의 생산량을 감소시키게 된다. 상기 논의된 모든 조작과정은 산소와 수분이 없이 실행하는 것이 중요하고 건조질소 또는 아르곤과 같은 비활성 대기하에서 실행하는 것이 적절하다.
결합반응에서 수득한 생성혼합물은 포화된 NaHCO3와 같은 중염기수용액에 수회 세척한다. 유기상은 마그네슘 설페이트와 같은 건조시약으로 교반시켜 건조하고 고형물은 여과시키고 생성물을 제공하기 위해 약한 전공하에서 농축시킨다. 더 이상의 정제과정을 공지된 기술분야에서 이용할 수 있는 과정으로 실행할 수 있다(예로써, 분별증류, 별결정화, 크로마토그래피분리).
5.2.2. 일반식3과 4의 성분물 제조
5.1에서 정의한 치환체 OR과 R1-R4로 일반식3의 치환된 디하이드로벤조퓨란 유도체는 메틸화반응과 설명한 것과 같은 결합된 중개물질의 연속적인 알킬반응 그리고 보호기의 가수분해와 ene-페놀의 결정화에 의해 수득할 수 있다. 합성과정은 도표1에서 상술한다.
[Scheme 1]
[Sheme 1 (cont'd)]
적절한 구체예에서, 친전자기로써 알릴 브로마이드 6a를 이용하여 도표1의 1단계에서 보호된 레조르시놀을 리듐화시키고 알킬화한다. 생성된 결합 생성물 9a는 건조헥산에 용해시키고 0℃에서 TMEDA 존재하에 알킬리듐으로 한방울씩 처리한다. -78℃로 반응 혼합물을 냉각시키고 이단계에서 소용의 친전자기를 첨가하여 R2의 치환을 유도한다.
일반적으로 R2 치환체의 유무에 관계없이 이와 같은 중간물질의 MOM 보호기는 5% HCl/에테르 혼합물에서 24시간동안 성분물을 교반함으로써 가수분해할 수 있다. 프리페놀의 탈보호는 4NHCl/PrOHfh 구성된 용매 혼합물에 영향을 받는데 특히 수일간 교반이 필요한 유도체를 포함한 카르복시 알데히드에 영향을 받는다. 결정화 단계는 비극성 욤애에서 암버라이스트 수지존재하에 기질을 교반하고 이어서 여과시킴으로써 이루어진다. 특정과정에서는 수지는 신선한 용매로 세척하고 여과물은 결합되고 농축되어 소용의 생산량으로 소용의 결정화된 생성물을 얻을 수 있다. 특정 경우에 R2가 -COOH(중간물질 10a 도표1의 단계 2, E+=CO2), 페놀의 결정화(단계 3, 4)는 실온에서 24-72시간동안 벤젠에서 Amberlyst 수지로 교반하여 얻을 수 있다. 하이드록시메틸 치환체(예로써 R2=CH2OH)의 결정화단계에서 약간의 어려움에 부딪히게 된다. 이 치환체의 결정화된 사이클화된 생성물의 합성에는 상이한 과정이 적절하다.
결정화 단계전에 다양한 R2 치환체가 유도될 수 있다. 예로써, 알릴리듐 중에 추가의 친전자기의 첨가는 다음 기능기를 생산한다:카본 디옥시드(카르복실);에틸 클로로포르메이트 또는 디에틸 카르보네이트(카르베톡시); 디메틸포르미드(포르밀); 메틸리소시아네이트(N-메틸-카르바모밀); tert-부틸이소시아네이트(N-tert-부틸카르바모밀); 파라포름알데히드(하이드록시메틸); 트리플로로아세틱 안하이드리드(프리플로로아세틸); 브로민(브로마이드); 클로린(클로라이드); 이오딘(이오디드); 치환된 비닐 이오다이드(치환된 비닐기) 다른 성분물은 공지된 방법에 의해 이들 기능기의 변형으로 수득할 수 있다.
11의 사이클화된 메틸에테르 유도체는 공지된 방법에 의해 프리페놀 14(도형 1의 단계5)로 전환될 수 있다. 이 과정에는 보톤 트리할라이드와 메틸 에테르의 처리(McOmie, J.F.W. and West, D.E. Org. Synth. 1973, 5,412' Grieco, P.A. J. Org. Chem. 1945, 40, 1450). 티올 존재하에 보톤트리플로리드와의 처리(Fujita, E, et al., Ibid. 1979, 44, 1661;Fujita, E. J. Chem. Soc. Perkin. Trans. 1, 1976, 44, 4444). 헤사메틸 포스포릭 트리아미드에서의 t-BuSLi와의 처리 등이 포함되나 이에 한정하지는 않는다(McMurry, J. E. and Erion, M.D. J. Am. Chem. Soc. 1985, 107, 2712). t-BuSLi의 이용이 적절하다.
9b 또는 9c와 같은 오픈체인 결합 생성물은 각각 21 또는 25와 같은 생성물을 만든다. 후자의 중간물질은 올레핀 결합이 엑소시이클일 때 또는 불포화된 알리파틱기를 포함하는 다른 유도체일 때 탈보호와 Amberlyst 이온 교환수지에서 디하이드로벤조퓨란 유도체를 만든다(20).
24 또는 27과 같은 디올기를 포함한 다소 복잡한 유도체는 이와 같은 방법으로 수득할 수 있다.
시발 아로마틱 성분물로써 3,5-디메톡시벤질 알코올, 8의 이용은 이미 R1으로 치환된 것을 가질 수 있는 장점이 있다. 성분물 8은 THF에 용해되어 TMEDA(2.0동량) 존재하에서 n-부틸리듐 2.0등가용액으로 0℃에서 처리한다. 벤질알코올은 약 2시간뒤에 4-위치에서 주로 리듐화된다. -40℃에서 아실쿠퍼레이트 형성과 알킬화 약품의 첨가는 형성된 아이소머 13' 소량과 함께 13(도형 2, 단계1)의 합성을 완료하게 된다. 생성혼합물의 정제로 순수한 13을 제공할 수 있다.
이미 언급한 바와 같이, 하이드록시메틸 치환물과의 중간물질의 사이클화반응은 문제가 있다. 한 구체예에서 이 문제의 해결은 벤질알코올 13c를 포밀성분물 13b로 전환시키는 것과 연관된다(도형 2, 단계2). 이 과정은 스웨런, 산화 또는 더욱 적절하게는 완충화된 메틸렌 클로리드에선 피리디니움 클로로크로메이트를 이용하여 가능하게 된다. 대칭형 메틸에테르중 하나를 선택적으로 절단하고(단계 3) 그리고 정상적인 방법으로 6-치환된 포밀 유사체 30b를 만들기 위해 사이클화시킨다. 포밀기의 카르복실산으로의 산호(30a 또는 31a)는 단계4의 사이클화반응 전후에 다수의 시약에 의해 영향을 받을 수 있다. 적절한 무기산화제에는 퍼망간네이트염, 망가네이즈옥시드, 크롬산, 크로메이트염, 실버옥시드, 실버 니트레이트, 니켈 퍼옥시드, 세리움 설페이트, 세리움 옥시드와 세리움 퍼클로레이트와 같은 세리움염이 포함되나 이에 한정하지는 않는다. 실버옥시드가 적절하다. 벤질 알코올 30c(4, R=CH3, R1=CH2OH, R2=H)는 THF, 디옥산 또는 디에틸 에테르와 같은 에테르 용매에서 리듐 알루미늄 하이드리브 또는 디보란과 같은 환원제를 이용하여 30b를 환원하여 수득할 수 있다.
[Scheme 2]
상기 상술한 유사체를 좀더 변형시킴으로써 좀더 복잡한 디하이드로벤조퓨란 기초 성분물을 수득할 수 있다. 디하이드로벤조퓨란 구조의 4위치에서 메틸에테르기를 포함하는 성분물들은 언급한 것과 같은 보론 또는 티오레이트에 의해 전달될 수 있다. 리모넴 시리즈에서처럼 알킬 에테르에 보호된 7위치에서 카르복실산과 메틸에테르의 탈메틸반응을 실행하는 것이 바람직하다. 페닐링의 열린위치에서 메탈화되고 이미 언급한 것과 같이 기능화된다. 20a 성분물의 이중결합은 포타슘 퍼망간네이트 또는 오스미움 테트로옥시드와 같은 전이 금속 옥시드에 의해 하이드록실화된다. 예로써 20a의 메틸에테르 절단과 하이드록실화의 복합은 24a 성분물을 만들게 한다. 또한 24a는 중간물질 27c의 탈메틸화반응에 의해 프리페놀을 수득할 수 있다.
여기에서처럼 알킬에스테르가 7위치에서 카르복실산기를 보호하는데 이용되고 알칼린, 가수분해단계는 프리 카르복실산을 얻는데 필수적이다(도형 1, 단계1). 본 발명은 생성무의 기본영역내에서 벗어나지 않는 다른 변형도 예견할 수 있다. 이중결합의 에폭시화반응, 이중결합의 알릴위치에서의 하이드록실화반응, 이중결합의 옥시데이트 절단, 하이드포포밀레이션, 여기에서 수득된 생성물의 변화와 같은 전형이 예가 될 수 있다.
5.2.3. 일반식 6-카르복실-4-치환된 스피로[벤조퓨란-2-(3H)-시클로헥산]성분물의 제조
에테르 치환된 일련의 유도체를 형성하기 위해 4위치에 치환된-6-카르복실-스피로[벤조퓨란-2-(3H)-시클로헥산]이 모형3과 4에 의해 만들어질 수 있다.
[Scheme 3]
[Scheme 4]
이들 성분물과 염은 상보시스템 조절된 용혈의 저해로 명백한 상보시스템 저해를 나타낸다. 이들 성분물의 상보-저해 성질은 6.6.1, 10.2 내지 10.4 등에 상술된 공지된 기술에 의해 측정할 수 있다. 일반식4의 성분물 위치 4에서 R의 치환물은 수소 또는 저가알킬기(CH3-, CH3CH2-, n-Bu-), 기능화된 저가알킬기(HOCH2CH2-), 벤질 또는 치환된 벤질기, 페닐 또는 치환된 페닐기(C6H5CH2-, C6H5-, P-NO2C6H4-, P-CHOC6H4-, P-NO2C6H4-, P-NH2C6H4-)등이 포함된다. 또한 일반식4의 성분물 위치4에서 OR은 H로 대신될 수 있다. 위치4에 적절한 치환물은 K76 COOH보다 상보시스템 조절되는 용혈의 저해에 효과가 큰 44b, 55c, 성분물이 될 수 있다.
5.2.4. 6, 7-이중치환된-4-메톡시스피로[벤조퓨란-2-(3H)-시클로헥산] 성분물의 제조
아래 도표5와 6에 따라 6, 7-이중치환된 스피로[벤조퓨란-2-(3H)-시클로헥산] 분자를 만들 수 있고 8에서 상술한다.
[Scheme 5]
자연발생 성분물 K76은 아래에서 보는 것과 같이 D링의 6과 7의 위치에 이중치환된 포밀기를 가진다. 이의 산화된 유도체 K76COOH는 위치7에 포밀기의 위치6에는 카르복실기를 가진다.
이것에서 K76의 A링 구조가 부족한 이중치환된 BCD 유사체를 나타내기 때문에 K76과는 상이하다. 또한 이 성분물은 3중 치환된 BCD 유사체를 형성하기 위해서 D링의 4위치에 또한 치환되었다. 이들 2중 그리고 3중 치환된 성분물과 이들의 염은 상밀이스템 조절된 용혈의 저해로 나타나는 상보시스템 저해를 나타낸다. 성분물의 다른 상보시스템 저해 성질은 6.6.1, 10.2 내지 10.4에 공지된 기술에 의해 측정할 수 있다.
R1과 R2기는 다음의 어느 것과의 복합물이 될 수 있다:수소, 카르복실산기, 포르밀기, 하이드록시메틸기, N-(저가알킬), 카르바모밀기, 트리플로로아세틸기, 카르보알콕시기, 할리드기, 비닐기, 10개 탄소원소를 가진 치환된 비닐기, 20개 탄소를 가진 알킬리덴기, 알리파틱 아실기, 치환된 알리파틱 아실기, 아로마틱기, 치환된 아로마틱 아실기, 트리플로로아세틸기, 설파모밀기, N-아실 카보밀기, 테트라졸기, 4가 알리파틱 아민기, 옥사졸린기, 아미딘기 또는 하이드라존기.
R1과 R2기의 특이적 치환제로는 -CHO, CH2OH, -COOH, COCF3, SO2NH2와 테트라졸, 옥사졸린, 이미드 또는 CH2NMe2 유도체 등이 포함된다. 6과 7 위치의 치환물은 62와 68 성분물과 같은 사이클 성분물이 될 수 있다. 6과 7위치에 극성기의 존재는 상보시스템 저해활성에 효과가 있는 것으로 보이는데 그 이유는 이와 같은 극성기가 상보시스템 수용체의 부분과 상호작용하기 때문이다.
상기 설명한 것과 같이 R이 매우 다양한 식4의 성분물이 포함된다. R1은 카르복실기 또는 바이오이소스테릭 산기(예로써 설폰아미드, 이미드 또는 테트라졸) 또는 바이오이소스테린염기(4가 알리파틱 아민, 옥사졸린, 아미딘 또는 하이드라존) 또는 바이오이소스테린 중성기(트리플로로아세틸); R2는 포밀기 또는 메틸케톤(아세틸) 다른 알킬케톤 또는 유사기와 같은 바이오이소스테릭기가 된다.
본 발명의 성분의 적절한 유기성분물은 68과 같은 4, 6, 7-삼중치환된 스피로[벤조퓨란-2-(3H)-시클로헥산]과 6-카르복시-7-포밀-4-페녹시-스피로[벤조퓨란-2-(3H)-시클로헥산]이다. 구체예에서 성분물 68은 용혈검사에서 상대적으로 많은량의 상보시스템 저해를 나타낸다. 저해성분물은 68에서 6.7이중치환제와 함께 4위치에 적절한 치환물을 결합시킴으로써 생성될 수 있는데, 적절한 구체예에서 페녹시기가 4위치에 치환된다.
5.3. 상보시스템 저해의 설명
본 발명의 성분물은 이들의 상보시스템 저해활성을 설명하기 위해 공지된 기술을 이용하여 검사하였다. 이 검사는 상보시스템 활성 저해 능력 검사 또는 상보시스템 유도성 펩티드 생선저해 검사 등이 있으나 이에 한정하지는 않는다.
(i) 적혈세포의 상보시스템 중재성 해리(용혈)의 저해도 측정;
(ii) C3a와 C3a des Arg 형성의 저해능의 측정과 C5a와 C5a des Arg 형성저해능의 측정;
(iii) 또다른 경로의 용혈의 저해.
중요한 상보시스템 저해활성을 가지는 것으로 설명되는 이들 성분물은 5.5에 상술한 것과 같이 질병의 치료 또는 예방에 중요한 치료요법적 가치를 가질 수 있다.
5.4. 면역억제 활성
본 발명의 성분물의 면역활성을 저해할 수 있다. 특히 본 발명의 성분물은 세포조절성 면역기능을 저해한다. 예로써 이 성분물은 NH 활성을 억제하고 말초혈관 임파세포의 증식을 저해하고 PBL 배양에서 T 임파세포의 활성을 저해한다.
공지된 과정을 이용하여 면역억제활성을 설명할 수 있다. 이와 같은 과정은 표식세포의 NK 해리저해, 말초 혈액 임파세포의 증식저해 또는 세포표면 IL-2 수용체 발현 저해와 같은 검사가 포함되나 이에 한정하지 않는다. 구체예에서 이용한 과정을 상술한다(6.7.1-6.7.4).
5.5. 본 발명의 성분물의 치료요법적 이용
상보시스템을 나타내거나 면역활성 저해를 나타내는 본 발명의 성분물은 다양한 면역성 또는 염증질환 예방 또는 치료에 치료요법적 가치를 가진다. 본 발명의 성분물을 환자에 주입하여 부적절한 상보시스템의 활성과 연관된 면역질환을 치료한다. 특히 본 발명의 저해성 성분물의 효과량은 상보시스템의 성분물의 활성(C5a0 또는 부적절한 반응성 면역시스템에 의한 나쁜 효과를 예방하거나 개선하는데 이용될 수 있다. 부적절한 상보시스템 활성 또는 면역질환과 연관된 질환의 치료를 위한 본 발명의 성분물의 효과량은 지속적인 안정성 검사, 독성검사, 약농도검사, 수송방법 등을 고려하여 결정할 수 있다. 구체예에서 kg 당 0.01 내지 500㎎의 량이 주입되었다.
본 발명의 성분물에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 질병은 표3에 나열한 것이 포함되나 이에 한정하지는 않는다. 특히 화상 또는 심장경색 유도성외상, ARDS 등에 의한 조직파괴의 연관된 질환은 이성분물의 효과량의 주입으로 치료될 수 있다.
상보시스템의 유해성 비특이적 활성 또는 다른 경로를 통한 비소요적 활성 등도 본 발명의 성분물에 의해 치료되거나 예방될 수 있다. 구체예에서, 이와 같은 성분물은 특이적 또는 비특이적 C5의 단백질 용해 과정에 의해 유도되는 급성질환의 변화를 개선한다.
본 발명의 성분물은 상보시스템에 의해 직간접으로 조절되는 생물학적 또는 면역학적 기능을 조절하는데 이용될 수 있고 이는 표 Ⅰ과 Ⅱ에 나열한 것이 포함되나 이에 한정하지 않는다.
구체예에서 저해성 성분물은 신장결석, 조직적 낭창흥반, 신조직 사구체염 또는 다발성 경식과 연관된 염증성 질환치료에 이용될 수 있다(Sec, e.g., Experimental Allegric Encephalomyelitis. A Useful Model for Multiple Sclerosis, A Satellite Conference of the International Society of Neurochemists, July 16-19, 1983, University of Washington, Seattle, Washing-ton; Miyazaki, W. et al. Microbiol. Immunol. 1980, 24, 1091; Konno, S. and Tsurutuji, S, Sr. J. Pharmacol. 1983, 80, 269).
또다른 구체예에서 본 발명의 성분물은 상보시스템에 의해 활성화되는 호중구에 의한 심정허혈, 재환류 등에 의해 조직손상의 치료를 위해 주입될 수 있다.
본 발명의 성분물은 위축성 위염, 갑상선염, 알레르기성 뇌척수염, 위점막, 감성성독성, 자가면역성 용혈성 빈혈, 핍피거스 불가리스, 교감신경성 안염, 지연성 과민성, 자가이식거부, 이색체-숙주 반응, 기관이식거부, 자가면역질환, 약물 알레르기를 포함한 NK할성 또는 증가된 임파세포에 의해 수반되는 질환의 치료 또는예방을 위해 주입될 수 있다. 이 성분물은 또한 조직 플라스미노겐 활성성분 치료 또는 심파측관과 같은 요법적 간섭에 의한 역효과를 경감시키는데 이용될 수 있다.
저해성 성분물 또는 이들의 염으로 구성된 제약학적 성분물이 제공된다. 이와 같은 성분물에는 본 성문물의 치료학적 효과량과 제약학적 수용가능한 담체로 구성된다. 이와 같은 담체에는 살린, 완충액염, 덱스트로스, 물 등이 포함되나 이에 한정하지 않는다. 제약학적 성분물의 하나 이상의 성분으로 충전된 용기로 구성되는 제약학적 키트는 본 발명의 영역내에 속한다.
다양한 수송 시스템(예로, 리포좀내에 포획, 미량입자, 마이크로캡슐, 특정분야에 결합)이 공지되어 있고 이 성분물의 치료요법적 수송에 이용할 수 있다. 주입방법은 구강, 피하, 경피식, 정맥내, 근육내, 복강내, 비강내 경로가 포함되나 이에 한정하지 않는다. 이와 같은 주입은 큰 알약 또는 반복량 또는 지속적 주입 등에 의해 실행될 수 있다.
본 발명의 구체예에는 환자에 본 발명의 성분물과 복합하여 조직플라스미노겐 활성인자, 스트렙토키나제 또는 유로키나제와 같은 혈전용해제로 지속적 치료를 하는 복합치료가 포함된다. 상보시스템의 관측에 의해 유도된 이와 같은 복합치료의 유용성은 심장경색 또는 측관 외과술과 같은 질환에 활성이 있는 것으로 나타났다. 복합치료의 효과는 상보시스템 저해 성분물이 부족절한 그리고 손상적인 상보시스템 활성을 조절하는 능력이 있기 때문에 혈전용해제 치료 단독보다는 더 효과가 큰 것으로 나타났다. 혈전용해와 상보시스템 저해성분물의 주입은 동시에 또는 연속적으로 또는 상이한 약형으로 주입될 수 있다.
본 발명의 다음의 실시예에 의해 더 자세히 이해될 수 있으며 이 실시예는 본 발명의 설명을 위한 것이며 본 발명을 이에 한정하지는 않는다.
본 발명은 면역 억제 활성을 가지거나 또는 상보적 효과를 저해시키는 성분물에 관계한다. 특히 본 발명의 성분물은 C5의 상보작용에서 상보물을 선택적으로 저해한다. 본 발명의 성분물은 디하이드로벤튜란, 스피로벤조퓨란-2(3H)-사이클로알칸으로 대체하고 이들의 사슬을 이와 같은 저해활성을 나타내는 중개작용을 한다. 본 발명의 성분물은 6, 7-치환안된 스피로벤조퓨란-2-3(H)-사이클로알칸과 4-치환된 스피로벤조퓨란-2-(3H)-사이클로알칸이 포함된다. 본 발명은 면역과 염증질환 치료의 성분물에 이용될 수 있다.
제1도는 성분물 11a의 적외선 스펙트럼을 설명한다.
제2도는 성분물 11a에 의한 상보 펩티드 C5a 또는 C3a 생성의 저해를 설명한다.
제3도는 성분물 11a에 의해 상보물 조절되는 용혈의 저해를 설명한다.
제4도와 5도는 성분물 11a에 의한 PBL의 증식을 억제하는 것을 설명한다.
제6도는 11a에 의해 FBL에 의해 해리되는 IL-2R의 저해를 설명한다.
제7도는 11a에 의한 PBL에서의 CD8단백질의 해리의 저해를 설명한다.
제8도는 치환안된 스피로벤조푸란 62, 66, 68에 의한 상보물 조절되는 용혈의 저해를 설명한다.
6.1. 2-(1'-시클로헥시닐) 메틸-3-메톡시메톡시아니졸(9a)
3-메톡시메톡시아니졸 7은 다음의 과정에 의해 96% 수득률로 수득된다. 건조 아세토니트릴에서 미세분말 K2CO3(2. Oequiv)과 3-메톡시페놀(1. Oequio)의 혼합물의 질소하에서 15분간 0℃에서 교반한다. 반응물의 pH를 6이상으로 유지시키기 위해 페놀 g당 아세토니트릴 100ml을 사용한다. 18-크라운-6(0.12 equiv)의 촉매량을 첨가하고 혼합물은 0℃에서 15분간 더 교반시킨다. 니트 클로로메틸 메틸 에테르 91.5eqiv)를 서서히 도입시킨다. 현탁액은 실온이 될 때까지 방지해두고 6시간 동안 교반시킨다. 그후에 혼합물은 다시 0℃로 냉각시키고 K2CO3, 18-크라운-6와 CH3OCH2Cl의 처음량의 절반을 첨가한다. 실온에서 4시간 추가 교반후에 현탁액을 여과하고 여과물은 감압하에서 농축시킨다. 잔유물은 Et20에 용해하고 5% 소듐 하이드록시드(3×50ml)로 세척하고 진공하에서 농축하여 감압하에서 증류한다. 맑은 무색액체인 성분물 7이 수득된다.
성분물7의 THF 용액(1.0equiv)과 TMEDA(1.1equiv)에 n-BuLi(1.1equiv)를 0℃에서 질소하에 서서히 첨가한다. 용액은 2-4시간동안 실온에서 교반시키고 -78℃로 냉각한다. 쿠퍼러스이오디드(1.2equiv)를 한번에 첨가한다. 밝은 회색 현탁액을 -40℃로 올리고 1.5시간 교반시킨 후에는 녹회색을 띄게된다. 구리시약은 -78℃로 냉각시키고 새로 준비한 알릴 브로마이드 6a(1.3equiv)의 THF 용액과 반응시킨다. 반응 혼합물은 실온이 되도록 방치해두고 72시간동안 교반시킨다. 혼합물을 식히고 수요액층이 무색이 될 때까지 소듐 비가르보네이트 포화수용액으로 세척한다. 유기층은 포타슘 카르보네이트 플러그를 통과시켜 건조시키고 진공하에 농축시켜 어두운 오렌지 오일이 된다. 생성물은 감압하에 증류하여 69% 수득률의 성분물 9a를 만든다.
6.2. 3-(1'-시클로헥시닐)메틸-2-하이드록시-4-메톡시벤조익산(12a)
다음의 과정에 의해 성분물 9a는 4위치에서 금속화된다. 9a(1.0equiv)와 TMEDA(1.1equiv)의 핵산 용액은 질소하에서 0℃에 점진적으로 첨가하는 n-BuLi(1.1equiv)의 핵산용액으로 처리된다. 용액은 3시간동안 실온에서 교반시킨 후 -78℃로 냉각시킨다.
상기 과정에 의해 준비된 알릴리듐 시약 Li-9a는 건조된 카본디옥시드 기체에 30분간 -78℃ 용액을 통해 노출된다. 0℃에서 이 반응을 실행할 경우 생성량은 반으로 줄게된다. 혼합물은 기체의 흐름은 유지시키면서 실온으로 상승시킨다. 혼합물을 물에 넣고 5% 수용성 소듐 하이드록시드로 수회 주출한다음 농축 염산으로 ph1로 산화시키고 에테르에서 추출한다. 생성물은 Et20에서 추출하고 복합된 유기층은 마그네슘 설페이트로 건조시킨다. 용매는 가화시키고, 잔유물은 끓는 에테르에 재용해시킨다. 더운 용액은 서서히 식히고 헥산을 첨가한다. 혼합물은 냉동기에 둔다. 161-163℃ 녹는점에서 고형을 수득한다(66% 수득률).
6.3. 3-(1'-사이클로헥시닐)메틸-2-하이드록시-4-메톡시벤질알데히드(12b)
6.2에 의한 과정으로 준비된 알릴리듐 시약 Li-9a 용액을 -12℃로 냉각시켜 니트 N-N'-디메틸포름아미드(1.5equiv)로 처리한다. 혼합물을 실온에서 3시간동안 교반시킨다. 혼합물을 물에 넣고 염화나트륨으로 포화시키고 Et20로 추출한다. 유기층을 복합시켜, 건조시키고(MgSO4), 진공하에선 농축시키며 잔유물은 에틸핵산에서 재결정화한다. 생성물은 컬럼 크로마토그래피로 정제한다.
6.4. 7-카르복시-4-메톡시스피로[벤조퓨란-2-(3H)-시클로헥산](11a)
성분물 12a의 벤젠용액은 건조된 Amberlyst 이온 교환수지(기질 g당 3-4g, 고진공하에서 110℃에서 건조)로 처리한다. 혼합물은 실온에서 24시간동안 교반시키고 그다음 여과시킨다. 수지비드는 새로운 벤젠과 메틸렌 클로리드를 통하여 완전히 세척한다. 여과물은 결합시키고 물로 세척하여 마그네슘 설페이트로 건조시키고 진공하에서 농축한다. 생성물 11a를 컬럼 크로마토그래피로 정제하고 수득률은 85%가 된다.
THF 에소 보론 트리폴리드 에테르용액 또는 50/50 4N 염산/이소프로판을 용매에서 페놀 전구체를 가열함으로써 사이클화할 수 있다. 후자의 반응은 12a가 아닌 다른 페놀전수체에서는 추천할만한 것이 아니다.
6.5. 7-포르밀-4-메톡시스피로[벤조퓨란-2-(3H)-시클로헥산](11b)
페놀전구체 12b를 이미 상술한 것과 같이 Amberlyst 수지로 처리한다. 생성물 11b를 분리하고 컬럼 크로마토그래피로 정제한다. 수득률 83%
성분물 11b는 금속 하이드리드 환원반응 또는 다른 공지된 방법에 의해 용이하게 11e로 전환될 수 있다.
6.6. 상보시스템 저해
본 발명의 구조식 3.4의 디하이트로벤조퓨란과 스피로벤조퓨란사이클로헥산 성분물과 구조식5의 합성 중간물질을 하기 설명하는 방법에 의해 상보시스템 저해능력을 검사하였다.
6.6.1. C3a와 C5a 생산 저해 설명
상보시스템 저해능력은 C3a와 C5a 생산의 특이적 저해도를 검사하여 테스트한다. 모든 실험에서 상보시스템의 원료로써는 단일 사람 혈청이 이용되는데 이는 -70℃에서 냉동 저장보관되었다. 사람 IgG는 열응집되고, 정제되어 -70℃ 냉동보관된다. 각 실험에서 혈청 엘리코트는 시험할 성분물의 다양한 농도로 37℃에서 평형시킨다. 전통적인 상보시스템의 경로는 응집된 사람 IgG의 첨가로 개시된다. 10분간의 고정된 반응시간 후에 해리된 상보펩티드의 양(C5a 또는 C3a)은 RIA 키트(C5a RIA, UpJohn Cat. No 3250-02; C3a RIA, UpJohn Cat. No 3245-01; C5a RIA, Amersham Cat No RPA 420; C3a RIA Amersham RPA 518)을 이용하여 방사능 면역검사에 의해 결정된다.
경쟁성 면역검사가 이용되었기 때문에 상보적 펩티드(C5a, C3a) 농도는 이수에 역으로 다양하다. 시료의 CB는 이는 펠렛에서 측정된 총카운터에서 비특이적 결합 콘트롤에서 측정된 카운터를 뺀 것이다. NSB 콘트롤은 미량 펩티드(125I-라벨된) 그리고 2차 침전된 항혈청을 포함하는 시료이고, 여기에는 C5a 또는 C3a 특이적 항혈청이 포함되지는 않는다.
도면 2의 Y축은 분별저해를 나타낸다. 분별저해는
가 된다.
C5a 생산이 C3a 생산에 영향이 없는 성분물의 농도에서 저해될 때 데이터에서는 C5a 활성단계에서 상보시스템의 저해가 일어나는 것으로 알 수 있다. 도면 2는 상술한 검사에서 수득된 데이터를 나타낸 것이다. 그 결과를 표 Ⅳ에 요약하고 성분물에 의해 나타나는 상보시스템 저해활성은 C5 활성저해쪽으로 나타남을 알 수 있고 저해활성은 K-76 COONa의 것과 비교할만하다.
6.6.2. 상보시스템 조절된 용혈의 저해설명
상보시스템 저해능은 상보시스템 조절된 적세포 용해의 저해를 검사함으로써 테스트된다. 용혈의 저해는 성분물 농도에 대한 함수로써 결정된다. 시험될 성분물은 0.1M HEPES 완충액(0.15NHCl, pH 7.4)로 희석하여 50ul씩을 V자형 미량적정 플레이트의 각웰에 첨가한다. 상보시스템의 원료로 이용되는 사람혈청은 Hepes 완충액으로 1 내지 500 희석시켜 각웰에 50ul씩 첨가한다. 그다음 항-양항체와 상업적으로 이용되는 양적혈구(Diamedix Cat. No 789-001)을 수용체로 이용하고 웰에 100ul씩 첨가하여 용혈을 유도하는 상보시스템을 개시한다. 플레이트는 37℃에서 60분간 배양시키고 10분간 500xg에서 원심분리한다. 상층액은 제거하고 평평한 바닥 미량적정 플레이트에 넣는다. 용혈정도는 410nm에서 시료의 흡수도에 대한 함수로 측정한다. 최대흡수(최대용혈) A는 사람혈청만을 포함한 적혈구 시료의 흡수값 A에서 적세포만을 포함한 시료의 흡수값 A를 빼면된다. 즉 A=As-Ao이다. 사람 혈청과 저해성 성분물을 모두 포함하는 적혈세포 시료의 흡수도와 저해성 성분물만을 포함하는 시료의 흡수도의 차이는 Asample로써 정의한다. 저해도 IH는이 되고 IH50은 IH=1/2이 되는데 요구되는 저해성분물의 농도가 된다.
제3도는 IH와 세포 시료에 첨가되는 11a 농도를 나타낸 것이다. IH50에 상응하는 11a 농도는 약 0.9mM이 된다. 표 7에는 본 발명의 성분물이 이용한 검사결과를 나타내고 용혈의 저해에 대한 이들의 효과를 나타내었다.
6.7. 면역억제활성
본 발명의 일반식 3, 4의 디하이드로벤조퓨란과 스피로벤조퓨란사이클로 헥산 성분물과 이의 염을 세포중재된 면역 활성의 저해능을 검사하였다. 이 성분물에 의해 설명되는 특이활성은 NK 활성저해, PBL 증식저해, 세포-표면 IL-2 수용체 발현 저해 등이 포함된다. 또한 11a는 CHO 세포증식에 저해성이 있고, CHO세포의 저해성이 관찰되지 않아 성분물의 저해활성은 면역시스템의 임파세포에 한정된 특이성이 있음을 알 수 있다. 실험도 면역기능에서의 본 발명의 성분물이 약량의존성 효과도 검사하였다.
6.7.1. NK 활성저해의 설명
성분물은 NK 민감성 표식세포, K562를 용해시키는 말초혈액 단핵세포의 능력에 이들의 효과를 검사하였다. NK 활성은 표식세포로는51Cr-라벨된 K562 적혈구골수 백혈병세포, 효과세포로는 정상 말초혈액 단핵세포를 4시간동안 세포독성 검사를 이용하여 결정한다. 효과세포는 Ficoll-Hypaque 농도에서 신선한 혈액으로부터 분리해내고 웰당 현탁액 5×10 세포 100ul를 V자형 바닥 미량적정 플레이트에 첨가한다. 11a 성분물은 10%fcs를 포함하는 RPMI 1640 배지로 희석하고 각웰에 100ul씩 분배한다. 표식세포(K562)를 Cr 100uCi로 30분간 라벨시키고 완전히 세척시켜 웰딩 10 세포로 20ul씩 분배한다. 이 세포농도는 효과세포와 표식세포비가 50:1이 된다. 미량적정 플레이트는 5분간 50xg에서 원심분리하고 배양한다. 4시간후에 각웰에서 100ul씩 분리하여 방사능 활성을 LKB 1275 감마카운터로 측정한다. 특이적 용해율은 다음과 같이 계산한다.
특이적 용해%=[(CEXP-SR)/(TOTAL-B)]×100
이때 EXP는 효과세포와 표식세포를 이용하여 수득하고 SR은 배지만으로 배양한 표식세포에서 수득할 수 있다. TOTAL 해리는 저장용해에서 수득할 수 있고 B는 기계의 백그라운드를 나타낸다. 평균치는 4개의 웰에서 계산하고 표준편차는 10%를 넘지 않는다. 시험성분물로 배양된 효과세포의 생존율은 트립판 블루 추출에 의해 결정된다.
표 8에서 7-카르복시-4-메톡시스피로[벤조퓨란-2-(3H)-시클로헥산](11a) 나트륨염에 대한 NK활성저해 결과를 요약한 것이다.
표 8에 나열된 데이터는 성분물 11a가 적정농도에서 효과적으로 NK활성을 저해하는 것을 알 수 있다.
6.7.2 말초혈액 임파세포증식의 저해 설명
PHA 또는 항-CD3 단클론 항체에 대한 사람 말초혈액 임파세포의 증식은 3H-티미딘의 결합으로 추정할 수 있다. 성분물 11a는 소요의 농도로 배양배지로 희석하고, 사람 PBL은 최종농도가 10세포/ml로 첨가하고, 그 다음 PHA 또는 항-CD3 항체(최종농도 1mg/ml)을 첨가하여 증식을 개신한다. 시료당 최종용적은 100ml이 된다. 세포는 72시간 배양시키고, 4시간동안, 1uCi3H-티미딘으로 펠스 자극시킨 후 수득하여 신틸레이션 카운터로 카운터한다. 자극물없이 다양한 양의 11a에 노출시킨 시료로 별도의 실험을 하면 트립판 블루 추출에 의해 결정될 수 있을 때 PBL은 상기 사용한 11a 농도에서 살아있음을 볼 수 있다. 결과(도면 4, 5)는 성분물 11a가 약량의존성 방법으로 PBL 증식을 저해하는 것을 볼 수 있다. 배양물을 PHA(도면 4) 또는 항 CD-3항체(도면 5)로 자극시켰을 때 11a p.5mM에서 1/2 저해가 나타남을 볼 수 있다. 세포 생존능이 11a 존재에 의해 영향을 받지 않기 때문에 저해는 실재로 세포독성 효과가 아니다. 본 발명의 성분물을 면역억제활성 검사를 하고 그 결과를 표 9에 나타내었다.
결과(9)에서 시험된 각 성분물은 PBL 증식을 저해하는 것으로 보인다.
임파세포에서 세포표면 IL-2R 또는 CD8 항원의 해리는 T 세포활성과 연관이 있는 것으로 보인다(Rubin et al. J. Immunol. 1985, 135, 3172-77; Rubin et al. Fed. proc. 1985 44, 964; Fujimoto, J. et al. J. Exp. Med. 1983, 159, 752-66; Tomkinson, B. et al. 2d Annual Conference on Clinical Immunol. Washington, D.C., October 30, 1987). 몇몇 실험에서 PBL 배양물로 해리되는 IL-2R 또는 CD8 단백질의 양은 3H-티미딘에 펄스하기전에 한방울을 떼어내어 측정할 수 있다. 두 개 분석물의 량을 결정하기 위해 상업적으로 이용할 수 있는 효소 면역검사키트(CELLFREE IL-2R, Cat. No. CK1020, T Cell Sciences, Inc., Cambridge, MA, 또는 CELLFREE T8/CD8, Cat. No. CK1040, T Cell Sciences)를 이용한다. 성분물 11a을 이용한 결과에서 11a는 자극된 PBL 배양물에서 IL-2R(도면 6)과 CD8(도면 7) 단백질 해리의 저해제임이 나타났다.
6.7.3. 세포표면 IL-2R 발현 저해설명
IL-2R은 T세포면에서 감지할 수 있다. 특이항원 또는 미토겐에 의한 활성에 의해 활성화된 세포는 IL-2를 분비하고 세포표면 IL-2R을 발현한다(Meuer, S.C. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1984, 81, 1509; Tsudo, M., et al. J. Exp. Med. 1984, 160, 61-617; Waldmann, T.A., et al. J. Exp. Med. 1984, 160, 1450-1466).
성분물은 세포표면 IL-2R 발현 저해와 마찬가지로 T 세포활성을 저해하는 능력을 시험하였다. PBL 배양물(1.5ml)을 PHA로(1ug/ml) 72시간동안 성분물 11a의 다양한 농도하에서 자극시킨다. 연속적으로 세포는 FITC-라벨된 항-IL-2R 항체(Act-T-Set IL-2R, Cat. No. AA2009, T Cell Sciences, Inc.)와 플로우 사이토메트리에 의해 분석한다(표 10).
표 10에 나타낸 결과에서 11a 존재하에 IL-2R을 발현하는 IL-2R 세포 표면 발현량이 11a 존재하에 급격히 감소되었다. 성분물 11a는 IL-2R 세포 표면 발현을 억제하는 것으로 이들 성분물은 T세포 활성을 PBL 배양에서 효과적으로 저해함을 나타낸다.
6.7.4. CHO 세포증식 억제의 부족
면역세포에 대한 성분물 11a의 저해활성의 특이성은 CHO세포증식을 저해시키는 11a 능력의 검사로 설명할 수 있다. 비함류성 CHO 세포는 성분물 11a의 농도 1.8mM 유우하에 4시간동안 96웰 플레이트에서 증식을 허용하였다. 세포는 4시간동안 시료당 3H-티미딘 0.5uCi로 펄스키고, 수득하고, 결합된 3H-티미딘의 양은 신틸레이션 카운터한다. CHO 세포는 첨가된 성분물없이 증식되어 57025(±7530)CPM을 수득한다. 11a 존재하에 시료의 값은 52549(±6272)CPM이다. 이값은 두시료의 증시율에서 통계적 차이가 없는 것으로 보인다. CHO 세포는 비-임파성 형태이기 때문에, 이 결과는 본 발명의 성분물이 포유류 세포증식을 저해하지 않고 PBL 배양물의 활성과 증식을 억제한다.
7. 실시예:6-카르복실-4-치환된 스피로[벤조퓨란-2-(3H)-사이클로헥산]
7.1. 6-카르복실-4-메톡시스피로[벤조퓨란-2-(3H)-사이클로헥산] 소듐염(44a)와 6-카르복실레이트-4-에톡시-스피로[벤조퓨란-2-(3H)-사이클로헥산]소듐염(44b)
성분물 33a-b:건조아세톤(200ml)에 메틸 3,5-디하이드록시 벤조에미트(10g, 59.5mmol)에 건조 K2CO3(8.2g, 59.4mmol)을 첨가한다. 디메틸 설페이트(33a:75g, 59.5mmol)을 혼합물에 첨가하고 24시간동안 재환류시킨다. 혼합물을 여과한다. 에테르(200ml을 용액에 첨가하고, H2O(100ml×2)로 추출한다. 유기용액은 MgSO4로 건조시키고, 용매를 제거하고, 생성물(9.0g)을 흰생성물로 33a를 얻기위해 크로마토그래피(1:19)EtOAc/CH12(12)로 정제한다.
33b에서는 33a의 과정을 알킬레이팅제로써 디에틸 설페이트를 이용하여 변형시킨다.
34a-b의 제조:NaH(50% 미네랄오일, 2.2g P17mmol)을 N2하에 헥산(40ml×2)로 세척한다. 건조 DMF(50ml)을 첨가하고 혼합물은 0℃까지 냉각한다.
건조 DMF(40ml)에 용액 33a(7.6g. 41.7mmol)을 서서히 첨가하고, 25℃에서 1시간교반시킨다. 0℃로 다시냉각시키고, DMF(20ml)의 MOMCl(3.7g, 45.8mmol)용액을 적하시켜 3시간동안 25℃에서 교반시켜 에테르(200ml)을 첨가하고, H2O(100ml×4)로 세척하고 에테르는 건조(MgSO4)시키고, 농축한다.
35a-b의 제조:LiAlH4(1.7g, 44.2mmol)을 질소하에 THF(150ml)로 현탁시키고 0℃로 냉각시킨다. THF(20ml) 34a(10g. 44.2mmol)용액을 적하한다음 25℃에서 3시간 교반시킨다. 과량의 LiAlH4는 얼음으로 파괴하고, 혼합물을 실리카겔로, 여과하며 에테르르(150ml)세척한다. 용액은 물(50ml42)로 세척하고, 농축시켜 무색액상을 얻는다.
성분물 36a-b의 제조:CH2Cl2(50ml)에 35a(2.2g, 11.1mmol)과 이미다졸(1.51g, 22.2mmol)을 CH2Cl2에 용해된 TBDMSCl(2.0g, 13.3mmole)에 서서히 첨가한다. 혼합물은 3시간 동안 25℃에서 교반시키고 H2O(100ml×2)로 세척하여 MgSO4로 건조시키면 무색의 액체를 얻을 수 있다.
성분물 38a-b의 제조:0℃에서 질소하에 건조 THF(200ml)에서 36a(8.2g, 26.2mmol)과 TMEDA(4.6g, 39.4ml) 용액을 서서히 첨가한다. 용액은 0℃에서 30분간 교반시키고 25℃에서 1.5시간 교반시킨다. 용액은 -78℃로 냉각시키고, CuI(7.5g, 39.4mmol)을 N2하에 첨가하여 -78℃ 내지 -40℃에서 1.5h동안 교반시킨다. 혼합물은 다시 -78℃로 냉각시키고 브로이드 37(5.5g 31.5mmol)/THF(20ml)을 적하하고, 혼합물은 -78℃ 내지 25℃에서 4시간 교반시킨다. 에테르(20ml)을 첨가하고, 수용액에 청색이 없을때까지 20%NaOH용액으로 세척한다. 건조시키고 농축시켜 각색 액체(10.4g)을 수득하고 크로마토그래피로 정제한다.
생성물 39a-b의 제조:THF(100ml), (Bu)4NF(1.0M THF 21ml. 21mmol)의 38a(7.2g. 14.7mmol) 용액을 25℃에서 서서히 첨가한다. 용액은 2시간동안 25℃에서 교반시키고 에테르(100ml)을 첨가하여 HCl(20ml)로 H2O(100ml×2)로 세척 건조시켜 무색의 액체를 수득한다.
성분물 40a-b의 제조:CH2Clc(100ml)의 PCC(5.5g. 25.6mmol) 혼합물을 25℃에서 CH2Cl2(50ml)/39a(4.6g. 15.7mmol)에 서서히 첨가한 다음 4h동안 25℃에서 교반하고, 실리카겔로 여과시켜 EtOAc(40ml)로 세척하고, H2O(5oml)로 세척한 후 건조(MgSO4)하고 농축시킨후(3:7 EtOAc/헥산)으로 크로마토그래피하여 정제시킨다.
성분물 41a-b의 제조: 0℃에서 2-프로판올(30ml)과 THF(15ml)의 40a(4.2g, 14.5mmol)용액을, 2-프로판올(10ml)에서 4N HCl 용액(40ml, 160mmol)에 첨가한다. 용액은 40a가 없어질때까지 16h동안 25℃에서 교반시킨다. 용액은 에테르(50ml×3)로 추출한다음 H2O(30ml)로 세척하고 건조 농축시킨다. 생성물은 크로마토그래피로(3:7 EtOAc/헥산)으로 정제한다.
성분물의 42a-b. 제조: Amberlyst(5(10g)은 41a(3.3g. 13.4mmol) 용액에 첨가한다. 용액은 6h동안 25℃에서 교반시킨다. 혼합물은 여과시켜 3g 생성물로 농축시키고 크로마토그래피(1:4 EtOAc/헥산)으로 정제하여 흰색 고형물(2.5g 76%)를 수득한다.
43a-b의 제조:50℃에서 Ag2O(2.4g. 10.2mmol)을 포함하는 2NNaOH혼합물, EtOH(1ml)과 THF(5ml) 용액 42a(1g, 4.1mmol)을 서서히 첨가한다. 혼합물은 50℃에서 6h동안 교반시킨다. 혼합물은 여과하고 수용성용액은 에테르도(50ml) 세척한다. 수용성용액은 0℃로 냉각시킨다.
농축 HCl로 산성화시킨다. 생성된 흰색침전물은 에테르로 추출하고, 건조 농축시켜 흰색고형물인 43a를 수득할 수 있다. 수득률은 0.75g(71%)
44a-b의 제조: 소듐하이드리드(50% 미네랄오일 0.58g. 24.2mmol)을 N2하에서 헥산(30ml)로 세척하고 에테르(50ml)를 첨가한다. 에테르(150ml)의 43a 용액(3.2g. 12.2mmol)를 혼합물에 첨가하고 6h동안 교반시켜 흰색 침전물을 얻을 수 있다. 수용성용액을 수득하고, 동결건조시켜 고형물(3.2g, 92%)를 수득한다.
7.2. 6-포밀-4-하이드록시스피로(벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산](52)
45의 제조:45의 제조과정을 기본적으로 34에 사용된 것과 동일하나 2몰과 NaOH와 MOMCl이 사용되었다. 수득률은 83% TLC Rf0.65(1:1에테르/헥산).
46의 제조:46의 제조과정을 35의 사용된 것과 동일하다. 수득률은 89%, TLC Rf0.27(1:1 에테르 1헥산).
48의 제조:48의 제조과정을 39의 제조과정을 기본적으로 동일하다.
49의 제조 : 49의 제조과정은 39에 사용된 과정과 동일하다.
50의 제조 : 50의 제조과정은 40에 사용된 과정과 동일하다. 생성물은 크로마토그래리(3:7 에테르/헥산)에 의해 정제한다.
51의 제조:51의 제조과정은 41에 사용된 것과 동일하다. 생성물은 크로마토그래피(3:7 EtOAc/헥산)으로 정제한다. 다량의 생성물은 분해되고 실리카겔에 포획되어 수득률(28%)이 낮다.
52의 제조: 52의 제조과정은 42에 사용된 것과 같다. 생성물은 크로마토그래피 3:7(EtOAc/헥산)으로 정제한다.
7.3. 4-벤질옥시-6-포르밀-스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로 헥산](53a)
53a제조:소듐 하이드리드(50% 미네랄오일, 62mg, 2.58mmol)을 N2하에서 헥산(20ml)로 세척한다. 건조 DMF(5ml)를 첨가하고 DMF(10ml)의 용액 52(0.30g, 1.29mmol)을 25℃에서 서서히 첨가한다. 30분 교반후에 DMF(5ml) 벤질 브로마이드(0.22g, 1.29mmol) 용액을 적하한다. 혼합물을 50℃로 올리고 2시간이상 교반시킨다. 에테르롤(50ml) 첨가하고. H2O(50ml×3)로 세척한 후 건조 농축시켜 0.4g 생성물을 수득한다. 크로마토그래피(1:4 Et2O/헥산)에 의한
7.4. 4-N-부틸옥시-6-포르밀-[NBU-]스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산](53b)
53b 제조:소듐 하이드리드(50% 미네랄오일, 62ng, 2.58mmol)을 N2하에 헥산(30ml)로 세척하고 건조 DMF(5ml)을 첨가한다. 혼합물에 건조 DMF(10ml)에 용액 52(0.3g, 1.29mmol)을 한방울씩 떨어뜨린다. 혼합물은 30분간 교바너시킨다. DMF(5ml)에 n-부틸-p-톨루엔설포네이트(0.29g, 1.29mmol)을 한방울씩 떨어뜨린다. 혼합물은 50℃로 올리고, 2시간동안 교반시킨다. 혼합물에 에테르(50ml)을 첨가하고 물(50ml×2)로 세척하고, 건조시켜 생성물을 얻을 수 있다. 크로마토그래피에 의한 정제(1:4 에테르/헥산)은 53b와 같은 희미한 노란색액이 된다.
7.5. 6-포르밀-4-페녹시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산](53c)
53c제조:N2 조건하여 52 용액(0.4g, 1.72mmol)/CH2CL2를 트리페닐 비스무스 디아세테이트(1.16g, 2.08mmol)과 구리분말(11mg, 0.17mmol)/CH2C12(50ml)에 첨가하였다. 혼합물은 24시간동안 25℃에서 교반시키고, 실리가겔을 통하여 여과시킨 다음 CH2Cl2 용액(20ml)에서 10% EtOAc로 헹구어낸다. 용액은 H2O(50ml)로 세척해내고, 건조시켜 생성물(0.65g)으로 농축하여 53c와 같은 무색액체인 크로마토그래피(1:4 에테르/헥산)로 정제시킨다.
7.6. 6-포밀-4-(2'-하이드록시에틸옥시)스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산](53d)
53d의 제조:N2 존재하에 소듐 하이드리드(50% 미네랄 오일, 0.10g 2.15mmol)을 헥산(50ml)로 세척한다. 건조 DMF(15ml)을 첨가하고 DMF(10ml)에서 52용액(0.50g, 1.29mmol)을 25℃에서 서서히 첨가한다. 30분 교반후에 DMF(5ml) 2-[(사가부틸디메틸실릴)옥시]에틸 브로마이드 용액을 한방울씩 첨가한다. 혼합물 50℃로 올리고 3시간이상 교반시킨다. 에테르(50ml)을 혼합물에 첨가하고 물(50ml×3)으로 세척한다. 에테르층을 수득하고 건조시켜 농축시킴으로써 생성물(0.9g)을 얻는다. 크로마토그래피에 의한 정제(1.5:8.5 에테르/헥산)은 옅은 노란색 고형 0.70g(83%)을 수득할 수 있다.
상기 생성물(0.31g, 0.79mmol)을 THF(5ml)에 용해시켜 테트라부틸암모니움 플로리느(1ml, 1.0mmol, 1.0M THF 용액)을 첨가하고, 용액은 2시간동안 25℃에서 교반시킨다. 에테르(30ml)을 첨가하고 용액은 물(50ml)로 세척한다. 에테르층은 수득하고, 건조시켜 옅은 노란색액체로 농축시킨다. 크로마토그래피(1:4 헥산/에테르)에 의한 정제에서 53d와 같은 옅은 노란색 액체를 얻을 수 있다.
7.7. 6-포밀-4-P-니트로페녹시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산](53e)
53e의 제조:소듐 하이드리드(50% 미네랄 오일, 0.10g, 4.58mmol)을 질소하에서 헥산(20ml)로 세척하고 건조 DMF(50ml)을 첨가한다. 혼합물에 DMF(15ml) 52용액(0.50g, 2.15mmol)을 25℃에서 서서히 첨가한다. 혼합물은 30분간 서서히 교반시킨다. DMF(10ml)에서 1-플로로-4-니트로벤젠 용액을 서서히 첨가한다. 혼합물 35℃로 올리고 3시간동안 교반시킨다. 에테르(100ml)을 물로 세척(50ml×3)하여 25℃로 냉각시킨후 혼합물에 첨가한다. 에테르층을 수득하여, 건조시키고, 농축하여 생성물(0.79g)을 수득한다. 크로마토그래피(1:9 EtOAc/헥산)에의 한 정제로 53e와 같은 노란색의 끈끈한 오일이 된다.
7.8. 6-포밀-4-9-포밀페녹시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산](53f)
53f의 제조:소듐 하이드리드(50% 미네랄 오일, 103mg, 4.31mmol)을 N2 존재하에 헥산(20ml)로 세척한다. 건조 DMF(30ml)을 첨가하고 DMF(50ml)에서 용액 52(0.40g, 1.72mmol)을 25℃에서 서서히 첨가하고 DMF(5ml) p-플로로 벤즈알데히드 용액을 첨가한다. 혼합물은 50℃로 올리고 24시간동안 교반시킨다. 25℃로 냉각시킨후에 에테르(100ml)을 첨가하고 물(30ml×3)으로 세척한다. 에테르층을 수득하여 건조시키고, 크로마토그래피(1.9 EtOAc/헥산)에 의한 정체로 53f와 같은 옅은 황색고형물을 수득할 수 있다.
7.9. 6-포르밀스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산](53g)
53g의 제조:피리딘(0.34g, 4.32mmol)과 52(0.50g, 2.15mmol)을 메틸렌 클로리드(50ml)에 용해시키고 N2 존재하에 0℃에서 냉각시킨다. 트리플릭 인하이드리드(0.40ml, 2.37mmol)을 실린저로 한방울씩 첨가한다. 용액은 0℃에서 1시간동안 교반시킨다. 용액은 5% ag로 세척하고 HCl(10ml)과 물(30ml×3)으로 건조시키고 농축시켜 생성물을 얻는다. 페놀 트리플레이트 52를 얻기 위해 크로마토그래피(1:9 EtOAc/헥산)으로 정제한다. 수득율 0.70g(90%) 페놀 트리플레이트 52:
54d : 반응물은 50℃에서 8시간 교반시킨다.
54e : 혼합물은 50℃에서 24시간 교반시킨다.
(25mg, 0.11mmol)과 트리에틸아민(1.66g, 16.4mmol)을 DMF(10ml)에 용해시키고, DMF(2ml) 96% 포름산(0.50g, 10.8mmol)을 첨가한다. 혼합물은 N2하에서 2h동안 60℃에서 교반시키고, 생성물은 물(50ml) 세척한 후, 에테르(50ml×3)로 추출한다. 에테르층을 수득하고 건조농축시켜 갈색 잔유물을 수득한다. 생성물은 크로마토그래피(1:9 EtOAc/헥산)으로 정제하여 53g을 얻는다.
7.10. 4-벤질옥시-6-카로복시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산](54a)
4-N-부틸옥시-6-카르복시시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산](54b)
6-카르복실-4-페녹시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산](54c)
6-카르복실-4-(2'-하이드록시에틸스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산](54d)
6-카르복실-4-p-니트로페녹시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산]
54a-e제조:이성분물의 제조과정은 43에 이용된 것과 같다.
54d: 반응물은 50℃에서 8시간 교반시킨다.
54e: 혼합물은 50℃에서 24시간 교반시킨다.
7.11. 6-카르복실tm피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산](54g)
4-P-아미노페녹시-6-카르복실스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로 헥산](54h):6-카르복실-4-P-카르복실페녹시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로 헥산](54i) 54g : 혼합물은 60℃에서 4h교반 시킨다.
54h:54e(30mg, 0.81mmol)은 NeOH(10ml)와 10% Pd-C(20mg)에 용해되어 첨가된다. H2기체를 25℃에서 5hrks 통과시킨다. 혼합물은 여과하고 MeOH는 제거하면 각색 오일을 얻을 수 있다. 생성물은 TLC(1:19 MeOH/CH2Cl2)로 정제하여 옅은 황색 생성물 54h를 얻는다.
54i: 이 성분물의 제조과정은 43의 것과 동일하다. 혼합물은 60℃에서 24h 교반시킨다. 혼합물은 CH2N2로 처리하고, 크로마토그래피(1:4 EtOAc/헥산)으로 정제하여 54i의 디메틸에테르를 수득한다.
디메틸에테르 54i(0.15, 0.38mmol)을 THF(10ml)에 용해시키고 2N NaOH(5ml) 용액을 첨가한다. 용액은 50℃로 덮히고, 3h간 교반한다. 25℃로 냉각시킨후, 수용액은 에테르(20ml)로 헹구어내고, HCl로 수요액을 산성화시킨다. 흰색 침전물이 생성되고 에테르(50ml×2)로 추출한다. 침전물을 건조하고, 농축시키고 생성물 54i로써 흰색 고형물이 생성된다.
7.12. 4-벤질옥시-6-카르복실시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산](55a):4-N-부틸옥시-6-카르복실시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산](55b);6-카르복실-4-페녹시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산](55c);6-카르복실-4-(2'-하이드록시에틸옥시시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산](55d):6-카르복실-4-p-니트로페녹시시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산](55e):6-카르복실스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산](55g);6-카르복실-4-P-카르복실페녹시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산](55i)
55a-e.g:i의 제조
8. 실시예: 6-7-2치환된-4-메톡시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산]
Thomas Hoover 장치에 의해 녹는점을 측정하고 적외선은 Perkin Elmer 281B 스펙트로메트의 도움으로 측정하며, 1H NMR 스펙트럼은 듀터리오 클로로포름에서 90MHz, 또는 300MHz(각각 Varian EM390, Varian VXR 300 스펙트로메터에 의해 기록한다. C NMR은 Varian VXR 300 스펙트로메터에서 75.4MHz에서 기록된다. 모든 시그날은 ppm으로 기록된다. 시그날의 약어는 다음과 같다. s: 단일, d=이중, t:3중, q:4중, m:다중, b:광범위, 해상도가 낮은 메스스펙트라는 70eV에서 Finnigan 3221-F200 스펙트로그라프에서 수득할 수 있다. Atlantic Mirolab, Inc(Norcross, GA)에 의해 성분 분석을 실시한다. HRMS는 Massachusette Institute of Technology에서 수득하였다.
8.1. 7-카르복시-6-포르밀-4-메톡시스피로[벤조퓨란-2(DH)-시클로헥산](62)
58 제조: 헥산(32.67ml, 65.34mmol)에 n-부틸리듐용액을 한방울씩 적하시켜 THF(300ml)에 3, 5-디메톡시 벤질 알코올(56.5g, 29.7mmol)와 TMEDA(5.67ml), 35.64mmol)의 용액(0℃)로 냉각시킨다. 15분간 0℃에서 실온에서 90분간 교반시킨후에, 반응물은 -45℃로 냉각시키고, 구리(I) 이오디드를 첨가한다(7054mg, 37.13mmol). 한시간후에, 친전자기 57을 실린저로 첨가한다. 실온에서 24시간 교반후에, 농축된 암모늄 하이드록시드(100ml)을 첨가하고 반응 생성물은 에틸아세테이트(4×150ml)로 추출한다. 결합된 유기상은 MgSO4로 건조시키고, 용매는 진공하에서 응발시키고 남은 오일은 점성오일로 58(6678mg, 25.49mmol, 86%)를 생성하기 위해 크로마토그래피하고 흰색 고형물을 얻기위해 재결정화 한다.
59 제조: 헥산(4.2ml, 8.4mmol)에 n-부틸리듐용액(4.2ml, 8.4mmol)을 헥산(50ml)과 TMEDA(0,69ml, 4.58mmol)의 성분물 58(1000mg, 3.82mmol)에 첨가한다. 15분간 0℃에서 90분간 실온에서 교반시킨후 생성된 현탁액은 -78℃로 냉각시킨후, 건조카본 디옥시드는 -78℃에서 1시간동안, 실온에서 1시간동안 끓인다. 2N NaOH(25ml) 첨가후에 반응안된 물질은 에테르로 추출하고 추출물을 버린다. 수용성면은 6N HCl로 산상화시키고 반응생성물은 에테르(4×50ml)로 추출한다. 건조(MgSO4)와 유기상으로 진공하에서 농축시킨 후 59(727mg, 2.52mmol, 66%)를 고형으로 회수한다.
60 제조: 59(470m, 1.63mmol)용액을 시발물질이 남아있지 않을때까지 탈메틸화시킨다. 번 반응 생성물은 에틸아세테이트(4×40ml)로 추출하고 건조(MgSO4)시킨후, 진공하에서 농축시켜 흰색고형물인 생성물 60(332mg, 1.21mmol, 74%)을 정제한다.
61 제조: 암버리스트 15(290mg, 2g/mmol)을 실온에서 24시간 교반시킨후 건조 메틸렌 클로리드(2.9ml, 20ml/mmol)에서 용액 60(40mg, 0.146mmol)에 첨가하고, 용매는 실리카겔의 컬럼을 통하여 여과시킨 후, 고형물은 에틸아세테이트로 세척하고 여과물은 실리가겔을 통하여 여과시킨다. 결합된 여과물은 공공하에서 농축시키고, 크로마토그래피하여 61(38mg, 0.139mmol, 95%)를 얻는다.
62조의 제조:성분물 61(211mg, 0.77mmol)을 THF(4ml)에 용해시키고, 생성된 용액을 10N NaOH(6ml, 60mmol)과 FTBA(1ml, 1mmol) 용액에 첨가한다. 포타슘 퍼망간에이트를 시발물질이 남아있지 않을때까지 첨가한다. 과량의 kMnO4는 소듐 설피트로 제거하고, 반응물은 6N H2SO4로 산성화시킨다. 유기물질은 에틸아세테이트(4×50ml)로 추출하고, 추출물은 MgSO4로 건조시킨후 진공하에서 농축시켜 62(120mg, 0.41mmol, 53%)를 생성하기 위해 크로마토그래피한다.
8.2. 6-카르복시-7-포르밀-4-메톡시-스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산(68)과 6, 7-디카르복실-4-메톡시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산](66)의 합성
65조의 제조:헥산(2.20ml, 4.95mmol)에 n-부틸리듐의 용액은 THF(6ml)에 N, N, N' 트리메틸에틸렌디아민(0.65ml, 5.09mmol) 용액에 -20℃(CC14/CO2)에서 첨가한다. 30분후에 THF(4ml)에 11b(1170mg, 4.76mmol)용액을 적하시키고, 30분에 n-BuLi(6.35ml, 14.28mmol)을 적하시킨다. 생성된 시스템은 24시간 -20℃에서 유지시키고 DMF를 첨가한다(0.2.20ml, 28.56mmol) 24시간 반응후에, 반응생성물은 에테르(4×50ml)과 브린(50ml) 사이에서 분리되어 고형의 65 생성물(1135mg, 4.14mmol, 87%)를 크로마토그래피한다.
68의 제조:4N 포타슘 하이드록시드(52.92mmol)용액을 용해된 실버 니트레이트(3777mg, 22,22mmol, 1.05eq)를 포함하는 THF(10ml)과 물(7ml)에서 성분물 65(2900mg, 1058mmol)에 실온에서 교반시키면서 첨가한다. 반응시스템은 직사광선으로부터 보호한다. 실온에서 2시간 교반후에, 고형물은 여과시키고 증류스로 세척한다. pH가 3이 될 때까지 2N H2SO4를 첨가시키고 반응생성물은 에테르(3×150ml)로 추출한 후, 브린(2×25ml)로 세척하고 건조시킨다. (MgSO4), 반응생성물은 시발물질(1823mg, 63%) 성분물 68(326mg, 1.12mmol, 11%, 29% 수득율), 성분물 66(614mg, 2.01mmol, 19%, 51%)를 회수하기 위해 크로마토그래피한다.
66의 제조:에탄올(5ml)에 용액 65(153mg, 0.56mmol)을 증류스(1ml)에 실버 니트레이트(222mg, 1.30mmol) 용액에 첨가시키고 그다음 KOH(3ml, 2.99mmol)에 첨가시킨다. 시스템은 실온에서 24시간동안 교반시키고 빛으로부터는 차단시키며, 여과시켜, 잔유물은 물로 세척한다. 결합된 수용성 상은 에테르로 추출하고, 수용성 상은 산성화시켜 에테르(3×25ml)로 추출하고 흰고형물 66(156mg, 0.51mmol, 91%)를 수득하기 위해 크로마토그래피한다.
8.3. 4-메톡시-5a, 6, 8, 8a-테트라하이드로스피로[벤조[2.1-b:3.4-c']디퓨란-2(8H)-사이클로헥산]-6, 8-디이온;6, 7-디하이드록시메틸-4-메톡시스피로[벤조퓨란-2(3H)사이클로헥산]; 4-메톡시스피로[벤조[2.1-B:3.4-c']디퓨란-2(3H)-사이클로헥산]-6-(8H)-1의 합성
63의 제조:아세톤(10ml)에 냉각, 교반된 62 용액(150mg, 0.51mmol)을 시발물질이 완전히 전이될 때까지 Jones 시약으로 처리한다. 초과된 시약인 이소프로판올로 파괴시키고, 브린(30ml)을 첨가하여 반응생성물은 에틸아세테이트(4×50ml)로 추출하고 추출물은 MgSO4로 건조시켜, 진공하에 농축시켜 생성물 63을 얻기 위해 크로마토그래피한다.
64의 제조:THF(15ml)의 61용액(300mg, 1.09mmol)을 LAH로 3시간동안 처리한다. Na2SO4.10H20와 에테르 첨가후에 반응생성물을 여과시켜 디올 64를 얻는다.
(260mg, 0.94mmol, 86%);1H NMR:1.40-1.90(m 10H), 2.93(s, 2H), 3.83(s, 3H), 4.66(s, 2H), 4.70(s, 2H) and 6.47(s, 1H).
67의 제조:건조 메틸렌 클로리드(15ml) BaMnO4(1197mg, 4.68mmol)에 64용액(260mg, 0.935mmol)을 첨가하여 생성된 현탁액은 실온에서 3일간 보관한다. 브린(30ml)과 에틸아세테이트(3×50ml)사이에 반응생성물을 수득한 후에 여기에는 67과 65가 동몰량으로 존재함을 알 수 있다.
9. 이가와 3가 치환된 스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산]에 의한 상보적 저해
실시예 7의 4가 치환된 스피로벤조퓨란 성분물과 실시예 8의 2가 치환된 시프로벤조퓨란 성분물은 상보시스템 원료로 사람혈청을 이용하고 6.6.2에 상술한 것과 같이 SRBC의 상보-조절된 해리를 저해하는 능력을 검사하였다. 용혈검사는 도면 8과 표 11과 12에 나타내었다.
도면 8과 표 11에 나타낸 것과 같은 성분물 62, 66과 68에 의한 용혈의 저해를 비교함으로써 벤조퓨란링의 6과 7의 위치에 치환체들의 특정배열은 항-용혈성 활성에 중요한 것으로 보인다. 표 12의 4-치환된 것들의 값 IH50과 비교하면 항-용혈성 활성의 개선이 위치 4에서 R 치환체의 선택적으로 하여 수득할 수 있다. 또한 성분물중 몇몇이(55c, 55e, 55h, 68)이 K76COOH 보다 상보시스템 조절되는 용혈의 저해에 효과가 큰 것으로 보인다. 6과 7 위치의 치환체와 4위치의 치환체가 더 큰 상보적 저해를 나타내는 것으로 보인다.
10. 2와 3치환된 시피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산]에 의한 상보물의 생체내와 시험관에서의 저해
1.1. 개요
과민성 이식 거부반응에서의 상보시스템의 역할은 동물이식체의 모델에서 설명된다(Knechtle et al., J. Heart Trans-plant., 1983, 4:541; Pruitt and Bollinger, J. Surg. Res., 1991, 50:350-355: as well as xenograft transplantation(Adachi et al., Transplant Proc., 1987, 119:1145-1148; Migagawa et al., Transplantation, 1988, 46:825; Prewitt et al., 1991, Transplantation 52:868-873). 제노그라프트 모델, 기니아피그와 쥐-심장이식체를 선택하여 생체내에서 과민성 이식거부에서의 치환된 디하이드로벤조퓨란의 효과를 추정하였다.
10.2. 쥐와 사람의 상보시스템에서의 저해
8.2와 7.1에서 설명한 것과 같이 성분물 68과 44a를 준비한다. 이 성분물은 6.6.2와 9에서 설명한 것과 같이 사람혈청을 이용하여 상보시스템 조절된 용혈의 저해를 설명한다. 성분물 68과 44a는 상보시스템 소스로서 사람혈청대신에 쥐혈청을 사용한 것 이외에는 6.6.2의 방법을 이용한 쥐의 상보시스템을 저해하는 것을 설명한다. sCR1은 상술한 것과 같이 준비하고(Weisman et al., Science, 1990, 249:146-151; Y도 et al., J. Immunol, 1991; and International Patent Publications No. WO 89/09220 and WO 9/05047, both entitled The human c3b/c4b receptor(CRI) Fearon et al.) 생체내 검사에서 양성콘트롤로써 이용한다. 이 연구의 결과는 표 13에 요약하였다.
표 13에서 보는 바와 같이, 사람 sCR1 단백질은 이검사에서 유사한 능력으로 쥐와 사람 상보시스템을 저해한다. 한편, 이성분물은 쥐보다는 사람의 상보시스템에 더 큰 저해효과를 나타낸다. 성분물 68의 25 내지 70배 고농도에서는 사람의 상보시스템 조절된 용혈의 저해에 요구되는 것보다 더 쥐의 상보시스템 저해용해에 요구된다.
10.3 또다른 경로의 중재된 용혈의 저해
6.6.2에 설명하는 것과 같이 sRBC 용해의 저해는 적혈구의 표면에 항원-항체 복합물에 의해 용혈이 개시되기 때문에 전통적인 상보시스템의 활성화 과정을 반영한다. 이 검사는 또다른 경로의 활성화 과정도 포함된다.
또다른 상보시스템 경로를 저해하는 치환된 디하이드로벤조퓨란의 능력은 Platts-Mills와 Ishizaka, 1974, J. Immunol. 113:340-358을 이용하여 측정할 수 있다. 기본적으로 토끼 적혈구는 젤라틴 베르놀 완충액(GVB, Sigma, St. Louis, MO)와 EGTA, Mg2+ 8mM~2mM이 첨가된 곳에서 상보시스템으로 사람혈청을 이용하여 용해시킨다. 토끼 적혈구(4.5×10 세포/ml), 사람혈청(1:24 희석)과 시험할 성분물은 V-바닥 미량적정 플레이트에서 37℃에서 1시간 배양하고 세포는 원심분리하여, 상층액은 미량적정 판에 옮기고, 410nm에서 흡수도를 측정한다. 시료는 사람혈청이 부족한 동일한 콘트롤과 쌍을 이룬다. 시료와 콘트롤은 3회씩 반복한다. 시료값에서 콘트롤 값을 빼고, 단편적 저해는 저해안된 시료에 대해서 결정한다. 결과는 약 50%의 저해도 AH50을 나타내는 생성물의 농도로 보고된다. 성분물 몇가지의 AH50은 표 14에 요약한 것이 포함된다. 표 14에서 보는 바와 같이, 성분물 68은 전통적인 경로에서는 K76COOH보다 더 효과적인 저해를 나타내고 또다른 경로를 통한 저해에서는 K76COOH보다 잠재능이 약하다. 성문물 44a는 K76COOH와 마찬가지로 전통적인 경로를 저해하나 또다른 경로를 저해하는데에 있어서 K76COOH 또는 68보다는 약하다.
10.4. 인자 I에 의한 C3b 단백질 용해의 저해
K76COOH는 인자 I과 공인자 단백질 H에 의해 C3b의 단백질 분해를 저해하는 것으로 보인다(Hong et al., 1981. J. Immunol. 127:104-108). 인자 I에 의한 C3b α-사슬의 특이적인 분해를 저해하는 치환된 디하이드로벤조퓨란의 능력은 공인자로써 인자 H 또는 sCR1을 이용하여 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정할 수 있다(SDS-PAGE; Wong et al. 1985, J. Innunol. Methods, 82:303-313; Weisman et al., 1990, Science. 249:146-151). 1.2uM 인자 I(Cytotech, San Diego, CA), 0.1uMsCR1 8nM에서 정제된 C3b는 37℃에서 60분간 배양시킨다. 반응은 환원된 SDS PAGE 시료 완충액(Laemmli, 1970, Nature, 227:680-685)를 첨가하여 정지시키고, 4-20% PAGE 겔에서 전기영동하여 코마시 블루 착색으로 관찰하고 덴시토메트리로 정량한다. 인자 I이 부족한 콘트롤과 시험성분물이 부족한 인자 I의 콘트롤은 포함된다. 결과는 C3b -사슬 분해의 약 50% 저해(IC50)하는 시험 성분물의 농도로써 보고되어 있다.
이 성분물의 결과는 표 14에 나타내었다.
10.5. 기니아피그와 쥐심장 이식물
초급성 이식거부에서 성분물 68과 44a의 효과는 제노그라프의 모델에서 검사하였다. 방법은 기존의 것과 동일하나(Prewitt et al., 1991, Transplantation 52:868-873) 단, 초기연구에서 활성성분(sCR1) 대신에 성분물이 치환된다. 초기연구에서 지적한 것과 같이, 12-16주된 수컷 Lewis 쥐와 4-10주된 수컷 Hartley 기니아피그를 심장 제노그라프트의 수용자와 기증자로 이용하였다. 할로탄 마취하에서 이형심장 제노이식은 Ono와 Lindsey, 1990, J. Thorac. Cardiovas. Surg., 57:255의 마이크로혈관기술을 변형시켜 실시한다. 심장 제노그라프트는 30분간 측정한후 재환류시키고, 복부를 닫고, 매 10분 간격으로 거부가 일어날때까지 촉진시킨다. 거부는 심장 제노그라프트 농도의 총휴식으로 나타내는데 직접 관찰하거나 조직검사에 의해 실행할 수 있다. PBS 완충액 ml 당 14mg의 성분물 68과 44a는 수용체내로 정맥으로 2.0ml씩 주입하고 즉시 심장 제노그라프트 재환류를 시킨다. 콘트롤 동물은 PBS를 동양 수용하게 된다. 세 개의 콘트롤 동물(n=3)을 성분물 68을 수용한 동물과 동시에 검사하고 동일한 과정으로 비교한다(Pruitt et al., 1991, Transplantation 52:868-873). 표 15에는 각동물의 제노그라프트 생존시간과 다양한 집단에서의 평균과 SEM이 포함된다. 표에서 보는 것과 같이 성분물 68은 콘트롤과 비교할 때 2/3에서 이식의 생존기간이 연장되었음을 볼 수 있다.
본 발명은 전술한 실시예에 한정하지 않으며, 본 발명을 설명하기 위한 것으로 본 발명의 영역내에 기능적으로 등가의 변형이 있을 수 있고 또한 이러한 변형이나 수정은 본 기술분야에 속함이 자명하며 본 발명의 청구범위내에 속한다.
각종 참고문헌도 본 발명내에 기술하였다.

Claims (16)

  1. 하기의 일반식 4인 성분물에 있어서,
    R은 수소, 저가알킬기, 치환된 저가알킬기, 벤질기, 치환된 벤질기, 폐닐기 또는 치환된 페닐기이고, R1과 R2는 각각 독립적으로 카르복실산기, 포르밀기, 하이드록시메틸기, N-(저가알킬)카르바밀기, 트리플로로아세틸기, 할라이드기, 비닐기, 10개 탄소원자를 가진 치환된 비닐기, 20개 탄소원소를 가진 알킬기덴기, 알리파틱 아실기, 치환된 알리파틱 아실기, 아로마틱 아실기, 치환된 아로마틱 아실기, 설파모일기, 아미노메틸기, N-(저가알킬)아미노메틸기, N,N-디(저가알킬) 아미노메틸기, 헤테로사이클릭링, N-(아실)카르바밀기, 아미디노기 또는 하이드라진기이고, 탄소원소에 부착된 R1과 R2는 동시에 사이클 안하이드리드 또는 락톤이 될 수 있거나 또는제약학적으로 수용가능하고 산 또는 염기 첨가염 또는 이의 에스테르인 것을 특징으로 하는 성분물.
  2. 제1항에 있어서, 6, 7-디카르복시-4-메톡시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산], 6, 7-디포르밀-4-메톡시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산], 6, 7-디하이드록시메틸)-4-메톡시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산], 4-메톡시-3, 6-디하이드로스피로[벤조[2.1-b:3,4-c']디퓨란-2(3H)-사이클로헥산]-8-1, 7-카르복실-6-포밀-4-메톡시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산], 4-메톡시, 5a,6,8,8a-테트라하이드로스피로[벤조(2,1-b:3,4-c']디퓨란-2(8H)-사이클로헥산]-6,8-디온과 6-카르복시-7-하이드록시메틸-4-메톡시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산]락톤으로 구성된 집단에서 선택되는 것을 특징으로 하는 성분물.
  3. 제1항에 있어서, 6-카르복시-7-포밀-4-메톡시스피로[브레노퓨란-2(3H)-사이클로헥산]과 6-카르복시-7-포밀-4-페녹시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산]으로 구성된 집단에서 선택되는 것을 특징으로 하는 성분물.
  4. 하기 일반구조식 4를 가지고, 이때 R은 수소원자, 저가알킬기, 치환된 저가알킬기, 벤질기, 치환된 벤질기, 페닐기 또는 치환된 페닐기를 나타내고 R1은 카르복실산기, 또는 바이오이소스테릭산 또는 염기; R2는 포르밀기 또는 바이오이소스테릭 중성기; 또는 제약학적 수용가능한 산 또는 염기 첨가염 또는 이들의 에스테르를 나타내는 것을 특징으로 하는 성분물.
  5. 제4항에 있어서, 바이오이소스테릭 염기는 카르바밀기, 설파밀기, N-아크릴카르바밀기 또는 테트라졸링인 것을 특징으로 하는 성분물.
  6. 제4항에 있어서, 바이오이소스테릭염기는 아미노멜틸기, N-(저가알킬)아미노메틸기, N,N-디(저가알킬)아미노메틸기, 옥사졸린링, 아미디노기 또는 하이드라지드기인 것을 특징으로 하는 성분물.
  7. 제4항에 있어서, 바이오이소스테릭 중성기는 알리파틱아실기, 치환된 알리파틱 아실기, 아로마틱 아실기 또는 치환된 아로마틱 아실기인 것을 특징으로 하는 성분들.
  8. 하기의 일반식 4를 가지고,
    이때 R은 수소원자, 저가알킬기, 치환된 저가알킬기, 벤질기, 치환된 벤질기, 페닐기 또는 치환된 페닐기를 나타내고, R2는 수소원자를 나타내고, R1은 포르밀기, 카르복실기 또는 제약학적으로 수용가능한 산 또는 염기 첨가염 또는 이들의 에스테르로 구성되는 것을 특징으로 하는 성분물.
  9. 제8항에 있어서, 6-카르복시-4-메톡시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산]인 것을 특징으로 하는 성분물.
  10. 제8항에 있어서, 6-카르복시-4-에톡시스피로[벤조퓨란-3(3H)-사이클로헥산], 6-포밀-4-하이드록시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산], 4-벤질옥시-6-포르밀스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산], 4-부틸옥시-6-프로밀스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산], 6-프로밀-4-페녹시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산], 6-포르밀-4-(2-하이드록시에틸옥시)스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산], 6-포르밀-4-(p-니트포페녹시)스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산], 6-포르밀-4-(p-포르밀페녹시)스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산], 6-포르밀스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산];, 4-벤질옥시-6-카르복시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산], 4-부틸옥시-6-카르복시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산], 6-카르복시-4-(2-하이드록시에틸옥시)스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산], 6-카르복시-4-(p-니트로페녹시)스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산], 6-카르복시스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산], 6-카르복시-4-(p-아미노페녹시)스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산]와 6-카르복시-4-(p-카르복시페녹시)스피로[벤조퓨란-2(3H)-사이클로헥산]으로 구성된 집단에서 선택되는 것을 특징으로 하는 성분물.
  11. 하기 일반식 4를 가지고
    이때, R은 수소원자, 저가알킬기, 치환된 저가알킬기, 벤질기, 치환된 벤질기, 페닐기 또는 치환된 페닐기를 나타내고, R1과 R2는 각각 독립적으로 수소원자, 카르복실산기, 포르밀기, 하이드록시메틸기, N-(저가알킬) 카르바모밀기, 트리플로로 아세틸기, 할리드기, 비닐기, 10개 탄소원소를 가지는 치환된 비닐기, 20개 탄소원소를 가지는 알킬기덴기, 알리파틱 아실기, 치환된 알리파틱 아실기, 아로마틱 아실기, 치환된 아로마틱 아실기, 설파모일기, 아미노메틸기, N-(저가알킬) 아미노메틸기, N,N-디(저가알킬)아미노메틸기, 헤테로사이클릭링, N-(아실)카르보밀기, 아미디노기 하이드라지드기이고 R1과 R2가 동시에 사이클릭 안하이드리드 또는 락톤을 나타낼 수 있고 또는 제약학적 수용가능한 염기 또는 산 첨가 염 또는 이들의 에스테르인 것을 특징으로 하는 성분물.
  12. 면역질환 또는 부적절한 상보시스템 활성과 연관된 질병환자의 치료방법에서 제1,3,4,8,9 또는 11항에 따른 성분물의 효과량으로 구성된 성분물을 이용할 수 있는 것을 특징으로 하는 제약학적 성분물.
  13. 제12항에 있어서, 부적절한 상보시스템 활성과 연관된 면역질환 또는 질병은 화상으로 인한 유연조직파괴, 심장경색 유도성 외상, ARDS, 심장허혈과 재환류; 특이적, 비특이적 C5의 단백질분해성 과정, 신장결석, 조직적 낭창 홍반, 신세포 사구체염, 다발성 경색과 연관된 염증; 근위축성 위염, 기관지염, 알레르기성 뇌척수염, 위점마, 감상선독성염, 자가면역성 용혈성 빈혈, 펨피커스 불가리스, 교감적 안염, 지속성 과민성, 자가면역 질환, 약물알레르기 그리고 조직 플라스미노겐 활성치료와 심폐측관으로 구성된 집단에서 선택되는 것을 특징으로 하는 성분물.
  14. 이식거부, 이식-숙주반응 또는 기관조직 이식거부 환자의 치료방법에 사용하는 제약학적 성분물에 있어서, 제1,3,4,8,9 또는 11항에 따른 성분물의 효과량으로 구성된 것을 특징으로 하는 제약학적 성분물.
  15. 제15항에 있어서, 이식은 이종이식 또는 이인자형 이식인 것을 특징으로 하는 제약학적 성분물.
  16. 제15항에 있어서, 이식은 심장 이식은 것을 특징으로 하는 제약학적 성분물.
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