KR0178110B1

KR0178110B1 - Vaccine prepared from nicleocapsid protein of human derived hantaan virus expressed in e.coli

Info

Publication number: KR0178110B1
Application number: KR1019960001638A
Authority: KR
Inventors: 유왕돈; 김수옥; 김현수; 이성희; 신영철; 홍선표; 노갑수
Original assignee: 손경식; 제일제당주식회사
Priority date: 1995-09-30
Filing date: 1996-01-25
Publication date: 1999-04-01
Also published as: KR970015736A

Abstract

본 발명은 인간유래의 한탄바이러스 균주로부터 선별하고 그 서열이 밝혀진 뉴클레오캡시드 단백질 유전자, 이 유전자를 외래유전자로 함유하는 발현 플라스미드, 발현 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균 형질전환체, 형질전환체를 배양하여 단백질을 발현시키고 이를 정제함으로써 얻어진 뉴클레오캡시드 단백질 및 상기 단백질을 유효성분으로 함유하는 신증후출혈열 예방 백신에 관한 것이다.The present invention is to cultivate a nucleocapsid protein gene selected from a human-derived Hantan virus strain and its sequence is identified, an expression plasmid containing the gene as a foreign gene, an E. coli transformant transformed with an expression plasmid, and a transformant. The present invention relates to a nucleocapsid protein obtained by expressing a protein and purifying it, and to a renal hemorrhagic fever prevention vaccine containing the protein as an active ingredient.

Description

대장균에서 발현된 인간유래 한탄바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 이용한 백신Vaccine Using Nucleocapsid Protein of Human-Derived Hantan Virus Expressed in Escherichia Coli

제1도는 인간유래 한탄바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 합성 증폭하기 위한 프라이머들의 염기서열을 나타낸 것이다.Figure 1 shows the base sequence of the primers for the synthesis and amplification of the nucleocapsid protein gene of human-derived hantan virus.

제2도는 인간유래 한탄바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 포함한 재조합 유전자 운반체인 pThNP8 및 pThNP9의 제조방법을 도식화하여 나타낸 것이다.2 is a schematic diagram illustrating a method for preparing pThNP8 and pThNP9, which are recombinant gene carriers including the nucleocapsid protein gene of human-derived Hantan virus.

제3도의 (a)는 인간유래 한탄바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자의 염기서열을 공지의 한탄바이러스 76-118과 비교하여 나타낸 것이고, (b)는 유추된 아미노산 서열을 한탄바이러스 76-118과 비교하여 나타낸 것이다.(A) of FIG. 3 shows the nucleotide sequence of the nucleocapsid protein gene of human-derived hantan virus compared with the known hantan virus 76-118, and (b) compares the inferred amino acid sequence with the hantan virus 76-118. It is shown.

제4도는 발현 플라스미드 pEThNP의 제조과정을 도식화하여 나타낸 것이다.4 is a schematic of the preparation of the expression plasmid pEThNP.

제5도는 발현 플라스미드 pKKhNP의 제조과정을 도식화하여 나타낸 것이다.5 is a schematic diagram illustrating the preparation of the expression plasmid pKKhNP.

제6도는 pEThNP 또는 pKKhNP를 함유하는 대장균으로부터 각각 발현된 뉴클레오캡시드 단백질의 정제방법을 나타낸 것이다.6 shows a method for purifying nucleocapsid proteins expressed from E. coli containing pEThNP or pKKhNP, respectively.

제7도는 대장균 형질전환체 E.coli BL(pEThNP)로부터 발현된 뉴클레오캡시드 단백질의 정제단계별 순도를 나타내는 폴리아크릴아미드겔 전기영동사진이다.Figure 7 is a polyacrylamide gel electrophoresis showing the purity according to the purification step of the nucleocapsid protein expressed from E. coli BL E. coli BL (pEThNP).

제8도는 대장균으로부터 정제된 뉴클레오캡시드 단백질을 확인하기 위해 사람환자 혈액과 단일클론항체를 이용하여 웨스턴블롯팅을 수행한 결과를 나타낸 것이다.8 shows the results of Western blotting using human patient blood and monoclonal antibodies to identify the nucleocapsid protein purified from E. coli.

본 발명은 인간유래 한탄바이러스 균주로부터 선별한 뉴클레오캡시드 단백질 유전자, 이 유전자를 함유하는 발현 플라스미드, 발현 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균 형질전환체, 형질전환체를 배양하여 단백질을 발현시키고 이를 정제함으로써 얻어진 뉴클레오캡시드 단백질 및 상기 단백질을 유효성분으로 함유하는 한탄바이러스에 대한 예방 백신에 관한 것이다.The present invention is to express a protein by culturing a nucleocapsid protein gene selected from a human-derived Hantan virus strain, an expression plasmid containing the gene, an E. coli transformant transformed by the expression plasmid, a transformant, to express the protein and purify it. It relates to the obtained nucleocapsid protein and a prophylactic vaccine against hantan virus containing the protein as an active ingredient.

버어니아바이러스과의 한탄바이러스속에 속하는 한탄바이러스는 신증후군 출혈열을 유발시키는 병원균으로서 3개의 세그먼트(각각 S, M, L 세그먼트)로 이루어진 일본쇄 리보헥산 게놈(RNA genome)을 함유한다. 이중 L 절편 RNA는 RNA 의존형 RNA 폴리머라제를 암호화하고 M 절편 RNA는 당단백질인 G1 및 G2를 암호화하며 S 절편 RNA는 뉴클레오캡시드 N 단백질을 암호화하는데, 여기서 G1, G2 및 뉴클레오캡시드 N 단백질이 면역반응에 관여하는 것으로 밝혀져 있다.The hantan virus belonging to the genus Hantan virus of the Burrian viraceae family contains a single-chain ribohexane genome (RNA genome) consisting of three segments (S, M and L segments, respectively) as a pathogen causing nephrotic syndrome hemorrhagic fever. The double L fragment RNA encodes an RNA dependent RNA polymerase, the M fragment RNA encodes the glycoproteins G1 and G2 and the S fragment RNA encodes a nucleocapsid N protein, wherein the G1, G2 and nucleocapsid N proteins It has been shown to be involved in immune responses.

한탄바이러스 감염에 대한 효과적인 예방백신을 개발하고자, 지금까지 바이러스 자체 또는 이들 면역반응에 관여하는 단백질들을 이용한 많은 연구가 이루어져 왔다. 그러나, 바이러스 자체를 약독화 또는 불활화시켜 이용하는 것은 통상 효과면에서 우수한 것으로 알려져 있는 반면, 첫째, 종류에 따른 바이러스 배양 자체가 용이하지 않고 배양액으로부터의 바이러스 정제가 어려울 수 있으며 정제중 바이러스가 파괴되어 온전한 바이러스를 얻을 수 없는 경우가 많고, 둘째, 정제된 바이러스를 백신으로 사용하기 위해서는 포르말린이나 열처리를 통하여 약독화 또는 불활화시켜야 하는데 이 과정에서 백신물질이 변성될 수 있으며, 셋째, 백신 제조에 있어 가장 중요한 관건이라 할 수 있는 안전성이 미흡한 등의 문제를 안고 있다.In order to develop an effective preventive vaccine against Hantan virus infection, many studies have been made using the virus itself or proteins involved in these immune responses. However, while attenuating or inactivating the virus itself is generally known to be excellent in terms of effectiveness, firstly, the virus culture itself according to the type is not easy, and it may be difficult to purify the virus from the culture medium, and the virus is destroyed during purification. In many cases, intact viruses cannot be obtained. Second, in order to use the purified virus as a vaccine, attenuated or inactivated through formalin or heat treatment, the vaccine material may be denatured in the process. The most important issue is the lack of safety.

즉, 예를 들어 인슐린 또는 성장호르몬 등과 같이 대장균을 이용해 생산된 기존의 유전자 재조합 단백질들은 큰 부작용없이 의약품으로 널리 이용되고 있으나, 1세대 한탄바이러스 백신의 경우 살아있는 쥐의 뇌에 바이러스를 접종 배양한 후 쥐의 뇌유액으로부터 바이러스를 정제하기 때문에 아무리 정제를 잘한다 하더라도 이미 부작용의 소지가 있는 것으로 알려진 쥐 뇌의 베이직 미엘린 단백질(basic myelin protein)을 완전히 제거할 수 없으며 기타 분석되지 않은 쥐 뇌유래의 단백질들이 미량 포함되어 있을 수 있으므로 이들 동물유래 외부 단백질들에 의해 백신의 안전성에 관한 문제가 발생할 가능성이 있다.In other words, existing recombinant proteins produced using Escherichia coli, such as insulin or growth hormone, are widely used as pharmaceuticals without significant side effects. However, in the case of the first-generation Hantan virus vaccine, after inoculating and incubating the virus in the brain of living mice Because the virus is purified from rat brain fluid, no matter how well purified, it can not completely eliminate the basic myelin protein of the rat brain, which is known to have side effects. Since trace amounts may be present, these animal-derived foreign proteins are likely to cause problems with the safety of the vaccine.

따라서, 세포없는 생산체제(Cell free production system)나 유전자조작에 의해 발열반응 등을 일으킬 가능성이 있는 해로운 물질 및 단백질을 포함하지 않도록 면역 단백질의 유전자만을 생체외에서 발현시키려는 노력들이 많이 진행되어 왔다.Therefore, many efforts have been made to express only the genes of immune proteins in vitro so as not to contain harmful substances and proteins that may cause exothermic reactions by cell-free production system or gene manipulation.

이러한 노력의 일환으로, Schmaljohn 등은 원형 한탄바이러스 76-118 주의 각 세그먼트에 대한 염기서열 및 유전자 배열을 밝히고, 한탄바이러스의 외피 단백질 G1 및 G2를 암호화하고 있는 M 세그먼트를 백시니아 유전자와 결합시켜 동물(Hamster)에 주입시킨 후 한탄바이러스에 대한 방어효과를 관찰하였으며, 뉴클레오캡시드 단백질을 암호화하는 S 세그먼트는 외피단백질의 방어능을 증가시키는 것으로 보고한 바 있다. 또한, 이들은 바큘로바이러스(Baculovirus)를 이용하여 한탄바이러스의 G1, G2 및 뉴클레오캡시드 단백질을 곤충세포에서 발현시키고 이 발현세포를 파쇄하여 얻어진 세포 용해물로 동물에 접종하는 시도를 하였으나 한탄바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질에 의한 직접적인 중화항체 형성은 관찰하지 못하였다.As part of this effort, Schmaljohn et al. Revealed the sequencing and gene sequence for each segment of the prototype Hantan virus 76-118 strain, and combined the M-segments encoding the envelope proteins G1 and G2 of the Hantan virus with vaccinia genes to After the injection into Hamster, the protective effect against Hantan virus was observed, and the S segment encoding the nucleocapsid protein has been reported to increase the protective ability of the envelope protein. In addition, they attempted to inoculate animals with cell lysates obtained by expressing G1, G2 and nucleocapsid proteins of Hantan virus in insect cells using baculovirus and disrupting these cells. Direct neutralizing antibody formation by nucleocapsid protein was not observed.

이와 같이 신증후 출혈열 예방 백신의 제조에 있어 점점 관심이 집중되고 있는 뉴클레오캡시드 단백질은 바이러스의 리보헥산중 S 세그먼트에서 발현되어 각각의 리보헥산과 결합하여 존재하는 바이러스 구조단백질로서 바이러스 단백질 전체의 대부분을 차지하므로 바이러스 배양 후 대량으로 정제하기가 용이하다는 특성을 지니고 있다. 그러나, 이미 언급한 바와 같이 뉴클레오캡시드 단백질의 중화능에 관한 연구로는 유전자를 벡시니아 바이러스라는 매개체를 이용하여 부여하거나, 발현된 뉴클레오캡시드 단백질을 포함하고 있는 전체 세포 용해물을 동물에 투여하는 것이 전부일 뿐, 순수분리된 뉴클레오캡시드 단백질을 중화 항체형성 연구에 사용한 적이 없었으므로 뉴클레오캡시드 단백질에 의한 중화능, 특히 중화항체를 형성하여 신증후출혈열을 예방할 수 있는 백신물질로서의 가치를 판별할 수 없었다. 또한, 한탄바이러스 또는 한탄바이러스속에 속하는 다른 바이러스의 외피 단백질들(G1 및 G2)의 경우에는 이들 단백질이 정제하기 어려울뿐 아니라 대장균, 효모 또는 동물세포에서 유전공학적 방법으로 대량생산이 가능하지 않았으므로, 바이러스 자체를 백신물질로 사용하는 경우의 많은 문제점에도 불구하고 현재 신증후 출혈열에 대한 예방 백신으로는 포유마우스의 뇌 또는 동물세포에 바이러스를 직접 배양한 후 이를 포르말린으로 불활화시켜 제조된 백신만이 공급되고 있는 실정이다.The nucleocapsid protein, which is of increasing interest in the preparation of anti-bleeding hemorrhagic fever vaccines, is a viral structural protein that is expressed in the S segment of the ribohexane of a virus and binds to each ribohexane. It is characterized by the fact that it is easy to purify in large quantities after virus culture. However, as mentioned previously, studies on the neutralization ability of nucleocapsid proteins include the use of a vector called a vector of Vexonia virus or the administration of whole cell lysates containing expressed nucleocapsid proteins to animals. All of these are purely isolated nucleocapsid proteins, which have never been used for neutralizing antibody formation studies. Therefore, the neutralizing ability of nucleocapsid proteins, particularly neutralizing antibodies, can be used to determine the value of vaccines that can prevent hemorrhagic fever. Could not. In addition, in the case of coat proteins (G1 and G2) of the Hantan virus or other viruses belonging to the Hantan virus genus, not only are these proteins difficult to purify, but also they were not mass produced by E. coli, yeast or animal cells by genetic engineering methods. Despite many problems with the use of the virus itself as a vaccine, the current vaccine for preventing hemorrhagic fever with nephrotic syndrome is a vaccine prepared by directly incubating the virus in mammalian brain or animal cells and then inactivating it with formalin. It is being supplied.

이에 본 발명자들은 현재의 불활화바이러스 백신에 의한 안전성의 문제를 해결하기 위하여 집중적인 연구를 수행한 결과, 지금까지 순수분리되어 사용된 적이 없는 뉴클레오캡시드 단백질을 유전공학적 방법에 따라 대장균으로부터 대량 생산해내고 이를 한탄바이러스 예방 백신의 성분으로 사용하면 신증후출혈열에 대해 보다 안전하고 예방효과가 우수한 백신을 개발할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.Therefore, the present inventors conducted intensive studies to solve the safety problem caused by the current inactivated virus vaccine. As a result, the present inventors have produced a large amount of nucleocapsid protein that has never been purely isolated from E. coli by genetic engineering methods. The present invention was found to be able to develop a safer and more effective vaccine against hemorrhagic fever with nephrotic syndrome.

더구나, 한탄바이러스 감염에 대한 예방 백신 기술분야에 있어서, 지금까지는 주로 들쥐를 숙주로 한 공지의 한탄바이러스가 그 연구대상으로 이용되었으나, 본 발명에서는 인간에 대한 면역성의 증가로 인해 백신으로서의 효율성을 높일 수 있다는 가능성에 기초하여, 감염된 환자의 혈액으로부터 분리된 인간유래의 한탄바이러스(clinical isolate)를 출발물질로 사용함으로써 우수한 결과를 얻을 수 있었다.Moreover, in the field of preventive vaccine against hantan virus infection, until now, a known hantan virus mainly used as a mouse host has been used as the subject of the study, but in the present invention, the efficiency as a vaccine is improved due to the increased immunity to humans. On the basis of the possibility, excellent results were obtained by using human-derived clinical isolates isolated from the blood of infected patients as starting materials.

즉, 본 발명자들은 본 발명의 목적에 따라서 인간유래의 한탄바이러스를 구성하고 있는 다양한 단백질의 항원성을 연구해 왔으며, 그 결과 인간유래 한탄바이러스 균주로부터 내피단백질, 즉 뉴클레오캡시드 단백질의 유전자를 선별하여 그 염기서열을 분석하고, 대장균내에서 발현시킨 후 발현된 단백질을 분리, 정제하였으며 순수정제된 단백질의 중화항체 형성능을 연구하으로써 백신물질로서의 가치를 확인하였다.That is, the present inventors have studied the antigenicity of various proteins constituting the human-derived hantan virus according to the object of the present invention, as a result of selecting the gene of endothelial protein, that is, nucleocapsid protein from human-derived hantan virus strain The nucleotide sequence was analyzed, expressed in E. coli, and the expressed protein was isolated and purified, and the value of the vaccine was confirmed by studying the neutralizing antibody-forming ability of the purified protein.

따라서, 본 발명의 목적은 본 발명자들에 의해 그 염기서열이 밝혀진 인간유래 한탄바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a nucleocapsid protein gene of human-derived hantan virus whose base sequence is identified by the present inventors.

본 발명은 또한, 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 외래유전자로서 함유하는 재조합 발현 플라스미드, 상기 발현 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균 형질전환체 및 이 형질전환체를 적당한 배지에서 배양하고, 분리 및 정제과정을 거쳐 수득된 인간유래 한탄바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질에 관한 것이다.The present invention also provides a recombinant expression plasmid containing a nucleocapsid protein gene as an exogenous gene, an E. coli transformant transformed by the expression plasmid, and culturing the transformant in a suitable medium, followed by isolation and purification. It relates to the nucleocapsid protein of the human-derived hantan virus obtained.

궁극적으로, 본 발명은 상기와 같은 유전공학적 방법에 의해 순수하게 수득된 인간유래 한탄바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 유효성분으로 함유하는 신증후출혈열 예방 백신을 제공함을 목적으로 한다.Ultimately, an object of the present invention is to provide a renal hemorrhagic fever prevention vaccine containing a nucleocapsid protein of human-derived hantan virus obtained purely by the genetic engineering method as an active ingredient.

이하, 본 발명의 구성을 좀더 상세히 설명한다.Hereinafter, the configuration of the present invention in more detail.

본 발명에서는 우선 인간유래 한탄바이러스(clinical isolate)의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자 서열을 밝히기 위하여 한탄바이러스에 감염된 환자의 혈액으로부터 감염원인 한탄바이러스를 분리하였고 이 바이러스로부터 RNA 게놈을 분리하였다.In the present invention, in order to elucidate the gene sequence encoding the nucleocapsid protein of human-derived hantan virus (clinical isolate), Hantan virus as an infectious agent was isolated from blood of a patient infected with hantan virus, and RNA genome was separated from the virus.

역전사 효소에 의한 상보 DNA 합성과 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)에 의한 유전자 증폭을 위해서는 먼저 Schimaljohn과 Dalrymple(1983)에 의하여 이미 밝혀진 유전자 양말단의 염기서열을 기초로 하여 17개, 22개 그리고 23개로 구성된 프라이머(제1도, NP1, NP2 및 NP3 참조)를 DNA 합성기(Applied Biosys tems, Inc., Model 381A)를 이용하여 합성하였다. 합성한 5' 말단 프라이머에는 제한효소 BglII, 3' 말단에는 제한효소 EcoRI 인식부위를 갖도록 하여 박테리아와 파아지의 복제 오리진을 모두 가진 파지미드 벡터의 BglII, EcoRI 자리에 결합시켰다. 이를 대장균 NM522로 형질전환시킨 후 뉴클레오캡시드 단백질의 유전자를 가진 재조합벡터를 단리하여 확인하고 도움파아지(helper phage) M13K07을 이용하여 일본쇄 DNA를 분리함으로써 유전자 염기서열 결정의 실험재료로 사용하였다.Complementary DNA synthesis by reverse transcriptase and gene amplification by polymerase chain reaction are first performed based on the nucleotide sequence of the gene sock end identified by Schimaljohn and Dalrymple (1983). 23 primers (see FIG. 1, NP1, NP2, and NP3) were synthesized using a DNA synthesizer (Applied Biosystems, Inc., Model 381A). The synthesized 5 'terminal primer had a restriction enzyme BglII, and the 3' terminal had a restriction enzyme EcoRI recognition site, thereby binding to the BglII, EcoRI site of the phagemid vector having both the bacterial and phage replication origin. This was transformed into Escherichia coli NM522 and isolated and confirmed by recombination vector carrying the gene of nucleocapsid protein, and used as an experimental material for gene sequencing by separating single-stranded DNA using helper phage M13K07.

뉴클레오캡시드 단백질 전체에 대하여 분석된 염기서열 및 유추된 아미노산 서열은 제3도의 (a) 및 (b)에 나타낸 바와 같으며, 이로부터 본 발명에 따라 인간유래의 한탄바이러스로부터 분리된 뉴클레오캡시드 유전자의 염기서열은 공지의 76-118 바이러스의 해당 유전자 염기서열과 비교할 때 95%의 유사성을 나타내며, 아미노산 서열은 98.1%의 유사성을 나타냄을 알 수 있다.The nucleotide sequence and the inferred amino acid sequence analyzed for the whole nucleocapsid protein are as shown in (a) and (b) of FIG. 3, from which the nucleocapsid isolated from the human-derived hantan virus according to the present invention. It can be seen that the nucleotide sequence of the gene shows 95% similarity compared to the corresponding nucleotide sequence of the known 76-118 virus, and the amino acid sequence shows 98.1% similarity.

이와 같이 변화된 염기서열을 갖는 뉴클레오캡시드 단백질 유전자로부터 본 발명이 궁극적으로 목적하는 효과적이면서도 안전한 한탄바이러스 예방 백신을 제조하기 위해서는 먼저 외래 유전자의 증폭, 발현 플라스미드 및 형질전환체의 제조, 형질전환체의 배양 및 뉴클레오캡시드 단백질의 분리 및 정제과정을 거쳐야 하며 최종적으로 제조된 백신의 효능성을 조사함으로써 발명이 완성될 수 있다.From the nucleocapsid protein gene having such a nucleotide sequence, the amplification of foreign genes, preparation of expression plasmids and transformants, and transformation of The invention must be completed by culturing and isolating and purifying the nucleocapsid protein and investigating the efficacy of the finally prepared vaccine.

즉, 본 발명에서는 제1도에 나타낸 5가지의 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써 플라스미드에 클로닝하기에 충분한 양의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 확보하였고, 이들 유전자에 각각 플라스미드 pET-3a 및 pKK223-3에 클로닝될 수 있도록 적절한 제한효소 인식부위를 첨가하였다. 여기서 플라스미드 pET-3a는 s10 유도아미노산 서열의 일부를 포함하므로 이 플라스미드에 클로닝되어 발현된 뉴클레오캡시드 단백질은 N 말단에 12개의 아미노산을 더 함유한 융합단백질로 발현되는 반면, 플라스미드 pKK223-3에는 이러한 서열이 없으므로 융합단백질이 아닌 원래의 단백질 형태로 발현되게 된다.That is, in the present invention, by carrying out the polymerase chain reaction using the five primers shown in FIG. 1, a sufficient amount of nucleocapsid protein genes to be cloned into the plasmid was obtained, and these genes were respectively identified by plasmid pET-3a and Appropriate restriction enzyme recognition sites were added so that they could be cloned into pKK223-3. Wherein plasmid pET-3a contains a portion of the s10 derived amino acid sequence, the nucleocapsid protein cloned and expressed in this plasmid is expressed as a fusion protein containing 12 more amino acids at the N-terminal, whereas in plasmid pKK223-3 Since there is no sequence, it is expressed in the form of the original protein rather than the fusion protein.

플라스미드 pET-3a 및 pKK223-3 각각에 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 클로닝하여 본 발명에서 목적하는 발현 플라스미드 pEThNP 및 pKKhNP를 제조하기 위한 과정은 제4도 및 제5도에 도식화하여 나타낸 바와 같다. 또한, 제조된 각각의 발현 플라스미드를 전기장 충격법을 사용하여 숙주세포인 대장균 BL21(DE3) 및 HB101내로 삽입함으로써 원하는 뉴클레오캡시드 단백질을 대량으로 생산해낼 수 있는 대장균 형질전환체 E.coli BL(pEThNP) 및 E.coli BL(pKKhNP)를 수득하였으며, 이들을 1995년 8월 18일자로 사단법인 한국종균협회에 기탁하고 기탁번호를 부여받았다(KFCC-10865 및 KFCC-10868).Cloning the nucleocapsid protein genes into plasmids pET-3a and pKK223-3, respectively, to produce the desired expression plasmids pEThNP and pKKhNP in the present invention are illustrated in FIGS. 4 and 5. In addition, each of the prepared expression plasmids was inserted into host cells of Escherichia coli BL21 (DE3) and HB101 using an electric field bombardment, and E. coli BL (pEThNP) capable of producing a large amount of the desired nucleocapsid protein. ) And E. coli BL (pKKhNP) were obtained and deposited on August 18, 1995 by the Korean spawn association of corporations (KFCC-10865 and KFCC-10868).

다음 단계로, 본 발명에서는 유전공학분야에서 사용되는 통상의 방법에 따라, 수득된 대장균 형질전환체를 적당한 배지에서 배양하여 단백질을 대량으로 발현시키고, 제6도에 구체적으로 도시한 절차를 수행함으로써 발현된 단백질을 정제하였다. 정제된 단백질에 대한 폴리아크릴아미드겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅을 수행한 결과는 제7도 및 제8도에 나타낸 바와 같은데, 이로부터 정제된 단백질이 목적하는 한탄바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질임을 확인할 수 있었으며, 특히 전기영동결과로부터 판단된 정제된 단백질의 순도는 95% 이상이었다.In the next step, in the present invention, according to a conventional method used in the field of genetic engineering, the obtained E. coli transformant is cultured in a suitable medium to express a large amount of protein, and by performing the procedure specifically shown in FIG. The expressed protein was purified. The results of polyacrylamide gel electrophoresis and western blotting on the purified protein are shown in FIGS. 7 and 8, from which the purified protein is a nucleocapsid protein of the desired Hantan virus. In particular, the purity of the purified protein determined from the electrophoresis result was more than 95%.

한편, 발현 플라스미드 pEThNP로부터 얻어진 뉴클레오캡시드 단백질의 분자량은 약 49.5kDa으로 측정된 반면, pKKhNP로부터 얻어진 단백질의 분자량은 약 48kDa으로 측정되었는데, 이는 앞에서 이미 언급한 바와 같이 pEThNP의 제작에 사용된 pET-3a의 플라스미드 클로닝 부위인 BamHI 부위 앞쪽에 존재하는 s10 리더(leader) 서열에 기인하는 것이다. 즉, pEThNP로부터 생산된 뉴클레오캡시드 단백질은 천연상태의 단백질에 비해 12개의 아미노산을 더 함유하고 있으며, 이러한 구조상의 차이는 형질전환체에서의 단백질 생산량도 월등히 증대시키는 역할을 하는 것으로 생각된다. 이는 pEThNP 및 pKKhNP에 의해 각각 형질전환된 대장균에서 생산된 뉴클레오캡시드 단백질을 웨스턴블롯팅으로 분석해본 결과 pEThNP 유래의 뉴클레오캡시드 단백질 양이 pKKhNP 유래의 단백질 양보다 5배 가량 더 많은 사실로부터 뒷받침된다.On the other hand, the molecular weight of the nucleocapsid protein obtained from the expression plasmid pEThNP was measured to be about 49.5 kDa, whereas the molecular weight of the protein obtained from pKKhNP was measured to be about 48 kDa, which was previously mentioned as pET-NP used in the preparation of pEThNP. This is due to the s10 leader sequence present in front of the BamHI site, the plasmid cloning site of 3a. That is, the nucleocapsid protein produced from pEThNP contains 12 more amino acids than the protein in its natural state, and this structural difference is thought to play a role of significantly increasing the protein production in the transformant. This is supported by Western blotting of nucleocapsid proteins produced in Escherichia coli transformed with pEThNP and pKKhNP, respectively, as the amount of nucleocapsid proteins derived from pEThNP is about five times more than the amount of proteins derived from pKKhNP. .

정제된 뉴클레오캡시드 단백질을 백신의 정제원액으로 하고 이 정제원액으로부터 최종 백신제품을 제조하기 위한 과정에서 보조제로 알루미늄하이드록사이드 겔을 첨가할 수 있으며, 그 이외에도 치메로살 및 정제젤라틴을 첨가할 수 있다. 알루미늄하이드록사이드 겔은 면역보조제용으로 사용하는데 바람직한 첨가량은 백신제조용 정제원액 0.5㎖당 최대 0.625mg이고, 치메로살은 보존제로서 0.01%(w/v)양으로 사용함이 바람직하며, 정제젤라틴은 안정화제로서 0.02%(w/v)의 양으로 사용함이 바람직하다. 이들 이외에도 Tween 80을 0.01%(w/v)의 양으로 첨가할 수 있다.The purified nucleocapsid protein may be added to the purified stock of the vaccine, and aluminum hydroxide gel may be added as an aid in the preparation of the final vaccine product from the purified stock, and chimerosal and purified gelatin may be added. . Aluminum hydroxide gel is preferably used as an adjuvant, and the preferred amount is 0.625 mg per 0.5 ml of vaccine stock solution for vaccine preparation, and chimerosal is preferably used in an amount of 0.01% (w / v) as a preservative. It is preferable to use in an amount of 0.02% (w / v). In addition to these, Tween 80 may be added in an amount of 0.01% (w / v).

이상 설명한 방법에 의해 인간유래 한탄바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질로부터 제조된 본 발명의 백신제품 효능성을 조사하기 위해 현재 시판중인 주식회사 녹십자의 한타박스를 비교백신으로 하여 플라크감소 중화시험법으로 실험한 결과, 본 발명의 백신이 비교백신에 비해 탁월한 중화능력을 나타냄을 확인하였으며, 백신효능 테스트를 위해 기니픽에 40㎍씩 10일간격으로 3회 접종한 경우에도 별다른 이상 증상은 발견되지 않았다. 더구나, 본 발명에 따른 백신은 불활화시키거나 약독화바이러스 자체를 백신물질로 사용함에 따른 안전사고 발생의 소지를 완전히 배제하기 위하여 그로부터 항원성을 나타내는 것으로 규명된 특정의 단백질 성분, 즉 뉴클레오캡시드 단백질을 유전공학적 방법으로 대량생산 및 정제하여 백신물질로 사용하였으므로 신증후 출혈열 예방 백신에 있어서 지금까지 끊임없이 제기되어온 안전성 문제를 완전히 해결한 획기적인 발명으로 생각된다.In order to investigate the efficacy of the vaccine product of the present invention prepared from the nucleocapsid protein of human-derived hantan virus by the above-described method, the present invention was tested by plaque reduction neutralization test using Hantabox of Green Cross Co., Ltd. as a comparative vaccine. , It was confirmed that the vaccine of the present invention showed an excellent neutralization capacity compared to the comparative vaccine, even when inoculated three times at 10 days intervals of 40 ㎍ in guinea pigs for vaccine efficacy test was not found. Moreover, the vaccine according to the present invention is a specific protein component, i.e., nucleocapsid, which has been shown to be antigenic therefrom in order to completely eliminate the possibility of safety accidents caused by inactivation or use of the attenuated virus itself as a vaccine material. Since the protein was mass-produced and purified by genetic engineering method and used as a vaccine material, it is considered to be a revolutionary invention that completely solves the safety problem that has been raised continuously until now for the prevention of bleeding fever.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위해 추가된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, this is only added to aid the understanding of the present invention, the scope of the present invention is not limited by these examples.

[실시예 1]Example 1

감염환자로부터의 한탄바이러스 분리Isolation of Hantan Virus from Infected Patients

신증후군 출혈열 증세를 보이는 환자(남성, 32세)로부터 채취한 혈액 100㎕를 T-25 배양플라스크에서 꽉차게 자란 베로E6(Vero E6) 세포에 접종하였다. T-25 배양플라스크 내에서 숙주세포에 바이러스가 잘 흡착하도록 2시간동안 배양한 다음 5㎖의 DMEM 배지를 첨가하고 10 내지 12일동안 37℃에서 배양하였다. 첫 번째 계대배양은 베로E6 세포가 꽉찬 새로운 T-25 배양플라스크에 이미 배양한 플라스크로부터 150㎕의 배양액을 취하여 접종한 다음 상기의 과정을 반복 수행함으로써 이루어졌다. 이렇게 세 번의 계대배양을 거친 세포들을 트립신처리하고 항원존재 여부시험을 위한 IFA(Indirect Fluorescent Assay)를 수행하여 바이러스 존재를 확인한 후 배양액을 수집하여 RNA 게놈분리의 재료로 사용하였다.100 μl of blood collected from a patient (male, 32 years old) showing renal syndrome hemorrhagic fever was inoculated into Vero E6 cells grown in a T-25 culture flask. The cells were incubated for 2 hours to adsorb the virus to the host cells in a T-25 culture flask, and then 5 ml of DMEM medium was added thereto, and then cultured at 37 ° C. for 10 to 12 days. The first subculture was performed by taking 150 μl of the culture solution from the flask already incubated in a new T-25 culture flask filled with Vero E6 cells and repeating the above procedure. The cells passaged three times were trypsinized and subjected to indirect fluorescence assay (IFA) for antigen presence test to confirm the presence of the virus, and the culture medium was collected and used as a material for RNA genome separation.

[실시예 2]Example 2

한탄바이러스 RNA 게놈의 정제 및 cDNA의 합성Purification of the Hantan Virus RNA Genome and Synthesis of cDNA

환자로부터 분리하여 Vero E6 세포에서 증식된 한탄바이러스 배양액 100㎕를 취하여 용액 A(4.2M Guanidine isothiocyanate, 25mM Tris-HCl(pH8.0), 0.5% Sarkosyl, 0.7% β-mercaptoethanol) 400㎕와 잘 혼합하였다. 여기에 용액 B(1M Tris-HCl(pH8.0), 0.1M EDTA, 10% SDS) 50㎕를 가하고 잘 혼합한 후 65℃에서 5분간 용해시켰다. 혼합용액에 동일부피의 페놀/클로로포름(1:1) 혼합액을 가하고 65℃에서 30분동안 방치한 다음 원심분리하여 상등액만을 취하고, 남은 용액에 다시 용액 A를 300㎕ 더 가하여 65℃에서 5분간 방치한 후 원심분리하였다. 여기서 취한 상등액을 먼저 취한 상등액과 합한 다음, 이를 페놀/클로로포름(1:1) 혼합액으로 1회, 클로로포름으로 1회 추출하였다. 추출된 용액에 1/10 부피의 3M 아세트산나트륨 및 2배 부피의 이소프로필알콜을 가하고 잘 혼합한 후 -20℃에서 16시간 보관하였다. 이것을 마이크로 원심분리기에서 12,000rpm으로 15분간 원심분리하여 침전시키고 침전을 70% 에틸알콜로 2회 세척한 후 건조시켰다. 건조된 침전을 리보헥산 분해효소(RNase)가 없는 멸균수 10㎕에 용해시킨 다음 4℃에 보관하였다. 리보헥산 5㎕를 취해 전체 20㎕ 부피에서 cDNA를 합성하였는데, 이때의 반응조건은 하기 표 1에 나타낸 바와 같으며 37℃에서 1시간동안 반응시켰다.Take 100 μl of Hantan virus culture grown from Vero E6 cells from patient and mix well with 400 μl of Solution A (4.2M Guanidine isothiocyanate, 25mM Tris-HCl (pH8.0), 0.5% Sarkosyl, 0.7% β-mercaptoethanol) It was. 50 µl of solution B (1M Tris-HCl (pH8.0), 0.1M EDTA, 10% SDS) was added thereto, mixed well, and dissolved at 65 ° C for 5 minutes. The same volume of phenol / chloroform (1: 1) mixture was added to the mixed solution, and the mixture was left at 65 ° C. for 30 minutes, followed by centrifugation to take only the supernatant, and 300 µl of solution A was added to the remaining solution, and the mixture was left at 65 ° C. for 5 minutes. Then centrifuged. The supernatant taken here was combined with the supernatant taken first, and then extracted once with phenol / chloroform (1: 1) mixture and once with chloroform. 1/10 volume of 3M sodium acetate and 2 volumes of isopropyl alcohol were added to the extracted solution, mixed well, and then stored at −20 ° C. for 16 hours. This was precipitated by centrifugation at 12,000 rpm for 15 minutes in a micro centrifuge and the precipitate was washed twice with 70% ethyl alcohol and dried. The dried precipitate was dissolved in 10 µl of sterile water without ribohexane degrading enzyme (RNase) and then stored at 4 ° C. 5 μl of ribohexane was taken to synthesize cDNA at a total volume of 20 μl. The reaction conditions are as shown in Table 1 below and reacted at 37 ° C. for 1 hour.

[실시예 3]Example 3

염기서열 결정용 유전자 증폭Gene Amplification for Sequence Determination

DNA 중합효소에 의한 염기서열 결정용 유전자 증폭을 위해서는 제1도에서 나타낸 5가지 종류의 프라이머중 각각 17, 23 및 22mer 길이의 NP1, NP2 및 NP3을 사용하였다. 즉, 실시예 2에서 합성한 뉴클레오캡시드의 cDNA가 포함된 용액 5㎕를 취해 프라이머 NP1 및 NP3을 사용하여 뉴클레오캡시드 유전자를 1차 증폭시켰다. 1차 반응한 용액중에는 원하는 뉴클레오캡시드 유전자가 충분하지 않으므로 1차 반응용액 5㎕를 취하여 프라이머 NP2 및 NP3을 사용하여 2차 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 이때 사용한 프라이머 NP2 및 NP3의 5' 말단쪽에는 각각 BglII(AGATCT) 및 Eco RI(GAATTC)의 제한효소 인식부위가 포함되어 있다.For amplification of the gene for nucleotide sequence determination by DNA polymerase, NP1, NP2 and NP3 of lengths 17, 23 and 22mer were used among the five types of primers shown in FIG. That is, 5 µl of the solution containing the cDNA of the nucleocapsid synthesized in Example 2 was taken, and the nucleocapsid gene was first amplified using primers NP1 and NP3. Since the desired nucleocapsid gene was not sufficient in the first reaction solution, 5 µl of the first reaction solution was taken and a second polymerase chain reaction was performed using primers NP2 and NP3. At this time, the 5 'end of the primers NP2 and NP3 used contain restriction enzyme recognition sites of BglII (AGATCT) and Eco RI (GAATTC), respectively.

중합효소 연쇄반응에 사용된 기기는 퍼킨엘머사(PERKIN ELMER)의 데옥시리보헥산 온도 사이클러(DNA thermal cycler 480)를 사용하였으며, 중합효소 연쇄반응의 조건은 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.The instrument used for the polymerase chain reaction was a deoxyribohexane temperature cycler (DNA thermal cycler 480) of Perkin Elmer (PERKIN ELMER), the conditions of the polymerase chain reaction is shown in Table 2 below.

[실시예 4]Example 4

증폭된 유전자의 클로닝Cloning of Amplified Genes

실시예 3의 방법에 따라 증폭된 이본쇄 DNA의 크기를 아가로오스겔 전기영동상에서 확인한 후 전기추출방법에 의해 겔로부터 추출하였다. 추출된 DNA에 단백질분해효소(ProteinaseK)를 100㎍/㎖ 되도록 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시킨 다음, 70℃에서 15분동안 반응시켜 효소를 불활성화하였다. 증폭된 DNA의 양쪽 말단의 제한효소 인식부위를 각각 BglII 및 EcoRI로 절단한 다음 페놀/클로로포름 추출에 의해 절단된 증폭 DNA를 순수하게 분리하였다. 한편, 벡터 pT7T3 18U 및 pT7T3 19U DNA를 제2도에 나탄낸 바와 같이 제한효소 BglII 및 EcoRI로 절단한 후 전기추출법에 의해 순수분리하였다. 이들 두 종류의 DNA(벡터 및 증폭된 외래 유전자)를 T4 DNA 리가아제 존재하에 15℃에서 밤새 반응시켜 재조합 플라스미드 DNA(pThNP8 및 pThNP9)를 제조한 다음, CaCl형질전환법(참조 : Molecular Cloning; Laboratory Manual, Cold Spring Harbor)에 따라 대장균 NM522에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균을 항생제(암피실린 50㎍/㎖)를 포함하는 선택배지에서 배양하여 선별하고 DNA를 소량분리한 후, 제한효소(BglII, EcoRI)를 반응시켜서 정확한 증폭 DNA 절편이 포함된 재조합 플라스미드 DNA가 들어있는 균주만을 선별하였다.The size of the double-stranded DNA amplified according to the method of Example 3 was confirmed on agarose gel electrophoresis, and then extracted from the gel by the electroextraction method. Proteasease (ProteinaseK) was added to the extracted DNA so that the reaction was carried out at 37 ° C. for 30 minutes and then at 70 ° C. for 15 minutes to inactivate the enzyme. Restriction enzyme recognition sites at both ends of the amplified DNA were digested with BglII and EcoRI, respectively, followed by pure separation of the amplified DNA by phenol / chloroform extraction. Meanwhile, vector pT7T3 18U and pT7T3 19U DNA were cleaved with restriction enzymes BglII and EcoRI as shown in FIG. 2 and purified by electroextraction. These two kinds of DNA (vector and amplified foreign genes) were reacted overnight at 15 ° C. in the presence of T4 DNA ligase to prepare recombinant plasmid DNA (pThNP8 and pThNP9), followed by CaCl transfection (Molecular Cloning; Laboratory). E. coli NM522 was transformed according to Manual, Cold Spring Harbor). The transformed Escherichia coli were cultured in a selective medium containing antibiotics (Ampicillin 50µg / ml), selected for small amounts of DNA, and then reacted with restriction enzymes (BglII, EcoRI) to react with amplified DNA fragments containing the correct amplified DNA fragments. Only strains containing these were selected.

[실시예 5]Example 5

유전자 염기서열의 결정Determination of Gene Sequence

실시예 4에서 수득한 pThNP8 및 pThNP9가 각각 삽입되어 있는 대장균을 배양한지 30분후에 M13KO7 도움파아지를 10/㎖ 이상 되도록 첨가하고 그로부터 1시간 후에 가나마이신을 50㎍/㎖ 되도록 첨가하여 밤새도록 진탕배양하였다. PEG/NaCl (20% PEG6000/2M NaCl)을 이용한 일본쇄 DNA 분리방법(참조 : Molecular Clon ing; Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982)에 따라 분리된 일본쇄 DNA를 재료로 하여 Dideoxy Sequencing Kit(USB사)에서 제공하는 방법에 따라 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열로부터 유추된 아미노산 서열을 밝힌 다음, 이를 기존의 한탄바이러스 76-118 균주의 뉴클레오캡시드 단백질을 암호화하는 유전자 염기서열 및 아미노산 서열과 비교하였고 그 결과를 제3도의 (a) 및 (b)에 나타내었다.30 minutes after incubation of E. coli with pThNP8 and pThNP9 obtained in Example 4, the M13KO7 helper phage was 10It was added to more than / ml and after 1 hour, kanamycin was added to 50 ㎍ / ㎖ shaking culture overnight. Single chain DNA separation method using PEG / NaCl (20% PEG6000 / 2M NaCl) (Japanese Standard), followed by Molecular Cloning; Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982. The base sequence was determined according to the method provided in 4). The amino acid sequences inferred from the determined nucleotide sequences were identified and compared with the gene sequences and amino acid sequences encoding the nucleocapsid proteins of the existing Hantan virus 76-118 strains. ).

[실시예 6]Example 6

중합효소 연쇄반응에 의한 뉴클레오캡시드 단백질 유전자의 증폭Amplification of Nucleocapsid Protein Gene by Polymerase Chain Reaction

본 발명에 따라 공지의 플라스미드 pET-3a 및 pKK223-3에 클로닝하기 위한 뉴클레오캡시드 단백질 유전자는 다음에 설명하는 대로 각각 중합효소 연쇄반응에 의하여 증폭시켰다.Nucleocapsid protein genes for cloning into known plasmids pET-3a and pKK223-3 according to the present invention were amplified by polymerase chain reaction, respectively, as described below.

플라스미드 pET-3a에 클로닝하기 위한 뉴클레오캡시드 단백질 유전자는 실시예 3에 자세히 기재한 바와 동일한 방법으로 NP1, BglII(AGATCT) 인식부위를 함유하는 NP2 및 EcoRI(GAATTC) 인식부위를 함유하는 NP3으로 구성된 3가지 프라이머로부터 두차례에 걸친 증폭과정을 통하여 제조하였다. 한편, 플라스미드 pKK223-3에 클로닝하기 위한 단백질 유전자는 2차 중합효소 연쇄반응시 프라이머 NP2 및 NP3을 사용하는 대신에 EcoRI(GAATTC) 인식부위를 함유하는 프라이머 NP4 및 SalI(GTCGAC) 인식부위를 함유하는 NP5를 사용하는 점을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 제조하였다.The nucleocapsid protein gene for cloning into plasmid pET-3a consists of NP1 containing NP1, BglII (AGATCT) recognition site and NP3 containing EcoRI (GAATTC) recognition site in the same manner as detailed in Example 3 It was prepared through two amplification processes from three primers. On the other hand, the protein gene for cloning to plasmid pKK223-3 contains primers NP4 and SalI (GTCGAC) recognition sites containing EcoRI (GAATTC) recognition sites instead of using primers NP2 and NP3 in the second polymerase chain reaction. It was prepared in the same manner as in Example 3 except that NP5 was used.

[실시예 7]Example 7

발현 플라스미드 pEThNP 및 pKKhNP의 작제Construction of Expression Plasmids pEThNP and pKKhNP

뉴클레오캡시드 단백질 유전자의 클로닝 과정은 제4도 및 제5도에 나타내었다. 실시예 6의 방법에 따라 증폭된 두종류의 이본쇄 DNA는 아가로오스겔 전기영동상에서 그 크기를 확인한 후, 1.3kb 크기의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 포함한 DNA 절편을 진크린 키트를 사용하여 회수하였다. 회수된 DNA 절편들은 각각 s10 유도아미노산 서열의 일부를 포함하는 플라스미드 pET-3a 및 유도아미노산 서열을 전혀 포함하지 않는 플라스미드 pKK233-2내로 클로닝하였다. 회수된 DNA 절편중 pET-3a에 클로닝하기 위한 유전자는 제한효소 BglII 및 EcoRI로 이중소화하였고, pKK233-3에 클로닝하기 위한 유전자는 클레노우 효소로 처리하여 양말단을 블런트 엔드(blunt end)로 만든 후 EcoRI만을 사용하여 절단하고 페놀/클로로포름 혼합액(1:1)으로 1회 추출한 뒤 최종 20㎕의 멸균 증류수에 용해시켰다. 한편, 유전자 운반체인 pET-3a 5㎍을 EcoRI과 BamHI으로 이중소화하고 동량의 pKK233-3을 EcoRI과 SmaI으로 이중소화한 후 최종농도 5mM의 EDTA 존재하에 70℃에서 10분간 열처리하고 페놀/클로로포름 혼합액(1:1)으로 1회 추출한 뒤 각각 20㎕의 멸균 증류수에 용해시켰다. 절단된 각 유전자 운반체 5㎕와 뉴클레오캡시드 DNA 10㎕를 혼합하고 T4 DNA 리가아제를 이용하여 25℃에서 3시간동안 반응시켜 접합시킴으로써 본 발명에서 목적하는 발현 플라스미드 pEThNP 및 pKKhNP의 작제를 완료하였다.The cloning process of the nucleocapsid protein gene is shown in FIGS. 4 and 5. After confirming the size of the two-stranded DNA amplified according to the method of Example 6 on agarose gel electrophoresis, the DNA fragment containing the 1.3kb nucleocapsid protein gene was recovered using the Ginclean kit. It was. The recovered DNA fragments were cloned into plasmid pKK233-2, each containing a portion of the s10 derived amino acid sequence and plasmid pKK233-2 containing no derived amino acid sequence. The gene for cloning to pET-3a of the recovered DNA fragment was double digested with restriction enzymes BglII and EcoRI, and the gene for cloning to pKK233-3 was treated with Klenow enzyme to make the blunt end blunt end. After cutting using only EcoRI and extracted once with a phenol / chloroform mixture (1: 1) and dissolved in the final 20μl of sterile distilled water. Meanwhile, 5 μg of the gene carrier, pET-3a, was double-digested with EcoRI and BamHI, and the same amount of pKK233-3 was double-digested with EcoRI and SmaI, and then heat-treated at 70 ° C. for 10 minutes in the presence of EDTA with a final concentration of 5 mM and a phenol / chloroform mixture. Extracted once (1: 1) and dissolved in 20 µl of sterile distilled water, respectively. 5 μl of each of the truncated gene carriers and 10 μl of nucleocapsid DNA were mixed and reacted for 3 hours at 25 ° C. using T4 DNA ligase to complete the construction of the expression plasmids pEThNP and pKKhNP desired in the present invention.

[실시예 8]Example 8

형질전환체의 제조Preparation of Transformant

대장균의 형질전환은 전기장 충격법을 사용하였으며 숙주세포로서는 pEThNP는 대장균 BL21(DE3), 그리고 pKKhNP는 대장균 HB101을 각각 사용하였다.E. coli transformation was performed using electric field bombardment, pEThNP as Escherichia coli BL21 (DE3), and pKKhNP as Escherichia coli HB101, respectively.

형질전환용 숙주세포를 다량으로 수득하기 위해서 20㎖의 LB 배지에 대장균 BL21(DE3) 또는 HB101을 한천 평판배지로부터 접종하여 37℃에서 18시간동안 진탕배양하였다. 이들 각각을 1리터의 새로운 LB 배지에 접종하여 600nm의 파장에서 흡광도가 0.5 내지 0.8에 도달할 때까지 37℃에서 진탕 배양하였다. 균체를 회수하기 위해 배양액을 0℃에서 20분간 방치한 후 원심분리로 균체를 회수하였다. 회수한 균체를 1리터의 냉 멸균 증류수로 1회 세척한 후 다시 0.5리터로 세척하고 최종적으로 20% 글리세롤로 세척하였다. 이를 3㎖의 10% 글리세롤 용액에 재현탁시킨 다음, 분주하여 -70℃에 보관하고 각 형질전환시 1개씩 꺼내어 사용하였다. 전기장 충격법에 사용한 기기는 Bio-Rad사에서 제작한 Gene-Pulser를 사용하였으며, 형질전환 방법은 다음과 같다. -70℃에 보관된 균체 40㎕와 데옥시리보헥산 2㎕를 혼합하여 전극 간격이 0.2cm인 큐벳에 넣고 Gene-Pulser를 정전용량 25㎌, 저항 200Ω, 전기장의 세기 12.5㎸/cm에 고정하여 1회 전기장 충격을 가하고 즉시 1㎖의 SOC 배지(2% 박토트립톤, 0.5% 효모엑기스, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl, 10mM MgSO, 20mM 글루코오스)를 첨가하였다. 37℃에서 1시간동안 진탕배양한 후 50㎍/㎖의 암피실린이 첨가된 2개의 LB 한천평판배지에 각각 0.1㎖, 0.9㎖씩 도말하여 37℃ 인큐베이터에서 12 내지 18시간 배양하였다. 재조합 플라스미드의 스크리닝은 단일콜로니의 크래킹(cracking) 방법을 사용하였다. 즉, 크래킹 버퍼(0.05M Tris(pH6.8), 1% SDS, 2mM EDTA, 0.4M 수크로오스, 0.01% 브로모페놀 블루) 80㎕에 한천평판배지로부터 1루프의 균체를 넣고 볼텍스믹서로 현탁하여 마이크로 원심분리기로 12,000 rpm에서 15분간 원심분리한 다음 상등액을 취해 아가로오스겔 전기영동으로 원하는 뉴클레오캡시드 유전자 운반체의 pEThNP와 pKKhNP 플라스미드를 확인하였다. 또한, 최종적으로는 분리한 재조합 플라스미드를 제한효소로 절단하여 확인함으로써 스크리닝을 수행하였다.In order to obtain a large amount of transformed host cells, 20 ml of LB medium was inoculated with E. coli BL21 (DE3) or HB101 from agar plate medium and shaken for 18 hours at 37 ℃. Each of them was inoculated in 1 liter of fresh LB medium and shaken at 37 ° C. until absorbance reached 0.5 to 0.8 at a wavelength of 600 nm. In order to recover the cells, the culture solution was left at 0 ° C. for 20 minutes and the cells were recovered by centrifugation. The recovered cells were washed once with 1 liter of cold sterile distilled water, and then again with 0.5 liter and finally with 20% glycerol. This was resuspended in 3 ml of 10% glycerol solution, aliquoted, stored at -70 ° C, and used one by one for each transformation. The equipment used for the electric field impact method was a Gene-Pulser manufactured by Bio-Rad, and the transformation method is as follows. 40μl of cells stored at -70 ℃ and 2μl of deoxyribohexane were mixed and placed in a cuvette with an electrode spacing of 0.2cm, and the Gene-Pulser was fixed at a capacitance of 25㎌, a resistance of 200Ω and an electric field of 12.5㎸ / cm. One electric field shock was applied and immediately 1 ml of SOC medium (2% bactotriptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl, 10 mM MgSO, 20 mM glucose) was added. After shaking for 1 hour at 37 ° C., 0.1 ml and 0.9 ml of each plate were added to two LB agar plates containing 50 μg / ml of ampicillin and incubated for 12 to 18 hours in a 37 ° C. incubator. Screening of the recombinant plasmids used a cracking method of single colonies. In other words, put one loop of cells from agar plate medium into 80 µl of cracking buffer (0.05M Tris (pH6.8), 1% SDS, 2mM EDTA, 0.4M sucrose, 0.01% bromophenol blue) and suspended with a vortex mixer. The microcentrifuge was centrifuged at 12,000 rpm for 15 minutes and then the supernatant was taken to identify pEThNP and pKKhNP plasmids of the desired nucleocapsid gene carrier by agarose gel electrophoresis. In addition, screening was performed by finally cleaving the isolated recombinant plasmid with restriction enzymes.

[실시예 9]Example 9

형질전환체의 배양Culture of transformants

대장균의 배양을 위해서는 LB 배지(효모엑기스 0.5%, 박토트립톤 1%, NaCl 1%, pH 7.0)에 포도당과 엠피실린을 각각 0.5%, 100㎍/㎖되게 첨가하여 사용하였으며 밤새 배양한 종균액을 새로운 배지 1리터에 5%되게 접종하여 37℃에서 200rpm으로 진탕배양하였다. 배양액의 흡광도(A)가 0.5 내지 0.8에 도달했을 때 IPTG를 0.1 내지 2mM되게 첨가하여 4 내지 8시간동안 더 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하고 0.8% NaCl 용액으로 1회 세척하였다.For the culture of Escherichia coli, glucose and empicillin were added to LB medium (0.5% yeast extract, 1% bactotriptone, 1% NaCl, pH 7.0) at 0.5% and 100µg / ml, respectively. Was inoculated at 5% in 1 liter of fresh medium and shaken at 37 ° C at 200 rpm. When the absorbance (A) of the culture reached 0.5 to 0.8, IPTG was added to 0.1 to 2 mM to further incubate for 4 to 8 hours. The culture solution was centrifuged to recover the cells and washed once with 0.8% NaCl solution.

[실시예 10]Example 10

뉴클레오캡시드 단백질의 분리 및 정제Isolation and Purification of Nucleocapsid Proteins

pEThNP 및 pKKhNP를 포함한 대장균들로부터 발현된 뉴클레오캡시드 단백질을 정제하는 방법은 제5도에 간단히 나타내었다. 회수된 균체는 50 내지 100㎖의 Te 완충용액(50mM Tris, 1mM EDTA, pH8.0)에 현탁시키고 초음파기(sonicator)를 사용하여 균체를 파쇄하였는데 파쇄의 정도는 브래드포드 정량(Bradford assay) 방법을 사용하여 파쇄액의 단백질 농도가 더 이상 증가하지 않을 때까지 수행하였다. 파쇄된 용액을 8,000×g에서 1시간동안 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상등액에 암모늄설페이트를 포화농도의 25 내지 50%되게 첨가하여 용해시킨 후 상온에서 1시간동안 방치한 다음 8,000×g에서 다시 30분간 원심분리하여 상등액을 버리고 침전물은 20㎖의 TE 완충용액에 재현탁시켰다. 재현탁시킨 용액중의 암모늄설페이트를 제거하기 위해 2 리터의 TE 완충용액에 2시간씩 2회 투석을 수행하였다. 투석한 용액은 1차로 파마시아사의 세파크릴 S 200을 사용하여 겔 필트레이션(filtration)을 수행하고 이것을 2차로 DEAE 세파덱스 A-50 음이온 교환 수지를 사용하여 2차 정제하였다. 음이온 교환수지에 사용한 용출액은 50mM Tris(pH8.0)에 NaCl을 1.0M 농도가 되도록 첨가한 것을 사용하였다. 여기서 받은 용출액은 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단일클론항체가 커플링된 면역친화(immunoaffinity) 컬럼에 적하하고 PBS 완충용액(8g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g NaHPO, 0.24g KHPO/리터, pH8.0)으로 세척한 후 100mM의 초산을 사용하여 용출하였다. 용출액의 pH를 조정하기 위해서 2M Tris 완충용액(pH8.0)을 용출액 부피의 0.3배 첨가하였다. 이것을 다시 PBS 완충용액으로 투석하고 단백질을 원하는 농도로 농축하기 위해 아미콘사에서 제작한 센트리콘 또는 센트리프랩을 사용하였다. 각 단계에서의 정제된 단백질은 폴리아크릴아미드겔 전기영동을 통하여 확인하였는데(제7도 참조), 이로부터 최종적으로 정제된 단백질의 순도는 95% 이상인 것으로 판단되었다.The method for purifying nucleocapsid proteins expressed from E. coli, including pEThNP and pKKhNP, is shown briefly in FIG. The recovered cells were suspended in 50 to 100 ml of Te buffer solution (50 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) and the cells were crushed by using a sonicator. The degree of crushing was determined by the Bradford assay method. It was used until the protein concentration of the lysate no longer increased. The supernatant was taken by centrifuging the crushed solution at 8,000 × g for 1 hour. Ammonium sulfate was added to the supernatant at 25 to 50% of the saturated concentration, dissolved, and left to stand at room temperature for 1 hour, followed by centrifugation at 8,000 × g for 30 minutes to discard the supernatant. The precipitate was resuspended in 20 ml of TE buffer solution. I was. Dialysis was performed twice in 2 liters of TE buffer for 2 hours to remove ammonium sulfate in the resuspended solution. The dialyzed solution was first subjected to gel filtration using Sephacryl S 200 from Pharmacia and secondarily purified using DEAE Sephadex A-50 anion exchange resin. The eluate used for the anion exchange resin was used to add NaCl to 1.0M concentration in 50mM Tris (pH 8.0). The eluate received here was loaded onto an immunoaffinity column coupled to a monoclonal antibody to the nucleocapsid protein and PBS buffer (8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g NaHPO, 0.24 g KHPO / liter, pH8.0). ) And eluted with 100 mM acetic acid. To adjust the pH of the eluate, 2M Tris buffer (pH8.0) was added 0.3 times the eluent volume. This was dialyzed again with PBS buffer and centricon or CentriFrap manufactured by Amicon was used to concentrate the protein to the desired concentration. Purified protein at each step was confirmed by polyacrylamide gel electrophoresis (see FIG. 7), from which the final purity of the purified protein was determined to be greater than 95%.

면역친화컬럼에 사용된 단일군 항체로는 하이브리도마를 배양하고, 프로테인 A 컬럼을 사용해 배양액으로부터 정제한 것을 사용하였다. 여기서 하이브리도마는 포유마우스에서 배양한 한탄바이러스 원형 76-118을 정제하여 발브 C(Balb/c) 마우스에 접종하고 이로부터 지라세포와 미엘로마(myeloma) 세포를 얻은 다음, 폴리에틸렌글리콜을 사용하여 이를 융합시키고 융합된 세포중에서 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단일군 항체를 생산하는 융합세포만을 스크리닝함으로써 제작하였다. 또한, 정제된 단일군 항체의 커플링은 파마시아사의 CNBr에 의해 활성화된 세파로즈 4B를 사용하여 제조회사의 추천방법에 따라 수행하였다.As a single group antibody used in the immunoaffinity column, a hybridoma was cultured and purified from the culture solution using a Protein A column. Herein, hybridomas were purified from Hantan virus prototype 76-118 in mammalian mice, inoculated into Valve C (Balb / c) mice, and splenic and myeloma cells were obtained therefrom, and then polyethylene glycol was used. The fusions were made by screening only fusion cells that produced a single group antibody against nucleocapsid protein in the fused cells. Coupling of the purified single group antibody was also performed according to the manufacturer's recommendation using Sepharose 4B activated by CNBr from Pharmacia.

[실시예 11]Example 11

뉴클레오캡시드 단백질의 웨스턴 블롯팅Western blotting of nucleocapsid proteins

대장균에서 발현된 단백질이 한탄바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질임을 확인하기 위해 재조합 플라스미드로부터 발현되어 정제된 단백질에 대해 폴리아크릴아미드겔에서 전기영동을 수행하였으며, 전기영동한 겔로부터 단백질들을 멤브레인에 옮기고 신증후출혈열 환자의 혈청과 항 뉴클레오캡시드 단백질 단일클론 항체 ht9040을 이용하여 웨스턴 블롯팅(Western blotting)을 수행하였다. 이때, 특이성을 갖는 단백질만의 접착을 위해 멤브레인을 5%의 스킴밀크(skim milk)를 포함한 PBS 용액(1리터당 8g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g NaHPO, 0.24g KHPO/리터, pH7.4)과 30분간 충분히 반응시킨 후 위에서 언급한 1차 항체와 실온에서 1시간 이상 반응시켰다. 부착되지 않은 항체를 제거하기 위해 PBST 용액(PBS+0.5% Tween20)으로 멤브레인을 3 내지 4회 각각 5 내지 10분간 세척하였다. 세척완료된 멤브레인은 적당히 희석되고 퍼옥시다제(peroxidase)효소가 부착된 항토끼항체G(anti-rabbit immunoglobulin G) 및 5% 스킴밀크를 포함한 PBS 용액의 혼합액과 1시간동안 진탕하여 반응시켰다. 다시금 PBST 용액으로 멤브레인을 3 내지 4회 각각 5 내지 10분간 세척한 다음 4-클로로-1-나프톨을 발색시약으로 사용하여 발색반응을 수행한 결과 예상된 위치에서 원하는 뉴클레오캡시드 단백질 특유의 밴드(약 50Kd)를 확인하였다(제8도 참조).In order to confirm that the protein expressed in E. coli is a nucleocapsid protein of Hantan virus, electrophoresis was performed on polyacrylamide gels expressed from recombinant plasmids, and the proteins were transferred to the membrane from the electrophoretic gel and nephrotic symptoms were obtained. Western blotting was performed using serum of the hemorrhagic fever patient and antinucleocapsid protein monoclonal antibody ht9040. At this time, the membrane was attached to the PBS solution containing 5% of skim milk (specifically 8g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g NaHPO, 0.24g KHPO / liter, pH7.4) After fully reacting with for 30 minutes, the reaction was performed for 1 hour at room temperature with the above-mentioned primary antibody. Membranes were washed 3 to 4 times for 5 to 10 minutes each with PBST solution (PBS + 0.5% Tween20) to remove unattached antibodies. The washed membrane was shaken for 1 hour with a mixture of PBS solution containing an appropriately diluted anti-rabbit immunoglobulin G and 5% skim milk with peroxidase enzyme. Again, the membrane was washed 3 to 4 times with PBST solution for 5 to 10 minutes each, followed by color reaction using 4-chloro-1-naphthol as a color developing reagent. About 50 Kd) (see Figure 8).

[실시예 12]Example 12

정제된 뉴클레오캡시드 단백질을 이용하여 제조된 백신의 효능성 조사Investigation of efficacy of vaccine prepared using purified nucleocapsid protein

실시예 10에서 정제된 백신 정제원액 0.5㎖당 보조제인 알루미늄 하이드록사이드 겔을 0.625mg의 배합비로 첨가하고 4℃에서 15일간 정치시켰다. 그후, 0.01% (w/v) 치메로살과 0.02% 정제젤라틴을 가하여 최종 시험백신을 제조하였다.Aluminum hydroxide gel, an adjuvant per 0.5 ml of the vaccine purified stock solution, purified in Example 10, was added at a compounding ratio of 0.625 mg, and left standing at 4 ° C. for 15 days. The final test vaccine was then prepared by adding 0.01% (w / v) chimerosal and 0.02% purified gelatin.

이와 같이 제조된 시험백신의 중화 효능을 조사하기 위해 기니픽을 대상으로 실험하였으며, 비교백신으로는 현재 시판되고 있는 주식회사 녹십자의 한타박스를 사용하였다. 이때, 항원은 10㎍/0.5㎖, 20㎍/0.5㎖ 및 40㎍/0.5㎖의 3가지 농도로 기니픽에 접종시켰고, 시험백신과 비교백신을 기니픽에 접종한 후 얻어진 기니픽의 혈청을 플라크감소 중화시험법으로 검사함으로써 백신의 면역원성을 판정하였다. 플라크감소 중화시험은 아래 서술된 바와 같이 진행되었다.In order to investigate the neutralization efficacy of the test vaccine prepared as described above, the experiment was conducted on guinea pigs, and Hanta box of Green Cross Co., Ltd., which is commercially available, was used as a comparative vaccine. At this time, the antigen was inoculated into guinea pigs at three concentrations of 10 µg / 0.5 ml, 20 µg / 0.5 ml and 40 µg / 0.5 ml, and the serum of the guinea pig obtained after inoculating the guinea pigs with the test vaccine and the comparative vaccine was neutralized. By immunoassay, the immunogenicity of the vaccine was determined. Plaque reduction neutralization test was conducted as described below.

1) 플라크감소 중화시험을 위한 항체를 얻기 위하여, 3가지의 서로 다른 농도로 제조된 상기 시험백신과 비교백신을 기니픽에 10일 간격으로 3회 피하접종(0.5㎖/접종)을 하였다.1) Plaque reduction In order to obtain an antibody for neutralization test, the test vaccine and the comparative vaccine prepared in three different concentrations were subcutaneously inoculated (0.5ml / inoculation) three times at 10-day intervals to Guinea Pig.

2) 기니픽으로부터 혈청을 채취하여 56℃에서 30분간 비동화 처리한 후, 3% 우태아혈청을 함유하는 유지용 배지(MEM + M199 = 1:1)를 사용하여 각각 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 및 1:160으로 희석하였다.2) Serum was collected from guinea pigs, and then inactivated at 56 ° C. for 30 minutes, and then maintained using a maintenance medium containing 3% fetal bovine serum (MEM + M199 = 1: 1), respectively 1:10 and 1:20. , 1:40, 1:80 and 1: 160.

3) 희석시킨 혈청과 70PFU/배양용기(직경 6cm)되도록 희석시킨 한탄바이러스 공격균주 76-118을 동량씩 시험관에서 혼합한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.3) After mixing the diluted serum and the anti-tank virus strain 76-118 diluted to 70PFU / culture vessel (6cm in diameter) in the test tube by the same amount and reacted at 37 ℃ for 1 hour.

4) 미리 준비된 6cm의 세포배양 용기에서 단층배양한 베로E6 세포에 상기 혼합액을 0.2㎖씩 접종한 다음 37℃에서 90분간 반응시켰다.4) 0.2 ml of the mixed solution was inoculated into VeroE6 cells monolayered in a cell culture vessel of 6 cm prepared in advance, followed by reaction at 37 ° C. for 90 minutes.

5) 반응 후 접종액을 제거하고 각 배양용기당 5㎖씩의 1차 한천중층배지(Agarose overlay)를 분주하였다. 1차 한천중층배지의 조성은 다음과 같다.5) After the reaction, the inoculum was removed, and 5 ml of each primary agar rosette medium (Agarose overlay) was dispensed. The composition of the primary agar media is as follows.

이때 M199는 피놀레드를 함유하지 않는 배지로 사용하였으며 우태아 혈청은 56℃에서 30분간 열처리한 것을 사용하였다.At this time, M199 was used as a medium containing no pinol red, and fetal calf serum was used for 30 minutes at 56 ° C.

6) 1차 한천중층이 끝나면 각기 접종된 세포들을 37℃에서 10 내지 11일간 배양하였다.6) After completion of the first agar incubation, each inoculated cells were incubated for 10 to 11 days at 37 ℃.

7) 배양 후 각 배양용기당 3 내지 3.5㎖씩의 2차 한천중층배지를 분주하였으며 2차 한천중층배지의 조성은 다음과 같다.7) After incubation, the secondary agar medium medium was dispensed with 3 to 3.5 ml of each culture vessel, and the composition of the secondary agar medium medium is as follows.

8) 2차 한천중층이 끝나면 3일간 배양한 후 직경 2mm 정도의 플라크 수를 관찰하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.8) After the completion of the secondary agar layer was observed for the plaque number of about 2mm diameter after incubation for 3 days, the results are shown in Table 3 below.

상기 표 3의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 정제된 뉴클레오캡시드 단백질을 이용하여 제조된 시험백신의 경우 40㎍/0.5㎖ 및 20㎍/0.5㎖의 농도에서는 비교 백신에 비해 탁월한 중화능력을 나타내었으며, 10㎍/0.5㎖의 농도에서는 동등한 중화능력을 나타내었다.As can be seen from the results of Table 3, the test vaccine prepared using the purified nucleocapsid protein showed superior neutralizing ability at concentrations of 40 µg / 0.5 ml and 20 µg / 0.5 ml compared with the comparative vaccine. , 10μg / 0.5mL showed equivalent neutralizing capacity.

따라서 인간유래 한탄바이러스에서 항원성을 나타내는 물질중 하나인 뉴클레오캡시드 단백질을 유전공학적 방법으로 대량생산하여 제조된 본 발명의 백신은 기존의 백신에 비해 신증후군 출혈열에 대하여 뛰어난 면역원성을 지니고 있을 뿐 아니라, 특히 독성물질이 필연적으로 함유되게 마련인 바이러스 자체를 백신 물질로 사용하지 않고 성분이 규명된 단일 단백질을 백신 물질로 사용함으로써 백신 제제의 독성문제를 완전히 해결한 우수한 백신이다.Therefore, the vaccine of the present invention prepared by mass production of nucleocapsid protein, which is one of the antigenic substances in human-derived hantan virus, by genetic engineering method has excellent immunogenicity against hemorrhagic fever of nephrotic syndrome compared to the existing vaccine. In particular, it is an excellent vaccine that completely solves the toxicity problem of the vaccine preparation by using a single protein whose composition is identified as a vaccine material, rather than using the virus itself that is inevitably contained as a vaccine material.

Claims

인간유래 한탄바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 벡터 pET-3a내로 삽입시켜 제조된 발현 플라스미드 pEThNP.Expression plasmid pEThNP prepared by inserting the nucleocapsid protein gene of human-derived hantan virus into vector pET-3a.

인간유래 한탄바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 벡터 pKK233-3 내로 삽입시켜 제조된 발현 플라스미드 pKKhNP.Expression plasmid pKKhNP prepared by inserting the nucleocapsid protein gene of human-derived hantan virus into the vector pKK233-3.

발현 플라스미드 pEThNP로 대장균 BL21(DE3)을 형질전환시켜 제조된 대장균 형질전환체 E.coli BL(pEThNP)(기탁번호 : KFCC-10865).E. coli transformant E. coli BL (pEThNP) prepared by transforming E. coli BL21 (DE3) with the expression plasmid pEThNP (Accession No .: KFCC-10865).

발현 플라스미드 pKKhNP로 대장균 HB101을 형질전환시켜 제조된 대장균 형질전환체 E.coli BL(pKKhNP)(기탁번호 : KFCC-10868).E. coli transformant E. coli BL (pKKhNP) prepared by transforming E. coli HB101 with the expression plasmid pKKhNP (Accession No .: KFCC-10868).

제3항의 대장균 형질전환체 배양액으로부터 얻어지며 아미노말단부위에 s10 리더(leader) 서열을 추가로 함유하는 뉴클레오캡시드 융합단백질.A nucleocapsid fusion protein obtained from the E. coli transformant culture of claim 3 and further comprising an s10 leader sequence in the amino terminal region.

제5항에 있어서, 암모늄설페이트 침전법, 겔 필트레이션(filtration), 음이온교환수지 컬럼 및 면역친화(immunoaffinity) 컬럼을 이용하여 정제된 단백질.6. The protein of claim 5 purified using ammonium sulfate precipitation, gel filtration, anion exchange resin column and immunoaffinity column.

하기 서열 (I) 또는 (II)의 유전자를 벡터내로 삽입시켜 발현 플라스미드를 작제하고, 상기 발현 플라스미드로 E.coli를 형질전환시켜 E.coli 형질전환체를 제조하고, 상기 형질전환체를 배양하여 얻은 배양액으로부터 인간유래 한탄바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 분리, 정제함으로써 제조되는 인간유래 한탄바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 유효성분으로 함유하는 신증후출혈열 예방 백신.An expression plasmid was constructed by inserting the gene of the following sequence (I) or (II) into a vector, constructing an E. coli transformant by transforming E. coli with the expression plasmid, and culturing the transformant. A vaccine for preventing renal hemorrhagic fever containing the nucleocapsid protein of human-derived hantan virus as an active ingredient prepared by isolating and purifying the nucleocapsid protein of human-derived hantan virus from the obtained culture.

제7항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 보조제를 함유하는 백신.8. The vaccine of claim 7, which contains a pharmaceutically acceptable adjuvant.

제8항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 보조제가 알루미늄하이드록사이드겔, 치메로살, 정제젤라틴 중에서 선택된 1종 이상인 백신.The vaccine of claim 8, wherein the pharmaceutically acceptable adjuvant is at least one selected from aluminum hydroxide gel, chimerosal, and purified gelatin.