KR0176253B1 - 저항변수 측정장치를 사용한 혈액내의 호염기성 백혈구 자동계산에 이용되는 시약제와 그 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 혈액의 호염기성 백혈구집단을 자동적으로 정성하는데 사용되는 시약제와 그 이용법에 관계한다.
본 발명은 특히 호염기성 혈구를 제외한 모든 혈액세포를 용해시키는 분별 차등 시약제의 새로운 조성물에 관계되고 특히 고유저항 변화의 측정을 기본으로 하고 다시 말하면 조성물의 농도와 용액의 pH가 일정한 전기 전도매체에 적합하도록 하는데 관련된다.
본 발명은 시약제는 저항변수를 측정함으로써 자동적으로 혈액 조성을 정성하는 장치에 이용될 수 있다.
Description
제1a도는 정상혈액시료를 사용한 히스토그램을 나타낸다.
제1b도는 본 발명에 따르는 시약제를 이용한 시료를 정성한 히스토그램이다.
본 발명은 최소한 하나의 백혈구 소집단을 분리하고 셈함으로써 혈액조성의 분석에 관계하고, 또한 고유저항 측정을 이용한 흐름혈구계산기로 호염기성 백혈구 과립세포를 세는데 사용하는 시약과 방법에 관련된다.
상이한 백혈구 집단을 정확히 정성하는 것은 진단학상 매우 중요한 일로 인지되어 왔으며 또한 비정상적 백혈구 발생빈도는 다양한 질병발생에 연관될 것이다.
현미경을 통한 관측과 특이적 염색에 의한 전통적인 방법은 백혈구의 모든종류 즉 과립세포(호염기성, 호산성 그리고 중성)과 무과립세포(단세포와 임파세포) 사이를 구별할 수 있게 했으나 이 방법을 실시하는데는 상당한 시간이 필요로 한다.
상이한 전체 혈액 백혈구 집단을 구분하는데 사용되는 다양한 장치기구와 이러한 장치에 사용되는 시약제와 염색제가 개발되어 시판 되고 있다.
세포 원형질의 분별 용해후에 고유저항의 변수(특허 WO84/03771)를 측정하거나 광학회절(실시예에 설명 미국특허 제3,740,143)을 측정함으로써 세포의 크기를 측정하는 것이 가능해졌고 세포의 크기를 측정하는 것이 가능해졌고 또한 상이한 세포형태 특히 과립세포의 세가지 유형에 특이적 염색(효소적 또는 다른 것으로)을 실시하여 상이한 파장에서(미국특허 3 740 143) 세포의 광학밀도와 크기를 측정하는 것이 가능하다.
호염기성 백혈구 과립세포의 셈은 이 세포의 유형이 백혈구에 단지 0.5 내지 1% 밖에 존재하지 않아서 매우 정교한 작업이 된다. 호염기성 백혈구 과립세포는 그 내부에 헤파린 함량에 의해 구분되는데 헤파린은 알시안블루 또는 아스트라블루와 같은 페탈로시아나이드계 염색시약에 의해 정성되는 설페이드 다당류이다.
통상적으로 사용되는 방법으로 뉴트랄레드(neutral red)를 사용한 호염기성 백혈구 과립세포 염색은 자동장치에(미국특허 3 740 143) 사용되는 것으로 백혈구 분별용해처리와 병행할 수도 있다.
유럽특허출원 0 177 137에서는 호염기성 백혈구세포를 제외한 모든 혈액세포의 점진적으로 파괴시키는 용해 시약에 대해 설명한다. 이들 시약은 세포질을 용출시킬 수 있도록 세포막을 파괴시킨다. 여러시간대에서 상이한 세포형태들, 예로 적혈구, 임파세포, 호산성백혈구, 호중성세포구와 단세포가 연속적으로 제거되는 것을 관찰할 수 있다. 80초 후에는 단지 호염기성 백혈구 세포만이 그들의 정상적 크기와 모양을 유지하게 된다. 이 시약의 주성분은 계면활성제와 약산의 혼합물이 된다. 이 혼합물은 반드시 pH가 1.8에서 2.3 사이에서만 사용되어야 한다.
이 시약은 광학적으로 수를 세는 장치에서는 좋은 반응을 나타내나 고유저항을 이용한 측정에는 적합하지 않고 특히 적혈구막의 파괴가 완전히 끝나기전에 장치의 카운팅 오리피스에 응집이 일어나는 주된 문제가 발생한다.
고유저항을 이용한 세포수의 셈에 주요원리는 일정한 전류가 유지되는 전기장에서 실시되는 것이다. 세포가 이 전기장을 통과할 때 일정전류를 유지시키기 위해 전압의 증가가 필요하게 된다(옴(Ohm)의 법칙에 따라). 세포의 통과로 발생하는 전압의 증가는 장치에 의해서 기록되고 이는 현재 저항에 비례하고, 즉 세포의 용적에 비례하고 세포의 모양과는 무관하게 된다. 그러므로 이 감지방법은 부집단의 크기에 대한 분명한 정성을 얻기 위해서 전처리 즉 분별세포 용해가 실시된 세포에만 적용해야 하는 것은 아니다.
이 방법은 세포염색이 필수적이지 않을 때 사용되는 아주 간단한 방법이 된다.
출원인은 고유저항 측정장치에 사용할 수 있도록 호염기성 백혈구 과립세포를 보호하는 분별 차등 용해시약에 새로운 조성물을 개발하였다.
따라서 본 발명의 시약제는 폴리옥시에틸렌 에테르형 계면활성제(예로 Brij 35 또는 23-라우릴 에테르)가 1 내지 5g/ℓ의 농도, 파탈릭산이 0.5 내지 1.5g/ℓ 그리고 0.25mM 염산의 혼합물을 포함한다. 상이한 구성물의 상대적인 농도는 pH 값 2.5 내지 3.2를 얻기위해 조정되어야 한다.
출원인은 이 시약제에 50 내지 300㎎/ℓ 농도의 SDS(소듐 도데실 설페이트)를 첨가함으로써 감지 민감도를 개선시켰는데 SDS는 단백질 변성제로써 측정기구에 침전을 감소시키고 세포의 용해를 더욱 가속시킬 수 있다.
부틸 히드록시톨루엔 또는 BHT(C11H6O-디-테트-부틸-4-메틸페놀)과 같은 산화방지제를 10 내지 30㎎/ℓ 농도로 시약제에 첨가 사용하였다.
따라서 본 발명의 구체예에 따라 시약제는 하기와 같은 성분을 포함 한다 :
본 발명의 구체예에 따라 아스트라 블루를 시약제에 첨가할 수 있는데 이는 헤파린 입자 고정을 개선하기 위한 특수 염색제이다.
본 발명은 또한 호염기성 백혈구세포 정성을 위한 저항측정을 위한 자동세포 혈구계산기에 이 시약을 사용하는 방법에 관련한다.
본 발명에 따르는 방법은 조사되는 혈액시료를 30 내지 40℃로 온도조절되는 실험실에 이 시약과 접촉시켜 5 내지 30초 유지시킨다(온도와 시간은 조절될 수 있음 : 서로 반비례 관계).
이 방법은 적절한 고유저항 측정값을 히스토그램으로 기록하는 장치를 사용하여 호염기성 백혈구세포를 감지하는 것을 포함한다.
도면은 정상혈액세포를 본 발명에 따르는 방법으로 얻어진 대표적인 히스토그램을 나타낸다.
다음의 실시예는 그 영역에 제한을 두지않은 발명의 한 구체예를 설명한다.
[실시예]
상이한 구성 성분물의 하기농도는 시약제 1리터의 비율로 계산된 것이다 :
최종 증류수를 1ℓ로 조정한다. pH 값은 2.7(2.5 내지 3.2)를 유지한다.
아스트라블루는 선택된 pH 조건하에서 10 내지 100㎎/ℓ 농도로 시약제에 첨가될 수 있고, 아스트라블루는 가용성이며 안정하다.
이 시약제는 고유저항 측정원리(예로 ABX model 504F)를 이용한 혈구 자동계산기종의 어느것이나 사용될 수 있다. 전자압은 100V로 조정한다.
장치는 2㎖ 시약제와 15㎕ 혈액시료를 혼합하도록 되어있다. 이 혼합물은 혼합시간 17초에 40℃로 온도조절된 실험실에서 만들 수 있다(온도를 감소하고 접촉시간을 늘림으로써 같은 결과를 얻을 수 있고 이 역도 마찬가지가 된다).
이 시약제는 적혈세포를 즉시 용해시키고 호염기성 백혈구 과립세포를 제외한 모든 다른종의 세포를 단계적으로 용해시킨다. 30초 후에 40℃에서 현미경 관찰로써 그대로 남아있는 호염기성 과립세포의 모양을 확인할 수 있을 것이다. 시약제에 아스트라블루가 포함될때 호염기성 백혈구 과립세포의 염색정도는 사용된 아스트라블루의 농도에 비례한다.
정상 혈액시료의 대표적인 히스토그램(도면 1의 1.1)은 pH 1.9에서 SDS나 아스트라블루가 첨가되지 않은 시약에서 실시되었다. 적혈구막의 고유저항 측정을 저해하는 것으로 관찰된다. 곡선 1.2는 본 발명에 따르는 시약제로 실시한 정성을 나타낸다. A부위는 용해된 세포의 핵에 관계되고 B 부위는 고유의 호염기성 백혈구세포의 세포질에 관계한다.
Claims (8)
- 저항지수 측정원리를 이용한 자동분석기에서 혈액의 호염기성 백혈구 세포계산을 위해 사용되는 조성물에 있어서, -폴리옥시에틸렌 에테르형 계면활성제, -파탈린산과 염산 혼합액, -SDS(소듐 도데시 설페이트), -부틸레이트 히드록시톨루엔형 항산화제로 구성되고, 이 조성물 용액은 pH가 2.5에서 3.2 사이로 조절된 것을 특징으로 하는 전기 전도성 분별 차등세포 용액 시약제.
- 제1항에 있어서, 계면활성제 Brij 35이며, 최종농도가 1 내지 5g/ℓ인 것을 특징으로 하는 시약액.
- 제1항에 있어서, 산혼합액에 파탈린산 최종농도가 0.5 내지 1.5g/ℓ그리고 최종농도가 0.25mM인 염산이 포함되는 것을 특징으로 하는 시약제.
- 제1항에 있어서, 시약제에 최종농도가 50 내지 300㎎/ℓ의 SDS가 포함되는 것을 특징으로 하는 시약제.
- 제1항에 있어서, 최종농도가 10 내지 30㎎/ℓ의 부틸레이트 히드록시톨루엔이 포함되는 것을 특징으로 하는 시약제.
- 제1항에 있어서, 최종농도가 10 내지 100㎎/ℓ의 아스트라 블루가 포함되는 것을 특징으로 하는 시약제.
- 자동혈구 계산장치를 이용하여 호염기성 백혈구 세포를 계산하는 방법에 있어서; -제1항에 따르는 시약제와 혈액시료를 온도 조절된 실험실에서 접촉시키고, -저항변화를 측정함으로써 호염기성 백혈구 과립세포를 감지하고, -이 측정값을 히스토그램형태로 기록하는 것을 특징으로 하는 호염기성 혈구 계산방법.
- 제7항에 있어서, 온도가 30 내지 40℃로 조절되고 접촉 시간이 5 내지 30초동안에 혈액과 시약제를 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
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