KR0168719B1 - 발효에 의한 l-쓰레오닌의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 L-시스테인에 대해 요구성을 가지고 에 이 씨(S-2-Aminoethl-L-cysteine)와 항생물질의 일종일인 리팜피신(Rifampicin)에 대하여 내성을 가지는 변이주인 쎄라티아속(Serratia sp.)KFCC-10878 변이주를 분리하고 슈크로스를 주 당질로 이용하는 생산배지에서 호기적으로 배양하여 다량의 L-쓰레오닌을 제조하는 방법이다.

배양방법으로는 생산배지 및 배양중 첨가되는 추가당에 L-시스테인을 100 ~500㎍/㎖, 리팜피신을 0~100㎍/㎖되게 첨가하고 pH를 7.0~7.5, 통기량을 0.8~ 1.5vvm으로 유지하며 추가당을 배양약내의 당농도가 3~5％되게 유지하여 배양액내에 많은 L-쓰레오닌을 축적시키는 것을 특징으로 한다.

Description

발효에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법

본 발명은 미생물의 발효에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 L-시스테인을 요구하고, 동시에 S-2-아미노에틸-L-시스테인(S-2-Aminoethyl -L-cysteine, 이하 에이 이 씨라 칭한다.)과 마크로락탐계 항생물질인 리팜피신(Rifampicin)에 대한 내성을 가지는 변이주를 분리하여 슈크로스등의 당류를 탄소원으로 이용, 호기적으로 배양하여 L-쓰레오닌을 제조하는 방법에 관한 것이다.

L-쓰레오닌은 필수 아미노산의 일종으로서 쌀의 제2제한 아미노산이다. 지금까지 알려진 바로는 아미노산 수액제제, 종합아미노산제제의 의약 용도와 식품의 영양 강화제나 건강음료등의 식품용도로도 사용되고 있다. 최근에는 L-라이신과 사료첨가제로도 수요가 급증하고 있는 아미노산이다.

지금까지 알려진 발효법에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법은 상당수 공지되어 왔다. 그예로서 세라티아속(Serratia sp.) L-쓰레오닌 생상균으로부터 아스파르토 키나제, 호모세린 키나제, 호모세린 디하이드로게나제, 쓰레오닌 신타제의 유전정보를 함유한 디엔에이(DNA)절편을 재조합하여 다량의 쓰레오닌을 생산하는 방법으로 일본 특허공보 평 5-10076호와 프로비덴시아속(Providencia sp.)에 속하고 메사오닌 대사 길항물질에 내성을 가지는 균주를 이용해 유전자 재조합한 디엔에이를 삽입하여 생산성을 증가시킨 방법으로 일본 특허공보 평 1-289493호가 있다.

또한, 대장균(Escherichia)을 이용 쓰레오닌 대사길항 물질에 내성을 가지고, 생육중 메사오닌이나 디아미노피멜릭산(Diaminopimelic acid)의 요구성을 가지는 균주를 이용하는 방법으로 일본 특허공보 소 56-10037호, L-세린과 에사이오닌에 내성을 가지는 균주를 이용하는 방법은 유럽특허 91103569.9호가 알려져 있다.

본 발명의 목적은 발효에 의한 L-쓰레오닌의 제조에 있어서 보다 높은 수율로 L-쓰레오닌을 생산하는 방법을 모색하기 위한 것이다.

본 발명에 이용한 균주의 분리방법은 본 발명자들이 L-쓰레오닌 생산에 이용해오던 L-시스테인 요구주이며, 에이 이 씨에 내성을 가지는 세라티아속 SW9410 ( KFCC- 10848 )을 친주로하여 통상의 변이처리방법에 의해 얻은 변이주중 L-시스테인에 대한 요구성과 에이 이 씨와 리팜피신에 대한 내성을 동시에 가지는 변이주 SW9506 ( KFCC - 10878)을 유도하였다. 이 분리주를 이용 동일 조건에서 배양할 때 친주에 비하여 다량의 L-쓰레오닌을 배양액내에 축적하여 본 발명을 완성하게 된 것이다.

본 발명에 대하여 자세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 치주인 세리티아속 SW9410균주를 통상적인 변이처리 방법 즉 자외선 조사나 화학변이유기제인 NTG(N-메틸-N'-니트로-N-니트로소 구아니딘), DES(디에틸설페이트)로 처리하여 리팜피신이 50㎍/㎖첨가되어 있는 완전한 천평판배지에 도말하고 30℃에서 2~3일간 배양하였다. 그리고, 이 평판배지상에서 생육하는 콜로니들을 분리하여 에이 이 씨, L-시스테인을 첨가한 배지와 첨가하지 않은 2 종류의 최소한 천평판배지에 각각 레플리카하여 친주의 균주특성변화를 확인하였다. 이와같은 방법으로 리팜피신과 에이 이 씨에 내성을 가진 동시에 L-시스테인 요구성을 가진 변이주중 특성이 명확한 신균주 SW9506을 분리하여 1995년 12월 1일 사단법인 한국 종균협회에 수리번호KFCC-10878로 기탁하였다.

이들 변이주의 선별을 위한 완전액체배지조성은 효모엑기스1.0％, 펩톤1.0％, 육즙 0.3％, 염화나트륨 0.5％, 포도당 0.5％, pH7.0이며, 완전한 천평판배지는 완전 액체배지조성에 한천을 2％ 첨가한 것을 사용하였다. 또한, 항상제 내성을 확인하기 위하여 리팜피신 50㎍/㎖을 하였다. 친주의 특성 변화 확인을 위한 최소한천평판배지조성은 슈크로스 0.5％, 유안 0.2％, 제1인산칼륨 0.1％, 황산마그네슘 0.02％, 한천 2％, pH 7.3이며 영양요구성과 약제 내성을 확인하기 위하여 L-시스테인 100㎍/㎖과 에이 이 씨 5mM을 각각 첨가하였다.

이와같은 방법으로 분리하여 명명한 신균주 SW9506(KFCC-10878)은 표1.에 나타난 바와같이 0~100㎍/㎖의 리팜피신 농도에서 명확히 내성을 가지고 있으며 친주의 특성인 L-시스테인의 요구성 및 에이 이 씨의 내성을 동시에 가진 변이주임이 확인되었다.

주(1) : 리팜피신이 농도별로 첨가된 완전 액체배지에서 48시간 배양한 배양액을 100배 희석하여 660㎚에서 흡광도를 측정

이와같은 성질을 가지는 신균주 SW9506(KFFCC-10878)을 친주인 SW94 10과 리팜피신의 첨가농도별 생육 및 L-쓰레오닌의 생산성을 비교 분석한 결과는 표2.와 같다. 본 발명의 신균주는 친주인 SW9410보다 많은량의 L-쓰레오닌을 배양액내에 축적시키는 것으로 나타났으며 리팜피신의 첨가농도는 0~100㎍/㎖, 최적 농도는 50㎍/㎖ 이었다.

주(1) : 생산배지(후기 실시예1 참조)에서 72시간 진탕배양한 배양종료액을 희석 660㎚에서 흡광도(베크만 DU-70)측정

주(2) : 배양종료액 내의 L-쓰레오닌 축적량을 종이 크로마토그래피 또는 아미노산 자동 분석기(히다치 L-8500A)를 이용 분석

주(3) : 리팜피신은 중류수에 용해(5㎎/㎖)한 후 마이크로 필터로 여과하여 살균된 생산배지에 첨가

본 발명은 신균주가 친주에 비하여 현저하게 L-쓰레오닌을 배양액내에 축적시킨 원인에 대하여는 확실하게 밝혀지지 않았으나 대장균에서 밝혀진 바로는 리팜피신에 대한 내성주는 L-쓰레오닌을 생산하는 생합성 유전자의 오페론(operon)상에서 어테뉴에이션(attenuation)에 영향을 미친다고 알려졌다. 따라서, 대장균과 유전적 연관성이 매우 깊은 세라티아속 균주의 경우에도 이와같은 효과가 작용되었을 것으로 판단된다.

L-쓰레오닌 발효의 배양조건은 탄소원으로서 포도당, 원당, 페당밀등이 사용가능하며, 질소원으로는 암모니아가스, 암모니아수, 요소, 유안, 염화암모늄, 인산 암모늄등을 이용할 수 있으며, 그외 천연의 영양원과 무기금속염이 혼합된 배지면 이용이 가능하다.

본 배양을 행함에 있어서 배양관리조건은 다음과 같다.

발효온도는 30℃내외에서 통기량은 0.8~1.5vvm, 교반기 회전수는 400~600rpm으로 3~4일간 배양한다. 배양중 pH는 7.0~7.5로 암모니아수 또는 액화암모니아를 이용 자동 조절한다.

배양 완료액내에 축적된 L-쓰레오닌을 통상의 방법에 따라 이온교환수지에 흡착, 분리시켜 용리액을 얻고 여기에 에탄올을 처리하여 L-쓰레오닌 조결정을 얻는다.

이하 실시예에서 상세히 설명한다.

[실시예1]

사용균주 : 신균주 세라티아속 SW9506(KFCC-10878)

전배양배지 조성 : 포도당 0.5％, 효모 엑기스 1.0％, 펩톤 1.0％, 염화나트륨 0.5％, 육즙 0.3％, pH7.0

생산배지 조성 : 슈크로스 10％, 옥수수침지액 3％, 비오틴 50γ 제이인산 칼륨 0.1％, 황산제일철 2㎎/L, 황산 망간 2㎎/L, 유안 0.5％, L-시스테인 300㎎/㎖, 탄산칼슘 5％(별도멸균 첨가), pH 7.0

전배양 방법 : 18Φ x 185㎜의 시험관 각각 5㎖의 전배양 배지를 분주한 후 121℃에서 15분간 가압 살균한다. 냉각후에 신균주 SW9506(KFCC-10878)을 각각 일백금니씩 접종하여 30℃에서 20시간, 분당 120화 왕복 진탕 배양한 것을 전배양액으로 한다.

생산배양 방법 : 500㎖ 사카구찌 플라스크에 각각 70㎖정도의 쓰레오닌 생산배지를 분주하고 121℃에서 15분간 가압 살균한다. 냉각후 신균주 SW9506의 전배양액을1％ 접종하여, 30℃에서 72시간 분당 120회 진탕 배양한다.

발효종류 후 배양액내의 L-쓰레오닌 축적량은 17.7㎎/㎖였다.

[실시예2]

사용균주 : 신균주 쎄라티아속 SW9505(KFCC-10878)

1차 전배양 배지조성 : 실시예1의 전배양 배지와 동일

2차 전배양 배지조성 : 슈쿠로스 4％, 옥수수침지액 3％, 비오틴 100γ, 제이인산 칼륨 0.1％, 황상제일철 2㎎/L, 황산망간 2㎎/L, 유안 0.05％, 요소 0.6％, L-시스테인 200㎍/㎖, pH 7.0

생산배지 조성 : 슈크로스 10％, 옥수수침지액 3％, 비오틴 50γ, 제이인산 칼륨 0.1％, 황산제일철 2㎎/L, 황산망간 2㎎/L, 유안 0.5％, L-시스테인 300㎍/㎖, pH 7.0

전배양 방법 : 실시예1과 동등한 방법으로 배양된 1차 전배양액을 500㎖ 사카구찌 플라스크에 50㎖분주된 2차 전배양 배지에 1％ 접종한다. 접종후 30℃에서 24시간, 분당 120회 왕복 진탕배양한 것을 2차 전배양액으로 한다.

생산배양 방법 : 생산배지를 5L 소형 발효조에 2L사입하고, 121℃에서 15분간 가압살균한다. 냉각후 종배양액을 2％ 접종하고, 교반속도 600RPM, 통기 0.8~1.5VVM의 조건으로 30℃에서 72시간 배양한다. 이때 추가당은 당농도가 1-3％ 유지할수 있도록 추가하고, pH조절은 암모니아수로서 7.0~7.5로 유지시킨다.

발효종료 후 배양액내의 L-쓰레오닌의 축적량은 35.9㎎/㎖였다.

발효 종료액 1L를 원심분리법으로 균제를 제거한후 이온교환수지에 흡착, 분리, 정제한 L-쓰레오닌의 결정은 32.4ｇ을 얻었다.

상술한 바와같이 본원발명에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법은 보다 용이하게 높은 수율로 L-쓰레오닌을 제조할 수 있는 공업적으로 유용한 방법이다.

Claims (3)

1. 미생물의 발효에 의한 L-쓰레오닌의 생산에 있어서, L-시스테인을 요구하고 동시에 S-2-아미노에틸-L-시스테인 (S-2-Aminoethy-l-cysteine)과 리팜피신(Rifampicin)에 내성을 갖는 쎄라티아(Serratia)속 SW9506(KFCC-10878)을 이용하여 L-쓰레오닌을 제조함을 특징으로 하는 발효에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, L-시스테인을 100~500㎍/㎖, 리팜피신을 0~100㎍/㎖되게 첨가함을 특징으로 하는 발효에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, pH를 7.0~7.5, 통기량을 0.8~1.5VVM으로 유지하면서 배양함을 특징으로하는 발효에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법.