CN114015607A - 一种高产5-甲基四氢叶酸的解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
一种高产5-甲基四氢叶酸的解淀粉芽孢杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高产5‑甲基四氢叶酸的解淀粉芽孢杆菌及其应用，涉及微生物技术领域。本发明的高产5‑甲基四氢叶酸的解淀粉芽孢杆菌命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BOEN‑305，已于2021年11月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.62024。本发明的菌株来源于蔬菜种植基地土壤中，属于天然菌种，所分泌的5‑甲基四氢叶酸是天然合成，不会有任何副作用产生，安全性高；且该解淀粉芽孢杆菌具有较好的遗传稳定性、抗逆性很强，能够抵抗生产运输过程中的损伤，具有重要工业利用价值。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种高产5-甲基四氢叶酸的解淀粉芽孢杆菌及其应用。
背景技术
叶酸作为人体生长过程中必要的维生素，市场应用前景广阔，目前市场上叶酸主要以化学合成为主，但人工合成的叶酸和天然叶酸在人体中的代谢途径不同，具有一定的副作用，因而人工合成的叶酸产品的反作用不容忽视，而微生物发酵产生的叶酸安全性高，在吸收前已经被还原和甲基化，在一个很宽的安全摄入范围不会有副作用，并且具有更高的生物利用率，因此利用微生物合成叶酸倍受研究领域的关注，研究较多的菌种主要有酵母菌，乳酸菌，嗜热链球菌。
5-甲基四氢叶酸是叶酸在体内发挥作用的惟一活性形式，叶酸在人类饮食中无处不在，叶酸缺乏的问题仍然影响着全球数十亿人，叶酸作为食品添加剂已经成为必需品，成人建议摄取叶酸400微克/天，因此导致叶酸的市场需求不断增长。目前5-MTHF生产主要以工业合成为主，但是存在拆分工艺复杂，难以纯化等问题。而且其前体物质叶酸也是通过工业化学合成生产，会对环境造成污染。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一种被广泛用动物养殖饲料生产中的有益菌，但目前未见其应用于产生5-甲基四氢叶酸的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高产5-甲基四氢叶酸的解淀粉芽孢杆菌及其应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种高产5-甲基四氢叶酸的解淀粉芽孢杆菌，所述解淀粉芽孢杆菌命名为：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BOEN-305，已于2021年11月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.62024。
作为本发明所述的高产5-甲基四氢叶酸的解淀粉芽孢杆菌的优选实施方式，所述解淀粉芽孢杆菌BOEN-305的序列如SEQ ID NO.1所示。
作为本发明所述的高产5-甲基四氢叶酸的解淀粉芽孢杆菌的优选实施方式，所述解淀粉芽孢杆菌BOEN-305分离自蔬菜种植基地土壤。
本发明还提供所述的高产5-甲基四氢叶酸的解淀粉芽孢杆菌在制备含5-甲基四氢叶酸的产品中的应用。
本发明还提供一种解淀粉芽孢杆菌发酵液，由上述高产5-甲基四氢叶酸的解淀粉芽孢杆菌经液体发酵制备得到。
本发明还提供所述解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备方法，包括以下步骤：
(1)种子液制备：将解淀粉芽孢杆菌BOEN-305接种到种子培养基中，于30℃～40℃培养14～20h，得到种子液；
(2)发酵液制备：将步骤(1)的种子液接种到液体发酵培养基中，接种量为1％～7％，培养温度30℃～40℃，风量0.5～1.0vvm，搅拌速度150～300r/min，发酵时间24～48h，得所述解淀粉芽孢杆菌发酵液。
作为本发明所述解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备方法的优选实施方式，所述种子培养基包括：蛋白胨3～10g/L，酵母膏0.2～1.5g/L，葡萄糖8～25g/L，硫酸镁0.05～0.5g/L，硫酸铁0.05～0.15g/L。
作为本发明所述解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备方法的优选实施方式，所述液体发酵培养基包括：糖蜜12～25g/L，酵母粉5～18g/L，氯化钙1.2～3.5g/L，无水硫酸镁0.1～1g/L，硫酸锰0.01～0.5g/L，氯化钠2～5g/L，磷酸氢二钠0.1～5g/L，磷酸二氢钾0.01～0.5g/L，维生素C 0.05～0.2g/L。
作为本发明所述解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备方法的优选实施方式，所述种子培养基和液体发酵培养基均采用蒸馏水配制而成；所述种子培养基的pH为7.0～7.5；所述液体发酵培养基的pH为7.2～7.5。
本发明还提供所述的解淀粉芽孢杆菌发酵液或所述的解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备方法制备的解淀粉芽孢杆菌发酵液在制备含5-甲基四氢叶酸的产品中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供的高产5-甲基四氢叶酸的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BOEN-305能够产生5-甲基四氢叶酸，由于本发明的菌株来源于蔬菜种植基地土壤中，属于天然菌种，所分泌的5-甲基四氢叶酸是天然合成，不会有任何副作用产生，安全性高；且该解淀粉芽孢杆菌具有较好的遗传稳定性、抗逆性很强，能够抵抗生产运输过程中的损伤，具有重要工业利用价值。本发明还提供由该解淀粉芽孢杆菌BOEN-305液体发酵产生的解淀粉芽孢杆菌发酵液，与其他天然菌株相比，该解淀粉芽孢杆菌发酵液的5-甲基四氢叶酸的含量更高；而且该解淀粉芽孢杆菌发酵液发酵操作简单，易于工业化生产。
附图说明
图1为解淀粉芽孢杆菌BOEN-305的菌落形态。
图2为解淀粉芽孢杆菌BOEN-305的革兰氏染色图。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1解淀粉芽孢杆菌的保藏信息
本发明提供了一种高产5-甲基四氢叶酸的解淀粉芽孢杆菌，将该解淀粉芽孢杆菌命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BOEN-305，该解淀粉芽孢杆菌于2021年11月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.62024。
实施例2解淀粉芽孢杆菌BOEN-305的获取及菌种鉴定
1、解淀粉芽孢杆菌BOEN-305的获取：从江西省九江市蔬菜种植基地采集土壤样品。称取5g土壤样品于灭菌离心管中，加入5倍体积无菌水，过滤取滤液，取滤液接种于LB平板培养基，于37℃培养。挑取生长良好的细菌，接种于LB平板培养基。挑取菌落，划线培养，反复多次纯化，直到得到单菌落。
2、菌种鉴定
(1)菌落和菌体形态观察：将菌株BOEN-305在LB平板培养基上进行划线培养，在37℃培养48h后，观察并记录平板上菌落的生长情况。本实施例的菌株的菌落的形态图如图1所示。采用试剂盒对本实施例的菌株进行革兰氏染色，结果如图2所示。
由图1可知，本实施例的菌株形成的菌落呈乳白色，不透明，圆形，褶皱，中心凹陷，边缘呈齿状，黏脆状，易挑起。由图2可知，本实施例的菌株为直杆状，单个或短链状排列，芽孢椭圆形，次端生，周生鞭毛，为革兰氏阳性菌。
(2)生理生化特征：本实施例提供的菌株BOEN-305能够在4～40℃环境中生长，好氧；能耐受10％(wt)氯化钠；能水解明胶、淀粉、酪素、柠檬酸盐；能利用硫酸铵、硝酸铵；可利用果糖、葡萄糖、甘露醇、木糖为碳源；吲哚反应、V.P.反应、甲基红试验、接触酶和氧化酶试验为阳性；能产过氧化氢酶，不产硫化氢。
(3)分子生物学鉴定：采用细菌全基因组快速抽提试剂盒，提取本实施例的菌株BOEN-305的全基因组，将提取的DNA用于16S rDNA序列扩增，并对扩增的序列进行测序。将扩增得到的序列通过BLAST和16S rDNA数据库进行比对。
实验结果显示，本实施例的菌株BOEN-305扩增得到的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌。
综合本实施例对菌株BOEN-305的菌落和菌体形态、生理生化特征和分子生物学鉴定结果，能够确定菌株BOEN-305为解淀粉芽孢杆菌，并将其命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BOEN-305。
实施例3
本实施例的一种解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备方法，包括以下步骤：
(1)种子液制备：将实施例2的解淀粉芽孢杆菌BOEN-305接种到种子培养基中，于30℃培养20h，得到种子液；
(2)发酵液制备：将步骤(1)的种子液接种到液体发酵培养基中，接种量为7％，培养温度30℃，风量0.5vvm，搅拌速度150r/min，发酵时间48h，得所述解淀粉芽孢杆菌发酵液。
本实施例的种子培养基包括：蛋白胨3g/L，酵母膏1.5g/L，葡萄糖8g/L，硫酸镁0.05g/L，硫酸铁0.15g/L。所述种子培养基采用蒸馏水配制而成，其pH为7.0。
本实施例的液体发酵培养基包括：糖蜜12g/L，酵母粉5g/L，氯化钙1.2g/L，无水硫酸镁0.1g/L，硫酸锰0.1g/L，氯化钠3g/L，磷酸氢二钠0.1g/L，磷酸二氢钾0.01g/L，维生素C0.1g/L。所述液体发酵培养基采用蒸馏水配制而成，其pH为7.2。
实施例4
本实施例的一种解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备方法，包括以下步骤：
(1)种子液制备：将实施例2的解淀粉芽孢杆菌BOEN-305接种到种子培养基中，于35℃培养18h，得到种子液；
(2)发酵液制备：将步骤(1)的种子液接种到液体发酵培养基中，接种量为5％，培养温度35℃，风量0.8vvm，搅拌速度180r/min，发酵时间37h，得所述解淀粉芽孢杆菌发酵液。
本实施例的种子培养基包括：蛋白胨5g/L，酵母膏1g/L，葡萄糖16g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸铁0.1g/L。所述种子培养基采用蒸馏水配制而成，其pH为7.2。
本实施例的液体发酵培养基包括：糖蜜15g/L，酵母粉8g/L，氯化钙2.5g/L，无水硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.01g/L，氯化钠2g/L，磷酸氢二钠2g/L，磷酸二氢钾0.04g/L，维生素C0.1g/L。所述液体发酵培养基采用蒸馏水配制而成，其pH为7.3。
实施例5
本实施例的一种解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备方法，包括以下步骤：
(1)种子液制备：将实施例2的解淀粉芽孢杆菌BOEN-305接种到种子培养基中，于40℃培养14h，得到种子液；
(2)发酵液制备：将步骤(1)的种子液接种到液体发酵培养基中，接种量为1％，培养温度40℃，风量1.0vvm，搅拌速度300r/min，发酵时间24h，得所述解淀粉芽孢杆菌发酵液。
本实施例的种子培养基包括：蛋白胨10g/L，酵母膏0.2g/L，葡萄糖25g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸铁0.05g/L。所述种子培养基采用蒸馏水配制而成，其pH为7.5。
本实施例的液体发酵培养基包括：糖蜜25g/L，酵母粉18g/L，氯化钙3.5g/L，无水硫酸镁1g/L，硫酸锰0.5g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钠5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，维生素C0.2g/L。所述液体发酵培养基采用蒸馏水配制而成，其pH为7.5。
实施例6
本实施例采用高效液相色谱串联质谱法检测采用实施例3、实施例4和实施例5的解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备方法制备的解淀粉芽孢杆菌发酵液中5-甲基四氢叶酸的含量。结果如表1所示。
表1
实施例7
本实施例对实施例2的解淀粉芽孢杆菌BOEN-305的遗传稳定性进行验证。
实验方法：将实施例2的解淀粉芽孢杆菌BOEN-305菌株培养连续传代7次，分别检验每次传代后解淀粉芽孢杆菌BOEN-305产5-甲基四氢叶酸的能力，以传代后解淀粉芽孢杆菌BOEN-305产5-甲基四氢叶酸的含量作为该菌株的遗传稳定性的指标。结果如表2所示。
表2
由表2可知，解淀粉芽孢杆菌BOEN-305菌株培养连续传代7次，其产生的5-甲基四氢叶酸含量仍达到1.2ug/mL以上，表明该菌株具有较好的遗传稳定性。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 播恩集团股份有限公司、佛山播恩生物科技有限公司
<120> 一种高产5-甲基四氢叶酸的解淀粉芽孢杆菌及其应用
<130> 2021.11.19
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1139
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BOEN-305
<400> 1
actgaagacc acggtctcag actccgtacc ggaggcagca gtagggatct cgcaatgacg 60
gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt 120
tgttagggaa gaacaagtgc cgttcaaata gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa 180
agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg 240
aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc 300
tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt 360
ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct 420
ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct 480
ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct 540
gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg 600
aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga 660
accttaccag gtcttgacat cctctgacaa tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc 720
agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc 780
cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac 840
tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc 900
tgggctacac acgtgctaca atggacagaa caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc 960
aatcccacaa atctgttctc agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg 1020
aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gcaccctgga tctagtgcca 1080
gcattcactg gcactcgaag gtgactgcgg tggacaaccg aggaagtgtg aggacggtc 1139
Claims (10)
1.一种高产5-甲基四氢叶酸的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述高产5-甲基四氢叶酸的解淀粉芽孢杆菌命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BOEN-305，已于2021年11月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.62024。
2.根据权利要求1所述高产5-甲基四氢叶酸的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌BOEN-305的序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述高产5-甲基四氢叶酸的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌BOEN-305分离自蔬菜种植基地土壤。
4.根据权利要求1～3任一项所述的高产5-甲基四氢叶酸的解淀粉芽孢杆菌在制备含5-甲基四氢叶酸的产品中的应用。
5.一种解淀粉芽孢杆菌发酵液，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌发酵液由权利要求1～3任一项所述高产5-甲基四氢叶酸的解淀粉芽孢杆菌经液体发酵制备得到。
6.根据权利要求5所述的解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)种子液制备：将解淀粉芽孢杆菌BOEN-305接种到种子培养基中，于30℃～40℃培养14～20h，得到种子液；
(2)发酵液制备：将步骤(1)的种子液接种到液体发酵培养基中，接种量为1％～7％，培养温度30℃～40℃，风量0.5～1.0vvm，搅拌速度150～300r/min，发酵时间24～48h，得所述解淀粉芽孢杆菌发酵液。
7.根据权利要求6所述的解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备方法，其特征在于，所述种子培养基包括：蛋白胨3～10g/L，酵母膏0.2～1.5g/L，葡萄糖8～25g/L，硫酸镁0.05～0.5g/L，硫酸铁0.05～0.15g/L。
8.根据权利要求6所述的解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备方法，其特征在于，所述液体发酵培养基包括：糖蜜12～25g/L，酵母粉5～18g/L，氯化钙1.2～3.5g/L，无水硫酸镁0.1～1g/L，硫酸锰0.01～0.5g/L，氯化钠2～5g/L，磷酸氢二钠0.1～5g/L，磷酸二氢钾0.01～0.5g/L，维生素C 0.05～0.2g/L。
9.根据权利要求6所述的解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备方法，其特征在于，所述种子培养基和液体发酵培养基均采用蒸馏水配制而成；所述种子培养基的pH为7.0～7.5；所述液体发酵培养基的pH为7.2～7.5。
10.根据权利要求5所述的解淀粉芽孢杆菌发酵液或权利要求6～9任一项所述的解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备方法制备的解淀粉芽孢杆菌发酵液在制备含5-甲基四氢叶酸的产品中的应用。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN114698729A (zh) * | 2022-03-30 | 2022-07-05 | 播恩集团股份有限公司 | 一种含5-甲基四氢叶酸的微生态制剂及其制备方法和应用 |
| CN114698729B (zh) * | 2022-03-30 | 2023-01-10 | 播恩集团股份有限公司 | 一种含5-甲基四氢叶酸的微生态制剂及其制备方法和应用 |
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| CN114015607B (zh) | 2022-11-15 |
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