KR0137360B1 - 인플루엔자 백신과 새로운 보조제 - Google Patents

인플루엔자 백신과 새로운 보조제

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KR0137360B1
KR0137360B1 KR1019900700839A KR900700839A KR0137360B1 KR 0137360 B1 KR0137360 B1 KR 0137360B1 KR 1019900700839 A KR1019900700839 A KR 1019900700839A KR 900700839 A KR900700839 A KR 900700839A KR 0137360 B1 KR0137360 B1 KR 0137360B1
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마르시아 씨 포페스쿠
마리 에쓰. 레신
레오나드 에프. 에스티스
린 디. 케예스
카알 알. 어빙
앤드류 에쓰. 자노프
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알렌 부룸
더 리포좀 캄파니 인코포레이티드
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Abstract

내용없음

Description

인플루엔자 백신과 새로운 보조제
본 발명은 백신기술에서 면역화 분량으로 존재하는 리포좀과 인풀루엔자 항원 특히, 적혈구 응집소나 브로멜라인 성분을 포함하는 인플루엔자 면역제형에 관한 것이다. 덧붙여서, 면역반응을 일으키는 제형으로서 면역화 분량으로 존재하는 스테롤의 유기산 유도체의 염형성물과 항원을 포함하는 체형과 사용방법에 관한 것이다.
더욱이. 면역반응을 일으키는 제형으로서 임으로 수산화알루미늄겔속에 면역화 분량으로 존재하는 디미리스토일포수파티딜콜린(DMPC)/콜레스테롤 리포좀과 항원을 포함하여된 제형과 그 사용방법에 관한 것이다.
백신기술에 항원에 유기체에 삽입하는 것은 숙주유기체에 면역반응을 촉진시키기 위한 것이다. 면역반응 유도는 화학조성물과 또한 항원구조, 대상유기체의 면역학적 구성, 또한 항원투여 방식과 시간 등의 여러요인에 따라 변한다. 면역반응은 면역계 세포에 의해 표현되는 다양한 양상이 포함된다. (즉, B-임파세포, T-임파세포, 거대파지 또는 혈장세포등). 면역계세포는 항원과 상호작용 다른 면역계 세포와의 상호작용, 사이토킨 방출과 또한 사이토킨에 대한 반응도 등을 통하여 면역반응에 관여한다. 면역방응은 두가지 주요범주-체액 및 세포-중개으로 분리하는 것이 편리하다.(그러나, 임의적으로), 면역반응의 체액성분은 항운에 대한 면역글로부린 특이성의 생성물을 포함한다. 세포-중개성분은 항원에 대한 지연형 과민성과 세포독성 주효세포의 발생을 포함한다.
어떤 경우의 면역반응은 초기량 또는 촉진량의 항원투여 결과 이며 그후 항원에 대해 1회이상 노출된다. 비교적 강한 면역원과 리포좀을 함유한 촉진제에 대해 발표한다. (Liposomal Emhancement of the Immunogenicity of Ademovirus Type 5 Hexon and Fiber Vaccines', Kramp, W.J. et al., Infection and Immunity, 25:771-773 (1979) 또한 Liposomes ad Adjuvants with Immunopurfied Tetanus Toxoid: the Immune Response, Davis, D. et al., Immunology Letters, 14:341-8(1986/1987).
이론상으로 항원은 두가지 특성, 즉 상응하는 항체형성을 자극하는 능력과 항체에 대하여 특별히 반응하는 성향을 본인다. 면역원은 항체 혹은 면역글로부린의 결합위에서 인지할 수 있는 최소 부분의 항원인 하나이상의 에피토프에 대하여 내성이 있다.
특별한 경우의 항원 혹은 항원성분이나 또는 특별한 조건에서, 원하는 항원에 의해 촉진된 면역반응은 부적당하거나 발생하지 않으며 불충분한 면역성을 일으킨다. 이것은 특별히 향원으로서 펩티드나 다른 소형분자를 사용하는 경우이다.
어떤 경우에 있어서 백신기술은 항원과 결합하여 사용될 때 면역을 증진시키는 보조제인 물질의 사용도 인정한다. 보조제는 면역반응을 더 신속히, 또는 더 큰 면역반응을 또는 더 적은 항원에 대해서도 면역반응을 유도할 수 있으며 또는 면역학적으로 보호능력이 있는 항체아강의 생성을 증가시키고, 또는 면역방응성분의(즉, 체액의, 세포의)질을 향상시킨다.
잘알려진 보조제는 Freunds 보조제(또한 다른 오일 유탁액), 보르테멜라 페르투시스, 알루미늄염(또한 다른 금속염), 미코박테리아 미코박테리아 생성물(무라밀 디펩티드 포함) 또한 리포좀등을 포함한다. 여기서의 보조제는 항원과 함께 또한 결합한 형태로 텨되어 항원에 대한 면역반응을 증가시키는 물질을 뜻한다. 보조제는 유탁액(즉 Freund's보조제), 겔(수산화알루미늄겔) 또한 입자(리포좀)나 고형물질을 포함한 다수의 제형이다. 리포좀 백신과 보조제에 대해 발표하였다.(미국 특허원[Docket TLC-172], Popescu).
보조활성에 대해 다수의 요인의 영향을 끼친다. 이러한 요인으로서 (a)담체효과, (b)침전형성, (c)변형 임파세포 재순환 (d) T-임파세포의 자극, (e) B-임파세포의 직접자극 또한 (f) 거대파지의 자극등이 있다.
보조제를 사용하는 여러경우에서 역반응이 관찰된다. 어떤 경우의 역반응은 주입위치에서의 그라뉼로마(granuloma)형성, 주입위치의 심한염증, 보조제 유발관절염이나 다른 자가면역반응, 혹은 온코겐 반응 등을 포함한다. 이러한 반응 때문에 Freund's 보조제같은 보조제 이용에 지장이 있다.
구체예에서의 보조제는 리포좀을 포함한다. 특정한 물질을 체온 리포좀이 보조제로서 발표되었다(U.S.Patent No. 4,053,585 issued October17, 1977 to Allison et al.,) DMPC/콜레스테롤리포좀(1:1)과 또한 항원으로서 파상풍 변성독소와 함께 명확한 탈수/재수화 반응형의 소형 단일박막 소포에 대해 유리항원보다 약간더 향상된 면역학적 반응을 제공하는 강력한 면역원을 발표한다(Davis, D, et,. Liposomes as Adjuvants with Immunopurified Tetanus Toxoid; Influence of Liposomal Characteristics, Immunology, 61:229-234(1987) 또한 Gregoriadis, G. et al., Liposomes as Immunological Adjuvants: Antigen Incorporation Studies Vaccine, 5:145-151(1987)참조). 데이비스와 그레고리아디스의 논문에서, 리포좀 면역학적 반응은 유리항원의 반응과 차이점이 근소하다. 리포좀의 반응과 유리항원의 반응을 구별하기 위해서는 파상풍 변성독소룰 최소반응량으로 희석해야만 한다. 발명은 치료학상으로 효과적인 면역학적 반응을 일으키는 DMPC/콜레스테롤 리포좀의 조건을 택한다.
면역조절제 같은 다른분질(즉, 인터레우킨 같은 사이토킨)을 보조제/백신에 대해 결합시킬 수 있다.
체액 면역반응은 다른 공지방법에 따라 측정할 수 있다. 단방사 면역확산분석법(SRID), 효소 면역분석(EIA)또한 적혈구응집억제분석(HAI)등은 통상의 체액 면역반응분석법의 소수에 불과하다.
SRID는 실험할 면역원을 포함한 아가로스처럼 겔층을 활용한다. 겔에서 벽을 절단하고 검사할 혈정을 벽속에 넣는다. 겔속으로 들어가는 항체의 확산 때문에 검사혈청속의 항체농도에 비례하는 면적으로된 침전고리가 형성된다.
EIA또한 ELISA( 효소 결합 면역분석)으로도 알려진 분석법을 사용하여 표본속에 있는 총항체수를 측정한다. 항원은 마이크로타이터 판의 표면에 흡착된다. 검사혈청을 판에 노출하고 그위에 효소결합 면역글로부린 IgG를 올려놓는다. 판에 부착된 효소의 활성은 분광광도계 같은 편리한 수단으로 정량화하며 이것은 검사용 표본에 들어있는 항원에 대항하는 항체농도와 비례한다.
HAI는 닭의 적혈세포(이와 유사한 것)를 응집하는 바이러스 단백질 같은 항원의 능력을 이용한다. 이 분석법에서 중화항체 즉, 적혈구 응집반응을 억제할 수 있는 항체를 감지한다. 검사 혈청 희석액을 표준농도의 항원으로 배양하고 여기에 적혈세포를 첨가한다. 중화항체가 존재하면 항원에 의한 적혈세포 응집반응이 억제될 것이다.
알레르기성 또한 세포성 면역반응을 측정하는 실험법에는 지연성 과민성 측정이나 혹은 목표항원에 대한 임파세포의 증식반응 측정도 포함된다.
리포좀은 함입된 수성부피를 포함한 지질 이중층막과 아주 유사하다. 리포좀은 단일박막 소포(단일 이중층막을 포함한) 혹은 다중박막 소포(각각 수성층에 의해 분리되어 있는 다중막 이증층을 특징으로 하는 양파형구조)이다. 이중층은 소수성 꼬리 부분과 친수성머리 부분으로된 두 개의 지질단층으로 구성된다. 막이증층 구조는 이중층 중심을 향하는 지질단층의 소수(무극성) 꼬리와 반면에 수성상을 향하는 친수성 머리로 된 것이다.
최초의 리포좀 조제물(Banghan, et al. J. Mol. Biol., 1965, 12:238-252)은 유기용매에 인지질을 현탁하고 증발시켜 반응용기에 건조된 인지질막이 남아있도록한 것이다. 그후, 적당량의 수성상을 첨가하여 이 혼합물이 부풀게하고 그결과로 나온 다중박막 소포(MLVs)로된 리포좀을 기계적 수단으로 분산한다. 이 기술은 소형 음파파쇄 단일박막소포(Papahadjopoulos et al, Biochim. Biophys. Acta., 1968, 135:624-638)와 또한 대형 단일박막 소포 개발의 기초를 제공한다.
단일박막 소포는 압출장치를 사용하여 제조한다(Cullis et al., PCT Application No. WO 87/00238, Published January 16, 1986, Extrusion Technique for Producing Unilamellar Vesicles참조). 이 방법으로 제조된 LUVET를 막필텅에 대하여 1회 혹은 여러번 가압 압출한다. LUVET는 단일박막소포를 함축한다.
다중박막 리포좀의 또다른 종류는 박막용질 분포를 포함하는 것으로 특징지어진 것 들이다. 이 리포좀 안정화 복수 박막소포(SPLV)(U.S. Patent No. 4,522,803 to Lenk, et al.,), 단상소포(U.S. Patent No. 4,588,578 to Fountain et al.,) 또한 소포가 최소한 1회의 냉동해빙 사이클에 노출된 냉동해빙 다중박막소포(FATMLV)(Bally et al., PCT Publication No. 87/00043, January 15, 1987, Multilamellar Liposomes Having Improved Trapping Efficiencies 참조)로 명명한다. 다양하게 이용되는 스테로이드성 리포좀도 발표한다(U.S. Patent No. 4,721,612 to Jenoff et al.). 이러한 문헌에서 리포좀 제조 및 사용법을 설명한다.
본 발명의 한측면에서 면역화 분량으로 둘어있는 리포좀과 인풀후엔자 항원으로된 인풀루엔자 면역제형을 포함한다. 한구체에서, 항원은 적혈구 응집성분이나 브로멜라인 성분을 포함하고 있다. 또다른 구체예에서, 리포좀은 스테롤의 유기산 유도체의 염형성물을 함유한다. 주어진 면역제형에서 항원은 리포좀, 바람직하게는 약 1마이크론 직경크기의 다중박막소포속에 함입된다. 특별히 유용한 리포좀은 스테롤의 유기산 유도체의 트리스(히드록시메틸) 아미노메탄염형성물을 포함한다. 또다른 유용한 리포좀은 약 80 내지 20의 DMPC대 약 20 내지 80의 콜레스테롤의 또한 바람직하게는 약 40:60 내지 약 60:40의 몰비율로된 DMPC/콜레스테롤을 포함하고 또한 이 리포좀은 균등한 박막층 용질분포의 다중박막 소포이다.
본 발명은 면역화 분량으로 들어있는 스테롤의 유기산유도체 염형성물과 항원으로된 제형을 포함한다. 한구체에서 제형은 다중박막 소포 특별히는 최소한 1마이크론 크기의 직경으로된 다중박막 소포인 리포좀이다. 어떤 구체예의 항원은 리포좀속에 합입되어 있다.
특별한 구체예에서, 제형은 스테롤의 유기산유도체 염형성물인 트리스(히드록시메틸) 아미노메탄을 포함한다. 다른 구체예에서의 염형성물은 스테롤의 카르복시산 유도체(5개의 탄소원자까지의 지방족 카르복시산), 스테롤의 디카르복시산 유도체(특히 7개의 탄소원자까지의 지방족 디카르복시산), 스테롤의 히드록시산 유도체(서트로산), 스테롤의 아미노산유도체 혹은 스테롤의 폴리아미노산 유도체 염형성물 또는 스테롤의 폴리카르복시산 유도체 혐형성물을 포함한다.
한 구체예의 제형에서 지방족 디카르복시산은 숙시네이트이다.
본 발명의 제형에 대한 구체예에서 면역원은 단백질, 펩티드, 다당류, 핵산, 지질, 당지질, 리포단백질, 리포다당류, 합성펩티드 혹은 박테리아 성분, 바이러스성분, 원생동물 성분, 조직성분 또는 세포성분중에서 선택한다.
특히 항원은 적혈구 응집소, 파라인플루엔자 3(용해물 또한 적혈구 응집체-뉴라민 분해효소) 말라리아 홀씨소체 성분, 간장염(A,B, 또한 무-A/무-B)성분, 메닝고코쿠스성분, HIV성분(모든 변형물) 또한 멜라노마 성분등과 같은 인플루엔자 성분이다.
또한 본 발명의 제형은 사이토킨 같은 면역조절체를 포함한다(즉, 인터페론, 트롬보사이트 유도인자. 모노킨 또한 IL2 같음 림포킨).
본 발명의 한측면에서 동물에게 스테롤의 유기산 유도체와 항원으로된 면역화 분량의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 인체를 포함한 동물의 면역반응 강화방법을 제공한다. 한구체예에서 면역반응 강화방법은 다중박막 소포 특히 약 1마이크론 크기의 직경으로된 다중박막 소포 특히 약 1마이크론 크기의 직경으로된 다중박막 소포같은 리포좀의 사용도 포함한다. 어떤 구체예에서 항원을 리포좀속에 함입시킨다.
특별한 구체예에서, 면역반응 강화방법은 스테롤의 유기산 유도체 염형성물인 트리스(히드록시메틸) 아미노메탄을 포함하는 투약물질을 사용한다. 다른 구체예에서 염형성물은 스테롤의 카르복시산 유도체(특히 5개의 탄소원자까지의 지방족 디카르복시산), 스테롤의 디카르복시산 유도체 염형성물(특히 7개의 탄소원자까지의 지방족 디카르복시산), 스테롤의 히드록시산 유도체(시트르산). 스테롤의 아미노산유도체 혹은 스테롤의 폴리아미노산 유도체 염형성물 또는 스테롤의 폴리카르복시산 유도체의 염형성물이다.
면역반응 강화방법의 한구체예에서 지방족 디카르복시산은 숙시네이트이다.
본 발명의 면역반응 강화방법의 구체예에서, 항원을 단백질, 펩티드, 다당류, 핵산, 지질, 당지질, 리포단백질, 리포다당류, 합성펩티드, 혹은 박테리아, 바이러스, 원생동물, 조직성분 또는 세포 성분중에서 선택한다.
본 발명의 면역반응 강화방법은 또한 사이토킨 같은 면역조절체의 이용도 포함한다.
본 발명의 또다른 구체예는 스테롤의 유기산유도체 염형성물을 포함하는 보조제의 사용으로 인체를 포함한 동물의 면역반응을 강화하는 방법을 설명한다.
특정의 구체예에서, 보조제 이용으로 면역반응을 강화하는 방법은 스테롤의 유기산 유도체 염형성물인 트리스(히드록시메틸) 아미노메탄 혹은 나트륨염을 포함하는 투여물질도 사용한다. 다른 구체예에서의 염형성물은 스테롤의 카르복시산 유도체(특히 5개의 탄소원자까지의 지방족 카르복시산), 스테롤의 디카르복시산 유도체 염형성물(특히 7개의 탄소원자까지의 지방족 디카르복시산), 스테롤의 히드록시산 유도체(시트르산). 스테롤의 아미노산 유도체나 스테롤의 폴리아미노산 유도체 염형성물 또는 스테롤의 폴리카르복시산 유도체 염형성물 등이다.
면역반응 강화방법의 한구체예에서, 지방족 디카르복시산은 숙시 네이트이다.
또한 본 발명의 리포좀 보조제-리포좀류-특히 스테롤의 유기산유도체인 리포좀과 보조제-필수면역원으로된 촉진면역량의 조성물을 동물에게 투여하고 다시 보조량의 보조제-필수면역원 결핍 보조제를 투여하여 면역반응을 강화하여된 단계를 포함하는 인간을 포함한 동물의면역반응 촉진법도 포함한다.
구체예에서, 동물의 면역반응을 촉진하는 방법은 스테롤의 유기산 유도체의 트리스(히드록시메틸) 아미노메탄 혹은 나트륨염 형성물을 사용한다. 보조제 결핍의 면역반응을 일으키지 않은 면역원을 사용하는 촉진방법에 특별히 이 구체예에 포함된다.
동물의 면역반응 촉진방법의 다른 구체예에서, 리포좀은 스테롤의 유기산 유도체(5개의 탄소원자까지의 지방족 카르복시산), 스테롤의 디카르복시산 유도체 염형성물(특히 7개의 탄소원자까지의 지방족 디카르복시산), 또는 스테롤의 히드록시산 유도체(시트르산), 스테롤의 아미노산유도체나 스테롤의 폴리아미노산 유도체 염형성물 또는 스테롤의 폴리카르복시산 유도체의 염형성물이다. 덧붙여서, 특별히 1마이크론 이상의 직경으로 되고 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 포스파티딜세린 혹은 포스파티딜 에탄올아민을 포함하는 SPLV 리포좀 혹은 다중박막 리포좀을 사용한다. 또한 촉진방법의 바람직한 구체예는 최소한 1회 보조량의 보조제-필수 면역원 결핍보조제를 동물에게 투여하여 면역화하는 단계도 포함한다.
본 발명의 또다른 측면은 항원과 또한 스테롤의 유기산 유도체로된 면역화 분량의 조성물을 투여하는 적어도 한부분을 포함하는 치료학적 효과와 면역화 방법단계에 따라 인체를 포함한 동물에게 면역성을 제공하는 방법이다. 한구체예에서, 이 조성물은 최소한 1마이크론 직경으로서 항원이 함입되어 있는 리포좀(다중박막 소포를 포함한)이 바람직하다. 이 방법을 이용할 때 조성물은 스테롤의 유기산 유도체의 트리스(히드록시메틸) 아미노메탄 염형성물이나 혹은 지방족 카르복시산(5개의 탄소원자까지)같은 스테롤의 카르복시산 유도체염형성물 7개의 탄소원자까지의 지방족 디카르복시산 같은 스테롤의 디카르복시산 유도체 염형성물(숙시네이트), 또는 스테롤의 폴리카르복시산 유도체 염형성물 등을 포함한다. 이 방법의 구체예에서, 조성물은 또한 시트르산처럼 스테롤의 히드록시산 유도체 염형성물도 포함한다.
그외에도 본 발명은 면역원과 또한 면역화 분량의 DMPC/콜레스테롤로된 다중박막 리포좀을 포함하는 제형, 특히 한구체예에서는 수산화알루미늄 겔처럼 알루미늄 보조제를 함유하는 제형도 포함한다. 한구체예에서, 제형의 리포좀은 약 80 내지 20의 DMPC 대 약 20 내지 80의 콜레스테롤로된 몰비율, 특히 약 30:70 내지 70:30 또한 바람직하게는 70:30의 몰비율로된 것이다. 특별한 구체예에서, 제형의 다중박막 리포좀은 균등한 용질분포(SPLV)로 되고 또한/또는 최소한 1마이크론 크기의 직경으로되며 또한 특히 70:30 몰비율의 DMPC/콜레스테롤 SPLV이다.
제형의 구체예에서, 항원은 단백질, 펩티드, 다당류, 박테리아성분, 바이러스성분, 원생동물성분, 합성펩티드 혹은 리포다당류중에서 선택한다. 더욱기, 제형은 사이토킨을 함유한 면역조절체도 포함한다. 부가적으로, 제형은 적절한 약제학적 담체도 포함한다.
본 발명의 다른 측면에서, 동물에게 항원과 또한 DMPC/콜레스테롤로된 다중박막 리포좀을 포함하고 더욱더 수산화알루미늄겔처럼 알루미늄 보조제로 포함하는 면역화 분량의 조성물을 투여하여된 인간을 포함한 동물의 면역반응을 강화하는 방법이 포함된다. 한구체화된 방법에서 리포좀은 약 80 내지 20의 DMPC 대 약 20 내지 80의 콜레스테롤로 되며, 또한 특히 30:70 내지 70:30의 몰비율로된다. 특별한 구체예에서 다중박막 리포좀은 균등한 용질분포(즉, SPLV)로 되고 또한/또는 최소한 약 1마이크론 직경크기로 되고 특히 70:30의 몰비율의 DMPC/콜레스테롤 SPLV이다.
이방법의 구체 예에서 항원을 단백질 펩티드 다당류 박테리아 성분 바이러스 성분 원생동물 성분 합성 펩티드 혹은 리포 다당류 중에서 선택한다. 더우기 이방법을 이용할 때 투여물은 사이토킨을 함유한 변역 조절체도 포함한다. 첨가하여 이 제형은 적절한 약제학적 담체도 포함한다.
그 외에도 본 발명에서 DMPC/콜레스테롤로 되고 또한 구체 예에서와 같이 수산화알루미늄겔에서처럼 알루미늄 보조제도 함유하는 리포좀인 보조제를 사용하여 인체를 포함한 동물의 면역반응을 강화하는 방법도 포함된다. 한 구체적 예의 방법에서 리포좀은 약 80내지 20의 DMPC 대 약 20 내지 80의 콜레스테롤로 되고 또한 특히 30:70의 몰비율로 된다. 특별한 구체예에서 다중박막 리포좀은 SPLV이고 또한/또는 최소한 약 1 마이크론 직경크기로 되고 또는 특히 70:30 몰비율의 DMP/콜레스테롤 SPLv이다.
이방법의 구체 예에서 항원을 단백질, 펩티드, 다당류, 박테리아 성분, 바이러스 성분, 원생동물 성분, 합성펩티드 혹을 리포다당류 중에서 선택한다. 더욱이 이방법을 이용할 때 투여물은 사이토킨이 하유된 변역조절체도 포함한다. 첨가하여, 이 제형은 또한 적절한 약제학적 담체도 포함한다.
본 발명의 또다른 구체 예에서 DMPC/콜레스테롤로 된 다중 박막 리포좀인 보조제와 또한 보조-절대 면역원(또한 임의로 수산화알루미늄겔처럼 알루미늄보조제) 으로된 촉진면역량의 조상물을 동물에게 투여하고 다시 보조량의 보조제-필수면역원 결핍보조제를 투여하여 면역반응을 강화시켜서 된 다계를 포함하는 인간을 포함한 동물의 면역반응 촉진법이다.
촉진방법의 특별한 예에서 리포좀은 SPLV 다중박막 소포이고 또한/또는 최소한 약 1마이크론 직경크기이고 바람직하게는 70:30 몰비율의 DMPC/콜렛테롤로 된다. 제형 및 그 제조방법의 특이면역원을 적혈구 응집소, 파라인플루엔자 3(융해물 또한 적혈구 응집소-듀라민 분해효소) 말라리아 홀씨소체성분, 간장염(A,B 또한 무-A/ 무-B)성분, 메닝고코쿠스 성분, HIV성분(모든 변형체) 또한 메라노마 성분등과 같은 인플루엔자 성분들이다.
본 발명의 또다른 구체 예에서 항원과 또한 DMPC/콜레스테롤로 된 다중박막 리포좀을 포함하는 면혁화 분량의 조성물을 투여하는 적어도 한부분 과정이 포함된 치료학적 효과의 면역화 방법에 따라 인체를 포함한 동물에게 면역성을 제고하는 방법도 포함된다. 이 방법의 한 측면에서 조성물은 또한 수산화 알루미늄겔 같은 알루미늄 보조제도 포함한다. 이방법에서 리포좀은 약 80 내지 20의 DMPC 대 약 20 내지 80의 콜레스테롤로 되고 바람직하게는 약 70:30 내지 30:70 또한 가장바람직하게는 약 70:30 의 몰비율로 되고 또한 최소 1마이크론 크기 직경으로서 균등한 용질분포 (즉, SPLV)의 리포좀이다.
동물에게 면역성을 제고하는 방법의 실행에서 항원을 단백질, 펩티드, 다당류, 박테리아 성분, 바이러스 성분, 원생동물 성분, 합성펩티드 또는 리포다당류 중에서 선택한다. 이방법은 또한 사이토킨처럼 면역 조절체도 포함할수 있다. 또한 이 방법은 적절한 약제학적 담체도 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서는 항원과 또한 70:30 ±5 몰비율의 DMPC/콜레스테롤로된 면역화 분량의 리포좀을 함유하는 제형을 포함한다. 이 제형은 또한 수산화 알미늄겔 같은 알루미늄 보조제도 포함한다. 어떤 구체예에서 이것은 최소한 1 마이크론 크기 직경으로된 SPLV같은 다중박막 리포좀이나 혹은 최소한 1마이크론 크기 직경으로된 단일 박막 리포좀이다. 단일 박막 리포좀을 포함하는 제형의 구체예에서 면역원을 단백질, 펩티드, 다당류, 박테리아 성분, 바이러스 성분 , 원생동물 성분 , 합성펩티드나 리포다당류와 또한 적절한 약제학적 담체 중에서 선택한다.
본 발명의 부과적인 측면에서 면역원과 또한 70:30 ±5몰 비율의 DMPC/콜레스테롤의 리포좀을 포함하는 면역화 분량의 조성물을 동물에게 포함하는 단계로된 인체를 포함한 동물의 면역반응 강화 방법도 포함된다.
이 조성물은 또한 수산화아루미늄겔 처럼 알루미늄 보조제도 포함할 수 있다. 이방법의 리포좀은 바람직하게 최소한 약 1마이크론 크기직경으로 된 SPLV와 같은 다중박막 리포좀과 단일박막 리포좀도 포함한다.
구체 예에서 한원을 단백질, 펩티드, 다당류, 박테리아 성분, 바이러스 성분, 원생동물 성분, 합성펩티드 또는 리포다당류 또한 그외에도 사이토킨 같은 면역 조절체와 적절한 약제학적담체 중에서 선택하여 된 단일박막 리포종을 포함한다.
본 발명의 또다른 측면에서 70:30 ±5 몰비율의 DMPC/콜레스테롤인 보조제를 사용하여 된 인체를 포함하는 동물의 면역반응 강화방법도 포함된다. 이 방법은 또한 수산화아루미늄겔처럼 알루미늄보조제도 포함할 수있다. 이 방법에서의 리포좀은 최소한 1마이크론 크기의 직경으로 되며 SPLV같은 다중박막 리포좀과 단일박막 리포좀을 포함한다.
그외에도 또한 본 발명은 동물에게 70:30 ±5 몰비율의DMPC/콜레스테롤로 된 리포좀인 보조제와 또한 보조-절대 면역원을 포함하는 촉진면역화량의 조성물을 투여하고 다시 보조량의 보조제-필수 면역원 결핍보조제를 투여하여 인간을 포함한 동물의 면역 반응을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 또한 수산화알미늄겔에서 처럼 알루미늄 보조제를 포함한다. 이 방법의 리포좀은 바람직하게 최소한 약 1마이크론 크기의 직경으로되고 SPLV 같은 다중박막 리포좀과 또한 단일박막 리포좀을 포함한다.
덧붙혀서 본 발명은 동물에게 항원과 또한 70:30 ±5 몰비율의 DMPC/콜레스테롤로 된 리포좀을 포함하는 면역화 분량의 조성물을 투여하는 최소한 한 부분과정이 포함된 치료학적 효과의 면역화 방법에 따라 인체를 포함한 동물에 대해 면역성을 제공하는 방법도 포함한다. 이 조성물은 또한 수산화알미늄겔 같은 알루미늄 보조제도 포함한다. 이 방법에서의 리포좀은 최소한 약1마이크론 크기직경의 것으로 SPLV 같은 다중박막 리포좀과 단일박막 리포좀도 포함한다. 단일박막 리포좀을 포함하는 구체 예에서 항원을 단백질, 펩티드, 다당류, 박테리아 성분, 바이러스 성분, 원생동물 성분, 합성펩티드 또는 리포단백질과 또한 사이토킨 같은 면역조절체와 적절한 약제학적 담체 중에서 선택한다.
본발명의 보조제는 면역화 분량으로 존재하는 리포좀과 인플루인자 항원으로 된 인프루에자 면역화 제형을 포함한다고 발표한다. 이 인플루엔자 항원은 적혈구 응집소 성분이나 브로멜라인 성분이다.
또한, (Ⅰ) 스테롤의 유기산 유도체 염형성물이 특별한 유용성의 약제학적 보조제 (특히 리포좀의 형태) 이고 또한 (Ⅱ) DMPC/콜레스테롤 리포좀(특히 다중박막 리포좀)도 특별히 유용한 약제학적 보조제(이 보조제가 수산화아루미늄겔인 것이 바람직한)라는 사실도 발표한다. 더욱더, 바람직한 DMPC/콜레스테롤 몰비율이 70:30 ±5인 다중박막 또는 단일박막 리포좀이다.
면역학적으로 정의한 개념의 각종용어는 대체로 그의미가 부정확하며 혹은 잘못 사용되고 있다. 본 발명의 검토과정에서 정확성을 기하기 위하여 다음과 같이 정의한다.
항원은 항체에 의해 특이하게 인지되거나 또한/또는 항체와 결합 하는 기질 또는 물질을 뜻한다.
보조제는 항원과 결합하여 사용될 때 면역반응을 강화하는 기질이나 물질을 뜻한다. 또한 보조제는 면역반응을 신속히 유도하거나 더큰 반응을 유도하고 또는 더적은량의 항원으로도 반응을 일이키기 위해 사용한다. 면역원-필수 보조제는 단독으로는 면역원이 아니지만 보조제와 함께 결합하여 면역원으로 되는 항원을 말한다.
면역원은 단독으로 또는 보조제와 함께 면역반응을 유도할 수 있는 기질 또는 물질을 말한다. 천연 및 합성기질이 면역원이다. 면역원은 대체로 단백질, 펩티드, 다당류, 헥산단백질, 리포단백질, 합성폴리펩티드, 혹은 단백질, 펩티드, 다당류, 헥산단백질, 리포단백질이나 합성 폴리펩티드와 결합된 불완전 항원 또는 그외의 박테리아성분, 바이러스성분 또는 원생동물성분등이다. 또한 면역원은 보조제-필수 면역원인 보조제(즉, 소형 펩티드)와 결합하지 않으면 면역반응을 하지 않는(또는 단지 치료학적으로 무효한 면역반응만 일어나는) 물질을 포함한다고 이해된다.
면역반응은 항원이나 면역원에 대한 동물면역계의 특이반응을 뜻한다. 면역반응은 항체생성도 포함한다.
면역화 조건은 인체를 포함한 대상동물에게 전달되는 면역원이나 보조제의 양과 종류, 전달방법, 접종원수, 접종간격, 대상동물 종류와 그 조건들을 포함하여 면역반응에 영향을 미치는 요인들이다
백신은 면역성을 유발하는 약제학적 제제형이다.
면역성은 감염유기체나 기질에 대한 인간을 포함한 대상동물의 저항상태를 뜻한다. 감염 유기체나 물질은 광범위하게 정의 되고 박테리아와 바이러스 이외에도 기생물질, 독성물질, 종양 및 세포 등을 포함한다. 치료학적 효과의 면역화 과정은 특이 항체 생성으로 나타난 면역반응이나 또는 항원에 대한 면역세포의 반응성에서 전시되는 면역반응을 형성한다.
면역화(투여)분량은 면역반응 촉진하는데 필요한 항원이나 면역원의 양을 뜻한다. 이 양은 각종 보조제의 존재와 효과등에 따라 다양하게 변화한다. 이 양은 동물과 면역원 혹은 항원이나 보조제에 따라 변화하지만 대체로 0.1μg/ml 정도이거나 혹은 1회접종당 약 500μg 이하이다. 면역화 분량은 통4과적으로 유효한 숙주동물 면역화 실행과 같이 또한 첼린지 연구처럼 고지된 기술방법으로 쉽게 측정할 수 있다.(Manual df Clinical Immunology, H.R. Roseand H. Friedman, American SOciety for Microbiology, Washington D.C(1980)참조). 어떤 경우에서, 보조량을 포함한 여러 면역화 분량을 투여하여 면역성을 제공하게 되면 집합적으로 치료학적 효과의 면역화 과정 이라고 명한다.
촉진은 동물의 항원에 대한 1차 (2차 혹은 그 후의 것과 대비되는 )반응의 자극을 뜻한다. 1차반응은 항원에 대한 동물의 항체 생성과 또한 이론상에서 신속하고 실직적인 항체 생성과 함께 2차 혹은 그후의 면역원 챌린지-보조제 결핍된 것 까지도 -에 대응하는 B-임파세포와 T-임파세포 개체군 발생도 특장으로 한다. 면역반응을 기초로 하여 보조제가 결핍된 1,2,3 또는 그 아상의 보조량의 면역원은 항원에 대한 치료학적 효과의 면역반응을 일으킨다.
특별한 구체예에서, 리포종은 유효 전하를 갖거나 중성이다. 하전된 혹은 음성전하의 리포좀은 중성리포좀보다 유세한 효과를 보여준다.
리포좀 재조용 지질의 바람직한 종류는 대체로 음성전하를 띤 역이온으로서의 나트륨(CHS 나트륨)이나 트리스(히드복시메틸 아미노메탄(CHS트리스)이 있는 콜레스테롤 헤미숫시네이트(CHS)이다
스테롤의 유기산 유도체 염형성물을 본 발명의 실행에서 사용한다. 대체로 유기산의 결합에의해 변형될 수 있는 스테롤을 본 발명의 실행에서 사용할 수 있다. 예컨대 스테롤로서 제한적인 것은 아니지만 콜레스테롤, 비타민 D, 피토스테롤(제한적인 것은 아니지만 시토스테롤 캠페스테롤, 스티그마스테롤 등을 포함한), 스테로이드 호르몬 그외의 종류를 포함한다.
스테롤을 유도하기 위한 유기산으로 제한적인 것은 아니지만 카르복시산, 디카르복시산, 포리카르복시산, 히드복시산, 아미노산 또한 폴리아미노산이 포함된다. 염형성물이 유기산의 수용성도를 증가시키므로 임의의 유기산을 사용하여 스테롤을 유도할 수 있다. 한편 유기산 성분자체가 수용성이면 더 유리하다. 이 수용성 유기산성분으로 제한적인 것은 아니지만 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산 및 그외의 것과 같은 수용성 지방족 카르복시산(N.B. 4개까지의 탄산이 물에 용해 가능하며 5-탄소 유리산은 부분적으로 용해 가능하고 또한 긴사슬 유리산은 실질적으로 불용성이다) ; 말론산, 숙신산, 글루타루산, 아디프산, 피멜산, 말레인산, 그외의 것과 같은 숙성 지방족디카르복시산(N.B. 짧은 사슬이 물에 더 잘 용해하며 물솟에서 경계선 용해도는 C7이나C6에서발생한다.); 또한 헤미 멜리트산, 트리메스산, 숙신이미드, 그외의 것과 같은 불용성방향족 디카르복시산; 폴리카르복시산; 글리콜산, 락트산, 만델산, 글리세르산, 말리산, 타르타르산, 시트르산, 그외의 것과 같은 수용성 히드록시산 (N.B. 카르보닐기 알파-탄소에 대해 부착된 측쇄를 포함하는 알파 히드록시산은 다소 가수분해 하기 어려우며 그 결과 본발명의 실행에서 유리하다.); 또한 임의의 아미노산과 폴리아미노산 등이 포함된다.
관례적인 방법에 따라서 유기산은 에스테르나 에테르 결합을 통해 스테롤의 히드록시기와 결합할 수 있다(U.S.Pat, Nos.3,859,047; 4,040,784; 4,042,330; 4,183,874; 또한 4,189,400). 유도된 스테롤의 염형성물은 스테롤 유기산 유도체와 또한 염의 역이온 (즉, 염의 자유염기)을 모두 적절한 휘발성 용매에 용해하고 그후 증발이나 유사기술로 용매를 제거하여 그 결과로 스테롤의 유기산 유도체 염형성물로 된 잔유물이 남도록 하면 여기서 유도된 스테롤의 염형성물을 제조할 수 있다. 역 이온으로서 제한적인 것은 아니지만 , 트리스, 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올, 2-아미노에탄올, 비스-트리스 프로판, 트리에탄올아민, 또한 그 외의 상응하는 염을 형성 할 수 있는 것도 포함 된다. 실제로 미코나졸 유리염기 같은 이온화 생리 활성제의 유리염기 등을 역이온으로 사용한다.
수성물질에 더할 때 CHS가 리포좀을 형성한다. 이것은 20 ℃ 내지 25 ℃ (실온) 과 대기압 하에서 실시하는 것이 편리하다. 교반하여 리포좀 형성 과정을 가속화 하고 또한 이것은 소용돌이 교반, 음파파쇄 혹은 그외의 공지 방법에 따라 실행된다. 원한다면 결과로 나온 리포좀을 여과하거나 혹은 0.4 혹은 0.2μm필터처럼 필테스택을 통과시켜 크기분리 한다.정상적으로 지질의 양이 증가하면 더 우수한 보조 반응을 관측할 수 있다.
CHS 리포좀 속의 멜라노바 항원처럼 리포좀 박막층 속에 분할하여 들어간 면역원은 반복 접종하고 또한 부가적으로 면역 촉진제가 들에 있어야만 충분한 면역반응을 일으킬 수 있다. 특별한 이론을 기초로 하지 않아도 이 분할 작용결과 보조 리포좀에 대해 외부적으로 에피토프를 노출하는 것이 제한된다. 면역원은 아미노산 첨가나 제거 혹은 다른성분과의 접합등과 같이 다수의 고지 방법에 따라 변형시킬 수있다.
리포좀 형성을 의한 바람직한 지질 종류는 디미리스토일포스파티딜 콜린과 콜레스테롤로 된 것이다(DMPC/콜레스테롤)
DMPC콜레스테롤은 약 100:1 내지 20:80의 몰비율 까지의 광범위한 비율로 된 원하는 다중박막 리포좀을 만든다. 더 바람직한 것은 약 70:30 내지 약 30:70 이며 더욱 바람직한 것은 70:30의 몰비율이다. 부과적으로 다른 지질은 예컨대 디미리스토일포스파티딜글리세롤, 디세틸 포스페이트, 포스파티드산, 포스파티딜에탄올아민 , 포스파티딜콜린 또한 역이온으로서 나트륨(CHS나트륨)이나 트리스(히드록사메틸) 아미노 메탄(CHS트리스)를 함유한 콜레스테롤 헤미숙시네이트(CHS)와 같이 DMPC/콜레스테롤과 함께 혼합할 수도 있다.
알루미늄화합물은 공지된 보조물이며 수산화 알루미늄, 인산알루미늄, 산화알루미늄, 또는 황산 알루미늄 등을 포함하고 또한 이것을 집합적으로 알루미늄 보조제라고 한다. 예컨대 수산화알루미늄은 수의학 응용과 함께 디프테리아와 또한 파상풍 독소 백신에 광범위하게 이용된다. 수산화 알루미늄 분말은 수화과정에서 자발적으로 겔을 형성한다. 수산화 알루미늄을 함유한 백신의 제조에 있어서 수성 왼충용액에 들어 있는 면역원을 이미 형성된 겔에 더한다. 이 백신은 알루미늄-흡착된 것으로 간주한다.
SPLV공정의 DMPC/콜레스테롤 다중박막 리포좀이 바람직하지만 다른 종류의 리포좀도 사용할 수 있다. SPLV공정은 대체로 둥근 바닥 플라스크에 있는 용매에 지질을 녹이고 회전 증발시켜 박막을 형성하는 것이 수반된다. 지질막은 그후 에테르나 염화메틸렌처럼 무-수혼합성 용매에 분산하고 수성용질(면역원 함유)을 여기에 더한다. 혼합물을 음파파쇄 하는 동안 질소기체 흐름하에서 유기용매를 제거하여 건조시킨다.(U.S. Patent No. 4,522,803 to Lenk, et al. 참조)원한다면 결과로 나온 리포좀을 여과하거나 혹은 0.4 또는 0.2μm필터처럼 필터스택을 통과시켜 크기분리한다.(Nucleopore, Pleasanton, CA).
이 결과적인 리포좀을 수성물질 속에서 투여하는 것이 바람직하다. 수성물질의 부피는 투여할 특정한 리포좀에 따라 다르고 중요한 것은 아니다. 대체로 약 0.5ml면 적당한 리포좀 투여부피이다. 정상적으로 지질의 양이 증가하면 더 우수한 보조반응을 관측할 수 있다.
스테롤이나 DMPC/콜레스테롤 리포좀을 위해 적당한 수성물질은 염수 용액, 인산완충액 또는 다른 공지된 수성 약제학적 희석제이다.
이 리포좀은 면역화 분량의 항원 또는 면역원과 결합시키는 것이 편리한다. 이 결합관계는 혼합, 흡착, 캡슐화, 공동-형성 또는 그외의 고지방법에 따라 이루어진다.
본 발명의 보조제 효과는 스테롤 리포좀에대한 표1,2,3의 결과와 또한 DMPC/콜레스테롤 리포좀에 대한 표4,5,6의 결과 또한 스테롤 및 DMPC/콜레스테롤 리포좀 모두에 대한 표 7의 결과에서 보여 준다. 표1A는 인플루엔자B/앤 아보 적혈구 응집소(HA)를 단독으로 혹은 CHS트리스 리포좀을 함유한 제제형으로서 면역화 시킨 기니아픽에 대한 항체 반응을 서로 비교하였다. HA는 보조제 없이 항체 반응의 특별한 레벨을 유도 하였으나 이 반응은 보조제에 의해 강화된다. CHS 트리스 리포좀은 이 항체 생성을 촉진하기 위한 결과로부터 관찰된다. 특별히 5 또는 0.5μg의 HA에 대해서 HAI에서 감지된 중화항체 반응은 HA가 스테로이드성 보조제와 함께 투여 될 때 각각 50배와 70배까지 증가한다.
표1B는 각종 제제형속에 있는 HA(HAB) 의 브로메라인 성분으로 면역화 시킨 기니아픽의 항체 반응을 보여준다. HAB는 대체로 단독으로 투여된 경우 비-면역성이며 보조제-필수면역원의 전형이다. CHS형 스테로이드성 보조제 사용으로 완전 Freund's 보조제와 돋응한 혹은 더 우수한 면역반응을 증가시키고 특히 HAI에서 감지한 것같이 보호 중화항체를 생성한다. 이 증분은 약 1400배이다. 더욱이, 보조제의 양이 증가하면 면역반응도 증가한다.
표2는 면역반응 생성을 촉진시키는 중용성을 보여준다. HAB에서는 2차 챌린지에서 특히 본 발명의 보조제를 사용한 경우에도 크게 강화되지 않은 약한 면역반응이 일어나는 것으로 나타난다. 그러나 HAB를 본 발명의 보조제와 결합하여 여기에서는 CHS트리스 리포좀 형태로 투여한 경우에서, 큰 면역반응이 특히 용액 속의 HAB를 2차 접종한 결과로 발생한다. 본 발명의 중요한 측면에서 면역화 분량의 보조제-필수 면역원과 보조제를 투여한 대상동물의 촉진작용은 보조량을 사용함으로써 큰 효과가 있으며 한편 이 보조투약물에는 보조제 없이 단순한 보조제-필수 면역원 용액만을 함유하고 있다. 본발명의 보조제를 사용한 면역반응은 촉진에따라 보조제가 없는 보조제-필수 면역원을 또는 이 면역원을 보조제와 함께 공동투여 하여야만 면역반응이 초기 발생하는 경우까지도 보조적으로 투여할 수 있다.
이 구체 예에서 보조제-필수 면역원과 함께 사용하기 위해 스테로이드성 리포좀 뿐만이 아니라 다른 리포좀도 촉진용 보조제로 사용할 수 있음을 기억해 둔다.
표3은 항원을 보조 리포좀과 단순 혼합하지 않고 본 발명의 보조리포좀 속에 함입시켰을 때 더 우수한 결과를 수득하였음을 발표한다. 이것은 특히 촉진반응을 고려할 때 사실로 나타난다. 표2와 함께 연관시켜 표3을 검토하면 함입직용이 2차반응의 강화제 보다도 더 나은 촉진반응의 강화제 임을 알 수 있다. 표3은 또한 트리스에서 나티륨으로의 염조성물 변화가 CHS 리포좀에서의 보조제 효력을 변화시키지 않는 것도 보여준다.
표4는 각종 제형 속의 인프루엔자B/엔 아보 적혈구 응집소의 브로멜라인 성분으로 면역화시킨 기니아 픽의 항체 반응을 비교하였다. HAB는 단독으로 거의 면역성이 없으므로 보조제-필수면역원이라고 한다. 면역원 생성도는 NAB가 여러 몰비율 및 지질농도의 DMPC/콜레스테롤 SPLV속에 함입될 경우 크게 증가한다. EIA에 의해 감지된 총 항-HA IgG 반응은 5,000배까지 증가하며 또한 HAI에 의해 감지된 보호중화 항체는 HAB가 각각 30:70 및 70:30 몰비율의 DMPC/콜레스테롤 SPLV에 투여될 때 6 주째에서 35배까지 증가한다. 지질종도 증가에 따라 또한 50:50 몰비율의 제제형에서 나타난 보조제 효과도 증가한다.
표5는 인플루엔자B/앤 아보 적혈구 웅집소에서 DMPC/콜레스테롤 SPLV(70:30 몰비율)의 보조효과를 보여준다. 유리형태로 투여된 HA는 5μg으로 투여될때는 저항제 역가(titer)를 유도한다. 이두가지 투여 분량의 리포좀HA는 유리 HA보다 약 80 배 까지의 증가된 반응을 일으킨다.
표6은 DMPC/콜레스테롤 SPLV와 수산화 알루미늄겔의 보조효과를 보여준다. 표6에서 보는바와 같이 (실례1), DMPC/콜레스테롤 리포좀(200mg=출발지질농도)과 함께 HAB를 투여하면 HAB단독으로 투여한 것보다 100배까지 증가된 강한 항-HA IgG 반응과 또한 10배까지 증가된 HAI(중화)항체 역가를 생성한다. 출발지질 농도를 500mg까지 증가시키면 보호효과도 커진다.(각각 500배와 30배까지). 동일한 제제형을 수산화알미늄겔과 함께 투여할 경우 역가도 3배까지 증가한다. 리포좀 및 수산화알루미뉴과 결합한 보조제의 효과가 명확히 증명되었다.(표6, 실례2). 첫 번째 실례에서 리포좀 HAB는 항체반응을 유리 HAB의 약 200배까지 증가시킨다.(5μg분량). 수산화알루미늄겔 투여는 역가를 5배로 증가시킨다. 수산화 알루미늄과 함께 투여한 0.5μ 분량의 리포좀 HAB이 5μg리포좀 HAB와 균등한 반응을 나타낼 때 가장 확실하게 관찰할 수 있다.
표7은 세제와 함께 인플루에자 바이러스를 분할한 후 예방 접종에 사용하는 HA에서 나온 결과를 보여준다. 표7의 결과는 CHS트리스 리포좀 속의 5mg HA가 13.5 또는 1.9mg 지질속에 함입된것에 관계없이 강한 보조효과를 유도함을 보여준다. 같은결과를 DMPC/콜레스테롤 제제형의 경우에도 관측할 수 있다.
더우기 1:10의 CHS트리스 제제형의 희석액(0.5 mg HA)도 6.5 또는 5 mg HA에서의 무-함입 항원 대조부 보다.여러배의 높은 역가를 형성한다.
결과를 종합하면 제제형의 지질함량 감소가 리포좀의 보조효과에 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.
알루미늄 보조제는 잘 알려진 형태와 비율로 사용한다. 시판용 수산화 알루미늄겔은 약 1ml의 알루미늄당 0.2 내지 1mg의 파상풍 독소 같은 백신을 포함한다. 안장된 상부범위는 1회복용당 15mg이상의 수산화알루미늄을 함유하고 있는 인체용 백신으로서 다소 높지만 수의용으로 사용하는데에는 제한이 없다.
백신은 제형으로 투여하는 것이 바람직 하다. 제형은 피하주사, 경구용, 근육주사 및 안구투여와 같이 백신을 투여하고 또한 이백신을 희석형태, 합성형태 또는 보조제와 임의로 사이토킨 같은 면역조절체와 함께 부분형성물로서 생체에 활용하기 위한 약제학적 형태를 일컫는다. 전술한 성분의 결합물을 제조하여 이 제형이 인체를 포함한 대상동물에게 가능한 한 용이하고 효과적으로 면역반응을 일으킬 수 있도록 한다.
본 발명의 방법을 사용한 결과로 나온 리포좀 재형을 포함한 제형이 인간을 포함하여 포유동물 같은 동물에 대하여 생리작용 형태로 면역원을 전달할 필요가 있는 감염 혹은 그러한 상태의 치료를 위해 이용될 수 있다. 이러한 상태조건으로 제한적인 것은 아니지만 백신으로 치료 가능한 모든 질병상태를 말한다. 면역반응 조직의 외용적 치료 역시 고려할 수 있다.
제형으로서 포함될 수 잇는 알루미늄겔, 액체결정, 분체, 침전물 및 용액처럼 겔 속으로 주입할 보조제와 함께 교질 입자형 보조제도 가능하다. 특별한 구체 예에서 제형은 1회 투여용으로 구성 및 선택된 단일제형일 수 있다.
제형투여 방식은 제형이 전달될 유기체의 위치 및 세포를 측정한다. 본 발명의 리포좀 제형을 포함한 제형은 단독으로 투여할 수 있으나 일반적으로 투여 예상경로와 표준 약제적 실행에 따라 선택된 약제학적 담체와 함께 혼합하여 투여한다. 제형은 예컨대 근육주사 혹은 피하주사와 같이 비경구적으로 주입한다. 제형은 또한 경구로 투여할 수도 있다. 비경구적 투여에서 이들은 예컨대 다른 용질 특히 용액을 등장성으로 만들기위한 충분한 양의 염이나 글루코우스를 함유하는 멸균 수성 용액 형태로 사용할 수 있다. 조제물의 구체적 특성에 따라 다른 그외의 사용법을 숙련 기술자라면 예상할 수 있다.
백신 치료할 질병 상태의 예방 혹은 치료를 위해 인체에 투약할 때 결국은 담당 의사가 환자에게 적절한 치료적 효과의 재형 투여량을 결정할 것이고 이것은 아니, 체중, 또한 환자의 질화의 성격과 심각성 및 개인적인 반응 정도에 따라 달라질 수 있다. 리포좀 제형 속의 항원 분량은 대체로 사용된 유리항원 보다는 적거나 혹은 균등하다. 그러나 어떤 경우에서 이 한정 값 이외의 투여량을 사용해야 할 때도 있다.
항원을 포함하는 보조리모좀의 제조
50mg CHS트리스(분체형)를 15ml 시험관에 넣는다. 수성완충용액에 녹인 HA의 100μ1의브로멜라인 단편을 첨가 한다.(673μg HAB, 0.9% NaCl(중량%)에 넣은 0.01M 인산 완충염수). 혼합물을 22.5℃±2.5℃ 에서 2시간 동안 간헐적으로 휘젓고 큰 응집물이 보이지 않을 때까지 놓아둔다. 그 결과로 나온 리포좀을 10ml수성 완충 용액에서 2회 세척하고 1회 세척할 때마다 15분간의 원심분리 (10,000rpm, J-20로터(Beckman, Palo Alto, CA)로 용액을 분리시킨다. 생성된 펠릿을 완충액과 함께 40ml로 만들고 질소하에서 갈색 유리병에 담아 밀폐한다.
실시예2
항원을 포함하는 보조리모좀의 제조
500mg CHS트리스(분체형)를 15ml 시험관에 넣는다. 수성완충용액에 녹인 1ml HA를 첨가한다.(300μg HA, 0.9% NaCl내의 0.01M인산 완충염수). 혼합물을 22.5℃±2.5℃ 에서 2시간 동안 휘젓는다. 그 결과로 생긴 리포좀을 10ml수성 완충 용액에서 3회 세척하고각 회마다 3회 세척하고 각회마다 15분간의 원심분리 (10,000rpm, J-20로터(Beckman, Palo Alto, (A)로 용액을 분리한다. 생성된 펠릿을 완충액과 함께4.0ml로 만들고 질소하에서 갈색 유리병에 담아 밀폐한다.
실시예3
항원을 포함하는 보조 리포좀의 제조
500mg CHS트리스(분체형)를 15ml 시험관에 넣는다. 수성완충용액에 녹인 2ml HA의 브로멜라인 단편을 첨가한다. 673μg HAB, 0.9% NaCl에 녹인 0.01M 인산 완충염수. 혼합물을 22.5℃±2.5℃ 에서 2시간 동안 간헐적으로 휘젓는다. 그 결과로 나온 리포좀을 10ml수성 완충 용액에서 3회 세척하고 각회마다 15분간의 원심분리 (10,000rpm, J-20로터)로 용액을 분리한다. 생성된 펠릿을 완충액과 함께 4.0ml로 만들고 질소하에서 갈색 유리병에 담아 밀폐한다.
실시예4
항원을 포함하는 보조리모좀의 제조
500mg CHS트리스(분체형)를 15ml 시험관에 넣는다. 수성완충용액에 녹인 2ml HA의 브로멜라인 단편을 첨가한다. (1,100μg HAB, 0.9% NaCl) 혼합물을 22.5℃±2.5℃ 에서 2시간 동안 간헐적으로 휘젓는다. 그 결과로 나온 리포좀을 10ml의 0.9% NaCl용액에서 3회 세척하고 각회마다 15분간의 원심분리 (10,000rpm, J-20로터)로 용액을 분리시킨다. 생성된 펠릿을 완충액과 함께 4.0ml로 만들고 질소하에서 갈색 유리병에 담아 밀폐한다.
실시예5
항원을 포함하는 보조리모좀의 제조
1500mg CHS트리스(분체형)를 15ml 시험관에 넣는다. 수성완충용액에 녹인 3ml HA의 브로멜라인 단편을 첨가한다. 673μg HAB, 0.9% NaCl에 녹인 0.01M인산완충염수 혼합물을 22.5℃±2.5℃ 에서 2시간 동안 간헐적으로 휘젓는다. 그 결과로 나온 리포좀을 10ml의 수성완충액에서 3회 세척하고 각회마다 15분간의 원심분리로 (10,000rpm, J-20로터)로 용액을 분리시킨다. 생성된 펠릿을 완충액과 함께 4.0ml로 만들고 질소하에서 갈색 유리병에 담아 밀폐한다.
실시예6
항원을 포함하는 보조리모좀의 제조
1500mg CHS나트륨(분체형)를 15ml 시험관에 넣는다. 수성완충용액에 녹인 1ml HA의 브로멜라인 단편을 첨가한다. 673μg HAB, 0.9% NaCl에 녹인 0.01M인산완충염수 혼합물을 22.5℃±2.5℃ 에서 2시간 동안 간헐적으로 휘젓는다. 그 결과로 나온 리포좀을 10ml의 수성완충액에서 3회 세척하고 각회마다 15분간의 원심분리 (10,000rpm, J-20로터)로 용액을 분리시킨다. 생성된 펠릿을 완충액과 함께 4.0ml로 만들고 질소하에서 갈색 유리병에 담아 밀폐한다.
실시예7
보조효력표현
HAB를 함유한 리포좀을 실시 예2와 같이 제조한다. 함입량은 SRID로 측정하고 리포좀을 희석하여 10μg단백질/ml의 농도로 만든 후 마찰 방지제와 함께 유리병에 넣어 밀폐하고 크림프시일한다. 다섯 마리의 450-500g 수컷 하를리 기니아픽(Buckberg Lab Animals, Landis Store, PA)의 오른쪽 뒷다리에 0.5ml 리포좀 현탄액 또는 0.5ml 리포좀 현탁액 또는 0.5ml 유리 HAB를 근육주사 한다(5μg). 4주간의 면역화 후에서 기니아픽을 에테르로 가볍게 마취 시키고 심장을 천자 하여 4ml혈액을 받는다. 실온에서 하루밤이 지나면 혈액이 응고 한다.
혈액을 원심분리하여 혈청을 제거한 후에 4℃에서 저장한다. 출혈 후 하루가 지난후 왼쪽 뒷다리에 다시한번 0.5ml의 유리HAB나 리포좀 HAB를 근육주사 한다. 초기 주사한 뒤 1년 후 같은 방법으로 혈액을 수집한다.
혈청표본에 있는 모든 항-HA IgG 항체를 효소면역분석(EIA)으로 측정하고 또한 중화항체는 적혈구 응집억제분석(HAI)으로 측정한다. 그 결과는 표 1,2 또한 3과 같다.
실시예8
항원을 포함하는 보조 리보좀의 제조
100mg의 콜레스테롤과 400mg의 DMPC를 500ml 둥근바닥 플라스크에 넣고 3ml그로로포름에 현탁한 후 회전 증발법으로 건조시켜 막(film)이 형성되도록 한다. 20ml무수에테르를 플라스크에 첨가하고 다시 수성완충액에 녹인 1.5ml HA을 첨가한다.(915μg HA, 0.9% NaCl에 녹인 0.01M인산 완충염수-수성완충액) 혼합물을 호일로 덮고 40℃ 수조에서 음파파쇄하면서 함편 저속 흐름의 질소기체로 에테르를 병류 증발 시킨다. 그 결과로 나온 지질페이스트를 질소하에서 완전히 건조 시켜 냄세를 맡았을 때 에테르 흔적이 전혀 나타나지 않게 한다. 10ml 수성 완충액을 플라스크에 넣고 리포좀 현탄액은 15ml 시험관에 옮긴다. 생성된 리포좀을 10ml 수성완충용액으로 3회 세척하고 각회마다 10분간의 원심분리로 (10,000rpm, J-20 로터 (Beckman, Palo Alto, CA))용액을 분리한다. 생성된 펠릿은 완충액과 함께 6ml 로 만들고 질소하에서 갈색 유리병에 담아 밀폐한다.
실시예9
항원을 포함하는 보조 리보좀의 제조
100mg의 콜레스테롤과 400mg의 DMPC를 500ml 둥근바닥 플라스크에 넣고 3ml 클로로포름에 현탁한 후 회전 증발법으로 건조시켜 막(film)이 형성되도록 한다. 20ml 무수에테르를 플라스크에 첨가하고 다시 수성완충액에 녹인 1.5ml BHA을 첨가한다.(1,000μg HAB, 0.9% NaCl에 녹인 0.01M인산 완충염수) 혼합물을 호일로 덮고 40℃ 수조에서 음파파쇄하면서 한편 저속 흐름의 질소기체로 에테르를 병류 증발 시킨다. 그 결과로 나온 지질 페이스트를 질소하에서 완전히 건조 시켜 냄세를 맡았을 때 에태르 흔적이 전혀 나타나지 않게 한다. 10ml 수성 완충액을 플라스크에 넣고 리포좀 현탄액은 15ml 시험관에 옮긴다. 생성된 리포좀을 10ml 수성완충용액으로 3회 세척하고 각회마다 10분간의 원심분리로 (10,000rpm, J-20 로터 (Beckman, Palo Alto, CA))용액을 분리한다. 생성된 펠릿은 완충액과 함께 6ml 로 만들고 질소하에서 갈색 유리병에 담아 밀폐한다.
실시예10
항원을 포함하는 보조 리보좀의 제조
92mg의 콜레스테롤과 108mg의 DMPC를 100ml 둥근바닥 플라스크에 넣고 3ml클로로포름에 현탁한 후 회전 증발법으로 건조시켜 막(film)이 형성되도록 한다. 10ml 무수에테르를 플라스크에 첨가하고 다시 수성완충액에 녹인 2.0ml BHA을 첨가한다.(1,100μg HAB, 0.9% NaCl에 녹인 0.01M인산 완충염수) 혼합물을 호일로 덮고 40℃ 수조에서 음파파쇄하면서 한 편 저속 흐름의 질소기체로 에테르를 병류 증발 시킨다. 그 결과로 나온 지질 페이스트를 질소하에서 완전히 건조 시켜 냄세를 맡았을 때 에태르 흔적이 전혀 나타나지 않게 한다. 10ml 수성 완충액을 플라스크에 넣고 리포좀 현탄액은 15ml 시험관에 옮긴다. 생성된 리포좀을 10ml 수성완충용액으로 3회 세척하고 각회마다 10분간의 원심분리로 (10,000rpm, J-20 로터 (Beckman, Palo Alto, CA))용액을 분리한다. 생성된 펠릿은 완충액과 함께 6ml 로 만들고 질소하에서 갈색 유리병에 담아 밀폐한다.
실시예11
항원을 포함하는 보조 리보좀의 제조
40mg의 콜레스테롤과 160mg의 DMPC를 100ml 둥근바닥 플라스크에 넣고 3ml클로로포름에 현탁한 후 회전 증발법으로 건조시켜 막(film)이 형성되도록 한다. 10ml 무수에테르를 플라스크에 첨가하고 다시 수성완충액에 녹인 2.0ml BHA을 첨가한다.(1,000μg HAB, 0.9% NaCl에 녹인 0.01M인산 완충염수) 수성완충액 혼합물을 호일로 덮고 40℃ 수조에서 음파파쇄하면서 한 편 저속 흐름의 질소기체로 에테르를 병류 증발 시킨다. 그 결과로 나온 지질페이스트를 질소하에서 완전히 건조 시켜 냄새를 맡았을 때 에테르 흔적이 전혀 나타나지 않게 한다. 10ml 수성 완충액을 플라스크에 넣고 리포좀 현탄액은 15ml 시험관에 옮긴다. 생성된 리포좀을 10ml 수성완충용액으로 3회 세척하고 각회마다 10분간의 원심분리로 (10,000rpm, J-20 로터 (Beckman, Palo Alto, CA))용액을 분리한다. 생성된 펠릿은 완충액과 함께 6ml 로 만들고 질소하에서 갈색 유리병에 담아 밀폐한다.
실시예12
리포좀과 함께혼합한 겔의 제조
7.29mg/ml의 알루미늄이 들어있는 수산화알미늄겔 2%(Alhydrogel TM ; Connaught Laboratories, Inc., Swiftwater, PA)을 실시예10 에서처럼 제조한 몬 발명의 1.02ml리포좀과 함께 사용한다. 리포좀을 0.67ml 수산화알루미늄겔과 또한 5.31ml염수와 혼합한다.최종알루미늄 농도는 6.7mg/ml이고 HAB농도는 10μg/ml이다. 이 혼합물을 마찰방지제와 함께 유리병에 넣어 밀폐하고 크림프 시일한다.
실시예13
보조효력 표현
HAB를 함유한 리포좀을 실시예9와 같이 제조한다. 함입량은 SRID로 측정하고 리포좀을 염류에 희석하여 10μg단백질/ml의 농도로 만든 후 마찰 방지제와 함께 유리병에 덤어 밀폐하고 크림프 시일 한다.
다섯 마리의 450-500g 수컷 하를리 기니아픽(Buckberg Lab Animals, Landis Store, PA)의 오른쪽 뒷다리에 0.5ml 리포좀 현탄액 또는 0.5ml유리 HAB를 는육 주사한다.(5μg). 4주간의 면역화후에서 기니아픽을 에테르로 가볍게 마취시키고 삼장을 천자 하여 약 4ml 혈액을 받는다. 실온에서 하룻밤이 지나면 혈액이 응고한다. 혈액을 원심분리하여 혈청을 제거한 후 4℃에서 저장한다. 출혈 후 하루가 지난 뒤 왼쪽 뒷다리에 다시한번 0.5ml의 유리 HAB나 리포좀 HAB를 근육주사 한다. 초기 주사한지 1년 후 같은 방법으로 혈액을 수집한다.
혈청표본에 있는 모든 항-HA IgG 항체를 효소 면역 문석(EIA)으로 측정하고 또한 중화항체는 적혈구 응집 억제분석(HAI)으로 측정한다. 그결과는 표4,5,6 과 같다.
실시예14
멜라노마법
10mg 지질 대 1mg GD3또한 150mg지질 대 1.5mg GD3을 사용하여 결국 10:1과 100:1(w/w)의 지질 대 항원 GD3비율로서 강글리오시드 GD3를 포함하는 리포좀이 제조된다.(Dr. P Livingston, Sloan Kettering Institute for Cancer Research, New York). CHS트리스나 혹은 DMPC/콜레스테롤(70:30 몰비율)을 사용하여 리포좀을 제조한다.
pH7.2 의 인산완충염수 Ca++와 Mg++를 제거한 PBS)에 현탁시킨 GD3항원을 CHS트리스 지질 리포좀 혹은 DMPC/콜레스테롤(70:30 몰비율) 지질리포좀에 함입시킨다. CHS트리스/ GD3MLV리포좀은 방법 A으로 제조하고 DMPC/콜레스테롤/GD3SPLV리포좀은 방법 B로 제조한다.
리포좀 항원 제조물을 생쥐에게 4회 주입하고 항체레벨을 검사한다. 메라노마 GD3에 대한 항체가 형성된다. 여기서 설명한 양생법에 따른 인스턴트 제조물보다 다른 멜라노마 백신 제조물을 생쥐에게 투여 할 때 항체 적정량이 더 커진다.
방법 A
50μg PBS에 녹은 10 mg CHS트리스(분체형)과 1mg GD3(10:1)(wt/wt)을 시험관에 넣고 간헐적으로 교반하면서 2시간동안 실온에서 지질을 수화한다. Ca++또는 Mg++이 없는 10ml PBS에 지질화된 물질을 재현탁 시키고 13,000 prm으로 30 분동안 원심분리한다(2회). 최종적으로 생성된 리포좀은 펠릿을 2.5ml PBS에 재현탁 시킨다. 리포좀 제조물을 검사하기 전까지 질소하에서 갈색 유리병에 넣어 밀폐시킨다. 100:1 지질/향원 비율의 부가적인 제제형을 상기와 같이 제조하기 위하여 150mg CHS트리스와 1.5mg GD3를 300μ1 PBS에 녹여 사용한다.
방법 B
0.5 클로로포름에 녹인 2mg 콜레스테롤과 8mg DMPC를 25ml 둥근-바악 플라스크에서 회전증발시켜 건조하고, 2 무수에테르에 재용해시키고, 또한 60ml PBS에 녹은 1.5mg GD과 혼합한다. 그 결과로 나온 혼합물을 40℃의 N2흐름에서 음파파쇄하여 지질 페이스트를 형성하고 다시 N2하에서 건조시킨다. 건조물질을 10 PBS에 재현탁하고 10,000rpm으로 10분간 원심분리한다. (3회). 최종적으로 나온 리포좀 펠릿을 2,28ml로 만들고 알히드로겔을 넣어 보충한다.(0.7Al/ml). 100:1 지질/항원 비율의 부가적인 제제형은 0.45ml PBS에 녹인 120ml DMPC, 30mg 콜레스테롤 또한 1.5mg GD3용액을 사용하여 제조할 수 있다.
실시예 15
부가의 면역반응 연구
HA(분할항원)과 지질 투여량의 효과를 측정하기 위하여 다양한 양의 지질에 대해 각각 함입된 5μg혹은 0.5μg HA을 포함하는 리포좀 제제형을 기니아-픽에게 접종시킨다.
두 개의 CHS트리스 제제형을 실시예 2에서 설명한 것처럼 제조하여 5.0mg HA와 또한 13.6mg 지질(MLV, CHS, 트리스, H) 또는 다중막 소포 혹은 CHS(MLV, CHS, 트리스, L)인 1.9mg 지질을 투여한다. H와 L은 지질 투여량의 많고 적음을 구체적으로 표시한 것이다. 많고 적은 한계치는 상대량의 지질이 백신효과를 나타내는 역할을 개념화하기에 편리한 임의상수로 정한다. 두 개의 DMPC/CHOL 제제형을 실시예 8에서처럼 제조하고 그결과 5.0mg HA와 또한 안정한 복수박막 소포로서 디미리스토일포스파티딜콜린/콜레스테롤(SPLV, DMPC/C,H)인 9.7mg 지질 또는 2.9mg 지질(SPLV, DMPC/C,L)을 투여한다.
덧붙여서, 0.5ml 접종원 당 비교적 다량의 지질을 나타내는 각 H 제제형을 다시 PBS에 1:10 비율로 희석하고 그 결과로 나온 0.5mg HA, 또한 1.4mg CHS 트리스 혹은 1.0mg DMPC/CHOL를 함유한 현탁액도 동일한 유리병속에 주입한다. 기니아픽 접종과 또한 EIA나 EIA에 의한 항체 측정은 실시예 7와 15에서 설명한 것처럼 실행한다.
[표 1]
[표 2]
[표 7]

Claims (11)

  1. 백신 조성물은 (a)리포좀;과 (b)인플루엔자 바이러스 단편으로 구성되고, 이때, 리포좀의 지질 성분은 디미리스토일 포스파티딜콜린과 콜레스테롤로 구성되고, 바아러스 단편은 사람을 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있는 능력이 있으며, 리포좀과 바이러스 단편은 면역반응을 유도할 수 있는 효과량 즉, 조성물내에 0.1μg 내지 500μg 범위로 포함되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 리포좀은 다층 지질 이중층과 이와 같은 지질 이중층사이에 다수의 격실을 가지는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 리포좀의 직경은 1 미크론인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 리포좀의 지질 성분인 디미리스토일 포스파티딜콜린과 콜레스테롤의 몰비율은 80:20 내지 20:80인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 다층라멜라 리포좀은 안정한 다중층 소포(stable pluilamellar Vesicles;SPLV)인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 백신제형의 조성물에 알루미늄 어주번트가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  7. 제 1항에 따른 백신 조성물과 제약학적 수용가능한 담체로 구성된 것을 특징으로 하는 제형.
  8. 제 1항에 있어서, 리포좀의 지질 성분인 디미리스토일 포스파티딜콜린과 콜레스테롤의 몰비율은 60:40 내지 40:60인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  9. 제 1항에 있어서, 리포좀은 직경이 1미크론인 안정한 다중층 소포(stable pluilamellar Vesicles;SPLV)이고, 인플루엔자 바이러스 단편은 브로멜라인(bromelain) 또는 헤마글루티닌(hemagglutinin)단편인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  10. 제 1항에 있어서, 백신제형의 조성물에 사이토킨이 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  11. 제 1항에 있어서, 인풀루엔자 바이러스 단편은 브로멜라인(bromelain) 또는 헤마글루티닌(hemagglutinin)단편인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
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