KR0128159B1 - 효소 전극 및 이의 제조방법 - Google Patents

효소 전극 및 이의 제조방법

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KR0128159B1 KR1019890010694A KR890010694A KR0128159B1 KR 0128159 B1 KR0128159 B1 KR 0128159B1 KR 1019890010694 A KR1019890010694 A KR 1019890010694A KR 890010694 A KR890010694 A KR 890010694A KR 0128159 B1 KR0128159 B1 KR 0128159B1
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캠브리지 라이프 사이언시즈 피엘시
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Abstract

내용없음

Description

효소 전극 및 이의 제조방법
제1도는 내지 제9도는 각각 본 발명에 따른 실시예 1 내지 9의 방법에 의해 측정된 여러가지 농도의 글로코오즈에 대한 전극의 전류 출력을 도식한 그래프이다.
제10도는 본 발명에 따른 실시예 10의 방법에 의해 측정된 여러가지 농도의 락테이트에 대한 전극의 전류 출력을 도시한 그래프이다.
제11도는 내지 제13도는 본 발명에 따른 실시예 11 및 12의 방법에 의해 측정된 여러가지 농도의 글루코오즈에 대한 전극의 전류 출력을 도식한 그래프이다.
제14도는 본 발명에 따른 실시예 13의 방법에 따라 측정된 여러가지 농도의 클레스테롤에 대한 전극의 전류 출력을 도시한 그래프이다.
제15도 내지 제17도는 본 발명에 따른 실시예 14의 방법에 따라 측정된 여러가지 농도의 글루코오즈에 대한 전극의 전류 출력을 도식한 그래프이다.
본 발명은 효소 전극 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
국제 특허원 제PCT/GB87/00365호(국제공보 제WO 87/07295호)에는, 수지 결합된 탄소 또는 흑연 입자(이 입자들은 먼저 혼합한다)의 다공성 층으로 이루어지거나 다공성 층을 포함하는 전기 전도성 지지체 성분의 표면에 고정 또는 흡착되거나, 또는 당해 층을 형성하기 위해 미분된 백금족 금속을 결합시키기 전에 개개 입자의 표면에 침착 또는 흡착되어 다공성 기질층(여기에 효소가 흡착 또는 고정된다)을 형성하는 효소, 및 층을 통해 사실상 균일하게 분산된 백금족 금속과 수지 결합된 탄소 또는 흑연 입자의 사실상 균질한 층을 포함하며, 관련 기질의 존재하에 효소의 촉매 활성에 대해 전류적으로 반응할 수 있는 효소 전극이 기술되어 있다.
바람직한 기질 물질은 입자의 표면에 흡착되고 결합제로서 합성수지, 바람직하게는 폴리테트라플루오로에틸렌을 사용하여 탄소페이퍼 기질에 결합된 콜로이드성 백금을 갖는 백금화 탄소 분말 입자를 함유하는 수지 결합된 백금화 탄소 페이퍼 전극이다.
바람직한 효소 전극은 기질의 표면에 흡착 또는 고정된 글루코오즈 옥시다제를 함유하는 글루코오즈 옥시다제 전극이다.
국제 특허원 제PCT/GB 88/00868호(국제공보 제WO 89/038741호)에도 유사한 효소전극이 기술되어 있는 데, 이 문헌에서는 수지 결합된 탄소 또는 흑연 입자에 예비 흡착된 백금족 원소인 금속보다는 오히려 산화물(예 : PtO)을 사용한다.
당해 명세서에 기술되어 있는 바와 같이, 효소 전극용으로 바람직한 기질 물질은 연료 셀에서 가스 확산전극으로서 지금까지 사용된 수지 결합된 백금화(또는 산화백금을 함유) 탄소 물질(제조원 : 미합중국 New ton Highlands 소재의 The Prototech Company)이다. 이러한 물질은 필수적으로 수지 결합제로서 비교적 융점이 높은 소수성 플루오로 카본 수지, 바람직하게는 폴리테트라플루오로에틸렌을 함유한다.
이러한 수지 결합된 백금화 탄소, 가스 확산 전극 물질의 제조방법이 미합중국 특허 제4,044,193호, 제4,166,143호, 제4,293,396호 및 제4,478,696호에 기술되어 있다. 또한 효소 전극용 전기 전도성 기질 물질로서 국제 특허공보 제WO 87/07295호의 교시에 따라 적합하게 제조되는 유사한 가스 확산 전극 물질이 미합중국 특허 제4,229,490호에 기술되어 있다. 즉, 이러한 전극 물질은 백금 또는 팔라듐의 콜로이드성 크기 입자 또는 기타 백금족 금속을 미분된 탄소 또는 흑연 입자에 침착시키고, 백금화 또는 팔라듐화 탄소 또는 흑연 입자를 플루오로카본 수지, 바람직하게는 폴리테트라플루오로에틸렌과 혼합하고, 혼합물을 전기 전도성 지지체, 바람직하게는 전기 전도성 탄소 페이퍼, 또는 필라멘트상 탄소섬유 웹에 성형시킴으로써 제조된다. 유사한 방법을 산화물 함유 물질에 적용한다.
국제공보 제WO 87/07295호 및 제WO 89/03871호의 교시에 따라 효소 전극으로서 사용하기 위해, 적절한 효소(예 : 글루코오즈 옥시다제) 또는 효소의 혼합물을 상술한 바와 같이 수지 결합된 백금화 또는 팔라듐화(별도의 언급이 없는 한, 이후에 이 용어는 백금족 원소인 금속 뿐만 아니라 상응하는 산화물까지 포함하는 의미로 사용된다) 탄소 또는 흑연 입자의 다공성 표면층을 포함하는 예비성형된 웹의 표면에 고정 또는 흡착시킨다. 언급한 바와 같이, 고정된 효소는 수지 결합된 백금화 또는 팔라듐화 탄소 입자의 다공성층의 표면에 간단히 흡착되거나 또는, 예를들어, 발달된 효소 고정기술(예 : 카보디이미드 또는 카보닐디이미다졸 시약과의 공유결합, 1,6-디니트로-3,4-디플루오로벤젠과의 공유 결합 또는 글루타르알데히드와의 가교결합)을 사용하여 공유결합될 수 있다. 모든 경우에, 효소 또는 효소 혼합물은 열 및 압력을 가함으로써 전기 전도성 기질 위에 성형된 수지 결합된 백금화 또는 팔라듐화 탄소 또는 흑연 입자의 다공성 층을 포함하는 예비성형된 전기 전도성 기질 위에 고정되거나 흡착된다. 미분된 백금족 금속 대신, 상응하는 산화물(예 : 백금 또는 팔라듐 산화물)을 사용할 수 있다.
본 명세서에 기술된 기타 관련된 배경의 선행기술은 하기와 같다.
문헌 [참조 : Ianiello et al(1982) Analyt. Chem. 54, 1098-1101] 에는 글루코오즈 옥시다제 및 L-아미노산 옥시다제가 시아누르산 클로라이드 법에 의해 흑연 전극에 공유결합되는 무조정제 센서(mediatorlaess sensor)가 기술되어 있다.
문헌 [참조 : Matsushita Electric Appliance Industry Company, 미심사 일본국 특허공고 제56-16447호]에는 결합제로서 플루오로카본 수지 결합제(예 : 폴리테트라플루오로에틸렌) 10중량부 이하를 함유하는 성형 흑연의 전기 전도성 기재를 포함하고, 증착 또는 전기분해에 의해 백금 박막(1μm 이하)이 전착된 효소 전극이 기술되어 있다. 효소(예 : 글루코오즈 옥시다제)는 백금화된 전기 전도성 기재의 표면에 고정되는 데 본 발명은 효소를 백금에 직접 고정시키는 문제를 여실히 극복하고 있다.
문헌 [참조 : Matsushita Electrical Industrial Co. Ltd.(Nakamura et al) 미합중국 특허 제4,392,933호]에는 산화-환원효소(예 : 글루코오즈 옥시다제) 및 효소에 결합된, 산화 환원 반응할 수 있는 금속 산화물(예 : 산화루테늄)을 포함하는 고정된 효소 전극이 기술되어 있는데, 이때 금속 산화물은 자체가 전자 포집체 및 전도체를 형성하거나, 전자 포집체 및 전도체 물질(예 : 흑연)에 혼입된다. 전자 포집체 및 전도체 물질로서 흑연을 사용할 경우, 분말 형태의 반응성 금속 산화물(예 : RuO2)과 흑연 분말을 분말 컴팩트 또는 디스크로 가압 성형시키는데, 예를들어, 글루타르알데히드를 사용하여 흑연 표면에 가교결합시킴으로써 효소(예 : 글루코오즈 옥시다제)가 이에 고정된다.
효소 전극을 제조하는 상기 방법을 모두는 필수적으로 2단계 공정을 거치며, 상술한 바와 같이 이제까지는 고융점 소수성 합성 수지, 바람직하게는 폴리테트라플루오로에틸렌과 같은 플루오로카본 수지인 결합제를 용융시키기 위해 성형 콤팩트의 소결에 필요한 조건하에 종종 흑연 또는 탄소 기재를 예비형성시키는 것을 필요로 한다.
그러나, 이러한 방법은 큰 용적의 대량 제조 기술에는 적합치 않아 선행 기술에 따른 효소 전극은 비용이 많은 드는 경향이 있다. 따라서, 단지 1회 사용한 다음 페기시킬 수 있는 1회용 효소 전극을 제조할 수 있을 정도로 제조 비용을 더욱 절감할 수 있는 간단한, 바람직하게는 1단계의 대량 제조 기술로서 이러한 전극을 제조하는 것이 바람직하다. 이러한 1회용 효소 전극은 각종 의학적 검사 및 진단용으로 크게 요구되고 있다.
본 발명에 따라, 수지 결합된 백금화 또는 팔라듐화(또는 기타 백금족 금속) 탄소 또는 흑연 입자의 다공성 층에 고정되거나 흡착된 효소 또는 효소의 혼합물을 포함하는 효소 전극의 제조방법에 있어서, 고온 결합제(이를 테면, 고융점 플로오로카본 또는 기타 소수성 수지, 바람직하게는 폴리테트라플로오로에틸렌)가 전적으로 조제되거나, 실온에서 활성화될 수 있고 고온 소결이 필요치 않은 결합제와 같은 저온의 바람직하게는 수용성 또는 수분산성 결합체(예 : 젤라틴)에 의해 대체될 수 있음을 발견하였다.
오늘날 액체 현탁 매질(예 : 물) 중에서 효소 또는 효소 혼합물을 백금화 또는 팔라듐화(또는 기타 백금족 금속을 함유하는) 탄소 또는 흑연 입자, 및 임의로는 결합제와 예비 혼합시켜 효소, 백금화 또는 팔라듐화 미분 탄소 또는 흑연, 및 임의로는 결합제의 현탁액을 형성한 다음, 현탁액을, 예를들어, 스크린 인쇄 기술에 의해 전기 전도성 기질의 표면에 박막으로서 침착시키고, 이어서 피복된 기질을 건조시켜, 기질에 효소, 백금화 또는 팔라듐화 미분 탄소 또는 흑연, 및 경우에 따라, 결합제의 사실상 균일한 혼합물을 포함하는 박막을 침착시킬 수 있으므로 효소 전극의 제조가 상당히 용이해졌다.
특히, 스크린 인쇄 기술에 의해 매우 효율적이고 고민감성인 효소 전극 물질의 대량 제조가 가능해졌다.
뿐만 아니라, 미분된 탄소 또는 흑연의 존재가 전자 포집체 및 전도체로서 작용하기에 바람직한 반면, 또한 이는 실제 조제될 수 있으며, 작용성 효소 전극은 미분된 백금족 금속 또는 상응하는 산화물, 효소 및 임의로는 저온이면서, 바람직하게는 수용성인 결합제를 전기 전도성 트랙(예 : 탄소 트랙), 또는 기타 적합한 전기 전도성 기질(예 : 전기 전도성 탄소 페이퍼의 시이트)에 침착시키고 미분된 백금속 금속 또는 산화물, 효소 및 경우에 따라, 결합재를 사실상 균일한 현탁액으로서 포함하는 균일한 층을 이에 침착시키기 위해 건조시킴으로써 매우 간단히 수득될 수 있다.
본 발명의 제1양태에 따라, 미분된 백금족 또는 산화물 및 하나 이상의 효소를 액체 현탁 매질에 현탁시켜 실질적으로 균일한 현탁액을 형성하고, 현탁액을 지지체 성분의 표면에 침착시킨 다음, 침착된 현탁액을 효소의 분활성 온도 이하의 온도에서 건조시켜 미분된 백금족 금속 또는 산화물 및 상기 효소(들)를 사실상 균일하고 균질한 피복층으로서 지지체의 표면에 침착시킴을 특징으로 하는, 미분된 백금족 금속 또는 산화물과 하나 이상의 효소의 사실상 균질한 혼합물을 기본 지지체의 표면에 전기 전도층으로 침착시킨 효소 전극(이 전극은 전극의 효소 함유층이 개개의 효소 기질과 접촉하는 경우, 효소의 활성에 대해 전류적으로 반응한다)의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제2양태에 따라, 기본 지지체의 표면에 전기 전도성 표면층으로서 침착된 미분된 백금족 금속 또는 산화물과 하나 이상의 효소의 사실상 균질한 혼합물을 포함하는 효소 전극이 제공되는데, 이때 당해 층은 미분된 백금족 금속 또는 산화물과 효소(들) 입자를 위한 결합제를 추가로 함유하며, 결합제는 효소(들)의 불활성화 온도를 초과하지 않는 온도에서 미분된 백금족 금속 또는 산화물 입자를 지지체에 결합된 접착 응집층으로 결합시키기에 유효한 물질을 포함한다.
상기 방법에서, 피복 기질의 건조가, 효소의 불활성화 온도 이하의 온도, 바람직하게는 실온에서 수행된다는 것은 자명하다.
본 발명에 따르는 다른 방법에 있어서, 전극은 우선 결합제 중 모두 또는 일부의 존재 또는 부재하에, 미분된 탄소 또는 흑연 위에 임의로 예비흡착되거나 이들과 혼합된 미분된 백금족 금속 또는 산화물을 유사한 방법으로, 즉 현탁 매질, 바람직하게는 수성 매질중에서 미분된 탄소 또는 흑연 입자 위에 임의로 예비흡착되거나 이들과 혼합돈 미분된 백금족 금속 또는 산화물을 포함하는 액체 현탁액으로 피복시킴으로써 전기 전도성 기질 표면에 침착시킨 다음, 건조시킴으로서 형성할 수 있다.
이어서, 건조층을 효소, 임의로 결합제 또는 추가의 결합제를 함유한는 제2용액으로 함침시켜 효소를 미분된 백금 또는 백금 산화물 함유중 또는 다른 백금족 금속 또는 산화물 함유층에 분산시키고, 이어서 최종 생성물을 재건조시킨다.
미분된 원소 형태의 백금족 금속을 사용하는 대신에, 상응하는 산화물(예 : 백금 또는 팔라듐 산화물)을 사용할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서는 백금화 또는 팔라듐화 물질은 별도의 언급이 없는 한, 상응하는 산화물 함유 물질을 모두 포함한다.
더욱 놀랍게도, 상술한 바와 같이 본 발명의 다른 양태에 따라서, 플로오로카본 수지 결합제가 저온의, 바람직하게는 수용성 또는 수분산성 결합제로 조제되거나 이들 결합제에 의해 대체될 수 있을 뿐만 아니라 미분된 탄소 또는 흑연도 역시 조제될 수 있음을 밝혀냈다. 그러므로, 현재 효소 전극은 결합제의 존재하에 또는 부재하에 전기 전도성 탄소 페이퍼의 표면 또는 전기 전도성 탄소 트랙에 침착된 효소, 또는 효소의 혼합물과 미분된 백금족 금속, 또는 상응하는 금속 산화물의 혼합물로부터 매우 간단히 제조할 수 있다. 효소와의 혼화성을 위해 다른 전기 전도성 기질을 사용할 수 있다.
설정된 과도 전위에서 효소 기질과 접촉시킴에 있어서, 당해 전극은 광범위한 농도 범위에 걸쳐 전류 출력이 기질 농도에 직접 비례하는, 전류적으로 우수한 반응을 나타낸다. 따라서, 이러한 효소 전극 및 본 명세서에 기술한 기타 전극은 광범위한 적용분야에서, 특히 광범위한 의학 및 임상학 샘플에서 효소 기질 농도(예 : 글루코오즈, 락테이즈, 콜레스테롤 농도)를 측정하는 의학 및 수의학적 진단시 바이오센서로서 유용하다.
본 발명의 방법 양태에 따라서, 스크린 인쇄 이외에 기타 각종 인쇄 또는 피복 기술이 미분된 탄소 또는 흑연 입자의 표면에 임의로 흡착되고 임의로 추가의 결합제를 함유하는 효소, 미분돈 백금족 금속 또는 산화물의 혼합물을 전기 전도성 지지체의 표면에 적용시키는데 사용할 수 있다. 종래의 피복기술(예 : 닥터 블레이드 또는 롤러 피복) 이외에, 효소 및 미분된 백금족 금속 또는 산화물 함유 혼합물은 잉크 플로팅(inkplofting) 또는 탬포(tampo) 인쇄와 같은 공지된 인쇄 기술을 사용하여 지지체의 표면에 인쇄할 수 있다.
본 발명에 따르는 다른 방법에서, 효소 전극은 먼저, 임의로 저온 결합제(이 결합제는 결합제의 용융 또는 소결 없이 지지체의 표면에서 입자를 응집층으로 결합시킬 수 있다)와 혼합된 형태로 미분된 탄소 또는 흑연 입자의 표면에 임의로 흡착된, 미분된 백금족 금속 또는 금속 산화물 입자의 박막을 전기 전도성 지지체의 표면에, 예를들어, 스크린 인쇄하여 침착시키고, 이어서 침착층을 효소 또는 효소의 혼합물에 의해 함침시킴으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에 따라 사용된 바람직한 미분된 탄소 및 흑연 물질은 탄소 입자의 표면에 백금족 금속 원소(예 : 백금, 팔라듐, 이리듐 또는 로듐, 바람직하게는 백금 또는 로듐 또는 이의 혼합 형태)의 미분된 입자가 흡착된 미분된 활성 탄소 및 흑연 입자이며, 상응하는 산화물(예 : 백금 산화물, 팔라듐 산화물 및 로듐 산화물)을 대신 사용할 수 있다.
따라서, 본 명세서에 사용된 용어 백금화 및 팔라듐화란 별도의 언급이 없는 한 산화물까지 포함한다. 또한, 본 명세서에 사용된 용어 활성화 탄소 및 활성화흑연이란, 예를들어, 활성 탄소로서 본 분야에서 일반적으로 언급되는 표면적이 큰 생성물을 제공하기 위해 증기 또는 CO2중에서 탄소 또는 흑연 분말을 열 처리하겨 수득한 다공성이고 표면적이 큰 탄소 및 흑연 물질을 의미한다. 이러한 활성화 물질의 표면적은 10㎡/g 이상일 수 있고, 통상적으로 200 내지 600㎡/g 일 수 있다. 입자 크기는 중요하지 않으나, 입자 크기가 3 내지 150nm인 탄소 또는 흑연 분말이 바람직하며, 3 내지 50nm가 더욱 바람직하다.
탄소 분말에 흡착된 백금족 금속 또는 산화물의 양은 일반적으로 탄소의 중량을 기준으로 하여 0.1 내지 20중량%, 바람직하게는 0.5 내지 5중량%의 범위의 백금족 금속의 부하량을 제공하기에 충분할 것이다. 그러나, 이 제한치는 임계치라기 보다는 실제 사용치이며, 약 0.1% 미만의 산출 시그날은 초민감 측정장치를 사용하지 않으면 실제 범위에서 측정하기에 너무 낮은 농도로 떨어진다. 약 20% 이상인 경우, 백금족 금속의 부하량은 경제적이지 못하여, 반응성 및 민감도의 증가에 있어서 이점이 거의 없다. 바람직하게는 백금족 금속 또는 산화물 입자의 입자 크기는 1nm 내지 20㎛의 범위이며, 1 내지 4nm의 콜로이드성 크기가 가장 바람직하다.
본 발명의 효소 전극에는 결합제를 사용하는 경우, 임의의 적합한 저온 결합제(이를테면, 결합제를 용융시키기 위해 백금화 또는 팔라듐화 또는 흑연 분말/효소 혼합물을 가열하지 않는 실온에서 결합시킬 수 있는 결합제)를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 수용성 또는 수분산성 물질, 특히 하이드록시에틸 셀룰로오즈 또는 젤라틴이며, 기타 적합한 결합제로는 전분 및 셀룰로오즈성 유도체(예 : 전분 아세테이트 셀룰로오즈 아세테이트, 셀룰로오즈 아세테이트 부티레이트 및 에틸 셀룰로오즈), 수용성 합성 및 반합성 중합체(예 : 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈)를 들 수 있다.
사용된 결합제의 양은 효소와 백금화 또는 팔라듐화 탄소 분말의 합한 중량을 기준으로 하여 5 내지 100%(무수 중량기준), 바람직하게는 20 내지 50%이다.
본 명세서에 기술된 효소 전극은 무조정제로서 분류될 수 있으며, 경우에 따라, 전극을 형성하기 위해 사용된 현탁액 중에 전자 전이 조정제(예 : 페로센)를 혼힙시킬 수 있다.
백금화 또는 팔라듐화 탄소 분말 및 효소의 혼합물은 바람직하게는, 예를들어 스크린 인쇄에 의해 전기 전도성 기질에 적용시키기 전에 물에 현탁시키는 것이 바람직하며, 이때 유기 용매(예 : 사이클로헥사논 또는 디클로로메탄)를 함유하는 다른 적합한 액체를 현탁 매질로서 사용할 수 있다.
전기 전도성 기질에 침착시키는 경우, 피복 두께는 5 내지 500㎛일 수 있다.
효소 하중은 사용된 특정 효소 또는 효소의 혼합물에 따라 매우 다양한 것이다. 글루코오즈 옥시다제의 경우, 전극 표면의 10 내지 5000㎍/㎠의 하중이 만족스러우며, 100 내지 2000㎍/㎠가 바람직하다.
전기 전도성 기질로서, 다양한 상이한 물질들, 예를들어, 백금 또는 기타 전기 전도성 금속 스트립, 전기 전도성 합성 중합체 필름을 사용할 수 있으나, 가장 바람직하게는 기질로서 전기 전도성 탄소 페이퍼 또는 탄소 트랙, 이를 테면, 본 분야에서 상업적으로 시판되는 바와 같은 비전도성 지지체에 침착된 탄소 입자의 종류가 사용된다.
필수적이진 않지만, 통상적으로 효소 전극의 표면은 측정될 효소 기질(글루코오즈)에 의해 당연히 투과성이 있어야 하는, 폴리카보네이트와 같은 적절히 다공성인 막 또는 스크린을 도포하여 물리적으로 보호시킬 수 있다. 이러한 막은 센서의 반응시간을 증가시키는데는 어느 정도 불리하지만, 당해 막을 사용함에도 불구하고 대다수의 경우 종래의 효소 전극에 비해 실제 더 우수하다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 특히 이를테면 고정된 효소가 글루코오즈 옥시다제인 글루코오즈 옥시다제 전극에 관한 것이며, 항상 동등한 효과를 제공하지는 않지만 다른 산화환원 효소도 사용할 수 있다. 이는 반드시 효소의 본래의 비효율성에 기인하는 것이 아니라 다른 요인에 따른 것이다. 예를들어, 요산 분해 효소를 사용하여 요산을 측정할 경우, 요산 기질 그 자체는 기준 전극에서 전기화학 산화반응을 하므로, 효소로부터의 임의의 효과를 거의 방해하게 된다. 다른 적합한 산화환원 효소로는 락테이트 옥시다제, 갈락토오즈 옥시다제, 콜레스테롤 옥시다제 및 기타 과산화물 생성 효소(이는 주 기질에 작용하여 옥시다제에 대해 산화 가능한 기질을 생성한다)및 비옥시다제와 옥시다제의 혼합물을 포함하는 고정된 효소의 혼합물(이는 산화 가능한 생성물에 작용하여 주 기질의 농도에 비례하는 측정가능한 전류를 생성시킨다)을 들 수 있다.
그러한 혼합물중 하나가 베타-갈락토시다제와 글루코오즈 옥시다제의 혼합물(락토오즈의 정량적 측정시)이거나, 또는 베타-글루칸탈중합 효소, 베타-글루코시다제와 글루코오즈 옥시다제의 혼합물(베타-글루칸의 측정시)이다.
다른 형태의 센서 적용에 효소계 또는 비효소계 성분, 또는 전구체 반응에서 중요한 기질과 상호작용시키는 방법(이때 생성물은 연이어 본 발명에 따른 효소 전극에 대한 기질로서 작용하는 물질을 함유한다)의 사용이 포함된다. 이러한 전국체 단계의 여러가지 예들이 면역화학 반응 분야에서 발견될 수 있을 것이며, 본 발명에 따른 효소 전극을 활용하는 센서의 제작시 당해 반응을 사용하는 방법은 본 분야의 숙련가에게 명확할 것이다.
그러나, 본 발명에 따른 전극은 샘플, 특히 임상적 샘플(예 : 혈액, 혈청, 플라즈마, 뇨, 땀, 눈물 및 침)에서 산화가능한 기질, 특히 글루코오즈의 검출 및/또는 정량적 측정에 대한 바이오센서로 주로 사용될 수 있다.
기타 가능한 비임상적 사용은 다음과 같다 :
(a) 발효 모티터링, (b) 공업적 공정 조절, (c) 환경 모니터링(액체 및 기체의 유출 및 오염 조절), (d) 식품 검사 및 (e) 수의학적 적용, 특히 상술한 바와 같은 임상 적용과 관련된 적용.
본 발명에 따른 효소 전극 물질을 혼입시킨 바이오센서 및 기타 센서가 다른 구성 요소, 전기적 납, 전기적 비전도성(절연성) 지지체 또는 탐침을 함유할 수 있는 한, 제작에 있어서 이러한 요소는 통상적이므로 상세히 기술한 필요는 없다. 전극 물질과의 전기 접촉은 다양한 방법, 예를들어, 전극 물질을 이를테면 백금 또는 기타 적합한 전도체의 전기 전도성 접촉부 또는 말단부와 면 대 면으로 접촉시킴으로써 행해질 수 있다.
사용시 효소 기질을 함유하는 샘플의 존재하에, 본 발명의 효소 전극의 전류 출력을 본 분야에 이미 공지된 방법에 따라 설정된 전위에서 측정할 것이다. 일반적으로, 전류 출력은 은/염화은 참조 전극에 있어서 200 내지 600mV의 범위로 설정된 전위에서 측정할 것이다. 이러한 측정을 행하는데 사용하기 위한 적합한 2개의 전극 셀 및 3개의 전극 셀의 두 가지 예가 이미 참조문헌으로서 언급된 국제 특허공보 제WO 87/07295호에 예시되어 있고 상세히 기술되어 있다.
본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 하기 실시예에 예시되어 있으며, 제1도 내지 제17도는 본 발명에 따라 제작된 여러가지 효소 전극의 전류 출력을 나타낸 것이다.
실시예 1
글루코오즈 옥시다제 전극은 백금올 약 10중량% 함유하는 백금 탄소 분말 [제조원 : 프로토테크 캄파니(Prototech Company), Newton Highlands Massachusetts 소재, Vulcan XC-72 탄소 분말, 콜로이드성 백금을 갖는 공칭 입자 크기 : 30nm, 흡착된 입자 크기 범위 : 1.5 내지 2.5nm] 200mg을 인산염 완충액(NaH2PO4, 2mmol/L; (Na2HPO4, 16mmol/L; NaCl, 100mmol/L; K2H2(EDTA)2H2O, 1mmol/L : pH 7.4) 400μl에 현탁시켜 제조한다. 현탁액에 글루코오즈 옥시다제 40mg을 가한다.
현탁액을 교반하고 1시간 동안 실온에서 정치시킨다.
현탁액을 정치시킨 후 전기 전도성 탄소 페이퍼 [토레이 백킹 페이퍼(Toray backing paper)]의 시이트 표면에 박막으로서 수동 분무시킨다.
건조시킨 후 효소 전극 물질을 1.5mm 디스크로 절단하고 제16도와 관련하여 제WO 87/07295호에서 기술한 바와 같이 2개의 전기화학 셀 중 400mV 대 Ag/AgCl에서 글루코오즈에 대한 당해 물질의 반응을 시험한다.
여러가지 농도의 글로코오즈에 대한 전극의 전류 출력(μA)이 첨부된 도면의 제1도에 기술되어 있다. 수득된 결과는 괄목한 만한 2가지 효과를 보여주는데, 첫째는 전극 반응이 0 내지 30mmol/L의 글루코오즈 범위에 걸쳐서 거의 직선이며, 둘째는 수득된 이들 결과가 특정한 결합제 없이 산소가 풍부한 대기를 제공한다는 것이다. 제WO 87/07295호를 제외한 선행 기술분야에 따라, 이전에는 단지 한정된 범위의 글루코오즈 농도, 예를들어, 2 내지 5mmol/L에서만 직선을 얻을 수 있었다 [참조 : Yao T., Analytica Chimica Acta 148, 27-33(1983)]. 또한 선행 기술분야에서는 산소의 자유 확산이 허용된 경우 글루코오즈 전극의 반응의 직선성이 증가한다는 점을 교시하고 있으며 이는 산소에 대한 치환도 또는 용해도가 큰 결합제를 사용하는 제WO 87/07295호에서 지지된다 [참조 : Lobel E. and Rishpon J., Analytical Chemistry 53, 51-53(1981)]. 대조적으로, 본 발명은 훨씬 넓은 글루코오즈 농도의 범위에서, 심지어 결합제가 존재하지 않고도 반응의 직선성을 제공한다는데 있다.
실시예 2
실시예 1을 반복하되, 백금화 Vulcan XC-72 대신에 미분된 백금화 흑연(백금 5%) [제조원 : 존슨 매티케미칼즈(Johnson Matthey Chemicals), Royston, United Kingdom 소재, 공정 촉매 CH 15959/01로서 시판됨)을 사용한다. 필수적으로 유사한 직선 전극 반응이 수득된다(제2도 참조).
실시예 3
실시예 2를 반복하되, 미분된 백금화 흑연(백금 5%) (제조원 : 존슨 매티)을 사용하여 효소/백금화 흑연 현탁액을 생성시킨다. 이 경우에, 37℃로 냉각된 물 중 젤라틴 20% w/v 용액을 2 : 1의 용적비에서 현탁액에 가한다.
젤라틴 함유 페이스트를 토레이 백킹 페이퍼에 분무시켜 수득한 생성 전극은 실온에서 건조시킨 후 더욱 강한 생성물을 제공하나 글루코오즈에 대해 거의 직선상 반응을 나타낸다(제3도 참조).
실시예 4
수성 페이스트를 백금화 탄소 분말(흡착된 콜로이드성 백금10중량%를 함유하는 Vulcal XC-72, 제조원 : 프로토테크 캄파니) 45mg, 0.1M KCl 중 하이드록시에틸 셀룰로오즈 10% 용액 100mg에 현탁된 글로코오즈 옥시다제 5mg으로부터 제조한다.
페이스트를 예비습윤된 탄소 페이퍼(토레이 백킹 페이퍼)에 수동 피복하고 건조시킨다.
건조 전극 물질에서 1.5mm 디스크를 절단하고 기술한 바와 같이 400mV의 전위 대 Ag/AgCl에서 2-전극 셀중에서 글루코오즈에 대한 전극의 반응을 시험한다.
여러 농도의 글루코오즈에서 전류 출력을 측정하고, 결과를 제4도에 나타내었다. 반응은 필수적으로 0 내지 300mmol/L의 글루코오즈 농도 범위에서 직선이다.
실시예 5 및 실시예 6
실시예 4의 방법을 반복하되, 백금을 1% 및 0.2%로 각각 함유하는 백금화 탄소 분말(Vulcan XC-72)을 사용한다. 전극 물질의 전류 출력을 동일한 조건에서 측정하고 결과를 제5도 및 제6도에 나타내었다. 제5도는 0 내지 30mmol/L의 글루코오즈 농도 범위에서 거의 직선 반응을 보여준다. 적은 양(0.2%)의 백금에서도 0 내지 20mmol/L의 감소된 농도 범위에서만 거의 직선성을 나타낸다.
실시예 7
실시예 4의 방법을 반복하되, 글루코오즈 옥시다아제 0.5mg을 사용한다. 동일한 조건하에 측정된 전극 물질로부터의 전류 출력을 제7도에 나타내었다. 직선성은 0 내지 20mmol/L의 글루코오즈 농도에서 나타난다.
실시예 8
실시예 4의 방법을 반복하되, 백금 금속 대신 흡착된 콜로이드성 백금 산화물을 10중량% 함유하는 탄소분말(Vulcan XC-72) 45mg을 사용한다.
전극 물질의 1.5mm 디스크를 상술한 조건, 이를테면 400mV의 전위 대 Ag/AgCl애서 2개의 전극 셀에서 다양한 농도의 글루코오즈에 대한 반응에 대해 시험한다. 다양한 농도의 글루코오즈에서 측정한 전류 출력을 제8도에 나타내었다.
실시예 9
백금 블랙 5mg, 활성 탄소 분말(Vulcan XC-72) 400mg, 0.1M KCl 중 하이드록시에틸 셀룰로오즈(100%) 100mg 중 클루코오즈 옥시다제 5mg을 혼합하여 페이스트를 제조한다.
페이스트를 토레이 백킹 페이퍼에 수동적으로 바르고, 건조시킨다.
건조 전극 물질로부터 1.5mm 디스크를 절단하고 상술한 조건하에 글루코오즈에 대한 반응을 시험한다.
전극은 0 내지 30mmol/L의 전체 농도 범위에서 글루코오즈에 대한 직선 반응을 나타낸다.
실시예 10
실시예 4를 반복하되, 글루코오즈 옥시다제 대신 락테이트 옥시다제 EC 1.1.3.25 mg을 사용한다.
건조 전극 물질의 1.5mm 디스크를 상술한 조건(400mV 대 Ag/AgCl에서 2개의 전극 셀)하에 락테이트에 대한 디스크의 반응에 대해 시험한다.
제10도에 나타낸 바와 같이, 전류 출력은 0 내지 20mmol/L의 락테이트 농도 범위에서 락테이트 농도에 따라 거의 직선으로 변한다.
실시예 11
탄소를 함유하지 않는 효소 전극은 백금 블랙 5mg, 글루코오즈 옥시다제 5mg을 0.1M KCl 중 10% 하이드록시에틸 셀룰로오즈 100mg에 현탁시켜 제조한다.
현탁액을 토레이 백킹 페이퍼에 수동적으로 바른다.
건조 전극 물질의 1.5mm 디스크를 상술한 바와 같이 여러가지 글루코오즈 농도에 대한 전극 반응, 전류 출력에 대해 시험한다. 결과를 제11도에 나타내었으며, 0 내지 20mmol/L의 글루코오즈 농도 범위에서 거의 직선 반응을 나타낸다.
실시예 12
실시예 4의 방법을 따르되, 백금화 탄소 분말 대신 이리듐 및 로듐의 미분된 콜로이드성 입자가 각각 1 중량%(탄소의 중량 기준) 흡착된 활성 탄소 입자(Vulcan XC-72) 및 0.1M KCl 대신 인산염 완충액(실시예 1의 현탁 매질부분에 상세히 기술됨)을 사용하여, 탄소 페이퍼 백킹 층에서 하이드록시 에틸셀룰로오즈와 결합된 로듐 또는 이리듐 함유 흑연 입자 및 글루코오즈 옥시다제의 균일층으로 이루어진 글루코오즈 옥시다제 전극을 제조한다. 400mV 대 Ag/AgCl 참조 전극에서 0 내지 40mmol/L의 범위의 기질(글루코오즈) 농도에 대해 1.5mm 디스크로 절단돈 전극 물질의 반응(μA)을 제12도 및 제13도에 각각 나타내었다(제12도, 이리듐; 제13도, 로듐). 또 한번 거의 직선 반응이 얻어진다. 로듐을 사용하여 얻은 높은 수준의 반응이 특히 주목된다.
실시예 13
콜레스테롤 옥시다제(~16U/mg) 8mg을 인산염 완충액(NaH2PO4, 1.6mmol/L; Na2HPO45.3mmol/L; NaCl 52mmol/L; EDTA 0.15mmol/L : pH 7.4) 중 5% w/v 하이드록시에틸셀룰로오즈 용액 150μl와 혼합하여 용해시킨다. 미분된 백금 흑연(5% 백금) 72mg을 가하고 혼합하여 페이스트를 생성한다.
인산염 완충액(NaH2PO42mmol/L; Na2HPO416mmol/L; NaCl 100mmol/L; EDTA 1mmol/L; Triton X100 계면활성제 0.1% v/v; pH 7.4) 중에서 2주일 동안 습윤시킨 전기 전도성 탄소 페이퍼(토레이)는 블로팅(blotting)된 건조상태이며 이에 콜레스테롤 옥시다제/백금화 흑연/HEC 페이스트를 균일하게 수동 분무한다. 생성된 페이스트 전극을 실온에서 2시간, 30℃에서 30분 동안 건조시킨다. 보존 기간을 개선시키기 위해, 전극을 2분 동안 w/v 슈크로오즈 용액에 침지시킨 다음, 20℃에서 1시간 동안 건조시킨다.
건조후 페이스트 전극을 1.5mm 디스크로 절단하고 +340mV의 전위 대 Ag/AgCl에서 2개의 전극 셀에서 콜레스테롤에 대한 반응을 시험하는데, 이때 페이스트 전극은 0.05μ 폴리카보네이트(뉴클레오포어)에 의해 보호된다. 시험하기 위해, 표준 농도 0.5, 1, 2, 4 및 6mmol/L를 제공하는 희석비에서 인산염 완충액(인산염 1mmol/L; NaCl 100mmol/L; EDTA 1mmol/L; pH 7.4) 중에서 22%의 수용성 β-사이클로덱스트린(몰레쿠졸) 중 6 mM 콜레스테롤 원액으로부터 제조된다.
전류 출력(μA)은 제14도에 나타나 있으며, 0 내지 6mmol/L 범위의 콜레스테롤 농도에 대해 필수적으로 직선 반응을 나타낸다.
실시예 14
본 발명에 따른 효소 전극은 다음과 같이 비수성 시스템을 사용하여 제조한다.
페이스트 현탁액은 다음과 같이 비수성 결합제 시스템 중에서 글루코오즈 옥시다제 10mg 및 백금 흑연 분말(5% 백금) 40mg을 사용하여 제조한다.
(a) 사이클로헥사논중 10% w/v 셀룰로오즈 아세테이트 400μl, (b) 디클로로메탄중 5% w/v 셀룰로오즈 아세테이트 부티레이트 600μl, (c) 사이클로헥사논중 5% w/v 에틸셀룰로오즈 400μl.
혼합시킨 다음, 페이스트를 전기 전도성 탄소(토레이) 백킹 페이퍼에 분무시키고 실온에서 건조시킨다.
건조시킨 다음, 피복된 백킹 페이퍼로부터 1.5mm 디스크를 절단하고 340mV 대 Ag/AgCl에서 2개의 전극 셀에서 글루코오즈에 대한 반응을 시험한다. 전극 물질을 금-가공 전극에 올려 놓고 0.03μ 폴리카보네이트(뉴클레오포어) 막에 의해 이 위치를 유지시킨다. 인산염 완충액(NaH2PO42mmol/L; Na2HPO416mmol/L; NaCl 100mmol/L; EDTA 1mmol/L; pH 7.4) 중 글루코오즈를 0, 2.5, 5, 10 및 20mmol/L 함유하는 표준 글루코오즈 용액을 사용한다. 각 경우에 셀로부터의 전류 출력(μA)은 제15도 내지 제17도에 도시한 바와 같다 :
제15도는 사이클로헥사논중 셀룰로오즈 아세테이트이다.
제16도는 디클로로메탄중 셀룰로오즈 아세테이트 부티레이트이다.
제17도는 사이클로헥사논중 에틸셀룰로오즈이다.
이들 도면은 비수성 시스템과 선택적인 저온 결합제를 사용하는 본 발명의 수행 가능성을 예시한다.

Claims (27)

  1. 미분된 백금족 금속 또는 산화물 및 하나 이상의 효소를 액체 현탁 매질에 현탁시켜 실질적으로 균일한 현탁액을 형성하고, 현탁액을 지지체 성분의 표면에 침착시킨 다음, 침착된 현탁액을 효소의 불활성화 온도 이하의 온도에서 건조시켜 미분된 백금족 금속 또는 산화물 및 효소(들)를 사실상 균일하고 균질한 피복층으로서 지지체의 표면에 침착시킴을 포함하는, 미분된 백금족 금속 또는 산화물과 하나 이상의 효소의 사실상 균질한 혼합물을 기본 지지체의 표면에 전기 전도층으로서 침착시킨 효소 전극[당해 전극은, 전극의 효소 함유층이 관련 효소 기질과 접촉하는 경우, 효소의 활성에 대해 전류적으로 반응한다]의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 현탁액이 미분된 탄소 또는 흑연 입자를 추가로 함유하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 미분된 백금족 또는 산화물의 입자가 미분된 탄소 또는 흑연 입자의 표면에 예비흡착되는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 미분된 탄소 또는 흑연 입자의 크기가 3 내지 150mm이고, 입자에 예비흡착된 미분된 백금족 금속 또는 산화물의 입자 크기가 1 내지 4mm인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 현탁액이 미분된 백금족 금속 또는 산화물과 효소(들), 경우에 따라 미분된 탄소 또는 흑연을 혼합시키기 위한 저온 결합제 [당해 저온 결합제는 효소(들)의 불활성화 온도를 초과하지 않는 온도에서 입자와 효소를 함께 결합시켜 지지체의 표면에서 응집 효소 함유층을 형성하는데 유효하다]를 추가로 함유하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 액체 현탁 매질이 수성 매질인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 결합제가 젤라틴 또는 하이드록시에틸 셀룰로오즈인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 현탁액을 인쇄공정에 의해 지지체 성분의 표면에 도포하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 현탁액을 스크린 인쇄에 의해 지지체 성분에 도포하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 지지체 성분 자체가 전기 전도성인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 전기 전도성 기질이 전기 전도성 탄소 페이퍼 또는 탄소 트랙인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 미분된 백금족 금속 성분이 미분된 백금 또는 로듐인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 사용되는 효소가 글루코오즈 옥시다제, 락테이트 옥시다제 또는 콜레스테롤 옥시다제인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 지지체 성분에 초기에 침착된 미분된 현탁액이 단지 미분된 백금족 금속 또는 산화물 경우에 따라 미분된 탄소 또는 흑연과 결합제를 포함하며, 미분돈 현탁액을 지지체 성분 위에 침착시킨 다음, 미분된 입자의 침착층을 효소 함유 용액을 사용하여 함침시키고 재건조시킴으로써, 효소가 당해층내로 도입되도록 변형된 방법.
  15. 침착된 미분된 백금족 금속 또는 산화물과 하나 이상의 효소들의 사실상 균질한 혼합물을 전기 전도성 표면층 [여기서, 당해 층은 미분된 백금족 금속 또는 산화물과 효소(들) 입자를 위한 결합제(당해 결합제는 효소(들)의 불활성화 온도를 초과하지 않는 온도에서 미분된 백금족 금속 또는 산화물 입자와 효소(들)를 지지체에 결합된 접착 응집층으로 결합시키기에 유효한 물질을 포함한다)를 추가로 함유한다] 으로서 기본 지지체 성분의 표면에 포함하는 효소 전극.
  16. 제15항에 있어서, 결합제가 수용성 또는 수분산성인 효소 전극.
  17. 제16항에 있어서, 결합제가 젤라틴 또는 하이드록시에틸 셀룰로오즈인 효소 전극.
  18. 제15항에 있어서, 효소 자체가 미분된 백금족 금속 또는 산화물에 대한 결합제로서 작용하는 효소 전극.
  19. 제15항에 있어서, 효소 함유층이 미분된 탄소 또는 흑연 입자를 추가로 함유하는 효소 전극.
  20. 제19항에 있어서, 백금족 금속 또는 산화물의 미분 입자가 탄소 또는 흑연 입자의 표면에 예비흡착되는 효소 전극.
  21. 제20항에 있어서, 탄소 또는 흑연 입자의 입자 크기가 3 내지 150nm이고, 예비흡착된 백금족 금속 또는 산화물 입자의 입자 크기가 1 내지 4nm인 효소 전극.
  22. 제15항에 있어서, 효소 함유층이 기본 지지체 성분의 표면에 인쇄되는 효소 전극.
  23. 제22항에 있어서, 효소 함유층이 지지체 성분의 표면에 스크린 인쇄되는 효소 전극.
  24. 제15항에 있어서, 기본 지지체 성분 자체가 전기 전도성 효소 전극.
  25. 제24항에 있어서, 지지체 성분이 전기 전도성 탄소 페이퍼 또는 탄소 트랙의 시이트를 포함하는 효소 전극.
  26. 제15항에 있어서, 효소 함유층이 백금족 금속 성분으로서 미분된 백금 또는 로듐을 함유하는 효소 전극.
  27. 제15항에 있어서, 효소 함유층이 효소 글루코오즈 옥시다제, 락테이트 옥시다제 또는 콜레스테롤 옥시다제를 함유하는 효소 전극.
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