JPWO2020180967A5

JPWO2020180967A5 -

Info

Publication number: JPWO2020180967A5
Application number: JP2021551927A
Authority: JP
Publication date: 2023-03-08

Claims

治療用タンパク質の高分子量（ＨＭＷ）種のインビボでのレベルをアッセイするインビトロ方法であって、
ａ．（ｉ）前記治療用タンパク質を含むサンプルと、（ｉｉ）血清又は枯渇血清の画分とを含む混合物をインキュベートすること、
及び
ｂ．工程（ａ）後の１つ又は複数の時点で、前記混合物中に存在する前記治療用タンパク質のＨＭＷ種のレベルをアッセイすること
を含み、
（ｉ）アッセイされる前記ＨＭＷ種のサイズは、約０．１ミクロン未満のサイズであるか、
（ｉｉ）前記混合物中の前記治療用タンパク質のＨＭＷ種のレベルを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりアッセイするか、又は
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方である、
インビトロ方法。 1. An in vitro method of assaying in vivo levels of high molecular weight (HMW) species of a therapeutic protein comprising:
a. incubating a mixture comprising (i) a sample comprising said therapeutic protein and (ii) serum or a fraction of depleted serum ;
and b. assaying the level of HMW species of said therapeutic protein present in said mixture at one or more time points after step (a) ;
( i) the size of said HMW species assayed is less than about 0.1 microns in size;
(ii) assaying the level of HMW species of said therapeutic protein in said mixture by size exclusion chromatography (SEC), or (iii) both (i) and (ii);
in vitro method.

アッセイされる前記ＨＭＷ種のサイズは、約１０ｎｍ～約９９ｎｍのサイズである、請求項１に記載のインビトロ方法。 2. The in vitro method of claim 1 , wherein the size of the HMW species assayed ranges in size from about 10 nm to about 99 nm.

前記ＨＭＷ種は、前記治療用タンパク質の二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、及び八量体の内の１つ又は複数を含む、請求項１に記載のインビトロ方法。 4. The method of claim 1, wherein said HMW species comprise one or more of dimers, trimers, tetramers, pentamers, hexamers, heptamers, and octamers of said therapeutic protein. 1. The in vitro method according to 1 .

（ｉ）前記方法は、工程（ａ）前に前記サンプル中に存在するＨＭＷ種のレベルをアッセイすることをさらに含むか、又は（ｉｉ）工程（ａ）前に前記サンプル中に存在するＨＭＷ種のレベルは既知である、請求項１に記載のインビトロ方法。 (i) the method further comprises assaying the level of HMW species present in the sample prior to step (a), or (ii) the HMW species present in the sample prior to step (a); 2. The in vitro method of claim 1, wherein the level of is known.

工程（ｂ）でアッセイされる際に前記混合物中に存在するＨＭＷ種のレベルと、工程（ａ）前に前記サンプル中に存在するＨＭＷ種のレベルとを比較することをさらに含み、工程（ｂ）でアッセイされる際に前記混合物中に存在する前記治療用タンパク質の二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、及び八量体の内の１つ又は複数のレベルと、工程（ａ）前の前記サンプル中の前記治療用タンパク質の二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、及び八量体のレベルとを比較する、請求項１に記載のインビトロ方法。 further comprising comparing the level of HMW species present in said mixture as assayed in step (b) with the level of HMW species present in said sample prior to step (a) ; of dimers, trimers, tetramers, pentamers, hexamers, heptamers and octamers of said therapeutic protein present in said mixture when assayed in b) one or more levels and dimers, trimers, tetramers, pentamers, hexamers, heptamers and octamers of said therapeutic protein in said sample prior to step (a) 2. The in vitro method of claim 1 , wherein comparing to body levels.

方程式１：

に従って、前記治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性の割合を算出することをさらに含む請求項１～５のいずれか一項に記載のインビトロ方法。 Equation 1:

6. The in vitro method of any one of claims 1-5 , further comprising calculating the percentage in vivo reversibility of the HMW species of said therapeutic protein according to.

工程（ａ）は、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１８時間、又は少なくとも約２４時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４２時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、又は少なくとも約１週間にわたり前記混合物をインキュベートすることを含む、請求項１に記載のインビトロ方法。 step (a) for at least about 1 hour, at least about 2 hours, at least about 3 hours , at least about 4 hours, at least about 6 hours, at least about 12 hours, at least about 18 hours, or at least about 24 hours ; incubating the mixture for at least about 30 hours, at least about 36 hours, at least about 42 hours, at least about 48 hours, at least about 3 days, at least about 4 days, at least about 5 days, or at least about 1 week; The in vitro method of claim 1 .

前記治療用タンパク質は、ホルモン、サイトカイン、リンホカイン、融合タンパク質、抗体、その抗原結合断片、又は抗体タンパク質製品から選択される組換えタンパク質である、請求項１～５又は７のいずれか一項に記載のインビトロ方法。 8. Any one of claims 1-5 or 7 , wherein the therapeutic protein is a recombinant protein selected from hormones, cytokines, lymphokines, fusion proteins, antibodies, antigen-binding fragments thereof, or antibody protein products. in vitro method.

前記治療用タンパク質は、約１０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬの最終濃度で前記混合物中に存在する、請求項８に記載のインビトロ方法。 9. The in vitro method of claim 8 , wherein said therapeutic protein is present in said mixture at a final concentration of about 10 μg/mL to about 300 μg/mL.

前記混合物は、工程（ａ）の開始時に、約８７％（ｖ／ｖ）を超える血清又は枯渇血清を含む、請求項１に記載のインビトロ方法。 2. The in vitro method of claim 1 , wherein the mixture comprises greater than about 87% (v/v) serum or depleted serum at the start of step (a).

前記血清の枯渇画分は、ＩｇＧ枯渇血清画分である、請求項１又は１０のいずれかに記載のインビトロ方法。 11. The in vitro method of any of claims 1 or 10 , wherein said serum depleted fraction is an IgG depleted serum fraction.

前記血清の枯渇画分は、約３０ｋＤａ～約３００ｋＤａであるか、又はより高い、予め選択された分子量範囲を有する分子が枯渇した画分である、請求項１１に記載のインビトロ方法。 12. The in vitro method of claim 11 , wherein said depleted fraction of serum is a fraction depleted in molecules having a preselected molecular weight range of about 30 kDa to about 300 kDa or higher .

前記枯渇画分は、２回枯渇画分である、請求項１１に記載のインビトロ方法。 12. The in vitro method of claim 11 , wherein said depleted fraction is a twice depleted fraction.

前記混合物は、全血清を含む、請求項１又は１０に記載のインビトロ方法。 11. The in vitro method of claim 1 or 10 , wherein said mixture comprises whole serum.

前記全血清は、ヒト血清である、請求項１４に記載のインビトロ方法。 15. The in vitro method of claim 14 , wherein said whole serum is human serum.

（ｉ）前記サンプルは、蛍光標識を含む治療用タンパク質を含むか、又は（ｉｉ）前記方法は、工程（ａ）前に、前記治療用タンパク質を蛍光標識で標識することをさらに含む、請求項１５に記載のインビトロ方法。 10. The claim wherein (i) the sample comprises a therapeutic protein comprising a fluorescent label, or (ii) the method further comprises labeling the therapeutic protein with a fluorescent label prior to step (a). The in vitro method according to 15 .

工程（ａ）後に且つ工程（ｂ）前に、希釈工程をさらに含む、請求項１６に記載のインビトロ方法。 17. The in vitro method of claim 16 , further comprising a dilution step after step (a) and before step (b).

工程（ｂ）は、ＳＥＣにより、血清又はその枯渇画分を含む前記混合物中のＨＭＷ種のレベルをアッセイすることを含む、請求項１に記載のインビトロ方法。 2. The in vitro method of claim 1 , wherein step (b) comprises assaying the level of HMW species in said mixture comprising serum or a depleted fraction thereof by SEC.

工程（ａ）後に且つ工程（ｂ）前に、前記混合物の成分を分離することをさらに含む請求項１に記載のインビトロ方法。 2. The in vitro method of claim 1 , further comprising separating components of said mixture after step (a) and before step (b).

前記成分を、親和性クロマトグラフィーにより分離する、請求項１９に記載のインビトロ方法。 20. The in vitro method of claim 19 , wherein said components are separated by affinity chromatography.

前記親和性クロマトグラフィーは、酸性溶出緩衝液により溶出させることを含む溶出工程を含む、請求項２０に記載のインビトロ方法。 21. The in vitro method of claim 20 , wherein said affinity chromatography comprises an elution step comprising eluting with an acidic elution buffer.

前記溶出工程により、前記治療用タンパク質を含む溶出液が得られ、前記方法は、前記溶出液中に存在する前記治療用タンパク質のＨＭＷ種のレベルをアッセイすることを含む、請求項２１に記載のインビトロ方法。 22. The method of claim 21 , wherein said eluting step results in an eluate comprising said therapeutic protein, said method comprising assaying the level of HMW species of said therapeutic protein present in said eluate. in vitro method.

治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性を決定する方法であって、（Ａ）請求項１～２２のいずれか一項に記載のインビトロ方法により治療用タンパク質の高分子量（ＨＭＷ）種のインビボでのレベルをアッセイすることを含み、（ｉ）該方法は、前記インキュベートする工程前に前記サンプル中に存在するＨＭＷ種のレベルをアッセイすることをさらに含むか、又は（ｉｉ）前記インキュベートする工程前に前記サンプル中に存在するＨＭＷ種のレベルは既知であり、及び（Ｂ）前記混合物中に存在するＨＭＷ種のレベルと、前記インキュベートする工程前に前記サンプル中に存在するＨＭＷ種のレベルとを比較することを含む方法。 A method for determining in vivo reversibility of HMW species of a therapeutic protein, comprising: (A) determining the in vivo reversibility of a high molecular weight (HMW) species of a therapeutic protein by an in vitro method according to any one of claims 1-22 ; (i) the method further comprises assaying the level of HMW species present in said sample prior to said incubating, or (ii) said incubating The level of HMW species present in the sample prior to the step is known, and (B) the level of HMW species present in the mixture and the level of HMW species present in the sample prior to the incubating step. A method comprising comparing with.

治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性を決定する方法であって、
ａ．前記治療用タンパク質を含むサンプルと、枯渇血清とを含む混合物をインキュベートする工程であって、前記枯渇血清は、予め選択された分子量範囲を有する分子が枯渇した画分であり、前記予め選択された分子量範囲は、約３０ｋＤａ～約３００ｋＤａであるか、又はより高く、前記枯渇画分は、サイズに基づくろ過により得られた画分である、工程、
ｂ．ＳＥＣにより、工程（ａ）後の１つ又は複数の時点で、前記混合物中に存在する前記治療用タンパク質のＨＭＷ種のレベルをアッセイする工程、
ｃ．工程（ｂ）でアッセイされる際に前記混合物中に存在する前記ＨＭＷ種のレベルと、工程（ａ）前に前記サンプル中に存在する前記ＨＭＷ種のレベルとを比較する工程、
及び
ｄ．前記治療用タンパク質の前記ＨＭＷ種のインビボでの可逆性の割合を算出する工程
を含む方法。 A method for determining in vivo reversibility of HMW species of a therapeutic protein comprising:
a. incubating a mixture comprising a sample comprising said therapeutic protein and depleted serum, wherein said depleted serum is a fraction depleted in molecules having a preselected molecular weight range , said preselected the molecular weight range is about 30 kDa to about 300 kDa or higher , and said depleted fraction is a fraction obtained by size-based filtration;
b. assaying the level of HMW species of said therapeutic protein present in said mixture at one or more time points after step (a) by SEC;
c. comparing the level of said HMW species present in said mixture as assayed in step (b) to the level of said HMW species present in said sample prior to step (a);
and d. A method comprising calculating the percentage of in vivo reversibility of said HMW species of said therapeutic protein.

前記治療用タンパク質は、分子量が約１５ｋＤａであるか、又はより高い、請求項２４に記載の方法。 25. The method of claim 24 , wherein said therapeutic protein has a molecular weight of about 15 kDa or higher.

治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性を決定する方法であって、
ａ．前記治療用タンパク質を含むサンプルと、枯渇血清とを含む混合物をインキュベートする工程であって、前記枯渇血清は、ＩｇＧ枯渇血清画分である、工程、
ｂ．捕捉分子による親和性クロマトグラフィーにより前記混合物の成分を分離して、前記治療用タンパク質及びそのＨＭＷ種を含む画分を得る工程、
ｃ．ＳＥＣにより、前記画分中に存在する前記治療用タンパク質のＨＭＷ種のレベルをアッセイする工程、
ｄ．工程（ｃ）でアッセイされる際に前記画分中に存在する前記ＨＭＷ種のレベルと、工程（ａ）前に前記サンプル中に存在する前記ＨＭＷ種のレベルとを比較する工程、
並びに
ｅ．前記治療用タンパク質の前記ＨＭＷ種のインビボでの可逆性の割合を算出する工程
を含む方法。 A method for determining in vivo reversibility of HMW species of a therapeutic protein comprising:
a. incubating a mixture comprising a sample comprising said therapeutic protein and depleted serum, wherein said depleted serum is an IgG depleted serum fraction;
b. separating the components of said mixture by affinity chromatography with a capture molecule to obtain a fraction containing said therapeutic protein and its HMW species;
c. assaying the level of HMW species of said therapeutic protein present in said fraction by SEC;
d. comparing the level of said HMW species present in said fraction as assayed in step (c) to the level of said HMW species present in said sample prior to step (a);
and e. A method comprising calculating the percentage of in vivo reversibility of said HMW species of said therapeutic protein.

前記捕捉分子は、プロテインＡであり、前記治療用タンパク質は、プロテインＡに結合する、請求項２６に記載の方法。 27. The method of claim 26 , wherein said capture molecule is protein A and said therapeutic protein binds to protein A.

治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性を決定する方法であって、
ａ．前記治療用タンパク質を含むサンプルと、全血清とを含む混合物をインキュベートする工程であって、前記治療用タンパク質は、蛍光標識を含む、工程、
ｂ．前記混合物を希釈する工程、
ｃ．ＳＥＣにより、工程（ａ）後の１つ又は複数の時点で、前記混合物中に存在する前記治療用タンパク質のＨＭＷ種のレベルをアッセイする工程、
ｄ．工程（ｃ）でアッセイされる際に前記混合物中に存在する前記ＨＭＷ種のレベルと、工程（ａ）前に前記サンプル中に存在する前記ＨＭＷ種のレベルとを比較する工程、
及び
ｅ．前記治療用タンパク質の前記ＨＭＷ種のインビボでの可逆性の割合を算出する工程
を含む方法。 A method for determining in vivo reversibility of HMW species of a therapeutic protein comprising:
a. incubating a mixture comprising a sample containing the therapeutic protein and whole serum, wherein the therapeutic protein comprises a fluorescent label;
b. diluting the mixture;
c. assaying the level of HMW species of said therapeutic protein present in said mixture at one or more time points after step (a) by SEC;
d. comparing the level of said HMW species present in said mixture as assayed in step (c) to the level of said HMW species present in said sample prior to step (a);
and e. A method comprising calculating the percentage of in vivo reversibility of said HMW species of said therapeutic protein.

治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性を決定する方法であって、
ａ．前記治療用タンパク質を含むサンプルと、全血清とを含む混合物をインキュベートする工程、
ｂ．捕捉分子による親和性クロマトグラフィーにより、前記混合物の成分を分離して、前記治療用タンパク質及びそのＨＭＷ種を含む画分を得る工程、
ｃ．ＳＥＣにより、前記画分中に存在する前記治療用タンパク質のＨＭＷ種のレベルをアッセイする工程、
ｄ．工程（ｃ）でアッセイされる際に前記画分中に存在する前記ＨＭＷ種のレベルと、工程（ａ）前に前記サンプル中に存在する前記ＨＭＷ種のレベルとを比較する工程、
並びに
ｅ．前記治療用タンパク質の前記ＨＭＷ種のインビボでの可逆性の割合を算出する工程
を含む方法。 A method for determining in vivo reversibility of HMW species of a therapeutic protein comprising:
a. incubating a mixture comprising a sample comprising said therapeutic protein and whole serum;
b. separating the components of said mixture by affinity chromatography with a capture molecule to obtain a fraction containing said therapeutic protein and its HMW species;
c. assaying the level of HMW species of said therapeutic protein present in said fraction by SEC;
d. comparing the level of said HMW species present in said fraction as assayed in step (c) to the level of said HMW species present in said sample prior to step (a);
and e. A method comprising calculating the percentage of in vivo reversibility of said HMW species of said therapeutic protein.

前記捕捉分子は、前記治療用タンパク質に結合する抗体又は抗体以外の分子である、請求項２９に記載の方法。 30. The method of claim 29 , wherein said capture molecule is an antibody or molecule other than an antibody that binds said therapeutic protein.

工程（ｂ）は、（ｉ）前記混合物を親和性クロマトグラフィーカラムにロードして、前記治療用タンパク質を含む結合画分を得ること、及び（ｉｉ）前記結合画分を前記カラムから溶出させることを含む、請求項３０に記載の方法。 Step (b) comprises (i) loading said mixture onto an affinity chromatography column to obtain a bound fraction comprising said therapeutic protein; and (ii) eluting said bound fraction from said column. 31. The method of claim 30 , comprising:

前記治療用タンパク質の前記ＨＭＷ種のインビボでの可逆性の割合を、方程式１に従って算出する、請求項２４～３１のいずれか一項に記載の方法。 32. The method of any one of claims 24-31 , wherein the percentage in vivo reversibility of said HMW species of said therapeutic protein is calculated according to Equation 1.