FI95579B - Immunological method and means for the selective determination of intact procollagen peptide (type III) and procollagen (type III) in body fluids - Google Patents
Immunological method and means for the selective determination of intact procollagen peptide (type III) and procollagen (type III) in body fluids Download PDFInfo
- Publication number
- FI95579B FI95579B FI882018A FI882018A FI95579B FI 95579 B FI95579 B FI 95579B FI 882018 A FI882018 A FI 882018A FI 882018 A FI882018 A FI 882018A FI 95579 B FI95579 B FI 95579B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- type iii
- peptide
- procollagen
- amino
- intact
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 47
- 108010050808 Procollagen Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 20
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 title claims description 6
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 title abstract description 10
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 title abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 5
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 claims description 5
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 3
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 claims description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 3
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 claims 3
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 claims 3
- 241000283903 Ovis aries Species 0.000 claims 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims 1
- 102000001187 Collagen Type III Human genes 0.000 abstract 1
- 108010069502 Collagen Type III Proteins 0.000 abstract 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- KYRUKRFVOACELK-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(4-hydroxyphenyl)propanoate Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O KYRUKRFVOACELK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241001474728 Satyrodes eurydice Species 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 101710123661 Venom allergen 5 Proteins 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 208000018631 connective tissue disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- CSHFHJNMIMPJST-HOTGVXAUSA-N methyl (2s)-2-[[(2s)-2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoate Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 CSHFHJNMIMPJST-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Abstract
Description
, 95579, 95579
Immunologinen menetelmä intaktin prokollageenipepti-din (tyyppi III) ja prokollageenin (tyyppi III) määrittämiseksi selektiivisesti elimistönesteistä ja väline sen toteuttamiseksi 5Immunological method for the selective determination of intact procollagen peptide (type III) and procollagen (type III) in body fluids and means for its implementation 5
Prokollageenipeptidi (tyyppi III) on kollageenin (tyyppi III) aminoterminaalinen propeptidi, joka pilkkoutuu solun ulkopuolisesti prokollageenimolekyy-lin (tyyppi III) erittymisen jälkeen. Radioimmunologi-10 sella määritysmenetelmällä, jota kuvataan EP-julkaisus sa 4940, voidaan määrittää tämän prokollageenipeptidin pitoisuus elimistönesteissä. Seerumin peptidipitoisuu-den tunteminen antaa tietoa sidekudossairauksien, esimerkiksi maksasairauksien aktiivisuudesta /Rohde, H.A procollagen peptide (type III) is an amino-terminal propeptide of collagen (type III) that is cleaved extracellularly after secretion of a procollagen molecule (type III). The radioimmunoassay method described in EP 4940 can be used to determine the concentration of this procollagen peptide in body fluids. Knowledge of serum peptide levels provides information on the activity of connective tissue diseases, e.g. liver diseases / Rohde, H.
15 et ai., Eur. J. Clin. Invest. 9 (1979) 451 - 4597·15 et al., Eur. J. Clin. Invest. 9 (1979) 451 - 4597 ·
Prokollageenipeptidin (tyyppi III) tarkka selek-tiiviinen määrittäminen seerumista ja muista elimistö-nesteistä ei kuitenkaan ole mahdollista tähän mennessä kuvatuilla menetelmillä, koska polyklonaaliset vasta-20 aineet, joita käytetään näissä menetelmissä, reagoivat erilaisten seerumissa esiintyvien antigeenien, jotka ovat osaksi prokollageenipeptidin (tyyppi III) hajoamistuotteita, kanssa vaihtelevalla, alemmalla affiniteetilla /Niemelä, O. et ai., Clin. Chim. Acta 124 25 (1982) 39 - 447· Tämä johtaa siihen, etteivät seeru- • mistä ja muista elimistönesteistä saatavat laimennus- käyrät ole yhdensuuntaisia pelkästä prokollageenipep-tidistä (tyyppi III) saadun kalibrointikäyrän kanssa ja kustakin tuntemattomasta näytteestä täytyy siten 30 määrittää antigeenipitoisuus useasta laimennoksesta antigeenipitoisuuden määrittämiseksi laimennuskäyrien « · 50 %:n leikkauskohdan avulla.However, accurate selective determination of procollagen peptide (type III) in serum and other body fluids is not possible by the methods described so far because the polyclonal antibodies used in these methods react with various serum antigens that are part of the procollagen peptide (type III). ) degradation products, with varying, lower affinity / Niemelä, O. et al., Clin. Chim. Acta 124 25 (1982) 39-447 · This means that the dilution curves obtained from serum and other body fluids are not parallel to the calibration curve obtained from procollagen peptide alone (type III) and the antigen content of several unknown samples must therefore be determined from several dilutions. to determine the antigen content using the «· 50% intersection of the dilution curves.
Tämän menetelmän lisäheikkoutena on se, että vasta-aineen ja rotan tai hiiren antigeenin välisen 35 heikon ristireaktiivisuuden takia ei ole ollut mahdol- 2 95579 lista määrittää näiden lajien elimistönesteiden antigee-nipitoisuutta.A further disadvantage of this method is that, due to the poor cross-reactivity between the antibody and the rat or mouse antigen, it has not been possible to determine the antigen content of the body fluids of these species.
Menetelmällä, jota ovat kuvanneet Schuppan et ai.By the method described by Schuppan et al.
/J. Hepatol. 3 (1986) 27 - 377/ voidaan määrittää antigee-5 nipitoisuus rotan seerumissa. Tälläkin menetelmällä on kuitenkin se sama ihmisseerumille tarkoitetun menetelmän yhteudessä kuvattu haittapuoli TNiemelä et ai., Clin./ J. Hepatol. 3 (1986) 27-377 / the antigen-5 content in rat serum can be determined. However, this method also has the same disadvantage described in connection with the method for human serum, TNiemelä et al., Clin.
Chim. Acta 124 (1982) 39 - 447/ että eri elimistönesteiden inhibitiokäyrät eivät ole yhdensuuntaisia.Chim. Acta 124 (1982) 39-447 / that the inhibition curves of different body fluids are not parallel.
10 EP-hakemusjulkaisun 0 089 008 mukaisen menetelmän avulla on mahdollista ratkaista tämä tekninen ongelma käyttämällä vasta-aineita, joilla on vertailukelpoinen affiniteetti intaktin prokollageenipeptidin (tyyppi III) ja sen pilkkoutumistuotteen Col 1 suhteen. Tällä menetel-15 mällä määritetään intakti ja pilkkoutunut prokollageeni- peptidi (tyyppi III) yhdessä, mikä kuitenkin johtaa diagnostisen lausunnon epätarkkuuteen, koska normaali- ja potilasryhmät voivat olla voimakkaasti päällekkäisiä.The method of EP-A-0 089 008 makes it possible to solve this technical problem by using antibodies with a comparable affinity for the intact procollagen peptide (type III) and its cleavage product Col 1. This method determines intact and cleaved procollagen peptide (type III) together, which, however, leads to inaccurate diagnostic opinion, as there may be strong overlap between normal and patient groups.
Yllättävästi on nyt havaittu, että käyttämällä 20 peptidiä, jolla on tietty aminohapposekvenssi, voidaan saada immunisointia varten vasta-aineita, joiden avulla on mahdollista määrittää intakti prokollageenipeptidi (tyyppi III) spesifisesti. Näiden vasta-aineiden avulla voidaan yllättävästi määrittää prokollageenipeptidin 25 (tyyppi III) pitoisuus myös rotan tai hiiren elimistö- nesteistä, mikä on hyödyksi fibrosuppressiivisten aineiden tutkimisessa eläinkokein.Surprisingly, it has now been found that by using 20 peptides having a certain amino acid sequence, antibodies can be obtained for immunization, which make it possible to determine the intact procollagen peptide (type III) specifically. Surprisingly, these antibodies can also be used to determine the concentration of procollagen peptide 25 (type III) in rat or mouse body fluids, which is useful in the study of fibrosuppressive agents in animal experiments.
Keksintö koskee siten menetelmää aminoterminaali-sen prokollageenipeptidin (tyyppi III) määrittämiseksi im-30 munologisesti vasta-aineiden avulla, jolle menetelmälle ; on tunnusmerkillistä, että a) eläimet immunisoidaan peptidillä, jolla on sekvenssi I-C-E-S-C-P-T-G-G-Q-N-Y-S-P, 35 ja joka on sidottu immunogeeniseen proteiiniin, 95579 b) otetaan seerumista talteen vasta-aineet, jotka reagoivat intaktin aminoterminaalisen prokollageenipepti-din (tyyppi III) kanssa ja c) määritetään aminoterminaalisen prokollageeni- 5 peptidin (tyyppi III) ja prokollageenin (tyyppi III) mää rä muodostuneen antigeeni - vasta-aine-kompleksin kautta.The invention thus relates to a method for the immunological determination of an amino-terminal procollagen peptide (type III) by means of antibodies to which method; characterized in that a) the animals are immunized with a peptide having the sequence ICESCPTGGQNYSP, 35 and bound to an immunogenic protein, 95579 b) antibodies are reacted from the serum which react with the intact amino-terminal procollagen peptide (type III) and c) are determined the amount of procollagen peptide (type III) and procollagen (type III) through the antigen-antibody complex formed.
Keksintö koskee lisäksi vasta-aineita, joita muodostuu immunisoitaessa eläimiä edellä mainitulla peptidillä, joka on sidottu immunogeeniseen proteiiniin.The invention further relates to antibodies formed upon immunization of animals with the above-mentioned peptide bound to an immunogenic protein.
10 Seuraavassa kuvataan yksityiskohtaisesti keksin töä, erityisesti sen edullisia suoritusmuotoja. Keksintö määritellään lisäksi patenttivaatimuksissa.The invention, in particular the preferred embodiments thereof, is described in detail below. The invention is further defined in the claims.
Vasta-aineiden valmistamiseksi immunisoidaan eläimiä, edullisesti jyrsijöitä, kuten esimerkiksi kaniineja 15 tai marsuja, tai vuohia tai lampaita sopivaan immunogee niseen proteiiniin kytketyllä peptidillä, jolla on sekvenssi _ „ I-C-E-S-C-P-T-G-G-Q-N-Y-S-P , täydellisen apuaineen läsnä ollessa. Erityisen edullises- * 20 ti käytetään kaniineja. Immuunivastetta voimistetaan tois tetuilla sekundaari-injektioilla, esimerkiksi 4-8 viikon kuluttua. Immunisoitumisen onnistuminen tarkistetaan määrittämällä vasta-ainepitoisuus radioimmunologisella sitoutumistestillä (R. Timpl ja L. Risteli, Immunochemistry . 25 of the extracellular matrix, voi. 1, H. Furthmayr Ed.To prepare antibodies, animals, preferably rodents, such as rabbits or guinea pigs, or goats or sheep are immunized with a peptide of the sequence I-C-E-S-C-P-T-G-G-Q-N-Y-S-P in the presence of a complete excipient. Rabbits are particularly preferred. The immune response is enhanced by repeated secondary injections, for example after 4 to 8 weeks. The success of immunization is checked by determining the antibody concentration by a radioimmunological binding assay (R. Timpl and L. Risteli, Immunochemistry. 25 of the extracellular matrix, vol. 1, H. Furthmayr Ed.
1982, s. 199).1982, p. 199).
Soveltuvia proteiineja, joihin mainittu peptidi voidaan liittää, ovat kaikki immunogeeniset proteiinit. Edullisesti käytetään hemosyaniinia, albumiinia tai poly-30 lysiiniä. Peptidi voidaan valmistaa alan ammattimiesten ; tuntemin menetelmin, kuten esimerkiksi menetelmillä, joi ta kuvaavat G. Barany ja A. B. Merrifield (The Peptides, • voi. 2, Academic Press 1980, s. 3 - 254) tai E. Brown, R. C. Sheppard ja B. J. Williams [β. Chem. Soc. Perkin 35 Transact. 1 (1983) 116t7.Suitable proteins to which said peptide can be attached are all immunogenic proteins. Preferably hemocyanin, albumin or poly-30 lysine is used. The peptide can be prepared by those skilled in the art; by known methods, such as those described by G. Barany and A. B. Merrifield (The Peptides, • Vol. 2, Academic Press 1980, pp. 3-254) or E. Brown, R. C. Sheppard and B. J. Williams [β. Chem. Soc. Perkin 35 Transact. 1 (1983) 116t7.
4 955794,95579
Keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan käyttää seerumina tai puhdistettuina erilaisissa immunologisissa menetelmissä mukaan luettuina radioimmuunimääritysten kaikki muodot, esimerkiksi sekventiaalisissa kyllästys-5 analyyseissa tai tasapainoanalyyseissä, leimaamisessa klo ramiini T:llä tai Bolton - Hunter-reagenssilla ^Felber,The antibodies of the invention can be used as serum or purified by a variety of immunological methods, including all forms of radioimmunoassays, for example, in sequential saturation-5 assays or equilibrium assays, labeling with chloramine T or Bolton-Hunter reagent ^ Felber,
Meth. Biochem. Anal. 22 (1974) 1; Shelley et ai., Clin.Meth. Biochem. Anal. 22 (1974) 1; Shelley et al., Clin.
Chem. 19 (1975) 1467 samoin kuin muissa kompetitiivisis-sa sitoutumismäärityksissä, kuten fluoresenssi-, entsyy-10 mi-, kemiluminesenssi- tai muissa immuunimäärityksissä.Chem. 19 (1975) 1467 as well as in other competitive binding assays such as fluorescence, enzyme-10 mi, chemiluminescence or other immunoassays.
Vasta-aineita voidaan siten käyttää immunologisissa menetelmissä kudoksissa ja elimistönesteissä esiintyvän pro-kollageenipeptidin (tyyppi III) eristämiseksi ja karakte-risoimiseksi samoin kuin määrittämiseksi kvantitatiivi-15 sesti. Kvantitatiivisen määrityksen tekemiseksi käyte tään alan ammattimiesten sinänsä tuntemia menetelmiä, joissa nestemäinen näyte, joka sisältää prokollageenipep-tidiä (tyyppi III), saatetaan reagoimaan keksinnön mukaisten vasta-aineiden kanssa ja määritetään prokollageenipep-20 tidin (tyyppi III) määrä muodostuneen antigeeni - vasta- aine-kompleksin kautta. Tällöin ei ole merkitystä sillä seikalla, onko prokollageenipeptidi (tyyppi III) vielä kytkeytyneenä prokollageenin (tyyppi III) aminopäähän vai ei. Keksinnön mukaiset vasta-aineet eivät tunnista 25 immunologista määritystä tähän asti häirinneitä prokol- lageenipeptidin (tyyppi III) hajoamistuotteita, erityisesti Col l:ä.The antibodies can thus be used in immunological methods to isolate and characterize procollagen peptide (type III) present in tissues and body fluids, as well as to quantify them. For the quantitative determination, methods known per se to those skilled in the art are used, in which a liquid sample containing procollagen peptide (type III) is reacted with the antibodies according to the invention and the amount of procollagen peptide (type III) is determined antigen-antibody formed. through the complex. In this case, it is irrelevant whether or not the procollagen peptide (type III) is still linked to the amino terminus of the procollagen (type III). The antibodies of the invention do not recognize degradation products of the procollagen peptide (type III), in particular Col 1, which have hitherto interfered with the immunoassay.
Keksintöä valaistaan tarkemmin seuraavissa esimerk-keissä. Prosenttisuudet ovat painoprosentteina, ellei 30 toisin mainita.The invention is further illustrated by the following examples. Percentages are by weight unless otherwise indicated.
* 955 79* 955 79
Esimerkki 1Example 1
Peptidi-hemosyaniinikonjugaattiyhdisteen valmistus 100 mg hemosyaniinia /dialysoitu vettä (5x31) vastaan ja kylmäkuivattu sitten7 liuotetaan veteen (3 ml), 5 ja lisätään 24 mg peptidiä I-C-E-S-C-P-T-G-G-Q-N-Y-S-P .Preparation of Peptide-Hemocyanine Conjugate Compound 100 mg of hemocyanin / dialyzed against water (5x31) and lyophilized then7 is dissolved in water (3 ml), 5 and 24 mg of peptide I-C-E-S-C-P-T-G-G-Q-N-Y-S-P are added.
Huoneen lämpötilassa sekoittaen lisätään 2 tunnin aikana annoksittain kaikkiaan 1 g. N-sykloheksyyli-N'-/2-(4-morfolinyyli)-etyyli7karbodi-imidi-metyyli-p-tolueenisul-fonaattia. Kun reaktioseosta on sekoitettu yön yli, sitä 10 dialysoidaan 24 tuntia vettä (5 x 10 1) vastaan, ja eris tetään tuote sitten kylmäkuivaamalla. Saadaan 137 mg kon-jugaattiyhdistettä.With stirring at room temperature, a total of 1 g is added portionwise over 2 hours. N-cyclohexyl-N '- / 2- (4-morpholinyl) -etyyli7karbodi carbodiimide-methyl-p--toluenesul-sulfonate. After stirring overnight, the reaction mixture is dialyzed against water (5 x 10 L) for 24 hours, and the product is then isolated by freeze-drying. 137 mg of the conjugate compound are obtained.
Esimerkki 2Example 2
Radioimmuunisitoutumistesti 15 300 yul esimerkin 1 mukaisesti valmistetulla kon- jugaatilla immunisoidun kaniinin antiseerumia, joka on laimennettu sopivalla tavalla, inkuboidaan yön yli liuoksen (100 yul) kanssa, joka sisältää prokollageenipepti-diä (tyyppi III) (1 ng proteiinia/100 ^ul, valmistettu 20 EP-julkaisun 4940 esimerkin 1 mukaisesti), joka on radio- 1 25 leimattu I:llä. Muodostuneet antigeeni - vasta-aine-kompleksit saostetaan lisäämällä immunisointiin käytetyn lajin immunoglobuliini G:n vastaista toisen lajin anti-seerumia. Sentrifugoinnin ja supernatantin dekantoinnin 25 jälkeen määritetään saostuneen radioaktiivisuuden määrä ;· V-skintillaatiospektrometrillä.Radioimmunoassay Assay Rabbit antiserum immunized with the conjugate prepared according to Example 1, diluted as appropriate, is incubated overnight with a solution (100 μl) containing procollagen peptide (type III) (1 ng protein / 100 μl). 20 according to Example 1 of EP 4940) which is radiolabeled with I. The antigen-antibody complexes formed are precipitated by the addition of an antiserum of another species against immunoglobulin G of the species used for immunization. After centrifugation and decantation of the supernatant, the amount of radioactivity precipitated is determined by V scintillation spectrometry.
Esimerkki 3Example 3
Radioimmuunitesti 0,2 ml analysoitavaa näytettä tai prokollageeni-30 peptidi (tyyppi III) -standardia inkuboidaan lämpötilas sa 4°C yön yli antiseerumin (0,1 mlrssa puskuria) kanssa, ' * jonka määrä on rajoitettu leimatun antigeenin määrän suh- 1 25 teen. KGn on lisätty 0,1 ml I-leimattua prokollageeni-peptidin (tyyppi III) liuosta (sisältää 1 ng proteiinia), 35 inkuboidaan 6-8 tuntia lämpötilassa 4°C. Muodostunut 6 95579 antigeeni - vasta-aine-kompleksi saostetaan immunisointiin käytetyn lajin IgG:n vastaisella antiseerumilla. Sentrifugoinnin ja supernatantin dekantoinnin jälkeen määritetään saostunut radioaktiivisuus ‘Y'-skintillaatio-5 spektrometrillä.Radioimmunoassay 0.2 ml of the test sample or procollagen-30 peptide (type III) standard is incubated at 4 ° C overnight with antiserum (0.1 ml in buffer) limited to the amount of labeled antigen. . KGn is supplemented with 0.1 ml of an I-labeled solution of procollagen peptide (type III) (containing 1 ng of protein), incubated for 6-8 hours at 4 ° C. The 6,95579 antigen-antibody complex formed is precipitated with an antiserum against IgG of the species used for immunization. After centrifugation and decantation of the supernatant, the precipitated radioactivity is determined on a ‘Y’ scintillation spectrometer.
Vertaamalla kalibrointikäyrään, jonka muodostamiseen on käytetty standardeja, joissa prokollageenipepti-din (tyyppi III) pitoisuus vaihtelee, voidaan määrittää prokollageenipeptidin (tyyppi III) pitoisuus tuntematto-10 massa liuoksessa.By comparing with a calibration curve constructed using standards in which the concentration of procollagen peptide (type III) varies, the concentration of procollagen peptide (type III) in an unknown mass solution can be determined.
Esimerkki 4Example 4
Keksinnön mukaisten vasta-aineiden kanssa reagoivien antigeenien molekyylipainojakakutuman määrittäminen esimerkiksi naudan tai sian seerumista 15 Seeruminäytteelle (1 ml) tehdään geelisuodatuskro- matografinen erotus Sephacryl S 30 <β> -pylväällä (1,6 x 130 cm) , joka on tasapainotettu fosfaattipuskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa (PBS), joka sisältää 0,04 % Tween 20:ä. Kustakin fraktiosta (2,8 ml) käytetään 20 0,2 ml esimerkin 3 mukaiseen radioimmuunitestiin.Determination of the molecular weight distribution of antigens reactive with the antibodies of the invention, for example from bovine or porcine serum. A serum sample (1 ml) is subjected to gel filtration chromatography on a Sephacryl S 30 <β> column (1.6 x 130 cm) equilibrated in phosphate buffered saline. PBS) containing 0.04% Tween 20. 0.2 ml of each fraction (2.8 ml) is used for the radioimmunoassay of Example 3.
Kuvio 1a esittää sian seerumin antigeenin eluoitu-miskäyrää ja kuvio 1b naudan seerumin eluoitumiskäyrää verrattuina EP-julkaisun 4940 mukaisesti määritetyn antigeenin käyrään. Piikit 1/1 a vastaavat intaktia prokolla-25 geeniä (tyyppi III) tai pN-kollageenia (tyyppi III) (prokollageeni, josta puuttuu C-terminaalinen pää); piikit 2/2a vastaavat intaktia aminoterminaalista prokolla-geenipeptidiä (tyyppi III); piikit 3/3a vastaavat Col l:ä samoin kuin aminoterminaalisen prokollageenipeptidin 30 (tyyppi III) pilkkoutumistuotteita, joilla on sama mole- . kyylipaino kuin Col l:llä.Figure 1a shows the elution curve of porcine serum antigen and Figure 1b the elution curve of bovine serum compared to the antigen curve determined according to EP 4940. Peaks 1/1 a correspond to the intact procoll-25 gene (type III) or pN-collagen (type III) (procollagen lacking the C-terminus); peaks 2 / 2a correspond to an intact amino-terminal procolla gene peptide (type III); peaks 3 / 3a correspond to Col 1 as well as cleavage products of the amino-terminal procollagen peptide 30 (type III) having the same molecular. body weight than with Col l.
I : im B ill 114 41* - ;I: im B ill 114 41 * -;
Claims (8)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3714634 | 1987-05-02 | ||
| DE19873714634 DE3714634A1 (en) | 1987-05-02 | 1987-05-02 | METHOD FOR SELECTIVE IMMUNOLOGICAL DETERMINATION OF INTACT PROCOLLAGEN PEPTIDE (TYPE III) AND PROCOLLAGEN (TYPE III) IN BODY LIQUIDS AND MEANS TO IMPLEMENT IT |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI882018A0 FI882018A0 (en) | 1988-04-29 |
| FI882018A FI882018A (en) | 1988-11-03 |
| FI95579B true FI95579B (en) | 1995-11-15 |
| FI95579C FI95579C (en) | 1996-02-26 |
Family
ID=6326686
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI882018A FI95579C (en) | 1987-05-02 | 1988-04-29 | Method for selective immunologic determination of intact procollagen peptide (type III) and procollagen (type III) in body fluids and agents for carrying out this |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0298210B1 (en) |
| JP (1) | JPH0780913B2 (en) |
| AT (1) | ATE98377T1 (en) |
| DE (2) | DE3714634A1 (en) |
| DK (1) | DK168872B1 (en) |
| ES (1) | ES2061545T3 (en) |
| FI (1) | FI95579C (en) |
| IE (1) | IE63385B1 (en) |
| NO (1) | NO175639C (en) |
| PT (1) | PT87375B (en) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6010862A (en) * | 1987-11-06 | 2000-01-04 | Washington Research Foundation | Methods of detecting collagen type III degradation in vivo |
| DE4225038C2 (en) * | 1992-07-29 | 1995-11-30 | Boehringer Mannheim Gmbh | Production and use of antibodies against collagen |
| WO1995004282A1 (en) * | 1993-07-28 | 1995-02-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | Immunoassay for detecting collagen or collagen fragments |
| GB9506050D0 (en) | 1995-03-24 | 1995-05-10 | Osteometer A S | Assaying collagen fragments in body fluids |
| DE69520111T2 (en) | 1994-10-17 | 2001-09-06 | Osteometer Biotech As Herlev | Estimation of the fragmentation pattern of collagen in body fluids and diagnosis of disorders related to collagen metabolism |
| US6107047A (en) * | 1996-03-21 | 2000-08-22 | Osteometer Biotech A/S | Assaying protein fragments in body fluids |
| GB9617616D0 (en) | 1996-08-22 | 1996-10-02 | Osteometer Biotech As | Assaying protein fragments in body fluids |
| DE69705423T2 (en) | 1996-12-09 | 2002-05-16 | Osteometer Biotech As Herlev | SANDWEIGHT TEST FOR DETECTING COLLAGEN FRAGMENTS |
| US6117646A (en) * | 1997-09-22 | 2000-09-12 | Osteometer Biotech A/S | Assaying protein fragments in body fluids |
| DE69915059T2 (en) * | 1998-05-28 | 2004-08-26 | Bayer Healthcare Ag | MONOCLONAL ANTIBODY AND ASSAY FOR DETERMINING N-TERMINAL PROCOLLAGEN PROPEPTIDE TYPE III (PIIINP) |
| US6916903B2 (en) | 1998-06-19 | 2005-07-12 | Washington Research Foundation | Collagen type III synthetic peptides for collagen resorption assays |
| US6602980B1 (en) | 1998-06-19 | 2003-08-05 | Washington Research Foundation | Collagen type III synthetic peptides for collagen resorption assays |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2816841A1 (en) * | 1978-04-18 | 1979-10-31 | Max Planck Gesellschaft | RADIOIMMUNOLOGICAL DETERMINATION OF PROCOLLAGEN (TYPE III) AND PROCOLLAGEN PEPTIDE (TYPE III) |
| DE3209149A1 (en) * | 1982-03-13 | 1983-10-06 | Hoechst Ag | METHOD FOR THE COMMON IMMUNOLOGICAL DETERMINATION OF PROCOLLAGEN PEPTIDE (TYPE III) AND PROCOLLAGEN PEPTIDE COL 1 (TYPE III) AND METHOD FOR THE PRODUCTION OF ANTI-PROCOLLAGEN PEPTIDE COL 1 (TYPE III) SERUM |
-
1987
- 1987-05-02 DE DE19873714634 patent/DE3714634A1/en not_active Withdrawn
-
1988
- 1988-04-27 AT AT88106747T patent/ATE98377T1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-04-27 ES ES88106747T patent/ES2061545T3/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-27 DE DE88106747T patent/DE3886109D1/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-04-27 EP EP88106747A patent/EP0298210B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-28 JP JP63104474A patent/JPH0780913B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-28 DK DK232988A patent/DK168872B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-04-29 PT PT87375A patent/PT87375B/en active IP Right Grant
- 1988-04-29 IE IE128988A patent/IE63385B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-04-29 FI FI882018A patent/FI95579C/en not_active IP Right Cessation
- 1988-04-29 NO NO881904A patent/NO175639C/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IE63385B1 (en) | 1995-04-19 |
| FI882018A0 (en) | 1988-04-29 |
| NO881904D0 (en) | 1988-04-29 |
| EP0298210B1 (en) | 1993-12-08 |
| NO175639C (en) | 1994-11-09 |
| EP0298210A2 (en) | 1989-01-11 |
| JPS63292061A (en) | 1988-11-29 |
| FI95579C (en) | 1996-02-26 |
| PT87375A (en) | 1989-05-31 |
| EP0298210A3 (en) | 1991-05-15 |
| DK168872B1 (en) | 1994-06-27 |
| NO881904L (en) | 1988-11-03 |
| FI882018A (en) | 1988-11-03 |
| DE3886109D1 (en) | 1994-01-20 |
| PT87375B (en) | 1992-08-31 |
| IE881289L (en) | 1988-11-02 |
| ES2061545T3 (en) | 1994-12-16 |
| DE3714634A1 (en) | 1988-11-17 |
| DK232988D0 (en) | 1988-04-28 |
| DK232988A (en) | 1988-11-03 |
| ATE98377T1 (en) | 1993-12-15 |
| NO175639B (en) | 1994-08-01 |
| JPH0780913B2 (en) | 1995-08-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4312853A (en) | Radioimmunological determination of procollagen (type III) and procollagen peptide (type III) | |
| US8501415B2 (en) | Identification of TSH receptor autoantibodies using affinity-purified antibodies | |
| US4478744A (en) | Method of obtaining antibodies | |
| Schafmayer et al. | Radioimmunological determination of cholecystokinin in tissue extracts | |
| US4264571A (en) | Radioimmunoassay of thymosin α1 | |
| AU650028B2 (en) | Kit for the specific assay of angiotensin II | |
| FI95579B (en) | Immunological method and means for the selective determination of intact procollagen peptide (type III) and procollagen (type III) in body fluids | |
| US4339427A (en) | Radioimmunoassay of thymosinα | |
| US4124700A (en) | Immunoassay for thymopoietin | |
| JPH0213396A (en) | Monoclonal antibody for selective immunological determination | |
| AU707232B2 (en) | Antibody to aminoterminal propeptide of type 1 procollagen, and assay method using it | |
| US5679583A (en) | Monoclonal antibodies for the selective immunological determination of intact procollagen peptide (type III) and procollagen (type III) in body fluids | |
| US6008325A (en) | Antibody to aminoterminal propeptide of type 1 procollagen | |
| FI96433B (en) | Monoclonal antibodies for the selective immunological determination of intact procollagen peptide (type III) and procollagen (type III) in body fluids | |
| US5514599A (en) | Antibodies against highly conserved amino acid sequences of insulin a process for the preparation of these antibodies and the use thereof in immunoassays | |
| Erhard et al. | Identification of antigenic differences of recombinant and pituitary bovine growth hormone using monoclonal antibodies | |
| Motte et al. | A two-site immunoradiometric assay for serum calcitonin using monoclonal anti-peptide antibodies | |
| JP2001122899A (en) | Vitellogenin originating from cyprinodontiformes and antibody | |
| WO1992006377A1 (en) | Method and kit for immunoassay of propeptide of osteocalcin and proosteocalcin | |
| JP2715187B2 (en) | Method for immunological measurement of PTHrP | |
| JP2727477B2 (en) | PTHrP immunoassay by sandwich method | |
| Meager | RIA, IRMA, and ELISA for cytokines and their soluble receptors | |
| JPH06201691A (en) | High-affinity polyclonal antibody against protein related to human parathyroid hormone |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT Owner name: MAX-PLANCK-GESELLSCHAFT ZUR FOERDERUNG DER WISSENS |