JPWO2020097414A5

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Publication number: JPWO2020097414A5
Application number: JP2021525240A
Authority: JP
Publication date: 2022-11-16

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図7A～7Bは、PSMB5 mRNAを標的とするdsRNAを含むRNAi組成物への経口曝露の9日後の、CPBの死亡率を示すグラフを含む。dsRNAはサイズが異なり、GS2は460ヌクレオチド長を有し、GS188は200ヌクレオチド長を有し、GS189は150ヌクレオチド長を有し(図7A)、G190は100ヌクレオチド長を有し、GS191は50の相補的ヌクレオチドを伴う74ヌクレオチド長を有し、およびGS192は25の相補的ヌクレオチドを伴う49ヌクレオチド長を有する(図7B)。陰性対照RNAi組成物(GS4)は、さらに評価された。Figures 7A-7B include graphs showing CPB mortality after 9 days of oral exposure to RNAi compositions comprising dsRNA targeting PSMB5 mRNA. The dsRNAs differ in size, GS2 has a length of 460 nucleotides, GS188 has a length of 200 nucleotides, GS189 has a length of 150 nucleotides ( Fig . 7A), G190 has a length of 100 nucleotides and GS191 has a length of 50 nucleotides. and GS192 has a length of 49 nucleotides with 25 complementary nucleotides (Figure 7B). A negative control RNAi composition (GS4) was further evaluated.

いくつかの態様において、PSMB5を標的とするRNAi分子は、Coleopteran PSMB5 DNAの領域またはセグメントによってコードされるmRNAに相補的な配列を含むか、またはそれらからなる。いくつかの態様において、RNAi分子は、PSMB5 DNA（例として、配列番号1のヌクレオチド1～450）のヌクレオチド1～500、ヌクレオチド10～500、ヌクレオチド25～500、ヌクレオチド50～500、ヌクレオチド100～500、ヌクレオチド150～500、ヌクレオチド200～500、ヌクレオチド250～500、ヌクレオチド300～500、ヌクレオチド350～500、ヌクレオチド400～500、またはヌクレオチド450～500に包含される任意の配列を含むか、またはそれらからなってもよい、Coleopteran PSMB5 DNAの領域によってコードされるmRNAを標的とする。いくつかの態様において、RNAi分子は、PSMB5 DNA（例として、配列番号1のヌクレオチド450～927）のヌクレオチド200～950、ヌクレオチド250～950、ヌクレオチド300～950、ヌクレオチド350～950、ヌクレオチド400～950、ヌクレオチド450～950、ヌクレオチド500～950、ヌクレオチド550～950、ヌクレオチド200～700、ヌクレオチド250～700、ヌクレオチド300～700、ヌクレオチド350～700、ヌクレオチド400～700、ヌクレオチド450～700、ヌクレオチド500～700、ヌクレオチド550～700、ヌクレオチド600～700、またはヌクレオチド650～700に包含される任意の配列を含むか、またはそれらからなってもよい、Coleopteran PSMB5 DNAの領域によってコードされるmRNAを標的とする。いくつかの態様において、RNAi分子は、PSMB5 DNA（例として、配列番号1のヌクレオチド450～1010）のヌクレオチド400～1010、ヌクレオチド450～1010、ヌクレオチド500～1010、ヌクレオチド550～1010、ヌクレオチド600～1010、ヌクレオチド650～1010、ヌクレオチド700～1010、ヌクレオチド750～1010、ヌクレオチド800～1010、ヌクレオチド850～1010、ヌクレオチド900～1010、またはヌクレオチド950～1010に包含される任意の配列を含むか、またはそれらからなってもよい、Coleopteran PSMB5 DNAの領域またはセグメントによってコードされるmRNAを標的とする。 In some embodiments, an RNAi molecule targeting PSMB5 comprises or consists of a sequence complementary to an mRNA encoded by a region or segment of Coleopteran PSMB5 DNA. In some embodiments, the RNAi molecule comprises nucleotides 1-500, nucleotides 10-500, nucleotides 25-500, nucleotides 50-500, nucleotides 100-500 of PSMB5 DNA (eg, nucleotides 1-450 of SEQ ID NO:1). , nucleotides 150-500, nucleotides 200-500, nucleotides 250-500, nucleotides 300-500, nucleotides 350-500, nucleotides 400-500, or nucleotides 450-500. targets the mRNA encoded by a region of Coleopteran PSMB5 DNA that may be In some embodiments, the RNAi molecule comprises nucleotides 200-950, nucleotides 250-950, nucleotides 300-950, nucleotides 350-950, nucleotides 400-950 of PSMB5 DNA (eg, nucleotides 450-927 of SEQ ID NO: 1). , nucleotides 450-950, nucleotides 500-950, nucleotides 550-950, nucleotides 200-700, nucleotides 250-700, nucleotides 300-700, nucleotides 350-700, nucleotides 400-700, nucleotides 450-700, nucleotides 500-700 , nucleotides 550-700, nucleotides 600-700, or any sequence encompassed by nucleotides 650-700. In some embodiments, the RNAi molecule comprises nucleotides 400-1010, nucleotides 450-1010, nucleotides 500-1010 , nucleotides 550-1010, nucleotides 600-1010 of PSMB5 DNA (eg, nucleotides 450-1010 of SEQ ID NO: 1). , nucleotides 650-1010, nucleotides 700-1010, nucleotides 750-1010, nucleotides 800-1010, nucleotides 850-1010, nucleotides 900-1010, or nucleotides 950-1010. targeting the mRNA encoded by a region or segment of Coleopteran PSMB5 DNA that may be

GS192：配列番号34の配列からなる1本のRNA鎖に、配列番号51の配列からなるもう1本のRNA鎖が結合している。GS192は配列番号2のヌクレオチド167～192によってコードされるmRNAを標的とする。 GS192: One RNA strand having the sequence of SEQ ID NO:34 is bound to another RNA strand having the sequence of SEQ ID NO:51. GS 192 targets the mRNA encoded by nucleotides 167-192 of SEQ ID NO:2.

Claims

Coleopteranプロテアソームベータ5(PSMB5)遺伝子の発現を阻害する、ポリヌクレオチドであって、任意に、Coleoptera PSMB5遺伝子が、配列番号1のデオキシリボ核酸(DNA)配列を含む、前記ポリヌクレオチド。 A polynucleotide that inhibits expression of the Coleopteran proteasome beta 5 (PSMB5) gene , optionally wherein the Coleoptera PSMB5 gene comprises the deoxyribonucleic acid (DNA) sequence of SEQ ID NO:1.

ポリヌクレオチドが、リボ核酸(RNA)であり、任意に、RNAが、Coleoptera PSMB5遺伝子によってコードされるメッセンジャーRNA(mRNA)に相補的な第一の鎖、および第一の鎖に相補的な第二の鎖を含む二本鎖RNA(dsRNA)であり、さらに任意に、mRNAが、配列番号18のRNA配列を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチド。 The polynucleotide is ribonucleic acid (RNA) , optionally the RNA has a first strand complementary to messenger RNA (mRNA) encoded by the Coleoptera PSMB5 gene, and a second strand complementary to the first strand. 2. The polynucleotide of claim 1, which is a double-stranded RNA (dsRNA) comprising two strands, further optionally wherein the mRNA comprises the RNA sequence of SEQ ID NO:18.

dsRNAの第一の鎖が、Coleoptera PSMB5遺伝子によってコードされるmRNAまたはmRNAのセグメントに70％～100％、75％～80％、80％～100％、85％～100％、90％～100％、95％～100％、または98％～100％相補的なRNA配列を含み、任意に、mRNAのセグメントが、少なくとも18～500ヌクレオチド、少なくとも21～500ヌクレオチド、少なくとも50～500ヌクレオチド、少なくとも100～500ヌクレオチド、または少なくとも200～500ヌクレオチドの長さを有する、請求項2に記載のポリヌクレオチド。 70%-100% , 75%-80%, 80%-100%, 85%-100%, 90% -100% of the first strand of the dsRNA to the mRNA or segment of the mRNA encoded by the Coleoptera PSMB5 gene , 95% to 100%, or 98% to 100% complementary RNA sequence ; 3. The polynucleotide of claim 2 , having a length of -500 nucleotides, or at least 200-500 nucleotides.

dsRNAの第一の鎖が、Coleoptera PSMB5遺伝子によってコードされるmRNAまたはmRNAのセグメントに少なくとも90％～100％、95％～100％、または少なくとも98％～100％相補的な少なくとも18～21の連続したヌクレオチドを含む、請求項2または3に記載のポリヌクレオチド。 at least 18-21 stretches of which the first strand of the dsRNA is at least 90%-100%, 95%-100%, or at least 98%-100% complementary to the mRNA or segment of the mRNA encoded by the Coleoptera PSMB5 gene 4. The polynucleotide of claim 2 or 3 , comprising the nucleotides of

dsRNAの第一の鎖が、配列番号35のRNA配列またはRNA配列のセグメントに対して70％～100％、75％～100％、80％～100％、85％～100％、90％～100％、95％～100％、または98％～100％同一性を有するRNA配列を含み、任意に、配列番号35のRNA配列のセグメントが、少なくとも18～500ヌクレオチド、少なくとも21～500ヌクレオチド、少なくとも50～500ヌクレオチド、少なくとも100～500ヌクレオチド、または少なくとも200～500ヌクレオチドの長さを有する、請求項2～4のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。 the first strand of the dsRNA is 70%-100% , 75%-100%, 80%-100%, 85%-100%, 90%-100% relative to the RNA sequence or segment of the RNA sequence of SEQ ID NO:35 %, 95%-100%, or 98%-100% identity , optionally a segment of the RNA sequence of SEQ ID NO: 35 comprising at least 5. The polynucleotide of any one of claims 2-4 , having a length of 50-500 nucleotides, at least 100-500 nucleotides, or at least 200-500 nucleotides.

dsRNAの第一の鎖が、配列番号35のRNA配列に対して少なくとも90％～100％、95％～100％、または少なくとも98％～100％同一性を有する少なくとも18～21の連続したヌクレオチドを含む、請求項5に記載のポリヌクレオチド。 wherein the first strand of the dsRNA comprises at least 18-21 contiguous nucleotides having at least 90%-100%, 95%-100%, or at least 98%-100% identity to the RNA sequence of SEQ ID NO:35; 6. The polynucleotide of claim 5 , comprising:

RNAが、Coleoptera PSMB5遺伝子によってコードされるmRNAへ結合する一本鎖RNA(ssRNA)であり、任意に、mRNAが、配列番号18のRNA配列を含む、請求項2に記載のポリヌクレオチド。 3. The polynucleotide of claim 2 , wherein the RNA is single-stranded RNA (ssRNA) binding to mRNA encoded by the Coleoptera PSMB5 gene , optionally wherein the mRNA comprises the RNA sequence of SEQ ID NO:18 .

ssRNAが、Coleoptera PSMB5遺伝子によってコードされるmRNAまたはmRNAのセグメントに70％～100％、75％～100％、80％～100％、85％～100％、90％～100％、95％～100％、または98％～100％相補的なRNA配列を含み、mRNAのセグメントが、少なくとも18～500ヌクレオチド、少なくとも21～500ヌクレオチド、少なくとも50～500ヌクレオチド、少なくとも100～500ヌクレオチド、または少なくとも200～500ヌクレオチドの長さを有する、請求項7に記載のポリヌクレオチド。 ssRNA is 70%-100% , 75%-100%, 80%-100%, 85%-100%, 90%-100%, 95% -100% of the mRNA or segment of mRNA encoded by the Coleoptera PSMB5 gene %, or 98%-100% complementary RNA sequence, wherein the segment of the mRNA is at least 18-500 nucleotides, at least 21-500 nucleotides, at least 50-500 nucleotides, at least 100-500 nucleotides, or at least 200-500 nucleotides 8. The polynucleotide of claim 7 , having a length of 500 nucleotides .

ssRNAが、mRNAに少なくとも90％～100％、95％～100％、または少なくとも98％～100％相補的な少なくとも18～21の連続したヌクレオチドを含む、請求項7または8に記載のポリヌクレオチド。 9. The polynucleotide of claim 7 or 8 , wherein the ssRNA comprises at least 18-21 contiguous nucleotides that are at least 90%-100%, 95%-100%, or at least 98%-100% complementary to the mRNA.

ssRNAが、配列番号36または配列番号39のRNA配列に対して70％～100％、75％～100％、80％～100％、85％～100％、90％～100％、95％～100％、または98％～100％同一性を有するRNA配列を含み、任意に、配列番号36または配列番号39のRNA配列のセグメントが、少なくとも18～500ヌクレオチド、少なくとも21～500ヌクレオチド、少なくとも50～500ヌクレオチド、少なくとも100～500ヌクレオチド、または少なくとも200～500ヌクレオチドの長さを有する、請求項7～9のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。 ssRNA is 70%-100% , 75%-100%, 80%-100%, 85%-100%, 90%-100%, 95%-100% relative to the RNA sequence of SEQ ID NO:36 or SEQ ID NO:39 %, or 98%-100% identity , optionally the segment of the RNA sequence of SEQ ID NO: 36 or SEQ ID NO: 39 is at least 18-500 nucleotides, at least 21-500 nucleotides, at least 50-50 10. The polynucleotide of any one of claims 7-9 , having a length of 500 nucleotides, at least 100-500 nucleotides, or at least 200-500 nucleotides.

ssRNAが、配列番号36または配列番号39のRNA配列に対して少なくとも90％～100％、95％～100％、または少なくとも98％～100％同一性を有する少なくとも18～21の連続したヌクレオチドを含む、請求項10に記載のポリヌクレオチド。 the ssRNA comprises at least 18-21 contiguous nucleotides having at least 90%-100%, 95%-100%, or at least 98%-100% identity to the RNA sequence of SEQ ID NO:36 or SEQ ID NO:39 11. The polynucleotide of claim 10 .

配列番号19のRNA配列に対して少なくとも80％同一性を有する配列を含むポリヌクレオチドであって、任意に、ポリヌクレオチドは、配列番号19のRNA配列に対して少なくとも80%同一性を有する第一の鎖を含む二本鎖RNAである、前記ポリヌクレオチド。A polynucleotide comprising a sequence having at least 80% identity to the RNA sequence of SEQ ID NO:19, optionally wherein the polynucleotide has at least 80% identity to the RNA sequence of SEQ ID NO:19 The polynucleotide, which is a double-stranded RNA comprising a strand of

請求項1～12のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、組成物であって、任意に、組成物が、
(a)アジュバント、誘引剤、成長調節物質、昆虫の飼料、フェロモン、タンパク質、炭水化物、ポリマー、有機化合物、生物製剤、および駆除薬からなる群から選択される少なくとも1の添加剤をさらに含む; および／または
(b)液体、溶液、懸濁液、エマルション、乳化可能な濃縮物、濃縮液、低濃縮液、超少量濃縮液、水溶性濃縮液、ベイト、逆エマルション、流動体、エアロゾル、煙、霧、流動体、均質混合物、非均質混合物、固体、粉塵、粉末、顆粒、ペレット、カプセル、燻蒸剤、カプセル製剤、またはマイクロカプセル製剤として製剤化される；および／または
(c)スプレー、霧、種子処理、ドレンチ、ドリップ灌漑、インファロー、昆虫の食餌、またはベイトとして送達される、および／または
(d) 0.0001 μg/cm ² ～10 μg/cm ² の濃度で製剤化された、
前記組成物。 A composition comprising the polynucleotide of any one of claims 1-12 , optionally comprising
(a) further comprising at least one additive selected from the group consisting of adjuvants, attractants, growth regulators, insect feeds, pheromones, proteins, carbohydrates, polymers, organic compounds, biologics, and pesticides; and /or
(b) liquids, solutions, suspensions, emulsions, emulsifiable concentrates, concentrates, low concentrates, ultra-low concentrates, aqueous concentrates, baits, reverse emulsions, fluids, aerosols, smoke, fog; formulated as a fluid, homogeneous mixture, heterogeneous mixture, solid, dust, powder, granules, pellets, capsules, fumigant, capsule formulation, or microcapsule formulation; and/or
(c) delivered as a spray, mist, seed treatment, drench, drip irrigation, infallow, insect food, or bait; and/or
(d) 0.0001 μg/cm ² to 10 formulated at a concentration of μg/cm ² ,
said composition.

請求項2～12のいずれか一項に記載のRNAをコードする、デオキシリボ核酸(DNA)。 A deoxyribonucleic acid (DNA) encoding the RNA of any one of claims 2-12 .

Coleopteran昆虫被害を制御するための方法であって、該方法は、植物、地面、Coleopteran昆虫、またはColeopteran昆虫の食餌へ、請求項1～12のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド分子または請求項13に記載の組成物を送達することを含む、前記方法。 13. A method for controlling Coleopteran insect damage, the method comprising applying the polynucleotide molecule of any one of claims 1 to 12 or claim 1 to plants, ground, Coleopteran insects, or the diet of Coleopteran insects. 14. The above method, comprising delivering the composition of 13 .

Coleopteran昆虫被害を制御するための方法であって、該方法は、植物、地面、Coleopteran昆虫、またはColeopteran昆虫の食餌へ、Coleopteranプロテアソームベータ5(PSMB5)遺伝子の発現を特異的に阻害するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む組成物を送達することを含む、前記方法。 1. A method for controlling Coleopteran insect damage, comprising the step of transferring a polynucleotide that specifically inhibits expression of the Coleopteran proteasome beta 5 (PSMB5) gene or The above method, comprising delivering a composition comprising the polynucleotide.

組成物が、植物の葉、茎、種子、根、または土壌へ送達され、任意に、植物が、Solanaceae植物、Brassicaceae植物、Poaceae植物、Cucurbitaceae植物、Fobaceae植物、Apiaceae植物、Amaranthaceae植物、およびMalvaceae植物からなる群から選択される、請求項15または16に記載の方法。 The composition is delivered to the leaves, stems, seeds, roots, or soil of plants, and optionally the plants are Solanaceae plants, Brassicaceae plants, Poaceae plants, Cucurbitaceae plants, Fobaceae plants, Apiaceae plants, Amaranthaceae plants, and Malvaceae plants. 17. The method of claim 15 or 16, selected from the group consisting of

Coleopteran昆虫が、Leptinotarsa種、Phyllotreta種、Cerotoma種、Diabrotica種、tribolium種、Anthonomus種およびAlticini種からなる群から選択される種のものであり、任意に、Leptinotarsa種昆虫が、コロラドハムシである、請求項15～17のいずれか一項に記載の方法。 The Coleopteran insect is of a species selected from the group consisting of Leptinotarsa spp., Phyllotreta spp., Cerotoma spp., Diabrotica spp., tribolium spp., Anthonomus spp. and Alticini spp . and optionally the Leptinotarsa spp. insect is the Colorado potato beetle. , a method according to any one of claims 15-17 .

(a)送達ステップが、ポリヌクレオチドを、植物の表面へ、地面へ、Coleopteran昆虫へ、またはColeopteran昆虫の食餌へ、少なくとも0.0001 μg/cm²の、0.0001 μg/cm²～10μg/cm²の、または0.0001 μg/cm²～0.1 μg/cm²の濃度で適用することを含む、および／または、
(b)Coleopteran昆虫の死亡率が、Coleopteran昆虫のポリヌクレオチドへの曝露の13日未満後に、任意に未処理の条件下の対照と比べて、少なくとも45％に増加する、および／または、
(c)植物の落葉率が、Coleopteran昆虫のポリヌクレオチドへの曝露の10日未満後に、任意に未処理の条件下の対照と比べて、10％未満に減少する;またはColeopteran昆虫のポリヌクレオチドへの曝露後少なくとも10日後に、任意に未処理の条件下の対照と比べて、10％未満のままである、および／または、
(d)ポリヌクレオチドまたは組成物が、Coleopteran昆虫の発育阻止、死亡、摂食の減少、または繁殖の阻害を引き起こすために充分な量で送達される、請求項15～18のいずれか一項に記載の方法。 (a) the step of delivering the polynucleotide to the surface of the plant, to the ground, to the Coleopteran insect, or to the diet of the Coleopteran insect, at least 0.0001 μg/cm ² , from 0.0001 μg/cm ² to 10including applying at a concentration of μg/cm ² or between 0.0001 μg/cm ² and 0.1 μg/cm ² and/or
(b) Coleopteran insect mortality is increased by at least 45% compared to controls under optionally untreated conditions after less than 13 days of exposure to a Coleopteran insect polynucleotide, and/or;
(c) the rate of leaf defoliation of the plant is reduced to less than 10% after less than 10 days of exposure to the Coleopteran insect polynucleotide compared to controls under optionally untreated conditions; or to the Coleopteran insect polynucleotide; optionally remains less than 10% compared to controls under untreated conditions after at least 10 days of exposure to and/or
(d) the polynucleotide or composition is delivered in an amount sufficient to cause stunting, mortality, reduced feeding, or inhibition of reproduction of the Coleopteran insect; described method.