JP7011599B2 - Cell-free production of ribonucleic acid - Google Patents

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Description

関連出願
本願は、米国特許法第119条（e）の下において、2016年4月6日出願のU.S.仮出願番号62/319,220および2017年1月31日出願のU.S.仮出願番号62/452,550の利益を主張し、これらのそれぞれはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。 Related Applications This application is under US Patent Law Article 119 (e) of US Provisional Application Nos. 62 / 319,220 filed April 6, 2016 and US Provisional Application Nos. 62 / 452,550 filed January 31, 2017. Claiming interests, each of these is incorporated herein by reference in their entirety.

リボ核酸（ＲＮＡ）は生命に遍在する。ＲＮＡは、蛋白質の制御および合成のためのＤＮＡからの命令を運搬する、細胞内における情報の重要なメッセンジャーとして働く。細胞内におけるｍＲＮＡレベルの合成的な調節（ｍＲＮＡの導入によって正に、またはｓｉＲＮＡもしくはｄｓＲＮＡの導入によって負に）は、農作物保護、抗癌治療、およびワクチンなどの分野への適用を有するため、ＲＮＡはバイオテクノロジーにおいて関心がある。例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、遺伝子のＤＮＡ配列を用いて遺伝子を「オフ」にする細胞機序－「サイレンシング」と言われるプロセスを言う。動物、植物、および真菌を含む多種多様な生物において、ＲＮＡｉは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって誘発される。機能的な一本鎖（例えばｍＲＮＡ）および二本鎖ＲＮＡ分子は、生細胞内で、および精製された組換え体酵素と精製されたヌクレオチド三リン酸とを用いてin vitroで生産されてきた（例えば、欧州特許Ｎｏ．１６３１６７５およびＵ．Ｓ．特許出願公開Ｎｏ．２０１４／０２７１５５９Ａ１を参照。これらのそれぞれは参照によって本明細書に組み込まれる）。とはいえ、広範な商業的適用を可能にするスケールでのＲＮＡの生産は、現在は法外なコストがかかる。 Ribonucleic acid (RNA) is ubiquitous in life. RNA acts as an important messenger of information in cells, carrying commands from DNA for protein regulation and synthesis. Synthetic regulation of mRNA levels in cells (positively by introducing mRNA or negative by introducing siRNA or dsRNA) has applications in areas such as crop protection, anti-cancer treatment, and vaccines, and thus RNA. Is interested in biotechnology. For example, RNA interference (RNAi) refers to a process called "silencing" that turns a gene "off" using the DNA sequence of the gene. In a wide variety of organisms, including animals, plants, and fungi, RNAi is induced by double-stranded RNA (dsRNA). Functional single-stranded (eg, mRNA) and double-stranded RNA molecules have been produced in live cells and in vitro using purified recombinant enzymes and purified nucleotide triphosphates. (See, for example, European Patent No. 1631675 and US Patent Application Publication No. 2014/0271559A1; each of which is incorporated herein by reference). However, the production of RNA on a scale that allows for widespread commercial application is now exorbitantly costly.

本明細書においてはＲＮＡの生産（生合成）のための方法、組成物、細胞、構築物、およびシステムが提供される。一般的には、バイオマス材料からの多量体ＲＮＡがその成分モノマーへと酵素的に解重合され、それから、それらのモノマーは（一連のキナーゼによって）それらの同族の三リン酸化されたバリアントへとリン酸化され、これらはその後対応する核酸（例えばＤＮＡ）鋳型を用いて多量体ＲＮＡへと重合される。 Provided herein are methods, compositions, cells, constructs, and systems for RNA production (biosynthesis). In general, multimer RNA from biomass material is enzymatically depolymerized into its constituent monomers, and then those monomers are phosphorus (by a series of kinases) into their cognate triphosphorylated variants. It is oxidized and these are then polymerized into multimer RNA using the corresponding nucleic acid (eg DNA) template.

いくつかの態様において、本開示の方法、組成物、細胞、構築物、およびシステムは、例えば、少なくとも１つの細胞ライセート、精製蛋白質の組み合わせ、または細胞ライセート（単数または複数）と精製蛋白質（単数または複数）との組み合わせを用いた無細胞的条件下におけるＲＮＡの生産のために用いられる。いくつかの態様において、本開示は、細胞ライセートを用いたバイオマスからのＲＮＡ（例えば、細胞の内在性ＲＮＡ）からの所望の合成ＲＮＡ（例えば、合成の一本鎖または二本鎖ＲＮＡ）への変換に基づく。第１に、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、および／またはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）（例えば、細胞ライセート中に存在する）などのバイオマスからのＲＮＡ（例えば内在性ＲＮＡ）は、１つ以上のヌクレアーゼによってそのモノマー形態、５’－ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）へと解重合される（図１、反応１）。次に、それらのヌクレアーゼ、ならびに天然のヌクレアーゼおよびホスファターゼは（例えば熱不活性化によって）不活性化または部分的に不活性化され、ＮＭＰは一連の耐熱性キナーゼ活性によってリボヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）へとリン酸化される（図１、反応２）。最後に、ＮＴＰは核酸（例えばＤＮＡ）鋳型を用いてＲＮＡポリメラーゼ（例えば、耐熱性ＲＮＡポリメラーゼ）によって重合されて所望のＲＮＡを形成する（図１、反応３）。所望の合成ＲＮＡは任意に細胞ライセートから精製され得る。 In some embodiments, the methods, compositions, cells, constructs, and systems of the present disclosure are, for example, at least one cell lysate, a combination of purified proteins, or a cell lysate (s) and a purified protein (s). ) Is used for the production of RNA under cell-free conditions. In some embodiments, the present disclosure relates to the desired synthetic RNA (eg, synthetic single- or double-stranded RNA) from RNA from biomass using cellular lysates (eg, endogenous RNA of cells). Based on conversion. First, RNA from biomass (eg, endogenous RNA), such as messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), and / or ribosomal RNA (rRNA) (eg, present in cell lysates) is 1 It is depolymerized into its monomer form, 5'-nucleoside monophosphate (NMP), by one or more nucleases (FIG. 1, reaction 1). The nucleases, as well as the natural nucleases and phosphatases, are then inactivated or partially inactivated (eg, by thermal inactivation), and the NMP is ribonucleotide triphosphate (NTP) by a series of thermostable kinase activities. ) (Fig. 1, reaction 2). Finally, NTP is polymerized by RNA polymerase (eg, thermostable RNA polymerase) using a nucleic acid (eg DNA) template to form the desired RNA (FIG. 1, reaction 3). The desired synthetic RNA can optionally be purified from cellular lysates.

それゆえに、本開示のいくつかの側面はリボ核酸（ＲＮＡ）を生産する（生合成する）無細胞的方法を提供し、該方法は：（ａ）（ｉ）ＲＮＡと（ｉｉ）ＲＮＡを解重合する酵素活性、耐熱性キナーゼ活性、および耐熱性ＲＮＡポリメラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの酵素活性とを含む、少なくとも１つの細胞ライセート混合物を、ＲＮＡの解重合をもたらす条件下においてインキュベートして、ヌクレオシド一リン酸を含む細胞ライセート混合物を生産すること；（ｂ）ステップ（ａ）において生産された細胞ライセート混合物を、耐熱性キナーゼ活性および耐熱性ＲＮＡポリメラーゼ活性を完全に不活性化することなしに内在性のヌクレアーゼおよびホスファターゼを不活性化または部分的に不活性化する温度（例えば５０～８０℃）に加熱して、熱不活性化されたヌクレアーゼおよびホスファターゼを含む細胞ライセート混合物を生産すること；および（ｃ）ステップ（ｂ）において生産された細胞ライセート混合物を、エネルギー供給源（例えばＡＴＰ再生系）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）鋳型（例えば、関心のＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有する）の存在下において、ヌクレオシド三リン酸の生産およびヌクレオシド三リン酸の重合をもたらす条件下においてインキュベートして、関心のＲＮＡを含む細胞ライセート混合物を生産することを含む。 Therefore, some aspects of the disclosure provide a cell-free method of producing (biosynthesizing) ribonucleic acid (RNA), which method: solves (a) (i) RNA and (ii) RNA. Incubate at least one cellular lysate mixture containing at least one enzymatic activity selected from the group consisting of polymerizing enzyme activity, thermostable kinase activity, and thermostable RNA polymerase activity under conditions that result in RNA depolymerization. To produce a cell lysate mixture containing nucleoside monophosphate; (b) completely inactivate the heat-resistant kinase activity and the heat-resistant RNA polymerase activity of the cell lysate mixture produced in step (a). The cell lysate mixture containing the heat-inactivated nuclease and phosphatase is produced by heating to a temperature that inactivates or partially inactivates the endogenous nuclease and phosphatase (eg, 50-80 ° C.). And (c) the cellular lysate mixture produced in step (b) can be actuated into an energy source (eg, ATP regeneration system) and a deoxyribonucleic acid (DNA) template (eg, a nucleotide sequence encoding the RNA of interest). In the presence of a promoter linked to), it comprises incubating under conditions that result in the production of nucleoside triphosphate and the polymerization of nucleoside triphosphate to produce a cellular lysate mixture containing the RNA of interest. ..

細胞ライセート混合物は、ＲＮＡを含み、かつリボヌクレアーゼとして働く、キナーゼとして働く、および／またはＲＮＡポリメラーゼとして働く少なくとも１つの酵素（少なくとも１つの融合酵素を包む）を発現する細胞から得られる、単一の細胞ライセートを含み得る。代替的には、細胞ライセート混合物は少なくとも２つの（例えば、少なくとも３、４、５、または６つの）細胞ライセートを含み得、少なくとも１つの細胞ライセートはＲＮＡを含む細胞から得られ、少なくとも１つの細胞ライセート（例えば、少なくとも２、３、４、または５つ）は、ヌクレアーゼとして働く、キナーゼとして働く、および／またはＲＮＡポリメラーゼとして働く少なくとも１つの酵素を発現する細胞から得られる。 A cell lysate mixture is a single cell obtained from cells that contain RNA and express at least one enzyme (encapsulating at least one fusion enzyme) that acts as an RNA and acts as a ribonuclease, a kinase, and / or an RNA polymerase. May include lysate. Alternatively, the cell lysate mixture can contain at least two (eg, at least 3, 4, 5, or 6) cell lysates, at least one cell lysate is obtained from a cell containing RNA, and at least one cell. Lysates (eg, at least 2, 3, 4, or 5) are obtained from cells expressing at least one enzyme that acts as a nuclease, a kinase, and / or an RNA polymerase.

酵素または融合酵素は、融合酵素の酵素がヌクレアーゼ活性を発揮する（核酸を切断または解重合する；例えばＲＮａｓｅ Ｒ）場合に「ヌクレアーゼとして働く」と見なされる。酵素または融合酵素は、融合酵素の酵素がキナーゼ活性を発揮する（１つの分子から別の分子へのリン酸基の転移を触媒する；例えばポリリン酸キナーゼ）場合に「キナーゼとして働く」と見なされる。酵素または融合酵素は、融合酵素の酵素がポリメラーゼ活性を発揮する（ヌクレオチドをアセンブリして核酸を生産する；例えばＲＮＡポリメラーゼ）場合に「ポリメラーゼとして働く」と見なされる。 An enzyme or fusion enzyme is considered to "act as a nuclease" if the enzyme in the fusion enzyme exerts nuclease activity (cleaves or depolymerizes nucleic acids; eg, RNase R). An enzyme or fusion enzyme is considered to "act as a kinase" if the enzyme of the fusion enzyme exerts kinase activity (catalyzing the transfer of phosphate groups from one molecule to another; eg, polyphosphate kinase). .. An enzyme or fusion enzyme is considered to "act as a polymerase" if the enzyme of the fusion enzyme exerts polymerase activity (assembling nucleotides to produce nucleic acid; eg RNA polymerase).

いくつかの態様において、ステップ（ａ）のＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、またはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）である。 In some embodiments, the RNA in step (a) is messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), or ribosomal RNA (rRNA).

いくつかの態様において、細胞ライセート混合物は、少なくとも１つのリボヌクレアーゼ、少なくとも１つの耐熱性キナーゼ、および／または少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ（例えば、耐熱性ＲＮＡポリメラーゼ）を含む。融合酵素の使用もまた本開示に包含される。例えば、細胞ライセート混合物はリボヌクレアーゼとキナーゼとの融合体または複数のキナーゼの融合体を含み得る。他の融合酵素は本開示に包含される。 In some embodiments, the cellular lysate mixture comprises at least one ribonuclease, at least one thermostable kinase, and / or at least one RNA polymerase (eg, thermostable RNA polymerase). The use of fusion enzymes is also included in the present disclosure. For example, a cell lysate mixture may contain a fusion of a ribonuclease and a kinase or a fusion of multiple kinases. Other fusion enzymes are included in the present disclosure.

本開示の他の側面は、少なくとも１つのヌクレオシド一リン酸キナーゼ（例えば、耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼ）、少なくとも１つのヌクレオシド二リン酸キナーゼ（例えば、耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼ）、および少なくとも１つのポリリン酸キナーゼ（例えば、耐熱性ポリリン酸キナーゼ）を含む、改変細胞、細胞ライセート、および細胞ライセート混合物を提供する。いくつかの態様において、細胞は少なくとも１つのリボヌクレアーゼおよび／または少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ（例えば、耐熱性ＲＮＡポリメラーゼ）をもまた含み得る。 Other aspects of the disclosure include at least one nucleoside monophosphate kinase (eg, heat resistant nucleoside monophosphate kinase), at least one nucleoside diphosphate kinase (eg, heat resistant nucleoside diphosphate kinase), and at least. Provided are modified cells, cell lysates, and cell lysate mixtures comprising one polyphosphate kinase (eg, heat resistant polyphosphate kinase). In some embodiments, the cell may also contain at least one ribonuclease and / or at least one RNA polymerase (eg, thermostable RNA polymerase).

いくつかの態様において、ＲＮＡを生産する（生合成する）方法は、（ａ）ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、および／またはｒＲＮＡ）、ＲＮａｓｅ Ｒ、耐熱性キナーゼ（例えば、ＰｆＰｙｒＨ、ＴｔｈＡｄｋ、ＴｔｈＣｍｋ、ＰｆＧｍｋ、ＡａＮｄｋ、ＴｅＰｐｋ、および／またはＰＰＫ２（例えば表６参照）、および耐熱性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを含む培養細胞（例えば改変細胞）を溶解し、それによって細胞ライセートを生産すること、（ｂ）ステップ（ａ）において生産された細胞ライセートを、ＲＮＡから５’－ＮＭＰへの解重合をもたらす条件下においてインキュベートし、それによって５’－ＮＭＰを含む細胞ライセートを生産すること、（ｃ）ステップ（ｂ）において生産された細胞ライセートを６０～８０℃に加熱して、耐熱性キナーゼおよび耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを完全に不活性化することなしに内在性のヌクレアーゼおよびホスファターゼを不活性化し、それによって熱不活性化されたヌクレアーゼおよびホスファターゼを含む細胞ライセートを生産することと、（ｄ）ステップ（ｃ）において生産された細胞ライセートを、エネルギー供給源（例えば、ポリリン酸を含むＡＴＰ再生系）および改変核酸（例えばＤＮＡ）鋳型（例えば、関心のＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有する）の存在下において、ヌクレオシド三リン酸の生産およびヌクレオシド三リン酸の重合をもたらす条件下においてインキュベートして、関心のＲＮＡを生産することを含む。 In some embodiments, the method of producing (biosynthesizing) RNA is as follows: (a) RNA (eg, mRNA, tRNA, and / or rRNA), RNase R, heat resistant kinases (eg, PfPyrH, TthAdk, TthCmk, etc.). Dissolving cultured cells (eg, modified cells) containing PfGmk, AaNdk, TePpk, and / or PPK2 (eg, see Table 6), and heat-resistant T7 RNA polymerase, thereby producing cell lysates, (b) step (b). Incubating the cell lysates produced in a) under conditions that result in depolymerization from RNA to 5'-NMP, thereby producing cell lysates containing 5'-NMP, (c) step (b). The cell lysates produced in the above are heated to 60-80 ° C to inactivate endogenous nucleases and phosphatases without completely inactivating heat-resistant kinases and heat-resistant RNA polymerases, thereby being heat-inactivated. Producing cellular lysates containing the modified nuclease and phosphatase, and (d) using the cellular lysates produced in step (c) as an energy source (eg, an ATP regeneration system containing polyphosphate) and modified nucleic acids (eg, eg). Incubate under conditions that result in the production of nucleoside triphosphate and the polymerization of nucleoside triphosphate in the presence of a DNA) template (eg, containing a promoter operably linked to a nucleotide sequence encoding the RNA of interest). And it involves producing the RNA of interest.

いくつかの態様において、ＲＮＡ、ＲＮａｓｅ Ｒ、耐熱性キナーゼ、および耐熱性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは培養細胞（例えば改変細胞）の単一の株内に含有される。他の態様においては、上記活性／コンポーネントのサブセットを含有する培養細胞（例えば改変細胞）が溶解され、ライセートが組み合わせられて、上記ステップ（ａ）に記載されている全ての酵素活性を含む細胞ライセート混合物を生成する。いくつかの態様において、酵素活性は、精製酵素の形態で、上記ステップ（ａ）に記載されているライセートに追加される。いくつかの態様において、ライセートおよび／または精製蛋白質は上記ステップ（ｃ）に記載されている熱不活性化ステップ前に組み合わせられる。他の態様において、ライセートおよび／または精製蛋白質は上記ステップ（ｃ）に記載されている熱不活性化ステップ後に組み合わせられる。 In some embodiments, RNA, RNase R, heat-resistant kinase, and heat-resistant T7 RNA polymerase are contained within a single strain of cultured cells (eg, modified cells). In another embodiment, cultured cells containing a subset of the activity / component (eg, modified cells) are lysed and the lysate is combined to contain the cellular lysate comprising all the enzymatic activities described in step (a) above. Produce a mixture. In some embodiments, the enzyme activity is added to the lysate described in step (a) above, in the form of a purified enzyme. In some embodiments, the lysate and / or purified protein is combined prior to the heat inactivation step described in step (c) above. In another embodiment, the lysate and / or purified protein is combined after the heat inactivation step described in step (c) above.

関心のＲＮＡはＲＮＡのいずれかの形態であり得、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡを包含する。例えば、関心のＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり得る。他のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子は本明細書に包含される。 The RNA of interest can be in any form of RNA, including single-stranded RNA and double-stranded RNA. For example, the RNA of interest can be messenger RNA (mRNA), antisense RNA, microRNA, short interfering RNA (siRNA), or short hairpin RNA (SHRNA). Other RNA interference (RNAi) molecules are included herein.

本発明のいくつかの態様の詳細は付随する図および発明を実施するための形態に提示されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は明細書および請求項から明らかであろう。 Details of some aspects of the invention are presented in the accompanying figures and embodiments for carrying out the invention. Other features, purposes, and advantages of the invention will be apparent from the specification and claims.

図１は、本明細書に記載される無細胞的ＲＮＡ生産の概略図を示している。バイオマスからのＲＮＡ（例えば内在性ＲＮＡ）、ヌクレアーゼ、耐熱性キナーゼ、および／または耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを含有する細胞を溶解し（または組み合わせて溶解し）、もたらされた細胞ライセート（単数または複数）を、ＲＮＡの解重合をもたらす条件下においてインキュベートする。それから、細胞ライセートを加熱して、ヌクレアーゼおよびいずれかの内在性ホスファターゼを不活性化する（耐熱性キナーゼおよび耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを不活性化することなしに）。それから、細胞ライセートを、関心のＲＮＡをコードする改変ＤＮＡ鋳型の存在下において、ヌクレオシド三リン酸の生産およびヌクレオシド三リン酸の重合をもたらす条件下でインキュベートし、それによって関心のＲＮＡ（例えば、ｓｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ）を生産する。代替的には、個々の精製された経路酵素（例えば、耐熱性ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼ）を熱不活性化ステップ後の細胞ライセートに追加し得る。それゆえに、いくつかの場合には、細胞ライセートを生産するために用いられる改変細胞は、上に記載されている酵素活性の１つ以上、例えばヌクレアーゼ、耐熱性キナーゼ、および／または耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを発現しない。FIG. 1 shows a schematic diagram of cell-free RNA production described herein. Cell lysates (s) resulting by lysing (or combining) cells containing RNA from biomass (eg, endogenous RNA), nucleases, heat-resistant kinases, and / or heat-resistant RNA polymerases. Is incubated under conditions that result in RNA depolymerization. The cell lysate is then heated to inactivate the nuclease and any endogenous phosphatase (without inactivating thermostable kinases and thermostable RNA polymerases). The cell lysate is then incubated in the presence of a modified DNA template encoding the RNA of interest under conditions that result in the production of nucleoside triphosphate and the polymerization of the nucleoside triphosphate, thereby the RNA of interest (eg, ssRNA). Or dsRNA). Alternatively, individual purified pathway enzymes (eg, RNA polymerases such as thermostable RNA polymerase) can be added to the cellular lysates after the heat inactivation step. Therefore, in some cases, the modified cells used to produce cellular lysates are one or more of the enzymatic activities described above, such as nucleases, heat-resistant kinases, and / or heat-resistant RNA polymerases. Does not manifest.

図２Ａは、エネルギー生成のためのポリリン酸依存性キナーゼ経路の概略図を示している。図２Ｂは、本開示の方法およびシステムへの使用のための追加の例示的なエネルギー変換経路の概略図を示している。ＵＭＰキナーゼ（例えばPyrococcus furiosusから得られる）およびポリリン酸キナーゼ（例えば、Thermosynechococcus elongatus、Caldilinea aerophila、Deinococcus geothermalis、Meiothermus ruber、Meiothermus silvanus、Deinococcus geothermalis、Anaerolinea thermophila、Chlorobaculum tepidum、Oceanithermus profundus、Roseiflexus castenholzii、Roseiflexus ｓｐ．、またはTruepera radiovctrixから得られる）がＵＭＰをＵＤＰに変換するために用いられ得、ＮＤＰキナーゼ（例えばAquifex aeolicus ｎｄｋ遺伝子によってコードされる）およびポリリン酸キナーゼがＵＤＰをＵＴＰに変換するために用いられ得る。ＣＭＰキナーゼ（例えばThermus thermophilusから得られる）およびポリリン酸キナーゼがＣＭＰをＣＤＰに変換するために用いられ得、ＮＤＰキナーゼおよびポリリン酸キナーゼがＣＤＰをＣＴＰに変換するために用いられ得る。ＧＭＰキナーゼ（例えばThermotoga maritimaから得られる）およびポリリン酸キナーゼがＧＭＰをＧＤＰに変換するために用いられ得、ＮＤＰキナーゼおよびポリリン酸キナーゼがＧＤＰをＧＴＰに変換するために用いられ得る。ＡＭＰキナーゼ（例えばThermus thermophilusから得られる）およびポリリン酸キナーゼがＡＭＰをＡＤＰに変換するために用いられ得、ＮＤＰキナーゼ（例えばAquifex aeolicus ndk遺伝子によってコードされる）およびポリリン酸キナーゼがＡＤＰをＡＴＰに変換するために用いられ得る。代替的には、クラスＩＩＩ ＰＰＫ２酵素（例えば表６参照）がＡＭＰをＡＴＰに変換するために用いられ得る。FIG. 2A shows a schematic diagram of a polyphosphoric acid dependent kinase pathway for energy generation. FIG. 2B shows a schematic diagram of additional exemplary energy transformation paths for use in the methods and systems of the present disclosure. UDP kinase (eg, obtained from Pyrococcus furiosus) and polyphosphate kinase (eg, Thermosynechococcus elongatus, Caldilinea aerophila, Deinococcus geothermalis, Meiothermus ruber, Meiothermus silvanus, Deinococcus geothermalis, Anaerolinea thermophila, Chlorobaculum. , Or obtained from Truepera radiovctrix) can be used to convert UDP to UDP, and NDP kinases (eg encoded by the Aquifex aeolicus ndk gene) and polyphosphate kinases can be used to convert UDP to UDP. .. CMP kinase (eg, obtained from Thermus thermophilus) and polyphosphate kinase can be used to convert CMP to CDP, and NDP kinase and polyphosphate kinase can be used to convert CDP to CTP. GMP kinases (eg, obtained from Thermotoga maritima) and polyphosphate kinases can be used to convert GMP to GDP, and NDP kinases and polyphosphate kinases can be used to convert GDP to GTP. AMP kinase (eg, obtained from Thermus thermophilus) and polyphosphate kinase can be used to convert AMP to ADP, and NDP kinase (eg, encoded by the Aquifex aeolicus ndk gene) and polyphosphate kinase can convert ADP to ATP. Can be used to Alternatively, a class III PPK2 enzyme (see, eg, Table 6) can be used to convert AMP to ATP.

図３Ａは、二本鎖ＲＮＡの生合成のために用いられるＤＮＡ鋳型の例の概略図を示している。プラスミドの一部としてコードされたＤＮＡ鋳型は単一のコード領域を含有し、関心のコード領域に作動可能に連結されたプロモーターと１つ以上のターミネーターとを包含する。転写後に、ＲＮＡは分子内ヌクレオチド塩基対形成によってヘアピン構造へとフォールディングする。単独かまたはプラスミドの一部としてコードされたかどちらかのＤＮＡ鋳型は、ドメイン２によって離間された２つの相補的なドメイン（１および３）を含有する。図３Ｂは、二本鎖ＲＮＡの生合成のために用いられるＤＮＡ鋳型の別の例の概略図を示している。ＤＮＡ鋳型はコンバージェントなプロモーター配列を相補鎖上に含有する。各鋳型鎖から転写されたＲＮＡ配列は、転写後にアニーリングする。図３Ｃは、二本鎖ＲＮＡの生合成のために用いられるＤＮＡ鋳型の別の例の概略図を示している。プラスミドの一部としてコードされたＤＮＡ鋳型は、相補鎖上の関心のコード領域に作動可能に連結されたコンバージェントなプロモーター配列と、リードスルー転写を防ぐための１つ以上のターミネーター配列とを含有する。図３Ｄは、二本鎖ＲＮＡの生合成のために用いられるＤＮＡ鋳型の別の例の概略図を示している。プラスミドの一部としてコードされたＤＮＡ鋳型は独立したカセットを含有し、そのそれぞれは関心のコード領域に作動可能に連結されたプロモーターと１つ以上のターミネーターとを包含し、相補的な配列の転写を駆動し、これらは転写後にアニーリングする。図３Ｅは、二本鎖ＲＮＡの生合成のために用いられるＤＮＡ鋳型の別の例の概略図を示している。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いてｓｓＲＮＡ鋳型を生産し、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ＲＮＡを生産する。FIG. 3A shows a schematic diagram of an example of a DNA template used for biosynthesis of double-stranded RNA. The DNA template encoded as part of the plasmid contains a single coding region and includes a promoter operably linked to the coding region of interest and one or more terminators. After transcription, RNA folds into a hairpin structure by intramolecular nucleotide base pairing. The DNA template, either alone or encoded as part of a plasmid, contains two complementary domains (1 and 3) separated by domain 2. FIG. 3B shows a schematic diagram of another example of a DNA template used for biosynthesis of double-stranded RNA. The DNA template contains a convergent promoter sequence on the complementary strand. The RNA sequence transcribed from each template strand is annealed after transcription. FIG. 3C shows a schematic diagram of another example of a DNA template used for biosynthesis of double-stranded RNA. The DNA template encoded as part of the plasmid contains a convergent promoter sequence operably linked to the coding region of interest on the complementary strand and one or more terminator sequences to prevent read-through transcription. do. FIG. 3D shows a schematic diagram of another example of a DNA template used for biosynthesis of double-stranded RNA. The DNA template encoded as part of the plasmid contains a separate cassette, each containing a promoter operably linked to the coding region of interest and one or more terminators, and transcription of complementary sequences. Drive, and these are annealed after transfer. FIG. 3E shows a schematic diagram of another example of a DNA template used for biosynthesis of double-stranded RNA. A DNA-dependent RNA polymerase is used to produce the ssRNA template, and an RNA-dependent RNA polymerase is used to produce double-stranded RNA.

図４は、本開示の無細胞的ＲＮＡ生産方法の別の例の概略図を示している。プロセスは、改変細胞が生産される単一の発酵ベッセルから、標準的な発酵技術を用いて始まる。発酵により生成したバイオマスは例えば任意に精密濾過（ＭＦ）によって濃縮された後、機械的ホモジナイゼーションにより溶解される。それから、ライセートは第２の発酵ベッセルに圧送され、発現されたヌクレアーゼ酵素がＲＮＡをそのモノマー成分に変換する。反応全体を加熱して、任意の内在性ホスファターゼまたはヌクレアーゼ（例えばＲＮａｓｅ）活性、ならびにＲＮＡ産物安定性および／または忠実性にとって不利であろう任意の他の外来性の／導入された細胞（例えばヌクレアーゼ）活性を不活性化する。熱不活性化後に、ポリリン酸を一連の耐熱性キナーゼによるＮＭＰからＮＴＰへのリン酸化のための高エネルギーリン酸供給源として反応に供給し、続けてｄｓＲＮＡへの重合が起こる。９９重量％（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％）ｄｓＲＮＡほどまで純度を増大させるための下流処理が用いられ得る。例えば、純度を５０～６０％、５０～７０％、５０～８０％、５０～９０％、５０～９５％、７０～８０％、７０～９０％、または７０～９５％に増大させるための処理が用いられ得る。例示的な下流プロセスは、蛋白質沈殿剤（例えば酢酸アンモニウム）の追加によって始まり、ディスク型遠心（ＤＳＣ）またはタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）による製品流からの蛋白質、脂質、および何らかのＤＮＡの除去に続く。それから、塩を除去し体積を低減させるために限外濾過を実行する。製品流への塩化リチウムの追加はｄｓＲＮＡ産物の沈殿をもたらし、その後ディスク型遠心を用いてバルク液体から分離され、８０％純度のｄｓＲＮＡ製品流を得る。さらなるクロマトグラフィーポリッシングで９９％純粋な産物を得る（Nilsen, TW. Cold Spring Harb Protoc. 2012 Dec 1;2012(12)）。FIG. 4 shows a schematic diagram of another example of the cell-free RNA production method of the present disclosure. The process begins with a single fermentation vessel from which the modified cells are produced, using standard fermentation techniques. Biomass produced by fermentation is, for example, optionally concentrated by microfiltration (MF) and then dissolved by mechanical homogenization. The lysate is then pumped into a second fermentation vessel, where the expressed nuclease enzyme converts RNA into its monomeric component. The entire reaction is heated to allow any endogenous phosphatase or nuclease (eg, RNase) activity, as well as any other exogenous / introduced cells (eg, nuclease) that may be detrimental to RNA product stability and / or fidelity. ) Inactivate the activity. After thermal inactivation, polyphosphoric acid is supplied to the reaction as a source of high energy phosphate for phosphorylation of NMP to NTP by a series of heat resistant kinases, followed by polymerization to dsRNA. Downstream treatments can be used to increase the purity to as much as 99% by weight (eg, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, or 99%) dsRNA. For example, treatment to increase the purity to 50-60%, 50-70%, 50-80%, 50-90%, 50-95%, 70-80%, 70-90%, or 70-95%. Can be used. An exemplary downstream process begins with the addition of a protein precipitant (eg ammonium acetate) and follows the removal of proteins, lipids, and any DNA from the product stream by disc centrifuge (DSC) or tangential flow filtration (TFF). .. Then, extrafiltration is performed to remove the salt and reduce the volume. Addition of lithium chloride to the product stream results in precipitation of the dsRNA product, which is then separated from the bulk liquid using a disc centrifuge to obtain an 80% pure dsRNA product stream. Further chromatographic polishing yields a 99% pure product (Nilsen, TW. Cold Spring Harb Protoc. 2012 Dec 1; 2012 (12)).

図５Ａ～５Ｂは、精製E. coli ＲＮＡの消化によるリボヌクレアーゼ活性の比較を示している。（図５Ａ）ヌクレアーゼ処置による酸可溶性のヌクレオチド（モノヌクレオチドおよび短いオリゴヌクレオチド）の遊離はベンゾナーゼ、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｒ、およびヌクレアーゼＰ１で最も急速であった。（図５Ｂ）反応産物のＬＣ－ＭＳ分析は、ＲＮａｓｅ ＲおよびヌクレアーゼＰ１処置によるＲＮＡからのＮＭＰ遊離を実証した。5A-5B show a comparison of ribonuclease activity by digestion of purified E. coli RNA. (FIG. 5A) Release of acid-soluble nucleotides (mononucleotides and short oligonucleotides) by nuclease treatment was most rapid with benzonase, RNase A, RNase R, and nuclease P1. LC-MS analysis of the reaction product demonstrated NMP release from RNA by RNase R and nuclease P1 treatment.

図６は、外来性ＲＮａｓｅ Ｒを用いたライセートＲＮＡの解重合を示すグラフであり、５’－ＮＭＰを特異的に同定するために、産物はＵＰＬＣによって分析されている。ＲＮａｓｅ Ｒの非存在下では、ライセートは内在性のＲＮａｓｅ活性を発揮し、これは５’－ＮＭＰのゆっくりした蓄積をもたらした（濃灰色の実線）。外来性ＲＮａｓｅ Ｒの追加は、２’または３’ＮＭＰ蓄積の速度に影響することなしに（薄灰色の線）、急速な５’－ＮＭＰ遊離（濃灰色の点線）をもたらした。それゆえに、ＲＮａｓｅ Ｒの過剰発現は多量体ＲＮＡから５’－ＮＭＰへの変換の速度を加速させ、抽出液中に存在するホスファターゼ／ヌクレアーゼ活性の有害な効果を低減させる。実験は５０％ライセートの終濃度で実施した。FIG. 6 is a graph showing depolymerization of lysate RNA with exogenous RNase R, the product being analyzed by UPLC to specifically identify 5'-NMP. In the absence of RNase R, lysates exerted endogenous RNase activity, which resulted in a slow accumulation of 5'-NMP (dark gray solid line). The addition of exogenous RNase R resulted in rapid 5'-NMP release (dark gray dotted line) without affecting the rate of 2'or 3'NMP accumulation (light gray line). Therefore, overexpression of RNase R accelerates the rate of conversion of multimer RNA to 5'-NMP and reduces the detrimental effects of phosphatase / nuclease activity present in the extract. The experiment was carried out at a final concentration of 50% lysate.

図７Ａ～７Ｃは、バッチ段階で増殖した１Ｌバイオリアクター培養物中のＲＮａｓｅ Ｒ過剰発現の結果を示している。（図７Ａ）二つの培養物における蛋白質発現のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。空ベクター培養物は空の蛋白質発現ベクターを含有した（ｐＥＴＤｕｅｔ－１）。ＲＮａｓｅ Ｒ培養物はｐＥＴＤｕｅｔ－１にクローニングされたE. coli ｒｎｒを含有した。誘導した培養物からのサンプル（＋）は、右の矢印によって示されるＲＮａｓｅ Ｒ（ＭＷ ９２．９ｋＤａ。Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグを有する）の強い発現を示した。（図７Ｂ）空ベクター（濃灰色）およびＲＮａｓｅ Ｒ発現株（薄灰色）の増殖キネティクス（誘導前および後の増殖を包含する）は、ＲＮａｓｅ Ｒ過剰発現が細胞増殖にとって有害ではないということを実証した。点線は指数曲線フィットを表す。（図７Ｃ）過剰発現されたＲＮａｓｅ Ｒはバッチ増殖したバイオマスのライセート中において活性であり、酸可溶性のヌクレオチドを遊離させた。空ベクター株（濃灰色実線）では、外来性ＲＮａｓｅ Ｒを追加することはヌクレオチド遊離の速度を増大させた（濃灰色点線）。対照的に、ＲＮａｓｅ Ｒを発現する株は溶解によって急速なヌクレオチド遊離を示した（薄灰色実線）。外来性ＲＮａｓｅ Ｒを追加することはヌクレオチド遊離の速度または最終的なヌクレオチド収量を増大させなかった（薄灰色点線）。実験は５０％ライセートの終濃度で実施した。7A-7C show the results of RNase R overexpression in 1L bioreactor cultures grown in batch stages. (FIG. 7A) SDS-PAGE analysis of protein expression in two cultures. The empty vector culture contained an empty protein expression vector (pETDuet-1). The RNase R culture contained E. coli rnr cloned into pETDuet-1. Samples (+) from the induced culture showed strong expression of RNase R (MW 92.9 kDa, with a C-terminal hexahistidine tag) indicated by the arrow to the right. (FIG. 7B) proliferation kinetics (including pre- and post-induction proliferation) of empty vectors (dark gray) and RNase R-expressing strains (light gray) demonstrate that RNase R overexpression is not detrimental to cell proliferation. did. The dotted line represents the exponential curve fit. (FIG. 7C) Overexpressed RNase R was active in batch-grown biomass lysates, freeing acid-soluble nucleotides. In the empty vector strain (dark gray solid line), the addition of exogenous RNase R increased the rate of nucleotide release (dark gray dotted line). In contrast, strains expressing RNase R showed rapid nucleotide release upon lysis (solid light gray line). The addition of exogenous RNase R did not increase the rate of nucleotide release or the final nucleotide yield (light gray dotted line). The experiment was carried out at a final concentration of 50% lysate.

図８は、Ｍｇ２＋をキレートすることが高密度ライセート中の解重合速度に及ぼす効果を描写するグラフである。空ベクターを含有するバイオマスから調製されたライセート（濃灰色）はＥＤＴＡに不感であった。過剰発現されたＲＮａｓｅ Ｒを有するライセート（薄灰色）はＭｇ２＋除去に伴って急速なＲＮＡ解重合を示し、８ｍＭ ＥＤＴＡが最大の解重合速度を提供した。実験は９０％ライセートの終濃度で実施した。FIG. 8 is a graph illustrating the effect of chelating Mg 2+ on the depolymerization rate in high density lysates. Lysate (dark gray) prepared from biomass containing an empty vector was insensitive to EDTA. Lysate (light gray) with overexpressed RNase R showed rapid RNA depolymerization with Mg 2+ removal, with 8 mM EDTA provided the maximum depolymerization rate. The experiment was performed at a final concentration of 90% lysate.

図９Ａ～９Ｄは、ライセート中における外来性の同位体標識された「重い」ＮＭＰ（ｈＮＭＰ）の安定性を実証するグラフを示している：（図９Ａ）ｈＡＭＰはライセート中において比較的安定であり、３７℃での１時間インキュベーション後に９０％が残った。（図９Ｂ）ｈＣＭＰはライセート中において分解され、およそ３０分後に７０％が残った。１０ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム（点線）（いくつかのホスファターゼおよびキナーゼの阻害剤）の追加は安定性を有意に改善した。（図９Ｃ）ｈＵＭＰはライセート中において分解され、およそ２０分後に７０％が残った。リン酸ナトリウム（１５０ｍＭ）（点線）およびオルトバナジン酸ナトリウム（点線）は安定性を有意に改善した。（図９Ｄ）ｈＧＭＰはライセート中において分解され、およそ１０分後に７０％が残った。オルトバナジン酸ナトリウムは安定性を有意に改善し、７０％ｈＧＭＰが３０分後に残った。9A-9D show graphs demonstrating the stability of exogenous isotope-labeled "heavy" NMP (hNMP) in lysate: (FIG. 9A) hAMP is relatively stable in lysate. , 90% remained after 1 hour incubation at 37 ° C. (FIG. 9B) hCMP was degraded in lysate, with 70% remaining after approximately 30 minutes. The addition of 10 mM sodium orthovanadate (dotted line) (inhibitors of some phosphatases and kinases) significantly improved stability. (FIG. 9C) hUMP was degraded in lysate, with 70% remaining after approximately 20 minutes. Sodium phosphate (150 mM) (dotted line) and sodium orthovanadate (dotted line) significantly improved stability. (FIG. 9D) hGMP was degraded in lysate, with 70% remaining after approximately 10 minutes. Sodium orthovanadate significantly improved stability, with 70% hGMP remaining after 30 minutes.

図１０は、ライセート中の外来性ＮＴＰの安定性に及ぼす熱不活性化の効果を実証するグラフである。ライセートを７０℃でプレインキュベートした後に、温度を３７℃に下げ、ＮＴＰ（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、およびＧＴＰ）の等モル混合物を追加した。プレインキュベーション時間は右のレジェンドに列記されている。コントロールライセート（熱不活性化に付されない）はＮＴＰを急速に消費した（Ｔ＝０ｍｉｎ）。プレインキュベーション時間を増大させることはＮＴＰを安定化し、７０℃での１５分はＮＴＰａｓｅ活性を消去した（Ｔ＝１５ｍｉｎ）。FIG. 10 is a graph demonstrating the effect of thermal inactivation on the stability of exogenous NTP in lysates. After preincubating the lysate at 70 ° C., the temperature was lowered to 37 ° C. and an equimolar mixture of NTP (ATP, CTP, UTP, and GTP) was added. Pre-incubation times are listed in the legend on the right. The control lysate (not subject to heat inactivation) consumed NTP rapidly (T = 0 min). Increasing the pre-incubation time stabilized NTP and eliminated NTPase activity for 15 minutes at 70 ° C. (T = 15 min).

図１１Ａ～１１Ｂは、ライセート中のＮＭＰおよびｄｓＲＮＡの安定性に及ぼす熱不活性化の効果を実証するグラフである。（図１１Ａ）熱不活性化はライセート中のＮＭＰを安定化した。ライセートを３７℃で外来性ＲＮａｓｅ Ｒ（ライセート＋ＲＮａｓｅ Ｒ）によって処置して（ｔ＝０ｍｉｎ－５ｍｉｎ）、ＮＭＰを遊離させ、それから７０℃で熱不活性化した（ｔ＝５ｍｉｎから２５ｍｉｎ）。それから温度を３７℃に下げ、反応物をさらに６０ｍｉｎインキュベートした。ＮＭＰは熱不活性化後のライセート中において概ね安定であった。（図１１Ｂ）熱不活性化はライセート中における転写反応の反応物および産物を安定化した。ライセートを示されている温度で１５分間プレインキュベートし、それから温度を３７℃に下げ、転写反応物を追加した。７０℃および８０℃での熱不活性化は、正のコントロール（ライセートなし）と同様の検出可能な転写産物を生産するのに十分に基質および産物を安定化したが、６０℃ではしなかった。11A-11B are graphs demonstrating the effect of thermal inactivation on the stability of NMP and dsRNA in lysates. (FIG. 11A) Thermal inactivation stabilized NMP in the lysate. Lysate was treated with exogenous RNase R (lysate + RNase R) at 37 ° C (t = 0min-5min) to release NMP and then heat-inactivated at 70 ° C (t = 5min to 25min). The temperature was then lowered to 37 ° C. and the reaction was incubated for an additional 60 min. NMP was generally stable during the lysate after heat inactivation. (FIG. 11B) Thermal inactivation stabilized the reactants and products of the transcription reaction in the lysate. The lysate was pre-incubated at the indicated temperature for 15 minutes, then the temperature was lowered to 37 ° C. and the transcription reaction was added. Thermal inactivation at 70 ° C and 80 ° C stabilized the substrate and product sufficiently to produce a detectable transcript similar to positive control (without lysate), but not at 60 ° C. ..

図１２は、P. furiosusからのＵＭＰキナーゼ（ＰｆＰｙｒＨ）の温度依存的な活性を実証するグラフであり、ＡＴＰ消費についてルシフェラーゼアッセイによって定量した。精製ＰｆＰｙｒＨの比活性はインキュベーション温度に概ね不感であった。FIG. 12 is a graph demonstrating the temperature-dependent activity of UMP kinase (PfPyrH) from P. furiosus, quantifying ATP consumption by luciferase assay. The specific activity of purified PfPyrH was largely insensitive to the incubation temperature.

図１３は、E. coliからのＡｄｋ（ＥｃＡｄｋ）と比較したT. thermophilusからのＡＭＰキナーゼ（ＴｔｈＡｄｋ）の温度依存的な活性を実証するグラフであり、ルシフェラーゼによって測定した。精製ＥｃＡｄｋは６０℃よりも下の温度で活性であった。ＴｔｈＡｄｋはより高い比活性を有し、７０℃に最大を有した。FIG. 13 is a graph demonstrating the temperature-dependent activity of AMP kinase (TthAdk) from T. thermophilus compared to Adk (EcAdk) from E. coli and was measured by luciferase. Purified EcAdk was active at temperatures below 60 ° C. TthAdk had a higher specific activity, with a maximum at 70 ° C.

図１４は、T. thermophilusからのＣＭＰキナーゼ（ＴｔｈＣｍｋ）の温度依存的な活性を実証するグラフであり、ルシフェラーゼによって測定した。精製ＴｔｈＣｍｋは温度に比較的不感であり、３７～８０℃で高い活性を有した。FIG. 14 is a graph demonstrating the temperature-dependent activity of CMP kinase (TthCmk) from T. thermophilus, measured by luciferase. Purified TthCmk was relatively insensitive to temperature and had high activity at 37-80 ° C.

図１５は、E. coli（ＥｃＧｍｋ）、T. thermophilus（ＴｔｈＧｍｋ）、およびT. maritima（ＴｍＧｍｋ）からのＧＭＰキナーゼの温度依存的な活性を実証するグラフであり、ルシフェラーゼによって測定した。精製ＥｃＧｍｋ（濃灰色）はより低温でより活性であり、一方、ＴｔｈＧｍｋ（薄灰色）およびＴｍＧｍｋ（中間の灰色）は７０℃で最も活性であった。FIG. 15 is a graph demonstrating the temperature-dependent activity of GMP kinases from E. coli (EcGmk), T. thermophilus (TthGmk), and T. maritima (TmGmk), measured by luciferase. Purified EcGmk (dark gray) was more active at lower temperatures, while TthGmk (light gray) and TmGmk (intermediate gray) were most active at 70 ° C.

図１６は、A. aeolicusからの精製ＮＤＰキナーゼ（ＡａＮｄｋ）の活性を実証するデータのグラフであり、ルシフェラーゼによって測定した。精製ＡａＮｄｋはＡＴＰおよびＧＤＰを基質として用いると３７～８０℃で高度に活性であり、５０℃で最適活性であった。FIG. 16 is a graph of data demonstrating the activity of purified NDP kinase (AaNdk) from A. aeolicus, measured by luciferase. Purified AaNdk was highly active at 37-80 ° C and optimally at 50 ° C when ATP and GDP were used as substrates.

図１７は、E. coli（ＥｃＰｐｋ）、Thermosynechococcus elongatus（ＴｅＰｐｋ）、およびThermus thermophilus（ＴｔｈＰｐｋ）からの精製ポリリン酸キナーゼ１（ＰＰＫ１）酵素の活性を実証するグラフであり、ルシフェラーゼによって測定した。ＥｃＰｐｋは温度≦６０℃で最も活性であり、一方、ＴｅＰｐｋは７０℃で最適活性であった。ＴｔｈＰｐｋは比較的低い活性を示した。FIG. 17 is a graph demonstrating the activity of purified polyphosphate kinase 1 (PPK1) enzyme from E. coli (EcPpk), Thermosynechococcus elongatus (TePpk), and Thermus thermophilus (TthPpk), measured by luciferase. EcPpk was most active at a temperature of ≤60 ° C, while TePpk was optimally active at 70 ° C. TthPpk showed relatively low activity.

図１８は、緩衝液中における市販のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの活性を実証するグラフであり、３７℃でそれらのそれぞれの製造者によって推奨される条件を用いた。ＴｈｅｒｍｏＴ７およびＭｅｇａＳｃｒｉｐｔポリメラーゼは、（例えば、図３Ｂの）二重鎖ＤＮＡ鋳型による試験された条件下において、ＮＥＢポリメラーゼよりも高い比活性を示した。FIG. 18 is a graph demonstrating the activity of commercially available T7 RNA polymerase in buffer, using the conditions recommended by their respective manufacturers at 37 ° C. ThermoT7 and MegaScript polymerases showed higher specific activity than NEB polymerases under the conditions tested with the double-stranded DNA template (eg, FIG. 3B).

図１９は、二重鎖ＤＮＡ鋳型による標準化された反応条件下において、３７℃および５０℃での希釈ライセート中におけるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ活性を比較するグラフである。３７℃では、ＴｈｅｒｍｏＴ７が最も高い比活性を示した。５０℃ではＴｈｅｒｍｏＴ７のみが検出可能な活性を有し、１０ｇ／Ｌ／ｈｒを超えるｄｓＲＮＡを生じさせた。FIG. 19 is a graph comparing T7 RNA polymerase activity in diluted lysates at 37 ° C and 50 ° C under standardized reaction conditions with a double-stranded DNA template. At 37 ° C, ThermoT7 showed the highest specific activity. At 50 ° C., only ThermoT7 had detectable activity, yielding dsRNA greater than 10 g / L / hr.

図２０は、緩衝液および高密度の熱不活性化されたライセート中のＴｈｅｒｍｏＴ７活性の活性を実証するグラフである。ＴｈｅｒｍｏＴ７活性は熱不活性化後の遠心によって清澄化されたライセートにおいて最も高かった。清澄化されていないマトリックス中のポリメラーゼ活性は緩衝液単独を超えたが、清澄化ステップを省くことは活性の６０％減少をもたらした。FIG. 20 is a graph demonstrating the activity of ThermoT7 activity in buffer and dense heat-inactivated lysates. The ThermoT7 activity was highest in the lysates clarified by centrifugation after thermal inactivation. Polymerase activity in the unclarified matrix exceeded buffer alone, but omitting the clarification step resulted in a 60% reduction in activity.

図２１は、上昇した温度に対するＴｈｅｒｍｏＴ７の耐容性を実証するグラフである。ＴｈｅｒｍｏＴ７を５０℃でプレインキュベートすることは、３７℃でアッセイしたその後のポリメラーゼ活性に効果を有さなかった。６０℃および７０℃でのプレインキュベーションは酵素機能の急速な不可逆的阻害をもたらした。FIG. 21 is a graph demonstrating the tolerance of ThermoT7 to elevated temperatures. Pre-incubating ThermoT7 at 50 ° C had no effect on subsequent polymerase activity assayed at 37 ° C. Preincubation at 60 ° C and 70 ° C resulted in rapid irreversible inhibition of enzyme function.

図２２Ａは、E. coli株ＧＬ１６－１７０中のA. thermophila ＰＰＫ２について発現および可溶性データを示すＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの画像である。ＭＷ：未染色蛋白質標準ブロードレンジ（New England Biolabs Cat#P7704）。－：誘導前培養物。＋：収穫時の誘導した培養物。Ｌ：清澄化されたライセート中の可溶性蛋白質。A. thermophila ＰＰＫ２：３３ｋＤａ。図２２Ｂは、熱不活性化されたライセート中におけるA. thermophila ＰＰＫ２のＡＴＰ生産を示すグラフである。黒丸はＡＤＰからのＡＴＰ生産を表す。白丸はＡＭＰからのＡＴＰ生産を表す。両方の基質について、A. thermophila ＰＰＫ２は４００ｍＭ／ｈｒを超過する速度でＡＴＰを生産する。FIG. 22A is an image of an SDS-PAGE gel showing expression and solubility data for A. thermophila PPK2 in E. coli strain GL16-170. MW: Unstained protein standard broad range (New England Biolabs Cat # P7704). -: Pre-induction culture. +: Induced culture at harvest. L: Soluble protein in clarified lysate. A. thermophila PPK2: 33 kDa. FIG. 22B is a graph showing ATP production of A. thermophila PPK2 in heat-inactivated lysates. Black circles represent ATP production from ADP. White circles represent ATP production from AMP. For both substrates, A. thermophila PPK2 produces ATP at rates above 400 mM / hr.

図２３は、無細胞的ｄｓＲＮＡ生産におけるエネルギー生成のための耐熱性クラスＩＩＩ ＰＰＫ２の適用を実証するアガロースゲルの画像である。左のレーンは正のコントロールを含有しており、ＮＴＰからのｄｓＲＮＡ合成を実証している。真ん中のレーンは正のコントロールを含有しており、外来性ＡＴＰをエネルギー供給源として用いて、ヌクレオチドキナーゼ発現ライセート中におけるＮＭＰからのｄｓＲＮＡ合成を実証している。右のレーンは、ヌクレオチドキナーゼおよびC. aerophila Ｐｐｋ発現ライセートを用いたＮＭＰおよびＨＭＰからのｄｓＲＮＡ合成を実証する反応を含有する。各ケースにおいて、無細胞的ＲＮＡ合成反応はＭｎ２＋非依存的である。ポリメラーゼなしの反応が負のコントロールとして包含されており、各ライセート含有反応のバックグラウンド核酸含量を例解している。FIG. 23 is an image of an agarose gel demonstrating the application of thermostable class III PPK2 for energy generation in cell-free dsRNA production. The left lane contains positive controls, demonstrating dsRNA synthesis from NTP. The middle lane contains positive controls, demonstrating dsRNA synthesis from NMP in nucleotide kinase-expressing lysates using exogenous ATP as an energy source. The right lane contains reactions demonstrating dsRNA synthesis from NMP and HMP using nucleotide kinases and C. aerophila Ppk expression lysates. In each case, the cell-free RNA synthesis reaction is Mn 2+ independent. Reactions without polymerase are included as negative controls, illustrating the background nucleic acid content of each lysate-containing reaction.

図２４は、無細胞的ｄｓＲＮＡ生産におけるエネルギー生成のための耐熱性クラスＩＩＩ ＰＰＫ２の適用を実証するアガロースゲルの画像である。左のレーンは正のコントロールを含有しており、ＮＴＰからのｄｓＲＮＡ合成を実証している。真ん中のレーンは正のコントロールを含有しており、外来性ＡＴＰをエネルギー供給源として用いて、ヌクレオチドキナーゼ発現ライセート中におけるＮＭＰからのｄｓＲＮＡ合成を実証している。右のレーンは、ヌクレオチドキナーゼおよびC. aerophila Ｐｐｋ発現ライセートを用いたＮＭＰおよびＨＭＰからのｄｓＲＮＡ合成を実証する反応を含有している。C. aerophila ＰＰＫ２では、ｄｓＲＮＡ合成はＡＭＰキナーゼおよび外来性ＡＤＰの非存在下において進む。FIG. 24 is an image of an agarose gel demonstrating the application of thermostable class III PPK2 for energy generation in cell-free dsRNA production. The left lane contains positive controls, demonstrating dsRNA synthesis from NTP. The middle lane contains positive controls, demonstrating dsRNA synthesis from NMP in nucleotide kinase-expressing lysates using exogenous ATP as an energy source. The right lane contains reactions demonstrating dsRNA synthesis from NMP and HMP using nucleotide kinases and C. aerophila Ppk expression lysates. In C. aerophila PPK2, dsRNA synthesis proceeds in the absence of AMP kinase and exogenous ADP.

本明細書は、いくつかの側面において、核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）の無細胞的生産（生合成）のための方法、組成物、細胞、構築物、およびシステムが提供される。いくつかの態様においては、生物の単一の型（例えば、細菌細胞の集団）が、少なくとも１つのヌクレアーゼ、少なくとも１つの耐熱性キナーゼ、および少なくとも１つの耐熱性ポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡポリメラーゼ）を発現するように改変され得る。改変細胞は酵素発現をもたらす条件下において増殖させられる（培養される）。いくつかの態様において、改変細胞は所望の細胞密度まで増殖させられ得、それから、ある種の酵素の発現が誘導（活性化）され得る。それゆえに、ある種の酵素の転写は誘導型プロモーターのコントロール下にあり得る。それから、細胞（例えば、改変および／または未改変細胞）は溶解（例えば、機械的に、化学的に、または酵素的に破壊）されて、ＲＮＡ（例えば、ｓｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ）の無細胞的生産のために要求される酵素活性を含む細胞ライセートを生産する。いくつかの態様においては、多量体ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、および／またはｒＲＮＡ）を含有する細胞が、細胞溶解ステップに先立って、経路酵素を含有する改変細胞と混合される。他の態様においては、多量体ＲＮＡを含有する細胞から得られた細胞ライセート（単数または複数）が、経路酵素を含有する改変細胞から得られた細胞ライセート（単数または複数）と組み合わせられる（混合される）。まだ他の態様においては、１つ以上の精製された経路酵素が、改変細胞から得られた細胞ライセート（単数または複数）と組み合わせられる（混合される）。「経路酵素」は、関心のＲＮＡを（例えば、多量体ＲＮＡから出発して）生合成するために要求される酵素である。 The present specification provides methods, compositions, cells, constructs, and systems for cell-free production (biosynthesis) of nucleic acids (eg, RNA or DNA) in several aspects. In some embodiments, a single type of organism (eg, a population of bacterial cells) has at least one nuclease, at least one thermostable kinase, and at least one thermostable polymerase (eg, RNA or DNA polymerase). Can be modified to express. Modified cells are grown (cultured) under conditions that result in enzyme expression. In some embodiments, the modified cells can be grown to the desired cell density and then the expression of certain enzymes can be induced (activated). Therefore, transcription of certain enzymes can be under the control of an inducible promoter. The cells (eg, modified and / or unmodified cells) are then lysed (eg, mechanically, chemically, or enzymatically disrupted) to produce cell-free RNA (eg, ssRNA or dsRNA). Produces cellular lysates containing the enzyme activity required for. In some embodiments, cells containing multimer RNA (eg, mRNA, tRNA, and / or rRNA) are mixed with modified cells containing pathway enzymes prior to the cell lysis step. In another embodiment, cellular lysates (s) obtained from cells containing multimer RNA are combined (mixed) with cellular lysates (s) obtained from modified cells containing pathway enzymes. Ru). Yet in other embodiments, one or more purified pathway enzymes are combined (mixed) with cellular lysates (s) obtained from modified cells. A "pathogenic enzyme" is an enzyme required for biosynthesis of RNA of interest (eg, starting from multimer RNA).

ＲＮＡを合成するためには、細胞ライセート（または細胞ライセート混合物）は、ホスト由来の（内在性の）ＲＮＡの、所望の収量の５’－ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰまたはヌクレオシド一リン酸）への、ヌクレアーゼ媒介性（例えば、ＲＮａｓｅ媒介性）解重合をもたらす条件下でインキュベートされる。いくつかの態様において、細胞ライセート（または細胞ライセート混合物）はそれから加熱されて、ホスファターゼおよびヌクレアーゼ（例えばＲＮａｓｅ）を包含するホスト由来の酵素と、ホスト由来のＲＮＡの解重合を促すために細胞ライセートに先に追加されたいずれかの外来性ヌクレアーゼ（単数または複数）との大部分を不活性化する。熱不活性化ステップ後に、細胞ライセートは、例えば耐熱性ポリリン酸キナーゼとエネルギー供給源としてのポリリン酸の追加とを用いて、耐熱性キナーゼ（例えば、耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼおよびヌクレオシド二リン酸キナーゼ）によるＮＭＰからＮＴＰ（ヌクレオシド三リン酸）へのリン酸化をもたらす条件下でインキュベートされる。その後、もたらされたＮＴＰは、ライセート中に存在する（例えば、改変細胞によって発現され、細胞ライセートの細胞内コンポーネントとして包含されるか、または後で細胞ライセートに追加されるかどちらかの）改変鋳型（例えばＤＮＡ鋳型）を用いて、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば耐熱性ＲＮＡポリメラーゼ）によってＲＮＡへと重合される。
無細胞的生産 To synthesize RNA, cellular lysates (or cell lysate mixtures) are made into the desired yield of 5'-nucleoside monophosphate (NMP or nucleoside monophosphate) of host-derived (endogenous) RNA. , Also incubated under conditions that result in nuclease-mediated (eg, RNA-mediated) depolymerization. In some embodiments, the cell lysate (or cell lysate mixture) is then heated to a host-derived enzyme, including phosphatases and nucleases (eg, RNases), to the cell lysate to promote depolymerization of the host-derived RNA. Inactivates most of the previously added exogenous nucleases (s). After the heat inactivation step, the cell lysate uses, for example, a heat-resistant polyphosphate kinase and the addition of polyphosphate as an energy source to heat-resistant kinases (eg, heat-resistant nucleoside monophosphate kinase and nucleoside diphosphate). It is incubated under conditions that result in phosphorylation of NMP to NTP (nucleoside triphosphate) by a kinase). The resulting NTP is then modified to be present in the lysate (eg, either expressed by the modified cell and encapsulated as an intracellular component of the cellular lysate, or later added to the cellular lysate). Using a template (eg, a DNA template), it is polymerized into RNA by RNA polymerase (eg, heat resistant RNA polymerase).
Cell-free production

「無細胞的生産」は、生細胞を用いることのない生体分子または化学物質の合成のための生物学的プロセスの使用である。細胞は溶解され、両方が酵素を含有する未精製（クルード）部分または部分精製部分が、所望の産物の生産のために用いられる。いくつかの態様においては、精製された酵素が細胞ライセートに追加され得る。例として、細胞は培養され、収穫され、および高圧ホモジナイゼーションまたは他の細胞溶解方法（例えば化学的な細胞溶解）によって溶解される。無細胞的反応はバッチまたはフェドバッチモードで行われ得る。いくつかの場合には、酵素経路は反応器の有効体積を満たし、細胞内環境よりも希釈され得る。それでもやはり、膜結合している触媒を含む細胞内触媒の実質的に全てが提供される。内膜は細胞溶解の間に断片化され、それらの膜の断片は膜小胞を形成し得る。例えば、参照によって本明細書に組み込まれるSwartz, AIChE Journal, 2012, 58(1), 5-13参照。 "Cell-free production" is the use of biological processes for the synthesis of biomolecules or chemicals without the use of living cells. The cells are lysed and an unpurified or partially purified moiety, both containing the enzyme, is used for the production of the desired product. In some embodiments, the purified enzyme may be added to the cellular lysate. As an example, cells are cultured, harvested, and lysed by high pressure homogenization or other cytolytic methods (eg, chemical cytolysis). The cell-free reaction can be carried out in batch or fed batch mode. In some cases, the enzymatic pathway fills the effective volume of the reactor and can be diluted more than the intracellular environment. Nevertheless, substantially all of the intracellular catalysts, including membrane-bound catalysts, are provided. The endometrium is fragmented during cell lysis, and those membrane fragments can form membrane vesicles. See, for example, Swartz, AIChE Journal, 2012, 58 (1), 5-13, incorporated herein by reference.

本開示の無細胞的方法、組成物、およびシステムは、本明細書においてより詳細に論じられる細胞ライセート（例えば、クルードなまたは部分精製された細胞ライセート）を利用する。例えば機械的手段（例えば、剪断または粉砕）によって調製された細胞ライセートは、化学的に透過処理された細胞とは別物である。上で論じられているように、いくつかの態様においては、細胞溶解（例えば、機械的な細胞溶解）の間に、細胞内膜は断片化され、その結果、細胞ライセート中に反転膜小胞が形成される。かかる反転膜小胞は化学的な細胞透過処理方法によっては生産されない。溶解される細胞（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％）はもはや原形ではない。それゆえに、パーフォレーション（小さい穴）を含有する原形の細胞である透過処理された細胞は、溶解された細胞とは見なされない。 The cell-free methods, compositions, and systems of the present disclosure make use of cell lysates (eg, crude or partially purified cell lysates) discussed in more detail herein. Cell lysates prepared, for example, by mechanical means (eg, shearing or grinding) are separate from chemically permeabilized cells. As discussed above, in some embodiments, during cell lysis (eg, mechanical cell lysis), the intracellular membrane is fragmented, resulting in inverted membrane vesicles in the cell lysate. Is formed. Such inverted membrane vesicles are not produced by chemical cell permeation treatment methods. The cells to be lysed (eg, at least 75%, 80%, 85%, 90%, or 95%) are no longer in their original form. Therefore, permeabilized cells, which are prototypical cells containing perforations (small holes), are not considered lysed cells.

本明細書において提供される方法は一般的に無細胞的であり、細胞ライセートを用いるが、いくつかの態様において、少なくとも本方法のいくつかのステップについては透過処理された細胞を用いることが有利であり得る。それゆえに、本開示は、本ＲＮＡ生産方法の少なくとも１つのステップへの透過処理された細胞の使用を除外しない。 The methods provided herein are generally cell-free and use cell lysates, but in some embodiments it is advantageous to use permeabilized cells for at least some steps of the method. Can be. Therefore, the disclosure does not preclude the use of permeabilized cells in at least one step of the RNA production method.

本明細書に記載される態様の多くは特定の酵素を含む「培養細胞を溶解すること」に言及するが、この語句は、単一の培養物（例えば、ＲＮＡを合成するために必要とされる全ての酵素を含有する）から得られた細胞のクローン集団を溶解すること、ならびにそれぞれ異なる細胞培養物（例えば、それぞれが、ＲＮＡおよび／または多量体ＲＮＡ基質を合成するために必要とされる１つ以上の酵素を含有する）から得られた、１よりも多くの細胞のクローン集団を溶解することとを包含することが意図されているということが理解されるべきである。例えば、いくつかの態様においては、１つの耐熱性キナーゼを発現する細胞（例えば、改変細胞）の集団が一緒に培養され、１つの細胞ライセートを生産するために用いられ得、異なる耐熱性キナーゼを発現する細胞（例えば、改変細胞）の別の集団が一緒に培養され、別の細胞ライセートを生産するために用いられ得る。それから、それぞれ異なる耐熱性キナーゼを含むこれらの２つの細胞ライセートは、本開示のＲＮＡ生合成方法への使用のために組み合わせられ得る。
リボ核酸からヌクレオシド一リン酸への解重合 Many of the embodiments described herein refer to "lysing cultured cells" containing a particular enzyme, but the phrase is required to synthesize a single culture (eg, RNA). It is required to lyse a clonal population of cells obtained from (containing all the enzymes) and to synthesize different cell cultures (eg, each to synthesize RNA and / or multimeric RNA substrate). It should be understood that it is intended to include lysing a clonal population of more than one cell obtained from (containing one or more enzymes). For example, in some embodiments, populations of cells expressing one thermostable kinase (eg, modified cells) can be cultured together and used to produce one cell lysate, with different thermostable kinases. Another population of expressing cells (eg, modified cells) can be cultured together and used to produce another cellular lysate. These two cellular lysates, each containing a different thermostable kinase, can then be combined for use in the RNA biosynthesis methods of the present disclosure.
Depolymerization of ribonucleic acid to nucleoside monophosphate

本開示は、一連の酵素反応が関わる無細胞的プロセスによる、細胞ライセートを用いるバイオマスからのＲＮＡ（例えば、細胞の内在性ＲＮＡ）から所望の合成ＲＮＡへの変換に基づく。第１に、ホスト細胞に由来する細胞ライセート中に存在するＲＮＡ（例えば内在性ＲＮＡ）がヌクレアーゼによってその成分モノマーに変換される。バイオマスからのＲＮＡ（例えば内在性ＲＮＡ）は、典型的にはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、他のＲＮＡ、またはその組み合わせを包含する。ＲＮＡの解重合または分解は、単純に「モノマー」ともまた言われる５’－ヌクレオシド一リン酸（５’－ＮＭＰ）のプールをもたらす。それらのモノマーは関心のＲＮＡの下流の重合／合成のための出発材料として用いられ、それらはヌクレオシド二リン酸に変換され、これらはヌクレオシド三リン酸に変換される。いくつかの態様において、関心のＲＮＡはｓｓＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）である。いくつかの態様において、関心のＲＮＡはｄｓＲＮＡである。 The present disclosure is based on the conversion of RNA from biomass using cellular lysates (eg, endogenous RNA of cells) to the desired synthetic RNA by a cell-free process involving a series of enzymatic reactions. First, RNA present in cell lysates derived from host cells (eg, endogenous RNA) is converted by nucleases to its component monomers. RNA from biomass (eg, endogenous RNA) typically includes ribosomal RNA (rRNA), messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), other RNA, or a combination thereof. Depolymerization or degradation of RNA results in a pool of 5'-nucleoside monophosphate (5'-NMP), also simply referred to as the "monomer". These monomers are used as starting materials for the downstream polymerization / synthesis of RNA of interest, which are converted to nucleoside diphosphates, which are converted to nucleoside triphosphates. In some embodiments, the RNA of interest is ssRNA (eg mRNA). In some embodiments, the RNA of interest is dsRNA.

関心のＲＮＡを合成するために要求されるＲＮＡ（例えば内在性ＲＮＡ）の量は変わり得、例えば、関心のＲＮＡの所望の長さおよび収量と、細胞（例えばE. coli細胞）のＲＮＡ（例えば内在性ＲＮＡ）のヌクレオチド組成に対して相対的なＲＮＡのヌクレオチド組成とに依存する。典型的には、細菌細胞では、例えばＲＮＡ（例えば内在性ＲＮＡ）含量はトータルの細胞質量の５～５０％の範囲である。出発材料の質量は例えば次の等式を用いて計算され得る：（ＲＮＡのキログラム（ｋｇ）／乾燥細胞重量のキログラム）×１００％。 The amount of RNA required to synthesize the RNA of interest (eg, endogenous RNA) can vary, eg, the desired length and yield of the RNA of interest and the RNA of the cell (eg, E. coli cells) (eg, E. coli). It depends on the nucleotide composition of RNA relative to the nucleotide composition of endogenous RNA). Typically, in bacterial cells, for example RNA (eg, endogenous RNA) content is in the range of 5-50% of total cell mass. The mass of the starting material can be calculated, for example, using the following equation: (kilograms (kg) of RNA / kilograms of dry cell weight) x 100%.

内在性ＲＮＡは化学的または酵素的手段によってその成分モノマーへと解重合または分解され得る。しかしながら、ＲＮＡの化学的加水分解は典型的には２’－および３’－ＮＭＰを生産し、これらはＲＮＡへと重合され得ない。それゆえに、本明細書において提供される方法、組成物、およびシステムは、主として内在性ＲＮＡの解重合のために酵素を用いる。「ＲＮＡを解重合する酵素」は、ＲＮＡ中の２つのヌクレオチド間のホスホジエステル結合の加水分解を触媒する。それゆえに、「ＲＮＡを解重合する酵素」は、ＲＮＡ（多量体ＲＮＡ）をそのモノマー状形態のヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）に変換する。酵素に依存して、ＲＮＡの酵素的解重合は３’－ＮＭＰ、５’－ＮＭＰ、または３’－ＮＭＰおよび５’－ＮＭＰの組み合わせを生み得る。３’－ＮＴＰ（３’－ＮＭＰから変換される３’－ＮＤＰから変換される）を重合することは可能ではないので、５’－ＮＭＰ（これらは、それから５’－ＮＤＰに、それから５’－ＮＴＰに変換される）を生む酵素（例えばＲＮａｓｅ Ｒ）が好ましい。いくつかの態様において、３’－ＮＭＰを生む酵素は、ＲＮＡ生産の効率を増大させるために改変細胞のゲノムＤＮＡから除去される。いくつかの態様において、ＲＮＡ解重合に用いられる酵素はＲＮａｓｅ Ｒである。いくつかの態様において、用いられるＲＮａｓｅ Ｒの濃度は０．１～１．０ｍｇ／ｍＬ（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１．０ｍｇ／ｍＬ）である。いくつかの態様において、用いられるＲＮａｓｅ Ｒの濃度は０．４～０．６ｍｇ／ｍＬである。いくつかの態様において、用いられるＲＮａｓｅ Ｒの濃度は０．５ｍｇ／ｍＬである。いくつかの態様において、用いられるＲＮａｓｅ Ｒの濃度は１．０ｍｇ／ｍＬを超える。 Endogenous RNA can be depolymerized or degraded into its constituent monomers by chemical or enzymatic means. However, chemical hydrolysis of RNA typically produces 2'-and 3'-NMP, which cannot be polymerized into RNA. Therefore, the methods, compositions, and systems provided herein use enzymes primarily for the depolymerization of endogenous RNA. The "enzyme that depolymerizes RNA" catalyzes the hydrolysis of phosphodiester bonds between two nucleotides in RNA. Therefore, an "enzyme that depolymerizes RNA" converts RNA (multimer RNA) into its monomeric form, nucleoside monophosphate (NMP). Depending on the enzyme, enzymatic depolymerization of RNA can yield 3'-NMP, 5'-NMP, or a combination of 3'-NMP and 5'-NMP. Since it is not possible to polymerize 3'-NTP (converted from 3'-NDP converted from 3'-NMP), 5'-NMP (these are then 5'-NDP and then 5'. -An enzyme that produces (converted to NTP) (eg, RNase R) is preferred. In some embodiments, the enzyme that produces 3'-NMP is removed from the genomic DNA of the modified cell to increase the efficiency of RNA production. In some embodiments, the enzyme used for RNA depolymerization is RNase R. In some embodiments, the concentration of RNase R used is 0.1-1.0 mg / mL (eg, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0). .7, 0.8, 0.9, or 1.0 mg / mL). In some embodiments, the concentration of RNase R used is 0.4-0.6 mg / mL. In some embodiments, the concentration of RNase R used is 0.5 mg / mL. In some embodiments, the concentration of RNase R used is greater than 1.0 mg / mL.

ＲＮＡを解重合する酵素の例は、限定なしに、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ、例えばＲＮａｓｅ Ｒ）を包含するヌクレアーゼ、およびホスホジエステラーゼを包含する。ヌクレアーゼは核酸からより小さいコンポーネント（例えば、ヌクレオシド一リン酸ともまた言われるモノマー、またはオリゴヌクレオチド）への分解を触媒する。ホスホジエステラーゼはホスホジエステル結合の分解を触媒する。ＲＮＡを解重合するこれらの酵素は全長遺伝子または遺伝子融合体（例えば、２つの異なる酵素活性をコードする少なくとも２つの異なる遺伝子（または遺伝子の断片）を包含するＤＮＡ）によってコードされ得る。 Examples of enzymes that depolymerize RNA include, without limitation, nucleases that include ribonucleases (RNase, eg, RNase R), and phosphodiesterases. The nuclease catalyzes the degradation of nucleic acids into smaller components (eg, monomers, or oligonucleotides, also referred to as nucleoside monophosphates). Phosphodiesterase catalyzes the breakdown of phosphodiester bonds. These enzymes that depolymerize RNA can be encoded by full-length genes or gene fusions (eg, DNA containing at least two different genes (or fragments of genes) that encode two different enzyme activities).

ＲＮａｓｅは細胞内においてＲＮＡ成熟およびターンオーバーを制御するために機能する。各ＲＮａｓｅは特異的な基質選好性を有する－ｄｓＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ。それゆえに、いくつかの態様においては、一般的に、異なるＲＮａｓｅの組み合わせまたは異なるヌクレアーゼの組み合わせがバイオマス由来の多量体ＲＮＡ（例えば内在性ＲＮＡ）を解重合するために用いられ得る。例えば、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、または１～１０個の異なるヌクレアーゼがＲＮＡを解重合するために組み合わせで用いられ得る。いくつかの態様においては、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個の異なるヌクレアーゼがＲＮＡを解重合するために組み合わせで用いられ得る。本明細書において提供される使用のためのヌクレアーゼの限定しない例が表１に包含されている。いくつかの態様において、用いられるヌクレアーゼはＲＮａｓｅ Ｒである。

Figure 0007011599000001
RNase functions to control RNA maturation and turnover in cells. Each RNase has a specific substrate preference-dsRNA or ssRNA. Therefore, in some embodiments, different combinations of RNases or different nucleases can generally be used to depolymerize biomass-derived multimer RNAs (eg, endogenous RNAs). For example, 1 to 2, 1 to 3, 1 to 4, 1 to 5, 1 to 6, 1 to 7, 1 to 8, 1 to 9, or 1 to 10 different nucleases for depolymerizing RNA. Can be used in combination. In some embodiments, at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, or at least 10 different nucleases combine to depolymerize RNA. Can be used in. A non-limiting example of a nuclease for use provided herein is included in Table 1. In some embodiments, the nuclease used is RNase R.
Figure 0007011599000001

ＲＮＡを解重合する酵素（例えばＲＮａｓｅ）はホスト細胞にとって内在性（ホスト由来）であり得、またはそれらはホスト細胞内に外来的に導入された（例えば、エピソームベクター上の、またはホスト細胞のゲノム中にインテグレーションされた）改変核酸によってコードされ得る。 Enzymes that depolymerize RNA (eg, RNase) can be endogenous (host-derived) to the host cell, or they have been introduced exogenously into the host cell (eg, on an episome vector or in the genome of the host cell). It can be encoded by a modified nucleic acid (integrated into).

いくつかの態様において、ＲＮＡを解重合する酵素をコードする改変核酸は誘導型プロモーターに作動可能に連結される。それゆえに、いくつかの態様において、ＲＮＡを解重合する酵素をコードする改変核酸の発現は時間的または空間的に制御される。例えば、核酸はホスト細胞のペリプラズムに転置または隔離される酵素（例えばＲＮａｓｅ）をコードするように改変され得、その結果、酵素の活性が細胞増殖または他の代謝プロセスに干渉しない。細胞溶解によって、転置された酵素はペリプラズムから遊離し、内在性ＲＮＡとの接触をし、ＲＮＡをモノマー形態に解重合する。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる２０１１年１１月１０日公開の国際公開Ｎｏ．ＷＯ２０１１／１４０５１６参照。 In some embodiments, the modified nucleic acid encoding the enzyme that depolymerizes RNA is operably linked to an inducible promoter. Therefore, in some embodiments, the expression of the modified nucleic acid encoding the enzyme that depolymerizes RNA is temporally or spatially regulated. For example, the nucleic acid can be modified to encode an enzyme that is translocated or sequestered into the periplasm of the host cell (eg, RNase) so that the activity of the enzyme does not interfere with cell proliferation or other metabolic processes. Upon cell lysis, the translocated enzyme is released from the periplasm, contacts the endogenous RNA, and depolymerizes the RNA into monomeric forms. For example, International Publication No. published November 10, 2011, which is incorporated herein by reference. See WO2011 / 140516.

「ＲＮＡの解重合をもたらす条件」は当分野において公知である。または、当業者によって決定され得、例えば、ｐＨ、温度、時間の長さ、および細胞ライセートの塩濃度、ならびにいずれかの外来性補因子を包含するヌクレアーゼ（例えばＲＮａｓｅ）活性の最適条件を考慮に入れる。例は、先に記載されているものを包含する（例えばWong, C.H. et al. J. Am. Chem. Soc., 105: 115-117, 1983)、EP1587947B1、Cheng ZF, Deutscher MP. J Biol Chem. 277:21624-21629, 2002参照）。 "Conditions that result in RNA depolymerization" are known in the art. Alternatively, it can be determined by one of ordinary skill in the art, taking into account, for example, pH, temperature, length of time, and salt concentration of cellular lysates, as well as optimal conditions for nuclease (eg, RNase) activity, including any exogenous cofactor. put in. Examples include those described above (eg Wong, CH et al. J. Am. Chem. Soc., 105: 115-117, 1983), EP1587947B1, Cheng ZF, Deutscher MP. J Biol Chem. . 277: 21624-21629, 2002).

いくつかの態様においては、金属イオン（例えばＭｇ２＋）が解重合反応から枯渇させられる。いくつかの態様において、金属イオン（例えばＭｇ２＋）の濃度は８ｍＭ以下（例えば、８ｍＭ未満、７ｍＭ未満、６ｍＭ未満、５ｍＭ未満、４ｍＭ未満、３ｍＭ未満、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．５ｍＭ未満）である。いくつかの態様において、金属イオン（例えばＭｇ２＋）の濃度は０．１ｍＭ－８ｍＭ、０．１ｍＭ－７ｍＭ、または０．１ｍＭ－５ｍＭである。 In some embodiments, metal ions (eg Mg 2+ ) are depleted from the depolymerization reaction. In some embodiments, the concentration of metal ions (eg Mg 2+ ) is 8 mM or less (eg, less than 8 mM, less than 7 mM, less than 6 mM, less than 5 mM, less than 4 mM, less than 3 mM, less than 2 mM, less than 1 mM, less than 0.5 mM). Is. In some embodiments, the concentration of metal ions (eg Mg 2+ ) is 0.1 mM-8 mM, 0.1 mM-7 mM, or 0.1 mM-5 mM.

ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセートのｐＨは３．０から８．０の値を有し得る。いくつかの態様において、細胞ライセートのｐＨ値は３．０～８．０、４．０～８．０、５．０～８．０、６．０～８．０、７．０～８．０、３．０～７．０、４．０～７．０、５．０～７．０、６．０～７．０、３．０～６．０、４．０～６．０、５．０～６．０、３．０～５．０、３．０～４．０、または４．０～５．０である。いくつかの態様において、細胞ライセートのｐＨ値は３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、または８．０である。いくつかの態様において、細胞ライセートのｐＨ値は７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、または７．５である。細胞ライセートのｐＨ値は必要とされるように調整され得る。 The pH of the cell lysate during the RNA depolymerization reaction can have a value of 3.0 to 8.0. In some embodiments, the pH values of the cell lysates are 3.0-8.0, 4.0-8.0, 5.0-8.0, 6.0-8.0, 7.0-8. 0, 3.0-7.0, 4.0-7.0, 5.0-7.0, 6.0-7.0, 3.0-6.0, 4.0-6.0, It is 5.0 to 6.0, 3.0 to 5.0, 3.0 to 4.0, or 4.0 to 5.0. In some embodiments, the pH values of the cell lysates are 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7. 5 or 8.0. In some embodiments, the pH value of the cell lysate is 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, or 7.5. The pH value of the cell lysate can be adjusted as required.

ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセートの温度は１５℃から７０℃であり得る。いくつかの態様において、ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセートの温度は１５～６０℃、１５～５０℃、１５～４０℃、１５～３０℃、２５～７０℃、２５～６０℃、２５～５０℃、２５～４０℃、３０～７０℃、３０～６０℃、または３０～５０℃である。いくつかの態様において、ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセートの温度は３７℃である。いくつかの態様において、ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセートの温度は１５℃、２５℃、３２℃、３７℃、４０℃、４２℃、４５℃、５０℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、または７０℃である。 The temperature of the cell lysates during the RNA depolymerization reaction can be between 15 ° C and 70 ° C. In some embodiments, the temperature of the cell lysates during the RNA depolymerization reaction is 15-60 ° C, 15-50 ° C, 15-40 ° C, 15-30 ° C, 25-70 ° C, 25-60 ° C, 25-. It is 50 ° C., 25-40 ° C., 30-70 ° C., 30-60 ° C., or 30-50 ° C. In some embodiments, the temperature of the cell lysates during the RNA depolymerization reaction is 37 ° C. In some embodiments, the temperature of the cell lysates during the RNA depolymerization reaction is 15 ° C, 25 ° C, 32 ° C, 37 ° C, 40 ° C, 42 ° C, 45 ° C, 50 ° C, 55 ° C, 56 ° C, 57 ° C. , 58 ° C, 59 ° C, 60 ° C, 61 ° C, 62 ° C, 63 ° C, 64 ° C, 65 ° C, 66 ° C, 67 ° C, 68 ° C, 69 ° C, or 70 ° C.

ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセートは５分（ｍｉｎ）から７２時間（ｈｒ）インキュベートされ得る。いくつかの態様において、ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセートは５～１０ｍｉｎ、５～１５ｍｉｎ、５～２０ｍｉｎ、５～３０ｍｉｎ、または５ｍｉｎ－４８ｈｒインキュベートされる。例えば、ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセートは５ｍｉｎ、１０ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、２０ｍｉｎ、２５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、４５ｍｉｎ、１ｈｒ、２ｈｒ、３ｈｒ、４ｈｒ、５ｈｒ、６ｈｒ、７ｈｒ、８ｈｒ、９ｈｒ、１０ｈｒ、１１ｈｒ、１２ｈｒ、１８ｈｒ、２４ｈｒ、３０ｈｒ、３６ｈｒ、４２時間、または４８時間インキュベートされ得る。いくつかの態様において、ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセートは３７℃の温度で２４時間インキュベートされる。いくつかの態様において、ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセートは３７℃の温度で５～１０ｍｉｎインキュベートされる。いくつかの態様において、ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセートは７．０のｐＨを有し、３７℃の温度で１５分間インキュベートされる。いくつかの態様において、ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセートは、ＲＮＡから５’－ＮＭＰへの６５％超の変換をもたらす条件下においてインキュベートされ得る。いくつかの態様において、ＲＮＡは（または少なくとも）５０ｍＭ／ｈｒ、１００ｍＭ／ｈｒ、または２００ｍＭ／ｈｒの速度で５’－ＮＭＰに変換される。 Cellular lysates during the RNA depolymerization reaction can be incubated for 5 minutes (min) to 72 hours (hr). In some embodiments, the cell lysates during the RNA depolymerization reaction are incubated for 5-10 min, 5-15 min, 5-20 min, 5-30 min, or 5 min-48 hr. For example, the cell lysates during the RNA depolymerization reaction are 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 45 min, 1 hr, 2 hr, 3 hr, 4 hr, 5 hr, 6 hr, 7 hr, 8 hr, 9 hr, 10 hr, 11 hr, 12 hr, It can be incubated for 18hr, 24hr, 30hr, 36hr, 42 hours, or 48 hours. In some embodiments, the cell lysates during the RNA depolymerization reaction are incubated at a temperature of 37 ° C. for 24 hours. In some embodiments, the cell lysates during the RNA depolymerization reaction are incubated at a temperature of 37 ° C. for 5-10 min. In some embodiments, the cell lysates during the RNA depolymerization reaction have a pH of 7.0 and are incubated at a temperature of 37 ° C. for 15 minutes. In some embodiments, the cellular lysates during the RNA depolymerization reaction can be incubated under conditions that result in over 65% conversion of RNA to 5'-NMP. In some embodiments, RNA is (or at least) converted to 5'-NMP at a rate of 50 mM / hr, 100 mM / hr, or 200 mM / hr.

いくつかの態様においては、例えば酵素凝集を防ぐために、塩が細胞ライセートに追加される。例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、またはその組み合わせが細胞ライセートに追加され得る。ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセート中の塩の濃度は５ｍＭから１Ｍであり得る。いくつかの態様において、ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセート中の塩の濃度は５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、７５０ｍＭ、または１Ｍである。いくつかの態様において、細胞ライセートは、４０～６０ｍＭリン酸カリウム、１～５ｍＭ ＭｎＣｌ２、および／または１０～５０ｍＭ ＭｇＣｌ２（例えば、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２）を包含する混合物を含む。 In some embodiments, salts are added to the cellular lysates, for example to prevent enzyme aggregation. For example, sodium chloride, potassium chloride, sodium acetate, potassium acetate, or a combination thereof may be added to the cell lysate. The concentration of salt in the cell lysates during the RNA depolymerization reaction can be 5 mM to 1 M. In some embodiments, the concentration of salt in the cell lysate during the RNA depolymerization reaction is 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 500 mM, 750 mM, or 1 M. In some embodiments, the cell lysate comprises a mixture comprising 40-60 mM potassium phosphate, 1-5 mM MnCl 2 , and / or 10-50 mM MgCl 2 (eg, 20 mM MgCl 2 ).

いくつかの態様においては、例えば特定のｐＨ値および／または塩濃度を達成するために、緩衝液が細胞ライセートに追加される。緩衝液の例は、限定なしに、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リンゴ酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ヒスチジン緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、ｂｉｓ－ｔｒｉｓ緩衝液、およびエタノールアミン緩衝液を包含する。 In some embodiments, buffer is added to the cell lysate, eg, to achieve a particular pH value and / or salt concentration. Examples of buffers are, without limitation, phosphate buffer, Tris buffer, MOPS buffer, HEEPS buffer, citrate buffer, acetate buffer, apple acid buffer, MES buffer, histidine buffer, PIPES. Includes buffers, bis-tris buffers, and ethanolamine buffers.

ＲＮＡの解重合は、５’－ＡＭＰ、５’－ＵＭＰ、５’－ＣＭＰ、および５’－ＧＭＰを包含する５’－ＮＭＰの生産をもたらす。ＮＭＰは細胞ライセート中において比較的等モル量で存在し得、一方、ＲＮＡの解重合はＮＭＰのいずれかの所定の比をもたらさない。 Depolymerization of RNA results in the production of 5'-NMP, including 5'-AMP, 5'-UMP, 5'-CMP, and 5'-GMP. NMP can be present in relatively equimolar amounts in cell lysates, while RNA depolymerization does not result in any given ratio of NMP.

いくつかの態様においては、溶解によって、細胞内の内在性ＲＮＡの５０～９８％が５’－ＮＭＰに変換される（解重合される）。例えば、５０～９５％、５０～９０％、５０～８５％、５０～８０％、７５～９８％、７５～９５％、７５～９０％、７５～８５％、または７５～８０％ＲＮＡが５’－ＮＭＰに変換される（解重合される）。いくつかの態様においては、溶解によって、細胞内の内在性ＲＮＡの６５～７０％が５’－ＮＭＰに変換される（解重合される）。より低い収量もまた許容可能である。
無益回路の消去 In some embodiments, lysis converts (depolymerizes) 50-98% of the intracellular RNA into 5'-NMP. For example, 50-95%, 50-90%, 50-85%, 50-80%, 75-98%, 75-95%, 75-90%, 75-85%, or 75-80% RNA is 5 '-Converted to NMP (depolymerized). In some embodiments, lysis converts (depolymerizes) 65-70% of the intracellular RNA to 5'-NMP. Lower yields are also acceptable.
Elimination of futile cycle

内在性および／または外来性ヌクレアーゼによるバイオマス（例えば内在性ＲＮＡ）からそのモノマー成分へのＲＮＡの変換後に、典型的には、細胞ライセート中にはヌクレアーゼおよびホスファターゼを包含するいくつかの酵素が残っており、それらはＲＮＡ生合成に有害な効果を有し得る。例えば、Escherichia coliは数々のホスファターゼを有し、それらの多くはＮＴＰ、ＮＤＰ、およびＮＭＰを脱リン酸化する。ＲＮＡ解重合後のＮＭＰの脱リン酸化は、リン酸化されていないヌクレオシドの蓄積と使用可能なＮＭＰ基質の喪失とをもたらし、それゆえに合成ＲＮＡ収量を低減する。ＲＮＡ解重合後のＮＭＰ、ＮＤＰ、またはＮＴＰの脱リン酸化は無益エネルギー回路（合成ＲＮＡの低い収量を生じさせるエネルギー回路）をもたらし、その間にＮＭＰはＮＤＰおよびＮＴＰへとリン酸化され、これらは翻ってそれらのＮＭＰまたはヌクレオシド出発点へと再び脱リン酸化される。無益回路は単位エネルギー入力（例えば、ポリリン酸、ＡＴＰ、または他の高エネルギーリン酸供給源）あたりのＲＮＡ産物の収量を低減する。いくつかの態様において、酵素活性はホストゲノムからの除去によって消去される。いくつかの態様において、酵素活性は熱不活性化によって消去される。いくつかの態様において、酵素活性はプロテアーゼ標的化によって消去される。いくつかの態様において、酵素活性は化学的阻害剤の使用によって消去される。前述のアプローチのいずれかの組み合わせもまた用いられ得る。 After conversion of RNA from biomass (eg, endogenous RNA) to its monomeric components by endogenous and / or exogenous nucleases, typically some enzymes, including nucleases and phosphatases, remain in the cellular lysates. And they can have detrimental effects on RNA biosynthesis. For example, Escherichia coli has a number of phosphatases, many of which dephosphorylate NTP, NDP, and NMP. Dephosphorylation of NMP after RNA depolymerization results in the accumulation of unphosphorylated nucleosides and the loss of usable NMP substrate, thus reducing the yield of synthetic RNA. Dephosphorylation of NMP, NDP, or NTP after RNA depolymerization results in a futile energy circuit, during which NMP is phosphorylated to NDP and NTP, which in turn. And are dephosphorylated again to their NMP or nucleoside starting point. The futile cycle reduces the yield of RNA products per unit energy input (eg, polyphosphoric acid, ATP, or other high energy phosphate source). In some embodiments, enzyme activity is eliminated by removal from the host genome. In some embodiments, the enzyme activity is eliminated by thermal inactivation. In some embodiments, enzyme activity is eliminated by protease targeting. In some embodiments, the enzyme activity is eliminated by the use of a chemical inhibitor. Any combination of the above approaches can also be used.

本明細書において提供されるＲＮＡの生合成にとって有害な酵素は、ホスト細胞を改変するプロセスの間にホスト細胞ゲノムから欠失させられ得る。ただし、酵素はホスト細胞（例えば、細菌細胞）生存および／または増殖にとって必須ではないものとする。酵素または酵素活性の欠失は、例えばホスト細胞ゲノム中の必須酵素をコードする遺伝子を欠失させるかまたは修飾することによって達成され得る。酵素は、酵素がホスト細胞の生存にとって必要である場合には「ホスト細胞生存にとって必須」である。すなわち、ホスト細胞が特定の酵素の発現および／または活性なしには生存し得ない場合には、その酵素はホスト細胞生存にとって必須と見なされる。類似に、酵素は、酵素がホスト細胞の増殖に必要である場合には「ホスト細胞増殖にとって必須」である。すなわち、ホスト細胞が特定の酵素の発現および／または活性なしには***および／または増殖し得ない場合には、その酵素はホスト細胞増殖にとって必須と見なされる。 Enzymes that are detrimental to RNA biosynthesis provided herein can be deleted from the host cell genome during the process of modifying the host cell. However, the enzyme shall not be essential for the survival and / or proliferation of host cells (eg, bacterial cells). Deletion of an enzyme or enzyme activity can be achieved, for example, by deleting or modifying a gene encoding an essential enzyme in the host cell genome. Enzymes are "essential for host cell survival" if they are required for host cell survival. That is, if a host cell cannot survive without the expression and / or activity of a particular enzyme, that enzyme is considered essential for host cell survival. Similarly, an enzyme is "essential for host cell proliferation" if the enzyme is required for host cell proliferation. That is, if a host cell cannot divide and / or proliferate without the expression and / or activity of a particular enzyme, that enzyme is considered essential for host cell proliferation.

ＲＮＡの生合成にとって有害な酵素がホスト細胞生存および／または増殖にとって必須である場合には、酵素をコードする遺伝子を欠失させるかまたは修飾することが可能ではなくあり得る。かかる場合に、酵素は熱不活性化され得る。「熱不活性化」は、細胞ライセートを、内在性のヌクレアーゼおよびホスファターゼを不活性化する（または少なくとも部分的に不活性化する）ために十分な温度に加熱するプロセスを言う。一般的に、熱不活性化のプロセスには有害な酵素の変性（アンフォールディング）が関わる。細胞の内在性蛋白質が変性する温度は生物間で変わる。E. coliにおいては、例えば、細胞の内在性酵素は一般的に４１℃よりも上の温度で変性する。変性温度は他の生物では４１℃よりも高くまたは低くあり得る。ここで提供される細胞ライセートの酵素は４０℃～９５℃の、またはより高い温度で熱不活性化され得る。いくつかの態様において、細胞ライセートの酵素は４０～９０℃、４０～８０℃、４０～７０℃、４０～６０℃、４０～５０℃、５０～８０℃、５０～７０℃、５０～６０℃、６０～８０℃、６０～７０℃、または７０～８０℃の温度で熱不活性化され得る。例えば、細胞ライセートの酵素は４０℃、４２℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、または９５℃の温度で熱不活性化され得る。いくつかの態様において、細胞ライセートの酵素は５０～８０℃の温度で熱不活性化され得る。いくつかの態様において、細胞ライセートの酵素は７０℃の温度で熱不活性化され得る。いくつかの態様において、細胞ライセートの酵素は６０℃の温度で熱不活性化され得る。有害な酵素の化学的阻害剤を導入することもまた可能であり得る。かかる阻害剤はオルトバナジン酸ナトリウム（蛋白質ホスホチロシンホスファターゼの阻害剤）、フッ化ナトリウム（ホスホセリンおよびホスホトレオニンホスファターゼの阻害剤）、ピロリン酸ナトリウム（ホスファターゼ阻害剤）、リン酸ナトリウム、および／またはリン酸カリウムを包含し得るが、これに限定されない。 If an enzyme detrimental to RNA biosynthesis is essential for host cell survival and / or proliferation, it may not be possible to delete or modify the gene encoding the enzyme. In such cases, the enzyme can be heat inactivated. "Thermal inactivation" refers to the process of heating cell lysates to a temperature sufficient to inactivate (or at least partially inactivate) the endogenous nucleases and phosphatases. In general, the process of heat inactivation involves denaturation of harmful enzymes. The temperature at which the endogenous protein of a cell denatures varies between organisms. In E. coli, for example, cell endogenous enzymes are generally denatured at temperatures above 41 ° C. The denaturation temperature can be higher or lower than 41 ° C in other organisms. The cellular lysate enzymes provided herein can be heat inactivated at temperatures between 40 ° C. and 95 ° C., or higher. In some embodiments, the cell lysate enzyme is 40-90 ° C, 40-80 ° C, 40-70 ° C, 40-60 ° C, 40-50 ° C, 50-80 ° C, 50-70 ° C, 50-60 ° C. , 60-80 ° C, 60-70 ° C, or can be heat-inactivated at temperatures of 70-80 ° C. For example, the cell lysate enzyme is heated at temperatures of 40 ° C, 42 ° C, 45 ° C, 50 ° C, 55 ° C, 60 ° C, 65 ° C, 70 ° C, 75 ° C, 80 ° C, 85 ° C, 90 ° C, or 95 ° C. Can be inactivated. In some embodiments, the cellular lysate enzyme can be heat inactivated at a temperature of 50-80 ° C. In some embodiments, the cellular lysate enzyme can be heat inactivated at a temperature of 70 ° C. In some embodiments, the cellular lysate enzyme can be heat inactivated at a temperature of 60 ° C. It may also be possible to introduce chemical inhibitors of harmful enzymes. Such inhibitors are sodium orthovanadate (inhibitor of protein phosphotyrosine phosphatase), sodium fluoride (inhibitor of phosphoserine and phosphotreonine phosphatase), sodium pyrophosphate (phosphatase inhibitor), sodium phosphate, and / or potassium phosphate. Can include, but is not limited to.

細胞ライセートが内在性酵素の熱不活性化を達成するために上昇した温度でインキュベートされる時期は、例えば細胞ライセートの体積および細胞ライセートが調製された生物に依存して変わり得る。いくつかの態様において、細胞ライセートは３５℃～８０℃の温度で２分間（ｍｉｎ）から４８時間（ｈｒ）インキュベートされる。例えば、細胞ライセートは３５℃～８０℃の温度で２ｍｉｎ、４ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１０ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、４５ｍｉｎ、または１ｈｒインキュベートされ得る。いくつかの態様において、細胞ライセートは３５℃～８０℃の温度で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２４、３６、４２、または４８ｈｒインキュベートされる。 The timing at which cellular lysates are incubated at elevated temperatures to achieve thermal inactivation of endogenous enzymes can vary, for example, depending on the volume of cellular lysates and the organism from which the cellular lysates were prepared. In some embodiments, the cell lysates are incubated at a temperature of 35 ° C-80 ° C for 2 minutes (min) to 48 hours (hr). For example, cell lysates can be incubated for 2 min, 4 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, or 1 hr at a temperature of 35 ° C to 80 ° C. In some embodiments, the cell lysate is 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 at a temperature of 35 ° C to 80 ° C. , 19, 20, 24, 36, 42, or 48hr.

いくつかの態様において、酵素は６０～８０℃の温度で１０～２０ｍｉｎ熱不活性化される。いくつかの態様において、酵素は７０℃の温度で１５ｍｉｎ熱不活性化される。 In some embodiments, the enzyme is heat-inactivated for 10-20 min at a temperature of 60-80 ° C. In some embodiments, the enzyme is heat-inactivated for 15 min at a temperature of 70 ° C.

いくつかの態様において、内在性ＲＮＡを解重合する酵素は、酵素を熱に対してより感受性にする１つ以上の修飾（例えば変異）を含む。それらの酵素は「熱感受性酵素」と言われる。熱感受性酵素はそれらの野生型カウンターパートのものよりも低い温度で変性し不活性化されるようになり、および／または熱感受性酵素の活性を低減するために要求される時期はそれらの野生型カウンターパートのものよりも短い。 In some embodiments, the enzyme depolymerizing the endogenous RNA comprises one or more modifications (eg, mutations) that make the enzyme more sensitive to heat. These enzymes are called "heat sensitive enzymes". Heat-sensitive enzymes become denatured and inactivated at lower temperatures than those of their wild-type counterparts, and / or the time required to reduce the activity of heat-sensitive enzymes is their wild-type. Shorter than that of the counterpart.

熱不活性化される酵素はいくつかの場合には何らかの程度の活性を保持し得るということが理解されるべきである。例えば、熱不活性化された酵素の活性レベルは熱不活性化されていない同じ酵素の活性レベルの５０％未満であり得る。いくつかの態様において、熱不活性化された酵素の活性レベルは熱不活性化されていない同じ酵素の活性レベルの４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、または０．１％未満である。 It should be understood that the heat-inactivated enzyme may retain some degree of activity in some cases. For example, the activity level of a heat-inactivated enzyme can be less than 50% of the activity level of the same non-heat-inactivated enzyme. In some embodiments, the activity level of the heat-inactivated enzyme is less than 40%, less than 30%, less than 20%, less than 10%, less than 5% of the activity level of the same non-heat-inactivated enzyme. Less than 1% or less than 0.1%.

それゆえに、酵素の活性は完全に消去または低減され得る。酵素は、酵素の変性した（熱不活性化された）形態がその自然状態の形態の酵素によって触媒される反応をもはや触媒しない場合に、完全に不活性と見なされる。熱不活性化された変性した酵素は、熱不活性化された酵素の活性が（例えば、その自然状態の環境において）加熱されない酵素の活性に対して相対的に少なくとも５０％低減されるときに、「不活性化された」と見なされる。いくつかの態様において、熱不活性化された酵素の活性は、加熱されない酵素の活性に対して相対的に５０～１００％低減される。例えば、熱不活性化された酵素の活性は、加熱されない酵素の活性に対して相対的に５０～９０％、５０～８５％、５０～８０％、５０～７５％、５０～７０％、５０～６５％、５０～６０％、または５０～５５％低減される。いくつかの態様において、熱不活性化された酵素の活性は、加熱されない酵素の活性に対して相対的に２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％低減される。 Therefore, the activity of the enzyme can be completely eliminated or reduced. An enzyme is considered completely inactive when the denatured (heat-inactivated) form of the enzyme no longer catalyzes the reaction catalyzed by the enzyme in its natural form. A heat-inactivated denatured enzyme is when the activity of the heat-inactivated enzyme is reduced by at least 50% relative to the activity of the unheated enzyme (eg, in its natural environment). , Is considered "inactivated". In some embodiments, the activity of the heat-inactivated enzyme is reduced by 50-100% relative to the activity of the unheated enzyme. For example, the activity of the heat-inactivated enzyme is 50-90%, 50-85%, 50-80%, 50-75%, 50-70%, 50 relative to the activity of the unheated enzyme. It is reduced by ~ 65%, 50-60%, or 50-55%. In some embodiments, the activity of the heat-inactivated enzyme is 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60 relative to the activity of the unheated enzyme. %, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, or 100% reduction.

熱不活性化されるかまたはホスト細胞のゲノムから欠失させられ得る酵素の例は、限定なしに、ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｉ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＰＮＰａｓｅ、ＲＮａｓｅ ＩＩ、およびＲＮａｓｅ Ｔ）、ホスファターゼ（例えば、ヌクレオシドモノホスファターゼ、ヌクレオシドジホスファターゼ、ヌクレオシドトリホスファターゼ）、ならびにＲＮＡを解重合またはヌクレオチドを脱リン酸化する他の酵素を包含する。ＲＮＡを解重合する酵素は、ＲＮＡ分子を切断、部分的に加水分解、または完全に加水分解することができるいずれかの酵素を包含する。表２は、熱不活性化されるかまたはいくつかの場合には改変ホスト細胞から欠失させられ得る、ヌクレアーゼの限定しない例のリストを提供している。表３は、熱不活性化されるかまたはいくつかの場合には改変ホスト細胞から欠失させられ得る、ホスファターゼの限定しない例のリストを提供している。これらおよび他のヌクレアーゼおよびホスファターゼの熱不活性化は本開示によって包含される。

Figure 0007011599000002

Figure 0007011599000003
 Examples of enzymes that can be heat-inactivated or deleted from the genome of the host cell include, without limitation, nucleases (eg, RNase III, RNase I, RNase R, PNPase, RNase II, and RNase T). Includes phosphatases (eg, nucleoside monophosphatases, nucleoside diphosphatases, nucleoside triphosphatases), as well as other enzymes that depolymerize RNA or dephosphorylate nucleotides. Enzymes that depolymerize RNA include any enzyme that can cleave, partially hydrolyze, or completely hydrolyze RNA molecules. Table 2 provides a list of unrestricted examples of nucleases that can be heat inactivated or, in some cases, deleted from the modified host cell. Table 3 provides a list of unrestricted examples of phosphatases that can be heat inactivated or, in some cases, deleted from the modified host cell. The thermal inactivation of these and other nucleases and phosphatases is encapsulated by the present disclosure.
Figure 0007011599000002
Figure 0007011599000003

E. coli ＲＮａｓｅ ＩＩＩはｄｓＲＮＡおよびいくつかの一本鎖ｍＲＮＡ分子を選好的に切断する。細胞ライセート中のＲＮａｓｅ ＩＩＩの存在は、高濃度の合成ＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）の蓄積を限定し得る。なぜなら合成ＲＮＡが難なく切断されるからである。ＲＮａｓｅ ＩＩＩもＲＮａｓｅ ＩＩＩをコードする遺伝子ｒｎｃも細胞生存能にとって必須ではない。それゆえに、いくつかの態様においては、ｒｎｃが改変ホスト細胞において欠失または変異させられる。他の態様においては、ＲＮａｓｅ ＩＩＩが内在性ＲＮＡの解重合後に熱不活性化される。 E. coli RNase III preferentially cleaves dsRNA and some single-stranded mRNA molecules. The presence of RNase III in cellular lysates can limit the accumulation of high concentrations of synthetic RNA (eg, dsRNA). This is because synthetic RNA is easily cleaved. Neither RNase III nor the gene rnc encoding RNase III is essential for cell viability. Therefore, in some embodiments, the rnc is deleted or mutated in the modified host cell. In another embodiment, RNase III is heat-inactivated after depolymerization of the endogenous RNA.

E. coli ＲＮａｓｅ Ｉは、原形の細胞内のペリプラズム空間に局在し、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｔＲＮＡを包含する広範囲のＲＮＡ分子の解重合を触媒する。生理条件下においては、この酵素のペリプラズム局在は、酵素が細胞内のＲＮＡ安定性にはほとんど影響を有さないということを意味する；しかしながら、細胞ライセート中のペリプラズムおよび細胞質の混合は、細胞内ＲＮＡへのＲＮａｓｅ Ｉのアクセスを許可する。細胞ライセート中のＲＮａｓｅ Ｉの存在はＲＮＡ分解によって合成ＲＮＡの収量を低減し得る。ＲＮａｓｅ ＩもＲＮａｓｅ Ｉをコードする遺伝子ｒｎａも細胞生存能にとって必須ではない。それゆえに、いくつかの態様においては、ｒｎａが改変ホスト細胞において欠失または変異させられる。他の態様においては、ＲＮａｓｅ Ｉが内在性ＲＮＡの解重合後に熱不活性化される。 E. coli RNase I is localized in the periplasmic space of the original cell and catalyzes the depolymerization of a wide range of RNA molecules, including rRNA, mRNA, and tRNA. Under physiological conditions, the periplasmic localization of this enzyme means that the enzyme has little effect on intracellular RNA stability; however, the mixture of periplasm and cytoplasm in the cell lysate is cellular. Allows access of RNase I to internal RNA. The presence of RNase I in cell lysates can reduce the yield of synthetic RNA by RNA degradation. Neither RNase I nor the gene rna encoding RNase I is essential for cell viability. Therefore, in some embodiments, RNA is deleted or mutated in the modified host cell. In another embodiment, RNase I is heat-inactivated after depolymerization of the endogenous RNA.

E. coli ＲＮａｓｅ ＲおよびＲＮａｓｅ ＴはｄｓＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡ、ならびに小さい無構造ＲＮＡ分子の解重合を触媒する。酵素もそれぞれ酵素をコードする遺伝子ｒｎｒおよびｒｎｔも細胞生存能にとって必須ではない。それゆえに、いくつかの態様においては、ｒｎｒおよび／またはｒｎｔが改変ホスト細胞（例えばE. coliホスト細胞）において欠失または変異させられる。他の態様においては、ＲＮａｓｅ Ｒおよび／またはＲＮａｓｅ Ｔが内在性ＲＮＡの解重合後に熱不活性化される。 E. coli RNase R and RNase T catalyze the depolymerization of dsRNA, rRNA, tRNA, and mRNA, as well as small unstructured RNA molecules. Neither the enzyme nor the genes encoding the enzyme rnr and rnt are essential for cell viability. Therefore, in some embodiments, rnr and / or rt are deleted or mutated in a modified host cell (eg, E. coli host cell). In another embodiment, RNase R and / or RNase T are thermally inactivated after depolymerization of the endogenous RNA.

E. coli ＲＮａｓｅ ＥおよびＰＮＰａｓｅはデグラドソームのコンポーネントであり、これは細胞内のｍＲＮＡターンオーバーを担う。ＲＮａｓｅ Ｅは、ＰＮＰａｓｅおよびＲＮａｓｅ ＩＩと一緒に機能して細胞内ｍＲＮＡプールをターンオーバーさせると考えられている。ＲＮａｓｅ Ｅをコードする遺伝子ｒｎｅの破壊はE. coliにおいては致死的である。それゆえに、いくつかの態様においては、ＲＮａｓｅ Ｅが内在性ＲＮＡの解重合後に熱不活性化される。ＰＮＰａｓｅもＰＮＰａｓｅをコードする遺伝子ｐｎｐも細胞生存能にとって必須ではない。それゆえに、いくつかの態様においては、ｐｎｐが改変ホスト細胞（例えばE. coliホスト細胞）において欠失または変異させられる。他の態様においては、ＰＮＰａｓｅが内在性ＲＮＡの解重合後に熱不活性化される。 E. coli RNase E and PNPase are components of degradosomes, which are responsible for intracellular mRNA turnover. RNase E is thought to function with PNPase and RNase II to turn over the intracellular mRNA pool. Disruption of the gene rne encoding RNase E is lethal in E. coli. Therefore, in some embodiments, RNase E is thermally inactivated after depolymerization of the endogenous RNA. Neither PNPase nor the gene encoding PNPase, pnp, is essential for cell viability. Therefore, in some embodiments, pnp is deleted or mutated in a modified host cell (eg, E. coli host cell). In another embodiment, PNPase is heat-inactivated after depolymerization of the endogenous RNA.

E. coli ＲＮａｓｅ ＩＩはｍＲＮＡおよびｔＲＮＡ両方を３’－＞５’方向に解重合する。ＲＮａｓｅ ＩＩもＲＮａｓｅ ＩＩをコードする遺伝子ｒｎｂも細胞生存能にとって必須ではない。それゆえに、いくつかの態様においては、ｒｎｂが改変ホスト細胞において欠失または変異させられる。他の態様においては、ＲＮａｓｅ ＩＩが内在性ＲＮＡの解重合後に熱不活性化される。 E. coli RNase II depolymerizes both mRNA and tRNA in the 3'-> 5'direction. Neither RNase II nor the gene rnb encoding RNase II is essential for cell viability. Therefore, in some embodiments, the rnb is deleted or mutated in the modified host cell. In another embodiment, RNase II is heat-inactivated after depolymerization of the endogenous RNA.

ｐｎｐもｒｎｂもホスト細胞生存にとって必須ではなく、一方で、同時に両方の破壊は致死的であり得る。それゆえに、いくつかの態様においては、ＰＮＰａｓｅおよびＲＮａｓｅ ＩＩ両方が熱不活性化される。
ヌクレオシド一リン酸からヌクレオシド三リン酸へのリン酸化 Neither pnp nor rnb are essential for host cell survival, while destruction of both can be lethal at the same time. Therefore, in some embodiments, both PNPase and RNase II are heat-inactivated.
Phosphorylation from nucleoside monophosphate to nucleoside triphosphate

内在性ＲＮＡからそのモノマー状形態への変換後に、および内在性ヌクレアーゼおよびホスファターゼの熱不活性化後に、細胞ライセート中のもたらされたヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）はリン酸化された後に、重合させられて、所望の合成ＲＮＡ、例えば二本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ）を形成する。このプロセスは高度にエネルギー依存的であり、それゆえにこのプロセスはエネルギー供給源を要求する。典型的には、リン酸は、例えばホスホエノールピルビン酸、ＡＴＰ、またはポリリン酸などの高エネルギーリン酸供給源から供与される。 After conversion of the endogenous RNA to its monomeric form, and after thermal inactivation of the endogenous nuclease and phosphatase, the resulting nucleoside monophosphate (NMP) in the cellular lysate is phosphorylated and then polymerized. The desired synthetic RNA, such as double-stranded RNA or single-stranded RNA (eg, mRNA or antisense RNA), is formed. This process is highly energy dependent and therefore requires an energy source. Typically, the phosphoric acid is donated from a high energy phosphoric acid source such as phosphoenolpyruvate, ATP, or polyphosphoric acid.

いくつかの態様において、エネルギー供給源は細胞ライセートに直接的に追加されるＡＴＰである。他の態様において、エネルギー供給源はＡＴＰ再生系を用いて提供される。例えば、ポリリン酸およびポリリン酸キナーゼがＡＴＰを生産するために用いられ得る。他の例は、ＡＴＰを生産するためのアセチルリン酸および酢酸キナーゼ；ＡＴＰを生産するためのクレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼ；ならびにＡＴＰを生産するためのホスホエノールピルビン酸およびピルビン酸キナーゼの使用を包含した。他のＡＴＰ（または他のエネルギー）再生系が用いられ得る。いくつかの態様においては、エネルギー供給源の少なくとも１つのコンポーネントが細胞ライセートまたは細胞ライセート混合物に追加される。エネルギー供給源の「コンポーネント」は、エネルギー（例えばＡＴＰ）を生産するために要求される基質（単数または複数）および酵素（単数または複数）を包含する。それらのコンポーネントの限定しない例は、ポリリン酸、ポリリン酸キナーゼ、アセチルリン酸、酢酸キナーゼ、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸、およびピルビン酸キナーゼを包含する。 In some embodiments, the energy source is ATP, which is added directly to the cellular lysate. In another embodiment, the energy source is provided using an ATP regeneration system. For example, polyphosphoric acid and polyphosphate kinase can be used to produce ATP. Other examples include the use of acetyl phosphate and acetate kinase to produce ATP; creatine phosphate and creatine kinase to produce ATP; and phosphoenolpyruvate and pyruvate kinase to produce ATP. did. Other ATP (or other energy) regeneration systems may be used. In some embodiments, at least one component of the energy source is added to the cell lysate or cell lysate mixture. The "component" of an energy source includes the substrate (s) and enzyme (s) required to produce energy (eg, ATP). Non-limiting examples of these components include polyphosphate, polyphosphate kinase, acetylphosphate, acetate kinase, creatine phosphate, creatine kinase, phosphoenolpyruvate, and pyruvate kinase.

キナーゼは、ＡＴＰなどの高エネルギーリン酸供与分子から特異的な基質／分子へのリン酸基の転移を触媒する酵素である。このプロセスはリン酸化と言われ、そこでは基質はリン酸基を獲得し、高エネルギーＡＴＰ分子はリン酸基を供与する。このエステル交換はリン酸化された基質とＡＤＰとを生産する。いくつかの態様において、本開示のキナーゼは、ＮＭＰをＮＤＰに、ＮＤＰをＮＴＰに変換する。 Kinases are enzymes that catalyze the transfer of phosphate groups from high-energy phosphate donor molecules such as ATP to specific substrates / molecules. This process is called phosphorylation, where the substrate acquires a phosphate group and the high-energy ATP molecule donates a phosphate group. This transesterification produces phosphorylated substrate and ADP. In some embodiments, the kinases of the present disclosure convert NMP to NDP and NDP to NTP.

いくつかの態様において、キナーゼはヌクレオシド一リン酸キナーゼであり、これがＡＴＰからＮＭＰへの高エネルギーリン酸の転移を触媒し、ＡＤＰおよびＮＤＰをもたらす。ヌクレオシド一リン酸キナーゼの限定しない例が表４および５に提供されている。下で論じられているように、表４および５に列記されている酵素の耐熱性バリアントは本開示に包含される。いくつかの態様において、細胞ライセートは次の４つのヌクレオシド一リン酸キナーゼの１つ以上（または全て）を含む：耐熱性ウリジル酸キナーゼ、耐熱性シチジル酸キナーゼ、耐熱性グアニル酸キナーゼ、および耐熱性アデニル酸キナーゼ。いくつかの態様において、ＵＭＰキナーゼはPyrococcus furiosusから得られる（例えば、配列番号３、または配列番号３によって同定されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むバリアント）。いくつかの態様において、ＣＭＰキナーゼはThermus thermophilusから得られる（例えば、配列番号４、または配列番号４によって同定されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むバリアント）。いくつかの態様において、ＧＭＰキナーゼはThermotoga maritimaから得られる（例えば、配列番号５、または配列番号５によって同定されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むバリアント）。いくつかの態様において、ＡＭＰキナーゼはThermus thermophilusから得られる（例えば、配列番号６、または配列番号６によって同定されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むバリアント）。 In some embodiments, the kinase is a nucleoside monophosphate kinase, which catalyzes the transfer of high-energy phosphate from ATP to NMP, resulting in ADP and NDP. Non-limiting examples of nucleoside monophosphate kinases are provided in Tables 4 and 5. As discussed below, the thermostable variants of the enzymes listed in Tables 4 and 5 are included in the present disclosure. In some embodiments, the cellular lysate comprises one or more (or all) of the following four nucleoside monophosphate kinases: heat resistant uridine monophosphate kinase, heat resistant cytidine monophosphate kinase, heat resistant guanylic acid kinase, and heat resistant. Adenylate kinase. In some embodiments, the UMP kinase is obtained from Pyrococcus furiosus (eg, SEQ ID NO: 3, or a variant comprising an amino acid sequence that is at least 70% identical to the amino acid sequence identified by SEQ ID NO: 3). In some embodiments, the CMP kinase is obtained from Thermus thermophilus (eg, SEQ ID NO: 4, or a variant comprising an amino acid sequence that is at least 70% identical to the amino acid sequence identified by SEQ ID NO: 4). In some embodiments, the GMP kinase is obtained from Thermotoga maritima (eg, SEQ ID NO: 5, or a variant comprising an amino acid sequence that is at least 70% identical to the amino acid sequence identified by SEQ ID NO: 5). In some embodiments, the AMP kinase is obtained from Thermus thermophilus (eg, SEQ ID NO: 6, or a variant comprising an amino acid sequence that is at least 70% identical to the amino acid sequence identified by SEQ ID NO: 6).

それゆえに、いくつかの態様において、ＮＭＰキナーゼは、配列番号３～６のいずれか１つのアミノ酸配列によって同定されるアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、ＮＭＰキナーゼは、配列番号３～６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する。例えば、ＮＭＰキナーゼは、配列番号３～６のいずれか１つによって同定されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有し得る。 Therefore, in some embodiments, the NMP kinase has an amino acid sequence identified by any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3-6. In some embodiments, the NMP kinase has an amino acid sequence that is at least 70% identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 3-6. For example, NMP kinase is at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97% with the amino acid sequence identified by any one of SEQ ID NOs: 3-6. , Can have an amino acid sequence that is at least 98%, or at least 99% identical.

本開示は、本明細書に記載される酵素および酵素のバリアント（例えば「ＰＰＫ２バリアント」）のいずれか１つ以上の使用を包含するということが理解されるべきである。バリアント酵素は参照酵素に対してある種の程度の配列同一性を共有し得る。用語「同一性」は、２つ以上のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列間の関係性を言い、配列同士を比較することによって決定される。同一性は、２つ以上の配列のより小さいものの間における同一のマッチのパーセントを測定し、ギャップアラインメント（いずれかがある場合）が特定の数理モデルまたはコンピュータプログラム（例えば「アルゴリズム」）によって取り扱われる。近縁分子同士の同一性は公知の方法によって難なく計算され得る。アミノ酸または核酸配列に適用される「パーセント（％）同一性」は、最大のパーセント同一性を達成するように配列同士をアラインメントし、必要な場合にはギャップを導入した後に、第２の配列のアミノ酸配列または核酸配列中の残基と同一である候補アミノ酸または核酸配列中の残基（アミノ酸残基または核酸残基）のパーセンテージとして定められる。同一性はパーセント同一性の計算に依存するが、計算時に導入されるギャップおよびペナルティーが原因で値が異なり得る。特定の配列のバリアントはその特定の参照配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、しかし１００％未満の配列同一性を有し得、本明細書に記載され当業者に公知の配列アラインメントプログラムおよびパラメータによって決定される。 It should be understood that the present disclosure comprises the use of any one or more of the enzymes described herein and variants of the enzymes (eg, "PPK2 variants"). Variant enzymes may share some degree of sequence identity with respect to the reference enzyme. The term "identity" refers to the relationship between sequences of two or more polypeptides or polynucleotides and is determined by comparing the sequences. Identity measures the percentage of identical matches between two or more smaller sequences, and gap alignment (if any) is handled by a particular mathematical model or computer program (eg, "algorithm"). .. The identity between closely related molecules can be easily calculated by known methods. The "% (%) identity" applied to an amino acid or nucleic acid sequence is that of the second sequence after aligning the sequences to achieve maximum percent identity and introducing gaps if necessary. It is defined as the percentage of the residue (amino acid residue or nucleic acid residue) in the candidate amino acid or nucleic acid sequence that is the same as the residue in the amino acid sequence or nucleic acid sequence. Identity depends on the calculation of percent identity, but the values can vary due to gaps and penalties introduced during the calculation. Variants of a particular sequence are at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% with respect to that particular reference sequence. , 98%, 99%, but less than 100% sequence identity, as determined by sequence alignment programs and parameters described herein and known to those of skill in the art.

２つの配列間における配列の比較およびパーセント同一性の決定は、数理アルゴリズムを用いて成し遂げられ得る。同一性を決定するための技術は公に利用可能なコンピュータプログラムにコード化されている。２つの配列間の相同性を決定するための例示的なコンピュータソフトウェアは、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J. et al. Nucleic Acids Research, 12(1): 387, 1984）、ＢＬＡＳＴスイート（Altschul, S. F. et al. Nucleic Acids Res. 25: 3389, 1997）、およびＦＡＳＴＡ（Altschul, S. F. et al. J. Molec. Biol. 215: 403, 1990）を包含するが、これに限定されない。他の技術は：Smith-Watermanアルゴリズム（Smith, T.F. et al. J. Mol. Biol. 147: 195, 1981；Needleman-Wunschアルゴリズム（Needleman, S.B. et al. J. Mol. Biol. 48: 443, 1970；およびFast Optimal Global Sequence Alignmentアルゴリズム（ＦＯＧＳＡＡ）（Chakraborty, A. et al. Sci Rep.3 : 1746, 2013）を包含する。

Figure 0007011599000004
Sequence comparisons and percent identity determinations between two sequences can be accomplished using mathematical algorithms. The techniques for determining identity are coded into publicly available computer programs. Exemplary computer software for determining homology between two sequences is the GCG program package (Devereux, J. et al. Nucleic Acids Research, 12 (1): 387, 1984), BLAST suite (Altschul, SF). Et al. Nucleic Acids Res. 25: 3389, 1997), and FASTA (Altschul, SF et al. J. Molec. Biol. 215: 403, 1990), but not limited to. Other techniques are: Smith-Waterman algorithm (Smith, TF et al. J. Mol. Biol. 147: 195, 1981; Needleman-Wunsch algorithm (Needleman, SB et al. J. Mol. Biol. 48: 443, 1970). ; And includes the Fast Optimal Global Sequence Alignment Algorithm (FOGSAA) (Chakraborty, A. et al. Sci Rep. 3: 1746, 2013).
Figure 0007011599000004

いくつかの態様において、キナーゼはヌクレオシド二リン酸キナーゼであり、これはホスホリル基をＮＤＰに転移させ、ＮＴＰをもたらす。ホスホリル基のドナーは、限定なしに、ＡＴＰ、ポリリン酸ポリマー、またはホスホエノールピルビン酸であり得る。ＮＤＰをＮＴＰに変換するキナーゼの限定しない例は、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびピルビン酸キナーゼを包含する。下で論じられているように、前述の酵素の耐熱性バリアントは本開示に包含される。いくつかの態様において、ＮＤＰキナーゼ（単数または複数）はAquifex aeolicusから得られる（例えば、配列番号９、または配列番号９によって同定されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むバリアント）。いくつかの態様において、ＮＤＰキナーゼは配列番号９によって同定されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する。例えば、ＮＤＰキナーゼは、配列番号９によって同定されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有し得る。 In some embodiments, the kinase is a nucleoside diphosphate kinase, which transfers a phosphoryl group to NDP, resulting in NTP. The donor of the phosphoryl group can be, without limitation, ATP, a polyphosphoric acid polymer, or phosphoenolpyruvate. Non-limiting examples of kinases that convert NDP to NTP include nucleoside diphosphate kinase, polyphosphoric acid kinase, and pyruvate kinase. As discussed below, thermostable variants of the aforementioned enzymes are included in the present disclosure. In some embodiments, the NDP kinase (s) is obtained from Aquifex aeolicus (eg, SEQ ID NO: 9, or a variant comprising an amino acid sequence that is at least 70% identical to the amino acid sequence identified by SEQ ID NO: 9). In some embodiments, the NDP kinase has an amino acid sequence that is at least 70% identical to the amino acid sequence identified by SEQ ID NO: 9. For example, NDP kinase is at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least the amino acid sequence identified by SEQ ID NO: 9. It may have an amino acid sequence that is 99% identical.

いくつかの態様において、ＮＭＰからＮＴＰへのリン酸化はポリリン酸依存性キナーゼ経路によって生じ（図２Ａおよび２Ｂ）、そこでは、高エネルギーリン酸がポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）によってポリリン酸からＡＤＰに転移させられる。いくつかの態様において、ポリリン酸キナーゼはポリリン酸キナーゼ１（ＰＰＫ１）ファミリーに属し、これは高エネルギーリン酸をポリリン酸からＡＤＰに転移させてＡＴＰを形成する。このＡＴＰはその後ＮＭＰキナーゼ（例えば、ＡＭＰキナーゼ、ＵＭＰキナーゼ、ＧＭＰキナーゼ、およびＣＭＰキナーゼ）によって用いられて、ＮＭＰをそれらの対応するリボヌクレオチド二リン酸（ＮＤＰ）に変換する。さらにその上、その後、ＡＴＰはＮＤＰをＮＴＰに変換するためにヌクレオチド二リン酸キナーゼによって用いられる。例えば、例示的な酵素については表５および６参照。 In some embodiments, NMP-to-NTP phosphorylation is caused by the polyphosphate-dependent kinase pathway (FIGS. 2A and 2B), where high-energy phosphate is transferred from polyphosphate to ADP by polyphosphate kinase (PPK). Be made to. In some embodiments, the polyphosphate kinase belongs to the polyphosphate kinase 1 (PPK1) family, which transfers high-energy phosphate from polyphosphate to ADP to form ATP. This ATP is then used by NMP kinases (eg, AMP kinase, UMP kinase, GMP kinase, and CMP kinase) to convert NMP to their corresponding ribonucleotide diphosphate (NDP). Furthermore, ATP is then used by nucleotide diphosphate kinase to convert NDP to NTP. See, for example, Tables 5 and 6 for exemplary enzymes.

いくつかの態様において、ポリリン酸キナーゼはポリリン酸キナーゼ２（ＰＰＫ２）ファミリーに属する。いくつかの態様において、ポリリン酸キナーゼはクラスＩ ＰＰＫ２ファミリーに属し、これは高エネルギーリン酸をポリリン酸からＮＤＰに転移させてＮＴＰを形成する。システムによって生産されたＡＴＰはＮＭＰをＮＤＰに変換するための高エネルギーリン酸ドナーとして用いられる。いくつかの態様において、ポリリン酸キナーゼはクラスＩＩＩ ＰＰＫ２ファミリーに属し、これは高エネルギーリン酸をポリリン酸からＮＭＰおよびＮＤＰに転移させてＮＴＰを形成する。いくつかの態様において、クラスＩＩＩ ＰＰＫ２はＮＭＰからＮＴＰを生産するために単独で用いられる。他の態様において、クラスＩＩＩ ＰＰＫ２は他のキナーゼとの組み合わせで用いられる。クラスＩＩＩ ＰＰＫ２はＡＤＰ、ＡＭＰ、およびポリリン酸からＡＴＰを生産し、これはその後ＮＭＰをＮＴＰに変換するためにＮＭＰおよびＮＤＰキナーゼによって用いられる。 In some embodiments, the polyphosphate kinase belongs to the polyphosphate kinase 2 (PPK2) family. In some embodiments, the polyphosphate kinase belongs to the Class I PPK2 family, which transfers high-energy phosphate from polyphosphate to NDP to form NTP. The ATP produced by the system is used as a high energy phosphate donor to convert NMP to NDP. In some embodiments, the polyphosphate kinase belongs to the Class III PPK2 family, which transfers high-energy phosphate from polyphosphate to NMP and NDP to form NTP. In some embodiments, Class III PPK2 is used alone to produce NTP from NMP. In other embodiments, Class III PPK2 is used in combination with other kinases. Class III PPK2 produces ATP from ADP, AMP, and polyphosphate, which is then used by NMP and NDP kinases to convert NMP to NTP.

本明細書において提供される使用のためのＰＰＫ２酵素の限定しない例が、表６に列記されている（配列番号８～１８）。それゆえに、いくつかの態様において、ＰＰＫ２酵素は耐熱性である。例えば、ＰＰＫ２酵素は耐熱性クラスＩＩＩ ＰＰＫ２酵素であり得、これらはポリリン酸重合よりもＡＴＰ合成を選好し、ＡＤＰおよびＡＭＰ両方をＡＴＰに変換する。いくつかの態様において、ＰＰＫ２酵素は、例えば時間あたり１０から８００ｍＭの範囲である速度（例えば、時間あたり１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、または８００ｍＭ）で、ヘキサメタリン酸などのポリリン酸をＡＴＰに変換するために用いられる。 Non-limiting examples of PPK2 enzymes for use provided herein are listed in Table 6 (SEQ ID NOs: 8-18). Therefore, in some embodiments, the PPK2 enzyme is thermostable. For example, the PPK2 enzyme can be a heat resistant class III PPK2 enzyme, which prefers ATP synthesis over polyphosphoric acid polymerization and converts both ADP and AMP to ATP. In some embodiments, the PPK2 enzyme has a rate ranging from, for example, 10 to 800 mM per hour (eg, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 100, 150, 200, 250, 300, 350, per hour. 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, or 800 mM) used to convert polyphosphoric acids such as hexametaphosphate to ATP.

いくつかの態様において、本開示のＲＮＡ生合成方法は、配列番号８～１８のいずれか１つによって同定されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含むＰＰＫ２酵素を利用する。いくつかの態様において、ＰＰＫ２酵素は配列番号８～１８のいずれか１つによって同定されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、ＰＰＫ２酵素は、配列番号８～１８のいずれか１つによって同定されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。 In some embodiments, the RNA biosynthesis method of the present disclosure utilizes a PPK2 enzyme comprising an amino acid sequence identical to the amino acid sequence identified by any one of SEQ ID NOs: 8-18. In some embodiments, the PPK2 enzyme comprises an amino acid sequence that is at least 70% identical to the amino acid sequence identified by any one of SEQ ID NOs: 8-18. For example, the PPK2 enzyme is at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97% with the amino acid sequence identified by any one of SEQ ID NOs: 8-18. , At least 98%, or at least 99% identical amino acid sequences.

本開示は融合酵素をもまた包含する。融合酵素は複数の活性を発揮し得、それぞれが異なる酵素の活性に対応する。例えば、独立のヌクレオシド一リン酸キナーゼおよび独立のヌクレオシド二リン酸キナーゼを用いるよりもむしろ、ヌクレオシド一リン酸キナーゼ活性およびヌクレオシド二リン酸キナーゼ活性両方を有する融合酵素（またはいずれかの他の酵素）が用いられ得る。

Figure 0007011599000005

Figure 0007011599000006
ヌクレオシド三リン酸からリボ核酸への重合 The present disclosure also includes fusion enzymes. The fusion enzyme can exert multiple activities, each corresponding to a different enzyme activity. For example, a fusion enzyme (or any other enzyme) having both nucleoside monophosphate kinase activity and nucleoside diphosphate kinase activity, rather than using an independent nucleoside monophosphate kinase and an independent nucleoside diphosphate kinase. Can be used.
Figure 0007011599000005
Figure 0007011599000006
Polymerization of nucleoside triphosphate to ribonucleic acid

関心のＲＮＡの生合成の最後のステップはＮＴＰからＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ）最終産物への重合であり、例えばＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いる。プロセスのこのステップにおいては、関心のＲＮＡをコードするように設計されたＤＮＡが関心のＲＮＡの合成のための鋳型としての用をなす。いくつかの場合には、ＤＮＡ鋳型は関心のＲＮＡの転写を選択的に駆動する転写プロモーターを有するように改変され得る。例のＤＮＡ鋳型が図３Ａに示されている。ＤＮＡ鋳型は３つのＲＮＡドメインをコードする：センスドメイン（ドメイン１）、柔軟なヒンジドメイン（ドメイン２）、およびセンスドメインに対して相補的なドメイン（アンチセンスドメイン３）。ＤＮＡ鋳型の転写後に、アンチセンスドメインはセンスドメインに結合して（ハイブリダイゼーションして）、二本鎖ＲＮＡヘアピンステムドメインおよび隣接するヘアピンループドメインを形成する。ＤＮＡ鋳型の他の例が図３Ｂ～３Ｅに示されている。図３ＢのＤＮＡ鋳型は相補鎖同士の上にコンバージェントなプロモーター配列同士を含有する。各鋳型鎖から転写されたＲＮＡ配列同士は転写後にアニーリングする。プラスミドの一部としてコードされた図３ＣのＤＮＡ鋳型は、相補鎖同士の上のコンバージェントなプロモーター配列同士と、リードスルー転写を最小化するための１つ以上のターミネーター配列とを含有する。プラスミドの一部としてコードされた図３ＤのＤＮＡ鋳型は、相補配列同士の転写を駆動する独立のプロモーター－ターミネーターカセットを含有し、これらは転写後にアニーリングする。図３ＥのＤＮＡ鋳型は単一のＲＮＡドメインをコードする。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ両方の使用が二本鎖ＲＮＡ最終産物を生産する。 The final step in the biosynthesis of the RNA of interest is the polymerization of NTP to RNA (eg, dsRNA or ssRNA) end products, using, for example, a DNA-dependent RNA polymerase. In this step of the process, the DNA designed to encode the RNA of interest serves as a template for the synthesis of the RNA of interest. In some cases, the DNA template can be modified to have a transcription promoter that selectively drives the transcription of the RNA of interest. An example DNA template is shown in FIG. 3A. The DNA template encodes three RNA domains: a sense domain (domain 1), a flexible hinge domain (domain 2), and a domain complementary to the sense domain (antisense domain 3). After transcription of the DNA template, the antisense domain binds (hybridizes) to the sense domain to form a double-stranded RNA hairpin stem domain and an adjacent hairpin loop domain. Other examples of DNA templates are shown in FIGS. 3B-3E. The DNA template of FIG. 3B contains convergent promoter sequences on top of complementary strands. RNA sequences transcribed from each template strand are annealed after transcription. The DNA template of FIG. 3C encoded as part of the plasmid contains convergent promoter sequences on complementary strands and one or more terminator sequences to minimize read-through transcription. The DNA template of FIG. 3D encoded as part of the plasmid contains an independent promoter-terminator cassette that drives transcription between complementary sequences, which are annealed after transcription. The DNA template in FIG. 3E encodes a single RNA domain. The use of both DNA-dependent RNA polymerase and RNA-dependent RNA polymerase produces double-stranded RNA end products.

ＲＮＡの重合は、ＮＴＰ、転写プロモーターを含むＤＮＡ鋳型、および転写プロモーターに特異的なポリメラーゼ（ＲＮＡポリメラーゼ）を要求する。典型的には、本明細書において提供される使用のためのポリメラーゼは単一サブユニットポリメラーゼであり、その対応する転写プロモーターに対して高度に選択的であり、高い正確性を有し、高度に効率的である。ポリメラーゼの例は、限定なしに、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを包含する。バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、これは高度にＴ７ファージプロモーターに特異的である。９９ＫＤ酵素はＴ７プロモーターのコントロール下のクローニングされたＤＮＡ配列からのインビトロＲＮＡ合成を触媒する。バクテリオファージＴ３ ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、これは高度にＴ３ファージプロモーターに特異的である。９９ＫＤ酵素はＴ３プロモーター下のクローニングされたＤＮＡ配列からのインビトロＲＮＡ合成を触媒する。バクテリオファージＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、これは高度にＳＰ６ファージプロモーターに特異的である。９８．５ＫＤポリメラーゼはＳＰ６プロモーター下のクローニングされたＤＮＡ鋳型からのインビトロＲＮＡ合成を触媒する。Ｔ７、Ｔ３、およびＳＰ６ポリメラーゼのそれぞれは３７～４０℃で最適活性である。いくつかの態様においては、Ｔ７、Ｔ３、およびＳＰ６ポリメラーゼの耐熱性バリアントが用いられる。耐熱性バリアントポリメラーゼは典型的には４０℃よりも上の温度（または約５０～６０℃）で最適活性である。 RNA polymerization requires NTP, a DNA template containing a transcription promoter, and a polymerase specific for the transcription promoter (RNA polymerase). Typically, the polymerase for use provided herein is a single subunit polymerase, which is highly selective, highly accurate, and highly accurate for its corresponding transcriptional promoter. It is efficient. Examples of polymerases include, without limitation, T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase, and SP6 RNA polymerase. The bacteriophage T7 RNA polymerase is a DNA-dependent RNA polymerase, which is highly specific for the T7 phage promoter. The 99KD enzyme catalyzes in vitro RNA synthesis from the cloned DNA sequence under the control of the T7 promoter. Bacteriophage T3 RNA polymerase is a DNA-dependent RNA polymerase, which is highly specific for the T3 phage promoter. The 99KD enzyme catalyzes in vitro RNA synthesis from the cloned DNA sequence under the T3 promoter. Bacteriophage SP6 RNA polymerase is a DNA-dependent RNA polymerase, which is highly specific for the SP6 phage promoter. The 98.5KD polymerase catalyzes in vitro RNA synthesis from the cloned DNA template under the SP6 promoter. Each of T7, T3, and SP6 polymerase has optimal activity at 37-40 ° C. In some embodiments, thermostable variants of T7, T3, and SP6 polymerases are used. Thermostable variant polymerases are typically optimally active at temperatures above 40 ° C (or about 50-60 ° C).

「ヌクレオシド三リン酸の生産およびヌクレオシド三リン酸の重合をもたらす条件」は、「ＲＮＡの生合成のための条件」ともまた言われる。これは当業者によって決定され得、例えば、ｐＨ、温度、時間の長さ、および細胞ライセートの塩濃度、ならびにいずれかの外来性の補因子を包含するポリメラーゼ活性の最適条件を考慮に入れる。 The "conditions that result in the production of nucleoside triphosphate and the polymerization of nucleoside triphosphate" are also referred to as "conditions for RNA biosynthesis". This can be determined by one of ordinary skill in the art, taking into account, for example, pH, temperature, length of time, and salt concentration of cellular lysates, as well as optimal conditions for polymerase activity, including any exogenous cofactor.

ＲＮＡの生合成の間の細胞ライセートのｐＨは３．０から８．０の値を有し得る。いくつかの態様において、細胞ライセートのｐＨ値は３．０～８．０、４．０～８．０、５．０～８．０、６．０～８．０、７．０～８．０、３．０～７．０、４．０～７．０、５．０～７．０、６．０～７．０、３．０～６．０、４．０～６．０、５．０～６．０、３．０～５．０、３．０～４．０、または４．０～５．０である。いくつかの態様において、細胞ライセートのｐＨ値は３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、または８．０である。いくつかの態様において、ＲＮＡの生合成の間の細胞ライセートのｐＨ値は７．０である。 The pH of the cell lysate during RNA biosynthesis can have a value of 3.0 to 8.0. In some embodiments, the pH values of the cell lysates are 3.0-8.0, 4.0-8.0, 5.0-8.0, 6.0-8.0, 7.0-8. 0, 3.0-7.0, 4.0-7.0, 5.0-7.0, 6.0-7.0, 3.0-6.0, 4.0-6.0, It is 5.0 to 6.0, 3.0 to 5.0, 3.0 to 4.0, or 4.0 to 5.0. In some embodiments, the pH values of the cell lysates are 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7. 5 or 8.0. In some embodiments, the pH value of the cell lysate during RNA biosynthesis is 7.0.

ＲＮＡの生合成の間の細胞ライセートの温度は１５℃から７０℃であり得る。いくつかの態様において、ＲＮＡの生合成の間の細胞ライセートの温度は１５～６０℃、１５～５０℃、１５～４０℃、１５～３０℃、２５～７０℃、２５～６０℃、２５～５０℃、２５～４０℃、３０～７０℃、３０～６０℃、３０～５０℃、４０～７０℃、４０～６０℃、４０～５０℃、５０～７０℃、または５０～６０℃である。いくつかの態様において、ＲＮＡの生合成の間の細胞ライセートの温度は１５℃、２５℃、３２℃、３７℃、４２℃、４５℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、または７０℃である。いくつかの態様において、ＲＮＡの生合成の間の細胞ライセートの温度は５０℃である。 The temperature of cell lysates during RNA biosynthesis can be between 15 ° C and 70 ° C. In some embodiments, the temperature of the cell lysates during RNA biosynthesis is 15-60 ° C, 15-50 ° C, 15-40 ° C, 15-30 ° C, 25-70 ° C, 25-60 ° C, 25-. 50 ° C, 25-40 ° C, 30-70 ° C, 30-60 ° C, 30-50 ° C, 40-70 ° C, 40-60 ° C, 40-50 ° C, 50-70 ° C, or 50-60 ° C. .. In some embodiments, the temperature of the cell lysates during RNA biosynthesis is 15 ° C, 25 ° C, 32 ° C, 37 ° C, 42 ° C, 45 ° C, 55 ° C, 56 ° C, 57 ° C, 58 ° C, 59 ° C. , 60 ° C, 61 ° C, 62 ° C, 63 ° C, 64 ° C, 65 ° C, 66 ° C, 67 ° C, 68 ° C, 69 ° C, or 70 ° C. In some embodiments, the temperature of the cell lysate during RNA biosynthesis is 50 ° C.

ＲＮＡの生合成の間の細胞ライセートは１５分（ｍｉｎ）から７２時間（ｈｒ）インキュベートされ得る。いくつかの態様において、ＲＮＡの生合成の間の細胞ライセートは３０ｍｉｎ～４８ｈｒインキュベートされる。例えば、ＲＮＡの生合成の間の細胞ライセートは３０ｍｉｎ、４５ｍｉｎ、１ｈｒ、２ｈｒ、３ｈｒ、４ｈｒ、５ｈｒ、６ｈｒ、７ｈｒ、８ｈｒ、９ｈｒ、１０ｈｒ、１１ｈｒ、１２ｈｒ、１８ｈｒ、２４ｈｒ、３０ｈｒ、３６ｈｒ、４２時間、または４８時間インキュベートされ得る。いくつかの態様において、ＲＮＡの生合成の間の細胞ライセートは３時間インキュベートされる。いくつかの態様において、ＲＮＡの生合成の間の細胞ライセートは３７℃の温度で２４時間インキュベートされる。 Cellular lysates during RNA biosynthesis can be incubated for 15 minutes (min) to 72 hours (hr). In some embodiments, cell lysates during RNA biosynthesis are incubated for 30 min-48 hr. For example, cell lysates during RNA biosynthesis are 30 min, 45 min, 1 hr, 2 hr, 3 hr, 4 hr, 5 hr, 6 hr, 7 hr, 8 hr, 9 hr, 10 hr, 11 hr, 12 hr, 18 hr, 24 hr, 30 hr, 36 hr, 42 hours. , Or can be incubated for 48 hours. In some embodiments, cell lysates are incubated for 3 hours during RNA biosynthesis. In some embodiments, the cell lysates during RNA biosynthesis are incubated at a temperature of 37 ° C. for 24 hours.

いくつかの態様において、ＲＮＡの生合成の間の細胞ライセートは７．０のｐＨにおいて５０℃の温度で２～４時間インキュベートされる。 In some embodiments, cell lysates during RNA biosynthesis are incubated at a pH of 7.0 at a temperature of 50 ° C. for 2-4 hours.

いくつかのポリメラーゼ活性は金属イオンの存在を要求し得る。それゆえに、いくつかの態様においては、金属イオンが細胞ライセートに追加される。金属イオンの限定しない例はＭｇ２＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｎｉ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、およびＭｎ２＋を包含する。他の金属イオンが用いられてもよい。いくつかの態様においては、１つよりも多くの金属イオンが用いられ得る。細胞ライセート中の金属イオンの濃度は０．１ｍＭから１００ｍＭ、または１０ｍＭから５０ｍＭであり得る。いくつかの態様において、細胞ライセート中の金属イオンの濃度は０．１、０．２、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、２０．０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、４５．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０、９０．０、または１００．０ｍＭである。 Some polymerase activities may require the presence of metal ions. Therefore, in some embodiments, metal ions are added to the cell lysate. Non-limiting examples of metal ions include Mg2 + , Li + , Na + , K + , Ni2 + , Ca2 + , Cu2 + , and Mn2 + . Other metal ions may be used. In some embodiments, more than one metal ion may be used. The concentration of metal ions in the cell lysate can be 0.1 mM to 100 mM, or 10 mM to 50 mM. In some embodiments, the concentration of metal ions in the cell lysate is 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5. 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10 .0, 20.0, 25.0, 30.0, 35.0, 40.0, 45.0, 50.0, 60.0, 70.0, 80.0, 90.0, or 100. It is 0 mM.

いくつかの態様においては、例えば酵素凝集を防ぐために、塩が細胞ライセートに追加される。例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、またはその組み合わせが細胞ライセートに追加され得る。ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセート中の塩の濃度は５ｍＭから１Ｍであり得る。いくつかの態様において、ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセート中の塩の濃度は５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、７５０ｍＭ、または１Ｍである。
耐熱性酵素 In some embodiments, salts are added to the cellular lysates, for example to prevent enzyme aggregation. For example, sodium chloride, potassium chloride, sodium acetate, potassium acetate, or a combination thereof may be added to the cell lysate. The concentration of salt in the cell lysates during the RNA depolymerization reaction can be 5 mM to 1 M. In some embodiments, the concentration of salt in the cell lysate during the RNA depolymerization reaction is 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 500 mM, 750 mM, or 1 M.
Thermostable enzyme

本開示の無細胞的ＲＮＡ生合成方法の１つの利点は、内在性ＲＮＡを合成二本鎖ＲＮＡに変換するために必要とされる酵素の全てが例えば単一の改変細胞内で発現され得る（ただし、そうである必要はない）ということである。例えば、改変細胞のクローン系集団が所望の細胞密度まで培養され、細胞は溶解され、内在性ＲＮＡからそのモノマー形態への解重合をもたらす条件下において（例えば、３０～３７℃の温度で）インキュベートされ、内在性のヌクレアーゼおよびホスファターゼを不活性化するために十分な温度（例えば４０～９０℃）に付され、ＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ）の重合をもたらす条件下においてインキュベートされる（例えば３０～５０℃）。最終産物の合成ＲＮＡまで進むためには、ＮＭＰからＮＤＰ（例えば、ヌクレオシド一リン酸キナーゼおよび／またはポリリン酸キナーゼ）、ＮＤＰからＮＴＰ（例えば、ヌクレオシド二リン酸キナーゼおよび／またはポリリン酸キナーゼ）、およびＮＴＰからＲＮＡ（例えばポリメラーゼ）への変換に要求される酵素は、内在性ヌクレアーゼ（および／または外来性ヌクレアーゼ）およびホスファターゼの熱不活性化の間の変性を避けるために耐熱性であるべきである。耐熱性は、酵素が比較的高温での変性に堪える品質を言う。例えば、酵素が４２℃の温度で変性（不活性化）される場合には、類似の活性（例えばキナーゼ活性）を有する酵素は、それが４２℃で変性しない場合には「耐熱性」と見なされる。 One advantage of the cell-free RNA biosynthesis method of the present disclosure is that all of the enzymes required to convert endogenous RNA into synthetic double-stranded RNA can be expressed, for example, in a single modified cell ( However, it does not have to be so). For example, a cloned population of modified cells is cultured to the desired cell density, the cells are lysed, and incubated under conditions that result in depolymerization of the endogenous RNA into its monomeric form (eg, at a temperature of 30-37 ° C.). The cells are exposed to a temperature sufficient to inactivate the endogenous nuclease and phosphatase (eg, 40-90 ° C.) and incubated under conditions that result in the polymerization of RNA (eg, dsRNA or ssRNA) (eg, 30). ~ 50 ° C.). To proceed to the final synthetic RNA, NMP to NDP (eg, nucleoside monophosphate kinase and / or polyphosphate kinase), NDP to NTP (eg, nucleoside diphosphate kinase and / or polyphosphate kinase), and Enzymes required for conversion of NTPs to RNA (eg, polymerases) should be heat resistant to avoid denaturation during thermal inactivation of endogenous nucleases (and / or exogenous kinases) and phosphatases. .. Heat resistance refers to the quality at which an enzyme can withstand denaturation at a relatively high temperature. For example, if an enzyme is denatured (inactivated) at a temperature of 42 ° C, an enzyme with similar activity (eg, kinase activity) is considered "thermostable" if it is not denatured at 42 ° C. Is done.

酵素（例えば、キナーゼまたはポリメラーゼ）は、酵素が（ａ）他の自然状態の酵素を変性させる高温への一時的暴露後に活性を保持するか、または（ｂ）自然状態の酵素が低い速度で機能する中間温度から高温への一時的暴露後に高い速度で機能する場合に、耐熱性と見なされる。 Enzymes (eg, kinases or polymerases) either retain their activity after temporary exposure to high temperatures where the enzyme denatures other naturally occurring enzymes, or (b) the naturally occurring enzyme functions at a slower rate. It is considered heat resistant if it functions at a high rate after a temporary exposure from an intermediate temperature to a high temperature.

いくつかの態様において、耐熱性酵素は、さもなければ類似の（非耐熱性の）自然状態の酵素を変性させるであろう比較的高温（例えば、E. coliから得られるキナーゼの４１℃よりも高く、多くのＲＮＡポリメラーゼの３７℃よりも高い）への一時的暴露後に、５０％超の活性を保持する。いくつかの態様において、耐熱性酵素は、さもなければ類似の（非耐熱性の）自然状態の酵素を変性させるであろう比較的高温への一時的暴露後に、５０～１００％の活性を保持する。例えば、耐熱性酵素は、さもなければ類似の（非耐熱性の）自然状態の酵素を変性させるであろう比較的高温への一時的暴露後に、５０～９０％、５０～８５％、５０～８０％、５０～７５％、５０～７０％、５０～６５％、５０～６０％、または５０～５５％の活性を保持し得る。いくつかの態様において、耐熱性酵素は、さもなければ類似の（非耐熱性の）自然状態の酵素を変性させるであろう比較的高温への一時的暴露後に、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の活性を保持する。 In some embodiments, the thermostable enzyme is more than 41 ° C. of a kinase obtained from E. coli at a relatively high temperature that would otherwise denature a similar (non-thermostable) natural enzyme. High and retains> 50% activity after temporary exposure to (higher than 37 ° C. of many RNA polymerases). In some embodiments, the thermostable enzyme retains 50-100% activity after temporary exposure to relatively high temperatures, which would otherwise denature similar (non-thermostable) natural enzymes. do. For example, thermostable enzymes are 50-90%, 50-85%, 50-after temporary exposure to relatively high temperatures that would otherwise denature similar (non-thermostable) natural enzymes. It may retain 80%, 50-75%, 50-70%, 50-65%, 50-60%, or 50-55% activity. In some embodiments, the thermostable enzyme is 25%, 30%, 35% after temporary exposure to a relatively high temperature, which would otherwise denature a similar (non-thermostable) natural enzyme. , 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, or 100%. do.

いくつかの態様において、中間温度から高温（例えば４２～８０℃）への一時的暴露後の耐熱性酵素の活性は、類似の（非耐熱性の）自然状態の酵素の活性を超える（例えば、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％超える）。 In some embodiments, the activity of the thermostable enzyme after temporary exposure from intermediate temperature to high temperature (eg, 42-80 ° C.) exceeds the activity of similar (non-thermostable) natural enzymes (eg,). 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% , Or over 100%).

例えば、耐熱性キナーゼの活性は、キナーゼがリン酸化することができるＮＭＰまたはＮＤＰの量によって測定され得る。それゆえに、いくつかの態様において、耐熱性キナーゼは、３７℃で類似の変換を完了するために要求される同じ量の時間で、比較的高温（例えば４２℃）でＮＭＰの５０％超をＮＤＰに、またはＮＤＰの５０％超をＮＴＰに変換する。いくつかの態様において、耐熱性キナーゼは、３７℃で類似の変換を完了するために要求される同じ量の時間で、比較的高温（例えば４２℃）でＮＭＰの６０％超をＮＤＰに、またはＮＤＰの６０％超をＮＴＰに変換する。いくつかの態様において、耐熱性キナーゼは、３７℃で類似の変換を完了するために要求される同じ量の時間で、比較的高温（例えば４２℃）でＮＭＰの７０％超をＮＤＰに、またはＮＤＰの７０％超をＮＴＰに変換する。いくつかの態様において、耐熱性キナーゼは、３７℃で類似の変換を完了するために要求される同じ量の時間で、比較的高温（例えば４２℃）でＮＭＰの８０％超をＮＤＰに、またはＮＤＰの８０％超をＮＴＰに変換する。いくつかの態様において、耐熱性キナーゼは、３７℃で類似の変換を完了するために要求される同じ量の時間で、比較的高温（例えば４２℃）でＮＭＰの９０％超をＮＤＰに、またはＮＤＰの９０％超をＮＴＰに変換する。 For example, the activity of a thermostable kinase can be measured by the amount of NMP or NDP that the kinase can phosphorylate. Therefore, in some embodiments, the thermostable kinase NDPs more than 50% of NMP at relatively high temperatures (eg 42 ° C.) for the same amount of time required to complete a similar conversion at 37 ° C. Or convert more than 50% of NDP to NTP. In some embodiments, thermostable kinases add more than 60% of NMP to NDP, or at relatively high temperatures (eg, 42 ° C.), for the same amount of time required to complete a similar conversion at 37 ° C. Converts over 60% of NDP to NTP. In some embodiments, thermostable kinases add more than 70% of NMP to NDP, or at relatively high temperatures (eg, 42 ° C.), for the same amount of time required to complete a similar conversion at 37 ° C. Converts over 70% of NDP to NTP. In some embodiments, thermostable kinases add more than 80% of NMP to NDP, or at relatively high temperatures (eg, 42 ° C.), for the same amount of time required to complete a similar conversion at 37 ° C. Converts over 80% of NDP to NTP. In some embodiments, thermostable kinases transfer more than 90% of NMP to NDP, or at relatively high temperatures (eg, 42 ° C.), for the same amount of time required to complete a similar conversion at 37 ° C. Converts over 90% of NDP to NTP.

例えば、耐熱性ポリメラーゼの活性は正確性および重合キネティクス（例えば、重合の速度）に基づいて算定される。それゆえに、例えば、耐熱性Ｔ７ポリメラーゼの１単位は、３７℃よりも上の温度で（例えば５０℃で）３０分間に１０ｎモルのＮＴＰを酸不溶性の材料に組み込み得る。 For example, the activity of a thermostable polymerase is calculated based on accuracy and polymerization kinetics (eg, rate of polymerization). Thus, for example, one unit of thermostable T7 polymerase can incorporate 10 n mols of NTP into an acid-insoluble material for 30 minutes at temperatures above 37 ° C (eg at 50 ° C).

耐熱性酵素（例えば、キナーゼまたはポリメラーゼ）は４２℃から８０℃の、またはより高い温度で活性なままであり得る（反応を触媒することができる）。いくつかの態様において、耐熱性酵素は、４２～８０℃、４２～７０℃、４２～６０℃、４２～５０℃、５０～８０℃、５０～７０℃、５０～６０℃、６０～８０℃、６０～７０℃、または７０～８０℃の温度で活性なままである。例えば、耐熱性酵素は、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、または８０℃の温度で活性なままであり得る。耐熱性酵素は比較的高温で１５分間から４８時間、またはより長く活性なままであり得る。例えば、耐熱性酵素は比較的高温で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２４、３６、４２、または４８時間活性なままであり得る。 Thermostable enzymes (eg, kinases or polymerases) can remain active at temperatures between 42 ° C and 80 ° C, or higher (they can catalyze the reaction). In some embodiments, the thermostable enzyme is 42-80 ° C, 42-70 ° C, 42-60 ° C, 42-50 ° C, 50-80 ° C, 50-70 ° C, 50-60 ° C, 60-80 ° C. , 60-70 ° C, or 70-80 ° C remain active. For example, thermostable enzymes are 42 ° C, 43 ° C, 44 ° C, 45 ° C, 46 ° C, 47 ° C, 48 ° C, 49 ° C, 50 ° C, 51 ° C, 52 ° C, 53 ° C, 54 ° C, 55 ° C, 55. ℃, 56 ℃, 57 ℃, 58 ℃, 59 ℃, 60 ℃, 61 ℃, 62 ℃, 63 ℃, 64 ℃, 65 ℃, 66 ℃, 67 ℃, 68 ℃, 69 ℃, 70 ℃, 71 ℃, It can remain active at temperatures of 72 ° C, 73 ° C, 74 ° C, 75 ° C, 76 ° C, 77 ° C, 78 ° C, 79 ° C, or 80 ° C. Thermostable enzymes can remain active at relatively high temperatures for 15 minutes to 48 hours, or longer. For example, thermostable enzymes are relatively hot at 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, It can remain active for 24, 36, 42, or 48 hours.

耐熱性ＮＭＰキナーゼの限定しない例が表５および７に列記されている。他の耐熱性キナーゼは、耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、耐熱性ピルビン酸キナーゼ、および耐熱性ポリリン酸キナーゼを包含する（例えば表６参照）。他の耐熱性キナーゼが本開示に包含される。

Figure 0007011599000007
Non-limiting examples of thermostable NMP kinases are listed in Tables 5 and 7. Other heat-resistant kinases include heat-resistant nucleoside diphosphate kinase, heat-resistant pyruvate kinase, and heat-resistant polyphosphoric acid kinase (see, eg, Table 6). Other thermostable kinases are included in the present disclosure.
Figure 0007011599000007

ＲＮＡポリメラーゼの限定しない例が表８に列記されている。耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを包含する他のＲＮＡポリメラーゼが本開示に包含される。

Figure 0007011599000008
Non-limiting examples of RNA polymerases are listed in Table 8. Other RNA polymerases, including thermostable RNA polymerases, are included in the present disclosure.
Figure 0007011599000008

耐熱性ＲＮＡポリメラーゼは野生型酵素を修飾することによって調製され得る。かかる修飾（例えば変異）は公知である。例えば、バリアント耐熱性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは次の点変異の１つ以上を包含し得る：Ｖ４２６Ｌ、Ａ７０２Ｖ、Ｖ７９５Ｉ、Ｓ４３０Ｐ、Ｆ８４９Ｉ、Ｓ６３３Ｉ、Ｆ８８０Ｙ、Ｃ５１０Ｒ、およびＳ７６７Ｇ（ＥＰ２３７７９２８およびＥＰ１２６１６９６Ａ１。そのそれぞれは参照によって本明細書に組み込まれる）。いくつかの態様において、バリアント耐熱性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼはＶ４２６Ｌ、Ａ７０２Ｖ、およびＶ７９５Ｉ変異を包含する。いくつかの態様において、バリアント耐熱性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼはＳ４３０Ｐ、Ｆ８４９Ｉ、Ｓ６３３Ｉ、およびＦ８８０Ｙ変異を包含する。いくつかの態様において、バリアント耐熱性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼはＦ８８０Ｙ、Ｓ４３０Ｐ、Ｆ８４９Ｉ、Ｓ６３３Ｉ、Ｃ５１０Ｒ、およびＳ７６７Ｇ変異を包含する。いくつかの態様において、バリアント耐熱性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼはＹ６３９Ｖ、Ｈ７８４Ｇ、Ｅ５９３Ｇ、およびＶ６８５Ａ変異を包含する。いくつかの態様において、バリアント耐熱性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼはＳ４３０Ｐ、Ｎ４３３Ｔ、Ｓ６３３Ｐ、Ｆ８４９Ｉ、およびＦ８８０Ｙ変異を包含する。他のバリアントおよび組換え体耐熱性ポリメラーゼが本開示に包含される。 Thermostable RNA polymerases can be prepared by modifying wild-type enzymes. Such modifications (eg, mutations) are known. For example, the variant thermostable T7 RNA polymerase may include one or more of the following point mutations: V426L, A702V, V795I, S430P, F849I, S633I, F880Y, C510R, and S767G (EP237792 and EP1261696A1, respectively by reference. Incorporated herein). In some embodiments, the variant thermostable T7 RNA polymerase comprises V426L, A702V, and V795I mutations. In some embodiments, the variant thermostable T7 RNA polymerase comprises S430P, F849I, S633I, and F880Y mutations. In some embodiments, the variant thermostable T7 RNA polymerase comprises F880Y, S430P, F849I, S633I, C510R, and S767G mutations. In some embodiments, the variant thermostable T7 RNA polymerase comprises Y639V, H784G, E593G, and V685A mutations. In some embodiments, the variant thermostable T7 RNA polymerase comprises S430P, N433T, S633P, F849I, and F880Y mutations. Other variants and recombinant thermostable polymerases are included in the present disclosure.

いくつかの態様においては、耐熱性Ｔ７ポリメラーゼが関心のＲＮＡを生産するために用いられる。例えば、１～２％総蛋白質の濃度を有する耐熱性Ｔ７ポリメラーゼ（例えば、４０～６０℃の温度でインキュベートされる）が、関心のＲＮＡを２ｇ／Ｌ／ｈｒ超（または例えば２ｇ／Ｌ／ｈｒ～１０ｇ／Ｌ／ｈｒ）の速度で合成するために用いられ得る。別の例として、３～５％総蛋白質の濃度を有する耐熱性Ｔ７ポリメラーゼ（例えば、４０～６０℃の温度でインキュベートされる）が、関心のＲＮＡを１０ｇ／Ｌ／ｈｒ超（または例えば１０ｇ／Ｌ／ｈｒ～２０ｇ／Ｌ／ｈｒ）の速度で合成するために用いられ得る。 In some embodiments, thermostable T7 polymerase is used to produce the RNA of interest. For example, a thermostable T7 polymerase with a concentration of 1-2% total protein (eg, incubated at a temperature of 40-60 ° C.) can produce the RNA of interest above 2 g / L / hr (or eg 2 g / L / hr). It can be used to synthesize at a rate of ~ 10 g / L / hr). As another example, a thermostable T7 polymerase with a concentration of 3-5% total protein (eg, incubated at a temperature of 40-60 ° C.) can add more than 10 g / L / hr (or eg 10 g /) of RNA of interest. It can be used to synthesize at a rate of L / hr to 20 g / L / hr).

本開示の多くの態様は耐熱性ポリメラーゼ／酵素の使用を記載するが、他の酵素／ポリメラーゼが用いられ得るということが理解されるべきである。いくつかの態様において、ポリメラーゼは、例えば耐熱性酵素（単数または複数）の活性のいずれかの低減または喪失を補うために、熱不活性化された細胞ライセートに外来的に追加され得る。
関心のＲＮＡ Although many aspects of the disclosure describe the use of thermostable polymerases / enzymes, it should be understood that other enzymes / polymerases may be used. In some embodiments, the polymerase can be added extraneously to the heat-inactivated cellular lysates, eg, to compensate for the reduction or loss of any of the thermostable enzymes (s).
RNA of interest

本開示の方法は関心のＲＮＡを生合成するために用いられる。ＲＮＡは一本鎖または二本鎖であり得る。いくつかの態様において、ＲＮＡは二本鎖ＲＮＡ干渉分子である。例えば、関心のＲＮＡはｓｉＲＮＡまたはヘアピンＲＮＡ干渉分子であり得る。上で論じられているように、関心のＲＮＡはＤＮＡ鋳型によってコードされ、その例は図３Ａ～３Ｅに示されている。図３Ａの鋳型を用いて生産されるＲＮＡは、センスドメイン（ドメイン１）、柔軟なヒンジドメイン（ドメイン２）、およびセンスドメインに対して相補的なドメイン（アンチセンスドメイン３）を包含する。ＤＮＡ鋳型の転写後に、アンチセンスドメインはセンスドメインに結合して（ハイブリダイゼーションして）、二本鎖ＲＮＡヘアピンステムドメインおよび隣接するヘアピンループ（ヒンジ）ドメインを形成する。 The methods of the present disclosure are used to biosynthesize RNA of interest. RNA can be single-stranded or double-stranded. In some embodiments, RNA is a double-stranded RNA interfering molecule. For example, the RNA of interest can be siRNA or a hairpin RNA interfering molecule. As discussed above, the RNA of interest is encoded by a DNA template, examples of which are shown in FIGS. 3A-3E. RNA produced using the template of FIG. 3A includes a sense domain (domain 1), a flexible hinge domain (domain 2), and a domain complementary to the sense domain (antisense domain 3). After transcription of the DNA template, the antisense domain binds (hybridizes) to the sense domain to form a double-stranded RNA hairpin stem domain and an adjacent hairpin loop (hinge) domain.

二本鎖ヘアピンステムドメインは、２つの相補的な核酸ドメイン同士（例えば、別々のヌクレオチド配列同士）の互いへの結合によって形成される。核酸ドメイン同士は、それらが互いに結合（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ相互作用によって塩基対形成、ハイブリダイゼーション）して二本鎖核酸を形成する場合に「相補的」である。関心のＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型の相補的なドメイン同士は、所望の最終産物に依存して変わり得る。相補的なドメイン同士は、例えば４から１０００ヌクレオチドの、またはより長い長さを有し得る。例えば、相補的なドメイン同士は４から１０、４から２０、４から３０、４から５０、４から６０、４から７０、４から８０、４から９０、４から１００、４から２００、４から３００、４から４００、または４から５００、または４から１０００ヌクレオチドの長さを有し得る。いくつかの態様において、相補的なドメイン同士は１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、相補的なドメイン同士は４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ヌクレオチドの長さを有する。 Double-stranded hairpin stem domains are formed by the binding of two complementary nucleic acid domains (eg, different nucleotide sequences) to each other. Nucleic acid domains are "complementary" when they bind to each other (base pairing, hybridization by Watson-Crick interaction) to form double-stranded nucleic acids. The complementary domains of the DNA template encoding the RNA of interest can vary depending on the desired end product. Complementary domains can have a length of, for example, 4 to 1000 nucleotides, or longer. For example, complementary domains are 4 to 10, 4 to 20, 4 to 30, 4 to 50, 4 to 60, 4 to 70, 4 to 80, 4 to 90, 4 to 100, 4 to 200, and 4 to. It can have a length of 300, 4 to 400, or 4 to 500, or 4 to 1000 nucleotides. In some embodiments, complementary domains have a length of 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, or 25 nucleotides. In some embodiments, complementary domains are 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, It has a length of 75, 80, 85, 90, 95, or 100 nucleotides.

ヘアピンループドメインもまた２つの相補的な核酸ドメイン同士の結合によって形成される。ヘアピンループドメインは２つの相補的なドメイン同士の間の介在配列である。典型的には、ヘアピンループドメインは非特異的であり、それが分子内でまたは別の核酸に結合するように設計されてはいないということを意味する。ヘアピンループドメインは相補的なドメイン同士の結合によってループ様構造を形成して、二本鎖ヘアピンステムドメインを形成する。いくつかの態様において、ヘアピンループドメインは、４から５００ヌクレオチドの長さ、またはより多くを有する。例えば、ヘアピンループドメインは４から１０、４から２０、４から３０、４から５０、４から６０、４から７０、４から８０、４から９０、４から１００、４から２００、４から３００、４から４００、または４から５００ヌクレオチドの長さを有し得る。いくつかの態様において、ヘアピンループドメインは４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ヌクレオチドの長さを有する。 Hairpin loop domains are also formed by binding between two complementary nucleic acid domains. Hairpin loop domains are intervening sequences between two complementary domains. Typically, the hairpin loop domain is non-specific, meaning that it is not designed to bind intramolecularly or to another nucleic acid. Hairpin loop domains form a loop-like structure by binding complementary domains to form a double-stranded hairpin stem domain. In some embodiments, the hairpin loop domain has a length of 4 to 500 nucleotides, or more. For example, hairpin loop domains are 4 to 10, 4 to 20, 4 to 30, 4 to 50, 4 to 60, 4 to 70, 4 to 80, 4 to 90, 4 to 100, 4 to 200, 4 to 300, It can have a length of 4 to 400, or 4 to 500 nucleotides. In some embodiments, the hairpin loop domains are 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, It has a length of 80, 85, 90, 95, or 100 nucleotides.

本開示の「二本鎖ＲＮＡ」は、一本鎖領域（例えば、ループまたはオーバーハング）を含有しない全くの二本鎖分子、ならびに二本鎖領域および一本鎖領域（例えば、ループまたはオーバーハング）を含有する部分的二本鎖分子を包含する。図３Ａの一番下に図示されているｄｓＲＮＡ産物は部分的二本鎖分子と見なされ、一方、図３Ｂの一番下に図示されているｄｓＲＮＡ産物は全くの二本鎖分子と見なされる。 The "double-stranded RNA" of the present disclosure is an entirely double-stranded molecule that does not contain a single-stranded region (eg, loop or overhang), as well as double-stranded and single-stranded regions (eg, loop or overhang). ) Contains a partially double-stranded molecule. The dsRNA product shown at the bottom of FIG. 3A is considered a partially double-stranded molecule, while the dsRNA product shown at the bottom of FIG. 3B is considered a pure double-stranded molecule.

関心の「一本鎖ＲＮＡ」の例は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）およびアンチセンスＲＮＡを包含する。それゆえに、本明細書においてはｍＲＮＡおよび他の一本鎖ＲＮＡ分子を合成する方法が提供される。 Examples of "single-strand RNA" of interest include messenger RNA (mRNA) and antisense RNA. Therefore, a method of synthesizing mRNA and other single-strand RNA molecules is provided herein.

それらの方法は、（ａ）ＲＮＡ、ＲＮＡを解重合する酵素、耐熱性キナーゼ、耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを含む培養改変細胞を溶解し、それによって細胞ライセートを生産することと、（ｂ）ステップ（ａ）において生産された細胞ライセートを、ＲＮＡの解重合をもたらす条件下においてインキュベートし、それによってヌクレオシド一リン酸を含む細胞ライセートを生産することと、（ｃ）ステップ（ｂ）において生産された細胞ライセートを、耐熱性キナーゼおよび耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを不活性化することなしに内在性ヌクレアーゼおよびホスファターゼを不活性化する温度に加熱し、それによって熱不活性化されたヌクレアーゼおよびホスファターゼを含む細胞ライセートを生産することと、（ｄ）（ｃ）において生産された細胞ライセートを、エネルギー供給源と関心のＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有する改変ＤＮＡ鋳型との存在下において、ヌクレオシド三リン酸の生産およびヌクレオシド三リン酸の重合をもたらす条件下においてインキュベートし、それによって関心のｍＲＮＡを含む細胞ライセートを生産することとを含み得る。 These methods include (a) lysing cultured modified cells containing RNA, an enzyme that depolymerizes RNA, a heat-resistant kinase, and a heat-resistant RNA polymerase, thereby producing cell lysates, and (b) step (a). ) Is incubated under conditions that result in RNA depolymerization, thereby producing cell lysates containing nucleoside monophosphate, and (c) cell lysates produced in step (b). Is heated to a temperature that inactivates endogenous nucleases and phosphatases without inactivating heat-resistant kinases and heat-resistant RNA polymerases, thereby producing cellular lysates containing heat-inactivated nucleases and phosphatases. And in the presence of a modified DNA template containing a promoter operably linked to an energy source and a nucleotide sequence encoding the RNA of interest from the cellular lysates produced in (d) (c). It may include incubating under conditions that result in the production of nucleoside triphosphate and the polymerization of nucleoside triphosphate, thereby producing cellular lysates containing the mRNA of interest.

代替的には、かかる方法は、（ａ）内在性の多量体ＲＮＡ、ＲＮＡを解重合する酵素、耐熱性ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）キナーゼ、耐熱性ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、耐熱性ＰＰＫ２キナーゼ、および／またはポリリン酸を含む改変細胞から得られた細胞ライセート同士を組み合わせて、細胞ライセート混合物を生産することと、（ｂ）ステップ（ａ）において生産された細胞ライセート混合物を、ＲＮＡの解重合をもたらす条件下においてインキュベートし、それによってヌクレオシド一リン酸を含む細胞ライセートを生産することと、（ｃ）ステップ（ｂ）において生産された細胞ライセートを、耐熱性キナーゼおよび耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを不活性化することなしにホスファターゼおよびＲＮａｓｅ（ならびにＲＮＡ安定性または重合正確性にとって不利であり得るいずれかの他の活性、例えば自然状態のＲＮＡポリメラーゼ、ＮＭＰレダクターゼ、および／またはヌクレオシダーゼ）を不活性化する温度に加熱し、それによって、熱不活性化されたホスファターゼおよびＲＮａｓｅ（ならびに他の有害な細胞活性）を含む細胞ライセートを生産することと、（ｄ）ステップ（ｃ）において生産された細胞ライセートを、エネルギー供給源と関心のＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有する改変ＤＮＡ鋳型との存在下において、ヌクレオシド三リン酸の生産およびヌクレオシド三リン酸の重合をもたらす条件下においてインキュベートし、それによってｍＲＮＡを含む細胞ライセートを生産することとを含み得る。 Alternatively, such methods include (a) endogenous multimer RNA, RNA depolymerizing enzymes, heat resistant nucleoside monophosphate (NMP) kinase, heat resistant nucleoside diphosphate (NDP) kinase, heat resistance. Combining cell lysates obtained from modified cells containing PPK2 kinase and / or polyphosphate to produce a cellular lysate mixture, and (b) the cellular lysate mixture produced in step (a) of RNA. Incubate under conditions that result in depolymerization, thereby producing cellular lysates containing nucleoside monophosphate, and (c) the cellular lysates produced in step (b), heat-resistant kinase and heat-resistant RNA polymerase. Inactivates phosphatase and RNase (and any other activity that may be detrimental to RNA stability or polymerization accuracy, such as natural RNA polymerase, NMP reductase, and / or nucleosidase) without inactivation. To produce cell phosphate containing heat-inactivated phosphatase and RNA (as well as other harmful cellular activity) by heating to a temperature at which it becomes, and (d) the cells produced in step (c). Lysate results in the production of nucleoside triphosphate and the polymerization of nucleoside triphosphate in the presence of an energy source and a modified DNA template containing a promoter operably linked to the RNA-encoding nucleotide sequence of interest. It may include incubating under conditions thereby producing cellular lysates containing mRNA.

いくつかの態様において、単一の標的ドメインを含有するＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型は例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写され、もたらされたＲＮＡ転写物は例えばファージφ６ ＲｄＲＰなどのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの鋳型としての用をなして、相補的なＲＮＡ分子を合成し、ｄｓＲＮＡを生む。例えば図３Ｂ参照。ファージφ６は二本鎖ＲＮＡウイルスであり、これはPseudomonas属のメンバーに感染する。このファージはＲＮＡ鋳型を用いてＲＮＡを合成する能力があるＲｄＲＰをコードし、ｄｓＲＮＡ分子を生む。φ６ ＲｄＲＰはプライマー分子なしでＲＮＡを重合する能力があり、それゆえにポリメラーゼは鋳型ＲＮＡのみを要求する（Wright, S. et al, 2012. Journal of Virology. Mar;86(5):2837-49; Van Dijk, AA., et al, 2004. J Gen Virol. May;85(Pt 5）。参照によって本明細書に組み込まれる）。他のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）が本開示に包含される。 In some embodiments, the DNA template encoding RNA containing a single target domain is transcribed using a DNA-dependent RNA polymerase such as, for example, T7 RNA polymerase, and the resulting RNA transcript is eg, phage φ6 RdRP. It serves as a template for RNA-dependent RNA polymerases such as, and synthesizes complementary RNA molecules to produce dsRNA. See, for example, FIG. 3B. Phage φ6 is a double-stranded RNA virus that infects members of the genus Pseudomonas. This phage encodes RdRP capable of synthesizing RNA using an RNA template, giving rise to dsRNA molecules. φ6 RdRP is capable of polymerizing RNA without primer molecules, and therefore polymerase requires only template RNA (Wright, S. et al, 2012. Journal of Virology. Mar; 86 (5): 2837-49; Van Dijk, AA., Et al, 2004. J Gen Virol. May; 85 (Pt 5), incorporated herein by reference). Other RNA-dependent RNA polymerases (RdRP) are included in the present disclosure.

いくつかの態様において、改変細胞は関心のＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型を含む。ＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型は改変細胞のゲノムＤＮＡ中にインテグレーションされ得、またはＤＮＡ鋳型はプラスミド上で改変細胞内に導入され得る。他の態様においては、ＤＮＡ鋳型は関心のＲＮＡの生合成の間に（例えば熱不活性化ステップ後に）細胞ライセートに追加される。いくつかの態様において、細胞ライセート中のＤＮＡ鋳型の濃度は０．０５～１μｇ／μｌである。いくつかの態様において、細胞ライセート中のＤＮＡ鋳型の濃度は０．０５μｇ／μｌ、０．１μｇ／μｌ、０．５μｇ／μ１、１．０μｇ／μ１である。 In some embodiments, the modified cell comprises a DNA template encoding the RNA of interest. The DNA template encoding RNA can be integrated into the genomic DNA of the modified cell, or the DNA template can be introduced into the modified cell on a plasmid. In another embodiment, the DNA template is added to the cell lysate during the biosynthesis of the RNA of interest (eg, after the heat inactivation step). In some embodiments, the concentration of the DNA template in the cell lysate is 0.05-1 μg / μl. In some embodiments, the concentrations of the DNA template in the cell lysate are 0.05 μg / μl, 0.1 μg / μl, 0.5 μg / μ1, 1.0 μg / μ1.

上で論じられているように、関心のＲＮＡ最終産物の他の例はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）およびショート／短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（分解に向けて特定のｍＲＮＡを特異的に標的化するように設計された合成ＲＮＡ二重鎖）を包含する。 As discussed above, other examples of RNA end products of interest are messenger RNA (mRNA) and short / short interfering RNA (siRNA), which specifically target specific mRNAs for degradation. Includes synthetic RNA duplexes designed for).

いくつかの態様において、ＲＮＡ最終産物（生合成された関心のＲＮＡ）の濃度は、少なくとも１ｇ／Ｌから５０ｇ／Ｌ細胞ライセートである。例えば、ＲＮＡ最終産物の濃度は１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０ｇ／Ｌ、またはより多くであり得る。 In some embodiments, the concentration of RNA end product (biosynthesized RNA of interest) is at least 1 g / L to 50 g / L cell lysate. For example, the concentration of the RNA end product can be 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, or 50 g / L, or more.

いくつかの態様において、関心のＲＮＡは関心の標的核酸に結合するように設計され、例えば治療、予防、または診断薬として用いられる。
プロテアーゼ標的化 In some embodiments, the RNA of interest is designed to bind to the target nucleic acid of interest and is used, for example, as a therapeutic, prophylactic, or diagnostic agent.
Protease targeting

本開示の改変細胞は、ＲＮＡなどの核酸の生産に負の影響を有し得る細胞の健康に必要な酵素を発現（例えば内在的に発現）し得る。かかる酵素は本明細書においては「標的酵素」と言われる。例えば、改変細胞によって発現される標的酵素は、基質または補因子について、ＲＮＡ生合成経路に供給される前駆体の速度を増大させる酵素と競合し得る。別の例として、改変細胞によって発現された標的酵素は、基質または補因子について、ＲＮＡ生合成経路の鍵となる経路入り口酵素である酵素と競合し得る。まだ別の例として、改変細胞によって発現された標的酵素は、基質または補因子について、ＲＮＡ生合成経路の基質または補因子を供給する酵素と競合し得る。 The modified cells of the present disclosure may express (eg, endogenously) enzymes necessary for cell health that may have a negative effect on the production of nucleic acids such as RNA. Such enzymes are referred to herein as "target enzymes". For example, a target enzyme expressed by a modified cell can compete with an enzyme that increases the rate of precursors fed into the RNA biosynthetic pathway for substrates or cofactors. As another example, the target enzyme expressed by the modified cell can compete with the enzyme, which is the key pathway entry enzyme of the RNA biosynthetic pathway, for the substrate or cofactor. Yet another example, a target enzyme expressed by a modified cell may compete for a substrate or cofactor with an enzyme that supplies the substrate or cofactor for the RNA biosynthetic pathway.

この負の影響を無効化または低減するために、標的酵素はそれらの蛋白質配列中に部位特異的プロテアーゼ認識配列を包含するように修飾され得、その結果、標的酵素はＲＮＡ生産の間の不活性化に向けて「標的化」および切断され得る（例えば、そのそれぞれが参照によって本明細書に組み込まれる２０１２年３月１日公開のＵ．Ｓ．公開Ｎｏ．２０１２／００５２５４７Ａｌ；および２０１５年２月１２日公開の国際公開Ｎｏ．ＷＯ２０１５／０２１０５８Ａ２参照）。 To nullify or reduce this negative effect, target enzymes can be modified to include site-specific protease recognition sequences in their protein sequences, so that the target enzymes are inactive during RNA production. Can be "targeted" and cleaved towards conversion (eg, US Publication No. 2012/0052547Al; published March 1, 2012, each of which is incorporated herein by reference; and February 2015. See International Publication No. WO2015 / 021058A2 released on the 12th).

部位特異的プロテアーゼ認識配列を含有する標的酵素の切断は、対応する部位特異的プロテアーゼとの接触からもたらされる。これは細胞増殖段階の間には（例えば改変細胞が培養されているときには）細胞のペリプラズムに（標的酵素から離れて）隔離されており、ＲＮＡ生産段階の間に（例えば、細胞ライセートを生産するための細胞溶解後に）標的酵素との接触をさせられる。それゆえに、いくつかの態様において、本開示の改変細胞は、（ｉ）ＲＮＡ生産の速度に負に影響しかつ標的酵素の蛋白質配列中に部位特異的プロテアーゼ認識配列を包含する標的酵素をコードする改変核酸と（ｉｉ）標的酵素の部位特異的プロテアーゼ認識配列を切断しかつペリプラズム標的化配列を包含する部位特異的プロテアーゼをコードする改変核酸とを含む。このペリプラズム標的化配列は、細胞が溶解されるまで部位特異的プロテアーゼを細胞のペリプラズム空間に隔離することを担う。ペリプラズム標的化配列の例は下で提供されている。 Cleavage of the target enzyme containing the site-specific protease recognition sequence results from contact with the corresponding site-specific protease. It is sequestered by the periplasm of the cell (eg, when the modified cells are being cultured) during the cell proliferation stage and during the RNA production stage (eg, producing cell lysate). To be contacted with the target enzyme (after cell lysis). Therefore, in some embodiments, the modified cells of the present disclosure encode a target enzyme that (i) negatively affects the rate of RNA production and comprises a site-specific protease recognition sequence in the protein sequence of the target enzyme. Includes a modified nucleic acid and (ii) a modified nucleic acid encoding a site-specific protease that cleaves the site-specific protease recognition sequence of the target enzyme and comprises a periplasmic targeting sequence. This periplasmic targeting sequence is responsible for sequestering site-specific proteases in the cell's periplasmic space until the cell is lysed. Examples of periplasmic targeting sequences are provided below.

本開示に従って用いられ得るプロテアーゼの例は、限定なしに、アラニンカルボキシペプチダーゼ、Armillaria melleaから得られるプロテアーゼ、アスタシン、細菌ロイシルアミノペプチダーゼ、癌由来凝固促進因子、カテプシンＢ、クロストリパイン、細胞質アラニルアミノペプチダーゼ、エラスターゼ、エンドプロテイナーゼＢｒｇ－Ｃ、エンテロキナーゼ、ガストリシン、ゼラチナーゼ、Ｇｌｙ－Ｘカルボキシペプチダーゼ、グリシルエンドペプチダーゼ、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、ヒポデルミンＣ、Ｉｇａ特異的セリンエンドペプチダーゼ、ロイシルアミノペプチダーゼ、ロイシルエンドペプチダーゼ、ｌｙｓＣ、リソソームｐｒｏ－Ｘカルボキシペプチダーゼ、リシルアミノペプチダーゼ、メチオニルアミノペプチダーゼ、ミクソバクター（myxobacter）、ナルディライジン、膵エンドペプチダーゼＥ、ピコルナイン（picornain）２Ｂ、ピコルナイン（picornain）３Ｃ、プロエンドペプチダーゼ、プロリルアミノペプチダーゼ、プロ蛋白質転換酵素Ｉ、プロ蛋白質転換酵素ＩＩ、ラッセルライジン（russellysin）、サッカロペプシン（saccharopepsin）、セメノゲラーゼ、Ｔ－プラスミノーゲン活性化因子、トロンビン、組織カリクレイン、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）から得られるプロテアーゼ、トガビリン、トリプトファニルアミノペプチダーゼ、Ｕ－プラスミノーゲン活性化因子、Ｖ８、ベノムビンＢ、ベノムビンＢＢ、およびＸａａ－Ｐｒｏアミノペプチダーゼを包含する。
ペリプラズム標的化 Examples of proteases that can be used in accordance with the present disclosure are, without limitation, alanine carboxypeptidase, protease obtained from Armillaria mellea, ascin, bacterial leucylaminopeptidase, cancer-derived coagulation-promoting factor, catepsin B, crostrypine, cytoplasmic alanyl. Aminopeptidase, elastase, endoproteinase Brg-C, enterokinase, gastricin, zeratinase, Gly-Xcarboxypeptidase, glycylendopeptidase, hytrinovirus 3C protease, hypodermin C, Iga-specific serine endopeptidase, leucylaminopeptidase, Leucylendopeptidase, lysC, lysosome protease pro-Xcarboxypeptidase, lysylaminopeptidase, methionylaminopeptidase, mixobacter, naldilysin, pancreatic endopeptidase E, picornain 2B, picornain 3C Endopeptidase, Prolylaminopeptidase, Protease Convertase I, Proprotein Convertase II, Russellysin, saccharopepsin, Semenogerase, T-Plasminogen Activator, Trombin, Tissue Calicleine, Tobacco Includes proteases from Etchvirus (TEV), togabilin, tryptophanylaminopeptidase, U-plasminogen activator, V8, venombin B, venombin BB, and Xaa-Pro aminopeptidase.
Periplasm targeting

核酸（例えばＲＮＡ）生合成経路の酵素は、細胞の健康（例えば生存能）に負の影響を有する少なくとも１つの酵素を包含し得る。この負の影響を無効化または低減するために、酵素は転置配列を包含するように修飾され得、その結果、酵素は、それが天然には位置せずかつ酵素が細胞の健康に負に影響しない細胞内または細胞外区画に転置される（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる２０１１年１１月１０日公開の公開Ｎｏ．ＵＳ－２０１１－０２７５１１６－Ａ１参照）。例えば、生合成経路の酵素は細胞のペリプラズム空間に転置され得る。 Enzymes in the nucleic acid (eg, RNA) biosynthetic pathway may include at least one enzyme that has a negative effect on cell health (eg, viability). To negate or reduce this negative effect, the enzyme can be modified to include the translocated sequence so that the enzyme is not located naturally and the enzyme negatively affects the health of the cell. Not translocated into the intracellular or extracellular compartment (see, eg, Publication No. US-2011-0275116-A1 published November 10, 2011, incorporated herein by reference). For example, enzymes in the biosynthetic pathway can be transposed into the periplasmic space of cells.

それゆえに、いくつかの態様において、本開示の改変細胞はペリプラズム標的化配列に連結された核酸（例えばＲＮＡ）生合成経路の少なくとも１つの酵素を含む。「ペリプラズム標的化配列」は、それが連結されている蛋白質を細胞のペリプラズムに標的化するアミノ酸配列である。ペリプラズム標的化配列に連結されている蛋白質は、蛋白質が発現される細胞のペリプラズムに隔離されるであろう。 Therefore, in some embodiments, the modified cells of the present disclosure comprise at least one enzyme of a nucleic acid (eg, RNA) biosynthetic pathway linked to a periplasmic targeting sequence. A "periplasmic targeting sequence" is an amino acid sequence that targets the protein to which it is linked to the cell's periplasm. The protein linked to the periplasmic targeting sequence will be sequestered by the periplasm of the cell in which the protein is expressed.

例えば、ペリプラズム標的化配列は細菌分泌蛋白質のＮ末端に由来し得る。配列は長さが約１５から約７０アミノ酸まで変わる。ペリプラズム標的化配列の一次アミノ酸配列は変わるが、一般的には次のコンポーネントを包含する共通の構造を有する：（ｉ）Ｎ末端部は可変的な長さを有し、一般的に正味の正電荷を持ち；（ｉｉ）約６から約１５アミノ酸の疎水性の中心コアが後続し；（ｉｉｉ）最後のコンポーネントはシグナルペプチダーゼの切断部位を定める４から６アミノ酸を包含する。 For example, the periplasmic targeting sequence can be derived from the N-terminus of the bacterial secretory protein. The sequence varies in length from about 15 to about 70 amino acids. The primary amino acid sequence of the periplasmic targeting sequence varies, but generally has a common structure that includes the following components: (i) The N-terminus has a variable length and is generally net net. It has a charge; (ii) is followed by a hydrophobic central core of about 6 to about 15 amino acids; (iii) the last component contains 4 to 6 amino acids that define the cleavage site of the signal peptidase.

いくつかの態様において、本開示のペリプラズム標的化配列はグラム陰性細菌によって分泌される蛋白質に由来し得る。分泌蛋白質は、細菌によってまたは細菌に感染するバクテリオファージによってコードされ得る。分泌蛋白質のグラム陰性細菌供給源の例は、限定なしに、Escherichia、Pseudomonas、Klebsiella、Salmonella、Caulobacter、Methylomonas、Acetobacter、Achromobacter、Acinetobacter、Aeromonas、Agrobacterium、Alcaligenes、Azotobacter、Burkholderia、Citrobacter、Comamonas、Enterobacter、Erwinia、Rhizobium、Vibrio、およびXanthomonas属のメンバーを包含する。 In some embodiments, the periplasmic targeting sequences of the present disclosure may be derived from proteins secreted by Gram-negative bacteria. The secreted protein can be encoded by a bacterium or by a bacteriophage that infects the bacterium. Examples of Gram-negative bacterial sources of secreted protein are, without limitation, Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, Salmonella, Caulobacter, Methylomonas, Acetobacter, Achromobacter, Acinetobacter, Aeromonas, Agrobacterium, Alcaligenes, Azotobacter, Burkholderia, Citrobacter, Comamonas, Enterobacter. Includes members of the genus Erwinia, Rhizobium, Vibrio, and Xanthomonas.

本開示に従う使用のためのペリプラズム標的化配列の例は、限定なしに：
ＭＫＩＫＴＧＡＲＩＬＡＬＳＡＬＴＴＭＭＦＳＡＳＡＬＡ（配列番号１９）；
ＭＫＱＳＴＩＡＬＡＬＬＰＬＬＦＴＰＶＴＫＡ（配列番号２０）；
ＭＭＩＴＬＲＫＬＰＬＡＶＡＶＡＡＧＶＭＳＡＱＡＭＡ（配列番号２１）；
ＭＮＫＫＶＬＴＬＳＡＶＭＡＳＭＬＦＧＡＡＡＨＡ（配列番号２２）；
ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ（配列番号２３）；
ＭＫＫＩＷＬＡＬＡＧＬＶＬＡＦＳＡＳＡ（配列番号２４）；
ＭＭＴＫＩＫＬＬＭＬＩＩＦＹＬＩＩＳＡＳＡＨＡ（配列番号２５）；
ＭＫＱＡＬＲＶＡＦＧＦＬＩＬＷＡＳＶＬＨＡ（配列番号２６）；
ＭＲＶＬＬＦＬＬＬＳＬＦＭＬＰＡＦＳ（配列番号２７）；および
ＭＡＮＮＤＬＦＱＡＳＲＲＲＦＬＡＱＬＧＧＬＴＶＡＧＭＬＧＰＳＬＬＴＰＲＲＡＴＡ（配列番号２８）、
からなる群から選択される配列を包含する。
改変細胞 Examples of periplasmic targeting sequences for use in accordance with the present disclosure are, without limitation:
MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA (SEQ ID NO: 19);
MKQSTIALALLPLLFTPVTKA (SEQ ID NO: 20);
MMITLRKLPLAVAVAAGVMSAQAMA (SEQ ID NO: 21);
MNKKVLTLSAVMASMLFGAAAHA (SEQ ID NO: 22);
MKYLLPTAAAGLLLAAQPAMA (SEQ ID NO: 23);
MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEQ ID NO: 24);
MMTKIKLMLIIFYLIISASAHA (SEQ ID NO: 25);
MKQUALRVAFGFLILWASVLHA (SEQ ID NO: 26);
MRVLFLLLSLFMLPAFS (SEQ ID NO: 27); and MANNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATA (SEQ ID NO: 28),
Includes sequences selected from the group consisting of.
Modified cells

典型的には、本開示の改変細胞は、ＲＮＡを生合成するために要求される酵素活性の少なくとも１つ、大多数、または全てを含む。「改変細胞」は、少なくとも１つの改変（例えば、組換え体または合成）核酸を含むか、またはそれらの天然に生ずるカウンターパートとは構造的および／もしくは機能的に別物であるように別様に修飾されている細胞である。それゆえに、改変核酸を含有する細胞は「改変細胞」と見なされる。 Typically, the modified cells of the present disclosure contain at least one, the majority, or all of the enzymatic activity required for biosynthesis of RNA. A "modified cell" comprises at least one modified (eg, recombinant or synthetic) nucleic acid, or is otherwise structurally and / or functionally distinct from their naturally occurring counterparts. It is a modified cell. Therefore, cells containing the modified nucleic acid are considered "modified cells".

いくつかの態様において、本開示の改変細胞は、ＲＮＡ、ＲＮＡを解重合する酵素、耐熱性キナーゼ、および／または耐熱性ポリメラーゼを含む。いくつかの態様において、改変細胞は、関心のＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有するＤＮＡ鋳型をさらに含む。 In some embodiments, the modified cells of the present disclosure include RNA, an enzyme that depolymerizes RNA, a thermostable kinase, and / or a thermostable polymerase. In some embodiments, the modified cell further comprises a DNA template containing a promoter operably linked to a nucleotide sequence encoding the RNA of interest.

いくつかの態様において、改変細胞は選択マーカーを発現する。選択マーカーは、細胞のトランスフェクション後に（または外来性の核酸を細胞内に導入するために用いられる他の手続き後に）、改変核酸を取り込み発現した改変細胞を選択するために典型的に用いられる。それゆえに、産物をコードする核酸は選択マーカーをもまたコードし得る。選択マーカーの例は、限定なしに、抗生物質（例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびクロラムフェニコール耐性遺伝子）または他の化合物に対する耐性または感受性どちらかを増大または減少させる蛋白質をコードする遺伝子を包含する。選択マーカーの追加の例は、限定なしに、細胞がさもなければ必須の栄養素が欠乏した培地で増殖することを可能にする蛋白質をコードする遺伝子（栄養要求性マーカー）を包含する。他の選択マーカーが本開示に従って用いられ得る。 In some embodiments, the modified cell expresses a selectable marker. Selectable markers are typically used to select modified cells that have taken up and expressed the modified nucleic acid after transfection of the cell (or after other procedures used to introduce the exogenous nucleic acid into the cell). Therefore, the nucleic acid encoding the product can also encode a selectable marker. Examples of selectable markers are, without limitation, either resistance or susceptibility to antibiotics (eg, ampicillin resistance gene, kanamycin resistance gene, neomycin resistance gene, tetracycline resistance gene, and chloramphenicol resistance gene) or other compounds. Includes genes encoding proteins that increase or decrease. Additional examples of selectable markers include, without limitation, genes encoding proteins (auxotrophic markers) that allow cells to grow in media otherwise deficient in essential nutrients. Other selectable markers may be used according to the present disclosure.

改変細胞は、核酸（例えば改変核酸）によってコードされる産物が細胞内で生産される場合に、産物を「発現する」。遺伝子発現が、核酸の形態の遺伝子命令が用いられて蛋白質（例えば酵素）などの産物を合成するプロセスを言う、ということは当分野において公知である。 A modified cell "expresses" a product encoded by a nucleic acid (eg, a modified nucleic acid) when it is produced intracellularly. It is known in the art that gene expression refers to the process of synthesizing a product such as a protein (eg, an enzyme) using a genetic command in the form of a nucleic acid.

改変細胞は原核細胞または真核細胞であり得る。いくつかの態様において、改変細胞は細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、または細胞の他の型である。 The modified cell can be a prokaryotic cell or a eukaryotic cell. In some embodiments, the modified cell is a bacterial cell, yeast cell, insect cell, mammalian cell, or other type of cell.

本開示の改変細菌細胞は、限定なしに、改変Escherichia spp.、Streptomyces spp.、Zymomonas spp.、Acetobacter spp.、Citrobacter spp.、Synechocystis spp.、Rhizobium spp.、Clostridium spp.、Corynebacterium spp.、Streptococcus spp.、Xanthomonas spp.、Lactobacillus spp.、Lactococcus spp.、Bacillus spp.、Alcaligenes spp.、Pseudomonas spp.、Aeromonas spp.、Azotobacter spp.、Comamonas spp.、Mycobacterium spp.、Rhodococcus spp.、Gluconobacter spp.、Ralstonia spp.、Acidithiobacillus spp.、Microlunatus spp.、Geobacter spp.、Geobacillus spp.、Arthrobacter spp.、Flavobacterium spp.、Serratia spp.、Saccharopolyspora spp.、Thermus spp.、Stenotrophomonas spp.、Chromobacterium spp.、Sinorhizobium spp.、Saccharopolyspora spp.、Agrobacterium spp.、およびPantoea spp.を包含する。 The modified bacterial cells of the present disclosure are, without limitation, modified Escherichia spp., Streptomyces spp., Zymomonas spp., Acetobacter spp., Citrobacter spp., Synechocystis spp., Rhizobium spp., Clostridium spp., Corynebacterium spp., Streptococcus. spp., Xanthomonas spp., Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Bacillus spp., Alcaligenes spp., Pseudomonas spp., Aeromonas spp., Azotobacter spp., Comamonas spp., Mycobacterium spp., Rhodococcus spp. , Ralstonia spp., Acidithiobacillus spp., Microlunatus spp., Geobacter spp., Geobacillus spp., Arthrobacter spp., Flavobacterium spp., Serratia spp., Saccharopolyspora spp., Thermus spp., Stenotrophomonas spp. Includes spp., Saccharopolyspora spp., Agrobacterium spp., And Pantoea spp.

本開示の改変酵母細胞は、限定なしに、改変Saccharomyces spp.、Schizosaccharomyces、Hansenula、Candida、Kluyveromyces、Yarrowia、およびPichiaを包含する。 The modified yeast cells of the present disclosure include, without limitation, modified Saccharomyces spp., Schizosaccharomyces, Hansenula, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia, and Pichia.

いくつかの態様において、本開示の改変細胞は、改変Escherichia coli細胞、Bacillus subtilis細胞、Pseudomonas putida細胞、Saccharomyces cerevisae細胞、またはLactobacillus brevis細胞である。いくつかの態様において、本開示の改変細胞は改変Escherichia coli細胞である。
改変核酸 In some embodiments, the modified cells of the present disclosure are modified Escherichia coli cells, Bacillus subtilis cells, Pseudomonas putida cells, Saccharomyces cerevisae cells, or Lactobacillus brevis cells. In some embodiments, the modified cells of the present disclosure are modified Escherichia coli cells.
Modified nucleic acid

「核酸」は、共有結合的に一緒に連結された少なくとも２つのヌクレオチドであり、いくつかの場合にはホスホジエステル結合（例えばホスホジエステル「バックボーン」）を含有し得る。核酸（例えば、核酸のコンポーネントまたは部分）は天然に生ずるかまたは改変され得る。「天然に生ずる」核酸は、ヒトの介入の非存在下において天然に存在する細胞内に存在する。「改変核酸」は組換え体核酸および合成核酸を包含する。「組換え体核酸」は、（例えば同じ種からのまたは異なる種からの）核酸分子同士を繋ぎ合わせることによって構築される分子を言い、典型的には生細胞内で複製し得る。「合成核酸」は、生物学的に合成、化学的に合成、または他の手段によって合成もしくは増幅される分子を言う。合成核酸は、化学的に修飾または別様に修飾されているが、天然に生ずる核酸分子と塩基対形成し得る核酸を包含する。組換え体および合成核酸は、前述のどちらかの複製からもたらされる分子をもまた包含する。改変核酸は天然に生ずる核酸の部分を含有し得るが、全体としては、改変核酸は天然には生じず、ヒトの介入を要求する。いくつかの態様において、本開示の産物をコードする核酸は組換え体核酸または合成核酸である。他の態様において、産物をコードする核酸は天然に生ずる。 A "nucleic acid" is at least two nucleotides that are covalently linked together and may in some cases contain a phosphodiester bond (eg, a phosphodiester "backbone"). Nucleic acid (eg, a component or portion of nucleic acid) can occur naturally or be modified. "Naturally occurring" nucleic acids are present in naturally occurring cells in the absence of human intervention. "Modified nucleic acid" includes recombinant nucleic acid and synthetic nucleic acid. "Recombinant nucleic acid" refers to a molecule constructed by joining nucleic acid molecules (eg, from the same species or from different species) together and can typically replicate in a living cell. "Synthetic nucleic acid" refers to a molecule that is biologically synthesized, chemically synthesized, or synthesized or amplified by other means. Synthetic nucleic acids include nucleic acids that are chemically modified or otherwise modified but can base pair with naturally occurring nucleic acid molecules. Recombinants and synthetic nucleic acids also include molecules resulting from either of the aforementioned replications. Modified nucleic acids may contain portions of naturally occurring nucleic acids, but overall, modified nucleic acids do not occur naturally and require human intervention. In some embodiments, the nucleic acid encoding the product of the present disclosure is a recombinant nucleic acid or a synthetic nucleic acid. In other embodiments, the nucleic acid encoding the product is naturally occurring.

本明細書において提供されるＲＮＡをコードする改変核酸は、核酸のコントロール領域である「プロモーター」に作動可能に連結され得、そこでは核酸の残りの転写の開始および速度がコントロールされる。プロモーターは、それが制御する核酸の発現を駆動しまたは転写を駆動する。 The modified nucleic acid encoding the RNA provided herein can be operably linked to a "promoter", which is the control region of the nucleic acid, where the initiation and rate of transcription of the rest of the nucleic acid is controlled. A promoter drives the expression or transcription of the nucleic acid it controls.

プロモーターは、遺伝子または配列に天然に結び付けられているものであり得、所与の遺伝子または配列のコードセグメントの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得られ得る。かかるプロモーターは「内在性」と言われ得る。 The promoter can be naturally associated with a gene or sequence and can be obtained by isolating a 5'non-coding sequence located upstream of the coding segment of a given gene or sequence. Such promoters can be referred to as "intrinsic".

いくつかの態様において、コード核酸配列は組換え体または異種プロモーターのコントロール下に配置され得、これは、通常ではその天然環境においてはコードされている配列に結びつけられていないプロモーターを言う。かかるプロモーターは、他の遺伝子のプロモーター；いずれかの他の細胞から単離されたプロモーター；および例えば、異なる転写制御領域の異なるエレメント同士および／または当分野において公知である遺伝子工学の方法によって発現を変改する変異を含有するものなどの、「天然に生じ」ない合成プロモーターまたはエンハンサーを包含し得る。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に生産することに加えて、配列は、組換えクローニングおよび／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を包含する核酸増幅テクノロジーを用いて生産され得る。 In some embodiments, the coding nucleic acid sequence may be placed under the control of a recombinant or heterologous promoter, which refers to a promoter that is not normally associated with the sequence encoded in its natural environment. Such promoters are expressed by promoters of other genes; promoters isolated from any other cell; and, for example, between different elements of different transcriptional regulatory regions and / or by genetic engineering methods known in the art. It may include synthetic promoters or enhancers that are not "naturally occurring", such as those containing altered mutations. In addition to synthetically producing promoter and enhancer nucleic acid sequences, the sequences can be produced using nucleic acid amplification techniques that include recombinant cloning and / or polymerase chain reaction (PCR).

プロモーターは、それが制御する核酸に対して正しい機能的な位置および向きにあって、その核酸の転写開始および／または発現をコントロールする（「駆動する」）ときに、「作動可能に連結」されていると見なされる。 A promoter is "operably linked" when it is in the correct functional position and orientation with respect to the nucleic acid it controls and controls (“drives”) transcription initiation and / or expression of that nucleic acid. Is considered to be.

本開示の改変核酸は恒常的プロモーターまたは誘導型プロモーターを含有し得る。「恒常的プロモーター」は細胞内において常に活性であるプロモーターを言う。「誘導型プロモーター」は、誘導因子もしくは誘導剤の存在下にあるか、それによって影響されるか、もしくはそれと接触するか、または抑圧を引き起こす因子の非存在下において活性化されるときに、転写活性を開始または増強するプロモーターを言う。本開示に従う使用のための誘導型プロモーターは、本明細書に記載されるかまたは当業者に公知のいずれかの誘導型プロモーターを包含する。誘導型プロモーターの例は、限定なしに、化学的／生化学的に制御および物理的に制御されるプロモーター、例えばアルコールによって制御されるプロモーター、テトラサイクリンによって制御されるプロモーター、ステロイドによって制御されるプロモーター、金属によって制御されるプロモーター、発病機構によって制御されるプロモーター、温度／熱誘導型、リン酸によって制御される（例えばＰｈｏＡ）、および光によって制御されるプロモーターを包含する。 The modified nucleic acids of the present disclosure may contain a constitutive promoter or an inducible promoter. A "constant promoter" is a promoter that is always active in a cell. An "inducible promoter" is transcribed when it is activated in the presence of, influenced by, or in contact with an inducer or inducer, or in the absence of a factor that causes repression. A promoter that initiates or enhances activity. Inducible promoters for use in accordance with the present disclosure include any inducible promoter described herein or known to those of skill in the art. Examples of inducible promoters are, without limitation, chemically / biochemically controlled and physically controlled promoters such as alcohol-controlled promoters, tetracycline-controlled promoters, steroid-controlled promoters, etc. Includes metal-controlled promoters, pathogenic mechanisms-controlled promoters, temperature / heat-induced, phosphoric acid-controlled (eg, PhoA), and light-controlled promoters.

誘導因子または誘導剤は、内在的もしくは通常では外来的な条件（例えば光）、化合物（例えば、化学もしくは非化学化合物）、または誘導型プロモーターからの転写活性を制御する点で活性であるようなやり方で誘導型プロモーターに接触する蛋白質であり得る。それゆえに、核酸の「転写を制御するシグナル」は誘導型プロモーターに作用する誘導因子シグナルを言う。転写を制御するシグナルは、用いられる制御システムに依存して転写を活性化または不活性化し得る。転写の活性化には、プロモーターに直接的に作用して転写を駆動すること、またはプロモーターが転写を駆動することを防ぐリプレッサーを不活性化することによってプロモーターに間接的に作用することが関わり得る。反対に、転写の脱活性化には、プロモーターに直接的に作用して転写を防ぐこと、またはリプレッサーを活性化し、これがそれからプロモーターに作用することによってプロモーターに間接的に作用することが関わり得る。 Inducing factors or agents appear to be active in controlling transcriptional activity from endogenous or normally exogenous conditions (eg, light), compounds (eg, chemical or non-chemical compounds), or inducible promoters. It can be a protein that contacts the inducible promoter in a manner. Therefore, a nucleic acid "signal that controls transcription" refers to an inducing factor signal that acts on an inducible promoter. The signals that control transcription can activate or inactivate transcription depending on the control system used. Transcription activation involves acting directly on the promoter to drive transcription, or indirectly acting on the promoter by inactivating a repressor that prevents the promoter from driving transcription. obtain. Conversely, transcriptional deactivation can involve acting directly on the promoter to prevent transcription, or activating the repressor, which in turn acts indirectly on the promoter by acting on the promoter. ..

改変核酸は当分野において公知のいずれかの手段を用いてホスト細胞内に導入され得、限定なしに、形質転換、トランスフェクション（例えば、化学的（例えば、リン酸カルシウム、カチオン性ポリマー、もしくはリポソーム）または非化学的（例えば、エレクトロポレーション、ソノポレーション、インペイルフェクション（impalefection）、光学的トランスフェクション、流体力学的トランスフェクション））、および形質導入（例えば、ウイルス系形質導入）を包含する。 The modified nucleic acid can be introduced into the host cell using any means known in the art and can be transformed, transfected (eg, chemically (eg, calcium phosphate, cationic polymer, or liposome)) or without limitation. Includes non-chemical (eg, electroporation, sonoporation, impalefection, optical transfection, hydrodynamic transduction), and transduction (eg, viral transduction).

天然に生ずる細胞内核酸によってコードされる酵素または他の蛋白質は「内在性酵素」または「内在性蛋白質」と言われ得る。
細胞培養物および細胞ライセート Enzymes or other proteins encoded by naturally occurring intracellular nucleic acids can be referred to as "endogenous enzymes" or "endogenous proteins."
Cell cultures and cell lysates

典型的には、改変細胞は培養される。「培養する」は、細胞がコントロールされた条件下において、典型的にはそれらの天然環境の外において増殖させられるプロセスを言う。例えば、改変細菌細胞などの改変細胞は、液体「培養培地」ともまた言われる液体栄養素ブロス中において細胞懸濁液として増殖させられ得る。 Typically, the modified cells are cultured. "Culturing" refers to the process by which cells are allowed to grow under controlled conditions, typically outside their natural environment. For example, modified cells, such as modified bacterial cells, can be grown as cell suspensions in liquid nutrient broth, also referred to as liquid "culture medium."

普通に用いられる細菌Escherichia coli増殖培地の例は、限定なしに、ＬＢ（溶原ブロス）Ｍｉｌｌｅｒブロス（１％ＮａＣｌ）：１％ペプトン、０．５％酵母エキス、および１％ＮａＣｌ；ＬＢ（溶原ブロス）Ｌｅｎｎｏｘブロス（０．５％ＮａＣｌ）：１％ペプトン、０．５％酵母エキス、および０．５％ＮａＣｌ；ＳＯＢ培地（スーパーオプティマルブロス）：２％ペプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣ１、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４；ＳＯＣ培地（異化抑制因子を有するスーパーオプティマルブロス）：ＳＯＢ＋２０ｍＭグルコース；２×ＹＴブロス（２×酵母エキスおよびトリプトン）：１．６％ペプトン、１％酵母エキス、および０．５％ＮａＣｌ；ＴＢ（テリフィックブロス）培地：１．２％ペプトン、２．４％酵母エキス、７２ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、１７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、および０．４％グリセロール；ならびにＳＢ（スーパーブロス）培地：３．２％ペプトン、２％酵母エキス、および０．５％ＮａＣｌ、ならびに／またはＫｏｒｚ培地（Korz, DJ et al. 1995）を包含する。 Examples of commonly used bacterial Escherichia coli growth media are, without limitation, LB (solubilized broth) Miller broth (1% NaCl): 1% peptone, 0.5% yeast extract, and 1% NaCl; LB (dissolved). Raw broth) Lennox broth (0.5% NaCl): 1% peptone, 0.5% yeast extract, and 0.5% NaCl; SOB medium (superoptimal broth): 2% peptone, 0.5% yeast extract 10 mM NaCl, 2.5 mM KC1, 10 mM MgCl 2 , 10 mM ו 4 ; SOC medium (superoptimal broth with anti-catabolic factors): SOB + 20 mM glucose; 2 x YT broth (2 x yeast extract and trypton): 1.6 % Peptone, 1% Yeast Extract, and 0.5% NaCl; TB (Terific Bros) Medium: 1.2% Peptone, 2.4% Yeast Extract, 72 mM K 2 HPO 4 , 17 mM KH 2 PO 4 , and 0. .4% glycerol; and SB (super broth) medium: 3.2% peptone, 2% yeast extract, and 0.5% NaCl, and / or Korz medium (Korz, DJ et al. 1995).

高密度の細菌Escherichia coli増殖培地の例は、ＤＮＡＧｒｏ（商標）培地、ＰｒｏＧｒｏ（商標）培地、ＡｕｔｏＸ（商標）培地、ＤｅｔｏＸ（商標）培地、ＩｎｄｕＸ（商標）培地、およびＳｅｃＰｒｏ（商標）培地を包含するが、これに限定されない。 Examples of high density bacterial Escherichia coli growth medium include DNAGro ™ medium, ProGro ™ medium, AutoX ™ medium, DetoX ™ medium, InduX ™ medium, and SecPro ™ medium. However, it is not limited to this.

いくつかの態様において、改変細胞は酵素または核酸の発現をもたらす条件下において培養される。かかる培養条件は発現されようとする特定の産物と産物の所望の量とに依存し得る。 In some embodiments, the modified cells are cultured under conditions that result in expression of the enzyme or nucleic acid. Such culture conditions may depend on the particular product to be expressed and the desired amount of product.

いくつかの態様において、改変細胞は３０℃から４０℃の温度で培養される。例えば、改変細胞は３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、または４０℃の温度で培養され得る。典型的には、改変細胞、例えば改変E. coli細胞は３７℃の温度で培養される。 In some embodiments, the modified cells are cultured at a temperature of 30 ° C to 40 ° C. For example, the modified cells can be cultured at temperatures of 30 ° C., 31 ° C., 32 ° C., 33 ° C., 34 ° C., 35 ° C., 36 ° C., 37 ° C., 38 ° C., 39 ° C., or 40 ° C. Typically, modified cells, such as modified E. coli cells, are cultured at a temperature of 37 ° C.

いくつかの態様において、改変細胞は、１２時間から７２時間の、またはより多くの時期培養される。例えば、改変細胞は、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、または７２時間の時期培養され得る。典型的には、改変細菌細胞などの改変細胞は１２から２４時間の時期培養される。いくつかの態様において、改変細胞は３７℃の温度で１２から２４時間培養される。 In some embodiments, the modified cells are cultured for 12 to 72 hours, or more. For example, modified cells can be cultured for 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, or 72 hours. Typically, modified cells, such as modified bacterial cells, are cultured for 12 to 24 hours. In some embodiments, the modified cells are cultured at a temperature of 37 ° C. for 12 to 24 hours.

いくつかの態様において、改変細胞は（例えば、液体細胞培養培地中において）５から２００の６００ｎｍの波長で測定される光学密度（ＯＤ６００）まで培養される。いくつかの態様において、改変細胞は５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、または２００のＯＤ６００まで培養される。 In some embodiments, the modified cells are cultured (eg, in liquid cell culture medium) to an optical density (OD600) as measured at a wavelength of 5 to 200 at 600 nm. In some embodiments, the modified cells are cultured to 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, or 200 OD600.

いくつかの態様において、改変細胞は、１×１０８（ＯＤ＜１）から２×１０１１（ＯＤ～２００）生存可能細胞／ｍｌ細胞培養培地の密度で培養される。いくつかの態様において、改変細胞は１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、または２×１０１１生存可能細胞／ｍｌの密度まで培養される（変換係数：ＯＤ１＝８×１０８細胞／ｍｌ）。 In some embodiments, the modified cells are cultured at a density of 1 × 10 8 (OD <1) to 2 × 10 11 (OD-200) viable cell / ml cell culture medium. In some embodiments, the modified cells are 1 × 10 8 , 2 × 10 8 , 3 × 10 8 , 4 × 10 8 , 5 × 10 8 , 6 × 10 8 , 7 × 10 8 , 8 × 10 8 , 9. × 10 8 , 1 × 10 9 , 2 × 10 9 , 3 × 10 9 , 4 × 10 9 , 5 × 10 9 , 6 × 10 9 , 7 × 10 9 , 8 × 10 9 , 9 × 10 9 , 1 × 10 10 , 2 × 10 10 , 3 × 10 10 , 4 × 10 10 , 5 × 10 10 , 6 × 10 10 , 7 × 10 10 , 8 × 10 10 , 9 × 10 10 , 1 × 10 11 or Incubate to a density of 2 × 10 11 viable cells / ml (conversion factor: OD1 = 8 × 10 8 cells / ml).

いくつかの態様において、改変細胞はバイオリアクター内で培養される。バイオリアクターは単純に細胞が培養される容器、例えば培養フラスコ、ディッシュ、またはバッグを言い、これらは単回使用（使い捨て）、オートクレーブ可能、または滅菌可能であり得る。バイオリアクターはガラスから作られ得、またはこれはポリマーに基づき得、またはこれは他の材料から作られ得る。 In some embodiments, the modified cells are cultured in a bioreactor. A bioreactor simply refers to a container in which cells are cultured, such as a culture flask, dish, or bag, which can be single-use (disposable), autoclaved, or sterile. The bioreactor can be made from glass, or it can be based on a polymer, or it can be made from other materials.

バイオリアクターの例は、限定なしに、撹拌槽（例えば完全混合）バイオリアクターおよび管型（例えば押し出し流れ）バイオリアクター、エアリフトバイオリアクター、膜撹拌槽、スピンフィルター撹拌槽、バイブロミキサー、流動床反応器、ならびに膜バイオリアクターを包含する。バイオリアクターを作動させるモードはバッチまたは連続プロセスであり得、培養されようとする改変細胞に依存するであろう。バイオリアクターは、フィードおよび製品流が連続的にフィードされ、システムから取り出されるときに、連続的である。バッチ式バイオリアクターは連続的な再循環流れを有し得るが、栄養素の連続的なフィードまたは産物収穫はない。断続的収穫およびフェドバッチ（fed-batch）（またはバッチフェド（batch fed））培養では、細胞は、組成がバッチ培地に類似である培地に、より低い生存可能細胞密度で接種される。細胞は、栄養素がやや枯渇し細胞が定常増殖段階に近づくまで、本質的に外的操作なしに指数増殖することを許される。この時点において、断続的収穫バッチフェド（batch fed）プロセスでは、細胞および産物の部分が収穫され得、除去された培養培地が新しい培地によって補充される。このプロセスは数回繰り返され得る。組換え体蛋白質および抗体の生産のためには、フェドバッチプロセスが用いられ得る。細胞が指数増殖していくが栄養素が枯渇してくる一方で、濃縮されたフィード培地（例えば、１０～１５倍濃縮された基礎培地）が連続的または断続的にどちらかで追加されて、追加の栄養素を供給し、細胞濃度と生産段階の長さとのさらなる増大を許す。新しい培地が、培養培地（ブロス）の除去なしに細胞濃度に比例して追加され得る。培地の追加を収容するように、フェドバッチ培養はバイオリアクターの満容量よりも大分低い体積（例えば、最大の体積のおよそ４０％から５０％）で始められる。 Examples of bioreactors are, without limitation, stirring tanks (eg, complete mixing) bioreactors and tubular (eg, extruded flow) bioreactors, airlift bioreactors, membrane stirring tanks, spin filter stirring tanks, vibro mixers, fluidized bed reactors. , As well as membrane bioreactors. The mode in which the bioreactor is activated can be batch or continuous process and will depend on the modified cells to be cultured. The bioreactor is continuous when the feed and product stream are continuously fed and removed from the system. Batch bioreactors can have a continuous recirculation flow, but no continuous feed of nutrients or product harvest. In intermittent harvesting and fed-batch (or batch fed) cultures, cells are inoculated into medium having a composition similar to batch medium at a lower viable cell density. Cells are allowed to exponentially proliferate essentially without external manipulation until the cells are slightly depleted of nutrients and approach the steady growth stage. At this point, in the intermittent harvest batch fed process, cell and product portions can be harvested and the removed culture medium is replenished with fresh medium. This process can be repeated several times. A fed-batch process can be used for the production of recombinant proteins and antibodies. While cells are exponentially proliferating but nutrients are depleted, concentrated feed medium (eg, 10-15 times concentrated basal medium) is added either continuously or intermittently. Supply nutrients and allow further increases in cell concentration and length of production stage. New medium can be added in proportion to cell concentration without removal of culture medium (broth). Fed-batch cultures are initiated in volumes well below the full volume of the bioreactor (eg, approximately 40% to 50% of the maximum volume) to accommodate additional media.

本開示のいくつかの方法は、ＲＮＡ（例えば、ｓｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ）の大スケール生産を対象とする。大スケール生産方法では、改変細胞は、５リットル（Ｌ）から２５０，０００Ｌの、またはより多くの体積の液体培養培地中で増殖させられ得る。いくつかの態様において、改変細胞は、１０Ｌ、１００Ｌ、１０００Ｌ、１００００Ｌ、または１０００００Ｌ超の（またはそれに等しい）体積の液体培養培地中で増殖させられ得る。いくつかの態様において、改変細胞は、５Ｌ、１０Ｌ、１５Ｌ、２０Ｌ、２５Ｌ、３０Ｌ、３５Ｌ、４０Ｌ、４５Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ、５０００Ｌ、１００００Ｌ、１０００００Ｌ、１５００００Ｌ、２０００００Ｌ、２５００００Ｌ、またはより多くの体積の液体培養培地中で増殖させられる。いくつかの態様において、改変細胞は、５Ｌから１０Ｌ、５Ｌから１５Ｌ、５Ｌから２０Ｌ、５Ｌから２５Ｌ、５Ｌから３０Ｌ、５Ｌから３５Ｌ、５Ｌから４０Ｌ、５Ｌから４５Ｌ、１０Ｌから１５Ｌ、１０Ｌから２０Ｌ、１０Ｌから２５Ｌ、２０Ｌから３０Ｌ、１０Ｌから３５Ｌ、１０Ｌから４０Ｌ、１０Ｌから４５Ｌ、１０Ｌから５０Ｌ、１５Ｌから２０Ｌ、１５Ｌから２５Ｌ、１５Ｌから３０Ｌ、１５Ｌから３５Ｌ、１５Ｌから４０Ｌ、１５Ｌから４５Ｌ、または１５から５０Ｌの体積の液体培養培地中で増殖させられ得る。いくつかの態様において、改変細胞は、１００Ｌから３０００００Ｌ、１００Ｌから２０００００Ｌ、または１００Ｌから１０００００Ｌの体積の液体培養培地中で増殖させられ得る。 Some methods of the present disclosure are directed to large scale production of RNA (eg, ssRNA or dsRNA). In large scale production methods, modified cells can be grown in 5 liters (L) to 250,000 L, or more volumes of liquid culture medium. In some embodiments, the modified cells can be grown in 10 L, 100 L, 1000 L, 10000 L, or more than 100,000 L (or equivalent) volumes of liquid culture medium. In some embodiments, the modified cells are 5L, 10L, 15L, 20L, 25L, 30L, 35L, 40L, 45L, 50L, 100L, 500L, 1000L, 5000L, 10000L, 100000L, 150,000L, 200,000L, 250,000L, or more. It is grown in many volumes of liquid culture medium. In some embodiments, the modified cells are 5L to 10L, 5L to 15L, 5L to 20L, 5L to 25L, 5L to 30L, 5L to 35L, 5L to 40L, 5L to 45L, 10L to 15L, 10L to 20L, 10L to 25L, 20L to 30L, 10L to 35L, 10L to 40L, 10L to 45L, 10L to 50L, 15L to 20L, 15L to 25L, 15L to 30L, 15L to 35L, 15L to 40L, 15L to 45L, or 15 Can be grown in a volume of liquid culture medium from to 50 L. In some embodiments, the modified cells can be grown in 100 L to 300,000 L, 100 L to 200,000 L, or 100 L to 100,000 L volumes of liquid culture medium.

典型的には、改変細胞を培養することには、細胞を溶解することが後続する。「溶解する」は、細胞が例えばウイルス的、酵素的、機械的、または浸透圧的機序によって破片化されるプロセスを言う。「細胞ライセート」は、溶解された細胞（例えば、溶解された改変細胞）の内容物を含有する液を言い、例えばオルガネラ、膜脂質、蛋白質、核酸、および反転膜小胞を包含する。本開示の細胞ライセートは、本明細書において提供される改変細胞いずれかの集団を溶解することによって生産され得る。 Typically, culturing modified cells is followed by lysing the cells. "Dissolving" refers to the process by which cells are fragmented by, for example, viral, enzymatic, mechanical, or osmotic mechanisms. "Cell lysate" refers to a fluid containing the contents of lysed cells (eg, lysed modified cells) and includes, for example, organelles, membrane lipids, proteins, nucleic acids, and inverted membrane vesicles. The cell lysates of the present disclosure can be produced by lysing any population of modified cells provided herein.

「溶解する」と言われる細胞溶解の方法は当分野において公知であり、それらのいずれかが本開示に従って用いられ得る。かかる細胞溶解方法は、限定なしに、ホモジナイゼーションなどの物理的溶解を包含する。 Methods of cytolysis referred to as "lysing" are known in the art and any of them can be used in accordance with the present disclosure. Such cytolysis methods include, without limitation, physical lysis such as homogenization.

細胞溶解は綿密にコントロールされた細胞内環境を撹乱し得、無制御な内在性プロテアーゼおよびホスファターゼによる蛋白質分解および修飾をもたらす。それゆえに、いくつかの態様においては、プロテアーゼ阻害剤および／またはホスファターゼ阻害剤が細胞ライセートまたは溶解前の細胞に追加され得、またはそれらの活性は熱不活性化、遺伝子不活性化、またはプロテアーゼ標的化によって除去され得る。 Cytolysis can disrupt the tightly controlled intracellular environment, resulting in proteolysis and modification by uncontrolled endogenous proteases and phosphatases. Therefore, in some embodiments, protease inhibitors and / or phosphatase inhibitors may be added to cell lysates or pre-lysed cells, or their activity may be heat inactivated, gene inactivated, or protease targeted. Can be removed by conversion.

いくつかの態様において、細胞ライセートは少なくとも１つの栄養素と組み合わせられ得る。例えば、細胞ライセートはＮａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＮＨ４Ｃｌ、ＮａＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２と組み合わせられ得る。他の栄養素の例は、限定なしに、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、オロト酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、一塩基性リン酸カリウム、二塩基性リン酸カリウム、三塩基性リン酸カリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、三塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸アンモニウム、二塩基性リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、および水酸化アンモニウムを包含する。 In some embodiments, cellular lysates can be combined with at least one nutrient. For example, cell lysates can be combined with Na 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 , NH 4 Cl, NaCl, ו 4 , CaCl 2 . Examples of other nutrients are, without limitation, magnesium sulfate, magnesium chloride, magnesium olotoate, magnesium citrate, potassium monobasic phosphate, potassium dibasic phosphate, potassium tribasic phosphate, monobasic phosphorus. Includes sodium acid, sodium dibasic phosphate, sodium tribasic phosphate, monobasic ammonium phosphate, dibasic ammonium phosphate, ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium hydroxide.

いくつかの態様において、細胞ライセートは少なくとも１つの補因子と組み合わせられ得る。例えば、細胞ライセートは、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、または酵素の活性のために要求される他の非蛋白質化学化合物（例えば、無機イオンおよび補酵素）と組み合わせられ得る。 In some embodiments, cellular lysates can be combined with at least one cofactor. For example, cellular lysates are adenosine diphosphate (ADP), adenosine triphosphate (ATP), nicotinamide adenine dinucleotide (NAD +), or other non-protein chemical compounds required for the activity of the enzyme (eg, for example. Can be combined with inorganic ions and coenzymes).

いくつかの態様において、細胞ライセートはＲＮＡ解重合をもたらす条件下においてインキュベートされる。いくつかの態様において、細胞ライセートはｓｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡの生産をもたらす条件下においてインキュベートされる。 In some embodiments, the cell lysate is incubated under conditions that result in RNA depolymerization. In some embodiments, the cell lysate is incubated under conditions that result in the production of ssRNA or dsRNA.

単一の反応に用いられる細胞ライセートの体積は変わり得る。いくつかの態様において、細胞ライセートの体積は０．００１から２５０ｍ３である。例えば、細胞ライセートの体積は０．００１ｍ３、０．０１ｍ３、０．１ｍ３、１ｍ３、５ｍ３、１０ｍ３、１５ｍ３、２０ｍ３、２５ｍ３、３０ｍ３、３５ｍ３、４０ｍ３、４５ｍ３、５０ｍ３、５５ｍ３、６０ｍ３、６５ｍ３、７０ｍ３、７５ｍ３、８０ｍ３、８５ｍ３、９０ｍ３、９５ｍ３、１００ｍ３、１０５ｍ３、１１０ｍ３、１１５ｍ３、１２０ｍ３、１２５ｍ３、１３０ｍ３、１３５ｍ３、１４０ｍ３、１４５ｍ３、１５０ｍ３、１５５ｍ３、１６０ｍ３、１６５ｍ３、１７０ｍ３、１７５ｍ３、１８０ｍ３、１８５ｍ３、１９０ｍ３、１９５ｍ３、２００ｍ３、２０５ｍ３、２１０ｍ３、２１５ｍ３、２２０ｍ３、２２５ｍ３、２３０ｍ３、２３５ｍ３、２４０ｍ３、２４５ｍ３、または２５０ｍ３であり得る。いくつかの態様において、細胞ライセートの体積は２５ｍ３から２５０ｍ３、５０ｍ３から２５０ｍ３、または１００ｍ３から２５０ｍ３である。
下流処理 The volume of cellular lysates used in a single reaction can vary. In some embodiments, the volume of cell lysate is 0.001 to 250 m 3 . For example, the volume of cell lysate is 0.001m 3 , 0.01m 3 , 0.1m 3 , 1m 3 , 5m 3 , 10m 3 , 15m 3 , 20m 3 , 25m 3 , 30m 3 , 35m 3 , 40m 3 , 45m. 3 , 50m 3 , 55m 3 , 60m 3 , 65m 3 , 70m 3 , 75m 3 , 80m 3 , 85m 3 , 90m 3 , 95m 3 , 100m 3 , 105m 3 , 110m 3 , 115m 3 , 120m 3 , 125m 130m 3 , 135m 3 , 140m 3 , 145m 3 , 150m 3 , 155m 3 , 160m 3 , 165m 3 , 170m 3 , 175m 3 , 180m 3 , 185m 3 , 190m 3 , 195m 3 , 200m 3 , 205m 3 , 215m 3 , 220m 3 , 225m 3 , 230m 3 , 235m 3 , 240m 3 , 245m 3 , or 250m 3 . In some embodiments, the volume of cell lysates is 25 m 3 to 250 m 3 , 50 m 3 to 250 m 3 , or 100 m 3 to 250 m 3 .
Downstream processing

本明細書において提供される方法およびシステムは、いくつかの態様において、ＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ）産物を１～５０ｇ／Ｌ（例えば、３０、３５、４０、４５、または５０ｇ／Ｌ）の濃度で生む。下流処理は９９重量％（例えば、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％）ｄｓＲＮＡほどまで純度を増大させる。下流処理の例が図４に示されており、蛋白質沈殿剤（例えば酢酸アンモニウム）の追加によって出発し、蛋白質、脂質、および何らかのＤＮＡを製品流から除去するためのディスク型遠心（ＤＳＣ）が後続する。それから、塩および体積を除去するために限外濾過が実行される。製品流への塩化リチウムの追加はＲＮＡ産物の沈殿に至り、これはその後ディスク型遠心を用いてバルク液体から分離され、例えば～８０％純度のＲＮＡ製品流を生む。さらなるクロマトグラフィーポリッシングは～９９％純粋な産物を生む。
追加の態様 The methods and systems provided herein are, in some embodiments, 1 to 50 g / L (eg, 30, 35, 40, 45, or 50 g / L) RNA (eg, dsRNA, ssRNA) products. Produces in concentration. Downstream treatment increases the purity to as much as 99% by weight (eg, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, or 99%) dsRNA. An example of downstream treatment is shown in FIG. 4, starting with the addition of a protein precipitant (eg ammonium acetate), followed by disc centrifuge (DSC) to remove proteins, lipids, and any DNA from the product stream. do. Extrafiltration is then performed to remove salt and volume. Addition of lithium chloride to the product stream leads to precipitation of the RNA product, which is then separated from the bulk liquid using a disc centrifuge, producing, for example, an RNA product stream of ~ 80% purity. Further chromatographic polishing yields ~ 99% pure products.
Additional aspects

本開示の追加の態様は次の番号つきのパラグラフ１～４６に包含される：
１． リボ核酸（ＲＮＡ）を生合成する無細胞的方法であって、方法が：
（ａ）ＲＮＡ、ＲＮＡを解重合する酵素、耐熱性キナーゼ、耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを含む培養改変細胞を溶解し、それによって細胞ライセートを生産することと；
（ｂ）ステップ（ａ）において生産された細胞ライセートを、ＲＮＡの解重合をもたらす条件下においてインキュベートし、それによってヌクレオシド一リン酸を含む細胞ライセートを生産することと；
（ｃ）ステップ（ｂ）において生産された細胞ライセートを、耐熱性キナーゼおよび耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを不活性化することなしに内在性ヌクレアーゼおよびホスファターゼを不活性化する温度に加熱し、それによって、熱不活性化されたヌクレアーゼおよびホスファターゼを含む細胞ライセートを生産することと；
（ｄ）（ｃ）において生産された細胞ライセートを、エネルギー供給源と関心のＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有する改変ＤＮＡ鋳型との存在下において、ヌクレオシド三リン酸の生産およびヌクレオシド三リン酸の重合をもたらす条件下においてインキュベートし、それによって関心のＲＮＡを含む細胞ライセートを生産することと、
を含む。
２． パラグラフ１の方法であって、エネルギー供給源がポリリン酸、ポリリン酸キナーゼ、またはポリリン酸およびポリリン酸キナーゼ両方である。
３． パラグラフ１または２の方法であって、培養改変細胞が改変ＤＮＡ鋳型を含む。
４． パラグラフ１または２の方法であって、改変ＤＮＡ鋳型がステップ（ｄ）の細胞ライセートに追加される。
５． パラグラフ１～４のいずれか１つの方法であって、ＡＴＰ再生系がステップ（ｄ）の細胞ライセートに追加される。
６． パラグラフ１の方法であって、培養改変細胞がさらに耐熱性ポリリン酸キナーゼを含む。
７． パラグラフ１～６のいずれか１つの方法であって、ステップ（ａ）の改変細胞のＲＮＡが内在性ＲＮＡである。
８． パラグラフ１～７のいずれか１つの方法であって、ＲＮＡがリボソームＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、またはその組み合わせを含む。
９． パラグラフ１～８のいずれか１つの方法であって、培養改変細胞がＲＮＡを解重合する少なくとも２つの酵素を含む。
１０． パラグラフ１～９のいずれか１つの方法であって、ＲＮＡを解重合する酵素が：Ｓ１ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＰ１、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ ＪＩ、ＮｕｃＡ、ＰＮＰａｓｅ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅ Ｅ、ＲＮａｓｅＧ、およびその組み合わせからなる群から選択される。
１１． パラグラフ１０の方法であって、ＲＮＡを解重合する酵素がヌクレアーゼＰ１である。
１２． パラグラフ１～１１のいずれか１つの方法であって、ステップ（ｂ）の細胞ライセートがＭｇ２＋キレート剤を含む。
１３． パラグラフ１２の方法であって、Ｍｇ２＋キレート剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。
１４． パラグラフ１３の方法であって、ＥＤＴＡの濃度が０．１ｍＭから２５ｍＭである。
１５． パラグラフ１４の方法であって、ＥＤＴＡの濃度が８ｍＭである。
１６． パラグラフ１～１５のいずれか１つの方法であって、耐熱性キナーゼが耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼを含む。
１７． パラグラフ１６の方法であって、耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼが、耐熱性ウリジル酸キナーゼ、耐熱性シチジル酸キナーゼ、耐熱性グアニル酸キナーゼ、および耐熱性アデニル酸キナーゼからなる群から選択される。
１８． パラグラフ１７の方法であって、安定なヌクレオシド一リン酸キナーゼが、ｐｙｒＨ遺伝子によってコードされる耐熱性Pyrococcus furiosusウリジル酸キナーゼ（ＰｆＰｙｒＨ）、ａｄｋ遺伝子によってコードされる耐熱性Thermus thermophilusアデニル酸キナーゼ（ＴｔｈＡｄｋ）、ｃｍｋ遺伝子によってコードされる耐熱性Thermus thermophilusシチジル酸キナーゼ（ＴｔｈＣｍｋ）、およびｇｍｋ遺伝子によってコードされる耐熱性Pyrococcus furiosusグアニル酸キナーゼ（ＰｆＧｍｋ）からなる群から選択される。
１９． パラグラフ１～１８のいずれか１つの方法であって、耐熱性キナーゼが耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼを含む。
２０． パラグラフ１９の方法であって、耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼが、耐熱性ヌクレオシドリン酸キナーゼ、耐熱性ピルビン酸キナーゼ、および耐熱性ポリリン酸キナーゼからなる群から選択される。
２１． パラグラフ２０の方法であって、耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼの少なくとも１つがｎｄｋ遺伝子によってコードされる耐熱性Aquifex aeolicus酵素である。
２２． パラグラフ１～２１のいずれか１つの方法であって、細胞が耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼおよび耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼを含む。
２３． パラグラフ１～２２のいずれか１つの方法であって、培養改変細胞が耐熱性ウリジル酸キナーゼ、耐熱性シチジル酸キナーゼ、耐熱性グアニル酸キナーゼ、耐熱性アデニル酸キナーゼ、および耐熱性ポリリン酸キナーゼを含む。
２４． パラグラフ１～２３のいずれか１つの方法であって、耐熱性ＲＮＡポリメラーゼが耐熱性ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。
２５． パラグラフ２４の方法であって、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、耐熱性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、耐熱性ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、および耐熱性Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択される。
２６． パラグラフ２５の方法であって、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが耐熱性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼである。
２７． パラグラフ１～２６のいずれか１つの方法であって、ステップ（ｃ）の温度が少なくとも５０℃である。
２８． パラグラフ２７の方法であって、ステップ（ｃ）の温度が５０℃～８０℃である。
２９． パラグラフ１～２８のいずれか１つの方法であって、ステップ（ｃ）が、細胞ライセートを少なくとも１５分間加熱することを含む。
３０． パラグラフ１～２９のいずれか１つの方法であって、ステップ（ｃ）が、細胞ライセートを少なくとも６５℃の温度で１５分間加熱することを含む。
３１． パラグラフ１～３０のいずれか１つの方法であって、ステップ（ｄ）のヌクレオシド三リン酸が１５～３０ｍＭ／時間の速度で生産される。
３２． パラグラフ１～３１のいずれか１つの方法であって、ステップ（ｄ）において生産される関心のＲＮＡが二本鎖ＲＮＡである。
３３． パラグラフ１～３２のいずれか１つの方法であって、ステップ（ｄ）において生産される関心のＲＮＡがＲＮＡ干渉分子である。
３４． パラグラフ１～３３のいずれか１つの方法であって、ステップ（ｄ）において生産される関心のＲＮＡが、ヒンジドメインによって連結された相補的なドメイン同士を含有するｍＲＮＡである。
３５． パラグラフ１～３４のいずれか１つの方法であって、ステップ（ｄ）において生産される関心のＲＮＡが、少なくとも４ｇ／Ｌ、少なくとも６ｇ／Ｌ、少なくとも６ｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｇ／Ｌの濃度で生産される。
３６． パラグラフ３５の方法であって、さらに、二本鎖ＲＮＡを精製することを含む。
３７． パラグラフ３６の方法であって、精製ステップが、ステップ（ｄ）の細胞ライセートを蛋白質沈殿剤と組み合わせることと、沈殿した蛋白質、脂質、およびＤＮＡを除去することとを含む。
３８． パラグラフ１～３７のいずれか１つの方法によって生産される細胞ライセート。
３９． ＲＮＡ、ＲＮＡを解重合する酵素、耐熱性キナーゼ、および耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを含む、改変細胞。
４０． パラグラフ３９の改変細胞であって、さらに、関心のＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有する改変ＤＮＡ鋳型を含む。
４１． パラグラフ３９または４０の改変細胞の集団。
４２． 方法であって：細胞培養培地中においてパラグラフ３９の改変細胞を維持することを含む。
４３． パラグラフ４２の方法であって、さらに、培養改変細胞を溶解して細胞ライセートを生産することを含む。
４４． パラグラフ４３の方法であって、さらに、ＲＮＡの解重合をもたらす条件下において細胞ライセートをインキュベートして、ヌクレオシド一リン酸を含む細胞ライセートを生産することを含む。
４５． パラグラフ４４の方法であって、さらに、細胞ライセートを、耐熱性キナーゼおよび耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを不活性化することなしに内在性ヌクレアーゼおよびホスファターゼを不活性化する温度に加熱して、熱不活性化されたヌクレアーゼおよびホスファターゼを含む細胞ライセートを生産することを含む。
４６． パラグラフ４５の方法であって、さらに、熱不活性化されたヌクレアーゼおよびホスファターゼを含む細胞ライセートを、エネルギー供給源と関心のＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有する改変ＤＮＡ鋳型との存在下において、ヌクレオシド三リン酸の生産およびヌクレオシド三リン酸の重合をもたらす条件下においてインキュベートして、関心のＲＮＡを含む細胞ライセートを生産することを含む。 Additional embodiments of the present disclosure are contained in paragraphs 1-46 of the following numbers:
1. 1. It is a cell-free method for biosynthesizing ribonucleic acid (RNA), and the method is:
(A) To lyse a cultured modified cell containing RNA, an enzyme that depolymerizes RNA, a heat-resistant kinase, and a heat-resistant RNA polymerase, thereby producing cell lysates;
(B) Incubating the cellular lysates produced in step (a) under conditions that result in RNA depolymerization, thereby producing cellular lysates containing nucleoside monophosphate;
(C) The cell lysates produced in step (b) are heated to a temperature that inactivates the endogenous nuclease and phosphatase without inactivating the heat resistant kinase and heat resistant RNA polymerase, thereby heat. To produce cellular lysates containing inactivated nucleases and phosphatases;
(D) The cell lysate produced in (c) is nucleoside triphosphate in the presence of an energy source and a modified DNA template containing a promoter operably linked to a nucleotide sequence encoding RNA of interest. And thereby incubating under conditions that result in the production of nucleoside triphosphates, thereby producing cellular lysates containing the RNA of interest.
including.
2. 2. In paragraph 1, the energy source is polyphosphoric acid, polyphosphate kinase, or both polyphosphoric acid and polyphosphate kinase.
3. 3. In the method of paragraph 1 or 2, the cultured modified cells contain the modified DNA template.
4. The modified DNA template is added to the cell lysate in step (d) by the method of paragraph 1 or 2.
5. The ATP regeneration system is added to the cell lysate in step (d) by any one of paragraphs 1-4.
6. In paragraph 1, the cultured modified cells further comprise a thermostable polyphosphate kinase.
7. In any one of paragraphs 1 to 6, the RNA of the modified cell in step (a) is an endogenous RNA.
8. In any one of paragraphs 1-7, RNA comprises ribosomal RNA, messenger RNA, transfer RNA, or a combination thereof.
9. The method of any one of paragraphs 1-8, wherein the cultured modified cells contain at least two enzymes that depolymerize RNA.
10. In any one of paragraphs 1-9, the enzyme that depolymerizes RNA is: S1 nuclease, nuclease P1, RNase II, RNase III, RNase R, RNase JI, NucA, PNPase, RNase T, RNase E, It is selected from the group consisting of RNase G and combinations thereof.
11. In the method of paragraph 10, the enzyme that depolymerizes RNA is nuclease P1.
12. In any one of paragraphs 1-11, the cell lysate of step (b) comprises Mg 2+ chelating agent.
13. In paragraph 12, the Mg 2+ chelating agent is ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA).
14. According to the method of paragraph 13, the concentration of EDTA is 0.1 mM to 25 mM.
15. According to the method of paragraph 14, the concentration of EDTA is 8 mM.
16. In any one of paragraphs 1-15, the thermostable kinase comprises a thermostable nucleoside monophosphate kinase.
17. In the method of paragraph 16, the heat-resistant nucleoside monophosphate kinase is selected from the group consisting of heat-resistant uridylic acid kinase, heat-resistant cytidinelic acid kinase, heat-resistant guanylic acid kinase, and heat-resistant adenylate kinase.
18. In the method of paragraph 17, stable nucleoside monophosphate kinase is the heat-resistant Pyrococcus furiosus uridic acid kinase (PfPyrH) encoded by the pyrH gene, the heat-resistant Thermus thermophilus adenylate kinase (TthAdk) encoded by the apk gene. , The heat-resistant Thermus thermophilus citidilic acid kinase (TthCmk) encoded by the cmk gene, and the heat-resistant Pyrococcus furiosus guanylate kinase (PfGmk) encoded by the gmk gene.
19. In any one of paragraphs 1-18, the thermostable kinase comprises a thermostable nucleoside diphosphate kinase.
20. In the method of paragraph 19, the heat resistant nucleoside diphosphate kinase is selected from the group consisting of heat resistant nucleoside phosphate kinase, heat resistant pyruvate kinase, and heat resistant polyphosphate kinase.
21. In paragraph 20, at least one of the thermostable nucleoside diphosphate kinases is a thermostable Aquifex aeolicus enzyme encoded by the ndk gene.
22. In any one of paragraphs 1-21, the cell comprises a heat resistant nucleoside monophosphate kinase and a heat resistant nucleoside diphosphate kinase.
23. A method according to any one of paragraphs 1 to 22, wherein the cultured modified cells include a heat resistant uridylic acid kinase, a heat resistant cytidine acid kinase, a heat resistant guanylic acid kinase, a heat resistant adenylate kinase, and a heat resistant polyphosphate kinase. ..
24. In any one of paragraphs 1 to 23, the thermostable RNA polymerase is a thermostable DNA-dependent RNA polymerase.
25. In the method of paragraph 24, the DNA-dependent RNA polymerase is selected from the group consisting of heat-resistant T7 RNA polymerase, heat-resistant SP6 RNA polymerase, and heat-resistant T3 RNA polymerase.
26. In the method of paragraph 25, the DNA-dependent RNA polymerase is a heat-resistant T7 RNA polymerase.
27. In any one of paragraphs 1-26, the temperature in step (c) is at least 50 ° C.
28. In the method of paragraph 27, the temperature in step (c) is 50 ° C to 80 ° C.
29. In any one of paragraphs 1-28, step (c) comprises heating the cell lysates for at least 15 minutes.
30. In any one of paragraphs 1-29, step (c) comprises heating the cell lysates at a temperature of at least 65 ° C. for 15 minutes.
31. In any one of paragraphs 1-30, the nucleoside triphosphate of step (d) is produced at a rate of 15-30 mM / hour.
32. The RNA of interest produced in step (d) in any one of paragraphs 1-31 is double-stranded RNA.
33. The RNA of interest produced in step (d) in any one of paragraphs 1-32 is the RNA interfering molecule.
34. In any one of paragraphs 1-33, the RNA of interest produced in step (d) is an mRNA containing complementary domains linked by hinge domains.
35. In any one of paragraphs 1-34, the RNA of interest produced in step (d) is at a concentration of at least 4 g / L, at least 6 g / L, at least 6 g / L, or at least 10 g / L. Be produced.
36. The method of paragraph 35, further comprising purifying double-stranded RNA.
37. In the method of paragraph 36, the purification step comprises combining the cellular lysates of step (d) with a protein precipitating agent and removing the precipitated proteins, lipids and DNA.
38. Cellular lysates produced by the method of any one of paragraphs 1-37.
39. Modified cells containing RNA, enzymes that depolymerize RNA, heat-resistant kinases, and heat-resistant RNA polymerases.
40. The modified cell of paragraph 39 further comprises a modified DNA template containing a promoter operably linked to a nucleotide sequence encoding the RNA of interest.
41. Population of modified cells in paragraph 39 or 40.
42. The method comprises: maintaining the modified cells of paragraph 39 in cell culture medium.
43. The method of paragraph 42 further comprises lysing the cultured modified cells to produce cell lysates.
44. The method of paragraph 43 further comprises incubating the cellular lysates under conditions that result in RNA depolymerization to produce cellular lysates comprising a nucleoside monophosphate.
45. The method of paragraph 44 further heat inactivates the cell lysate by heating it to a temperature that inactivates the endogenous nuclease and phosphatase without inactivating the heat resistant kinase and heat resistant RNA polymerase. Includes producing cellular lysates containing the nucleases and phosphatases that have been produced.
46. Modified DNA according to the method of paragraph 45, further comprising a promoter operably linked to a cell lysate containing a heat-inactivated nuclease and a phosphatase to a nucleotide sequence encoding an energy source and RNA of interest. In the presence of a template, it comprises incubating under conditions that result in the production of nucleoside triphosphates and the polymerization of nucleoside triphosphates to produce cellular lysates containing the RNA of interest.

例１
ヌクレアーゼの絞り込み
ライセートＲＮＡを消化するための最適なヌクレアーゼ（単数または複数）を同定するために、一連のスクリーニング実験を、５’－ＮＭＰまたはオリゴヌクレオチドを生成するそれらの能力に基づいて選ばれた市販の酵素を用いて実施した。第１に、それらの酵素の活性を精製E. coli ＲＮＡと製造者が推奨する反応条件とを用いて決定した。ここでは、ＲＮＡ解重合を酸可溶性のヌクレオチドの遊離によってモニターした。これらの条件下においては、４つのヌクレアーゼはバックグラウンドを上回る解重合活性を実証した。正のコントロールとしての用をなすエンドヌクレアーゼのベンゾナーゼおよびＲＮａｓｅ Ａは、ＲＮＡから酸可溶性のヌクレオチドへの迅速な変換を生んだ（図５Ａ）。エキソヌクレアーゼＰ１およびＲＮａｓｅ ＲによるＲＮＡの処置はＲＮＡから酸可溶性のヌクレオチドへの時間依存的な変換を生み、ＲＮａｓｅ Ｒは２時間で１００％近くの解重合に達した。残りのヌクレアーゼ（ターミネーターエキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、およびＲＮａｓｅ Ｔ）はこのアッセイでは検出可能な解重合を生じさせなかった。ＬＣ－ＭＳによるその後の分析は、ベンゾナーゼまたはＲＮａｓｅ ＡではなくＲＮａｓｅ ＲおよびヌクレアーゼＰ１によって処置されたサンプルにおいて、ＮＭＰ遊離を明らかにした（図５Ｂ）。これらの結果は、ＲＮａｓｅ ＲおよびヌクレアーゼＰ１がライセートＲＮＡを５’－ＮＭＰへと解重合することにとって好適であろうということを示唆している。そのＤＮＡｓｅ活性の欠如、そのｄｓＲＮＡおよび有構造ＲＮＡを分解する能力、ならびにそのプロセッシブな３’－＞５’エキソヌクレアーゼ活性を含むいくつかの理由から、ＲＮａｓｅ Ｒをさらなる研究のために選んだ。
ライセート中におけるＲＮＡ解重合 Example 1
Filtering of nucleases To identify the optimal nuclease (s) for digesting lysate RNA, a series of screening experiments were performed on the market selected based on their ability to produce 5'-NMPs or oligonucleotides. It was carried out using the enzyme of. First, the activity of these enzymes was determined using purified E. coli RNA and the reaction conditions recommended by the manufacturer. Here, RNA depolymerization was monitored by the release of acid-soluble nucleotides. Under these conditions, the four nucleases demonstrated depolymerization activity above the background. The endonucleases benzonase and RNase A, which serve as positive controls, produced a rapid conversion of RNA to acid-soluble nucleotides (Fig. 5A). Treatment of RNA with exonucleases P1 and RNase R resulted in a time-dependent conversion of RNA to acid-soluble nucleotides, with RNase R reaching nearly 100% depolymerization in 2 hours. The remaining nucleases (Terminator exonuclease, RNase III, and RNase T) did not result in detectable depolymerization in this assay. Subsequent analysis by LC-MS revealed NMP release in samples treated with RNase R and nuclease P1 rather than benzonase or RNase A (FIG. 5B). These results suggest that RNase R and nuclease P1 may be suitable for depolymerizing lysate RNA to 5'-NMP. RNase R was selected for further study for several reasons, including its lack of DNAse activity, its ability to degrade dsRNA and structured RNA, and its processive 3'->5'exonuclease activity.
RNA depolymerization in lysates

それから、ＲＮａｓｅ Ｒを、細菌ライセート中の内在性ＲＮＡを解重合するその能力について試験した。これらの実験においては、精製ＲＮａｓｅ Ｒ（０．５ｍｇ／ｍＬ終濃度）をライセート（５０％終濃度）に追加し、遊離のヌクレオチドをＵＰＬＣによって定量した。代表的な実験が図６に示されている。精製ＲＮａｓｅ Ｒをライセートに追加することは、ライセートＲＮＡからの５’－ＮＭＰの急速な遊離をもたらし、最大のＮＭＰ遊離は５～１０分後であった。急速な解重合のこの初期期間後に、ＮＭＰ濃度は安定化し、それからゆっくり低下しはじめた。大分より低い速度でではあるが、内在性ＲＮａｓｅ活性もまた５’－ＮＭＰ遊離をもたらした。重要なことに、その公知の作用機序と整合して、ＲＮａｓｅ Ｒ追加はＲＮＡからの２’または３’ＮＭＰ遊離の速度を増大させなかった。複数の独立の実験において、ライセートへのＲＮａｓｅ Ｒの追加は、２００ｍＭ／ｈｒを超過する速度で５～１０分でライセートＲＮＡの６８％から５’－ＮＭＰへの変換をもたらした。 RNase R was then tested for its ability to depolymerize endogenous RNA in bacterial lysates. In these experiments, purified RNase R (0.5 mg / mL final concentration) was added to lysate (50% final concentration) and free nucleotides were quantified by UPLC. A representative experiment is shown in FIG. Addition of purified RNase R to lysate resulted in rapid release of 5'-NMP from lysate RNA, with maximum NMP release after 5-10 minutes. After this initial period of rapid depolymerization, the NMP concentration stabilized and then began to slowly decline. Endogenous RNase activity also resulted in 5'-NMP release, albeit at a much lower rate. Importantly, consistent with its known mechanism of action, the addition of RNase R did not increase the rate of 2'or 3'NMP release from RNA. In multiple independent experiments, addition of RNase R to lysate resulted in conversion of 68% of lysate RNA to 5'-NMP in 5-10 minutes at rates exceeding 200 mM / hr.

ＲＮａｓｅ Ｒ発現の毒性を算定するために、２つの細菌株を構築した。１つの株は空の蛋白質発現ベクターによって形質転換された元株（ＧＬ１６－１７０）を包含し、別のものはＲＮａｓｅ Ｒをコードする同じ蛋白質発現ベクターによって形質転換されたＧＬ１６－１７０を包含した。両方の株をバッチ条件下において１Ｌバイオリアクター内で増殖させ、ＯＤ６００＝２０で誘導し、グルコース消耗前に収穫した。誘導は、増殖速度の検出可能な変化なしに（図７Ｂ）ＲＮａｓｅ Ｒの強い発現を生んだ（図７Ａ）。溶解および５０％希釈によって、ＲＮａｓｅ Ｒを発現する株はＲＮＡから酸可溶性のヌクレオチドへの急速な解重合を発揮し（図７Ｃ）、過剰発現されたＲＮａｓｅ Ｒが機能的であるということを示した。特に、精製酵素を反応に追加することによって供給された追加のＲＮａｓｅ Ｒ活性は、解重合の速度または酸可溶性のヌクレオチドの収量を増大させず、過剰発現されたＲＮａｓｅ Ｒが溶解および希釈によって充分に活性であるということを示唆した。 Two bacterial strains were constructed to calculate the toxicity of RNase R expression. One strain contained the original strain (GL16-170) transformed with an empty protein expression vector, and the other contained GL16-170 transformed with the same protein expression vector encoding RNase R. Both strains were grown in 1 L bioreactor under batch conditions, induced at OD 600 = 20 and harvested prior to glucose depletion. Induction produced strong expression of RNase R without a detectable change in growth rate (FIG. 7B). Upon lysis and 50% dilution, strains expressing RNase R exhibited rapid depolymerization of RNA into acid-soluble nucleotides (FIG. 7C), indicating that overexpressed RNase R is functional. .. In particular, the additional RNase R activity supplied by adding the purified enzyme to the reaction did not increase the rate of depolymerization or the yield of acid-soluble nucleotides, and the overexpressed RNase R was sufficiently dissolved and diluted. It was suggested that it was active.

次に、過剰発現されたＲＮａｓｅ Ｒの活性を高密度ライセート中で算定した。リボソーム構造を安定化しｒＲＮＡをヌクレアーゼから保護することが公知であるＭｇ２＋は、ＲＮａｓｅ Ｒ活性のためにもまた（低い量で）要求される。よって、解重合速度を様々な濃度のＥＤＴＡの存在下において測定した（図８）。空ベクター株からのライセートは比較的ゆっくりした解重合速度を発揮し、それらはＥＤＴＡに不感であり、一方、過剰発現されたＲＮａｓｅ Ｒを有するライセートは増大していくＥＤＴＡ濃度によって解重合のより高い速度を発揮し、８ｍＭ ＥＤＴＡにおいて最大の速度であった。おそらくはＭｇ２＋依存性ＲＮａｓｅ Ｒの不活性化が原因で、８ｍＭよりも上では解重合速度は減少した。一緒にすると、これらの結果は、過剰発現されたＲＮａｓｅ Ｒが非毒性であり、溶解によって活性化され得るということを示唆している。
ライセート中におけるＮＭＰ安定性 Next, the activity of overexpressed RNase R was calculated in high density lysates. Mg 2+ , which is known to stabilize ribosomal structure and protect rRNA from nucleases, is also required (in low amounts) for RNase R activity. Therefore, the depolymerization rate was measured in the presence of various concentrations of EDTA (FIG. 8). Lysates from empty vector strains exhibit relatively slow depolymerization rates, they are insensitive to EDTA, while lysates with overexpressed RNase R have higher depolymerization due to increasing EDTA concentrations. It exerted its speed and was the highest speed in 8 mM EDTA. Depolymerization rates decreased above 8 mM, probably due to the inactivation of Mg 2+ -dependent RNase R. Together, these results suggest that overexpressed RNase R is non-toxic and can be activated by lysis.
NMP stability during lysate

ＲＮＡ解重合の後に、もたらされたＮＭＰプールはｄｓＲＮＡへの重合前にＮＴＰへと漸次リン酸化される。有害な酵素活性、例えばヌクレオシドへのＮＭＰ分解と糖および塩基へのその後の加水分解とは、ｄｓＲＮＡ収量に負に影響する。よって、個々のＮＭＰの安定性をライセート中で算定した。安定性算定は、同位体標識した「重い」ＮＭＰ（ｈＡＭＰ、ｈＣＭＰ、ｈＵＭＰ、およびｈＧＭＰ）をライセートに追加することと、ＬＣ－ＭＳを用いて経時的に存在量を定量することとによって実施した（図９Ａ～９Ｄ、実線）。比較的安定であるｈＡＭＰとは対照的に、ｈＣＭＰ、ｈＵＭＰ、およびｈＧＭＰはライセートによって盛んに分解され、それぞれ１時間、３０分、および２０分というおよその半減期（ｔ１／２）を有する。 After RNA depolymerization, the resulting NMP pool is gradually phosphorylated to NTP before polymerization to dsRNA. Harmful enzymatic activity, such as NMP degradation to nucleosides and subsequent hydrolysis to sugars and bases, negatively affects dsRNA yield. Therefore, the stability of individual NMPs was calculated in the lysate. Stability calculations were performed by adding isotope-labeled "heavy" NMPs (hAMP, hCMP, hUMP, and hGMP) to lysates and quantifying abundance over time using LC-MS. (Figs. 9A-9D, solid line). In contrast to hAMP, which is relatively stable, hCMP, hUMP, and hGMP are actively degraded by lysates and have approximately half-lives (t 1/2 ) of 1 hour, 30 minutes, and 20 minutes, respectively.

ＮＭＰの代謝の１つの経路はヌクレオシドへの脱リン酸化である。脱リン酸化がＮＭＰ分解に寄与しているかどうかを算定するために、安価なホスファターゼ阻害剤の追加によって安定性算定を繰り返した。リン酸（ＰＯ４、１５０ｍＭ）および構造的模倣物オルトバナジン酸（ＶＯ４、１０ｍＭ）の増大した濃度をｈＮＭＰ追加前のライセートとプレインキュベートした。リン酸濃度を増大させることはｈＵＭＰを安定化し（ｔ１／２≒６０分）、一方、ｈＣＭＰおよびｈＧＭＰには最小に影響した（図９Ａ～９Ｄ、点線）。対照的に、オルトバナジン酸はｈＣＭＰ（ｔ１／２＞＞６０分）、ｈＵＭＰ（ｔ１／２≒６０分）、およびｈＧＭＰ（ｔ１／２≒４５分）を安定化した（図９Ａ～９Ｄ、点線）。一緒にすると、これらの安定性算定はライセート中における１３ｍＭ／ｈｒという総体的なＮＭＰ分解速度を定め、外来的に追加されたＮＭＰの７０％が１５分後に存在する。ホスファターゼ阻害剤の非存在下においてであっても、ＲＮａｓｅ Ｒ依存的な解重合の速度（＞２００ｍＭ／ｈｒ）と比較してｈＮＭＰ消費の比較的低い速度（１３ｍＭ／ｈｒ）は、ＲＮＡから遊離したＮＭＰがｄｓＲＮＡへの重合に利用可能であるはずであるということを示唆した。
熱不活性化の開発 One pathway of NMP metabolism is dephosphorylation to nucleosides. Stability calculations were repeated with the addition of inexpensive phosphatase inhibitors to determine if dephosphorylation contributed to NMP degradation. Increased concentrations of phosphoric acid (PO 4 , 150 mM) and structural mimetic orthovanadic acid (VO 4 , 10 mM) were preincubated with lysate prior to hNMP addition. Increasing the phosphate concentration stabilized hUMP (t 1/2 ≈ 60 minutes), while having a minimal effect on hCMP and hGMP (FIGS. 9A-9D, dotted line). In contrast, orthovanadate stabilized hCMP (t 1/2 >> 60 minutes), hUMP (t 1/2 ≈ 60 minutes), and hGMP (t 1/2 ≈ 45 minutes) (FIGS. 9A-. 9D, dotted line). Together, these stability calculations determine the overall NMP degradation rate of 13 mM / hr in lysates, with 70% of the exogenously added NMP present after 15 minutes. Even in the absence of phosphatase inhibitors, a relatively low rate of hNMP consumption (13 mM / hr) compared to the rate of RNase R-dependent depolymerization (> 200 mM / hr) was released from RNA. It was suggested that NMP should be available for polymerization to dsRNA.
Development of thermal inactivation

ＮＭＰ、ならびにＮＤＰ、ＮＴＰ、およびｄｓＲＮＡを安定化するために、熱不活性化プロトコールを開発した。目的は、ライセート中のヌクレオチドおよびＲＮＡ分解活性を消去するであろう最も低い温度および最も短いインキュベーション時間を同定することであった。熱不活性化の効力を算定するために、（３７℃での）ＮＴＰ消費速度を熱不活性化されたライセートの間でＬＣ－ＭＳによって比較し、熱不活性化の時間および温度を変えた。熱不活性化前には、ライセートはＮＴＰをおよそ１２０ｍＭ／ｈｒで消費した（図１０）。７０℃よりも下の温度はＮＴＰａｓｅ活性に影響せず、一方、７０℃でのインキュベーションはＮＴＰａｓｅ活性の時間依存的な減少を生じさせた。ＮＴＰａｓｅ活性の完全な阻害は７０℃での１５分インキュベーション後に生じた（図１０）。 A heat-inactivated protocol was developed to stabilize NMP, as well as NDP, NTP, and dsRNA. The aim was to identify the lowest temperature and shortest incubation time that would eliminate nucleotide and RNA degradation activity in lysates. To calculate the efficacy of the heat inactivation, the NTP consumption rate (at 37 ° C.) was compared by LC-MS between the heat inactivated lysates and the time and temperature of the heat inactivation were varied. .. Prior to heat inactivation, Lysate consumed NTP at approximately 120 mM / hr (FIG. 10). Temperatures below 70 ° C did not affect NTPase activity, while incubation at 70 ° C resulted in a time-dependent decrease in NTPase activity. Complete inhibition of NTPase activity occurred after a 15-minute incubation at 70 ° C. (FIG. 10).

次に、これらの条件を、ライセート中のＮＭＰおよびｄｓＲＮＡを安定化するそれらの能力について評価した。ＮＭＰ分解に及ぼす熱不活性化の効果を評価するために、ライセートを外来性ＲＮａｓｅ Ｒによって処置してＲＮＡを遊離させ、それから７０℃での熱不活性化に付した。不活性化後に、温度を３７℃に下げ、反応を追加の６０分間インキュベートした。図１１Ａに示されているように、５分間のＲＮａｓｅ Ｒによる処置はＲＮＡを急速に解重合した。熱不活性化および３７℃でのインキュベーション後に、ＮＭＰ濃度は不変であり、選んだ熱不活性化条件がＮＭＰを安定にしたということを示唆した。 These conditions were then evaluated for their ability to stabilize NMP and dsRNA in lysates. To assess the effect of heat inactivation on NMP degradation, lysates were treated with exogenous RNase R to release RNA and then subjected to heat inactivation at 70 ° C. After inactivation, the temperature was lowered to 37 ° C. and the reaction was incubated for an additional 60 minutes. As shown in FIG. 11A, treatment with RNase R for 5 minutes rapidly depolymerized RNA. After heat inactivation and incubation at 37 ° C., the NMP concentration was unchanged, suggesting that the selected heat inactivation conditions stabilized the NMP.

最後に、これらの条件を、ライセート中のインビトロ転写反応の反応物および産物（ＮＴＰおよびｄｓＲＮＡを包含する）を安定化するそれらの能力について評価した。第１に、ライセートを上昇した温度で１５分間プレインキュベートした。それから温度を３７℃に下げ、転写反応物（外来性のＮＴＰ、ＤＮＡ鋳型、および精製Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを包含する）を追加した。図１１Ｂに示されているように、≧７０℃で熱不活性化されたライセート中における転写反応は、正のコントロール反応（緩衝液中で実施した）に定性的に類似のＲＮＡ産物を生んだ。６０℃で実施した反応ではＲＮＡ産物は明らかではなかった。 Finally, these conditions were evaluated for their ability to stabilize in vitro transcription reaction reactants and products (including NTP and dsRNA) in lysates. First, the lysate was pre-incubated at elevated temperature for 15 minutes. The temperature was then lowered to 37 ° C. and transcriptional reactants (including exogenous NTP, DNA template, and purified T7 RNA polymerase) were added. As shown in FIG. 11B, the transcription reaction in the lysate heat-inactivated at ≧ 70 ° C. produced an RNA product qualitatively similar to the positive control reaction (performed in buffer). .. RNA products were not apparent in the reaction performed at 60 ° C.

一緒にすると、これらの結果は、１５分間の７０℃インキュベーションが無細胞的反応においてＮＭＰ、ＮＴＰ、およびｄｓＲＮＡを安定化するために十分であるということを示唆している。
耐熱性キナーゼの選択および評価 Together, these results suggest that a 15-minute 70 ° C. incubation is sufficient to stabilize NMP, NTP, and dsRNA in a cell-free reaction.
Selection and evaluation of thermostable kinases

熱不活性化後には、ＲＮＡから遊離した５’－ＮＭＰを、ｄｓＲＮＡを形成するために重合され得るＮＴＰへと逐次的にリン酸化するために、一連のキナーゼ活性が要求される。ＡＴＰからの高エネルギーリン酸基を用いてＮＭＰおよびＮＤＰをリン酸化するそれらのキナーゼは、高温インキュベーション後に活性なままであるために十分に耐熱性であり、かつ高い速度でＮＴＰ（１ｇ ｄｓＲＮＡ／Ｌ／ｈｒで２１ｍＭ／ｈｒ ＮＴＰ）を生産するために十分に活性でなければならない。E. coliによる上首尾な発現および組換え体酵素の生化学的キャラクタリゼーションの文献報告に基づいて、好熱生物からの酵素を評価のために選んだ（表９）。

Figure 0007011599000009
After thermal inactivation, a series of kinase activities are required to sequentially phosphorylate the 5'-NMP released from RNA into NTPs that can be polymerized to form dsRNA. Those kinases that phosphorylate NMP and NDP using high-energy phosphate groups from ATP are sufficiently heat resistant to remain active after high temperature incubation and NTP (1 g dsRNA / L) at high rates. It must be active enough to produce (21 mM / hr NTP) at / hr. Enzymes from aerobic organisms were selected for evaluation based on the literature reports on successful expression by E. coli and biochemical characterization of recombinant enzymes (Table 9).
Figure 0007011599000009

ｄｓＲＮＡの無細胞的生産にとってのこれらの酵素の好適性を評価するために、酵素をＮ末端ヘキサヒスチジンタグと共にE. coli蛋白質発現ベクターにクローニングし、過剰発現し、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いて精製した。精製酵素の活性を第１にルシフェラーゼアッセイを用いて定量した。そこでは、ＡＴＰの消費がＮＭＰおよびＮＤＰリン酸化のプロキシとしての用をなした。アッセイをいろいろなインキュベーション温度で実施して、各酵素の最適反応温度を決定した。 To assess the suitability of these enzymes for cell-free production of dsRNA, the enzymes were cloned into an E. coli protein expression vector with an N-terminal hexahistidine tag, overexpressed and immobilized metal affinity chromatography (IMAC). ) Was purified. The activity of the purified enzyme was first quantified using a luciferase assay. There, consumption of ATP served as a proxy for NMP and NDP phosphorylation. Assays were performed at various incubation temperatures to determine the optimal reaction temperature for each enzyme.

T thermophilusおよびE. coliからのＵＭＰキナーゼ（ｐｙｒＨ遺伝子によってコードされる）の発現は、試験された誘導および精製条件下において不溶性の蛋白質を生んだ。P. furiosusからの精製ＰｙｒＨはおよそ２μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ蛋白質の比活性を発揮し、これは概ね温度非依存的であった（図１２）。この比活性に基づいて、ＰｆＰｙｒＨを１％総蛋白質で発現する高密度細胞ライセート（９０ｇ ｄｃｗ／Ｌ）は、過剰なＡＴＰの存在下においては、５０ｍＭ／ｈｒを超過する速度でＵＭＰをリン酸化するであろう（表１０）。１ｇ／Ｌ／ｈｒでのｄｓＲＮＡ生産はおよそ５．２５ｍＭ／ｈｒのＵＭＰキナーゼ活性を要求するので、ＰｆＰｙｒＨをさらなる評価のために選んだ。表１０は高密度（９０ｇ ｄｃｗ／Ｌ）ライセート中における予測されるＰｙｒＨ速度を示しており、ＰｆＰｙｒＨが総ライセート蛋白質の１％を構成していると想定している。

Figure 0007011599000010
Expression of UMP kinase (encoded by the pyrH gene) from T thermophilus and E. coli gave rise to insoluble proteins under the induced and purified conditions tested. Purified PyrH from P. furiosus exhibited a specific activity of approximately 2 μmol / min / mg protein, which was largely temperature independent (FIG. 12). Based on this specific activity, high density cell lysates (90 g dcw / L) expressing PfPyrH in 1% total protein phosphorylate UMP at rates above 50 mM / hr in the presence of excess ATP. Would be (Table 10). Since dsRNA production at 1 g / L / hr requires UMP kinase activity of approximately 5.25 mM / hr, PfPyrH was selected for further evaluation. Table 10 shows the expected PyrH rates during high density (90 g dcw / L) lysates, assuming that PfPyrH constitutes 1% of the total lysate protein.
Figure 0007011599000010

E. coliおよびT. thermophilusからのＡＭＰキナーゼ（ａｄｋ遺伝子によってコードされる）の発現は可溶性の組換え体蛋白質を生んだが、一方、Thermosynechococcus酵素は試験された発現および精製条件下において不溶性であった。精製E. coli酵素は３７℃および５０℃では活性であったが、より高温では検出可能な活性を発揮しなかった（図１３）。T. thermophilus酵素は、全ての試験された温度でE. coli酵素よりも高い比活性を発揮し、７０℃でｍｇ酵素あたり１ｍＭ／ｍｉｎ近くの最適活性を有した。この活性は、酵素が高密度ライセート中において総蛋白質の０．０１％で発現されているときには、ライセート中におけるＡＭＰリン酸化の２５０ｍＭ／ｈｒを超過する予想される速度に帰着する（表１１）。およそ５．２５ｍＭ／ｈｒのＡＭＰキナーゼ活性が、１ｇ／Ｌ／ｈｒでｄｓＲＮＡを合成するためには要求されるので、ＴｔｈＡｄｋをさらなる研究のために選んだ。表１１は高密度（９０ｇ ｄｃｗ／Ｌ）ライセート中における予測されるＡｄｋ反応速度を示しており、ＴｔｈＡｄｋが総ライセート蛋白質の０．０１％を構成していると想定している。

Figure 0007011599000011
Expression of AMP kinase (encoded by the adk gene) from E. coli and T. thermophilus gave rise to a soluble recombinant protein, while the Thermosynechococcus enzyme was insoluble under the expression and purification conditions tested. .. The purified E. coli enzyme was active at 37 ° C and 50 ° C, but did not exhibit detectable activity at higher temperatures (FIG. 13). The T. thermophilus enzyme exhibited higher specific activity than the E. coli enzyme at all tested temperatures and had an optimal activity of close to 1 mM / min per mg enzyme at 70 ° C. This activity results in the expected rate of AMP phosphorylation exceeding 250 mM / hr in lysate when the enzyme is expressed in 0.01% of total protein in high density lysate (Table 11). TthAdk was selected for further study as AMP kinase activity of approximately 5.25 mM / hr is required to synthesize dsRNA at 1 g / L / hr. Table 11 shows the expected Adk kinetics in high density (90 g dcw / L) lysates, assuming that TthAdk constitutes 0.01% of the total lysate protein.
Figure 0007011599000011

E. coliおよびP. furiosusからのＣＭＰキナーゼ（ｃｍｋ遺伝子によってコードされる）の発現は不溶性の蛋白質を生み、一方、T. thermophilus酵素の発現は試験された条件下においては可溶性蛋白質を生んだ。T. thermophilus ＣＭＰキナーゼは概ね温度に非依存的な活性を示したが、酵素活性は６０℃よりも上の温度では僅かに減少した（図１４）。これらの結果に基づくと、総蛋白質の０．０２％での高密度ライセート中におけるＴｔｈＣｍｋの発現は、５．２５ｍＭ／ｈｒの目標をかなり超過する３０～４５ｍＭ／ｈｒというＣＭＰキナーゼ活性を生むであろう（温度に依存する。表１２）。よって、ＴｔｈＣｍｋをさらなる評価のために選んだ。表１２は、高密度（９０ｇ ｄｃｗ／Ｌ）ライセート中における予測されるＣｍｋ反応速度を示しており、ＴｔｈＣｍｋが総ライセート蛋白質の０．０２％を構成していると想定している。

Figure 0007011599000012
Expression of CMP kinase (encoded by the cmk gene) from E. coli and P. furiosus produced an insoluble protein, while expression of the T. thermophilus enzyme produced a soluble protein under the conditions tested. T. thermophilus CMP kinase showed generally temperature-independent activity, but enzyme activity was slightly reduced above 60 ° C. (Fig. 14). Based on these results, expression of TthCmk in high density lysates at 0.02% of total protein would yield a CMP kinase activity of 30-45 mM / hr, well above the 5.25 mM / hr target. Deaf (depending on temperature, Table 12). Therefore, TthCmk was selected for further evaluation. Table 12 shows the expected Cmk kinetics in high density (90 g dcw / L) lysates, assuming that TthCmk constitutes 0.02% of the total lysate protein.
Figure 0007011599000012

試験されたＣＭＰキナーゼとは対照的に、E. coli、T. thermophilus、およびT. maritimaからのＧＭＰキナーゼの発現は可溶性の組換え体蛋白質を生んだ。E. coli酵素は試験された最も高い比活性を３７℃で有したが、より高温ではより活性でなかった（図１４）。T. thermophilusおよびT. maritima酵素両方は最適活性をより高温で発揮し、一方、T. maritima酵素は全ての試験された温度でより活性であった。ＴｍＧｍｋの測定された比活性に基づくと、総蛋白質の０．１％での高密度細胞ライセート中における発現は、５．２５ｍＭ／ｈｒという目標速度と比較して、過剰なＡＴＰの存在下において７０℃では６０ｍＭ／ｈｒを超過する予想される速度を生むであろう（表１３）。よって、ＴｍＧｍｋをさらなる評価のために選んだ。表１３は高密度（９０ｇ ｄｃｗ／Ｌ）ライセート中における予測されるＧｍｋ反応速度を示しており、ＴｍＧｍｋが総ライセート蛋白質の０．１％を構成していると想定している。

Figure 0007011599000013
Figure 0007011599000014
 In contrast to the CMP kinase tested, expression of GMP kinase from E. coli, T. thermophilus, and T. maritima yielded a soluble recombinant protein. The E. coli enzyme had the highest specific activity tested at 37 ° C, but was less active at higher temperatures (Fig. 14). Both the T. thermophilus and T. maritima enzymes exerted optimal activity at higher temperatures, while the T. maritima enzyme was more active at all tested temperatures. Based on the measured specific activity of TmGmk, expression in high density cell lysates at 0.1% of total protein is 70 in the presence of excess ATP compared to a target rate of 5.25 mM / hr. At ° C, it will produce expected velocities exceeding 60 mM / hr (Table 13). Therefore, TmGmk was selected for further evaluation. Table 13 shows the expected Gmk kinetics in high density (90 g dcw / L) lysates, assuming that TmGmk constitutes 0.1% of the total lysate protein.
Figure 0007011599000013
Figure 0007011599000014

概ね単一の基質に特異的であるＮＭＰキナーゼとは違って、ＮＤＰキナーゼはＡＤＰ、ＣＤＰ、ＵＤＰ、およびＧＤＰをリン酸化する。ＮＤＰキナーゼ同士を比較するために、好熱菌T. thermophilusおよびA. aeolicusからの酵素をクローニングし、E. coliによって発現した。T. thermophilus酵素は試験された条件下において不溶性であったが、一方、A. aeolicus酵素の発現は可溶性蛋白質を生んだ。ＡＴＰおよびＧＤＰを基質として用いたルシフェラーゼアッセイでの活性測定は、ＡａＮｄｋが広い範囲の温度に渡って高度に活性であり、５０℃の至適温度を有するということを明らかにした（図１６）。基質間の比較は、各ヌクレオチドについて５０℃では１００μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇを超過する比活性を明らかにし、ＡａＮｄｋが複数のＮＤＰ基質をリン酸化し得るということを確認した（表１４）。これらの測定に基づくと、０．０１％総蛋白質での高密度ライセート中におけるＡａＮｄｋの発現は、６０ｍＭ／ｈｒをかなり超過するＵＤＰキナーゼ速度に帰着する。２１ｍＭ／ｈｒのＮＤＰキナーゼ活性が１ｇ／Ｌ／ｈｒのｄｓＲＮＡ合成をサポートするために要求されるということに鑑みて、ＡａＮｄｋをさらなる評価のために選んだ。表１４は、５０℃ではＡａＮｄｋがＣＤＰ、ＵＤＰ、およびＧＤＰ基質について高度に活性であるということを示している。

Figure 0007011599000015
Unlike NMP kinase, which is largely specific to a single substrate, NDP kinase phosphorylates ADP, CDP, UDP, and GDP. To compare NDP kinases with each other, enzymes from the thermophiles T. thermophilus and A. aeolicus were cloned and expressed by E. coli. The T. thermophilus enzyme was insoluble under the conditions tested, while the expression of the A. aeolicus enzyme gave rise to soluble proteins. Measurements of activity in a luciferase assay using ATP and GDP as substrates revealed that AaNdk was highly active over a wide range of temperatures and had an optimal temperature of 50 ° C. (FIG. 16). Comparisons between substrates revealed a specific activity of over 100 μmol / min / mg for each nucleotide at 50 ° C., confirming that AaNdk can phosphorylate multiple NDP substrates (Table 14). Based on these measurements, expression of AaNdk in high density lysates with 0.01% total protein results in UDP kinase rates well above 60 mM / hr. AaNdk was selected for further evaluation in view of the fact that 21 mM / hr NDP kinase activity is required to support 1 g / L / hr dsRNA synthesis. Table 14 shows that AaNdk is highly active for CDP, UDP, and GDP substrates at 50 ° C.
Figure 0007011599000015

ポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）は高エネルギーリン酸基を多量体リン酸鎖とアデノシンヌクレオチドとの間で可逆的に転移させる。E. coliならびに好熱生物T. thermophilusおよびThermosynechococcus elongatusからの酵素を包含する、ポリリン酸キナーゼのＩ型ファミリーに属する複数のＰｐｋ酵素を活性について評価した。これらの酵素は、これらが良くキャラクタリゼーションされたＩ型ファミリーに属するか、または活性であることが先に示されていたので、試験のために選択した。Ｐｐｋ酵素の発現および精製は可溶性蛋白質を生んだ。それから、これを、基質としてＡＤＰおよびヘキサメタリン酸ナトリウムを用いて、ルシフェラーゼアッセイシステムによって活性について試験した。図１７に示されているように、全ての試験されたＰｐｋ酵素の比活性は他のキナーゼ活性に対して相対的に低かった。E. coli Ｐｐｋはより低温（最高で６０℃）で最も高い比活性を有し、一方、Thermosynechococcus酵素は７０℃で最も高い活性を有した。加えて、熱不活性化条件（７０℃、１５分間）下におけるE. coli酵素のインキュベーションは不可逆的な不活性化をもたらした（示されていない）。Thermosynechococcus酵素の比活性に基づくと、総蛋白質の２％での高密度ライセート中における発現は、７０℃では、１ｇ／Ｌ／ｈｒ ｄｓＲＮＡ合成をサポートするための要求されるＡＴＰ生産速度にマッチする４２ｍＭ／ｈｒという予想される速度をもたらすであろう（表１５）。しかしながら、より低温（例えば５０℃）での無細胞的ｄｓＲＮＡ合成はＴｅＰｐｋのより高い発現（４％総蛋白質を超過する）を要求するであろう。表１５は高密度（９０ｇ ｄｃｗ／Ｌ）ライセート中における予測されるＰｐｋ反応速度を示しており、ＴｅＰｐｋが総ライセート蛋白質の２％を構成していると想定している。

Figure 0007011599000016
Polyphosphate kinase (Ppk) reversibly transfers high-energy phosphate groups between multimeric phosphate chains and adenosine nucleotides. Multiple Ppk enzymes belonging to the type I family of polyphosphate kinases, including enzymes from E. coli and the thermophiles T. thermophilus and Thermosynechococcus elongatus, were evaluated for activity. These enzymes were selected for testing because they belonged to the well-characterized type I family or were previously shown to be active. Expression and purification of the Ppk enzyme gave rise to soluble protein. It was then tested for activity by the luciferase assay system using ADP and sodium hexametaphosphate as substrates. As shown in FIG. 17, the specific activity of all tested Ppk enzymes was relatively low relative to the activity of other kinases. E. coli Ppk had the highest specific activity at lower temperatures (up to 60 ° C), while the Thermosynechococcus enzyme had the highest activity at 70 ° C. In addition, incubation of E. coli enzyme under heat inactivation conditions (70 ° C., 15 minutes) resulted in irreversible inactivation (not shown). Based on the specific activity of the Thermosynechococcus enzyme, expression in high density lysates at 2% of total protein is 42 mM at 70 ° C., matching the required ATP production rate to support 1 g / L / hr dsRNA synthesis. It will result in the expected speed of / hr (Table 15). However, cell-free dsRNA synthesis at lower temperatures (eg, 50 ° C.) will require higher expression of TePpk (exceeding 4% total protein). Table 15 shows the expected Ppk kinetics in high density (90 g dcw / L) lysates, assuming that TePpk constitutes 2% of the total lysate protein.
Figure 0007011599000016

精製されたシステムにおける各酵素活性を評価した後に、酵素を熱不活性化されたライセート中における活性について試験した。個々のキナーゼを発現するライセートを７０℃で１５分間プレインキュベートした後に、基質を追加した。精製された反応のように、ＡＴＰ消費（ＮＭＰおよびＮＤＰキナーゼについて）またはＡＴＰ生産（ポリリン酸キナーゼについて）を、ルシフェラーゼアッセイキットを用いて定量した。下の表１６に示されているように、ＮＭＰおよびＮＤＰリン酸化の速度は目標をかなり超過する。

Figure 0007011599000017
After evaluating the activity of each enzyme in the purified system, the enzyme was tested for activity in heat-inactivated lysates. After preincubating the lysates expressing the individual kinases at 70 ° C. for 15 minutes, the substrate was added. Like purified reactions, ATP consumption (for NMP and NDP kinases) or ATP production (for polyphosphate kinases) was quantified using the luciferase assay kit. As shown in Table 16 below, the rates of NMP and NDP phosphorylation are well above the target.
Figure 0007011599000017

個々のキナーゼがライセート中において十分に活性である（Ｐｐｋを例外とする）ということを確認した後に、ＮＭＰをＮＴＰに変換するそれらの能力について、キナーゼをマルチ酵素システムによって評価した。これらの研究においては、個々のキナーゼ（５）を発現する同体積のライセートを組み合わせ、熱不活性化し、それから、ＬＣ－ＭＳによってＮＭＰの等モルミックスからのＮＴＰのＡＴＰ依存的生産についてアッセイした。表１７に示されているように、総体的なＮＴＰ生産速度はＵＴＰ、ＣＴＰ、およびＧＴＰについては２４ｍＭ／ｈｒを超過し、ライセートの単純混合物が、反応条件のいずれかの最適化なしに、充分なＡＴＰの存在下において１ｇ／Ｌ／ｈｒ ｄｓＲＮＡの合成をサポートするために十分な速度でＮＴＰを提供し得るということを示唆した。

Figure 0007011599000018

ＲＮＡポリメラーゼの絞り込み After confirming that the individual kinases were sufficiently active in lysates (with the exception of Ppk), the kinases were evaluated by a multi-enzyme system for their ability to convert NMP to NTP. In these studies, equal volumes of lysates expressing the individual kinase (5) were combined, heat-inactivated, and then assayed for ATP-dependent production of NTP from an isomorphic mix of NMP by LC-MS. As shown in Table 17, the overall NTP production rate exceeds 24 mM / hr for UTP, CTP, and GTP, and a simple mixture of lysates is sufficient without any optimization of the reaction conditions. It was suggested that NTP could be provided at a rate sufficient to support the synthesis of 1 g / L / hr dsRNA in the presence of ATP.
Figure 0007011599000018
Narrowing down RNA polymerase

ＲＮＡからＮＭＰへの解重合とＮＭＰからそれらの対応するＮＴＰへのリン酸化との後には、ＮＴＰをｄｓＲＮＡ産物に変換するためにＲＮＡポリメラーゼが要求される。バクテリオファージＴ７からのＲＮＡポリメラーゼは、いくつかの理由から組換え体システムへの使用にとって魅力的な酵素である。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは（細菌および真核生物からの多くのＲＮＡポリメラーゼとは違って）単一のサブユニットを包含し、生化学的および分子生物学研究によって鋭意にキャラクタリゼーションされてきた。加えて、改善された耐熱性を付与する複数のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ変異が記載されている（表１８参照）。

Figure 0007011599000019
After depolymerization of RNA to NMP and phosphorylation of NMP to their corresponding NTP, RNA polymerase is required to convert NTP to dsRNA products. RNA polymerase from bacteriophage T7 is an attractive enzyme for use in recombinant systems for several reasons. T7 RNA polymerase contains a single subunit (unlike many RNA polymerases from bacteria and eukaryotes) and has been enthusiastically characterized by biochemical and molecular biology studies. In addition, multiple T7 RNA polymerase mutations that confer improved thermostability have been described (see Table 18).
Figure 0007011599000019

第１に、市販のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの活性を二重鎖ＤＮＡ鋳型（例えば図３Ｂ）および３７℃の反応温度を用いて評価した。ＲＮＡの生産をＱｕａｎｔ－ｉＴ ＲＮＡキット（ブロードレンジ）（Thermo Fisher Scientific）を用いて経時的に定量した。各製造者が推奨する条件下において、ＴｈｅｒｍｏＴ７およびＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ酵素は高度に活性であり、一方、ＮＥＢ酵素は有意により低い活性を見せた（図１８）。 First, the activity of commercially available T7 RNA polymerase was evaluated using a double-stranded DNA template (eg, FIG. 3B) and a reaction temperature of 37 ° C. RNA production was quantified over time using the Quant-iT RNA kit (Broad Range) (Thermo Fisher Scientific). Under the conditions recommended by each manufacturer, ThermoT7 and MegaScript enzymes were highly active, while NEB enzymes were significantly less active (FIG. 18).

次に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのＬＶＩ変異をＮ末端ヘキサヒスチジンタグと共にクローニングし、E. coliで発現し、ＩＭＡＣを用いて精製した。 Next, the LVI mutation of T7 RNA polymerase was cloned with an N-terminal hexahistidine tag, expressed on E. coli, and purified using IMAC.

次に、ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔおよびＴｈｅｒｍｏＴ７ポリメラーゼの活性を、ＬＶＩ変異ポリメラーゼと並べて、希釈された熱不活性化されたライセート（３５％ライセート終濃度）中において、標準化された反応条件下において試験した（図１９）。精製されたシステムのように、ＴｈｅｒｍｏＴ７は３７℃ではＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ酵素よりも高い比活性を示した（３．１ｎｍｏｌ ＲＮＡ／ｍｉｎ／ｍｇ蛋白質）。ＬＶＩ変異は試験された３つの酵素のうち最も低い比活性（０．３３ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）を有した。さもなければ同一の条件下において５０℃で試験したときには、ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ酵素もＬＶＩ変異もいずれかの検出可能な活性を発揮しなかった。対照的に、ＴｈｅｒｍｏＴ７の活性は３７℃でより高かった。アッセイの総蛋白質のおよそ４％をＴｈｅｒｍｏＴ７ポリメラーゼとして、ＲＮＡ合成速度は二重鎖ＤＮＡ鋳型およびＴｈｅｒｍｏＴ７ポリメラーゼでは５０℃で１１ｇ／Ｌ／ｈｒを超過した（図１９）。そこで、ＴｈｅｒｍｏＴ７をさらなるキャラクタリゼーションのために選択した。 The activities of MegaScript and ThermoT7 polymerase were then tested side by side with the LVI mutant polymerase in diluted, heat-inactivated lysates (35% final lysate concentration) under standardized reaction conditions (FIG. 19). .. Like the purified system, ThermoT7 showed higher specific activity than the MegaScript enzyme at 37 ° C (3.1 nmol RNA / min / mg protein). The LVI mutation had the lowest specific activity (0.33 nmol / min / mg) of the three enzymes tested. Otherwise, neither the MegaScript enzyme nor the LVI mutation exhibited any detectable activity when tested at 50 ° C. under the same conditions. In contrast, ThermoT7 activity was higher at 37 ° C. Approximately 4% of the total protein in the assay was the ThermoT7 polymerase, and the RNA synthesis rate exceeded 11 g / L / hr at 50 ° C. with the double-stranded DNA template and the ThermoT7 polymerase (FIG. 19). Therefore, ThermoT7 was selected for further characterization.

希釈された熱不活性化されたライセート中における５０℃でのＴｈｅｒｍｏＴ７の活性を確認した後に、ＴｈｅｒｍｏＴ７の活性を大規模な無細胞的ｄｓＲＮＡ生産の代表的な条件下において検討した。ライセートの増大した濃度に加えて、大規模な反応は、熱不活性化プロセスに起因する沈殿したライセートコンポーネント（例えば蛋白質）を包含し得る。これらの条件下におけるＴｈｅｒｍｏＴ７の性能を算定するために、ＲＮＡ重合を、熱不活性化後の沈殿した蛋白質を除去するための清澄化ありまたはなしで、熱不活性化された高密度ライセート（６８％ライセート終濃度）中で定量した（図２０）。ＲＮＡ合成速度は緩衝液中よりもマトリックス中において有意に高く、最も高い速度は遠心によって清澄化された熱不活性化されたマトリックスにおいて生じた。清澄化されていない反応では、総体的なＲＮＡ合成速度（２時間反応による）は、アッセイの総蛋白質の１．４％をＴｈｅｒｍｏＴ７ポリメラーゼとして２ｇ／Ｌ／ｈｒを超過した。 After confirming the activity of ThermoT7 at 50 ° C. in diluted heat-inactivated lysates, the activity of ThermoT7 was examined under typical conditions of large-scale cell-free dsRNA production. In addition to the increased concentration of lysate, the large-scale reaction may include precipitated lysate components (eg, proteins) due to the heat inactivation process. To calculate the performance of ThermoT7 under these conditions, RNA polymerization was performed on the heat-inactivated high-density lysate (68) with or without clarification to remove the precipitated protein after heat-inactivation. Quantified in% lysate final concentration) (FIG. 20). RNA synthesis rates were significantly higher in the matrix than in buffer, with the highest rates occurring in the centrifuge-clarified, heat-inactivated matrix. In the unclarified reaction, the overall RNA synthesis rate (due to the 2-hour reaction) exceeded 2 g / L / hr with 1.4% of the total protein in the assay as ThermoT7 polymerase.

最後に、ＴｈｅｒｍｏＴ７の耐熱性をより高温で試験して、このプログラムにおいて以前に確立された熱不活性化条件との適合性を評価した。これらの研究では、ＴｈｅｒｍｏＴ７酵素を上昇した温度（５０～７０℃）で様々な長さの時間（０～１５分）プレインキュベートし、残っている活性を３７℃で定量した。図２１に示されているように、５０℃でのインキュベーションは酵素によって良く耐容性を示すが、より高温はポリメラーゼ活性の急速な不可逆的不活性化をもたらす。よって、これらの実験では、この特定のＴｈｅｒｍｏ Ｔ７は５０～７０℃での熱不活性化とは適合性ではなかった。それゆえに、いくつかの場合には、精製ＴｈｅｒｍｏＴ７酵素が熱不活性化後の無細胞的反応に追加され得、または例えば７０℃で十分な半減期を有する替わりのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ変異体が用いられ得る。
材料および方法
ヌクレオチド分析 Finally, the thermostability of ThermoT7 was tested at higher temperatures to evaluate its compatibility with the previously established thermal inactivation conditions in this program. In these studies, the ThermoT7 enzyme was preincubated at elevated temperatures (50-70 ° C.) for various lengths of time (0-15 minutes) and the remaining activity was quantified at 37 ° C. As shown in FIG. 21, incubation at 50 ° C. is well tolerated by the enzyme, while higher temperatures result in rapid irreversible inactivation of polymerase activity. Thus, in these experiments, this particular Thermo T7 was not compatible with thermal inactivation at 50-70 ° C. Therefore, in some cases, purified ThermoT7 enzyme can be added to the cell-free reaction after heat inactivation, or alternative T7 RNA polymerase variants with sufficient half-life at, for example, 70 ° C. are used. obtain.
material and method
Nucleotide analysis

ヌクレオチド一リン酸（ＡＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、およびＧＭＰ）の分析を液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によって実施した。サンプルは、ＺＩＣ－ｃＨＩＬＩＣカラム（２．１×２０ｍｍ，３μｍ ｉ．ｄ．）（Ｍｅｒｃｋ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣを用いて、室温で、０．５ｍＬ／ｍｉｎの流量および２μＬ注入体積によって分離した。移動相は２０ｍＭ酢酸アンモニウム（Ａ）と９０％アセトニトリル中の２０ｍＭ酢酸アンモニウム（Ｂ）とからなった。分離方法は３．５分間の１５～５０％（Ｂ）の勾配からなり、１．５分間の５０％（Ｂ）、それから３分間の１５％Ｂが後続した。定量は、ＡＢＳｃｉｅｘ ＡＰＩ ３２００質量分析計によって、エレクトロスプレーイオン化（キャピラリー電圧：－３０００Ｖ、温度：６００℃、脱溶媒ガス：２０ｐｓｉ）を用いて複数反応モニター（ＭＲＭ）モードで実施した。ヌクレオチド一リン酸、二リン酸、および三リン酸種（ＮＭＰ、ＮＤＰ、およびＮＴＰ）の分析は、上に記載されている方法を次の分離勾配で用いた：３．５分間の１５％Ｂから５０％Ｂに、続いて２．５ｍｉｎの５０％Ｂ、それから４分間の１５％Ｂが後続する。ピーク面積を、精製化合物（Sigma-Aldrich）からなる標準曲線と比較した。ライセート中のサンプルの分析では、標準曲線を、下に記載されているサンプル調製ステップのように酸クエンチ、清澄化、ｐＨ中和、および濾過したライセートバックグラウンドで作成した。 Analysis of nucleotide monophosphates (AMP, CMP, UMP, and GMP) was performed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Samples were separated at room temperature by 0.5 mL / min flow rate and 2 μL injection volume using an Agilent 1100 Series HPLC equipped with a ZIC-cHILIC column (2.1 × 20 mm, 3 μm id) (Merck). did. The mobile phase consisted of 20 mM ammonium acetate (A) and 20 mM ammonium acetate (B) in 90% acetonitrile. The separation method consisted of a gradient of 15-50% (B) for 3.5 minutes, followed by 50% (B) for 1.5 minutes, followed by 15% B for 3 minutes. Quantification was performed in multiple reaction monitor (MRM) mode using electrospray ionization (capillary voltage: -3000 V, temperature: 600 ° C., desolvent gas: 20 psi) with an ABSix API 3200 mass spectrometer. Analysis of nucleotide monophosphate, diphosphate, and triphosphate species (NMP, NDP, and NTP) used the method described above with the following separation gradient: 15% B for 3.5 minutes. To 50% B, followed by 2.5 min of 50% B, followed by 4 minutes of 15% B. The peak area was compared with a standard curve consisting of purified compound (Sigma-Aldrich). For analysis of samples in lysates, standard curves were created in acid quenching, clarification, pH neutralization, and filtered lysate backgrounds as in the sample preparation steps described below.

２’、３’、および５’－ＮＭＰの分析は、ACQUITY CSHフルオロフェニルカラム（２．１×１５０ｍｍ，１．７μｍ ｉ．ｄ．）（Ｗａｔｅｒｓ）を備えたACQUITY HクラスＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）を用いる液体クロマトグラフィーによって、４０℃で、０．５ｍＬ／ｍｉｎの流量および０．５μＬ注入体積によって実施した。移動相は、０．２％ギ酸中の１０ｍＭ酢酸アンモニウム（Ａ）および９５％アセトニトリル，０．２％ギ酸中の１０ｍＭ酢酸アンモニウム（Ｂ）からなった。分離方法は２．８分間の１％Ｂからなり、２．２分間のｌ％～３０％Ｂの勾配が後続し、７分間の１００％Ｂ、それから３分間の１％Ｂが後続した。定量を、ACQUITY UPLC PDA（Waters）を用いて２６０、２５４、および２１０ｎｍで実施した。ピーク面積を、精製化合物（Biolog Life Science Instituteから購入した２’および３’ＣＭＰ、ＵＭＰ、およびＧＭＰを例外として、Sigma-Aldrichから購入）からなる標準曲線と比較した。ライセート中のサンプルの分析では、標準曲線を、下に記載されているサンプル調製ステップのように酸クエンチ、清澄化、ｐＨ中和、および濾過したライセートバックグラウンドで作成した。
E. coli ＲＮＡの抽出および精製 Analysis of 2', 3', and 5'-NMP uses an ACQUITY H-class UPLC (Waters) equipped with an ACQUITY CSH fluorophenyl column (2.1 x 150 mm, 1.7 μm id) (Waters). It was performed by liquid chromatography at 40 ° C. with a flow rate of 0.5 mL / min and a 0.5 μL injection volume. The mobile phase consisted of 10 mM ammonium acetate (A) in 0.2% formic acid and 95% acetonitrile, 10 mM ammonium acetate (B) in 0.2% formic acid. The separation method consisted of 1% B for 2.8 minutes, followed by a gradient of l% -30% B for 2.2 minutes, followed by 100% B for 7 minutes, followed by 1% B for 3 minutes. Quantification was performed using an ACQUITY UPLC PDA (Waters) at 260, 254, and 210 nm. The peak area was compared to a standard curve consisting of purified compounds (purchased from Sigma-Aldrich with the exception of 2'and 3'CMP, UMP, and GMP purchased from the Biolog Life Science Institute). For analysis of samples in lysates, standard curves were created in acid quenching, clarification, pH neutralization, and filtered lysate backgrounds as in the sample preparation steps described below.
Extraction and purification of E. coli RNA

ＲＮＡを確立されたプロトコールに従って高密度E. coliライセート（蛋白質濃度：４０～５０ｍｇ／ｍＬ）から抽出および精製した（Mohanty, B. K., Giladi, H., Maples, V. F., & Kushner, S. R. (2008). Analysis of RNA decay, processing, and polyadenylation in Escherichia coli and other prokaryotes. Methods in enzymology, 447, 3-29）。凍結E. coliライセートの４００μＬ毎に、６７μＬの２０ｍＭ酢酸を追加してＲＮａｓｅ活性を低減した。サンプルをビーズバス中において３７℃で融解した。融解直後に、トリメチル（テトラデシル）アンモニウムブロミド（Sigma-Aldrich）の１０％（ｗ／ｖ）溶液の４００μＬを追加した。それから、もたらされた懸濁液を４℃におけるマイクロ遠心機による１０，０００×ｇでの遠心によって清澄化し、上清を除去した。ペレットを３５％エタノール中の塩化リチウム（Sigma-Aldrich）の２Ｍ溶液の１ｍＬ中に再懸濁した。懸濁液を室温で５分間インキュベートし、それから４℃における６分間の１５，０００×ｇでの遠心によって清澄化し、上清を除去した。それから、ペレットを水中の塩化リチウムの２Ｍ溶液の１ｍＬ中に再懸濁し、６分間の１５，０００×ｇでの清澄化前に室温で２分間インキュベートした。それから上清を除去し、残っているペレットを、７０％エタノール中への再懸濁と４℃における５分間の最大スピード（２１，０００×ｇ）での遠心とによって洗浄した。それから上清を除去し、ペレットを室温で１５分間風乾した。それから、ペレットを２００μＬヌクレアーゼ不含水中に再懸濁し、４℃で一晩インキュベートしてＲＮＡを可溶化した。ＲＮＡ溶液を遠心（４℃での５分間の最大スピード）によって清澄化し、可溶性ＲＮＡを含有する上清を無菌のＲＮａｓｅ不含チューブに移し、－２０℃で保存した。
ヌクレアーゼの絞り込み RNA was extracted and purified from high density E. coli lysate (protein concentration: 40-50 mg / mL) according to an established protocol (Mohanty, BK, Giladi, H., Maples, VF, & Kushner, SR (2008). Analysis of RNA decay, processing, and polyadenylation in Escherichia coli and other prokaryotes. Methods in enzymology, 447, 3-29). For every 400 μL of frozen E. coli lysate, 67 μL of 20 mM acetic acid was added to reduce RNase activity. The sample was thawed in a bead bath at 37 ° C. Immediately after thawing, 400 μL of a 10% (w / v) solution of trimethyl (tetradecyl) ammonium bromide (Sigma-Aldrich) was added. The resulting suspension was then clarified by centrifugation at 10,000 xg with a microcentrifuge at 4 ° C. and the supernatant was removed. The pellet was resuspended in 1 mL of a 2M solution of lithium chloride (Sigma-Aldrich) in 35% ethanol. The suspension was incubated at room temperature for 5 minutes and then clarified by centrifugation at 15,000 xg for 6 minutes at 4 ° C. to remove the supernatant. The pellet was then resuspended in 1 mL of a 2M solution of lithium chloride in water and incubated for 2 minutes at room temperature prior to clarification at 15,000 xg for 6 minutes. The supernatant was then removed and the remaining pellets were washed by resuspension in 70% ethanol and centrifugation at 4 ° C. for 5 minutes at maximum speed (21,000 xg). The supernatant was then removed and the pellet was air dried at room temperature for 15 minutes. The pellet was then resuspended in 200 μL nuclease-free water and incubated overnight at 4 ° C to solubilize RNA. The RNA solution was clarified by centrifugation (maximum speed for 5 minutes at 4 ° C.) and the supernatant containing soluble RNA was transferred to sterile RNase-free tubes and stored at −20 ° C.
Nuclease narrowing down

ヌクレアーゼは次の商業的供給源から得た：ベンゾナーゼおよびヌクレアーゼＰ１はSigma-Aldrichから得、ＲＮａｓｅ Ｒ、ターミネーターエキソヌクレアーゼ、およびＲＮａｓｅ ＩＩＩはEpicentreから得、ＲＮａｓｅ ＡはThermo Fisherから得、エキソヌクレアーゼＴはNew England BioLabsから得た。スクリーニングアッセイのためには、各酵素溶液の１μＬを２×アッセイ緩衝液（１００ｍＭ リン酸カリウムｐＨ７．４、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ塩化亜鉛）の１００μＬに追加し、それから時間ｔ＝０において等体積の１ｍＭ ＲＮＡ溶液（～３４０ｎｇ／μＬ）と組み合わせ、良く混合した。反応を３７℃でインキュベートし、２０μＬを氷上の酸クエンチ溶液（１８０μＬの０．２Ｍ硫酸）に移すことによって定期的にサンプリングした。時系列の完了後に、クエンチされたサンプルを４℃における５分間の３，０００×ｇでの遠心によって清澄化した。それから、各サンプルからの上清の１７０μＬをＵＶ透明９６ウェルハーフエリアプレート（Corning）に移し、酸可溶性のヌクレオチドを、マイクロプレートリーダーと各モノヌクレオチドの個々の減衰係数を平均することによって概算された１０６６５Ｍ－１ｃｍ－１の減衰係数とを用いて、２６０ｎｍの吸光度によって定量した。ＬＣ－ＭＳによるその後の分析のために、４５μＬの清澄化された上清を５μＬの２．５Ｍ水酸化カリウムによってｐＨ中和した。トータルヌクレオチドプール（すなわち１００％解重合）をＲＮＡのアルカリ加水分解によって決定した：ＲＮＡを等体積の０．２Ｍ水酸化カリウムと組み合わせ、それから９９℃に２０分間加熱した。それから、アルカリ加水分解されたサンプルをクエンチし、上に記載されているように分析した。
蛋白質発現および精製 Nucleases were obtained from the following commercial sources: benzoases and nucleases P1 from Sigma-Aldrich, RNase R, terminator exonucleases, and RNase III from Epicentre, RNase A from Thermo Fisher, and exonuclease T from Thermo Fisher. Obtained from New England BioLabs. For the screening assay, 1 μL of each enzyme solution is added to 100 μL of 2 × assay buffer (100 mM potassium phosphate pH 7.4, 10 mM magnesium chloride, 1 mM zinc chloride) and then in equal volume at time t = 0. Combined with 1 mM RNA solution (~ 340 ng / μL) and mixed well. The reaction was incubated at 37 ° C. and sampled periodically by transferring 20 μL to acid quench solution on ice (180 μL 0.2 M sulfuric acid). After completion of the time series, the quenched sample was clarified by centrifugation at 3,000 xg for 5 minutes at 4 ° C. 170 μL of supernatant from each sample was then transferred to a UV clear 96-well half area plate (Corning) and acid-soluble nucleotides were estimated by averaging the individual attenuation coefficients of each mononucleotide with a microplate reader. Quantified by absorbance at 260 nm using a decay coefficient of 10665 M -1 cm -1 . For subsequent analysis by LC-MS, 45 μL of the clarified supernatant was pH neutralized with 5 μL of 2.5 M potassium hydroxide. The total nucleotide pool (ie, 100% depolymerization) was determined by alkaline hydrolysis of RNA: RNA was combined with an equal volume of 0.2 M potassium hydroxide and then heated to 99 ° C. for 20 minutes. The alkaline hydrolyzed sample was then quenched and analyzed as described above.
Protein expression and purification

組換え体蛋白質を、ヘキサヒスチジンタグと併せて当該遺伝子をコードする合成ＤＮＡからｐＥＴＤｕｅｔ－１（Novagen）にクローニングした。プラスミドをE. coli Ｔ７Ｅｘｐｒｅｓｓ（New England Biolabs）に形質転換し、それから、１Ｌ培養によって、５０μｇ／ｍＬカルベニシリンを添加したＺＹＭ－５０５培地（Studier, F. W. (2005). Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein expression and purification, 41(1), 207-234）を用いて増殖させた。発現をＡ６００＝０．６において誘導した。ＲＮａｓｅ Ｒおよびキナーゼについては、０．１ｍＭ ＩＰＴＧによって発現を誘導し、温度を１６℃に下げ、培養物は１６℃で２４時間増殖させた。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼについては、０．８ｍＭ ＩＰＴＧによって発現を誘導し、培養物は３７℃で３時間増殖させた。バイオマスを遠心によって収穫し、上清を傾瀉した後に、細胞ペレットを－８０℃で保存した。細胞ペレットを融解し、ベンゾナーゼ（０．０４μＬ／ｍＬ）を添加した４体積のＢ－ＰＥＲ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Thermo Fisher Scientific）中への再懸濁と、穏やかな振盪をしながらの室温における１５分間のインキュベーションとによって溶解した。それから、ライセートを４℃における１時間の１６，０００×ｇでの遠心によって清澄化した。ＡＫＴＡPrime Plus FPLCシステム（GE Healthcare）に接続されたＨｉｓ ＧｒａｖｉＴｒａｐカラム（GE Healthcare）またはＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムを用いる固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって、蛋白質を精製した。両方の精製方法について、カラムを平衡化／洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）によって平衡化し、ライセートをローディングし、それから３０カラム体積の平衡化／洗浄緩衝液によって洗浄した。溶出緩衝液（５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）によって蛋白質を溶出した。キナーゼの精製のためには、平衡化／洗浄および溶出緩衝液はリン酸緩衝液の代わりに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５を用いた。溶出画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、蛋白質含量をＢＣＡ（Thermo Fisher Scientific）によって定量した。それから、画分を組み合わせ、緩衝液を１０００体積の２×保存緩衝液による透析によって交換した。ＲＮａｓｅ Ｒについては、２×保存緩衝液は追加の５００ｍＭ ＮａＣｌを添加した２×ＰＢＳからなった。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼについては、２×保存緩衝液は２×ＰＢＳからなった。キナーゼについては、２×保存緩衝液は１００ｍＭ ＮａＣｌを有する１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．０からなった。透析後に、蛋白質を等体積の１００％グリセロールと混合し（５０％終濃度）、－２０℃で保存した。
細胞ライセート調製 The recombinant protein was cloned into pETDuet-1 (Novagen) from the synthetic DNA encoding the gene in combination with the hexahistidine tag. The plasmid was transformed into E. coli T7Express (New England Biolabs) and then by 1 L culture, ZYM-505 medium supplemented with 50 μg / mL carbenicillin (Studier, FW (2005). Protein production by auto-induction in high- It was grown using density shaking cultures. Protein expression and purification, 41 (1), 207-234). Expression was induced at A 600 = 0.6. For RNase R and kinase, expression was induced by 0.1 mM IPTG, the temperature was lowered to 16 ° C, and the culture was grown at 16 ° C for 24 hours. For T7 RNA polymerase, expression was induced by 0.8 mM IPTG and the culture was grown at 37 ° C. for 3 hours. Biomass was harvested by centrifugation, the supernatant was tilted, and then the cell pellet was stored at −80 ° C. Resuspension of cell pellet in 4 volumes of B-PER Complete (Thermo Fisher Scientific) supplemented with benzoase (0.04 μL / mL) and incubation at room temperature for 15 minutes with gentle shaking. Dissolved by. The lysate was then clarified by centrifugation at 16,000 xg for 1 hour at 4 ° C. Proteins were purified by immobilized metal affinity chromatography using a His GraviTrap column (GE Healthcare) or a HisTrap HP column connected to the AKTA Prime Plus FPLC system (GE Healthcare). For both purification methods, the column is equilibrated with equilibration / wash buffer (50 mM phosphate buffer pH 7.4, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole), loaded with lysate, and then 30 column volumes of equilibration / wash buffer. Washed by. The protein was eluted with elution buffer (50 mM phosphate buffer pH 7.4, 500 mM NaCl, 500 mM imidazole). For kinase purification, 50 mM Tris-HCl pH 7.5 was used as the equilibration / wash and elution buffer instead of phosphate buffer. The eluted fraction was analyzed by SDS-PAGE and the protein content was quantified by BCA (Thermo Fisher Scientific). The fractions were then combined and the buffer was replaced by dialysis with 1000 volumes of 2x storage buffer. For RNase R, the 2 x storage buffer consisted of 2 x PBS supplemented with an additional 500 mM NaCl. For T7 RNA polymerase, 2 x storage buffer consisted of 2 x PBS. For kinases, 2 × storage buffer consisted of 100 mM Tris-HCl pH 7.0 with 100 mM NaCl. After dialysis, the protein was mixed with an equal volume of 100% glycerol (50% final concentration) and stored at −20 ° C.
Cell lysate preparation

E. coli株ＧＬ１６－１７０（ＢＬ２１（ＤＥ３）．ｔ５２６ｐｇｉ．Δｅｄｄ．ΔｔｋｔＢ．ΔｔｏｌＣ＿ｗｔ－７－Ｅ１．ΔｍｇｓＡ＊－Ｆ３．ΔａｐｐＡ＊．Δａｍｎ＊－Ｆ１．ｎａｇＤ（ｋｅｉｏ）：：ｚｅｏＲ－１．ΔｐｈｏＡ＊．ｔ３５２ＢＡＡ１６４４．ΔｕｓｈＡ＊－Ｃ４．ｒｎａ：：ｔｏｌＣ－Ｂ０４）およびＧＬ１４－３２２（ＢＬ２１（ＤＥ３）．ｔ５２６ｐｇｉ．Δｅｄｄ．ΔｔｋｔＢ．ΔｔｏｌＣ＿ｗｔ－７－Ｅ１．ΔｍｇｓＡ＊－Ｆ３．ΔａｐｐＡ＊．Δａｍｎ＊－Ｆ１．ｎａｇＤ（ｋｅｉｏ）：：ｚｅｏＲ－１．ΔｐｈｏＡ＊．ｔ３５２ＢＡＡ１６４４．ΔｕｓｈＡ：：ｔｏｌＣ－Ａ０１）を、Ｋｏｒｚ培地によって１０Ｌバイオリアクター内でバッチ段階の終わりまで増殖させ、それから遠心によって収穫し、－８０℃で凍結した。ペレットを１０％乾燥細胞重量になるよう５８．８ｍＭ二塩基性リン酸カリウム中に再懸濁し、１５，０００ｐｓｉで４℃に冷却されたPandaPLUSホモジナイザー（GEA Niro Soavi）による２パスを用いて溶解した。ライセートを４℃における１時間の１６，０００×ｇでの遠心によって清澄化し、蛋白質含量を－８０℃での保存前にＢＣＡアッセイ（Thermo Fisher）によって分析した。
外来性ＲＮａｓｅ ＲによるライセートＲＮＡの解重合 E. coli strain GL16-170 (BL21 (DE3) .t526pgi.Δedd.ΔtktB.ΔtorC_wt-7-E1.ΔmgsA * -F3.ΔappA *. Δamn * -F1.nagD (keio) :: zeoR-1.ΔphoA * .T352BAA1644.ΔushA * -C4.rna :: trolC-B04) and GL14-322 (BL21 (DE3) .t526 pgi. nagD (keio) :: zeoR-1.ΔphoA * .t352BAA1644.ΔushA :: torC-A01) was grown in Korz medium in a 10 L bioreactor until the end of the batch stage, then harvested by centrifugation and at -80 ° C. Frozen. The pellet was resuspended in 58.8 mM potassium dibasic phosphate to a 10% dry cell weight and lysed using 2 passes with a PandaPLUS homogenizer (GEA Niro Soavi) cooled to 4 ° C. at 15,000 psi. .. Lysates were clarified by centrifugation at 16,000 xg for 1 hour at 4 ° C. and protein content was analyzed by BCA assay (Thermo Fisher) prior to storage at −80 ° C.
Depolymerization of lysate RNA by exogenous RNase R

ＧＬ１６－１７０ライセート（蛋白質含量３４．５ｍｇ／ｍＬ）およびＲＮａｓｅ Ｒ溶液（３００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．４，２００ｍＭ ＫＣ１，２ｍＭ ＭｇＣｌ２中に１ｍｇ／ｍＬ）を２℃で予め平衡化した後に、反応を開始した。時間ｔ＝０において、５０μＬのE. coliライセートおよび５０μＬ ＲＮａｓｅ Ｒ溶液を混合し、予熱された３７℃ブロックに移すことによって反応を開始した。ライセートを水中の５×デオキシコール酸ナトリウム溶液の０．２体積と予め混合し、開始前に２℃で１５分間インキュベートしたことを例外として、デオキシコール酸を包含する反応を上に記載されているようにアセンブリした。開始後に、反応を３７℃でインキュベートし、１０μＬを氷上の酸クエンチ溶液（９０μＬの０．２Ｍ硫酸）に移すことによって定期的にサンプリングした。時系列の完了後に、クエンチされたサンプルを２℃における１０分間の３，２００×ｇでの遠心によって清澄化した。解重合を第１に酸可溶性のヌクレオチドの吸光度によって定量した：クエンチおよび清澄化された反応の１０μＬをＵＶ透明９６ウェルハーフエリアプレート（Corning）上で１６０μＬの０．２Ｍ硫酸に追加した。酸可溶性のヌクレオチドを、マイクロプレートリーダーを用いて２６０ｎｍの吸光度によって定量した（上参照）。解重合は５’、２’、および３’ＮＭＰのＵＰＬＣ分析によってもまた定量した：各酸クエンチされたサンプルの３０μＬを、１０μＬの１Ｍ ＫＯＨを追加することによってｐＨ中和し、それから、ＵＰＬＣ分析前に０．２μｍフィルターに通した。トータルヌクレオチドプール（すなわち１００％解重合）をライセートＲＮＡのアルカリ加水分解によって決定した：５０μＬライセートを１５０μＬの０．２Ｍ水酸化カリウムと組み合わせ、それから９９℃で２０分間加熱した。それから、アルカリ加水分解されたサンプルを上に記載されているようにクエンチし、分析した。
過剰発現されたＲＮａｓｅ Ｒによるライセート中のＲＮＡの解重合 After pre-equilibrating GL16-170 lysate (protein content 34.5 mg / mL) and RNase R solution (300 mM potassium phosphate buffer pH 7.4,200 mM KC1,2 mM MgCl 2 in 1 mg / mL) at 2 ° C. The reaction was started. At time t = 0, the reaction was initiated by mixing 50 μL E. coli lysate with 50 μL RNase R solution and transferring to a preheated 37 ° C. block. Reactions involving deoxycholic acid are described above, with the exception of premixing lysate with 0.2 volumes of 5 x sodium deoxycholic acid solution in water and incubating at 2 ° C. for 15 minutes prior to initiation. Assembled as. After initiation, the reaction was incubated at 37 ° C. and 10 μL was sampled periodically by transferring to an acid quench solution on ice (90 μL 0.2 M sulfuric acid). After completion of the time series, the quenched sample was clarified by centrifugation at 3,200 xg for 10 minutes at 2 ° C. Depolymerization was first quantified by the absorbance of acid-soluble nucleotides: 10 μL of the quenched and clarified reaction was added to 160 μL of 0.2 M sulfuric acid on a UV clear 96-well half area plate (Corning). Acid-soluble nucleotides were quantified by absorbance at 260 nm using a microplate reader (see above). Depolymerization was also quantified by UPLC analysis of 5', 2', and 3'NMP: 30 μL of each acid-quenched sample was pH neutralized by adding 10 μL of 1 M KOH and then UPLC analysis. It was previously passed through a 0.2 μm filter. Total nucleotide pools (ie 100% depolymerization) were determined by alkaline hydrolysis of lysate RNA: 50 μL lysate was combined with 150 μL 0.2 M potassium hydroxide and then heated at 99 ° C. for 20 minutes. Alkaline hydrolyzed samples were then quenched and analyzed as described above.
Depolymerization of RNA in lysates by overexpressed RNase R

E. coli株ＧＬ１６－１７０を、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグを有するE. coli ｒｎｒ遺伝子をコードするｐＥＴＤｕｅｔ－１によって形質転換した。この株を、空のｐＥＴＤｕｅｔ－１によって形質転換されたＧＬ１６－１７０と並べて、５０ｍｇ／Ｌカルベニシリンを添加したＫｏｒｚ培地によってバッチ段階で増殖させた。培養物をＡ６００＝２０において０．８ｍＭ ＩＰＴＧによって誘導し、誘導時に追加の１０ｇ／Ｌグルコースを添加した。誘導の１時間後に、バイオマスを遠心によって収穫し、凍結した。ライセートを上に記載されているように凍結されたバイオマスから調製した（蛋白質濃度：空のｐＥＴＤｕｅｔ－１を有するＧＬ１６－１７０バイオマスでは３６．６ｍｇ／ｍＬ；クローニングされたＲＮａｓｅ Ｒを持つｐＥＴＤｕｅｔ－１を有するＧＬ１６－１７０では５３．２ｍｇ／ｍＬ）。希釈ライセート中における解重合を、反応中の５０％ライセート終濃度について上に記載されているように算定した。濃縮されたライセート中における解重合を、９体積のライセートを１体積の１０×ＥＤＴＡ溶液と２℃で５分間プレインキュベートすることによって算定した。それから、上に記載されているように予熱された３７℃ブロックに移すこととサンプリングすることとによって、反応を開始した。
ＮＭＰ安定性算定 E. coli strain GL16-170 was transformed with pETDuet-1, which encodes the E. coli rnr gene with a C-terminal hexahistidine tag. This strain was grown in batch stages on Korz medium supplemented with 50 mg / L carbenicillin alongside GL16-170 transformed with empty pETDuet-1. Cultures were induced with 0.8 mM IPTG at A 600 = 20 and an additional 10 g / L glucose was added at the time of induction. One hour after induction, the biomass was harvested by centrifugation and frozen. Lysate was prepared from frozen biomass as described above (protein concentration: 36.6 mg / mL for GL16-170 biomass with empty pETDuet-1; pETDuet-1 with cloned RNase R. With GL16-170, it has 53.2 mg / mL). Depolymerization in diluted lysates was calculated for the final concentration of 50% lysates during the reaction as described above. Depolymerization in concentrated lysates was calculated by preincubating 9 volumes of lysates with 1 volume of 10 × EDTA solution at 2 ° C. for 5 minutes. The reaction was then initiated by transferring to a preheated 37 ° C. block and sampling as described above.
NMP stability calculation

４体積のＧＬ１４－３２２ライセート（蛋白質濃度：５０．５ｍｇ／ｍＬ）を１体積のホスファターゼ阻害剤溶液（５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．４， １５０ｍＭ リン酸カリウムｐＨ７．４、または１０ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウムという終濃度）と氷上で組み合わせた。同位体標識したＮＭＰ（アデノシン－１３Ｃ１０，１５Ｎ５ ５’－一リン酸、シチジン－１５Ｎ３－５’－一リン酸、ウリジン－１５Ｎ２－５’－一リン酸、およびグアノシン－１５Ｎ５－５’－一リン酸［Sigma-Aldrich］、各２５ｍＭ）の等モル溶液を水中に調製した。ライセートおよびＮＭＰを３７℃に１０分間平衡化した後に、反応を開始した。反応を開始するためには、９０μＬライセート溶液を１０μＬＮＭＰ溶液に追加し、反応を良く混合した。反応は指定されているタイムポイントにおけるサンプリングによってモニターした。サンプリングの間には、反応混合物の１２μＬを氷上の１０８μＬの０．２Ｍ硫酸に移した。それから、クエンチされた反応を、上に記載されているようにＬＣ－ＭＳ分析のために遠心によって清澄化、ｐＨ中和、および濾過した。
熱不活性化の開発 4 volumes of GL14-322 lysate (protein concentration: 50.5 mg / mL) in 1 volume of phosphatase inhibitor solution (50 mM potassium phosphate pH 7.4, 150 mM potassium phosphate pH 7.4, or 10 mM sodium orthovanadate) Concentration) and combined on ice. Isotope-labeled NMPs (adenosin- 13 C 10 , 15 N 5 5'-monophosphate, citidine- 15 N 3-5' -monophosphate, uridine- 15 N 2-5' -monophosphate, and guanosine An equimolar solution of -15 N 5-5' -monophosphate [Sigma-Aldrich], 25 mM each) was prepared in water. The reaction was initiated after equilibration of lysate and NMP at 37 ° C. for 10 minutes. To initiate the reaction, 90 μL lysate solution was added to the 10 μL NMP solution and the reaction was mixed well. The reaction was monitored by sampling at the specified time point. During sampling, 12 μL of the reaction mixture was transferred to 108 μL 0.2 M sulfuric acid on ice. The quenched reaction was then clarified, pH neutralized, and filtered by centrifugation for LC-MS analysis as described above.
Development of thermal inactivation

ＧＬ１４－３２２ライセートを氷上の５つのマイクロ遠心チューブに分注し、それから、所望の熱不活性化温度で平衡化されたヒートブロックに移した。指定されている時間において、チューブを氷上で冷却し、それから遠心（５分間の２１，０００×ｇ）によって清澄化し、上清を収穫した。熱不活性化されたライセートからの上清を、ＮＴＰの等モル混合物（Sigma-Aldrich、各２５ｍＭ）と共に３７℃で１０分間平衡化した。時間ｔ＝０において、９体積の熱不活性化されたライセート上清を１体積のＮＴＰ溶液と組み合わせ、反応を上に記載されているように酸クエンチ溶液中へのサンプリングによってモニターし、ｐＨ中和し、濾過し、ＬＣ－ＭＳによって分析した。ライセート中における転写反応では、酵素ミックスの低減された量（最終反応体積の５％）と熱不活性化されたライセート上清（最終反応体積の４０％）を包含することとを例外として、１０μＬ反応をキット取扱説明にならってＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ Ｔ７転写キット（Thermo Fisher）を用いて実施した。正のコントロール反応はＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ反応緩衝液単独の中で実施し、一方、負のコントロール反応はライセートを包含したが、酵素ミックスを省いた。反応を１ｋｂ ＤＮＡラダー（New England Biolabs）と並べて、SYBR Safe（Invitrogen）によって染色したアガロースゲル電気泳動によって分析した。
ヌクレオチドキナーゼ活性アッセイ The GL14-322 lysates were dispensed into 5 microcentrifuge tubes on ice and then transferred to a heat block equilibrated at the desired heat inactivation temperature. At the specified time, the tubes were cooled on ice and then clarified by centrifugation (21,000 xg for 5 minutes) and the supernatant was harvested. The supernatant from the heat-inactivated lysate was equilibrated with an equimolar mixture of NTP (Sigma-Aldrich, 25 mM each) at 37 ° C. for 10 minutes. At time t = 0, 9 volumes of the heat-inactivated lysate supernatant were combined with 1 volume of the NTP solution and the reaction was monitored by sampling into an acid quench solution as described above in pH. It was summed, filtered and analyzed by LC-MS. Transcription reactions in lysates are 10 μL, with the exception of including a reduced amount of enzyme mix (5% of final reaction volume) and heat-inactivated lysate supernatant (40% of final reaction volume). The reaction was carried out using the MegaScript T7 transcription kit (Thermo Fisher) according to the kit instruction manual. Positive control reactions were performed in MegaScript reaction buffer alone, while negative control reactions included lysates but omitted the enzyme mix. Reactions were analyzed side by side with a 1 kb DNA ladder (New England Biolabs) by agarose gel electrophoresis stained with SYBR Safe (Invitrogen).
Nucleotide kinase activity assay

ヌクレオチドキナーゼを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．０、４ｍＭ ＭｇＳＯ４、４ｍＭ ＡＴＰ、および４ｍＭの対応するＮＭＰまたはＮＤＰからなる緩衝液中において、様々な温度（３７℃、５０℃、６０℃、７０℃、および８０℃）でアッセイした。反応緩衝液（１．２×濃縮液）および酵素溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）を反応温度で１分間予め平衡化した後に、反応を開始した。時間ｔ＝０において、８０μＬ反応緩衝液を２０μＬ酵素と混合することによって反応を開始した。反応は指定されているタイムポイントにおけるサンプリングによってモニターした。サンプリングの間には、反応混合物の１５μＬを氷上の１３５μＬの０．２Ｍ硫酸に移した。反応の完了後に、サンプルを上に記載されているように１Ｍ ＫＯＨによってｐＨ中和し、それから氷冷水によって１：１０希釈した。キット取扱説明にならってＡＴＰ生物発光アッセイキット（Sigma-Aldrich）を用いて各サンプル中のＡＴＰを定量した。ライセート中における反応のために、上のプロトコールを次のように修飾した：ライセートを個々の反応チューブに分注し、それから１５分間の７０℃でのインキュベーションによって熱不活性化した。反応緩衝液（２×濃縮液）および熱不活性化されたライセートを反応温度で予め平衡化し、ライセートおよび反応緩衝液の等体積同士を組み合わせることによって反応を開始した。反応は個々の反応チューブを９体積の酸クエンチ溶液によってクエンチすることによってサンプリングし、それから上に記載されているように分析した。 Nucleotide kinases are placed at various temperatures (37 ° C, 50 ° C, 60 ° C, 70 ° C,) in a buffer consisting of 50 mM Tris-HCl pH 7.0, 4 mM ו 4 , 4 mM ATP, and 4 mM corresponding NMP or NDP. And 80 ° C.). The reaction was started after pre-equilibriumizing the reaction buffer (1.2 x concentrate) and enzyme solution (0.5 mg / mL) at the reaction temperature for 1 minute. At time t = 0, the reaction was initiated by mixing 80 μL reaction buffer with 20 μL enzyme. The reaction was monitored by sampling at the specified time point. During sampling, 15 μL of the reaction mixture was transferred to 135 μL of 0.2 M sulfuric acid on ice. After completion of the reaction, the sample was pH neutralized with 1 M KOH as described above and then diluted 1:10 with ice cold water. ATP in each sample was quantified using the ATP bioluminescence assay kit (Sigma-Aldrich) according to the kit instruction manual. For the reaction in lysate, the above protocol was modified as follows: lysate was dispensed into individual reaction tubes and then heat inactivated by incubation at 70 ° C. for 15 minutes. The reaction buffer (2 x concentrate) and the heat-inactivated lysate were pre-equilibriumized at the reaction temperature and the reaction was initiated by combining equal volumes of lysate and reaction buffer. Reactions were sampled by quenching individual reaction tubes with 9 volumes of acid quenching solution and then analyzed as described above.

ライセート中のキナーゼの組み合わせられた（すなわち、ＮＭＰからＮＴＰへの）活性をアッセイするために、各キナーゼを個々に発現するライセート同士を１：１比で混合し、１０μＬアリコートに分割し、それから上に記載されているように熱不活性化した。キナーゼ活性は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．０、１６ｍＭ ＭｇＳＯ４、２ｍＭ各ヌクレオチド一リン酸（ＡＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、およびＧＭＰ）、および１６ｍＭ ＡＴＰからなる緩衝液中において分析した。反応温度で予め平衡化した反応緩衝液（２×濃縮液）を等体積のライセートと組み合わせて、反応を開始した。反応は７０℃で実施し、個々の反応チューブを９体積の酸クエンチ溶液によってクエンチすることによってサンプリングし、それから上に記載されているように分析した。
ポリリン酸キナーゼ活性アッセイ To assay the combined (ie, NMP to NTP) activity of the kinases in the lysates, the lysates expressing each kinase individually were mixed in a 1: 1 ratio, split into 10 μL aliquots, and then above. Heat-inactivated as described in. Kinase activity was analyzed in buffer consisting of 50 mM Tris-HCl pH 7.0, 16 mM ו 4 , 2 mM each nucleotide monophosphate (AMP, CMP, UMP, and GMP), and 16 mM ATP. The reaction was initiated by combining a reaction buffer (2 x concentrate) pre-equilibrium at the reaction temperature with an equal volume of lysate. The reaction was performed at 70 ° C. and individual reaction tubes were sampled by quenching with 9 volumes of acid quenching solution and then analyzed as described above.
Polyphosphate kinase activity assay

ポリリン酸キナーゼを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．０、４ｍＭ ＭｇＳＯ４、２５ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｍＭ ＡＤＰ、および１ｍＭヘキサメタリン酸ナトリウムからなる緩衝液中において、様々な温度（３７℃、５０℃、６０℃、７０℃、および８０℃）でアッセイした。反応緩衝液（１．２×濃縮液）および酵素溶液（０．２５ｍｇ／ｍＬ）を反応温度で１分間予め平衡化した後に、反応を開始した。時間ｔ＝０において、８０μＬ反応緩衝液を２０μＬ酵素と混合することによって反応を開始した。反応は指定されているタイムポイントにおけるサンプリングによってモニターした。サンプリングの間には、反応混合物の１５μＬを氷上の１３５μＬの０．２Ｍ硫酸に移した。反応の完了後に、サンプルを上に記載されているように１Ｍ ＫＯＨによってｐＨ中和し、それから氷冷水によって１：１０希釈した。キット取扱説明にならってＡＴＰ生物発光アッセイキット（Sigma-Aldrich）を用いて、各サンプル中のＡＴＰを定量した。ライセート中における反応のためには、上のプロトコールを次のように修飾した：ライセートを個々の反応チューブに分注し、それから１５分間の７０℃でのインキュベーションによって熱不活性化した。反応緩衝液（２×濃縮液）および熱不活性化されたライセートを反応温度で予め平衡化し、等体積のライセートおよび反応緩衝液を組み合わせることによって反応を開始した。反応は個々の反応チューブを９体積の酸クエンチ溶液によってクエンチすることによってサンプリングし、それから上に記載されているように分析した。ライセート中における反応速度を、同じ反応条件下のコントロールライセート（過剰発現されたポリリン酸キナーゼなし）からのシグナルを差し引くことによって計算した。
転写鋳型の生成 Polyphosphate kinase is placed in buffers consisting of 50 mM Tris-HCl pH 7.0, 4 mM ו 4 , 25 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 1 mM ADP, and 1 mM sodium hexametaphosphate at various temperatures (37 ° C, 50 ° C). , 60 ° C, 70 ° C, and 80 ° C). The reaction was started after pre-equilibriumizing the reaction buffer (1.2 x concentrate) and enzyme solution (0.25 mg / mL) at the reaction temperature for 1 minute. At time t = 0, the reaction was initiated by mixing 80 μL reaction buffer with 20 μL enzyme. The reaction was monitored by sampling at the specified time point. During sampling, 15 μL of the reaction mixture was transferred to 135 μL of 0.2 M sulfuric acid on ice. After completion of the reaction, the sample was pH neutralized with 1 M KOH as described above and then diluted 1:10 with ice cold water. ATP in each sample was quantified using the ATP bioluminescence assay kit (Sigma-Aldrich) according to the kit instruction manual. For the reaction in lysate, the above protocol was modified as follows: lysate was dispensed into individual reaction tubes and then heat inactivated by incubation at 70 ° C. for 15 minutes. The reaction buffer (2 x concentrate) and the heat-inactivated lysate were pre-equilibriumized at the reaction temperature and the reaction was initiated by combining equal volumes of lysate and reaction buffer. Reactions were sampled by quenching individual reaction tubes with 9 volumes of acid quenching solution and then analyzed as described above. The kinetics in lysate was calculated by subtracting the signal from the control lysate (without overexpressed polyphosphate kinase) under the same reaction conditions.
Generation of transfer template

二重鎖ＤＮＡ鋳型を合成ｇＢｌｏｃｋ ＤＮＡ（Integrated DNA Technologies）のＰＣＲ増幅によって調製した。反応をイソプロパノール沈殿によって精製および濃縮した。
ＲＮＡポリメラーゼの絞り込み Double-stranded DNA templates were prepared by PCR amplification of synthetic gBlock DNA (Integrated DNA Technologies). The reaction was purified and concentrated by isopropanol precipitation.
Narrowing down RNA polymerase

市販のＲＮＡポリメラーゼ同士を、各製造者が推奨する条件を用いて比較した。各５０μＬ反応は１０×反応緩衝液（製造者によって供給）、ＮＴＰ、ＤＮＡ鋳型（０．５μｇ）、および酵素からなった。ＮＥＢ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼについては、反応は０．５ｍＭ各ＮＴＰ、５ｍＭ ＤＴＴ、および１００Ｕ酵素を包含した。ＴｈｅｒｍｏＴ７ポリメラーゼによる反応は、ＤＴＴを省いたことを例外として同一であった。ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ Ｔ７による反応は７．５ｍＭの各ＮＴＰおよび５μＬ酵素ミックスを包含した。酵素濃度はＢＣＡアッセイ（Thermo Fisher）によって決定した。反応は指定されているタイムポイントにおけるサンプリングによってモニターした。サンプリングの間には、反応混合物の１０μＬをＲＮＡクエンチ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、５ｍＭ ＥＤＴＡ）の９０μＬに移し、氷上で保存した。クエンチ溶液中のＲＮＡサンプルを、キット取扱説明にならってQuant-iT ＲＮＡブロードレンジアッセイキット（Thermo Fisher）を用いて定量した。キット取扱説明にならってＭｅｇａＳｃｒｉｐｔキットを用いて調製および精製された精製ｄｓＲＮＡの段階希釈物を用いて、定量化のための標準曲線を構築した。反応をアガロースゲル電気泳動によって定性的に分析した。
ライセート中におけるＲＮＡポリメラーゼ評価 Commercially available RNA polymerases were compared using the conditions recommended by each manufacturer. Each 50 μL reaction consisted of 10 × reaction buffer (supplied by the manufacturer), NTP, DNA template (0.5 μg), and enzyme. For NEB T7 RNA polymerase, the reaction included 0.5 mM each NTP, 5 mM DTT, and 100 U enzyme. The reaction with ThermoT7 polymerase was identical with the exception of omitting DTT. The reaction with MegaScript T7 included 7.5 mM of each NTP and 5 μL enzyme mix. Enzyme concentration was determined by the BCA assay (Thermo Fisher). The reaction was monitored by sampling at the specified time point. During sampling, 10 μL of the reaction mixture was transferred to 90 μL of RNA quench solution (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA) and stored on ice. RNA samples in the quench solution were quantified using the Quant-iT RNA Broad Range Assay Kit (Thermo Fisher) according to the kit instructions. A standard curve for quantification was constructed using serial dilutions of purified dsRNA prepared and purified using the MegaScript kit according to the kit instructions. The reaction was qualitatively analyzed by agarose gel electrophoresis.
Evaluation of RNA polymerase in lysate

ＧＬ１４－３２２ライセートを先に記載されているように熱不活性化し、遠心によって清澄化した。各２０μＬ反応は、清澄化されたライセート（７μＬ）、１０×補因子溶液（３００ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭスペルミジン）、ＮＴＰ（各７．５ｍＭ。ｐＨ中和されたストック溶液から調製）、ＤＮＡ鋳型（０．６μｇ）、および酵素（１μＬ）からなった。反応を３７℃または５０℃で１時間インキュベートし、それから９体積のＲＮＡクエンチ溶液を追加することによってクエンチした。クエンチされた反応をさらにクエンチ溶液によって１０倍希釈した（最終希釈：１００倍）。それから、希釈した反応をQuant-iTキットを用いて定量した（上参照）。反応によって生産されたＲＮＡを、コントロール反応（ＲＮＡポリメラーゼを省いた）において定量されたＲＮＡを差し引くことによって計算した。 The GL14-322 lysate was heat-inactivated as described above and clarified by centrifugation. Each 20 μL reaction was clarified lysate (7 μL), 10 × cofactor solution (300 mM MgCl 2 , 20 mM spermidine), NTP (7.5 mM each, prepared from pH-neutralized stock solution), DNA template (0). It consisted of .6 μg), and the enzyme (1 μL). The reaction was incubated at 37 ° C. or 50 ° C. for 1 hour and then quenched by adding 9 volumes of RNA quenching solution. The quenched reaction was further diluted 10-fold with the quench solution (final dilution: 100-fold). The diluted reaction was then quantified using the Quant-iT kit (see above). RNA produced by the reaction was calculated by subtracting the RNA quantified in the control reaction (without RNA polymerase).

高密度ライセート中におけるＲＮＡポリメラーゼアッセイを、次の修飾と共に、上に記載されているように実施した。各１００μＬ反応はライセート（６７．５μＬ）、１０×補因子溶液（３００ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭスペルミジン）、ＮＴＰ（各７．５ｍＭ。ｐＨ中和されたストック溶液から調製）、ＤＮＡ鋳型（３μｇ）、および酵素（１０μＬ）からなった。清澄化されていない反応マトリックス中において実施される反応では、ＧＬ１４－３２２ライセート（６７．５μＬ）を個々の反応チューブに分注し、それから先に記載されているように熱不活性化した。追加の反応物を熱不活性化されたマトリックスに追加し、それから均質までボルテックスすることによって良く混合した。緩衝液中において実施される反応では、１０×補因子溶液は３００ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭスペルミジン、および４００ｍＭ ＤＴＴからなった。加えて、緩衝液のみの反応には５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．４が包含された。全ての反応は５０℃で２時間インキュベートした。各反応からのサンプルは９体積のＲＮＡクエンチ溶液を追加することによってクエンチし、それから最大スピード（２１，０００×ｇ）での１分の遠心によって清澄化した。これらの反応からの上清をクエンチ溶液によってさらに４０倍希釈し（最終希釈：４００倍）、それからQuant-iTキットを用いて定量した（上参照）。
例２ An RNA polymerase assay in high density lysates was performed as described above, with the following modifications. Each 100 μL reaction was lysate (67.5 μL), 10 × cofactor solution (300 mM MgCl 2 , 20 mM spermidine), NTP (7.5 mM each, prepared from pH-neutralized stock solution), DNA template (3 μg), and It consisted of an enzyme (10 μL). For reactions performed in the unclarified reaction matrix, GL14-322 lysate (67.5 μL) was dispensed into individual reaction tubes and then heat-inactivated as described above. Additional reactants were added to the heat-inactivated matrix and then mixed well by vortexing to homogeneity. In the reaction performed in buffer, the 10 × cofactor solution consisted of 300 mM MgCl 2 , 20 mM spermidine, and 400 mM DTT. In addition, 50 mM potassium phosphate pH 7.4 was included in the buffer-only reaction. All reactions were incubated at 50 ° C. for 2 hours. Samples from each reaction were quenched by adding 9 volumes of RNA quenching solution and then clarified by centrifugation at maximum speed (21,000 xg) for 1 minute. The supernatants from these reactions were further diluted 40-fold with quench solution (final dilution: 400-fold) and then quantified using the Quant-iT kit (see above).
Example 2

耐熱性ＰＰＫ２酵素をE. coliでの発現のためにコドン最適化し、合成し、ｐＥＴＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。それから、プラスミドをＧＬ１６－１７０に形質転換した。コントロール株を生成するためには、空のｐＥＴＤｕｅｔ－１プラスミドをＧＬ１６－１７０に形質転換した。５ｍＬ溶原ブロス（ＬＢ）中における一晩の前培養後に、細胞密度がおよそ０．５のＯＤ６００に達するまで、株を１ＬのＬＢ中において３７℃で培養した。それから培養物を氷上で手短に冷やし、イソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．２５ｍＭの終濃度で追加することによって、ＰＰＫ２発現を誘導した。誘導後に、培養物を２０℃でおよそ１６時間増殖させた。培養物を遠心によって収穫し、細胞ペレットを－８０℃に保存した。凍結ペレットを融解することと、２ペレット体積の１５０ｍＭ ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ ｐＨ７中への再懸濁と、１５，０００ｐｓｉでEmulsiFlex C3ホモジナイザー（Avestin）による４パスを用いるホモジナイゼーションとによって、ライセートを生産した。それから、ライセートを４℃における１時間の１５，０００×ｇでの遠心によって清澄化した。ライセートのアリコートを使用前に－８０℃で凍結した。 The thermostable PPK2 enzyme was codon-optimized for expression in E. coli, synthesized and cloned into pETDuet-1 (Novagen). The plasmid was then transformed into GL16-170. To generate a control strain, an empty pETDuet-1 plasmid was transformed with GL16-170. After overnight preculture in 5 mL lysogen broth (LB), the strains were cultured in 1 L LB at 37 ° C. until the cell density reached OD 600 of approximately 0.5. The culture was then briefly cooled on ice and PPK2 expression was induced by adding isopropylthiogalactopyranoside (IPTG) at a final concentration of 0.25 mM. After induction, the cultures were grown at 20 ° C. for approximately 16 hours. Cultures were harvested by centrifugation and cell pellet was stored at −80 ° C. Lysates were produced by thawing frozen pellets, resuspending 2 pellet volumes in 150 mM MOPS-NaOH pH 7, and homogenization using 4 passes with an EmulsiFlex C3 homogenizer (Avestin) at 15,000 psi. .. The lysate was then clarified by centrifugation at 15,000 xg for 1 hour at 4 ° C. The lysate aliquot was frozen at −80 ° C. before use.

それから、熱不活性化されたライセート中の耐熱性ＰＰＫ２活性を測定した。ＰＰＫ２酵素を発現する融解したライセートを、第１に、１：１０希釈されたD. geothermalis ＰＰＫ２ライセートを例外として、コントロール株から調製されたライセートによって１：１００希釈した。塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）およびヘキサメタリン酸ナトリウム（ＨＭＰ）の予***液をそれぞれ１０ｍＭおよび１ｍＭの終濃度で追加した。それから、予熱された７０℃サーモサイクラーによる１５分間のインキュベーションによってライセートを熱不活性化した。それから、熱不活性化されたライセートを１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、２ｍＭアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）またはアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、および９ｍＭ ＨＭＰからなる２×反応緩衝液の等体積と混合することによって、反応を開始した。反応を７０℃でインキュベートし、反応混合物のアリコートを除去することと氷上の９部のクエンチ溶液（２００ｍＭ Ｈ２ＳＯ４）による希釈とによって、タイムポイントを取った。初期タイムポイント（ｔ０）は、ライセートをクエンチ溶液と直接的に混合すること、クエンチされたライセートを氷上に１５分間保存すること、それから２×反応緩衝液を追加することによって取った。アッセイの締め括りに、クエンチされたタイムポイント溶液を１０分間の３，２００×ｇでの遠心によって清澄化した。それから、３部のクエンチされた反応溶液を１部の中和溶液（１Ｍ ＫＯＨ）と混合することによって、クエンチされた反応からの上清をｐＨ中和した。それから、キット取扱説明にならってアデノシン５’－三リン酸（ＡＴＰ）生物発光アッセイキット（Sigma-Aldrich cat#:FLAA）を用いる定量化前に、クエンチおよび中和されたサンプルを水によって１：１０希釈した。ＰＰＫ２含有反応中のＡＴＰの蓄積に基づき、コントロールライセートからのＡＴＰ濃度を差し引いて、初期反応速度を計算した。 Then, the thermostable PPK2 activity in the heat-inactivated lysate was measured. Melted lysates expressing the PPK2 enzyme were first diluted 1: 100 with lysates prepared from control strains, with the exception of 1:10 diluted D. geothermalis PPK2 lysates. Precooled solutions of manganese chloride (MnCl 2 ) and sodium hexametaphosphate (HMP) were added at final concentrations of 10 mM and 1 mM, respectively. The lysate was then heat-inactivated by incubation with a preheated 70 ° C. thermocycler for 15 minutes. Then, by mixing the heat-inactivated lysate with an equal volume of 2 × reaction buffer consisting of 10 mM MnCl 2 , 2 mM adenosine diphosphate (ADP) or adenosine monophosphate (AMP), and 9 mM HMP. The reaction was started. The reaction was incubated at 70 ° C. and time points were taken by removing the aliquots of the reaction mixture and diluting with 9 parts quench solution ( 200 mM H2 SO 4 ) on ice. Initial time points (t 0 ) were taken by mixing the lysates directly with the quench solution, storing the quenched lysates on ice for 15 minutes, and then adding 2x reaction buffer. To conclude the assay, the quenched timepoint solution was clarified by centrifugation at 3,200 xg for 10 minutes. The supernatant from the quenched reaction was then pH neutralized by mixing 3 parts of the quenched reaction solution with 1 part of the neutralizing solution (1M KOH). Then, prior to quantification using the adenosine 5'-triphosphate (ATP) bioluminescence assay kit (Sigma-Aldrich cat #: FLAA) according to the kit instructions, quench and neutralize the sample with water 1: It was diluted 10 times. Based on the accumulation of ATP in the PPK2-containing reaction, the initial reaction rate was calculated by subtracting the ATP concentration from the control lysate.

５つのクラスＩＩＩ ＰＰＫ２酵素は、ライセート中において７０℃で可溶性の発現、耐熱性、および高い反応速度を示した。代表的な発現および活性データが図２２Ａ～２２Ｂに示されている。 The five Class III PPK2 enzymes showed soluble expression, thermostability, and high kinetics at 70 ° C. in lysates. Representative expression and activity data are shown in FIGS. 22A-22B.

試験された各酵素の発現およびキネティクスデータの概要が表１７に示されている。C. aerophila、Roseiflexus、A. thermophila、およびR. castenholzii酵素は、基質としてＨＭＰを用いてＡＭＰおよびＡＤＰを急速にＡＴＰに変換した。D. geothermalis酵素は、ＡＭＰおよびＡＤＰ基質両方について他の試験されたＰＰＫ２よりも大体２０×低い変換速度を示した。

Figure 0007011599000020
Figure 0007011599000021
例３ A summary of the expression and kinetic data for each enzyme tested is shown in Table 17. The C. aerophila, Roseiflexus, A. thermophila, and R. castenholzii enzymes rapidly converted AMP and ADP to ATP using HMP as a substrate. The D. geothermalis enzyme showed approximately 20 × lower conversion rates than the other tested PPK2 for both AMP and ADP substrates.
Figure 0007011599000020
Figure 0007011599000021
Example 3

それから、耐熱性C. aerophila ＰＰＫ２を用いて、ＮＭＰ、ＡＤＰ、およびＨＭＰからのｄｓＲＮＡの無細胞的生産のためのＡＴＰを供給した。無細胞的なｄｓＲＮＡ合成反応を、表１８に挙げられているキナーゼを個々に過剰発現する６つのE. coliライセートの混合物によって実施した。

Figure 0007011599000022
The thermostable C. aerophila PPK2 was then used to supply ATP for cell-free production of dsRNA from NMP, ADP, and HMP. Cell-free dsRNA synthesis reactions were performed with a mixture of 6 E. coli lysates that individually overexpress the kinases listed in Table 18.
Figure 0007011599000022

第１に、表１８に挙げられているライセート同士を氷上において等体積で組み合わせた。塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、およびヘキサメタリン酸ナトリウム（ＨＭＰ）の予***液を、それぞれ０～２．５ｍＭ、３０ｍＭ、および１ｍＭの終濃度まで追加した。それから、予熱された７０℃サーモサイクラーによる１５分間のインキュベーションによってライセート混合物を熱不活性化した。反応を開始するためには、熱不活性化されたライセートを次のコンポーネントと組み合わせた：２０μＬの総体積中に、ヌクレオチド一リン酸（アデノシン５’－一リン酸、シチジン５’－一リン酸、ウリジン５’－一リン酸、およびグアノシン５’－一リン酸。各２ｍＭ）の等モル混合物，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０，３０ｍＭ ＭｇＳＯ４，０～２．５ｍＭ ＭｎＣｌ２；１ｍＭアデノシン５’－二リン酸、２ｍＭスペルミジン、１．５μｇプラスミドＤＮＡ鋳型、および３μｇ耐熱性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｓ４３０Ｐ，Ｆ８４９Ｉ，Ｆ８８０Ｙ）。コントロールとして、ｄｓＲＮＡを２ｍＭ ＮＴＰの等モル混合物から合成した（ライセート、ＡＤＰ、およびＨＭＰは省いた）。追加のコントロールとして、ｄｓＲＮＡを２ｍＭ ＮＭＰの等モル混合物から合成した（ＰＰＫ２発現ライセート、ＡＤＰ、およびＨＭＰは省いたが、エネルギー供給源として８ｍＭ ＡＴＰを包含した）。負のコントロールとして、ポリメラーゼを省いた二重の反応を実施した。全ての反応は５０℃で２時間インキュベートし、それから９体積のＴＥ＋緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、５ｍＭ ＥＤＴＡ）の追加によって停止させた。サンプルを等体積の２×ＲＮＡローディング色素（New England Biolabs）と混合し、７０℃に１０分間加熱し、アガロース／ＴＡＥゲル電気泳動が後続した。 First, the lysates listed in Table 18 were combined on ice in equal volumes. Precooled solutions of manganese chloride (MnCl 2 ), magnesium sulfate (ו 4 ), and sodium hexametaphosphate (HMP) were added to final concentrations of 0-2.5 mM, 30 mM, and 1 mM, respectively. The lysate mixture was then heat-inactivated by incubation with a preheated 70 ° C. thermocycler for 15 minutes. To initiate the reaction, heat-inactivated lysates were combined with the following components: nucleotide monophosphate (adenosine 5'-monophosphate, citidine 5'-monophosphate in a total volume of 20 μL. , Uridine 5'-monophosphate, and guanosine 5'-monophosphate, 2 mM each), 50 mM Tris pH 7.0, 30 mM transferase 4 , 0-2.5 mM MnCl 2 ; 1 mM adenosine 5'-2. Phosphoric acid, 2 mM spermidin, 1.5 μg plasmid DNA template, and 3 μg heat resistant T7 RNA polymerase (S430P, F849I, F880Y). As a control, dsRNA was synthesized from an equimolar mixture of 2 mM NTP (lysate, ADP, and HMP omitted). As an additional control, dsRNA was synthesized from an equimolar mixture of 2 mM NMP (PPK2-expressing lysate, ADP, and HMP omitted, but included 8 mM ATP as an energy source). As a negative control, a double reaction was performed without the polymerase. All reactions were incubated at 50 ° C. for 2 hours and then stopped by the addition of 9 volumes of TE + buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA). Samples were mixed with equal volumes of 2 × RNA loading dyes (New England Biolabs) and heated to 70 ° C. for 10 minutes, followed by agarose / TAE gel electrophoresis.

図２３に示されているように、所望のｄｓＲＮＡ産物を、緩衝液中においてＮＴＰを用いて（左のレーン）、ヌクレオチドキナーゼ発現ライセート中においてＮＭＰおよびＡＴＰから（真ん中のレーン）、ヌクレオチドキナーゼおよびポリリン酸キナーゼ発現ライセート中においてＮＭＰおよびＨＭＰから（右のレーン）生産した。塩化マンガンはいずれかの反応に要求されず、C. aerophila酵素が補因子としてＭｎ２＋およびＭｇ２＋を利用し得るということを実証した。よって、Ｍｎ２＋はC. aerophila ＰＰＫ２を含有する無細胞的反応のためにアプリオリには要求されない。 As shown in FIG. 23, the desired dsRNA product from NMP and ATP (middle lane) in nucleotide kinase expression lysates using NTP in buffer (left lane), nucleotide kinase and polyline. Produced from NMPs and HMPs (right lane) during acid kinase expression lysates. Manganese chloride was not required for either reaction, demonstrating that the C. aerophila enzyme can utilize Mn 2+ and Mg 2+ as cofactors. Therefore, Mn 2+ is not required a priori due to the cell-free reaction containing C. aerophila PPK2.

図２４に示されているように、所望のｄｓＲＮＡ産物を、緩衝液中においてＮＴＰを用いて（左のレーン）、ヌクレオチドキナーゼ発現ライセート中においてＮＭＰおよびＡＴＰから（真ん中のレーン）、ヌクレオチドキナーゼおよびポリリン酸キナーゼ発現ライセート中においてＮＭＰおよびＨＭＰから（右のレーン）生産した。ＮＭＰおよびＨＭＰからのｄｓＲＮＡ生産は外来性ＡＤＰまたはT. thermophilus ＡＭＰキナーゼを要求しなかった。よって、C. aerophila ＰＰＫ２は、無細胞的反応によってＮＭＰおよびＨＭＰからｄｓＲＮＡを生産するために５－キナーゼシステムの一部として用いられ得る。
他の態様 As shown in FIG. 24, the desired dsRNA product from NMP and ATP (middle lane) in nucleotide kinase expression lysates using NTP in buffer (left lane), nucleotide kinase and polyline. Produced from NMPs and HMPs (right lane) during acid kinase expression lysates. DsRNA production from NMP and HMP did not require exogenous ADP or T. thermophilus AMP kinase. Thus, C. aerophila PPK2 can be used as part of the 5-kinase system to produce dsRNA from NMP and HMP by cell-free reactions.
Other aspects

請求項において、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は、それと反対に示されないかまたは文脈から別様に明白でない限り、１つまたは１つよりも多くを意味し得る。群の１つ以上のメンバーの間に「または」を包含する請求項または記載は、それと反対に示されないかまたは文脈から別様に明白でない限り、群のメンバーの１つ、１つよりも多く、または全てが所与の産物またはプロセスに存在するか、使用されるか、または別様に関係する場合には、満足されると見なされる。本発明は、群の厳密に１つのメンバーが所与の産物またはプロセスに存在するか、使用されるか、または別様に関係する態様を包含する。本発明は、群のメンバーの１つよりも多くまたは全てが所与の産物またはプロセスに存在するか、使用されるか、または別様に関係する態様を包含する。 In the claims, articles such as "a", "an", and "the" can mean one or more, unless otherwise indicated or otherwise obvious from the context. Claims or statements that include "or" between one or more members of the group are more than one of the members of the group, unless otherwise indicated or otherwise apparent from the context. , Or if all are present, used, or otherwise related to a given product or process, are considered satisfactory. The present invention includes aspects in which exactly one member of a group is present, used, or otherwise related to a given product or process. The present invention includes aspects in which more than one or all of the members of a group are present, used, or otherwise related to a given product or process.

さらにその上、本発明は、列記されている請求項の１つ以上から１つ以上の限定、要素、節、および記述用語が別の請求項に導入される全ての変形、組み合わせ、および順列を包含する。例えば、別の請求項に従属するいずれかの請求項は、同じ元の請求項に従属するいずれかの他の請求項に見出される１つ以上の限定を包含するように修飾され得る。要素がリストとして、例えばマーカッシュ群フォーマットで提出されているところでは、要素の各下位群もまた開示され、いずれかの要素（単数または複数）は群から除去され得る。一般的に、本発明または本発明の側面が特定の要素および／または特徴を含むと言われるところでは、ある種の本発明の態様または本発明の側面がかかる要素および／または特徴からなるかまたは本質的になるということが理解されるべきである。単純の目的のために、それらの態様は本明細書において一々具体的には提示しなかった。用語「含む」および「含有する」は開放的であることが意図されており、追加の要素またはステップの包含を許可するということもまた注意される。範囲が与えられているところでは、エンドポイントが包含される。さらにその上、別様に示されていないかまたは文脈および当業者の理解から別様に明白でない限り、範囲として表現されている値は、文脈が明らかに別様に指示しない限り、本発明の異なる態様において、述べられている範囲内のいずれかの具体的な値または部分範囲を、範囲の下限の単位の１／１０までとり得る。 Moreover, the present invention comprises all modifications, combinations, and sequences in which one or more of the listed claims to one or more limitations, elements, clauses, and descriptive terms are introduced in another claim. Include. For example, any claim subordinate to another claim may be modified to include one or more limitations found in any other claim subordinate to the same original claim. Where the elements are submitted as a list, eg in Markush group format, each subgroup of elements is also disclosed and any element (s) may be removed from the group. Where the invention or aspects of the invention are generally said to contain specific elements and / or features, certain aspects of the invention or aspects of the invention consist of such elements and / or features. It should be understood that it will be essential. For the sake of simplicity, those embodiments have not been specifically presented herein. It is also noted that the terms "contain" and "contain" are intended to be open and allow the inclusion of additional elements or steps. Where the range is given, the endpoint is included. Moreover, unless otherwise indicated or otherwise apparent from the context and understanding of one of ordinary skill in the art, the values expressed as ranges are of the invention unless the context clearly dictates otherwise. In different embodiments, any specific value or subrange within the stated range can be taken up to 1/10 of the lower bound unit of the range.

本明細書は種々の発行済み特許、公開特許出願、雑誌記事、および他の刊行物を参照し、その全ては参照によって本明細書に組み込まれる。組み込まれる参照のいずれかと本明細書との間に矛盾がある場合には、本明細書がコントロールするものとする。加えて、従来技術のうちである本発明のいずれかの特定の態様は請求項のいずれか１つ以上から明示的に除外され得る。かかる態様は当業者に公知であると判断されるので、それらは、除外が本明細書において明示的に提示されていない場合であっても除外され得る。本発明のいずれかの特定の態様は、従来技術の存在に関するか否かにかかわらず、いずれかの請求項からいずれかの理由で除外され得る。 This specification refers to various published patents, published patent applications, journal articles, and other publications, all of which are incorporated herein by reference. In the event of any inconsistency between any of the incorporated references and the present specification, this specification shall control. In addition, any particular aspect of the invention within the prior art may be explicitly excluded from any one or more of the claims. As such embodiments will be determined to be known to those of skill in the art, they may be excluded even if the exclusions are not expressly presented herein. Any particular aspect of the invention may be excluded from any claim for any reason, whether or not it relates to the existence of prior art.

当業者は、本明細書に記載される具体的な態様の多くの均等物を認識するか、またはせいぜい慣例の実験作業を用いて確かめることができるであろう。本明細書に記載される本態様の範囲は上の明細書に限定されることを意図されず、むしろ添付の請求項に提示されている通りである。当業者は、次の請求項に定められている本発明の趣旨または範囲から外れることなしに、本明細書の種々の変化および修飾がなされ得るということを理解するであろう。

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配列
E. coli RNase R
MSQDPFQEREAEKYANPIPSREFILEHLTKREKPASRDELAVELHIEGEEQLEGLRRRLR
AMERDGQLVFTRRQCYALPERLDLVKGTVIGHRDGYGFLRVEGRKDDLYLSSEQMKTCIH
GDQVLAQPLGADRKGRREARIVRVLVPKTSQIVGRYFTEAGVGFVVPDDSRLSFDILIPP
DQIMGARMGFVVVVELTQRPTRRTKAVGKIVEVLGDNMGTGMAVDIALRTHEIPYIWPQA
VEQQVAGLKEEVPEEAKAGRVDLRDLPLVTIDGEDARDFDDAVYCEKKRGGGWRLWVAIA
DVSYYVRPSTPLDREARNRGTSVYFPSQVIPMLPEVLSNGLCSLNPQVDRLCMVCEMTVS
SKGRLTGYKFYEAVMSSHARLTYTKVWHILQGDQDLREQYAPLVKHLEELHNLYKVLDKA
REERGGISFESEEAKFIFNAERRIERIEQTQRNDAHKLIEECMILANISAARFVEKAKEP
ALFRIHDKPSTEAITSFRSVLAELGLELPGGNKPEPRDYAELLESVADRPDAEMLQTMLL
RSMKQAIYDPENRGHFGLALQSYAHFTSPIRRYPDLTLHRAIKYLLAKEQGHQGNTTETG
GYHYSMEEMLQLGQHCSMAERRADEATRDVADWLKCDFMLDQVGNVFKGVISSVTGFGFF
VRLDDLFIDGLVHVSSLDNDYYRFDQVGQRLMGESSGQTYRLGDRVEVRVEAVNMDERKI
DFSLISSERAPRNVGKTAREKAKKGDAGKKGGKRRQVGKKVNFEPDSAFRGEKKTKPKAA
KKDARKAKKPSAKTQKIAAATKAKRAAKKKVAE（配列番号１）

T. elongatus Ppk (PPK1)
MPSAKSPRRKAPEPIDLDNPQYYFNRSLSWLEFNKRVLHEAYDPRTPLLERLKFMAIFSS
NLDEFFMVRVAGLKQQVESGILQVGADGMPPAEQLQAVRQYLLPIVTEQHRYFDQELRAL
LAKESIFLTRFNELTPEQQAYLNDYFQAQVFPVLTPLAVDPAHPFPYISSLSLNLAVLIR
DPESGQERLARVKVPNQFPRFVALPQHLHSPQGVHWLGVPLEEIIAHNLSALFPGMEIEA
YFAFRITRSADLELETDKADDLLIAIEQEIRKRRFGSVVRLEVQRGIPPLLRQTLMEEMD
LEEIDVYELEGLLCLNDLFAFMGLPLPQFKDPEWQPQVPPSFQRVEERESMFDTSSEITT
LGTDYWEAVANELFSLIREGDIIVHHPYHSFAATVQRFITLAAHDPQVLAIKITLYRTSG
DSPIVSALIKAAENGKQVAVLVELKARFDEENNILWARKLEKVGVHVVYGVPGLKTHTKT
VLVVRQEAGQIRRYVHIGTGNYNPKTASLYEDLGLFSCREELGADLSELFNVLTGYARQR
DYRKLLVAPVTMRDRTLQLIYREIEHARNGQPARIIAKMNAITDTQVIRALYEASQAGVD
IDLIIRGMCCLRPGVPGVSDRIRVISIIGRFLEHSRIFYFGNNGDPEYYIGSADWRSRNL
DRRVEAITPIEDPAIQLELKERLEIMLADNRQAWELQPDGTYRQRQPAPGEAERGTHSVL
MARTLKDVQGSH（配列番号２）

P. furiosus Umk
MRIVFDIGGSVLVPENPDIDFIKEIAYQLTKVSEDHEVAVVVGGGKLARKYIEVAEKFNSSE
TFKDFIGIQITRANAMLLIAALREKAYPVVVEDFWEAWKAVQLKKIPVMGGTHPGHTTDAVA
ALLAEFLKADLLVVITNVDGVYTADPKKDPTAKKIKKMKPEELLEIVGKGIEKAGSSSVIDP
LAAKIIARSGIKTIVIGKEDAKDLFRVIKGDHNGTTIEP（配列番号３）

T. thermophilius Cmk
MRGIVTIDGPSASGKSSVARRVAAALGVPYLSSGLLYRAAAFLALRAGVDPGDEEGLLAL
LEGLGVRLLAQAEGNRVLADGEDLTSFLHTPEVDRVVSAVARLPGVRAWVNRRLKEVPPP
FVAEGRDMGTAVFPEAAHKFYLTASPEVRAWRRARERPQAYEEVLRDLLRRDERDKAQSA
PAPDALVLDTGGMTLDEVVAWVLAHIRR（配列番号４）

T. maritima Gmk
MKGQLFVICGPSGAGKTSIIKEVLKRLDNVVFSVSCTTRPKRPHEEDGKDYFFITEEEFL
KRVERGEFLEWARVHGHLYGTLRSFVESHINEGKDVVLDIDVQGALSVKKKYSNTVFIYV
APPSYADLRERILKRGTEKEADVLVRLENAKWELMFMDEFDYIVVNENLEDAVEMVVSIV
RSERAKVTRNQDKIERFKMEVKGWKKL（配列番号５）

T. thermophilus Adk
MDVGQAVIFLGPPGAGKGTQASRLAQELGFKKLSTGDILRDHVARGTPLGERVRPIMERG
DLVPDDLILELIREELAERVIFDGFPRTLAQAEALDRLLSETGTRLLGVVLVEVPEEELV
RRILRRAELEGRSDDNEETVRRRLEVYREKTEPLVGYYEARGVLKRVDGLGTPDEVYARI
RAALGI（配列番号６）

A. aeolicus Ndk
MAVERTLIIVKPDAMEKGALGKILDRFIQEGFQIKALKMFRFTPEKAGEFYYVHRERPFF
QELVEFMSSGPVVAAVLEGEDAIKRVREIIGPTDSEEARKVAPNSIRAQFGTDKGKNAIH
ASDSPESAQYEICFIFSGLEIV（配列番号７）

Meiothermus ruber DM 1279 PPK2
MGFCSIEFLMGAQMKKYRVQPDGRFELKRFDPDDTSAFEGGKQAALEALAVLNRRLEKLQEL
LYAEGQHKVLVVLQAMDAGGKDGTIRVVFDGVNPSGVRVASFGVPTEQELARDYLWRVHQQV
PRKGELVIFNRSHYEDVLVVRVKNLVPQQVWQKRYRHIREFERMLADEGTTILKFFLHISKD
EQRQRLQERLDNPEKRWKFRMGDLEDRRLWDRYQEAYEAAIRETSTEYAPWYVIPANKNWYR
NWLVSHILVETLEGLAMQYPQPETASEKIVIE（配列番号８）

Meiothermus silvanus DSM 9946 PPK2
MAKTIGATLNLQDIDPRSTPGFNGDKEKALALLEKLTARLDELQEQLYAEHQHRVLVILQGM
DTSGKDGTIRHVFKNVDPLGVRVVAFKAPTPPELERDYLWRVHQHVPANGELVIFNRSHYED
VLVARVHNLVPPAIWSRRYDHINAFEKMLVDEGTTVLKFFLHISKEEQKKRLLERLVEADKH
WKFDPQDLVERGYWEDYMEAYQDVLDKTHTQYAPWHVIPADRKWYRNLQVSRLLVEALEGLR
MKYPRPKLNIPRLKSELEKM（配列番号９）

Deinococcus geothermalis DSM 11300 PPK2
MQLDRYRVPPGQRVRLSNWPTDDDGGLSKAEGEALLPDLQQRLANLQERLYAESQQALLIVL
QARDAGGKDGTVKHVIGAFNPSGVQVSNFKVPTEEERAHDFLWRIHRQTPRLGMIGVFNRSQ
YEDVLVTRVHHLIDDQTAQRRLKHICAFESLLTDSGTRIVKFYLHISPEEQKKRLEARLADP
SKHWKFNPGDLQERAHWDAYTAVYEDVLTTSTPAAPWYVVPADRKWFRNLLVSQILVQTLEE
MNPQFPAPAFNAADLRIV（配列番号１０）

Thermosynechococcus elongatus BP-1 PPK2
MIPQDFLDEINPDRYIVPAGGNFHWKDYDPGDTAGLKSKVEAQELLAAGIKKLAAYQDVLYA
QNIYGLLIIFQAMDAAGKDSTIKHVMSGLNPQACRVYSFKAPSAEELDHDFLWRANRALPER
GCIGIFNRSYYEEVLVVRVHPDLLNRQQLPPETKTKHIWKERFEDINHYERYLTRNGILILK
FFLHISKAEQKKRFLERISRPEKNWKFSIEDVRDRAHWDDYQQAYADVFRHTSTKWAPWHII
PANHKWFARLMVAHFIYQKLASLNLHYPMLSEAHREQLLEAKALLENEPDED（配列番号１１）

Anaerolinea thermophila UNI-1 PPK2
MGEAMERYFIKPGEKVRLKDWSPDPPKDFEGDKESTRAAVAELNRKLEVLQERLYAERKHKV
LVILQGMDTSGKDGVIRSVFEGVNPQGVKVANFKVPTQEELDHDYLWRVHKVVPGKGEIVIF
NRSHYEDVLVVRVHNLVPPEVWKKRYEQINQFERLLHETGTTILKFFLFISREEQKQRLLER
LADPAKHWKFNPGDLKERALWEEYEKAYEDVLSRTSTEYAPWILVPADKKWYRDWVISRVLV
ETLEGLEIQLPPPLADAETYRRQLLEEDAPESR（配列番号１２）

Caldilinea aerophila OSM 14535 PPK2
MDVDRYRVPPGSTIHLSQWPPDDRSLYEGDKKQGKQDLSALNRRLETLQELLYAEGKHKVLI
ILQGMDTSGKDGVIRHVFNGVNPQGVKVASFKVPTAVELAHDFLWRIHRQTPGSGEIVIFNR
SHYEDVLVVRVHGLVPPEVWARRYEHINAFEKLLVDEGTTILKFFLHISKEEQRQRLLERLE
MPEKRWKFSVGDLAERKRWDEYMAAYEAVLSKTSTEYAPWYIVPSDRKWYRNLVISHVIINA
LEGLNMRYPQPEDIAFDTIVIE（配列番号１３）

Chlorobaculum tepidum TLS PPK2
MKLDLDAFRIQPGKKPNLAKRPTRIDPVYRSKGEYHELLANHVAELSKLQNVLYADNRYAIL
LIFQAMDAAGKDSAIKHVMSGVNPQGCQVYSFKHPSATELEHDFLWRTNCVLPERGRIGIFN
RSYYEEVLVVRVHPEILEMQNIPHNLAHNGKVWDHRYRSIVSHEQHLHCNGTRIVKFYLHLS
KEEQRKRFLERIDDPNKNWKFSTADLEERKFWDQYMEAYESCLQETSTKDSPWFAVPADDKK
NARLIVSRIVLDTLESLNLKYPEPSPERRKELLDIRKRLENPENGK（配列番号１４）

Oceanithermus profundus DSM 14977 PPK2
MDVSRYRVPPGSGFDPEAWPTREDDDFAGGKKEAKKELARLAVRLGELQARLYAEGRQALLI
VLQGMDTAGKDGTIRHVFRAVNPQGVRVTSFKKPTALELAHDYLWRVHRHAPARGEIGIFNR
SHYEDVLVVRVHELVPPEVWGRRYDHINAFERLLADEGTRIVKFFLHISKDEQKRRLEARLE
NPRKHWKFNPADLSERARWGDYAAAYAEALSRTSSDRAPWYAVPADRKWQRNRIVAQVLVDA
LEAMDPRFPRVDFDPASVRVE（配列番号１５）

Roseiflexus castenholzii DSM 13941 PPK2
MYAQRVVPGMRVRLHDIDPDANGGLNKDEGRARFAELNAELDVMQEELYAAGIHALLLILQG
MDTAGKDGAIRNVMLNLNPQGCRVESFKVPTEEELAHDFLWRVHRVVPRKGMVGVFNRSHYE
DVLVVRVHSLVPESVWRARYDQINAFERLLADTGTIIVKCFLHISKEEQEQRLLARERDVSK
AWKLSAGDWRERAFWDDYMAAYEEALTRCSTDYAPWYIIPANRKWYRDLAISEALVETLRPY
RDDWRRALDAMSRARRAELEAFRAEQHAMEGRPQGAGGVSRR（配列番号１６）

Roseiflexus sp. RS-1 PPK2
MHYAHTVIPGTQVRLRDIDPDASGGLTKDEGRERFASFNATLDAMQEELYAAGVHALLLILQ
GMDTAGKDGAIRNVMHNLNPQGCRVESFKVPTEEELAHDFLWRVHKVVPRKGMVGVFNRSHY
EDVLVVRVHSLVPEHVWRARYDQINAFERLLTDTGTIIVKCFLHISKDEQEKRLLAREQDVT
KAWKLSAGDWRERERWDEYMAAYEEALTRCSTEYAPWYIIPANRKWYRDLAISEVLVETLRP
YRDDWQRALDAMSQARLAELKAFRHQQTAGATRL（配列番号１７）

Truepera radiovictrix DSM 17093 PPK2
MSQGSAKGLGKLDKKVYARELALLQLELVKLQGWIKAQGLKVVVLFEGRDAAGKGSTITRIT
QPLNPRVCRVVALGAPTERERTQWYFQRYVHHLPAAGEMVLFDRSWYNRAGVERVMGFCTEA
EYREFLHACPTFERLLLDAGIILIKYWFSVSAAEQERRMRRRNENPAKRWKLSPMDLEARAR
WVAYSKAKDAMFYHTDTKASPWYVVNAEDKRRAHLSCIAHLLSLIPYEDLTPPPLEMPPRDL
AGADEGYERPDKAHQTWVPDYVPPTR（配列番号１８） One of ordinary skill in the art will be able to recognize or at best ascertain many equivalents of the specific embodiments described herein using conventional experimental work. The scope of this aspect described herein is not intended to be limited to the above specification, but rather as set forth in the accompanying claims. Those skilled in the art will appreciate that various modifications and modifications of the present specification may be made without departing from the spirit or scope of the invention as set forth in the following claims.

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arrangement
E. coli RNase R
MSQDPFQEREAEKYANPIPSREFILEHLTKREKPASRDELAVELHIEGEEQLEGLRRRLR
AMERDGQLVFTRRQCYALPERLDLVKGTVIGHRDGYGFLRVEGRKDDLYLSSEQMKTCIH
GDQVLAQPLGADRKGRREARIVRVLVPKTSQIVGRYFTEAGVGFVVPDDSRLSFDILIPP
DQIMGARMGFVVVVELTQRPTRRTKAVGKIVEVLGDNMGTGMAVDIALRTHEIPYIWPQA
VEQQVAGLKEEVPEEAKAGRVDLRDLPLVTIDGEDARDFDDAVYCEKKRGGGWRLWVAIA
DVSYYVRPSTPLDREARNRGTSVYFPSQVIPMLPEVLSNGLCSLNPQVDRLCMVCEMTVS
SKGRLTGYKFYEAVMSSHARLTYTKVWHILQGDQDLREQYAPLVKHLEELHNLYKVLDKA
REERGGISFESEEAKFIFNAERRIERIEQTQRNDAHKLIEECMILANISAARFVEKAKEP
ALFRIHDKPSTEAITSFRSVLAELGLELPGGNKPEPRDYAELLESVADRPDAEMLQTMLL
RSMKQAIYDPENRGHFGLALQSYAHFTSPIRRYPDLTLHRAIKYLLAKEQGHQGNTTETG
GYHYSMEEMLQLGQHCSMAERRADEATRDVADWLKCDFMLDQVGNVFKGVISSVTGFGFF
VRLDDLFIDGLVHVSSLDNDYYRFDQVGQRLMGESSGQTYRLGDRVEVRVEAVNMDERKI
DFSLISSERAPRNVGKTAREKAKKGDAGKKGGKRRQVGKKVNFEPDSAFRGEKKTKPKAA
KKDARKAKKPSAKTQKIAAATKAKRAAKKKVAE (SEQ ID NO: 1)

T. elongatus Ppk (PPK1)
MPSAKSPRRKAPEPIDLDNPQYYFNRSLSWLEFNKRVLHEAYDPRTPLLERLKFMAIFSS
NLDEFFMVRVAGLKQQVESGILQVGADGMPPAEQLQAVRQYLLPIVTEQHRYFDQELRAL
LAKESIFLTRFNELTPEQQAYLNDYFQAQVFPVLTPLAVDPAHPFPYISSLSLNLAVLIR
DPESGQERLARVKVPNQFPRFVALPQHLHSPQGVHWLGVPLEEIIAHNLSALFPGMEIEA
YFAFRITRSADLELETDKADDLLIAIEQEIRKRRFGSVVRLEVQRGIPPLLRQTLMEEMD
LEEIDVYELEGLLCLNDLFAFMGLPLPQFKDPEWQPQVPPSFQRVEERESMFDTSSEITT
LGTDYWEAVANELFSLIREGDIIVHHPYHSFAATVQRFITLAAHDPQVLAIKITLYRTSG
DSPIVSALIKAAENGKQVAVLVELKARFDEENNILWARKLEKVGVHVVYGVPGLKTHTKT
VLVVRQEAGQIRRYVHIGTGNYNPKTASLYEDLGLFSCREELGADLSELFNVLTGYARQR
DYRKLLVAPVTMRDRTLQLIYREIEHARNGQPARIIAKMNAITDTQVIRALYEASQAGVD
IDLIIRGMCCLRPGVPGVSDRIRVISIIGRFLEHSRIFYFGNNGDPEYYIGSADWRSRNL
DRRVEAITPIEDPAIQLELKERLEIMLADNRQAWELQPDGTYRQRQPAPGEAERGTHSVL
MARTLKDVQGSH (SEQ ID NO: 2)

P. furiosus Umk
MRIVFDIGGSVLVPENPDIDFIKEIAYQLTKVSEDHEVAVVVGGGKLARKYIEVAEKFNSSE
TFKDFIGIQITRANAMLLIAALREKAYPVVVEDFWEAWKAVQLKKIPVMGGTHPGHTTDAVA
ALLAEFLKADLLVVITNVDGVYTADPKKDPTAKKIKKMKPEELLEIVGKGIEKAGSSSVIDP
LAAKIIARSGIKTIVIGKEDAKDLFRVIKGDHNGTTIEP (SEQ ID NO: 3)

T. thermophilius Cmk
MRGIVTIDGPSASGKSSVARRVAAALGVPYLSSGLLYRAAAFLALRAGVDPGDEEGLLAL
LEGLGVRLLAQAEGNRVLADGEDLTSFLHTPEVDRVVSAVARLPGVRAWVNRRLKEVPPP
FVAEGRDMGTAVFPEAAHKFYLTASPEVRAWRRARERPQAYEEVLRDLLRRDERDKAQSA
PAPDALVLDTGGMTLDEVVAWVLAHIRR (SEQ ID NO: 4)

T. maritima Gmk
MKGQLFVICGPSGAGKTSIIKEVLKRLDNVFSVSCTTRPKRPHEEDGKDYFFITEEEFL
KRVERGEFLEWARVHGHLYGTLRSFVESHINEGKDVVLDIDVQGALSVKKKYSNTVFIYV
APPSYADLRERILKRGTEKEADVLVRLENAKWELMFMDEFDYIVVNENLEDAVEMVVSIV
RSERAKVTRNQDKIERFKMEVKGWKKL (SEQ ID NO: 5)

T. thermophilus Adk
MDVGQAVIFLGPPGAGKGTQASRLAQELGFKKLSTGDILRDHVARGTPLGERVRPIMERG
DLVPDDLILELIREELAERVIFDGFPRTLAQAEALDRLLSETGTRLLGVVLVEVPEEELV
RRILRRAELEGRSDDNEETVRRRLEVYREKTEPLVGYYEARGVLKRVDGLGTPDEVYARI
RAALGI (SEQ ID NO: 6)

A. aeolicus Ndk
MAVERTLIIVKPDAMEKGALGKILDRFIQEGFQIKALKMFRFTPEKAGEFYYVHRERPFF
QELVEFMSSGPVVAAVLEGEDAIKRVREIIGPTDSEEARKVAPNSIRAQFGTDKGKNAIH
ASDSPESAQYEICFIFSGLEIV (SEQ ID NO: 7)

Meiothermus ruber DM 1279 PPK2
MGFCSIEFLMGAQMKKYRVQPDGRFELKRFDPDDTSAFEGGKQAALEALAVLNRRLEKLQEL
LYAEGQHKVLVVLQAMDAGGKDGTIRVVFDGVNPSGVRVASFGVPTEQELARDYLWRVHQQV
PRKGELVIFNRSHYEDVLVVRVKNLVPQQVWQKRYRHIREFERMLADEGTTILKFFLHISKD
EQRQRLQERLDNPEKRWKFRMGDLEDRRLWDRYQEAYEAAIRETSTEYAPWYVIPANKNWYR
NWLVSHILVETLEGLAMQYPQPETASEKIVIE (SEQ ID NO: 8)

Meiothermus silvanus DSM 9946 PPK2
MAKTIGATLNLQDIDPRSTPGFNGDKEKALALLEKLTARLDELQEQLYAEHQHRVLVILQGM
DTSGKDGTIRHVFKNVDPLGVRVVAFKAPTPPELERDYLWRVHQHVPANGELVIFNRSHYED
VLVARVHNLVPPAIWSRRYDHINAFEKMLVDEGTTVLKFFLHISKEEQKKRLLERLVEADKH
WKFDPQDLVERGYWEDYMEAYQDVLDKTHTQYAPWHVIPADRKWYRNLQVSRLLVEALEGLR
MKYPRPKLNIPRLKSELEKM (SEQ ID NO: 9)

Deinococcus geothermalis DSM 11300 PPK2
MQLDRYRVPPGQRVRLSNWPTDDDGGLSKAEGEALLPDLQQRLANLQERLYAESQQALLIVL
QARDAGGKDGTVKHVIGAFNPSGVQVSNFKVPTEEERAHDFLWRIHRQTPRLGMIGVFNRSQ
YEDVLVTRVHHLIDDQTAQRRLKHICAFESLLTDSGTRIVKFYLHISPEEQKKRLEARLADP
SKHWKFNPGDLQERAHWDAYTAVYEDVLTTSTPAAPWYVVPADRKWFRNLLVSQILVQTLEE
MNPQFPAPAFNAADLRIV (SEQ ID NO: 10)

Thermosynechococcus elongatus BP-1 PPK2
MIPQDFLDEINPDRYIVPAGGNFHWKDYDPGDTAGLKSKVEAQELLAAGIKKLAAYQDVLYA
QNIYGLLIIFQAMDAAGKDSTIKHVMSGLNPQACRVYSFKAPSAEELDHDFLWRANRALPER
GCIGIFNRSYYEEVLVVRVHPDLLNRQQLPPETKTKHIWKERFEDINHYERYLTRNGILILK
FFLHISKAEQKKRFLERISRPEKNWKFSIEDVRDRAHWDDYQQAYADVFRHTSTKWAPWHII
PANHKWFARLMVAHFIYQKLASLNLHYPMLSEAHREQLLEAKALLENEPDED (SEQ ID NO: 11)

Anaerolinea thermophila UNI-1 PPK2
MGEAMERYFIKPGEKVRLKDWSPDPPKDFEGDKESTRAAVAELNRKLEVLQERLYAERKHKV
LVILQGMDTSGKDGVIRSVFEGVNPQGVKVANFKVPTQEELDHDYLWRVHKVVPGKGEIVIF
NRSHYEDVLVVRVHNLVPPEVWKKRYEQINQFERLLHETGTTILKFFLFISREEQKQRLLER
LADPAKHWKFNPGDLKERALWEEYEKAYEDVLSRTSTEYAPWILVPADKKWYRDWVISRVLV
ETLEGLEIQLPPPLADAETYRRQLLEEDAPESR (SEQ ID NO: 12)

Caldilinea aerophila OSM 14535 PPK2
MDVDRYRVPPGSTIHLSQWPPDDRSLYEGDKKQGKQDLSALNRRLETLQELLYAEGKHKVLI
ILQGMDTSGKDGVIRHVFNGVNPQGVKVASFKVPTAVELAHDFLWRIHRQTPGSGEIVIFNR
SHYEDVLVVRVHGLVPPEVWARRYEHINAFEKLLVDEGTTILKFFLHISKEEQRQRLLERLE
MPEKRWKFSVGDLAERKRWDEYMAAYEAVLSKTSTEYAPWYIVPSDRKWYRNLVISHVIINA
LEGLNMRYPQPEDIAFDTIVIE (SEQ ID NO: 13)

Chlorobaculum tepidum TLS PPK2
MKLDLDAFRIQPGKKPNLAKRPTRIDPVYRSKGEYHELLANHVAELSKLQNVLYADNRYAIL
LIFQAMDAAGKDSAIKHVMSGVNPQGCQVYSFKHPSATELEHDFLWRTNCVLPERGRIGIFN
RSYYEEVLVVRVHPEILEMQNIPHNLAHNGKVWDHRYRSIVSHEQHLHCNGTRIVKFYLHLS
KEEQRKRFLERIDDPNKNWKFSTADLEERKFWDQYMEAYESCLQETSTKDSPWFAVPADDKK
NARLIVSRIVLDTLESLNLKYPEPSPERRKELLDIRKRLENPENGK (SEQ ID NO: 14)

Oceanithermus profundus DSM 14977 PPK2
MDVSRYRVPPGSGFDPEAWPTREDDDFAGGKKEAKKELARLAVRLGELQARLYAEGRQALLI
VLQGMDTAGKDGTIRHVFRAVNPQGVRVTSFKKPTALELAHDYLWRVHRHAPARGEIGIFNR
SHYEDVLVVRVHELVPPEVWGRRYDHINAFERLLADEGTRIVKFFLHISKDEQKRRLEARLE
NPRKHWKFNPADLSERARWGDYAAAYAEALSRTSSDRAPWYAVPADRKWQRNRIVAQVLVDA
LEAMDPRFPRVDFDPASVRVE (SEQ ID NO: 15)

Roseiflexus castenholzii DSM 13941 PPK2
MYAQRVVPGMRVRLHDIDPDANGGLNKDEGRARFAELNAELDVMQEELYAAGIHALLLILQG
MDTAGKDGAIRNVMLNLNPQGCRVESFKVPTEEELAHDFLWRVHRVVPRKGMVGVFNRSHYE
DVLVVRVHSLVPESVWRARYDQINAFERLLADTGTIIVKCFLHISKEEQEQRLLARERDVSK
AWKLSAGDWRERAFWDDYMAAYEEALTRCSTDYAPWYIIPANRKWYRDLAISEALVETLRPY
RDDWRRALDAMSRARRAELEAFRAEQHAMEGRPQGAGGVSRR (SEQ ID NO: 16)

Roseiflexus sp. RS-1 PPK2
MHYAHTVIPGTQVRLRDIDPDASGGLTKDEGRERFASFNATLDAMQEELYAAGVHALLLILQ
GMDTAGKDGAIRNVMHNLNPQGCRVESFKVPTEEELAHDFLWRVHKVVPRKGMVGVFNRSHY
EDVLVVRVHSLVPEHVWRARYDQINAFERLLTDTGTIIVKCFLHISKDEQEKRLLAREQDVT
KAWKLSAGDWRERERWDEYMAAYEEALTRCSTEYAPWYIIPANRKWYRDLAISEVLVETLRP
YRDDWQRALDAMSQARLAELKAFRHQQTAGATRL (SEQ ID NO: 17)

Truepera radiovictrix DSM 17093 PPK2
MSQGSAKGLGKLDKKVYARELALLQLELVKLQGWIKAQGLKVVVLFEGRDAAGKGSTITRIT
QPLNPRVCRVVALGAPTERERTQWYFQRYVHHLPAAGEMVLFDRSWYNRAGVERVMGFCTEA
EYREFLHACPTFERLLLDAGIILIKYWFSVSAAEQERRMRRRNENPAKRWKLSPMDLEARAR
WVAYSKAKDAMFYHTDTKASPWYVVNAEDKRRAHLSCIAHLLSLIPYEDLTPPPLEMPPRDL
AGADEGYERPDKAHQTWVPDYVPPTR (SEQ ID NO: 18)

Claims (18)

リボ核酸（ＲＮＡ）を生合成する無細胞的方法であって、該方法が：
（ａ）ＲＮＡ、リボヌクレアーゼ、耐熱性キナーゼ、および耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを含む細胞ライセート混合物をインキュベートして、解重合したヌクレオシド一リン酸を含む細胞ライセート混合物を生産すること、ここでリボヌクレアーゼは、ＲＮａｓｅ ＲおよびヌクレアーゼＰ１からなる群から選択され、耐熱性キナーゼは、耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼ、耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、および耐熱性ポリリン酸キナーゼからなる群から選択され、耐熱性ＲＮＡポリメラーゼは、耐熱性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、耐熱性ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、および耐熱性Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択される；
（ｂ）ステップ（ａ）において生産された細胞ライセート混合物を、耐熱性キナーゼおよび耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを不活性化することなしに内在性ヌクレアーゼおよびホスファターゼを不活性化または部分的に不活性化する温度に加熱して、熱不活性化されたヌクレアーゼおよびホスファターゼを含む細胞ライセート混合物を生産すること；および
（ｃ）ステップ（ｂ）において生産された細胞ライセート混合物を、エネルギー供給源と関心のＲＮＡをコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）鋳型との存在下においてインキュベートして、関心のＲＮＡを含む細胞ライセート混合物を生産すること、ここで、エネルギー供給源は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）またはＡＴＰ再生系である、
を含む、
前記方法。 A cell-free method for biosynthesizing ribonucleic acid (RNA), which is:
(A) Incubate a cellular lysate mixture containing RNA, ribonuclease, heat-resistant kinase, and heat-resistant RNA polymerase to produce a cellular lysate mixture containing depolymerized nucleoside monophosphate, where the ribonuclease is RNase R. And nuclease P1 were selected from the group consisting of heat-resistant nucleoside monophosphate kinase, heat-resistant nucleoside diphosphate kinase, and heat-resistant polyphosphate kinase. Selected from the group consisting of heat-resistant T7 RNA polymerase, heat-resistant SP6 RNA polymerase, and heat-resistant T3 RNA polymerase;
(B) The temperature at which the cellular lysate mixture produced in step (a) inactivates or partially inactivates endogenous nucleases and phosphatases without inactivating heat resistant kinases and heat resistant RNA polymerases. To produce a cellular lysate mixture containing a heat-inactivated nuclease and phosphatase; and (c) encode the cellular lysate mixture produced in step (b) into an energy source and RNA of interest. Incubate in the presence of a deoxyribonucleic acid (DNA) template to produce a cellular lysate mixture containing the RNA of interest, where the energy source is adenosine triphosphate (ATP) or ATP regeneration system. ,
including,
The method. ステップ（ａ）の細胞ライセート混合物が、単一の細胞ライセートまたは少なくとも２つの細胞ライセートを含み、少なくとも２つの細胞ライセートのうちの少なくとも１つの細胞ライセートが、ＲＮＡを含む細胞から得られ、少なくとも２つの細胞ライセートのうちの少なくとも１つの細胞ライセートが、リボヌクレアーゼ、耐熱性キナーゼ、および／または耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞から得られる、請求項１に記載の方法。 The cell lysate mixture of step (a) comprises a single cell lysate or at least two cell lysates, and at least one of the at least two cell lysates is obtained from a cell containing RNA and at least two. The method of claim 1, wherein at least one of the cell lysates is obtained from a cell expressing a ribonuclease, a thermostable kinase, and / or a thermostable RNA polymerase. 耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼが、耐熱性ウリジル酸キナーゼ、耐熱性シチジル酸キナーゼ、耐熱性グアニル酸キナーゼ、および耐熱性アデニル酸キナーゼからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。 The method according to claim 1 or 2, wherein the heat -resistant nucleoside monophosphate kinase is selected from the group consisting of heat-resistant uridylic acid kinase, heat-resistant cytidinelic acid kinase, heat-resistant guanylic acid kinase, and heat-resistant adenylate kinase. .. 耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼが、耐熱性Pyrococcus furiosusウリジル酸キナーゼ（ＰｆＰｙｒＨ）、耐熱性Thermus thermophilusアデニル酸キナーゼ（ＴｔｈＡｄｋ）、耐熱性Thermus thermophilusシチジル酸キナーゼ（ＴｔｈＣｍｋ）、および耐熱性Thermotoga maritimaグアニル酸キナーゼ（ＴｍＧｍｋ）からなる群から選択され、および／または、耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼが、耐熱性Aquifex aeolicusヌクレオシド二リン酸キナーゼからなる群から選択され、および／または、耐熱性ポリリン酸キナーゼが、耐熱性ポリリン酸キナーゼ１（ＰＰＫ１）酵素および耐熱性ポリリン酸キナーゼ２（ＰＰＫ２）酵素からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。 Heat-resistant nucleoside monophosphate kinases are heat-resistant Pyrococcus furiosus uriodilic acid kinase (PfPyrH), heat-resistant Thermophilus adenylic acid kinase (TthAdk), heat-resistant Thermophilus citidilic acid kinase (TthCmk), and heat-resistant Thermophilus guanylate kinase. Selected from the group consisting of (TmGmk) and / or heat resistant nucleoside diphosphate kinase, and / or heat resistant polyphosphate kinase selected from the group consisting of heat resistant Aquifex aeolicus nucleoside diphosphate kinase. The method according to claim 3, which is selected from the group consisting of a heat-resistant polyphosphate kinase 1 (PPK1) enzyme and a heat-resistant polyphosphate kinase 2 (PPK2) enzyme. 耐熱性ＰＰＫ１酵素が、耐熱性Thermosynechococcus elongatus ＰＰＫ１酵素からなる群から選択され、および／または、耐熱性ＰＰＫ２酵素が、耐熱性クラスＩＩＩ ＰＰＫ２酵素からなる群から選択され、任意に、耐熱性クラスＩＩＩ ＰＰＫ２酵素が、Meiothermus ruber、Meiothermus silvanus、Deinococcus geothermalis、Thermosynechococcus elongates、Anaerolinea thermophile、Caldilinea aerophila、Chlorobaculum tepidum、Oceanithermus profundus、Roseiflexus castenholzii、Roseiflexus sp.、およびTruepera radiovctrix ＰＰＫ２酵素からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。 The thermostable PPK1 enzyme is selected from the group consisting of the thermostable Thermosynechococcus elongatus PPK1 enzyme and / or the thermostable PPK2 enzyme is selected from the group consisting of the thermostable class III PPK2 enzyme, optionally the thermostable class III PPK2. Enzymes are selected from Meiothermus ruber, Meiothermus silvanus, Deinococcus geothermalis, Thermosynechococcus elongates, Anaerolinea thermophile, Caldilinea aerophila, Chlorobaculum tepidum, Oceanitermus profundus, Roseiflexus castenholzii, Roseiflexus sp. The method described in. 耐熱性クラスＩＩＩ ＰＰＫ２酵素が、配列番号８～１８のいずれか１つによって同定されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む耐熱性クラスＩＩＩ ＰＰＫ２酵素からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。 Heat Resistant Class III PPK2 Enzyme contains an amino acid sequence that is at least 90%, at least 95%, or 100% identical to the amino acid sequence identified by any one of SEQ ID NOs: 8-18. The method of claim 5, selected from the group consisting of enzymes. ステップ（ａ）の細胞ライセート混合物が、少なくとも１つの耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼ、少なくとも１つの耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、および少なくとも１つの耐熱性ポリリン酸キナーゼを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。 Claims 1-6, wherein the cellular lysate mixture of step (a) comprises at least one heat resistant nucleoside monophosphate kinase, at least one heat resistant nucleoside diphosphate kinase, and at least one heat resistant polyphosphate kinase. The method described in any one of the items. ＡＴＰ再生系が、ポリリン酸を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the ATP regeneration system comprises polyphosphoric acid. ＡＴＰ再生系が、ヘキサメタリン酸、ヌクレオシド一リン酸、および／またはポリリン酸キナーゼを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the ATP regeneration system comprises hexametaphosphate, nucleoside monophosphate, and / or polyphosphoric acid kinase. エネルギー供給源、またはエネルギー供給源の少なくとも１つのコンポーネントがステップ（ｃ）の細胞ライセート混合物に追加される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。The method of any one of claims 1-9, wherein the energy source, or at least one component of the energy source, is added to the cellular lysate mixture of step (c). 少なくとも１つの精製された酵素または融合酵素がステップ（ａ）および／またはステップ（ｃ）の細胞ライセート混合物に追加され、該少なくとも１つの精製された酵素または融合酵素は、リボヌクレアーゼ、耐熱性キナーゼ、および／または耐熱性ＲＮＡポリメラーゼであり、ここでリボヌクレアーゼは、ＲＮａｓｅ ＲおよびヌクレアーゼＰ１からなる群から選択され、耐熱性キナーゼは、耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼ、耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、および耐熱性ポリリン酸キナーゼからなる群から選択され、耐熱性ＲＮＡポリメラーゼは、耐熱性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、耐熱性ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、および耐熱性Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。 At least one purified enzyme or fusion enzyme is added to the cellular lysate mixture of step (a) and / or step (c), and the at least one purified enzyme or fusion enzyme is ribonuclease, thermostable kinase, and / Or a heat resistant RNA polymerase, wherein the ribonuclease is selected from the group consisting of RNase R and nuclease P1, and the heat resistant kinases are heat resistant nucleoside monophosphate kinase, heat resistant nucleoside diphosphate kinase, and heat resistant. One of claims 1-10 , selected from the group consisting of polyphosphate kinase, the heat resistant RNA polymerase is selected from the group consisting of heat resistant T7 RNA polymerase, heat resistant SP6 RNA polymerase, and heat resistant T3 RNA polymerase. The method described in paragraph 1. （ｉ）ステップ（ａ）の細胞ライセート混合物が、関心のＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型を含む、および／または、
（ｉｉ）ステップ（ａ）の細胞ライセート混合物が、さらにＭｇ２＋キレート剤を含み、任意に、Ｍｇ２＋キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）であるか、または、ステップ（ａ）の細胞ライセート混合物が、さらに塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）および／または硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）を含む、および／または、
（ｉｉｉ）ステップ（ｂ）の温度が、５０℃～８０℃である、および／または、
（ｉｖ）関心のＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型がステップ（ｃ）の細胞ライセート混合物に追加される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。 (I) The cell lysate mixture of step (a) contains a DNA template encoding the RNA of interest and / or
(Ii) The cell lysate mixture of step (a) further comprises Mg 2+ chelating agent, and optionally the Mg 2+ chelating agent is ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) or the cell lysate mixture of step (a). Further contains manganese chloride (MnCl 2 ) and / or magnesium sulfate ( Л4 ), and / or
(Iii) The temperature in step (b) is between 50 ° C and 80 ° C and / or.
(Iv) The method of any one of claims 1-11 , wherein the DNA template encoding the RNA of interest is added to the cellular lysate mixture of step (c). 関心のＲＮＡが、一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡであり、任意に、一本鎖ＲＮＡが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、または、ヒンジドメインによって互いに連結された相補的なドメインを含有する一本鎖ＲＮＡであり、任意に、二本鎖ＲＮＡが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。 The RNA of interest is single-stranded RNA or double-stranded RNA, and optionally the single-stranded RNA is a messenger RNA (mRNA), an antisense RNA, or a complementary domain linked to each other by a hinge domain. The method according to any one of claims 1 to 12 , wherein the single-stranded RNA contained, optionally the double-stranded RNA, is a small interfering RNA (siRNA) or a short hairpin RNA (shRNA). .. 関心のＲＮＡが、少なくとも１ｇ／Ｌ、任意に少なくとも５ｇ／Ｌ、またはさらに任意に少なくとも１０ｇ／Ｌの濃度で生産される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。The method of any one of claims 1-13, wherein the RNA of interest is produced at a concentration of at least 1 g / L, optionally at least 5 g / L, or even optionally at least 10 g / L. 任意に、ステップ（ｃ）において生産された熱不活性化された細胞ライセート混合物と蛋白質沈殿剤とを組み合わせること、および沈殿した蛋白質、脂質、およびＤＮＡを除去することによって、関心のＲＮＡを精製することをさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。 Optionally, purify the RNA of interest by combining the heat-inactivated cellular lysate mixture produced in step (c) with a protein precipitant and removing the precipitated proteins, lipids, and DNA. The method according to any one of claims 1 to 14 , further comprising the above. 細胞が、細菌細胞または酵母細胞であり、任意に、細菌細胞が、Escherichia coli細胞である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 15 , wherein the cell is a bacterial cell or a yeast cell, and optionally the bacterial cell is an Escherichia coli cell. 細胞培養培地中で、（ａ）ＲＮＡを含む細胞と、（ｂ）少なくとも１つのリボヌクレアーゼ、少なくとも１つの耐熱性キナーゼ、および少なくとも１つの耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを含む細胞とを培養することを含む、リボ核酸（ＲＮＡ）を生合成する方法であって、ここでリボヌクレアーゼは、ＲＮａｓｅ ＲおよびヌクレアーゼＰ１からなる群から選択され、耐熱性キナーゼは、耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼ、耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、および耐熱性ポリリン酸キナーゼからなる群から選択され、耐熱性ＲＮＡポリメラーゼは、耐熱性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、耐熱性ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、および耐熱性Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択され、以下：
（ｉ）（ａ）および（ｂ）の細胞を溶解して細胞ライセートを生産することおよび該細胞ライセートを組み合わせて複数の酵素を含有する細胞ライセート混合物を生産すること；あるいは
（ｉｉ）（ａ）および（ｂ）の細胞を組み合わせること、および組み合わせられた細胞を溶解して複数の酵素を含有する細胞ライセート混合物を生産すること；および
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）または（ｉｉ）において生産された細胞ライセート混合物をインキュベートして、解重合したヌクレオシド一リン酸を含む細胞ライセート混合物を生産すること
をさらに含み、
ステップ（ｉｉｉ）において生産された細胞ライセート混合物を、耐熱性キナーゼおよび耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを完全に不活性化することなしに内在性ヌクレアーゼおよびホスファターゼを不活性化または部分的に不活性化する温度に加熱して、熱不活性化されたヌクレアーゼおよびホスファターゼを含む熱不活性化された細胞ライセート混合物を生産することをさらに含み、および、
熱不活性化された細胞ライセート混合物を、エネルギー供給源および関心のＲＮＡをコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）鋳型の存在下、ヌクレオシド三リン酸の生産およびヌクレオシド三リン酸の重合をもたらす条件下でインキュベートして、関心のＲＮＡを含む細胞ライセート混合物を生産することをさらに含み、ここで、エネルギー供給源は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）またはＡＴＰ再生系である、前記方法。 Revo, comprising culturing (a) RNA-containing cells and (b) cells containing at least one ribonuclease , at least one heat-resistant kinase, and at least one heat-resistant RNA polymerase in a cell culture medium. A method of biosynthesizing nucleic acid (RNA) , wherein the ribonuclease is selected from the group consisting of RNase R and nuclease P1, and the heat resistant kinases are heat resistant nucleoside monophosphate kinase, heat resistant nucleoside diphosphate kinase. , And the group consisting of heat-resistant polyphosphate kinase, the heat-resistant RNA polymerase is selected from the group consisting of heat-resistant T7 RNA polymerase, heat-resistant SP6 RNA polymerase, and heat-resistant T3 RNA polymerase.
(I) To lyse the cells of (a) and (b) to produce a cell lysate and to combine the cell lysates to produce a cell lysate mixture containing a plurality of enzymes; or (ii) (a). And (b) combining cells and lysing the combined cells to produce a cellular lysate mixture containing multiple enzymes ; and
(Iii) Incubating the cellular lysate mixture produced in step (i) or (ii) to produce a cellular lysate mixture containing a depolymerized nucleoside monophosphate.
Including
Bring the cellular lysate mixture produced in step (iii) to a temperature that inactivates or partially inactivates the endogenous nuclease and phosphatase without completely inactivating the heat-resistant kinase and heat-resistant RNA polymerase . Further comprising heating to produce a heat-inactivated cellular lysate mixture containing a heat-inactivated nuclease and phosphatase , and
Incubate the heat-inactivated cellular lysate mixture in the presence of an energy source and a deoxyribonucleic acid (DNA) template encoding the RNA of interest under conditions that result in the production of nucleoside triphosphate and the polymerization of nucleoside triphosphate. The method further comprises producing a cellular lysate mixture comprising the RNA of interest, wherein the energy source is adenosine triphosphate (ATP) or an ATP regeneration system. 請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法における使用のための細胞ライセートであって、少なくとも１つのリボヌクレアーゼ、少なくとも１つの耐熱性キナーゼ、および少なくとも１つの耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを含み、ここでリボヌクレアーゼは、ＲＮａｓｅ ＲおよびヌクレアーゼＰ１からなる群から選択され、耐熱性キナーゼは、耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼ、耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、および耐熱性ポリリン酸キナーゼからなる群から選択され、耐熱性ＲＮＡポリメラーゼは、耐熱性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、耐熱性ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、および耐熱性Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択され、任意に、エネルギー供給源、ヌクレオシド一リン酸、および５’－ヌクレオシド一リン酸から５’－ヌクレオシド三リン酸への変換を直接的または間接的に触媒するキナーゼをさらに含み、ここで、エネルギー供給源は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）またはＡＴＰ再生系であり、および／または、任意に、
該細胞ライセートおよび／または該細胞ライセートの少なくとも１つのコンポーネントは改変細胞および／または細菌細胞から得られ、任意に細菌細胞が、Escherichia coli細胞である、前記細胞ライセート。 A cell lysate for use in the method of any one of claims 1-17 , comprising at least one ribonuclease, at least one thermostable kinase, and at least one thermostable RNA polymerase. Here, the ribonuclease is selected from the group consisting of RNase R and nuclease P1, and the heat resistant kinase is selected from the group consisting of heat resistant nucleoside monophosphate kinase, heat resistant nucleoside diphosphate kinase, and heat resistant polyphosphate kinase. The heat-resistant RNA polymerase is selected from the group consisting of heat-resistant T7 RNA polymerase, heat-resistant SP6 RNA polymerase, and heat-resistant T3 RNA polymerase, and optionally an energy source, nucleoside monophosphate, and 5'-nucleoside one. It further comprises a kinase that directly or indirectly catalyzes the conversion of phosphoric acid to 5'-nucleoside triphosphate, where the energy source is adenosine triphosphate (ATP) or an ATP regeneration system, and / Or optionally,
The cell lysate and / or at least one component of the cell lysate is obtained from modified cells and / or bacterial cells, optionally the bacterial cell is an Escherichia coli cell, said cell lysate.
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