JPWO2019124461A1

JPWO2019124461A1 - 抗体断片多量体分子、医薬品、抗腫瘍剤、自己免疫疾患治療剤及び抗体断片多量体分子の作製方法

Info

Publication number: JPWO2019124461A1
Application number: JP2019560543A
Authority: JP
Inventors: 勝実前仲; 高志田所
Original assignee: Hokkaido University NUC
Current assignee: Hokkaido University NUC
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2020-12-24
Also published as: WO2019124461A1

Abstract

抗体断片多量体分子は、一本鎖Ｆｖ抗体断片の２以上の多量体であり、抗原に対して、１０−３〜１０３ｎＭの見かけの解離定数ＫＤを有し、前記一本鎖Ｆｖ抗体断片は、前記抗原に対して、１０−５〜１０２ｓ−１の解離速度定数ｋｏｆｆを有し、かつ１０−１〜１０５ｎＭの解離定数ＫＤを有する、ことを特徴とする。

Description

本発明は、抗体断片多量体分子、医薬品、抗腫瘍剤、自己免疫疾患治療剤及び抗体断片多量体分子の作製方法に関する。

近年、抗体医薬品の研究が積極的に進められている。癌治療用の抗体医薬品は、癌特異的に発現している抗原を標的とし、高い治療効果が得られる場合があることから、癌治療薬として期待が高まっている。

しかしながら、例えばＩｇＧの全長抗体は、約１５０ｋＤａという大きな分子量を有するため、組織浸透性及び血中滞留性が悪く、また製造コストが高くなり、薬価が高いといった問題があった。さらに、癌抗原に対する結合が強すぎるために、細胞内に取り込まれにくいということ、また、癌組織においては組織の形態や抗原発現が均一ではなく、抗体の高い親和性による不要な癌抗原を発現する正常細胞への結合もあり、実際には投与したＩｇＧのごく少量（０．００３−０．０１％）しか癌組織に蓄積しないことが明らかにされている（非特許文献１）。このように、抗体医薬品の薬効が不十分である場合があることが問題視されてきた。

そこで、抗体医薬品による治療効果を高めるための提案がいくつかなされている。非特許文献２には、抗体医薬品と低分子薬との併用により、一定の治療効果が認められた例が報告されている。また、抗体に薬物を連結させる抗体−薬物コンジュゲート（Ａｎｔｉｂｏｄｙｄｒｕｇｃｏｎｊｕｇａｔｅ：ＡＤＣ）を利用した方法も提案されている（非特許文献３）。ＡＤＣは、高い標的選択性をもつ抗体を薬物の運搬役とし、抗体に連結した薬物に薬効を担わせるように設計されている。

ＳｅｄｌａｃｅｋＨ−Ｈｅｔａｌ．ＣｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓｔｏＯｎｃｏｌｏｇｙ１９９２，４３，１−１４５．ＲｏｂｅｒｔＮｅｔａｌ．ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ．２００６，２４，２７８６−２７９２．ＪｕｎｕｔｕｌａＪＲｅｔａｌ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８，２６，９２５−９３２．

しかしながら、非特許文献２に記載の低分子薬との併用では、低分子薬自体が強い副作用を示すことが多く、また治療効果の点でも課題を残していた。また、非特許文献３に記載のＡＤＣでは、全長抗体を基本骨格としたものが主流であり、副作用、高薬価等の問題があった。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、高度な標的選択性及び親和性を有するとともに低コストである抗体断片多量体分子、医薬品、抗腫瘍剤、自己免疫疾患治療剤、抗体断片多量体分子の作製方法及び一本鎖Ｆｖ抗体断片を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係る抗体断片多量体分子は、
一本鎖Ｆｖ抗体断片の２以上の多量体であり、
抗原に対して、１０^−３〜１０^３ｎＭの見かけの解離定数Ｋ_Ｄを有し、
前記一本鎖Ｆｖ抗体断片は、前記抗原に対して、１０^−５〜１０^２ｓ^−１の解離速度定数ｋ_ｏｆｆを有し、かつ１０^−１〜１０^５ｎＭの解離定数Ｋ_Ｄを有する。

例えば、前記一本鎖Ｆｖ抗体断片は、重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域の少なくとも１つのアミノ酸配列において変異を有する。

例えば、前記一本鎖Ｆｖ抗体断片の重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されている。

例えば、前記一本鎖Ｆｖ抗体断片は、重鎖の可変領域の少なくとも１つのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入され、かつ、軽鎖の可変領域の少なくとも１つのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されている。

本発明の第２の観点に係る医薬品は、本発明の第１の観点に係る抗体断片多量体分子からなる。

本発明の第３の観点に係る抗腫瘍剤は、本発明の第１の観点に係る抗体断片多量体分子からなる。

本発明の第４の観点に係る自己免疫疾患治療剤は、本発明の第１の観点に係る抗体断片多量体分子からなる。

本発明の第５の観点に係る抗体断片多量体分子は、腫瘍の治療に使用するための抗体断片多量体分子である。

本発明の第６の観点に係る抗体断片多量体分子は、自己免疫疾患の治療に使用するための抗体断片多量体分子である。

本発明の第７の観点に係る抗体断片多量体分子の作製方法は、
抗原に対して、１０^−５〜１０^２ｓ^−１の解離速度定数ｋ_ｏｆｆを有し、かつ１０^−１〜１０^５ｎＭの解離定数Ｋ_Ｄを有する一本鎖Ｆｖ抗体断片を、２以上の多量体に多量体化することで、前記抗原に対して、１０^−３〜１０^３ｎＭの見かけの解離定数Ｋ_Ｄを有する抗体断片多量体分子を得る工程を含む。

例えば、前記一本鎖Ｆｖ抗体断片の重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域において少なくとも１つのアミノ酸配列において変異を生じさせる。

例えば、前記一本鎖Ｆｖ抗体断片の重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域において、１又は数個のアミノ酸を置換、欠失、付加又は挿入させる。

本発明の第８の観点に係る抗体断片多量体分子の作製方法は、
抗原に対して、１０^−５〜１０^２ｓ^−１の解離速度定数ｋ_ｏｆｆを有し、かつ１０^−１〜１０^５ｎＭの解離定数Ｋ_Ｄを有する一本鎖Ｆｖ抗体断片を用いる。

本発明の第９の観点に係る一本鎖Ｆｖ抗体断片は、
抗原に対して、１０^−５〜１０^２ｓ^−１の解離速度定数ｋ_ｏｆｆを有し、かつ１０^−１〜１０^５ｎＭの解離定数Ｋ_Ｄを有する。

本発明によれば、高度な標的選択性及び親和性を有するとともに低コストである抗体断片多量体分子、医薬品、抗腫瘍剤、自己免疫疾患治療剤、抗体断片多量体分子の作製方法及び一本鎖Ｆｖ抗体断片を提供することができる。

（ａ）はトラスツズマブの全長抗体を模式的に示す図であり、（ｂ）はｓｃＦｖを模式的に示す図であり、（ｃ）はｓｃＦｖの構造を模式的に示す図である。（ａ）は分子設計の概念図であり、（ｂ）は抗体断片多量体分子の期待される効果について説明した図である。速度論的パラメーターの求め方を説明した図である。（ａ）は一実施形態によるｓｃＦｖ変異体の構造を模式的に示す図であり、（ｂ）はトラスツズマブの各ＣＤＲを模式的に示した図である。（ａ）はトラスツズマブの抗原結合部を示した図であり、（ｂ）は抗原との結合に関わるＣＤＲ１及びＣＤＲ２（重鎖ＣＤＲ周辺）におけるアミノ酸残基を示した図であり、（ｃ）は軽鎖ＣＤＲ周辺におけるアミノ酸残基を示した図である。（ａ）は二量体を形成するＧＣＮロイシンジッパーを模式的に示した図であり、（ｂ）は三量体を形成する軟骨マトリックスタンパク質を模式的に示した図であり、（ｃ）は五量体を形成する軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質を模式的に示した図であり、（ｄ）は二量体である抗原断片多量体分子を模式的に示した図であり、（ｅ）は三量体である抗原断片多量体分子を模式的に示した図であり、（ｆ）は五量体である抗原断片多量体分子を模式的に示した図である。ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ベクターを説明した図である。ｓｃＦｖ−ＬＨ−ｄｉｍｅｒの遺伝子配列を示す図である。ｓｃＦｖ−ＬＨ−ｔｒｉｍｅｒの遺伝子配列を示す図である。ｓｃＦｖ−ＬＨ−ｐｅｎｔａｍｅｒの遺伝子配列を示す図である。（ａ）はｐＥＴ２２ｂ−ｗｔ−ｐｅｎｔａｍｅｒの作製方法を示す図であり、（ｂ）はｐＥＴ２２ｂ−ｗｔ−ｄｉｍｅｒ及びｐＥＴ２２ｂ−ｗｔ−ｔｒｉｍｅｒの作製方法を示す図である。変異導入の方法について説明した図である。多量体への変異導入の方法について説明した図である。（ａ）はｓｃＦｖ変異体を模式的に示した図であり、（ｂ）は比較例の野生型多量体分子を模式的に示した図であり、（ｃ）は実施例の抗体断片多量体分子を模式的に示した図である。（ａ）はＳＥＣ−ＭＡＬＳを説明した図であり、（ｂ）はＳＥＣ−ＭＡＬＳによる多量体化進行確認のグラフ図である。（ａ）はアナライトと固定化されたリガンドとの相互作用の様子を模式的に示した図であり、（ｂ）はｓｃＦｖ変異体又は実施例の抗体断片多量体分子の抗原ＨＥＲ２との速度論的相互作用解析の図である。（ａ）はＨＥＲ２−ＥＣＤ及びＥＧＦＲ−ＥＣＤを模式的に示した図であり、（ｂ）はＥＧＦＲ及びＥＧＦＲ−ＥＣＤの構造を模式的に表した図であり、（ｃ）はｐＦａｓｔＢａｃベクターを説明した図であり、（ｄ）は抗原結合特異性実験のグラフ図である。多量体化によるアビディティ効果検証のグラフ図である。（ａ）はｗｔ−ｄｉｍｅｒ、（ｂ）はｗｔ−ｔｒｉｍｅｒ、（ｃ）はｗｔ−ｐｅｎｔａｍｅｒのグラフ図である。癌細胞表面抗原への抗体滞留性評価のグラフ図である。（ａ）は抗体残存率の時間変化を示したグラフ図であり、（ｂ）は３時間後抗体残存率のグラフ図である。（ａ）はセツキシマブの抗原結合部を示した図であり、（ｂ）は抗原との結合に関わるＣＤＲ１におけるアミノ酸残基を示した図であり、（ｃ）はアナライトと固定化されたリガンドとの相互作用の様子を模式的に示した図であり、（ｄ）はｓｃＦｖ変異体の抗原との速度論的相互作用解析の図である。

まず、本実施形態による抗体断片多量体分子について詳細に説明する。

本発明者らは、標的組織（例えば、癌組織）への蓄積率の向上及び正常細胞への結合の阻止を目的とした、正常細胞と標的細胞（例えば、癌細胞）とを高度に識別する抗体医薬品を開発するために、本実施形態による抗体断片多量体分子を発明した。具体的には、高分子量の全長抗体（図１（ａ））ではなく、標的細胞への標的化能を持ちつつ低分子化した抗体フラグメント、具体的には、一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎｆｒａｇｍｅｎｔｖａｒｉａｂｌｅ：ｓｃＦｖ）（図１（ｂ））が利用される。ｓｃＦｖは全長抗体より低分子量であるため、組織浸透性及び血中滞留性が改善することが知られている。この一本鎖Ｆｖ抗体断片について、標的抗原（例えば、癌抗原）への特異性を維持したまま、例えば一価あたりの親和性を意図して低減させ、これを多量体化することで、抗体断片多量体分子を作製する（図２（ａ）、（ｂ））。本実施形態による抗体断片多量体分子は、結合価数の増加によってアビディティ効果が得られ、高い標的選択性及び高い親和性を有する。また、抗原発現がごくわずかである正常細胞に留まることが低減され、抗原が密に発現している標的細胞（例えば、癌細胞）に特異的に蓄積することができる。一方で、正常細胞からは容易に離脱することができ、優れた薬効及び副作用の低減を実現することができる。

本実施形態による抗体断片多量体分子は、一本鎖Ｆｖ抗体断片の２以上の多量体であり、１０^−３〜１０^３ｎＭの見かけの解離定数Ｋ_Ｄを有し、好ましくは、１０^−３〜１０^１ｎＭの見かけの解離定数Ｋ_Ｄを有する。

本明細書において、「一本鎖Ｆｖ抗体断片」（ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎｆｒａｇｍｅｎｔｖａｒｉａｂｌｅ：ｓｃＦｖ）は、全抗体のうちＶＬ（軽鎖の可変領域）及びＶＨ（重鎖の可変領域）を残して低分子化したフラグメントである。後述するように、低下した抗原結合能を有していてもよい。本明細書において、「ｓｃＦｖ」と称される場合がある。

本実施形態による一本鎖Ｆｖ抗体断片は、抗原結合能の程度として、１０^−５〜１０^２ｓ^−１の解離速度定数ｋ_ｏｆｆを有し、かつ１０^−１〜１０^５ｎＭの解離定数Ｋ_Ｄを有する。本実施形態による一本鎖Ｆｖ抗体断片は、好ましくは１〜１０^５ｎＭの解離定数Ｋ_Ｄを有する。

本実施形態による一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）の抗原に対する解離速度定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｒａｔｅｃｏｎｓｔａｎｔ、単位：ｓ^−１）ｋ_ｏｆｆは、任意の方法により求めることができるが、例えば、表面プラズモン共鳴法（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア社製）を用いた相互作用解析）により測定したセンサグラムより求めることができる。Ｂｉａｃｏｒｅを用いた相互作用解析において、より具体的には、以下（ｉ）〜（ｉｖ）（図３）に従って、該センサグラムにおける結合相と解離相とから、近似式によりｋ_ｏｎとｋ_ｏｆｆとを算出することができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｂｆ．ｕｎｉ−ｌｊ．ｓｉ／ｂｉ／ｓｐｒｃｅｎｔｅｒ／ＢｉａｃｏｒｅＴ１００／Ｓｅｓｓｉｏｎ５％２０ＢａｓｉｃＫｉｎｅｔｉｃｓ．ｐｄｆを参照）。
（ｉ）ある濃度のアナライト（ｓｃＦｖ変異体）をリガンド（抗原）又はコントロール（例えば、ＢＳＡ）に送液し、データ（センサグラム）を取得する。
（ｉｉ）Ｂｉａｃｏｒｅシステムに備えられた解析ソフトにより、得られたセンサグラムを差し引きする。この場合、（センサグラムＡ）−（センサグラムＢ）を実施。
（ｉｉｉ）異なるアナライト濃度に対して同様の実験を実施する。（ｉ）及び（ｉｉ）を繰り返す。
（ｉｖ）Ｂｉａｃｏｒｅシステムに備えられた解析ソフトにより、１：１結合モデル（Ｌａｎｇｍｕｉｒｂｉｎｄｉｎｇｍｏｄｅｌ）に近似することで速度論的パラメーター（ｋ_ｏｎ及びｋ_ｏｆｆ）が算出される。近似式を以下に示す。

本実施形態による一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）の抗原に対する解離定数Ｋ_Ｄ（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｃｏｎｓｔａｎｔ、単位：Ｍ）は、式：解離定数Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎにより求めることができる。なお、解離定数Ｋ_Ｄは、表面プラズモン共鳴、ＥＬＩＳＡ、等温滴定カロリメトリー等のいずれの任意の方法からも、スキャッチャード・プロット、又は各装置の添付文書に従った解析を行うことで、求めることができる。

本実施形態による抗体断片多量体分子は、抗原に対して、１０^−３〜１０^３ｎＭの見かけの解離定数Ｋ_Ｄを有する。本実施形態による抗体断片多量体分子の抗原に対する「見かけの解離定数Ｋ_Ｄ（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｃｏｎｓｔａｎｔ、単位：Ｍ）」は、式：「見かけの解離定数Ｋ_Ｄ」＝「見かけのｋ_ｏｆｆ」／「見かけのｋ_ｏｎ」により求めることができ、見かけのｋ_ｏｆｆ及びｋ_ｏｎは、任意の方法により求めることができるが、例えば、表面プラズモン共鳴法（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア社製）を用いた相互作用解析）により測定したセンサグラムより求めることができる。Ｂｉａｃｏｒｅを用いた相互作用解析より具体的には、以下（ｉ）〜（ｉｖ））（図３）に従って、該センサグラムにおける結合相と解離相とから、近似式により見かけのｋ_ｏｎとｋ_ｏｆｆとを算出することができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｂｆ．ｕｎｉ−ｌｊ．ｓｉ／ｂｉ／ｓｐｒｃｅｎｔｅｒ／ＢｉａｃｏｒｅＴ１００／Ｓｅｓｓｉｏｎ５％２０ＢａｓｉｃＫｉｎｅｔｉｃｓ．ｐｄｆを参照）。
（ｉ）ある濃度のアナライト（抗体断片多量体分子）をリガンド（抗原）又はコントロール（例えば、ＢＳＡ）に送液し、データ（センサグラム）を取得する。
（ｉｉ）Ｂｉａｃｏｒｅシステムに備えられた解析ソフトにより、得られたセンサグラムを差し引きする。この場合、（センサグラムＡ）−（センサグラムＢ）を実施。
（ｉｉｉ）異なるアナライト濃度に対して同様の実験を実施する。（ｉ）及び（ｉｉ）を繰り返す。
（ｉｖ）Ｂｉａｃｏｒｅシステムに備えられた解析ソフトにより、１：１結合モデル（Ｌａｎｇｍｕｉｒｂｉｎｄｉｎｇｍｏｄｅｌ）に近似することで速度論的パラメーター（ｋ_ｏｎ、ｋ_ｏｆｆ、Ｋ_Ｄ；Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎより求まる。）が算出される。多量体解析の場合、例えば３重合体について３個全てが結合したときのセンサグラムと、２個又は１個が結合したときのセンサグラムと、を分けて考えることができないため、センサグラムが表しているものを便宜上１：１結合したとみなして近似することで解析する。そのため、解析した結果は、“見かけの”１：１結合という表現になり、各パラメーターについても系の中で１：１結合が起こったときのものと解釈される。近似式を以下に示す。

一本鎖Ｆｖ抗体断片の解離定数Ｋ_Ｄと抗体断片多量体分子の見かけの解離定数Ｋ_Ｄとの関係について、抗体断片多量体分子の見かけの解離定数Ｋ_Ｄは、一本鎖Ｆｖ抗体断片の解離定数Ｋ_Ｄより低いことが好ましく、抗体断片多量体分子の見かけの解離定数Ｋ_Ｄは一本鎖Ｆｖ抗体断片の解離定数Ｋ_Ｄの１／１０以下であることがより好ましく、抗体断片多量体分子の見かけの解離定数Ｋ_Ｄは一本鎖Ｆｖ抗体断片の解離定数Ｋ_Ｄの１／１００以下であることがさらに好ましい。

本実施形態による「一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）」は、重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域の少なくとも１つのアミノ酸配列において変異を有することで、低下した抗原結合能を有していてもよい。本明細書において、重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域の少なくとも１つのアミノ酸配列において変異を有する一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）を、「一本鎖Ｆｖ抗体断片変異体（ｓｃＦｖ変異体）」と称する場合がある。一本鎖Ｆｖ抗体断片変異体（ｓｃＦｖ変異体）の抗原結合特異性を維持する限り、重鎖の可変領域のみにおいて変異を有していてもよく、軽鎖の可変領域のみにおいて変異を有していてもよく、又は重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域の両方の領域において変異を有していてもよい。

「重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域の少なくとも１つのアミノ酸配列において変異を有する」とは、例えば、一本鎖Ｆｖ抗体断片変異体（ｓｃＦｖ変異体）が、抗原結合能が低下するように、重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域の少なくとも１つのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されていてもよい。「１又は数個」とは、１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個を指す。一本鎖Ｆｖ抗体断片変異体（ｓｃＦｖ変異体）が１０^−５〜１０^２ｓ^−１の解離速度定数ｋ_ｏｆｆを有し、かつ１０^−１〜１０^５ｎＭの解離定数Ｋ_Ｄを有する限り、「１又は数個」の数は特に制限なく選択され得る。なお、抗原結合能を低下させるために、一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）のアミノ酸配列において変異を有するようにする手段は特に制限はなく、例えば、重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域の少なくとも１つを構造的に変化させることで（例えば、小分子を結合させる等）、抗原との相互作用を弱めて、抗原結合能を低下させてもよい。

重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域において、１又は数個のアミノ酸が置換される場合、例えば、抗原との結合に関わるアミノ酸残基を他の種類のアミノ酸残基に置換することができる。例えば、抗原における特定のアミノ酸残基と、一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基と、の間でソルトブリッジを形成する場合には、一本鎖Ｆｖ抗体断片のアミノ酸配列におけるカチオン性の残基又はアニオン性の残基を中性のアミノ酸残基に置換してもよい。また例えば、抗原における特定のアミノ酸残基と、一本鎖Ｆｖ抗体断片のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基と、の間でΠ結合を形成する場合には、一本鎖Ｆｖ抗体断片のアミノ酸配列における当該アミノ酸残基を他のアミノ酸残基（例えば、中性のアミノ酸残基）に置換してもよい。

重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）において、１又は数個のアミノ酸が置換される場合、例えば、Ｈ−ＣＤＲ１（ＶＨの相補性決定領域１）、Ｈ−ＣＤＲ２（ＶＨの相補性決定領域２）、Ｌ−ＣＤＲ１（ＶＬの相補性決定領域１）及びＬ−ＣＤＲ２（ＶＬの相補性決定領域２）の少なくとも１つのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換されていてもよい。また、重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）において、立体構造上、抗原との結合に深く関与するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換してもよい。

一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）は、重鎖の可変領域の少なくとも１つのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入され、かつ、軽鎖の可変領域の少なくとも１つのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されているのが好ましい。つまり、ＶＬ（軽鎖の可変領域）及びＶＨ（重鎖の可変領域）の両方において変異を有する（１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されている）ことが好ましい。ＶＬ及びＶＨの両方のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されていることで、より効率的に一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）の抗原との相互作用を弱めて、抗原結合能を低下させることができる。

本実施形態による抗体断片多量体分子は、一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）の２以上の多量体であるが、多量体化の数は特に制限はなく、例えば、二量体、三量体、五量体、十量体等でもよく、本発明の効果を奏する限り、任意の多量体化の数を採用することができる。多量体化の方法は、任意の手法を用いることができ、例えば図４（ａ）に示すように、公知の多量体形成ペプチド（ｍｕｌｔｉｍｅｒ）を利用してもよい。ｍｕｌｔｉｍｅｒとして例えば、二量体を形成するために、例えばＧＣＮロイシンジッパー、三量体を形成するために、例えば軟骨マトリックスタンパク質、五量体を形成するために、例えば軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質由来のタンパク質を用いることができる（図６）。また、一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）同士をＳ−Ｓ結合等により連結させて、多量体化させてもよい。さらに、他の手法（例えば、ＰｈｉｌｉｐｐＨｏｌｌｉｇｅｒ＆ＰｅｔｅｒＪＨｕｄｓｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄａｎｔｉｂｏｄｙｆｒａｇｍｅｎｔｓａｎｄｔｈｅｒｉｓｅｏｆｓｉｎｇｌｅｄｏｍａｉｎｓ，ＮＡＴＵＲＥＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬＵＭＥ２３ＮＵＭＢＥＲ９ＳＥＰＴＥＭＢＥＲ２００５，１１２６−１１３６；ＭａｎｅｅｓｈＪａｉｎｅｔａｌ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＴＲＥＮＤＳｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．２５Ｎｏ．７，３０７−３１６；ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙ，ＶＯＬＵＭＥ１７，ＡＵＧＵＳＴ，２０１８，５３１−５３３）により多量体化させてもよい。

一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）の元となる全長抗体として、いかなる種類のモノクローナル抗体を用いてもよい。例えば、抗体医薬品として使用可能なモノクローナル抗体を用いることができる。例えば、以下に列挙されるモノクローナル抗体を用いることができるが、以下に限定されるものではない。
・ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ
軽鎖配列：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
重鎖配列：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
・ｒｉｔｕｘｉｍａｂ
軽鎖配列：ＱＩＶＬＳＱＳＰＡＩＬＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨＷＦＱＱＫＰＧＳＳＰＫＰＷＩＹＡＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＴＳＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
重鎖配列：ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＮＭＨＷＶＫＱＴＰＧＲＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＮＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＡ
・ｃｅｔｕｘｉｍａｂ
軽鎖配列：ＤＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号３５）
重鎖配列：ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＮＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号３６）
・ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ
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本実施形態による抗体断片多量体分子は、一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）の２以上の多量体であるが、ｓｃＦｖの元となる全長抗体の種類は１つであってもよく（ホモ多量体分子）、２つ以上であってもよい（ヘテロ多量体分子）。例えば、抗体断片多量体分子がトラスツズマブを用いた三量体である場合、（ｉ）３つのｓｃＦｖがすべてトラスツズマブのｓｃＦｖであってもよく（ホモ多量体分子）、（ｉｉ）３つのｓｃＦｖのうち、２つがトラスツズマブのｓｃＦｖであり、他１つがトラスツズマブとは異なる抗体のｓｃＦｖであってもよく（ヘテロ多量体分子）、（ｉｉｉ）３つのｓｃＦｖのうち、１つがトラスツズマブのｓｃＦｖであり、他１つがトラスツズマブとは異なる抗体のｓｃＦｖであり、他１つがトラスツズマブとも前記他１つとも異なる抗体のｓｃＦｖであってもよい（ヘテロ多量体分子）。なお、抗体断片多量体分子の分子量は、良好な浸透性の観点から、ホモ多量体分子である場合、一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）の元となる全長抗体の分子量より小さいことが好ましく、ヘテロ多量体分子である場合、ＩｇＧ抗体の分子量（１５０〜１６０ｋＤａ）より小さいことが好ましい。

本明細書において「抗原」は、生体内において免疫反応を引き起こさせる物質であれば制限されることなく選択され得る。一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）の元となる全長抗体として、例えば、トラスツズマブを用いる場合、抗原は、例えば、ＨＥＲ２（ｈｕｍａｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ２）となる。

本実施形態による一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）において、ＶＨとＶＬとは、任意のリンカーによって連結されており（図４（ａ））、例えば、（Ｇ_４Ｓ）_３が挙げられる。

本実施形態による一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）において、多量体化するためのｍｕｌｔｉｍｅｒは、任意の領域に連結することができ、例えば、ＶＨのＣ末端にリンカー（例えば、アミノ酸配列ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ）を介してｍｕｌｔｉｍｅｒが連結されてもよい。

本実施形態による一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）において、例えばｍｕｌｔｉｍｅｒに、血中滞留、癌組織特異的薬物送達等を目的としたコンジュゲートを結合させてもよい。

次に、抗体断片多量体分子の作製方法について説明する。

本実施形態による抗体断片多量体分子の作製方法は、抗原に対して、１０^−５〜１０^２ｓ^−１の解離速度定数ｋ_ｏｆｆを有し、かつ１０^−１〜１０^５ｎＭの解離定数Ｋ_Ｄを有する一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）を、２以上の多量体に多量体化することで、前記抗原に対して、１０^−３〜１０^３ｎＭの見かけの解離定数Ｋ_Ｄを有する抗体断片多量体分子を得る工程を含む。

ｓｃＦｖの解離速度定数ｋ_ｏｆｆ及び解離定数Ｋ_Ｄの詳細及び求め方、並びに抗体断片多量体分子の見かけの解離定数Ｋ_Ｄの詳細及び求め方については、前述の通りである。抗体断片多量体分子を調製する方法は、例えば、まず、任意の遺伝子組換え技術を用いて、ｓｃＦｖ及び多量体形成ペプチド（ｍｕｌｔｉｍｅｒ）をコードする遺伝子を発現ベクター等に組み込んだ組換えベクターを構築し、次いで、任意の各種形質転換法により、構築した組換えベクターを宿主に導入して形質転換体を得、これを培養することにより、抗体断片多量体分子を発現させ、回収することにより行うことができる。多量体形成ペプチド（ｍｕｌｔｉｍｅｒ）の詳細については、前述同様である。

所定の解離速度定数ｋ_ｏｆｆ及び解離定数Ｋ_Ｄを有するｓｃＦｖを得るために、ｓｃＦｖの重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域の少なくとも１つのアミノ酸配列において変異を生じさせることで、抗原結合能を低下させてもよい。この場合、抗体断片多量体分子は、所定の解離速度定数ｋ_ｏｆｆ及び解離定数Ｋ_Ｄを有する「ｓｃＦｖ変異体」の多量体となる。具体的には、例えば、ｓｃＦｖ及びｍｕｌｔｉｍｅｒをコードする遺伝子を発現ベクター等に組込んだ組換えベクターを構築した後に、重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域の少なくとも１つのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸を置換、欠失、付加又は挿入させるように、ＰＣＲ法等の任意の方法により、ｓｃＦｖをコードする遺伝子に変異を導入してもよい。また、重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域の少なくとも１つのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸を置換、欠失、付加又は挿入させるように、ＰＣＲ法等の任意の方法により、ｓｃＦｖをコードする遺伝子に変異を導入した後に、組換えベクターを構築してもよい。なお、抗原結合特異性を維持する限り、重鎖の可変領域のみにおいて変異を有するように変異導入してもよく、軽鎖の可変領域のみにおいて変異を有するように変異導入してもよく、又は重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域の両方の領域において変異を有するように変異導入してもよい。変異導入の詳細については、前述同様である。

ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ変異体を含む）の多量体化については、上述のｍｕｌｔｉｍｅｒを利用する方法の他、例えば、ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ変異体を含む）同士を任意の手法によりＳ−Ｓ結合等により連結させて、多量体化させてもよい。

形質転換体の作製に使用される宿主は、導入された組換えベクター等からｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ変異体を含む）を発現し得るものであれば、特に限定はされず、例えば、ヒトやマウス等の各種動物に由来する細胞、各種昆虫に由来する細胞、大腸菌などの原核細胞、酵母などの真核細胞、植物細胞等、宿主となり得る任意の細胞を使用することができる。

ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ変異体を含む）の作製は、具体的には、上述の形質転換体を培養する工程と、得られる培養物からｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ変異体を含む）を採取する工程とを含む方法により行うことができる。ここで、「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。上記形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。目的のタンパク質は、上記培養物中に蓄積される。

ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ変異体を含む）が細胞外に生産される場合は、培養液をそのまま使用するか、遠心分離やろ過等により細胞を除去する。その後、必要に応じて硫安沈澱による抽出等により、培養物中からｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ変異体を含む）を採取し、さらに必要に応じて透析、各種クロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等）を用いて単離精製することができる。

ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ変異体を含む）が細胞内に生産される場合は、細胞を破砕することによりｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ変異体を含む）を採取することができる。可溶性画分にｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ変異体を含む）が含まれる場合は、破砕後、遠心分離や濾過などにより、必要に応じて細胞の破砕残渣（細胞抽出液不溶性画分を含む）を除く。残渣除去後の上清は、細胞抽出液可溶性画分であり、粗精製したタンパク質溶液とすることができる。一方、不溶性画分に封入体としてｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ変異体を含む）が発現する場合は、破砕後、遠心分離により不溶性画分を単離し、界面活性剤等を含んだバッファーで洗浄、遠心を繰り返すことにより、細胞の破砕残渣を取り除く。得られた封入体はグアニジンや尿素などの変性剤を含むバッファーで可溶化した後、希釈法や透析法を利用した蛋白質の巻き戻しを行う。機能的に巻き戻ったｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ変異体を含む）の精製は各種クロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等）を用いて単離精製することができる。

また、ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ変異体を含む）の産生は、形質転換体を用いたタンパク質合成系のほか、生細胞を全く使用しない無細胞タンパク質合成系を用いて行うこともでき、産生されたｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ変異体を含む）は、クロマトグラフィー等の手段を適宜選択して精製することができる。

他の観点における抗体断片多量体分子の作製方法は、抗原に対して、１０^−５〜１０^２ｓ^−１の解離速度定数ｋ_ｏｆｆを有し、かつ１０^−１〜１０^５ｎＭの解離定数Ｋ_Ｄを有する一本鎖Ｆｖ抗体断片を用いる、ことを特徴とする。一本鎖Ｆｖ抗体断片、ｓｃＦｖの解離速度定数ｋ_ｏｆｆ及び解離定数Ｋ_Ｄの詳細及び求め方については、前述の通りである。

次に、一本鎖Ｆｖ抗体断片について説明する。

本実施形態による一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）は、抗原に対して、１０^−５〜１０^２ｓ^−１の解離速度定数ｋ_ｏｆｆを有し、かつ１０^−１〜１０^５ｎＭの解離定数Ｋ_Ｄを有する。一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖの解離速度定数ｋ_ｏｆｆ及び解離定数Ｋ_Ｄの詳細及び求め方については、前述の通りである。

本実施形態による一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）は、例えば、重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域の少なくとも１つのアミノ酸配列において変異を有していてもよく、例えば、重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域の少なくとも１つのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されていてもよい。ｓｃＦｖは好ましくは、重鎖の可変領域の少なくとも１つのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入され、かつ、軽鎖の可変領域の少なくとも１つのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されている。重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域の少なくとも１つのアミノ酸配列において変異を有することで、一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）の抗原との相互作用を弱めて、抗原結合能を低下させることができる。本段落の各語句の詳細については、前述同様である。

次に、医薬品、抗腫瘍剤及び自己免疫疾患治療剤について説明する。

本実施形態による医薬品、抗腫瘍剤及び自己免疫疾患治療剤は、前述の抗体断片多量体分子からなる。

本実施形態による抗腫瘍剤は、前述の抗体断片多量体分子からなり、例えば、乳癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、副腎皮質癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、子宮頚癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、胆嚢癌、ホジキン病、下咽頭癌、喉頭癌、***口腔癌、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）等の腫瘍に対して治療効果を奏する。

本実施形態による自己免疫疾患治療剤は、前述の抗体断片多量体分子からなり、例えば、多発性筋炎、血管炎症候群、巨細胞性動脈炎、高安動脈炎、再発性多発軟骨炎、後天性血友病Ａ、スティル病、成人発症性スティル病、アミロイドＡアミロイドーシス、リウマチ性多発筋痛症、脊椎関節炎（関節炎）、肺動脈高血圧症、移植片対宿主病、自己免疫性心筋炎、接触性過敏症（接触性皮膚炎）、胃食道逆流症、紅皮症、ベーチェット病、筋萎縮性側索硬化症、移植、視神経脊髄炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、悪性関節リウマチ、薬剤耐性慢性関節リウマチ、川崎病、多関節型または全身型若年性特発性関節炎、乾癬、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、キャッスルマン病、喘息、アレルギー性喘息、アレルギー性脳脊髄炎、関節炎、進行性慢性関節炎、反応性関節炎、乾癬性関節炎、腸炎性関節炎、変形性関節炎、リウマチ性疾患、脊椎関節症、強直性脊椎炎、ライター症候群、過敏症（気道過敏症および皮膚過敏症の両方を含む）、アレルギー、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、皮膚エリテマトーデス、癩性結節性紅斑、シェーグレン症候群、炎症性筋障害、軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、皮膚筋炎、スティーブン−ジョンソン症候群、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、特発性吸収不良、自己免疫炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸症候群、内分泌性眼障害、強皮症、グレーブス病、サルコイドーシス、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、膣炎、直腸炎、インスリン依存性糖尿病、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病（Ｉ型糖尿病）、自己免疫性血液疾患、溶血性貧血、再生不良性貧血、純粋な赤血球貧血、特発性血小板減少症（ＩＴＰ）、自己免疫性ブドウ膜炎、ブドウ膜炎（前部および後部）、乾性角結膜炎、春季カタル、間質性肺線維症、糸球体腎炎（ネフローゼ症候群の有無）、特発性ネフローゼ症候群または微小変化型腎症、皮膚の炎症性疾患、角膜炎症、筋炎、骨インプラント、代謝障害、アテローム性動脈硬化症、脂質代謝異常、骨喪失、骨関節症、骨粗鬆症、閉塞性または炎症性気道疾患の歯周病、気管支炎、塵肺、肺気腫、急性および超急性炎症反応、急性感染、敗血症性ショック、内毒素性ショック、成人呼吸窮迫症候群、髄膜炎、肺炎、複合的代謝異常症候群、卒中、ヘルペス性間質性角膜炎、ドライアイ疾患、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、ギラン・バレー症候群、スティッフマン症候群、橋本甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎、脳脊髄炎、急性リウマチ熱、交感性眼炎、グッドパスチャー症候群、全身性壊死性血管炎、抗リン脂質抗体症候群、アジソン病、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、疱疹状皮膚炎、アトピー性皮膚炎、湿疹性皮膚炎、アフタ性潰瘍、扁平苔癬、自己免疫性脱毛症、白斑症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、悪性貧血、感音難聴、突発性両側進行性感音難聴、多腺性自己免疫症候群Ｉ型またはＩＩ型、免疫不妊、免疫介在性不妊等の自己免疫疾患に対して治療効果を奏する。

本実施形態による医薬品は、前述の抗体断片多量体分子からなり、所望の医薬用途に用いられ、例えば、前述の抗腫瘍剤、自己免疫疾患治療剤等として用いられ得る。

本実施形態による医薬品、抗腫瘍剤及び自己免疫疾患治療剤の投与方法は、経口投与、局所投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、舌下投与等、適宜選択され得る。投与剤型も任意であってよく、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤、注射剤などの非経口用液体製剤等に適宜調製することができる。また、適切なドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）を用いてもよい。

次に、本実施形態による腫瘍の治療に使用するための抗体断片多量体分子及び自己免疫疾患の治療に使用するための抗体断片多量体分子について説明する。

本実施形態による腫瘍の治療に使用するための抗体断片多量体分子は、前述の抗体断片多量体分子の抗腫瘍剤としての用途に関し、腫瘍の種類については、前述同様である。

本実施形態による自己免疫疾患の治療に使用するための抗体断片多量体分子は、前述の抗体断片多量体分子の自己免疫疾患治療剤としての用途に関し、自己免疫疾患の種類については、前述同様である。

以上説明したように、本実施形態による抗体断片多量体分子は、所定の解離速度定数ｋ_ｏｆｆ及び解離定数Ｋ_Ｄを有する一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）の多量体であり、所定の見かけの解離定数Ｋ_Ｄを有する。多量化することで、結合価数の増加によるアビディティ効果が得られ、高い標的選択性及び高い親和性を有する。また、抗原発現がごくわずかである正常細胞に留まることが低減され、抗原が密に発現している標的細胞（例えば、癌細胞）に特異的に蓄積することができる。一方で、正常細胞からは容易に離脱することができる。このため、本実施形態による医薬品、抗腫瘍剤及び自己免疫疾患治療剤は、優れた薬効及び副作用の低減を実現することができ、著しい投与量の低減と、それによる副作用の低下及び医療費の軽減とが期待できる。

また、本実施形態による抗体断片多量体分子は、高分子量の全長抗体ではなく、標的細胞（例えば、癌細胞）への標的化能を持ちつつ低分子化した一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）を利用している。このため、本実施形態による医薬品、抗腫瘍剤及び自己免疫疾患治療剤は、組織浸透性及び血中滞留性が向上しており、また、低コストで作製することが可能である。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
抗体医薬品であるトラスツズマブをモデル抗体として、可変領域へ変異導入を行い、多量体形成ペプチドの付加による多量体化を試みた。

トラスツズマブは、上皮増殖因子受容体ファミリーのＨＥＲ２（ｈｕｍａｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ２）を抗原とする分子標的薬であり、ＨＥＲ２過剰発現が確認された乳癌及び胃癌で適応されるヒト化モノクローナル抗体である（図１（ａ））。トラスツズマブはイムノグロブリンＧ全長抗体であり、Ｆｖドメインにおいて抗原に対して結合し、ＦｃドメインにおいてＡＤＣＣ活性による抗腫瘍効果及びリサイクリングによる血中半減期延長などの機能を発揮する。しかしながら、全長抗体は約１５０ｋＤａと高分子量であるため、動物細胞培養系では生産コストが高くなること、また、癌組織への浸透性が低いことが課題であった。さらには、標的癌細胞への正確な送達が難しく治療効果が低い場合があること、また、標的抗原ＨＥＲ２を発現した正常細胞に対して作用することが原因と考えられる副作用についても課題として挙げられていた。

トラスツズマブから一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）（図１（ｂ））を作製し、一分子あたりの抗原結合能を意図的に低下させたｓｃＦｖ変異体を、蛋白質工学的なアプローチにより多量体化させた。トラスツズマブのＶＬのアミノ酸配列は配列番号１、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号２に示される。

（抗体断片多量体分子の作製）
まず、多量体化ペプチドとｓｃＦｖとを一本のポリペプチド鎖として発現させた融合蛋白質を作製した（図４（ａ））。多量体化には多量体形成ペプチド（ｍｕｌｔｉｍｅｒ）を用いて、ｓｃＦｖのＣ末端にリンカーで連結することで融合蛋白質として発現させるコンストラクトを作製した。

多量体形成ペプチド（ｍｕｌｔｉｍｅｒ）として、αヘリックス間の相互作用によって高次構造を形成するコイルドコイルに着目し、二量体化用にはＧＣＮ４ロイシンジッパー（以下、「ＧＣＮ４」という場合がある）（図６（ａ））を、三量体化用には軟骨マトリックスタンパク質（以下、「ＣＭＰ」という場合がある）（図６（ｂ））を、五量体化用には軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（以下、「ＣＯＭＰ」という場合がある）（図６（ｃ））を用いた。それぞれの多量体形成ペプチド（ｍｕｌｔｉｍｅｒ）は、Ｎ末端からＣ末端まで一方向にコイルドコイルを形成する。二量体、三量体及び五量体をそれぞれ形成させるために（図６（ｄ）−（ｆ））、ｍｕｌｔｉｍｅｒをｓｃＦｖ変異体のＣ末端に連結させた。なお、ＣＭＰはＮ末端で、ＣＯＭＰはＣ末端で分子間ジスルフィド結合を形成する。

（コンストラクト作製）
まず、以下の４種のコンストラクトを作製した。使用したベクターは、ｐＥＴ２２ｂ（＋）である（図７）。なお、図４（ａ）に示すように、「Ｌｉｎｋｅｒ１」は、ＶＬ（配列番号１）のＣ末端側と、ＶＨ（配列番号２）のＮ末端側と、を連結させるものであり（−（ＧＧＧＧＳ）３−：配列番号３）、「Ｌｉｎｋｅｒ２」は、ＶＨ（配列番号２）のＣ末端側に多量体形成ペプチド（ｍｕｌｔｉｍｅｒ）を連結させるものである（ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ：配列番号４、ＷａｌｄｏＧＳ．ｅｔａｌ．，１９９９，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１７：６９１−６９５）。
・ｐＥＴ２２ｂ−ｓｃＦｖ−ＬＨ（モノマー）
ｐＥＴ２２ｂ（＋）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイト内に、ｓｃＦｖをコードする遺伝子（配列番号５）が挿入されている。
・ｐＥＴ２２ｂ−ｗｔ−ｄｉｍｅｒ（二量体化ペプチド）
ｐＥＴ２２ｂ（＋）のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩサイト内に、図４（ａ）に示されるように、ｓｃＦｖ、ｌｉｎｋｅｒ２及びＧＣＮ４ロイシンジッパー由来ペプチドをコードする遺伝子（配列番号６、図８）が挿入されている（ＧＣＮ４ロイシンジッパー由来ペプチドのアミノ酸配列：配列番号７）。
・ｐＥＴ２２ｂ−ｗｔ−ｔｒｉｍｅｒ（三量体化ペプチド）
ｐＥＴ２２ｂ（＋）のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩサイト内に、図４（ａ）に示されるように、ｓｃＦｖ、ｌｉｎｋｅｒ２及び軟骨マトリックスタンパク質（ＣＭＰ；ＣａｒｔｉｌａｇｅＭａｔｒｉｘＰｒｏｔｅｉｎ）由来ペプチドをコードする遺伝子（配列番号８、図９）が挿入されている（軟骨マトリックスタンパク質（ＣＭＰ）由来ペプチドのアミノ酸配列：配列番号９）。
・ｐＥＴ２２ｂ−ｗｔ−ｐｅｎｔａｍｅｒ（五量体化ペプチド）
ｐＥＴ２２ｂ（＋）のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩサイト内に、図４（ａ）に示されるように、ｓｃＦｖ、ｌｉｎｋｅｒ２及び軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ；ＣａｒｔｉｌａｇｅＯｌｉｇｏｍｅｒｉｃＭａｔｒｉｘＰｒｏｔｅｉｎ）由来ペプチドをコードする遺伝子（配列番号１０、図１０）が挿入されている（軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）由来ペプチドのアミノ酸配列：配列番号１１）。

ｓｃＦｖ多量体の作製にはオーバーラップエクステンションＰＣＲを用いた。ｓｃＦｖ多量体作製に先駆けて、ｐＥＴ２２ｂ（＋）のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩサイト内に、Ｃ末端にＬｉｎｋｅｒ２を含むｓｃＦｖをコードする遺伝子（配列番号１２）を挿入した、“ｐＥＴ２２−ＬＨ−ｌｉｎｋｅｒ”を作製した。このｐＥＴ２２−ＬＨ−ｌｉｎｋｅｒを、上記のｐＥＴ２２ｂ−ｓｃＦｖ−ＬＨ（モノマー）を鋳型としＬＨ−Ｆｗ（５’−ＧＡＡＧＡＣＴＴＡＣＡＴＡＴＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧ−３’、配列番号１３）とＬＨ−ｌｉｎｋｅｒ１−Ｒｖ（５’−ＣＣＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＣＡＧＣＣＡＡＡＣＴＣＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＧＡＧＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＣＴＧＡＣＡＧＴＣＡＣＣＡＧＴＧ−３’、配列番号１４）をプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）のＮｄｅＩとＨiｎｄＩＩＩ部位に挿入した。続いてｗｔ−ｐｅｎｔａｍｅｒ作製するために、上記ｐＥＴ２２−ＬＨ−ｌｉｎｋｅｒを鋳型としＬＨ−Ｆｗ（５’−ＧＡＡＧＡＣＴＴＡＣＡＴＡＴＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧ−３’、配列番号１５）とＬｉｎｋｅｒ１−ＣＯＭＰ−Ｒｖ（５’−ＧＴＧＧＧＧＣＴＡＧＧＴＣＡＡＧＣＴＴＡＡＡＣＴＣＧＣＣＡＧＡＡＣＣ−３’、配列番号１６）を用いたＰＣＲ反応、及びｐＥＴ２２ｂ−ＣＯＭＰを鋳型として、Ｌｉｎｋｅｒ１−ＣＯＭＰ−Ｆｗ（５’−ＣＴＧＧＣＧＡＧＴＴＴＡＡＧＣＴＴＧＡＣＣＴＡＧＣＣＣＣＡＣＡＧＡＴＧ−３’、配列番号１７）とＣＯＭＰ−Ｒｖ（５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＣＧＣＡＡＧＣＧＴＣＡＣＡＴＴＣＣＡＴＣ−３’、配列番号１８）を用いたＰＣＲ反応をそれぞれ行った（１ｓｔＰＣＲ反応）。これら１ｓｔＰＣＲ産物それぞれを鋳型ＤＮＡとしてＬＨ−Ｆｗ（５’−ＧＡＡＧＡＣＴＴＡＣＡＴＡＴＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧ−３’、配列番号１９）とＣＯＭＰ−Ｒｖ（５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＣＧＣＡＡＧＣＧＴＣＡＣＡＴＴＣＣＡＴＣ−３’、配列番号２０）を用いて再度ＰＣＲ反応を行った（２ｎｄＰＣＲ反応）。この２ｎｄＰＣＲ反応産物をｐＥＴ２２ｂ（＋）のＮｄｅＩとＸｈｏＩ部位に挿入した（図１１（ａ））。これをｐＥＴ２２ｂ−ｗｔ−ｐｅｎｔａｍｅｒとした。

ｗｔ−ｄｉｍｅｒ及びｗｔ−ｔｒｉｍｅｒ作製するため、ＰＣＲ反応は、それぞれｐＥＴ２２ｂ−ＧＣＮ４を鋳型としＧＣＮ４−Ｆｗ（５’−ＣＧＧＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＡＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡＣＡＡＡＧ−３’、配列番号２１）とＧＣＮ４−Ｒｖ（５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＣＡＣＣＡＡＣＣＡＧＴＴＴＣＴＴＣＡＧＡＣ−３’、配列番号２２）をプライマーとしたＰＣＲ、およびｐＥＴ２２ｂ−ＣＭＰを鋳型としＣＭＰ−Ｆｗ（５’−ＣＧＧＡＡＧＣＴＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＧＴＧＣＧＡＡＴＧＣ−３’、配列番号２３）とＣＭＰ−Ｒｖ（５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＴＴＴＴＣＣＡＧＣＧＣ−３’、配列番号２４）をプライマーとしたＰＣＲを行った。各ＰＣＲ産物をｐＥＴ２２ｂ−ｗｔ−ｐｅｎｔａｍｅｒのＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩ部位に挿入した（図１１（ｂ））。それぞれｐＥＴ２２ｂ−ｗｔ−ｄｉｍｅｒおよびｐＥＴ２２ｂ−ｗｔ−ｔｒｉｍｅｒとした。

（変異導入）
次に、ｓｃＦｖ一分子あたりの抗原結合能を意図的に下げるために、変異を導入した（図１４（ａ）、（ｃ））。トラスツズマブのｓｃＦｖはＨＥＲ２に対して強力に結合するため、野生型ではＨＥＲ２を発現した正常細胞に結合する可能性がある。そこで、既報のＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＨＥＲ２−ＥＣＤ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｄｏｍａｉｎ））とトラスツズマブのＦａｂとの複合体結晶構造より、結合に関わるアミノ酸残基を確認し、結合能の抑制を検討した（図５（ａ））。該複合体結晶構造より、ＣＤＲ２における重鎖５０番目及び５９番目のアルギニン残基（以下、各々「ＨＣ＿Ｒ５０」及び「ＨＣ＿Ｒ５９」という）は、ＨＥＲ２−ＥＣＤの５５８番目のグルタミン酸及び５６０番目のアスパラギン酸と強力にソルトブリッジを形成すること、またＣＤＲ１における重鎖３３番目のチロシン残基（以下、ＨＣ＿Ｙ３３」という）は、ＨＥＲ２−ＥＣＤの５７３番目のフェニルアラニンとΠ相互作用することが想定された（図５（ｂ））。さらに、ＣＤＲ１における軽鎖３０番目のアスパラギン残基（以下、「ＬＣ＿Ｎ３０」という）は、ＨＥＲ２−ＥＣＤの６０２番目のグルタミン残基と極性相互作用をすること、またＣＤＲ２近傍のフレームワーク領域における軽鎖６６番目のアルギニン残基（以下、「ＬＣ＿Ｒ６６」という）は、５９８番目のグルタミン酸と強力にソルトブリッジを形成することが想定された（図５（ｃ））。そこで、これら結合に重要な残基であるＨＣ＿Ｒ５０、ＨＣ＿Ｒ５９、ＨＣ＿Ｙ３３、ＬＣ＿Ｎ３０及びＬＣ＿Ｒ６６をそれぞれ中性アミノ酸であるアラニンに置換することにした。なお、比較例である野生型多量体分子（図１４（ｂ））では、変異を導入しなかった。

変異導入の方法について説明する（図１２）。ｐＥＴ２２ｂ−ｓｃＦｖ−ＬＨを鋳型ＤＮＡとして以下の反応溶液５０μＬを準備し、ＰＣＲ法により各プラスミドを増幅した。ＨＣ＿Ｙ３３Ａの増幅にはプライマーＨＣ＿Ｙ３３Ａ＿Ｆ（５’−ＧＡＣＡＣＣＧＣＧＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＧＴＣＡＡ−３’（配列番号２５））及びプライマーＨＣ＿Ｙ３３Ａ＿Ｒ（５’−ＧＴＧＧＡＴＣＧＣＧＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡＴＧＴＴＡＡＡ−３’（配列番号２６））、ＨＣ＿Ｒ５０Ａの増幅にはプライマーＨＣ＿Ｒ５０Ａ＿Ｆ（５’−ＧＴＡＧＣＴＧＣＧＡＴＴＴＡＣＣＣＧＡＣＡＡＡＴＧＧＣ−３’（配列番号２７））及びプライマーＨＣ＿Ｒ５０Ａ＿Ｒ（５’−ＧＴＡＡＡＴＣＧＣＡＧＣＴＡＣＣＣＡＴＴＣＣＡＡＧＣＣ−３’（配列番号２８））、ＨＣ＿Ｒ５９Ａの増幅にはプライマーＨＣ＿Ｒ５９Ａ＿Ｆ（５’−ＣＴＡＴＡＣＣＧＣＣＴＡＣＧＣＡＧＡＴＴＣＣＧＴＣＡＡ−３’（配列番号２９））及びプライマーＨＣ＿Ｒ５９Ａ＿Ｒ（５’−ＣＴＧＣＧＴＡＧＧＣＧＧＴＡＴＡＧＣＣＡＴＴＴＧＴＣＧ−３’（配列番号３０））、ＬＣ＿Ｎ３０Ａの増幅にはプライマーＬＣ＿Ｎ３０Ａ＿Ｆ（５’−ＧＡＣＧＴＧＧＣＴＡＣＣＧＣＧＧＴＴＧＣＣ−３’（配列番号３７））及びプライマーＬＣ＿Ｎ３０Ａ＿Ｒ（５’−ＧＧＣＡＡＣＣＧＣＧＧＴＡＧＣＣＡＣＧＴＣ−３’（配列番号３８））、ＬＣ＿Ｒ６６Ｇの増幅にはプライマーＬＣ＿Ｒ６６Ｇ＿Ｆ（５’−ＧＧＴＡＧＴＧＧＣＴＣＡＧＧＧＡＣＣＧＡＴ−３’（配列番号３９））及びプライマーＬＣ＿Ｒ６６Ｇ＿Ｒ（５’−ＡＴＣＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＡＣＴＡＣＣ−３’（配列番号４０））、ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａの増幅にはｓｃＦｖ＿ＨＣ＿Ｒ５０Ａを鋳型ＤＮＡとし、上記プライマーＨＣ＿Ｒ５９Ａ＿Ｆ及びＨＣ＿Ｒ５９Ａ＿Ｒ、ＬＣ＿Ｎ３０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａの増幅にはｓｃＦｖ＿ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａを鋳型ＤＮＡとし、上記プライマーＬＣ＿Ｎ３０Ａ＿Ｆ及びＬＣ＿Ｎ３０Ａ＿Ｒ、ＬＣ＿Ｒ６６Ｇ／ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａの増幅にはｓｃＦｖ＿ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａを鋳型ＤＮＡとし、上記プライマーＬＣ＿Ｒ６６Ｇ＿Ｆ及びＬＣ＿Ｒ６６Ｇ＿Ｒを使用した。ＰＣＲ増幅産物をエタノール沈殿により精製し、大腸菌発現用プラスミドの調製に供した。作製したプラスミドを各々、ｐＥＴ２２ｂ−ＨＣ＿Ｙ３３Ａ、ｐＥＴ２２ｂ−ＨＣ＿Ｒ５０Ａ、ｐＥＴ２２ｂ−ＨＣ＿Ｒ５９Ａ、ｐＥＴ２２ｂ−ＬＣ＿Ｎ３０Ａ、ｐＥＴ２２ｂ−ＬＣ＿Ｒ６６Ｇ、ｐＥＴ２２ｂ−ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａ、ｐＥＴ２２ｂ−ＬＣ＿Ｎ３０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａ及びｐＥＴ２２ｂ−ＬＣ＿Ｒ６６Ｇ／ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａとした。

反応溶液は以下の通りである。
鋳型ＤＮＡ１μＬ
１０ｘＰＣＲＢｕｆｆｅｒ５μＬ
２ｍＭｄＮＴＰｍｉｘ５μＬ
２５ｍＭＭｇＳＯ４４μＬ
プライマー１１．５μＬ
プライマー２１．５μＬ
ＫＯＤＰｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１μＬ
滅菌蒸留水を加えて５０μＬに調製

サーマルサイクラーは以下の通りプログラムした。
（１）９４℃ ２分
（２）９８℃ １０秒
（３）５５℃ ３０秒
（４）６８℃ ６分３０秒
（５）６８℃ １分
（２）〜（４）を３０サイクル行った。

ｓｃＦｖ多量体へのＣＤＲ変異の導入は以下の方法に従って実施した（図１３）。二量体変異体Ｒ５９Ａ−ｄｉｍｅｒ及びＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａ−ｄｉｍｅｒの作製は、ｐＥＴ２２ｂ−ＨＣ＿Ｒ５９Ａ又はｐＥＴ２２ｂ−ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９ＡのＮｄｅＩ−ＮｃｏＩ処理断片をｐＥＴ２２ｂ−ｗｔ−ｄｉｍｅｒのＮｄｅＩ−ＮｃｏＩ処理断片とそれぞれ連結することで作製した。作製したプラスミドをｐＥＴ２２ｂ−ＨＣ＿Ｒ５９Ａ−ｄｉｍｅｒ及びｐＥＴ２２ｂ−ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａ−ｄｉｍｅｒとした。

同様に、三量体変異体ＨＣ＿Ｒ５９Ａ−ｔｒｉｍｅｒ、ｐＥＴ２２ｂ−ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａ−ｔｒｉｍｅｒ及びｐＥＴ２２ｂ−ＬＣ＿Ｒ６６Ｇ／ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａ−ｔｒｉｍｅｒは、ｐＥＴ２２ｂ−ＨＣ＿Ｒ５９Ａ、ｐＥＴ２２ｂ−ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａ又はｐＥＴ２２ｂ−ＬＣ＿Ｒ６６Ｇ／ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９ＡのＮｄｅＩ−ＮｃｏＩ処理断片とｐＥＴ２２ｂ−ｗｔ−ｔｒｉｍｅｒのＮｄｅＩ−ＮｃｏＩ処理断片と連結することにより作製し、ｐＥＴ２２ｂ−ＨＣ＿Ｒ５９Ａ−ｔｒｉｍｅｒ、ｐＥＴ２２ｂ−ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａ−ｔｒｉｍｅｒ及びｐＥＴ２２ｂ−ＬＣ＿Ｒ６６Ｇ／ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａ−ｔｒｉｍｅｒとした。

（大腸菌発現用プラスミド）
上記の通り作製した各プラスミドを大腸菌体内に封入体として発現させた。

（プラスミドの調製）
プラスミド０．５μＬを大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル１００μＬに加え、氷上に約２０分静置した後、４２℃で４５秒間インキュベートして形質転換した。形質転換後の大腸菌を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し３７℃で一晩培養した。得られたシングルコロニーを、終濃度１００μｇ／ｍＬになるようにアンピシリンを加えた２×ＹＴ培地５ｍＬに植菌し、３７℃、１５０ｒｐｍの条件で一晩振盪培養した。培養液１．４ｍＬを１３，２００ｒｐｍ、１分間の条件で遠心分離し、上清を除去した。得られた大腸菌のペレットからアルカリ−ＳＤＳ法とＰＣＩ抽出、アルコール沈殿を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。

（大腸菌発現系を用いた封入体の調製）
図１４に示される各分子を、大腸菌体内に封入体として発現させた。上記の通り得られたプラスミドＤＮＡで、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天培地に播種後、３７℃で一晩培養した。得られたコロニーを５０μｇ／ｍＬアンピシリン、２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール含有２×ＹＴ培地（１０ｍＬ）に植菌し、３７℃で２〜４時間振盪培養した（前培養）。次に、前培養した１０ｍＬの菌液を５０μｇ／ｍＬアンピシリン、２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール含有２×ＹＴ培地（１Ｌ）へと植菌し、３７℃で振盪培養した。対数増殖前期であるＯＤ_６００＝０．４〜０．６に達したら、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように加えて組換えタンパク質の発現を誘導し、その後３７℃で４時間振盪培養した。培養後の菌液を遠心分離（５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して大腸菌を回収した。菌体を懸濁バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ）で懸濁して、氷上で超音波破砕を行った。破砕液を遠心分離し（８，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）、得られた沈殿を洗浄バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で懸濁することによって洗浄し、懸濁液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）する洗浄作業を３回繰り返した。洗浄後、得られた沈殿から界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＸ−１００を除去するために、懸濁バッファーを用いて沈殿を懸濁後、懸濁液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）する洗浄操作を３回繰り返し、封入体を得た。得られた封入体に可溶化バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０、６Ｍｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ）を加えて一晩４℃で振盪し、完全に可溶化した。封入体を可溶化させた後、各封入体溶液の吸光度を１μＬ分光光度計（ＮＤ−１０００Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、ＮａｎｏＤｒｏｐＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて測定した。

（巻き戻し法による各タンパク質の調製）
各分子は、封入体から希釈法による巻き戻しを行うことで調製した。巻き戻しバッファー（０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０、１ＭＬ−ａｒｇｉｎｉｎｅ、２ｍＭＥＤＴＡ、３．７３ｍＭｃｙｓｔａｍｉｎｅ、６．７３ｍＭｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ）を用いて、タンパク質の終濃度が１〜２μＭとなるように希釈を行った後、４℃で巻き戻しを行った。続いて、可溶化した封入体にＤＴＴを終濃度１０ｍＭとなるように加え、室温で１時間インキュベートしたタンパク質溶液に対し、同巻き戻しバッファーを１滴ずつ、ｇｕａｎｉｄｉｎｅ濃度が１．５Ｍになるまで加えた。希釈後の溶液を巻き戻しバッファーに１滴ずつ加え、タンパク質の終濃度が１〜２μＭとなるように希釈した後、４℃で７２時間攪拌した。巻き戻し後のタンパク質溶液はＶＩＶＡＦｌｏｗｓｙｓｔｅｍ（ＭＷＣＯ：１０，０００，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ（ＭＷＣＯ：１０，０００Ｄａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で限外ろ過濃縮を行った。

濃縮したタンパク質溶液はＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒシステム（ＧＥ社）を用いた液体クロマトグラフィーにて精製した。ＨｉＬｏａｄ２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ＴＭＰｒｅｐｇｒａｄｅカラム（ＧＥ社）を用いてサイズ排除クロマトグラフィーを行った。この時、バッファーは２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０、１００ｍＭＮａＣｌを用いた。各二量体の精製にはＨｉＬｏａｄ２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＴＭＰｒｅｐｇｒａｄｅカラム（ＧＥ社）を、各三量体及び各五量体の精製にはＳｕｐｅｒｏｓｅ６ＴＭＧＬカラム（ＧＥ社）をそれぞれ用いた。二量体以上の分子の精製の時、バッファーは２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０、４００ｍＭＮａＣｌを用いた。精製後のタンパク質溶液の吸光度を分光光度計（ＮＤ−１，０００Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、ＮａｎｏＤｒｏｐＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて測定した。また、吸光度（Ａｂｓ）の測定値から紫外吸収法を用いて各タンパク質溶液の濃度を算出した。各単量体の濃度算出時に用いたタンパク質の分子量は２６，０００Ｄａ、モル吸光係数は４８，０００Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍの値を用いた。ただし、ＨＣ＿Ｙ３３Ａ変異体の場合のみ、分子量は２６，０００Ｄａ、モル吸光係数は４７，０００Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍの値を用いた。各二量体の濃度算出時に用いたタンパク質の分子量は６２，０００Ｄａ、モル吸光係数は４９，０００Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍの値を用いた。各三量体の濃度算出時に用いたタンパク質の分子量は９７，０００Ｄａ、モル吸光係数は４８，０００Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍの値を用いた。各五量体の濃度算出時に用いたタンパク質の分子量は１６０，０００Ｄａ、モル吸光係数は４８，０００Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍの値を用いた。

作製した分子を図１４に示す。
（１）上記の通り変異を導入することでＨＥＲ２への結合能を意図的に低下させた「ｓｃＦｖ変異体」（図１４（ａ））
・ＨＣ＿Ｙ３３Ａ：ＣＤＲ１の重鎖３３番目のチロシン残基（ＨＣ＿Ｙ３３）をアラニンに置換したｓｃＦｖ変異体
・ＨＣ＿Ｒ５０Ａ：ＣＤＲ２の重鎖５０番目のアルギニン残基（ＨＣ＿Ｒ５０）をアラニンに置換したｓｃＦｖ変異体
・ＨＣ＿Ｒ５９Ａ：ＣＤＲ２の重鎖５９番目のアルギニン残基（ＨＣ＿Ｒ５９）をアラニンに置換したｓｃＦｖ変異体
・ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａ：ＨＣ＿Ｒ５０及びＨＣ＿Ｒ５９の両方をアラニンに置換したｓｃＦｖ変異体
・ＬＣ＿Ｎ３０Ａ：ＣＤＲ１の軽鎖３０番目のアスパラギン残基（ＬＣ＿Ｎ３０）をアラニンに置換したｓｃＦｖ変異体
・ＬＣ＿Ｎ３０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａ：ＬＣ＿Ｎ３０、ＨＣ＿Ｒ５０及びＨＣ＿Ｒ５９の全てをアラニンに置換したｓｃＦｖ変異体
・ＬＣ＿Ｒ６６Ｇ／ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａ：ＣＤＲ２近傍のフレームワーク領域の軽鎖６６番目のアルギニン残基（ＬＣ＿Ｒ６６）をグリシンに、ＨＣ＿Ｒ５０及びＨＣ＿Ｒ５９の各々をアラニンに置換したｓｃＦｖ変異体
（２）変異を導入していない野生型のｓｃＦｖを多量体化させた「野生型多量体分子」（図１４（ｂ））（比較例）
・ｗｔ−ｄｉｍｅｒ：野生型のｓｃＦｖの二量体
・ｗｔ−ｔｒｉｍｅｒ：野生型のｓｃＦｖの三量体
・ｗｔ−ｐｅｎｔａｍｅｒ：野生型のｓｃＦｖの五量体
（３）ｓｃＦｖ変異体を多量体化させた「抗体断片多量体分子」（図１４（ｃ））（実施例）
・ＨＣ＿Ｒ５９Ａ−ｄｉｍｅｒ：ＨＣ＿Ｒ５９Ａの二量体
・ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａ−ｄｉｍｅｒ：ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａの二量体
・ＨＣ＿Ｒ５９Ａ−ｔｒｉｍｅｒ：ＨＣ＿Ｒ５９Ａの三量体
・ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａ−ｔｒｉｍｅｒ：ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａの三量体
・ＬＣ＿Ｎ３０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａ−ｔｒｉｍｅｒ：ＬＣ＿Ｎ３０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａの三量体
・ＬＣ＿Ｒ６６Ｇ／ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａ−ｔｒｉｍｅｒ：ＬＣ＿Ｒ６６Ｇ／ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａの三量体

（実施例２）
（多量体化の確認）
野生型多量体分子（図１４（ｂ））について、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳｉｚｅＥｘｃｌｕｓｉｏｎＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＳＥＣ）と多角度光散乱器（ＭｕｌｔｉＡｎｇｌｅＬｉｇｈｔＳｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＭＡＬＳ）とを組み合わせた測定方法（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）により解析した（図１５（ａ））。ＳＥＣ−ＭＡＬＳではＳＥＣにより分離した分子に照射して得られた静的散乱光から、分子の外形及び絶対分子量が明らかとなり、ＳＥＣ単独よりも精度高く分子の大きさを解析することができる。測定条件は以下の通りである。
・測定機器：ＤＡＷＮ８（昭和サイエンティフィック）
・カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）
・バッファー：２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４００ｍＭＮａＣｌ

結果を図１５（ｂ）に示す。絶対分子量は、ｗｔ−ｄｉｍｅｒ：６６ｋＤａ、ｗｔ−ｔｒｉｍｅｒ：７８ｋＤａ、ｗｔ−ｐｅｎｔａｍｅｒ：１５０ｋＤａであった。解析結果及び分子量の比較より、野生型のｓｃＦｖの二量体、三量体及び五量体が意図した通りに形成されていることが確認された。

（実施例３）
（ｓｃＦｖ変異体の結合解析）
ＳＰＲ法（表面プラズモン共鳴法）を用いて、各ｓｃＦｖ変異体（ＨＣ＿Ｙ３３Ａ、ＨＣ＿Ｒ５０Ａ、ＨＣ＿Ｒ５９Ａ、ＬＣ＿Ｎ３０Ａ、ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａ及びＬＣ＿Ｒ６６Ｇ／ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａ、図１４（ａ））及び抗体断多量体分子（ＨＣ＿Ｒ５９Ａ−ｄｉｍｅｒ、ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａ−ｄｉｍｅｒ、ＬＣ＿Ｒ６６Ｇ／ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａ−ｔｒｉｍｅｒ、図１４（ｃ））とＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃとの相互作用解析を行った。

センサーチップ上に固定したＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃに対し、各濃度のｓｃＦｖ変異体及び抗体断多量体分子を添加し、これらのセンサグラムを得て、速度論的パラメータを算出した。測定条件は以下の通りである。なお、ネガティブコントロールとして、Ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）を用いた。なお、ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃとして、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社より購入したタンパク質（ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＨｕｍａｎＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２ＦｃＣｈｉｍｅｒａＰｒｏｔｅｉｎ，ＣＦ）を用いた。

本測定ではＢＩＡｃｏｒｅ２０００、３０００（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、センサーチップＣＭ５上にリガンドとしてＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ又はＢＳＡをアミンカップリング法によりそれぞれ１２００ＲＵ程度固定化し、各ｓｃＦｖ変異体及び抗体断多量体分子のアナライトとしての希釈系列（４、８、１６、３２ｎＭ）を作成し、低濃度側から順次送液を行った（図１６（ａ））。各濃度において、各ｓｃＦｖ変異体をリガンドとした場合のセンサグラム（Ａ）及びＢＳＡをリガンドとした場合のセンサグラム（Ｂ）を差し引き（センサグラムＡ−センサグラムＢ）した。１：１結合モデル（Ｌａｎｇｍｕｉｒｂｉｎｄｉｎｇｍｏｄｅｌ）に近似することで速度論的パラメーター（ｋ_ｏｎ、ｋ_ｏｆｆ、Ｋ_Ｄ；Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎより求まる。）を算出した（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｂｆ．ｕｎｉ−ｌｊ．ｓｉ／ｂｉ／ｓｐｒｃｅｎｔｅｒ／ＢｉａｃｏｒｅＴ１００／Ｓｅｓｓｉｏｎ５％２０ＢａｓｉｃＫｉｎｅｔｉｃｓ．ｐｄｆを参照）（図３）。近似式を以下に示す。
・測定機器：Ｂｉａｏｃｒｅ２０００、３０００（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
・チップ：ＣＭ５
・バッファー：ＨＢＳ−ＥＰ
・リガンド：ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ
・リガンド固定化法：アミンカップリング法
・リガンド固定化量：１２００ＲＵ
・アナライト濃度：４、８、１６、３２ｎＭ
・流速：３０μＬ／ｍｉｎ
・温度：３０℃

結果を図１６に示す。ｓｃＦｖ変異体において（図１６（ｂ））、ｋ_ｏｆｆは、ｗｔ（野生型）で８．５×１０^−５（１／ｓ）であったのに対して、ＨＣ＿Ｙ３３Ａで１．６×１０^−３（１／ｓ）、ＨＣ＿Ｒ５０Ａで２．１×１０^−３（１／ｓ）、ＨＣ＿Ｒ５９Ａで１．１×１０^−３（１／ｓ）、ＬＣ＿Ｎ３０Ａで１．３×１０^−３（１／ｓ）、ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａで５．０×１０^−３（１／ｓ）、ＬＣ＿Ｒ６６Ｇ／ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａで３．６×１０^−２（１／ｓ）であり、変異型では解離が早くなることが明らかとなった。また、Ｋ_Ｄは、ｗｔ（野生型）で０．２（ｎＭ）であったのに対して、ＨＣ＿Ｙ３３Ａで３．１（ｎＭ）、ＨＣ＿Ｒ５０Ａで７．２（ｎＭ）、ＨＣ＿Ｒ５９Ａで５．１（ｎＭ）、ＬＣ＿Ｎ３０Ａで２．２（ｎＭ）、ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａで７０（ｎＭ）、ＬＣ＿Ｒ６６Ｇ／ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａで１１００（ｎＭ）であり、変異型では結合親和性が低下したことが明らかとなった。以上より、単一変異体であるＨＣ＿Ｙ３３Ａ、ＨＣ＿Ｒ５０Ａ、ＨＣ＿Ｒ５９Ａ、ＬＣ＿Ｎ３０Ａでは野生型ｓｃＦｖの１０倍以上、二重変異体であるＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａでは１００倍以上、三重変異体であるＬＣ＿Ｒ６６Ｇ／ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａでは１０００倍以上解離定数が大きくなっており、抗原への結合親和性が低下したことが明らかとなった。これより、各種ｓｃＦｖ変異体の結合能は想定通り、野生型ｓｃＦｖと比べて低下し、特に、解離が早くなることがわかった。また、ＨＣ＿Ｒ５０Ａ及びＨＣ＿Ｒ５９Ａの二重変異導入、ＬＣ＿Ｎ３０Ａ、ＨＣ＿Ｒ５０Ａ及びＨＣ＿Ｒ５９Ａの三重変異導入により、結合能が相乗的に低下することが明らかとなった。

また、抗体断多量体分子の見かけの解離定数Ｋ_Ｄは、ｗｔ−ｄｉｍｅｒ（野生型）で２．０×１０^−２（ｎＭ）であったのに対して、ＨＣ＿Ｒ５９Ａ−ｄｉｍｅｒで０．４８（ｎＭ）、ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａ−ｄｉｍｅｒで５．９（ｎＭ）、ＬＣ＿Ｒ６６Ｇ／ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａ−ｔｒｉｍｅｒで３３０（ｎＭ）であり、本実施例の抗体断多量体分子では結合親和性が低下したことが明らかとなった（図１６（ｂ））。また、ＨＣ＿Ｒ５０Ａ及びＨＣ＿Ｒ５９Ａの二重変異導入、ＬＣ＿Ｎ３０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５０Ａ及びＨＣ＿Ｒ５９Ａの三重変異導入により、結合能が相乗的に低下することが明らかとなった。図１６の結果より、１０^−５〜１０^２ｓ^−１の解離速度定数ｋ_ｏｆｆを有し、かつ１０^−１〜１０^５ｎＭの解離定数Ｋ_Ｄを有するｓｃＦｖ変異体は、変異を導入することで野生型ｓｃＦｖに比べて結合能を減少させる一方で、これを多量体すると１０^−３〜１０^３ｎＭの解離定数Ｋ_Ｄを有しており、期待どおりにアビディティ効果により各々の単量体に比べて結合能が向上した抗体を作ることができた。

（実施例４）
（ｓｃＦｖ変異体の結合特異性）
次に、各ｓｃＦｖ変異体（ＨＣ＿Ｙ３３Ａ、ＨＣ＿Ｒ５０Ａ、ＨＣ＿Ｒ５９Ａ及びＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａ）の結合特異性への影響を調べるため、“ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ”、及び同じＥＧＦＲファミリーであるＥＧＦＲの細胞外ドメインの“ＥＧＦＲ−ＥＣＤ”への結合実験を行った（図１７（ａ））。ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ及びＥＧＦＲ−ＥＣＤを、実施例３と同様の方法及び固定化量でセンサーチップに固定し、各濃度のｓｃＦｖ変異体を添加した。ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃについては、実施例３と同様のものを用い、ＥＧＦＲ−ＥＣＤについては下記の通り調製した。測定条件は以下の通りである。
・測定機器：Ｂｉａｏｃｒｅ３０００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）
・チップ：ＣＭ５
・リガンド固定化法：アミンカップリング法
・リガンド：ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ、ＥＧＦＲ−ＥＣＤ
・リガンド固定化量：６００−７００ＲＵ
・アナライト濃度：野生型（ｗｔ）及び単変異体（ＨＣ＿Ｙ３３Ａ、ＨＣ＿Ｒ５０Ａ）：１μＭ、二重変異体（ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａ）：５ｍＭ
・バッファー：ＨＢＳ−ＥＰ
・流速：３０μＬ／ｍｉｎ
・温度：３０℃

ＥＧＦＲ−ＥＣＤ（図１７（ｂ））の調製方法について説明する。カイコ−バキュロウイルス発現系により調製した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｓｓｊ．ｊｐ／ａｒｃｈｉｖｅｓ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ／ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ／Ｂａｃｍｉｄ＿０１／Ｂａｃｍｉｄ＿０１．ｈｔｍｌを参照）。Ｓｆ９（昆虫細胞）―バキュロウイルス発現系による調製例（ＫａｔｈｒｙｎＭ．Ｆｅｒｇｕｓｏｎ（２０００）．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｄｏｍａｉｎｓｄｒｉｖｅｈｏｍｏ−ｂｕｔｎｏｔｈｅｔｅｒｏ−ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｅｒｂＢｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．ＥＭＢＯＪ，１９（１７），４６３２−４６４３）も参照した。
１）コンストラクトの作製
ＥＧＦＲ全長遺伝子より、図１７（ｂ）のように分泌シグナル配列及びＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ、Ｌｉｇａｎｄｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ）をコードする遺伝子をｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）（図１７（ｃ））のＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩサイト内に挿入した。ＰＣＲプライマーＥＧＦＲ−Ｆ（５’−ＧＧＧＧＡＡＧＡＴＣＴＡＴＧＣＧＡＣＣＣＴＣＣＧＧＧＡＣＧ−３’：配列番号３１）とＥＧＦＲ−Ｒ（５’−ＧＣＧＣＴＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＧＴＧＧＣＡＣＡＣＡＴＧＧＣＣＧＧＣ−３’：配列番号３２）を用いて、図１７（ｂ）のように３’末端に６ｘＨｉｓ（ヒスチジンタグ；精製用）を付加し、目的領域を増幅した。分泌シグナルにより目的タンパク質（ＥＧＦＲ−ＥＣＤ）がカイコ体液に分泌発現されることが期待できる。
２）組換えＢｍＮＰＶバクミド（カイコに感染するバキュロウイルスのゲノムＤＮＡ）の調製
氷上で溶かしたＢｍＤＨ１０Ｂａｃコンピテントセル（１００μＬ）にのプラスミド（０．１〜１μｇ）を加え、氷上で３０分インキュベートした。４２℃で４０秒ヒートショックを行い、氷上に２分静置した後、ＬＢ培地（１．４ｍＬ）を加え、３７℃で１時間培養した。Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ（終濃度１０μｇ／ｍＬ）を加え、３７℃で一晩培養した。Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（終濃度７μｇ／ｍＬ）を加え、３７℃で２時間培養した。Ｋａｎａｍｙｃｉｎ（終濃度５０μｇ／ｍＬ）、Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（終濃度７μｇ／ｍＬ）、ＩＰＴＧ（終濃度２００μＭ）、Ｘ−ｇａｌ（終濃度４０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地に播種した。白色コロニーについてｄｉｒｅｃｔＰＣＲ（Ｍ１３Ｆｏｒｗａｒｄ（−４０）：５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’：配列番号３３、Ｍ１３Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’：配列番号３４）によって目的遺伝子の有無を確認した（目的遺伝子がバクミドに挿入されていれば、約２，３００ｂｐ＋目的遺伝子のサイズのバンドが得られる）。目的遺伝子が挿入された組換えＢｍＮＰＶバクミドを持つコロニーをｋａｎａｍｙｃｉｎ（終濃度５０μｇ／ｍＬ）、ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（終濃度７μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩培養した。増殖した大腸菌からＥｎｄｏＦｒｅｅＰｌａｓｍｉｄＭｉｄｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ＥＧＦＲ−ＥＣＤ遺伝子が組み込まれた組換えＢｍＮＰＶバクミドＤＮＡを精製した。
３）組換えＢｍＮＰＶバクミドＤＮＡのカイコ幼虫への導入
組換えＢｍＮＰＶバクミドＤＮＡ（１μｇ）とＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（３μＬ）を混ぜ、室温で４５分静置した。滅菌水（５０μＬ）を加えて混ぜ、５齢カイコ幼虫（愛媛蚕種株式会社より購入）の腹部（尾部に近い方）に頭部へ向けて針（テルモシリンジ２６Ｇ）を刺し接種した。このようにして１０頭のカイコ幼虫に組換えＢｍＮＰＶバクミドを導入した。組換えタンパク質を回収するまで、朝晩２回人工飼料を与え、飼育用タッパーに入れて２５℃で飼育した。
４）組換えタンパク質の抽出
接種後６〜７日後、体色が黒くなることで感染成立を確認できる。幼虫の体液を回収し、ウエスタンブロッティングで目的タンパク質の発現を確認した。カイコ体液のメラニン化を防止するため、バッファーにチオ硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％となるように添加した。１．５ｍＬチューブに５％チオ硫酸ナトリウム（５０μＬ（体液の１／１０量を目安））を入れておき、カイコ幼虫の足にシリンジの針を刺して穴をあけ、体液をチューブに受けた。カイコ幼虫１頭あたり約５００μＬの体液を回収した。１０頭のカイコ幼虫から約５ｍＬの体液を回収した。１０，０００ｘｇ×１０ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、組換えタンパク質を含む上清を回収し、次の目的タンパク質を精製する工程に移った。
５）目的タンパク質の精製
ＥＧＦＲ−ＥＣＤの精製は、硫安沈殿、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィー、２回のゲル濾過クロマトグラフィーによる４段階の工程で実施した。硫安沈殿では、終濃度が８０％となるように飽和硫酸アンモニウム溶液をカイコ体液に加え、４℃で１時間程度ゆるやかに攪拌し、１０，０００ｘｇ、２０ｍｉｎで遠心分離した。ペレットを回収し次の実験で用いるバッファー（２５ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ）に溶解した。Ｎｉ−ＮＴＡ（ＱＩＡＧＥＮ）樹脂をカラムに充填し、上記バッファーで平衡化した。その後硫安沈殿で回収したペレット溶解液をカラムに供し、５０、１００、３００ｍＭイミダゾールを含むバッファーにて溶出した。ＥＧＦＲ−ＥＣＤを含む画分を回収し、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ＧＬカラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーを行った。ランニングバッファーは上記と同様２５ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌを用いた。ＥＧＦＲ−ＥＣＤを含む画分を回収し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００１０／３００ＧＬカラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーを行った。ランニングバッファーは上記と同じものを用いた。ＥＧＦＲ−ＥＣＤを含む画分を回収しこれを最終精製品とした。各精製段階およびクロマトグラフィー後の純度についてはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。

結果を図１７（ｄ）に示す。各ｓｃＦｖ変異体は野生型同様、ＥＧＦＲには結合せず抗原ＨＥＲ２に対して特異的に相互作用することが明らかとなった。

（実施例５）
（抗体断片多量体分子の結合能解析）
次に、野生型多量体分子（ｗｔ−ｄｉｍｅｒ：二量体、ｗｔ−ｔｒｉｍｅｒ：三量体、ｗｔ−ｐｅｎｔａｍｅｒ：五量体）の抗原結合実験を行った。実施例３と同様の方法により、チップ上に固定したＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃに対して各濃度の多量体を添加して、結合能を解析した。測定条件は以下の通りである。なお、ネガティブコントロールとして、ＢＳＡを用いた。また、ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃについては、実施例３と同様のものを用いた。
・測定機器：Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
・チップ：ＣＭ５
・リガンド固定化法：アミンカップリング法
・リガンド固定化量：１２００ＲＵ
・バッファー：ＨＢＳ−ＥＰ
・流速：３０μＬ／ｍｉｎ
・温度：３０℃
・再生条件：１０ｍＭＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）、１２５ｍＭＮａＣｌ

結果を図１８に示す。各野生型多量体分子はＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃに対して結合し、二量体及び三量体は、単量体と同条件でチップ表面から解離できることが分かった（図１８（ａ）、（ｂ））。しかし、五量体では、リガンドとの複合体形成により安定化し、同条件で解離させることができなかった（図１８（ｃ））。これにより、ｓｃＦｖ単量体を抗原から解離させるのに十分な条件下において、量体数が上がるにつれ抗原から解離しにくくなっていることが分かった。つまり、量体数が上がるにしたがって、アビディティ効果によって、抗原と強力に相互作用することが明らかとなった。

（実施例６）
（ＨＥＲ２高発現細胞を用いた細胞表面滞留性の検討）
続いて、ＨＥＲ２高発現細胞を用いて、細胞表面滞留性が多量体化により向上したか否かについて調べた。実験には、ＨＥＲ２高発現細胞として卵巣癌腺腫由来ＳＫ−ＯＶ−３を用い、ＡｄａｍｓＧＰらが実施した細胞表面滞留性試験方法に倣った（ＡｄａｍｓＧＰ，ｅｔａｌ．ＢｒＪＣａｎｃｅｒ１９９８，ｖｏｌ．７７，１４０５−１４１２．）。具体的には、Ｎ末端アミノ酸残基及び表面リジン残基をビオチン化したトラスツズマブ全長抗体、ｓｃＦｖ（実施例１で作製したｐＥＴ２２ｂ−ｓｃＦｖ−ＬＨ（モノマー）から実施例１と同様の方法で発現させたタンパク質）、ｗｔ−ｄｉｍｅｒ及び抗体断片多量体分子（ＨＣ＿Ｒ５９Ａ−ｄｉｍｅｒ、ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａ−ｄｉｍｅｒ（ＨＣ＿Ｒ５０Ａ／ＨＣ＿Ｒ５９Ａ二重変異））をＳＫ−ＯＶ−３とインキュベートし、細胞表面に結合したままの抗体をストレプトアビジンにて標識することで、フローサイトメトリーにより解析した。より具体的には、ＳＫ−ＯＶ−３に対する抗体の添加後、０、１、２、３時間後に細胞を回収し、蛍光標識ストレプトアビジンの添加及びＦＡＣＳ解析を行うことで、細胞表面の経時的な抗体残存率を評価した。測定条件は以下の通りである。なお、トラスツズマブ全長抗体として、Ｒｏｃｈｅ社より購入した抗体（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））を用いた。
・細胞：ＳＫ−ＯＶ−３（卵巣癌細胞、ＨＥＲ２過剰発現）
・細胞数：１．３×１０^６個
・抗体：ビオチン化した上記の抗体（全長１５ｍｇ、その他５−６ｍｇ）
・ネガティブコントロール：ｈｕｍａｎｍｙｅｌｏｍａＩｇＧｋａｐｐａ
・測定機器：ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）
・バッファー：ＦＡＣＳｂｕｆｆｅｒ（１×ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ_３）

結果を図１９に示す。全長抗体、ｓｃＦｖ、ｗｔ−ｄｉｍｅｒ（野生型二量体）の抗体残存率の時間変化を比較すると、ｓｃＦｖ断片化により癌細胞表面抗原への滞留性が減少したことが示された（図１９（ａ））。また、３時間後抗体残存率を比較すると、単量体及び二量体では抗原結合部位の変異により滞留性が低下すること、さらに、Ｒ５９Ａを二量体化することで、滞留性が向上することが示された（図１９（ｂ））。

（実施例７）
抗体医薬品であるセツキシマブをモデル抗体として、可変領域およびその周辺へ変異導入を行い、多量体形成ペプチドの付加による多量体化を試みた。

セツキシマブは、上皮増殖因子受容体ファミリーのＥＧＦＲを抗原とする分子標的薬であり、ＥＧＦＲ過剰発現が確認された転移性大腸癌や頭頸部癌で適応されるヒト化モノクローナル抗体である。

セツキシマブから一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）を作製し、一分子あたりの抗原結合能を意図的に低下させたｓｃＦｖ変異体を、蛋白質工学的なアプローチにより多量体化させた。セツキシマブのＶＬのアミノ酸配列は配列番号３５、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号３６に示される。

（コンストラクト作製）
まず、以下の２種のコンストラクトを作製した。使用したベクターは、ｐＥＴ２２ｂ（＋）である（図７）。
・ｐＥＴ２２ｂ−ｓｃＦｖ−ＬＨ（モノマー）
ｐＥＴ２２ｂ（＋）のＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイト内に、ｓｃＦｖをコードする遺伝子（アミノ酸配列：配列番号４１、ＤＮＡ配列：配列番号４２）が挿入されている。

（変異導入）
次に、ｓｃＦｖ一分子あたりの抗原結合能を意図的に下げるために、変異を導入した（図２０（ａ）、（ｂ））。セツキシマブのｓｃＦｖはＥＧＦＲに対して強力に結合するため、野生型ではＥＧＦＲを発現した正常細胞に結合する可能性がある。そこで、既報のＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＧＦＲ−ＥＣＤ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｄｏｍａｉｎ））とセツキシマブのＦａｂとの複合体結晶構造より、結合に関わるアミノ酸残基を確認し、結合能の抑制を検討した。該複合体結晶構造より、ＣＤＲ１における軽鎖２７番目のグルタミン残基（以下、「ＬＣ＿Ｑ２７」という）は、ＥＧＦＲ−ＥＣＤの４７３番目のグルタミン酸残基と極性相互作用を形成することが想定された（図２０（ｂ））。そこで、この結合に重要な残基であるＬＣ＿Ｑ２７を中性アミノ酸であるアラニンに置換することにした。なお、比較例である野生型では、変異を導入しなかった。

変異導入の方法について説明する。ｐＥＴ２２ｂ−ｓｃＦｖ−ＬＨを鋳型ＤＮＡとして以下の反応溶液５０μＬを準備し、ＰＣＲ法により各プラスミドを増幅した。ＬＣ＿Ｑ２７Ａの増幅にはプライマーＬＣ＿Ｑ２７Ａ＿Ｆ（５’−ＧＣＡＴＣＡＧＣＣＴＣＧＡＴＴＧＧＴＡＣＣＡＡＴＡＴＣ−３’（配列番号４３））及びプライマーＬＣ＿Ｑ２７Ａ＿Ｒ（５’−ＧＡＴＡＴＴＧＧＴＡＣＣＡＡＴＣＧＡＧＧＣＴＧＡＴＧＣ−３’（配列番号４４））を使用した。ＰＣＲ増幅産物をエタノール沈殿により精製し、大腸菌発現用プラスミドの調製に供した。作製したプラスミドを、ｐＥＴ２２ｂ−ＬＣ＿Ｑ２７Ａとした。

（大腸菌発現用プラスミド）
上記の通り作製した各プラスミドを実施例１と同様の方法により大腸菌体内に封入体として発現させた。

（ｓｃＦｖ変異体の結合解析）
ＳＰＲ法（表面プラズモン共鳴法）を用いて、ｓｃＦｖ変異体（ＬＣ＿Ｑ２７Ａ）とＥＧＦＲ−ＥＣＤとの相互作用解析を行った。

センサーチップ上に固定したＥＧＦＲ−ＥＣＤに対し、各濃度のｓｃＦｖ変異体及び抗体断多量体分子を添加し、これらのセンサグラムを得て、速度論的パラメータを算出した。測定条件は以下の通りである。なお、ネガティブコントロールとして、Ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）を用いた。なお、ＥＧＦＲ−ＥＣＤとして実施例４と同様のカイコ発現系により調製したタンパク質を用いた。

本測定ではＢＩＡｃｏｒｅ２０００、３０００（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、センサーチップＣＭ５上にリガンドとしてＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ又はＢＳＡをアミンカップリング法によりそれぞれ１２００ＲＵ程度固定化し、各ｓｃＦｖ変異体及び抗体断多量体分子のアナライトとしての希釈系列（１３、２５、５０、１００、２００ｎＭ）を作成し、低濃度側から順次送液を行った（図２０（ｃ））。各濃度において、各ｓｃＦｖ変異体をリガンドとした場合のセンサグラム（Ａ）及びＢＳＡをリガンドとした場合のセンサグラム（Ｂ）を差し引き（センサグラムＡ−センサグラムＢ）した。１：１結合モデル（Ｌａｎｇｍｕｉｒｂｉｎｄｉｎｇｍｏｄｅｌ）に近似することで速度論的パラメーター（ｋ_ｏｎ、ｋ_ｏｆｆ、Ｋ_Ｄ；Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎより求まる。）を算出した（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｂｆ．ｕｎｉ−ｌｊ．ｓｉ／ｂｉ／ｓｐｒｃｅｎｔｅｒ／ＢｉａｃｏｒｅＴ１００／Ｓｅｓｓｉｏｎ５％２０ＢａｓｉｃＫｉｎｅｔｉｃｓ．ｐｄｆを参照）（図３）。近似式については前述同様である。
・測定機器：Ｂｉａｏｃｒｅ２０００、３０００（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
・チップ：ＣＭ５
・バッファー：ＨＢＳ−ＥＰ
・リガンド：ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ
・リガンド固定化法：アミンカップリング法
・リガンド固定化量：６００ＲＵ
・アナライト濃度：１３、２５、５０、１００、２００ｎＭ
・流速：３０μＬ／ｍｉｎ
・温度：２５℃

結果を図２０（ｄ）に示す。ｓｃＦｖ変異体において、ｋ_ｏｆｆは、ｗｔ（野生型）で１．４×１０^−３（１／ｓ）であったのに対して、ＬＣ＿Ｑ２７Ａで５．９×１０^−３（１／ｓ）であり、変異型では解離が早くなることが明らかとなった。また、Ｋ_Ｄは、ｗｔ（野生型）で０．７０（ｎＭ）であったのに対して、ＬＣ＿Ｑ２７Ａで５．４（ｎＭ）であり、変異型では結合親和性が低下したことが明らかとなった。以上より、単一変異体であるＬＣ＿Ｑ２７Ａでは野生型ｓｃＦｖの１０倍程度解離定数が大きくなっており、抗原への結合親和性が低下したことが明らかとなった。これより、ｓｃＦｖ変異体の結合能は想定通り、野生型ｓｃＦｖと比べて低下し、特に、解離が早くなることがわかった。

本実施例で作製されたセツキシマブのｓｃＦｖ変異体は、多量化することで、結合価数の増加によるアビディティ効果が得られ、高い標的選択性及び高い親和性を有することが期待される。また、例えば、先の実施例で作製されたトラスツズマブのｓｃＦｖ変異体とヘテロ多量体分子を作製することができる。

以上より、本実施例による抗体断片多量体分子では、一抗体断片分子あたりの抗原結合能の低下、多量体化による抗原結合能の向上、及び細胞表面への滞留性の向上が見られた。

なお、本発明は、本発明の広義の精神及び範囲を逸脱することなく、様々な実施形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。つまり、本発明の範囲は、実施形態ではなく、請求の範囲によって示される。そして、請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。

本発明は、２０１７年１２月１９日に出願された日本国特許出願２０１７−２４３１２２号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０１７−２４３１２２号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。

Claims

一本鎖Ｆｖ抗体断片の２以上の多量体であり、
抗原に対して、１０^−３〜１０^３ｎＭの見かけの解離定数Ｋ_Ｄを有し、
前記一本鎖Ｆｖ抗体断片は、前記抗原に対して、１０^−５〜１０^２ｓ^−１の解離速度定数ｋ_ｏｆｆを有し、かつ１０^−１〜１０^５ｎＭの解離定数Ｋ_Ｄを有する、
ことを特徴とする抗体断片多量体分子。
前記一本鎖Ｆｖ抗体断片は、重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域の少なくとも１つのアミノ酸配列において変異を有する、
ことを特徴とする請求項１に記載の抗体断片多量体分子。
前記一本鎖Ｆｖ抗体断片の重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されている、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の抗体断片多量体分子。
前記一本鎖Ｆｖ抗体断片は、重鎖の可変領域の少なくとも１つのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入され、かつ、軽鎖の可変領域の少なくとも１つのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されている、
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の抗体断片多量体分子。
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の抗体断片多量体分子からなる医薬品。
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の抗体断片多量体分子からなる抗腫瘍剤。
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の抗体断片多量体分子からなる自己免疫疾患治療剤。
腫瘍の治療に使用するための請求項１乃至４のいずれか１項に記載の抗体断片多量体分子。
自己免疫疾患の治療に使用するための請求項１乃至４のいずれか１項に記載の抗体断片多量体分子。
抗原に対して、１０^−５〜１０^２ｓ^−１の解離速度定数ｋ_ｏｆｆを有し、かつ１０^−１〜１０^５ｎＭの解離定数Ｋ_Ｄを有する一本鎖Ｆｖ抗体断片を、２以上の多量体に多量体化することで、前記抗原に対して、１０^−３〜１０^３ｎＭの見かけの解離定数Ｋ_Ｄを有する抗体断片多量体分子を得る工程を含む抗体断片多量体分子の作製方法。
前記一本鎖Ｆｖ抗体断片の重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域において少なくとも１つのアミノ酸配列において変異を生じさせる、
ことを特徴とする請求項１０に記載の抗体断片多量体分子の作製方法。
前記一本鎖Ｆｖ抗体断片の重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域において、１又は数個のアミノ酸を置換、欠失、付加又は挿入させる、
ことを特徴とする請求項１０又は１１に記載の抗体断片多量体分子の作製方法。
前記一本鎖Ｆｖ抗体断片は、重鎖の可変領域の少なくとも１つのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入され、かつ、軽鎖の可変領域の少なくとも１つのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されている、
ことを特徴とする請求項１０乃至１２のいずれか１項に記載の抗体断片多量体分子の作製方法。
抗原に対して、１０^−５〜１０^２ｓ^−１の解離速度定数ｋ_ｏｆｆを有し、かつ１０^−１〜１０^５ｎＭの解離定数Ｋ_Ｄを有する一本鎖Ｆｖ抗体断片を用いる、
ことを特徴とする抗体断片多量体分子の作製方法。
抗原に対して、１０^−５〜１０^２ｓ^−１の解離速度定数ｋ_ｏｆｆを有し、かつ１０^−１〜１０^５ｎＭの解離定数Ｋ_Ｄを有する一本鎖Ｆｖ抗体断片。