JPWO2019035478A1 - Method of manufacturing polymer by native chemical ligation method - Google Patents

Abstract

本発明は、ペプチド結合を有する高分子を高収率かつ短時間で製造する方法を提供することを目的とする。本発明によれば、ペプチド結合を有する高分子の製造方法であって、（Ａ）未保護のシステイン残基を有する高分子断片１と、保護されたシステイン残基を有し、かつ、活性化された任意のアミノ酸残基を有する高分子断片２とを、ＮＣＬ法により連結させて保護されたシステイン残基を有する高分子断片１−２を得る工程、および（Ｂ）前記工程（Ａ）の後に、脱保護剤を添加して、未保護のシステイン残基を有する高分子断片１−２を得る工程を含んでなり、工程（Ａ）および（Ｂ）を脱保護剤の不活性化剤が存在する反応系で実施する、製造方法が提供される。工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）をさらに１回以上繰り返すことができる。An object of the present invention is to provide a method for producing a polymer having a peptide bond in a high yield and in a short time. According to the present invention, it is a method for producing a polymer having a peptide bond, wherein (A) a polymer fragment 1 having an unprotected cysteine residue and a protected cysteine residue and being activated. A step of ligating the polymer fragment 2 having an arbitrary amino acid residue obtained by the NCL method to obtain a polymer fragment 1-2 having a protected cysteine residue, and (B) the step (A). Later, a deprotecting agent was added to obtain a polymer fragment 1-2 having an unprotected cysteine residue, and steps (A) and (B) were carried out by the deprotecting agent inactivating agent. A production method is provided that is carried out in an existing reaction system. Step (A), step (B) and step (C) can be repeated one or more times.

Description

関連出願の参照Reference of related application

本願は、先行する日本国出願である特願２０１７−１５７７５１（出願日：２０１７年８月１８日）の優先権の利益を享受するものであり、その開示内容全体は引用することにより本明細書の一部とされる。 The present application enjoys the benefit of the priority of Japanese Patent Application No. 2017-157751 (Filing date: August 18, 2017), which is a prior application in Japan, and the entire disclosure contents are hereby cited by reference. Be part of.

本発明は、ネイティブケミカルライゲーション法による高分子の製造方法に関し、さらに詳細には、ネイティブケミカルライゲーション法によるペプチドおよびタンパク質の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a polymer by a native chemical ligation method, and more particularly to a method for producing a peptide and a protein by a native chemical ligation method.

ペプチドを合成する手法としては固相法と液相法が知られている。固相法ではＣ末端からＮ末端に向かって１アミノ酸ずつ鎖長を延長するため、固相法により合成されるペプチド鎖は１００アミノ酸程度が上限である。このため長鎖のペプチドを合成する場合には、生合成やペプチド鎖を連結する手法が用いられている。 Solid-phase method and liquid-phase method are known as methods for synthesizing peptides. In the solid phase method, the chain length is extended by one amino acid from the C-terminal to the N-terminal, so that the upper limit of the peptide chain synthesized by the solid phase method is about 100 amino acids. Therefore, when synthesizing a long-chain peptide, biosynthesis or a method of linking peptide chains is used.

ペプチド鎖連結手法としては、これまでにネイティブケミカルライゲーション法（Native Chemical Ligation、ＮＣＬ法）が広く用いられている。ＮＣＬ法は、Ｃ末端にαカルボキシチオエステル部分を有するようにしたペプチドと、Ｎ末端にシステイン残基を有するペプチドとの化学選択反応であり、無保護のペプチド断片を用いて緩衝溶液中で混合するのみで、ペプチド結合を介して二つのペプチド断片を連結することができる。このためＮＣＬ法は、複数のペプチド断片を連結させて人工タンパク質を創製する手法として利用されている。 As a peptide chain linking method, the Native Chemical Ligation method (NCL method) has been widely used so far. The NCL method is a chemical selection reaction between a peptide having an α-carboxythioester moiety at the C-terminal and a peptide having a cysteine residue at the N-terminal, and mixes in a buffer solution using an unprotected peptide fragment. Only one can link two peptide fragments via a peptide bond. Therefore, the NCL method is used as a method for creating an artificial protein by linking a plurality of peptide fragments.

このようにＮＣＬ法によれば、液相で比較的長鎖のタンパク質を調製することができるが、ＮＣＬ法では、ペプチド断片を連結させるたびに連結したペプチド断片を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法などの精製手段により精製する必要があった。このためＮＣＬ法により比較的長鎖のタンパク質を調製する場合には、ペプチド断片の連結工程が多ければ多いほど、時間がかかり、しかも収率が低くなるという課題があった。 As described above, according to the NCL method, a relatively long-chain protein can be prepared in the liquid phase, but in the NCL method, the peptide fragments linked each time the peptide fragments are linked are subjected to a high performance liquid chromatography (HPLC) method. It was necessary to purify by a purification means such as. Therefore, when a relatively long-chain protein is prepared by the NCL method, there is a problem that the more steps of linking the peptide fragments, the longer it takes and the lower the yield.

これまでに複数のペプチド断片をワンポットで連結させる手法が報告されている（非特許文献１）。しかしこの手法は、脱保護工程を強塩基条件下（ｐＨ１１以上）で実施するため、ペプチド鎖が分解されたりすることなど課題があった。 So far, a method of linking a plurality of peptide fragments in one pot has been reported (Non-Patent Document 1). However, since this method carries out the deprotection step under strong base conditions (pH 11 or higher), there is a problem that the peptide chain is decomposed.

Tang S. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 54:5713-5717(2015)Tang S. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 54: 5713-5717 (2015)

本発明は、ペプチド結合を有する高分子（特に、ペプチドおよびタンパク質）を高収率かつ短時間で製造する方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for producing a polymer having a peptide bond (particularly, a peptide and a protein) in a high yield and in a short time.

本発明者らは、今般、脱保護剤として使用可能なパラジウム錯体をＮＣＬ法の促進剤である４−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）によって不活性化できること、ＮＣＬ法によるペプチド断片の連結反応において、脱保護剤であるパラジウム錯体の添加とパラジウム錯体の不活性化をワンポットで連続的に実施できること、５つのペプチド断片をＮＣＬ法により順次連結させる際にパラジウム錯体の添加とＭＰＡＡによる不活性化を連続的に行うことで、約３０％の収率で１日以内に目的ペプチドを製造できることを見出した。本発明者らはまた、本発明が１００アミノ酸残基を超えるタンパク質の合成にも適用可能であることを確認した。本発明はこれらの知見に基づくものである。 The present inventors have now shown that a palladium complex that can be used as a deprotecting agent can be inactivated by 4-mercaptophenylacetic acid (MPAA), which is an accelerator of the NCL method, and that the palladium complex can be deactivated in the peptide fragment ligation reaction by the NCL method. The addition of the palladium complex as a protecting agent and the inactivation of the palladium complex can be continuously carried out in one pot, and when the five peptide fragments are sequentially linked by the NCL method, the addition of the palladium complex and the inactivation by MPAA are continuously carried out. It was found that the target peptide can be produced within 1 day with a yield of about 30%. The present inventors have also confirmed that the present invention is applicable to the synthesis of proteins having more than 100 amino acid residues. The present invention is based on these findings.

本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］ペプチド結合を有する高分子の製造方法であって、
（Ａ）未保護のシステイン残基を有する高分子断片１：

（上記式中、Ｃｙｓはシステイン残基を表す。）
と、保護されたシステイン残基を有し、かつ、活性化された任意のアミノ酸残基を有する高分子断片２：

（上記式中、Ｃｙｓはシステイン残基を表し、ＡＡは任意のアミノ酸残基を表し、Ｐｒはアミノ基の保護基を表し、Ｘはカルボキシル基の活性化基を表す。）
とを、ＮＣＬ法により連結させて保護されたシステイン残基を有する高分子断片１−２：

（上記式中、Ｃｙｓはシステイン残基を表し、ＡＡは任意のアミノ酸残基を表し、Ｐｒはアミノ基の保護基を表す。）
を得る工程、
（Ｂ）前記工程（Ａ）の後に、脱保護剤を添加して、未保護のシステイン残基を有する高分子断片１−２：

（上記式中、Ｃｙｓはシステイン残基を表し、ＡＡは任意のアミノ酸残基を表す。）
を得る工程を含んでなり、工程（Ａ）および（Ｂ）を脱保護剤の不活性化剤が存在する反応系で実施する、製造方法。
［２］工程（Ｂ）の後に、（Ｃ）脱保護剤を不活性化させる工程をさらに含む、上記［１］に記載の製造方法。
［３］不活性化剤を脱保護剤の添加量を上回る量で存在させる、上記［１］または［２］に記載の製造方法。
［４］工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）をさらに１回以上繰り返す、上記［２］または［３］に記載の製造方法。
［５］工程（Ｃ）の後に、得られた高分子断片を精製する工程を実施せずに、次の工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）を実施する、上記［４］に記載の製造方法。
［６］工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）を４回または５回繰り返して実施した場合に、ペプチド結合を有する高分子の収率が２５〜３５％である、上記［４］または［５］に記載の製造方法。
［７］ペプチド結合を有する高分子が、ペプチドであり、
高分子断片１が、アミノ基が未保護のシステイン残基をＮ末端に有するペプチド断片１であり、
高分子断片２が、アミノ基が保護基により保護されたシステイン残基をＮ末端に有し、かつ、カルボキシル基が活性化された任意のアミノ酸残基をＣ末端に有するペプチド断片２であり、
保護されたシステイン残基を有する高分子断片１−２が、アミノ基が保護基により保護されたシステイン残基をＮ末端に有するペプチド断片１−２であり、
未保護のシステイン残基を有する高分子断片１−２が、アミノ基が未保護のシステイン残基をＮ末端に有するペプチド断片１−２である、
上記［１］〜［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］脱保護剤が、リン系配位子、窒素系配位子、酸素系配位子または硫黄系配位子が配位結合した金属錯体である、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の製造方法。
［９］保護基が、上記［８］に記載の脱保護剤により脱保護される基である、上記［１］〜［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］不活性化剤が、チオール系化合物である、上記［１］〜［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］反応系において、工程（Ａ）で得られた高分子断片に対する脱保護剤の１回当たりの添加量の比率（モル比）が、１〜３０である、上記［１］〜［１０］のいずれかに記載の製造方法。According to the present invention, the following inventions are provided.
[1] A method for producing a polymer having a peptide bond.
(A) Polymer fragment with unprotected cysteine residue 1:

(In the above formula, Cys represents a cysteine residue.)
And a polymer fragment with a protected cysteine residue and any activated amino acid residue 2:

(In the above formula, Cys represents a cysteine residue, AA represents an arbitrary amino acid residue, Pr represents a protecting group of an amino group, and X represents an activating group of a carboxyl group.)
And are linked by the NCL method to have a protected cysteine residue.

(In the above formula, Cys represents a cysteine residue, AA represents an arbitrary amino acid residue, and Pr represents a protecting group of an amino group.)
The process of getting
(B) After the step (A), a deprotecting agent is added to polymer fragment 1-2 having an unprotected cysteine residue.

(In the above formula, Cys represents a cysteine residue and AA represents an arbitrary amino acid residue.)
A production method comprising the steps of obtaining the above, wherein steps (A) and (B) are carried out in a reaction system in which an inactivating agent for a deprotecting agent is present.
[2] The production method according to the above [1], further comprising a step of inactivating the deprotecting agent (C) after the step (B).
[3] The production method according to the above [1] or [2], wherein the inactivating agent is present in an amount exceeding the addition amount of the deprotecting agent.
[4] The production method according to the above [2] or [3], wherein the step (A), the step (B) and the step (C) are repeated one or more times.
[5] After the step (C), the following steps (A), (B) and (C) are carried out without carrying out the step of purifying the obtained polymer fragment. The manufacturing method described in.
[6] When the steps (A), (B) and (C) are repeated 4 or 5 times, the yield of the polymer having a peptide bond is 25 to 35%. ] Or [5].
[7] The polymer having a peptide bond is a peptide.
The polymer fragment 1 is a peptide fragment 1 having an unprotected cysteine residue at the N-terminal of the amino group.
The polymer fragment 2 is a peptide fragment 2 having a cysteine residue having an amino group protected by a protective group at the N-terminal and an arbitrary amino acid residue having an activated carboxyl group at the C-terminal.
The polymer fragment 1-2 having a protected cysteine residue is a peptide fragment 1-2 having an amino group-protected cysteine residue at the N-terminal.
The polymer fragment 1-2 having an unprotected cysteine residue is a peptide fragment 1-2 having an unprotected cysteine residue at the N-terminal of the amino group.
The production method according to any one of the above [1] to [6].
[8] The deprotective agent is a metal complex in which a phosphorus-based ligand, a nitrogen-based ligand, an oxygen-based ligand, or a sulfur-based ligand is coordinate-bonded, according to the above [1] to [7]. The manufacturing method according to any one.
[9] The production method according to any one of the above [1] to [8], wherein the protecting group is a group that is deprotected by the deprotecting agent according to the above [8].
[10] The production method according to any one of the above [1] to [9], wherein the inactivating agent is a thiol compound.
[11] In the reaction system, the ratio (molar ratio) of the amount of the deprotecting agent added at one time to the polymer fragment obtained in the step (A) is 1 to 30, the above [1] to [10]. ] The manufacturing method according to any one of.

本発明の製造方法によれば、ＮＣＬ法において、複数のペプチド断片を連続してワンポットで連結させることができ、しかも目的産物を高い収率で得ることができる。本発明の製造方法はまた、反応系を極端なｐＨ値に調整せずに反応を実施することができることから、副反応産物の生成が低い点でも有利である。 According to the production method of the present invention, in the NCL method, a plurality of peptide fragments can be continuously linked in one pot, and the target product can be obtained in a high yield. The production method of the present invention is also advantageous in that the production of side reaction products is low because the reaction can be carried out without adjusting the reaction system to an extreme pH value.

図１は、本発明によりｎ個の高分子断片を連結させてｎ−１個のペプチド結合を有する高分子を製造する手順の模式図である。FIG. 1 is a schematic diagram of a procedure for producing a polymer having n-1 peptide bonds by linking n polymer fragments according to the present invention. 図２は、本発明によりｎ個のペプチド断片を連結させてペプチドを製造する手順の模式図である。FIG. 2 is a schematic diagram of a procedure for producing a peptide by linking n peptide fragments according to the present invention.

発明の具体的説明Specific description of the invention

本発明の製造方法は、２種またはそれ以上の高分子断片を連結させてペプチド結合を有する高分子、すなわち、高分子断片がペプチド結合で連結されてなる高分子を製造する方法である。ペプチド結合を有する高分子としては、例えば、ペプチド、ペプチド結合を有する炭化水素分子、ペプチド結合を有するポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ペプチド結合を有する樹脂が挙げられるが、典型的には、ペプチドである。なお、本発明においてペプチドとは、アミノ酸がペプチド結合により結合したものを意味し、ポリペプチドおよびタンパク質を含む意味で用いられるものとする。 The production method of the present invention is a method for producing a polymer having a peptide bond by linking two or more kinds of polymer fragments, that is, a polymer in which the polymer fragments are linked by a peptide bond. Examples of the polymer having a peptide bond include a peptide, a hydrocarbon molecule having a peptide bond, a polynucleotide molecule having a peptide bond (for example, DNA, RNA), and a resin having a peptide bond, but typically. , Peptide. In the present invention, the term "peptide" means an amino acid bonded by a peptide bond, and is used to include a polypeptide and a protein.

高分子断片１および高分子断片２は、最終生産物であるペプチド結合を有する高分子を構成する高分子断片であり、かつ、システイン残基および場合によっては任意のアミノ酸残基を有する限り特に限定されるものではない。高分子断片としては、所定のアミノ酸残基を有するペプチド断片、炭化水素断片、ポリヌクレオチド断片、樹脂断片が挙げられるが、典型的には、ペプチド断片である。 The polymer fragment 1 and the polymer fragment 2 are particularly limited as long as they are polymer fragments constituting the polymer having a peptide bond, which is the final product, and have a cysteine residue and, in some cases, an arbitrary amino acid residue. It is not something that is done. Examples of the polymer fragment include a peptide fragment having a predetermined amino acid residue, a hydrocarbon fragment, a polynucleotide fragment, and a resin fragment, and a typical example is a peptide fragment.

工程（Ａ）の連結工程を効率的に実施するためには、高分子断片１および高分子断片２の分子量並びに繰り返し工程で新たに添加される高分子断片の分子量（数平均分子量）は、１０００〜１００００Ｄａとすることができる。また、最終産物として得られる高分子の分子量（数平均分子量）は、４０００〜５００００Ｄａ（好ましくは、５０００〜４００００Ｄａ）とすることができる。さらに、ペプチド断片を連結させてペプチドを製造する場合、工程（Ａ）の連結工程を効率的に実施するためには、ペプチド断片１およびペプチド断片２のアミノ酸数並びに繰り返し工程で新たに添加されるペプチド断片のアミノ酸数は、５〜１００個（好ましくは２０〜６０個）とすることができる。また、最終産物として得られるペプチドのアミノ酸数は、２０〜７００個、２５〜５００個または２５〜４００個とすることができる。 In order to efficiently carry out the connecting step of the step (A), the molecular weights of the polymer fragments 1 and 2 and the molecular weights (number average molecular weights) of the polymer fragments newly added in the repeating step are 1000. It can be 10000 Da. The molecular weight (number average molecular weight) of the polymer obtained as the final product can be 4000 to 50000 Da (preferably 5000 to 40,000 Da). Further, when a peptide is produced by linking peptide fragments, in order to efficiently carry out the linking step of step (A), the number of amino acids of peptide fragment 1 and peptide fragment 2 and new additions are made in a repeating step. The number of amino acids in the peptide fragment can be 5 to 100 (preferably 20 to 60). The number of amino acids in the peptide obtained as the final product can be 20 to 700, 25 to 500 or 25 to 400.

工程（Ａ）は、２種類の高分子断片を連結させる工程（連結工程）である。工程（Ａ）はネイティブケミカルライゲーション法（ＮＣＬ法）に基づいて実施するため、連結させる２種類の高分子断片のうち一方は、システイン残基（但し、そのＣ末端側（カルボキシル基）が高分子断片に結合し、そのＮ末端側（アミノ基）が未保護である）を有するもの（高分子断片１）である。また他方は、保護基により保護されたシステイン残基（但し、そのＣ末端側（カルボキシル基）が高分子断片に結合し、そのＮ末端側（アミノ基）が保護基により保護されている）と、任意のアミノ酸残基（但し、そのＮ末端側（アミノ基）が高分子断片に結合し、そのＣ末端側（カルボキシル基）が活性化基により活性化されている）とを有するもの（高分子断片２）である。高分子断片へのシステイン残基および任意のアミノ酸残基の導入方法並びに保護基および活性化基の導入方法は公知であり、当業者であれば市販の試薬および装置や適切な方法を選択して実施することができる。 The step (A) is a step (linking step) of connecting two types of polymer fragments. Since the step (A) is carried out based on the native chemical ligation method (NCL method), one of the two types of polymer fragments to be linked has a cysteine residue (however, its C-terminal side (carboxyl group) is a polymer. It is a polymer fragment 1 that binds to a fragment and has an N-terminal side (amino group) thereof (unprotected). The other is a cysteine residue protected by a protecting group (however, its C-terminal side (carboxyl group) is bound to a polymer fragment and its N-terminal side (amino group) is protected by a protecting group). , Any amino acid residue (however, its N-terminal side (amino group) is bound to the polymer fragment and its C-terminal side (carboxyl group) is activated by an activating group) (high) It is a molecular fragment 2). Methods for introducing cysteine residues and arbitrary amino acid residues into polymer fragments and methods for introducing protecting and activating groups are known, and those skilled in the art can select commercially available reagents and devices or appropriate methods. Can be carried out.

ＮＣＬ法により高分子断片同士を連結させると、高分子断片１のシステイン残基（Ｎ末端）と、高分子断片２の活性化された任意のアミノ酸残基（Ｃ末端）とがペプチド結合した高分子断片１−２が得られる。この高分子断片１−２は、高分子断片２由来の保護されたシステイン残基を有しており、後述の通り、工程（Ｂ）によりこの保護基を脱保護することができる。 When the polymer fragments are linked to each other by the NCL method, the cysteine residue (N-terminal) of the polymer fragment 1 and the activated arbitrary amino acid residue (C-terminal) of the polymer fragment 2 are peptide-bonded to each other. Molecular fragment 1-2 is obtained. The polymer fragment 1-2 has a protected cysteine residue derived from the polymer fragment 2, and the protecting group can be deprotected by the step (B) as described later.

高分子断片がペプチド断片である場合には、Ｎ末端にシステイン残基を有するペプチド断片１と、アミノ基が保護基により保護されたシステイン残基をＮ末端に有し、かつ、カルボキシル基が活性化基により活性化された任意のアミノ酸残基をＣ末端に有するペプチド断片２とをＮＣＬ法により連結させることができ、両者がペプチド結合したペプチド断片１−２が得られる。このペプチド断片１−２は、ペプチド断片２由来の保護されたシステイン残基をＮ末端に有しており、後述の通り、工程（Ｂ）によりこの保護基を脱保護することができる。ペプチド断片の合成方法並びにペプチド断片への保護基および活性化基の導入方法は公知であり、当業者であれば市販の試薬および装置や適切な方法を選択して実施することができる。 When the polymer fragment is a peptide fragment, it has a peptide fragment 1 having a cysteine residue at the N-terminal and a cysteine residue whose amino group is protected by a protective group at the N-terminal, and the carboxyl group is active. A peptide fragment 2 having an arbitrary amino acid residue activated by a chemical group at the C-terminal can be linked by the NCL method to obtain a peptide fragment 1-2 in which both are peptide-bonded. This peptide fragment 1-2 has a protected cysteine residue derived from peptide fragment 2 at the N-terminal, and this protecting group can be deprotected by step (B) as described later. Methods for synthesizing peptide fragments and introducing protecting and activating groups into peptide fragments are known, and those skilled in the art can select and carry out commercially available reagents and devices and appropriate methods.

高分子断片２およびペプチド断片２のシステイン残基のアミノ基の保護基Ｐｒは、工程（Ｂ）で使用する脱保護剤により脱保護される限り特に限定されるものではないが、例えば、アリルオキシカルボニル基（以下、単に「Ａｌｏｃ基」ということがある）、トリアルキルシリルエチルオキシカルボニル基、アルキルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、プロパルギルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基、イソプロピルアリルオキシカルボニル基およびトリクロロエトキシカルボニル基が挙げられ、好ましくはＡｌｏｃ基である。 The protecting group Pr of the amino group of the cysteine residue of the polymer fragment 2 and the peptide fragment 2 is not particularly limited as long as it is deprotected by the deprotecting agent used in step (B), but for example, allyloxy. Carbonyl group (hereinafter sometimes simply referred to as "Aloc group"), trialkylsilylethyloxycarbonyl group, alkyloxycarbonyl group, benzyloxycarbonyl group, propargyloxycarbonyl group, adamantyloxycarbonyl group, isopropylallyloxycarbonyl group and Examples thereof include a trichloroethoxycarbonyl group, preferably an Aloc group.

高分子断片２およびペプチド断片２の任意のアミノ酸残基のカルボキシル基の活性化基Ｘは、ＮＣＬ法によるペプチド結合の形成反応が進行する限り特に限定されるものではないが、例えば、チオエステル基（−ＳＲａ）、Ｎ−アシル−ベンズイミダゾリノン基（Ｎｂｚ基）が挙げられ、好ましくはチオエステル基、より好ましくはアルキルチオエステル基である。ここで、チオエステル基の基Ｒａは、ＮＣＬ法におけるチオエステル交換反応を阻害せず、カルボニル炭素上での置換反応において脱離基となる基であれば特に限定されない。Ｒａは、例えば、置換または非置換のベンジル基、置換または非置換のアリール基および置換または非置換のアルキル基から選択することができ、好ましくは置換または非置換のベンジル基、置換または非置換のＣ_６−１０アリール基（より好ましくは置換または非置換のフェニル基またはナフチル基）および置換または非置換のＣ_１−８アルキル基（より好ましくはＣ_１−６アルキル基）から選択することができる。The activating group X of the carboxyl group of any amino acid residue of the polymer fragment 2 and the peptide fragment 2 is not particularly limited as long as the peptide bond forming reaction by the NCL method proceeds, but for example, a thioester group ( -SRa), N-acyl-benzimidazolinone group (Nbz group), preferably a thioester group, more preferably an alkylthioester group. Here, the group Ra of the thioester group is not particularly limited as long as it does not inhibit the thioester exchange reaction in the NCL method and becomes a leaving group in the substitution reaction on the carbonyl carbon. Ra can be selected from, for example, substituted or unsubstituted benzyl groups, substituted or unsubstituted aryl groups and substituted or unsubstituted alkyl groups, preferably substituted or unsubstituted benzyl groups, substituted or unsubstituted. It can be selected from C _6-10 aryl groups (more preferably substituted or unsubstituted phenyl or naphthyl groups) and substituted or unsubstituted C _1-8 alkyl groups (more preferably C _1-6 alkyl groups). ..

工程（Ａ）における高分子断片１と高分子断片２との連結並びにペプチド断片１とペプチド断片２との連結は、ＮＣＬ法によるペプチドの連結反応に基づいて実施することができる。ＮＣＬ法によるペプチドの連結反応は、チオエステル交換反応により進行するが、反応を促進するためにチオール系化合物（チオール触媒）を添加してもよい。このようなチオール系触媒としては、チオフェニル／ベンジルメルカプタン混合物、２−メルカプトエタンスルホナート（ＭＥＳＮａ）、４−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）、ヒドロキシチオフェノールが挙げられる。チオール系触媒以外には、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）などの還元剤をＮＣＬ法の反応促進に用いてもよい。 The linking of the polymer fragment 1 and the polymer fragment 2 and the linking of the peptide fragment 1 and the peptide fragment 2 in the step (A) can be carried out based on the peptide linking reaction by the NCL method. The peptide ligation reaction by the NCL method proceeds by a thioester exchange reaction, but a thiol compound (thiol catalyst) may be added to promote the reaction. Examples of such a thiol-based catalyst include a thiophenyl / benzyl mercaptan mixture, 2-mercaptoethanol sulfonate (MESNa), 4-mercaptophenylacetic acid (MPAA), and hydroxythiophenol. In addition to the thiol-based catalyst, a reducing agent such as tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) may be used to promote the reaction of the NCL method.

工程（Ｂ）は、工程（Ａ）において得られた高分子断片１−２およびペプチド断片１−２上のシステイン残基のアミノ基の保護基を脱保護する工程（脱保護工程）である。脱保護された高分子断片１−２およびペプチド断片１−２は、次回以降の連結工程において、アミノ基が未保護のシステインを有する高分子断片およびＮ末端に未保護のシステイン残基を有するペプチド断片として使用することができる。 The step (B) is a step (deprotection step) of deprotecting the protecting group of the amino group of the cysteine residue on the polymer fragment 1-2 and the peptide fragment 1-2 obtained in the step (A). The deprotected polymer fragment 1-2 and the peptide fragment 1-2 are a polymer fragment having an unprotected cysteine amino group and a peptide having an unprotected cysteine residue at the N-terminal in the next and subsequent ligation steps. Can be used as a fragment.

脱保護は脱保護剤の添加により実施することができる。本発明において使用できる脱保護剤としては、リン系配位子、窒素系配位子、酸素系配位子または硫黄系配位子が配位結合した金属錯体が挙げられる。このような金属錯体としては、パラジウム錯体、プラチナ錯体、ニッケル錯体、ロジウム錯体、ルテニウム錯体、銅錯体および鉄錯体が挙げられる。また、リン系配位子としては、トリフェニルホスフィントリホスホン酸（ＴＰＰＴＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン（ＴＨＭＰ）、トリフェニルホスフィンモノ（３−スルホン酸ナトリウム）（ＴＰＰＭＳ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）が挙げられる。リン系配位子が配位結合した金属錯体の好ましい例としては、Ｐｄ／ＴＰＰＴＳ、Ｐｄ／ＴＨＭＰ、Ｐｄ／ＴＰＰＭＳ、Ｐｄ／ＴＣＥＰが挙げられる。 Deprotection can be performed by adding a deprotecting agent. Examples of the deprotecting agent that can be used in the present invention include a metal complex in which a phosphorus-based ligand, a nitrogen-based ligand, an oxygen-based ligand, or a sulfur-based ligand is coordinated. Examples of such metal complexes include palladium complexes, platinum complexes, nickel complexes, rhodium complexes, ruthenium complexes, copper complexes and iron complexes. The phosphorus-based ligands include triphenylphosphine triphosphonic acid (TPPTS), tris (hydroxymethyl) phosphine (THMP), triphenylphosphine mono (sodium 3-sulfonate) (TPPMS), and tris (2-carboxy). Ethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) can be mentioned. Preferred examples of the metal complex in which the phosphorus-based ligand is coordinate-bonded include Pd / TPPTS, Pd / THMP, Pd / TPPMS, and Pd / TCEP.

システイン保護基の脱保護に使用可能な脱保護剤を例示すると以下の通りである。
アリルオキシカルボニル基：Ｐｄ／ＴＰＰＴＳ
トリアルキルシリルエチルオキシカルボニル基：ＨＦ
アルキルオキシカルボニル基：Ｐｄ／Ｃ／水素
ベンジルオキシカルボニル基：Ｐｄ／ＴＰＰＴＳ
プロパルギルオキシカルボニル基：トリフルオロメタンスルホン酸
アダマンチルオキシカルボニル基：Ｐｄ／ジベンジリデンアセトン（ｄｂａ）
イソプロピルアリルオキシカルボニル基：Ｚｎ／Ｈ^＋
トリクロロエトキシカルボニル基：Ｚｎ／酢酸Examples of deprotective agents that can be used to deprotect cysteine protecting groups are as follows.
Allyloxycarbonyl group: Pd / TPPTS
Trialkylsilylethyloxycarbonyl group: HF
Alkyloxycarbonyl group: Pd / C / hydrogen benzyloxycarbonyl group: Pd / TPPTS
Propargyloxycarbonyl group: trifluoromethanesulfonic acid adamantyloxycarbonyl group: Pd / dibenzylideneacetone (dba)
Isopropylallyloxycarbonyl group: Zn / H ⁺
Trichloroethoxycarbonyl group: Zn / acetic acid

高分子断片１−２およびペプチド断片１−２に対する脱保護剤１回添加量の比率（モル比）は、脱保護効果が得られる限り特に限定されるものではないが、例えば、１〜３０とすることができ、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜２である。 The ratio (molar ratio) of the amount of the deprotecting agent added once to the polymer fragment 1-2 and the peptide fragment 1-2 is not particularly limited as long as the deprotecting effect can be obtained, but is, for example, 1 to 30. It is possible, preferably 1 to 10, and more preferably 1 to 2.

本発明において、工程（Ａ）および（Ｂ）並びに工程（Ｃ）は、脱保護剤の不活性化剤が存在する反応系で実施することができる。工程（Ｂ）で添加された脱保護剤は脱保護作用が完了した後、その場で不活性化することができる。このため、本発明においては、脱保護工程の後に、脱保護された高分子断片１−２またはペプチド断片１−２を精製する手順や、脱保護剤を分離する手順が不要になる。 In the present invention, steps (A) and (B) and step (C) can be carried out in a reaction system in which the deprotecting agent inactivating agent is present. The deprotecting agent added in step (B) can be inactivated on the spot after the deprotecting action is completed. Therefore, in the present invention, after the deprotection step, the procedure for purifying the deprotected polymer fragment 1-2 or the peptide fragment 1-2 and the procedure for separating the deprotecting agent become unnecessary.

本発明に使用できる不活性化剤は、反応系において脱保護剤を不活性化状態にできるものであれば特に限定されないが、脱保護剤が金属錯体である場合には、金属錯体の配位子として機能しうる物質を用いることができる。金属錯体の配位子として機能しうる物質としては、例えば、チオール系化合物が挙げられ、チオール系化合物としては、アルキルチオール系化合物（例えば、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（ＭＥＳＮａ））、芳香族チオール系化合物（例えば、４−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）、ヒドロキシチオフェノール）が挙げられる。なお、本発明においては高分子断片やペプチド断片の連結をＮＣＬ法により実施することから、ＮＣＬ法による反応を阻害しないか、あるいは、ＮＣＬ法による反応をむしろ促進する物質を不活性化剤として用いることが望ましい。このような物質としては、チオール系化合物が挙げられ、好ましくはＭＰＡＡ、ヒドロキシチオフェノールである。 The inactivating agent that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it can inactivate the deprotecting agent in the reaction system, but when the deprotecting agent is a metal complex, the coordination of the metal complex A substance that can function as a child can be used. Examples of the substance capable of functioning as a ligand of the metal complex include thiol compounds, and examples of the thiol compounds include alkyl thiol compounds (for example, sodium 2-mercaptoethanesulfonate (MESSNa)) and aromatic compounds. Thiol compounds (eg, 4-mercaptophenylacetic acid (MPAA), hydroxythiophenols) can be mentioned. In the present invention, since the polymer fragments and peptide fragments are linked by the NCL method, a substance that does not inhibit the reaction by the NCL method or rather promotes the reaction by the NCL method is used as the inactivating agent. Is desirable. Examples of such a substance include thiol compounds, preferably MPAA and hydroxythiophenol.

工程（Ｂ）で脱保護剤を添加することによって高分子断片１−２およびペプチド断片１−２が脱保護されるが、その後、添加した脱保護剤を不活性化させる工程（工程（Ｃ））を実施することができる。工程（Ｃ）では、例えば、反応系を撹拌することにより、添加した脱保護剤を、反応系に存在する不活性化剤により不活性化することができる。本発明においては、脱保護剤を添加した後に反応系を撹拌して高分子断片１−２およびペプチド断片１−２を脱保護し、撹拌を継続することによって添加した脱保護剤を不活性化させてもよい。すなわち、本発明においては、高分子断片１−２およびペプチド断片１−２の脱保護と、脱保護剤の不活性化を連続的に実施することができる。ここで、「撹拌」とは、反応溶液を混合により溶媒および溶質を均一化させるあらゆる手段を含む意味で用いられる。 The polymer fragment 1-2 and the peptide fragment 1-2 are deprotected by adding the deprotecting agent in the step (B), and then the added deprotecting agent is inactivated (step (C)). ) Can be implemented. In step (C), for example, by stirring the reaction system, the added deprotecting agent can be inactivated by the inactivating agent present in the reaction system. In the present invention, after the deprotecting agent is added, the reaction system is stirred to deprotect the polymer fragment 1-2 and the peptide fragment 1-2, and the added deprotecting agent is inactivated by continuing stirring. You may let me. That is, in the present invention, the deprotection of the polymer fragment 1-2 and the peptide fragment 1-2 and the inactivation of the deprotecting agent can be continuously carried out. As used herein, "stirring" is used to include any means of homogenizing the solvent and solute by mixing the reaction solution.

不活性化剤は、反応系において脱保護剤の添加量を上回る量で存在させることができる。後述のように工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）をさらに１回以上繰り返す場合には、反応系の不活性化剤の量は、脱保護剤の添加量の合計量を上回る量とすることができる。脱保護剤１回添加量に対する反応系中の不活性化剤の比率（モル比）は、２〜５００とすることができ、好ましくは５〜１００、より好ましくは１０〜５０とすることができる。 The inactivating agent can be present in the reaction system in an amount exceeding the addition amount of the deprotecting agent. When the steps (A), (B) and (C) are repeated one or more times as described later, the amount of the inactivating agent in the reaction system exceeds the total amount of the deprotecting agent added. Can be a quantity. The ratio (molar ratio) of the inactivating agent in the reaction system to the amount of the deprotecting agent added once can be 2 to 500, preferably 5 to 100, and more preferably 10 to 50. ..

本発明においては、工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）をさらに１回以上繰り返して３個以上の高分子断片またはペプチド断片を連結させることができる。以下、図１および２に従って、工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）をｎ−１回繰り返してｎ個の高分子断片またはペプチド断片を連結した高分子を製造する態様について説明する。 In the present invention, the step (A), the step (B) and the step (C) can be repeated one or more times to connect three or more polymer fragments or peptide fragments. Hereinafter, an embodiment in which steps (A), steps (B), and steps (C) are repeated n-1 times to produce a polymer in which n polymer fragments or peptide fragments are linked will be described with reference to FIGS. 1 and 2. ..

本発明においては、１回目の工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）（第１サイクル）の後、反応系においては脱保護剤が不活性化されている。従って、工程（Ｃ）の後に高分子断片１−２またはペプチド断片１−２を精製する工程を実施せずに（すなわち、ワンポットで連続的に）、次の工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）（第２サイクル）を実施することができる。第２サイクル以降についても同様にして実施することができる。 In the present invention, the deprotecting agent is inactivated in the reaction system after the first step (A), step (B) and step (C) (first cycle). Therefore, without performing the step of purifying the polymer fragment 1-2 or the peptide fragment 1-2 after the step (C) (that is, continuously in one pot), the following steps (A) and (B) And step (C) (second cycle) can be carried out. The same can be performed for the second and subsequent cycles.

図１の１回目の工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）により得られた高分子断片１−２は、システイン残基（但し、Ｃ末端側が高分子断片に結合し、Ｎ末端側が未保護である）を有するものである。第２サイクルでは、高分子断片１−２と、保護基により保護されたシステイン残基（但し、Ｃ末端側が高分子断片に結合し、Ｎ末端側が保護基により保護されている）と、任意のアミノ酸残基（但し、Ｎ末端側が高分子断片に結合し、Ｃ末端側が活性化基により活性化されている）とを有する高分子断片３とを、工程（Ａ）に従ってＮＣＬ法により連結させて、保護基により保護されたアミノ基を有する高分子断片１−２−３を得ることができる。この高分子断片１−２−３はアミノ基が保護基により保護されたシステイン残基を有していることから、工程（Ｂ）に従って脱保護剤を添加することによって、高分子断片１−２−３上のシステイン残基のアミノ基の保護基を脱保護し、アミノ基が未保護のシステインを有する高分子断片１−２−３を得ることができる。そして、反応系に存在する脱保護剤は工程（Ｃ）に従って不活性化することができる。このようにして２回目の工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）（第２サイクル）を完了させることができる。３回目の工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）（第３サイクル）並びにそれ以降のサイクルは、上記の第２サイクルの記載に従って実施することができる。 The polymer fragments 1-2 obtained by the first step (A), step (B) and step (C) of FIG. 1 are cysteine residues (however, the C-terminal side is bound to the polymer fragment and the N-terminal side is N-terminal. The side is unprotected). In the second cycle, the polymer fragment 1-2 and the cysteine residue protected by the protective group (however, the C-terminal side is bound to the polymer fragment and the N-terminal side is protected by the protective group) and any A polymer fragment 3 having an amino acid residue (however, the N-terminal side is bound to the polymer fragment and the C-terminal side is activated by an activating group) is linked by the NCL method according to the step (A). , A polymer fragment 1-2-3 having an amino group protected by a protective group can be obtained. Since this polymer fragment 1-2-3 has a cysteine residue whose amino group is protected by a protecting group, by adding a deprotecting agent according to step (B), the polymer fragment 1-2 By deprotecting the protecting group of the amino group of the cysteine residue on -3, a polymer fragment 1-2-3 having an unprotected cysteine in the amino group can be obtained. Then, the deprotecting agent present in the reaction system can be inactivated according to the step (C). In this way, the second step (A), step (B) and step (C) (second cycle) can be completed. The third step (A), step (B) and step (C) (third cycle) and subsequent cycles can be carried out in accordance with the description of the second cycle above.

また、図２の１回目の工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）により得られたペプチド断片１−２は、Ｎ末端に未保護のシステイン残基を有するものである。第２サイクルでは、ペプチド断片１−２と、アミノ基が保護されたシステイン残基をＮ末端に有し、かつ、カルボキシル基が活性化された任意のアミノ酸残基をＣ末端に有するペプチド断片３とを、工程（Ａ）に従ってＮＣＬ法により連結させて、アミノ基が保護基により保護されたシステイン残基をＮ末端に有するペプチド断片１−２−３を得ることができる。このペプチド断片１−２−３は、アミノ基が保護基により保護されたシステイン残基をＮ末端に有していることから、工程（Ｂ）に従って脱保護剤を添加することによって、ペプチド断片１−２−３上のシステイン残基のアミノ基の保護基を脱保護し、Ｎ末端に未保護のシステインを有する高分子断片１−２−３を得ることができる。そして、反応系に存在する脱保護剤は工程（Ｃ）に従って不活性化することができる。このようにして２回目の工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）（第２サイクル）を完了させることができる。３回目の工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）（第３サイクル）並びにそれ以降のサイクルは、上記の第２サイクルの記載に従って実施することができる。 Further, the peptide fragments 1-2 obtained by the first step (A), step (B) and step (C) of FIG. 2 have an unprotected cysteine residue at the N-terminal. In the second cycle, the peptide fragment 1-2 and the peptide fragment 3 having an amino group-protected cysteine residue at the N-terminal and an arbitrary amino acid residue having an activated carboxyl group at the C-terminal. Can be ligated by the NCL method according to the step (A) to obtain a peptide fragment 1-2-3 having an amino group-protected cysteine residue at the N-terminal. Since this peptide fragment 1-2-3 has a cysteine residue whose amino group is protected by a protecting group at the N-terminal, the peptide fragment 1 is added by adding a deprotecting agent according to step (B). By deprotecting the protecting group of the amino group of the cysteine residue on -2-3, a polymer fragment 1-2-3 having an unprotected cysteine at the N-terminal can be obtained. Then, the deprotecting agent present in the reaction system can be inactivated according to the step (C). In this way, the second step (A), step (B) and step (C) (second cycle) can be completed. The third step (A), step (B) and step (C) (third cycle) and subsequent cycles can be carried out in accordance with the description of the second cycle above.

本発明においては、連結する高分子断片およびペプチド断片の個数に応じて、工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）を繰り返すことができる。すなわち、本発明において連結する高分子断片およびペプチド断片がｎ個（ｎは整数である）である場合、工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）はｎ−１回実施することとなる。 In the present invention, the steps (A), (B) and (C) can be repeated depending on the number of polymer fragments and peptide fragments to be linked. That is, when the number of polymer fragments and peptide fragments linked in the present invention is n (n is an integer), steps (A), steps (B) and steps (C) are carried out n-1 times. Become.

但し、本発明の高分子の製造方法の最後の第ｎ−１サイクルにおいては、高分子断片ｎは、任意のアミノ酸残基（但し、Ｎ末端側が高分子断片に結合し、Ｃ末端側が活性化基により活性化されている）を有していればよく、システイン残基を有していないものを使用することができる。このような断片を最終サイクルに用いた場合には、第ｎ−１サイクルにおいて工程（Ｂ）および工程（Ｃ）を省略することができる。もちろん、システイン残基（但し、Ｃ末端側が高分子断片に結合し、Ｎ末端側が保護基により保護されている）を有する高分子断片ｎを第ｎ−１サイクルで用いることもできるが、その場合には、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）を実施できることはいうまでもない。 However, in the final n-1 cycle of the polymer production method of the present invention, the polymer fragment n is an arbitrary amino acid residue (however, the N-terminal side binds to the polymer fragment and the C-terminal side is activated. It suffices to have (activated by a group), and those having no cysteine residue can be used. When such a fragment is used in the final cycle, steps (B) and (C) can be omitted in the n-1 cycle. Of course, the polymer fragment n having a cysteine residue (however, the C-terminal side is bound to the polymer fragment and the N-terminal side is protected by a protecting group) can be used in the n-1 cycle, but in that case, Needless to say, the step (B) and the step (C) can be carried out.

また、本発明のペプチドの製造方法の最後の第ｎ−１サイクルにおいては、ペプチド断片ｎは、Ｃ末端のカルボキシル基が活性化基により活性化されていればよく、システイン残基をＮ末端に有していないものを使用することができる。このような断片を最終サイクルに用いた場合には、第ｎ−１サイクルにおいて工程（Ｂ）および工程（Ｃ）を省略することができる。もちろん、保護されたシステイン残基をＮ末端に有するペプチド断片ｎを第ｎ−１サイクルで用いることもできるが、その場合には、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）を実施できることはいうまでもない。 Further, in the final n-1 cycle of the method for producing a peptide of the present invention, the peptide fragment n may have a C-terminal carboxyl group activated by an activating group, and a cysteine residue may be added to the N-terminal. You can use what you do not have. When such a fragment is used in the final cycle, steps (B) and (C) can be omitted in the n-1 cycle. Of course, the peptide fragment n having a protected cysteine residue at the N-terminal can also be used in the n-1 cycle, but it goes without saying that the steps (B) and (C) can be carried out in that case. Absent.

本発明において連結できる高分子断片およびペプチド断片の個数ｎは、ＮＣＬ法による連結工程が進行する限り特に制限はないが、例えば、ｎの下限は２または３とすることができ、ｎの上限は１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６または５とすることができる。すなわち、本発明における工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）の実施回数は、例えば、下限を１回または２回とすることができ、上限を１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５または４回とすることができる。 The number n of polymer fragments and peptide fragments that can be linked in the present invention is not particularly limited as long as the linking step by the NCL method proceeds, but for example, the lower limit of n can be 2 or 3, and the upper limit of n is It can be 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 or 5. That is, the number of times of the steps (A), (B) and (C) in the present invention can be, for example, a lower limit of once or twice and an upper limit of 14, 13, 12, 11, 10 , 9, 8, 7, 6, 5 or 4 times.

本発明においては、最終サイクル（第ｎ−１サイクル）の工程完了後に、得られた最終産物を精製する精製工程を実施することができる。最終産物の精製は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法などの精製手段により実施することができる。 In the present invention, after the completion of the final cycle (n-1 cycle), a purification step of purifying the obtained final product can be carried out. Purification of the final product can be carried out by purification means such as high performance liquid chromatography (HPLC) method.

本発明においては、第１サイクルを実施した後、得られた中間産物（すなわち、高分子断片およびペプチド断片）を精製せずに、第２サイクル以降の工程を実施することができる。第２サイクル以降も同様に、工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）を実施した後、得られた中間産物を精製せずに、次のサイクルを実施することができる。中間産物の精製を行うと必然的に収率が低下するとともに、最終産物を得るまでに長期間を要することになるが、本発明では中間産物の精製を行わずに、ワンポットで連続的に高分子断片およびペプチド断片の連結を行うことができる。すなわち、本発明によれば、精製工程は、すべての高分子断片またはペプチド断片の連結の後に１回実施すればよい。従って、本発明によれば、結果として高収率かつ短時間で最終産物を製造することができる。例えば、３５〜４５アミノ酸のペプチドを本発明により４回の連結工程（４サイクル）で製造する場合には、最終産物のペプチドを収率２５〜３５％で１日以内に得ることができる。 In the present invention, after carrying out the first cycle, the steps after the second cycle can be carried out without purifying the obtained intermediate products (that is, polymer fragments and peptide fragments). Similarly, after the second and subsequent cycles, the steps (A), (B), and (C) can be carried out, and then the next cycle can be carried out without purifying the obtained intermediate product. Purification of the intermediate product inevitably lowers the yield, and it takes a long time to obtain the final product. However, in the present invention, the intermediate product is not purified and is continuously high in one pot. The molecular fragment and the peptide fragment can be linked. That is, according to the present invention, the purification step may be performed once after the ligation of all the polymeric or peptide fragments. Therefore, according to the present invention, as a result, the final product can be produced in a high yield and in a short time. For example, when a peptide of 35 to 45 amino acids is produced by the present invention in four linking steps (4 cycles), the final product peptide can be obtained in a yield of 25 to 35% within 1 day.

本発明においては、ペプチド合成化学（特に、ＮＣＬ法によるペプチド合成方法）で使用される一般的な方法を特に制限なく採用することができる。例えば、本発明においては、工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）の後、あるいは、工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）の繰り返し工程の後に、得られた産物を脱硫処理に付すことができる。脱硫処理によって、得られた産物のシステイン残基をアラニン残基に転換することができる。例えば、ペプチド結合を有する高分子がペプチドである場合には、目的とする最終産物のアミノ酸配列を考慮して、適宜脱硫処理を施すことができる。また、脱硫処理にあたっては、アラニン残基への転換を望まないシステイン残基をアセトアミドメチル基（Ａｃｍ基）等の保護基によりあらかじめ保護しておき、脱硫処理後に該保護基を脱保護することにより、所定の位置にシステイン残基を有するペプチドを得ることができる。 In the present invention, a general method used in peptide synthesis chemistry (particularly, a peptide synthesis method by the NCL method) can be adopted without particular limitation. For example, in the present invention, the product obtained after the steps (A), steps (B) and (C), or after the iterative steps of steps (A), steps (B) and (C). Can be subjected to desulfurization treatment. The desulfurization treatment can convert the cysteine residue of the obtained product to an alanine residue. For example, when the polymer having a peptide bond is a peptide, desulfurization treatment can be appropriately performed in consideration of the amino acid sequence of the target final product. In the desulfurization treatment, cysteine residues that are not desired to be converted to alanine residues are protected in advance with a protecting group such as an acetamide methyl group (Acm group), and the protecting group is deprotected after the desulfurization treatment. , A peptide having a cysteine residue at a predetermined position can be obtained.

本発明はまた、ペプチドの液相合成法に適用されるものである。ここで、「ペプチドの液相合成法」とは、固相合成法とは区別されることを意味し、全ての試薬が溶媒に溶解している場合のほか、試薬の一部または全部が溶媒に溶解せず、懸濁、分散等しているいわゆる不均一反応も本発明に含まれるものとする。 The present invention is also applied to a method for synthesizing a liquid phase peptide. Here, the "liquid phase synthesis method of peptide" means that it is distinguished from the solid phase synthesis method, and not only when all the reagents are dissolved in a solvent, but also a part or all of the reagents are solvents. The present invention also includes so-called heterogeneous reactions that are not dissolved in, but are suspended or dispersed.

本発明の好ましい態様においては、ペプチド結合を有する高分子は、ペプチドである。この場合、
・高分子断片１は、Ｎ末端に未保護のシステイン残基を有するペプチド断片であり、
・高分子断片２は、アミノ基が保護されたシステイン残基をＮ末端に有し、かつ、カルボキシル基が活性化された任意のアミノ酸残基をＣ末端に有するペプチド断片であり、
・保護されたシステイン残基を有する高分子断片１−２は、アミノ基が保護基により保護されたシステイン残基をＮ末端に有するペプチド断片１−２であり、
・未保護のシステイン残基を有する高分子断片１−２は、アミノ基が未保護のシステイン残基をＮ末端に有するペプチド断片１−２である。In a preferred embodiment of the invention, the polymer having a peptide bond is a peptide. in this case,
-Polymer fragment 1 is a peptide fragment having an unprotected cysteine residue at the N-terminal.
-Polymer fragment 2 is a peptide fragment having an amino group-protected cysteine residue at the N-terminal and an arbitrary amino acid residue having an activated carboxyl group at the C-terminal.
The polymer fragment 1-2 having a protected cysteine residue is a peptide fragment 1-2 having a cysteine residue whose amino group is protected by a protecting group at the N-terminal.
The polymer fragment 1-2 having an unprotected cysteine residue is a peptide fragment 1-2 having an unprotected cysteine residue at the N-terminal of the amino group.

すなわち、本発明の好ましい態様によれば、ペプチドの製造方法であって、
（Ａ）Ｎ末端に未保護のシステイン残基を有するペプチド断片１：

（上記式中、Ｃｙｓはシステイン残基を表し、Ｃｙｓはペプチド断片１の一部である。）
と、アミノ基が保護されたシステイン残基をＮ末端に有し、かつ、カルボキシル基が活性化された任意のアミノ酸残基をＣ末端に有するペプチド断片２：

（上記式中、Ｃｙｓはシステイン残基を表し、Ｃｙｓはペプチド断片２の一部であり、Ｐｒはアミノ基の保護基を表し、Ｘはカルボキシル基の活性化基を表す。）
とを、ＮＣＬ法により連結させて、アミノ基が保護基により保護されたシステイン残基をＮ末端に有するペプチド断片１−２：

（上記式中、Ｃｙｓはシステイン残基を表し、Ｃｙｓはペプチド断片１−２の一部であり、Ｐｒはアミノ基の保護基を表す。）
を得る工程、
（Ｂ）前記工程（Ａ）の後に、脱保護剤を添加して、アミノ基が未保護のシステイン残基をＮ末端に有するペプチド断片１−２：

（上記式中、Ｃｙｓはシステイン残基を表し、Ｃｙｓはペプチド断片１−２の一部である。）
を得る工程を含んでなり、工程（Ａ）および（Ｂ）を脱保護剤の不活性化剤が存在する反応系で実施する、製造方法が提供される。That is, according to a preferred embodiment of the present invention, it is a method for producing a peptide.
(A) Peptide fragment 1: having an unprotected cysteine residue at the N-terminus

(In the above formula, Cys represents a cysteine residue, and Cys is a part of peptide fragment 1.)
Peptide fragment 2: which has an amino group-protected cysteine residue at the N-terminal and an arbitrary amino acid residue whose carboxyl group has been activated at the C-terminal.

(In the above formula, Cys represents a cysteine residue, Cys is a part of peptide fragment 2, Pr represents a protecting group of an amino group, and X represents an activating group of a carboxyl group.)
And are linked by the NCL method, and the amino group has a cysteine residue protected by a protecting group at the N-terminal.

(In the above formula, Cys represents a cysteine residue, Cys is a part of peptide fragment 1-2, and Pr represents a protecting group of an amino group.)
The process of getting
(B) After the step (A), a deprotecting agent is added to have a peptide fragment 1-2: which has an unprotected cysteine residue at the N-terminal.

(In the above formula, Cys represents a cysteine residue, and Cys is a part of peptide fragment 1-2.)
Provided is a production method comprising the steps of obtaining the above, wherein steps (A) and (B) are carried out in a reaction system in which the deprotecting agent inactivating agent is present.

本発明のペプチドの製造方法は、本発明の高分子の製造方法についての記載に従って実施することができる。なお、本明細書および図面においてペプチドおよびペプチド断片の化学式および模式図は、特に断りがない限り、向かって左側がＮ末端であり、右側がＣ末端である。 The method for producing a peptide of the present invention can be carried out according to the description of the method for producing a polymer of the present invention. Unless otherwise specified, the chemical formulas and schematic diagrams of peptides and peptide fragments in the present specification and drawings are the N-terminal on the left side and the C-terminal on the right side.

以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail based on the following examples, but the present invention is not limited to these examples.

例１：４−メルカプトフェニル酢酸によるＰｄ／ＴＰＰＴＳの不活性化
ワンポットにおけるペプチド連結法を確立するため、Ａｌｏｃ基の脱保護剤として機能するパラジウム／トリフェニルホスフィン（Ｐｄ／ＴＰＰＴＳ）を不活性化する方法について検討した。 Example 1: Inactivation of Pd / TPPTS with 4-mercaptophenylacetic acid Inactivates palladium / triphenylphosphine (Pd / TPPTS), which functions as a deprotecting agent for the Aloc group, to establish a one-pot peptide ligation method. The method was examined.

（１）ＮＣＬ緩衝溶液におけるＰｄ／ＴＰＰＴＳ活性の検討
２ｍＬチューブにおいてＮＣＬ緩衝溶液（６Ｍ 塩酸グアニジン、０．２Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１００ｍＭ ４−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）、４０ｍＭ トリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、ｐＨ７．０）２００μＬに、Ｎ末端がＡｌｏｃ基で保護されたペプチドを２ｍＭとなるように溶解した。次いで、６Ｎ 塩酸で反応溶液のｐＨを６．０に低下させ、アルゴンガスでバブリングして酸素を脱気し、Ｐｄ／ＴＰＰＴＳ（４ｍＭ）を添加し、反応溶液を室温で２時間攪拌して、Ａｌｏｃ基の脱保護反応を行った。(1) Examination of Pd / TPPTS activity in NCL buffer solution NCL buffer solution (6M guanidine hydrochloride, 0.2M NaH ₂ PO ₄ , 100 mM 4-mercaptophenylacetic acid (MPAA), 40 mM tris (2-carboxyethyl)) in a 2 mL tube. phosphine _{(TCEP), 3mM MgCl 2 ·} 6H 2 O, pH7.0) to 200 [mu] L, and the peptide N-terminus is protected by Aloc group was dissolved at a 2 mM. Then, the pH of the reaction solution was lowered to 6.0 with 6N hydrochloric acid, bubbling with argon gas to degas oxygen, Pd / TPPTS (4 mM) was added, and the reaction solution was stirred at room temperature for 2 hours. A deprotection reaction of the Aloc group was carried out.

Ｐｄ／ＴＰＰＴＳを添加してから３分後、１時間後および２時間後における反応溶液中のＡｌｏｃ基が脱保護されたペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣにより分析したところ、それぞれの変換収率（原料ペプチドの消費効率に基づく値、以下同様）（conversion yield）は２６％、４８％および４８％であった。この結果は、Ａｌｏｃ基の脱保護反応がＰｄ／ＴＰＰＴＳ添加後直ちに進行し、Ｐｄ／ＴＰＰＴＳ添加から１〜２時間後においては脱保護反応は進行していないことを示している。これは、Ｐｄ／ＴＰＰＴＳを添加後、反応溶液の撹拌を継続することにより、Ｐｄの配位子であるＴＰＰＴＳがＭＰＡＡによって置き換えられ、Ｐｄが不活性化されたためと考えられた。なお、実施例を通してＲＰ−ＨＰＬＣは以下の条件で実施した。 Peptides in which the Aloc group was deprotected in the reaction solution 3 minutes, 1 hour and 2 hours after the addition of Pd / TPPTS were analyzed by RP-HPLC, and the conversion yields (of the raw material peptides) were analyzed. Values based on consumption efficiency, and so on, conversion yields were 26%, 48% and 48%. This result indicates that the deprotection reaction of the Aloc group proceeds immediately after the addition of Pd / TPPTS, and the deprotection reaction does not proceed 1 to 2 hours after the addition of Pd / TPPTS. It was considered that this was because TPPTS, which is a ligand of Pd, was replaced by MPAA and Pd was inactivated by continuing stirring of the reaction solution after adding Pd / TPPTS. Throughout the examples, RP-HPLC was carried out under the following conditions.

＜ＲＰ−ＨＰＬＣ＞
カラム：ＡＲ−ＩＩ（ナカライテスク社製）
カラム温度：室温
流速：１．０ｍＬ／分
試料導入量：２０μＬ
溶離液：水、アセトニトリル
グラジエント：５〜４０％（３５分間）
検出器：ＰＤＡ検出器<RP-HPLC>
Column: AR-II (manufactured by Nacalai Tesque)
Column temperature: Room temperature Flow velocity: 1.0 mL / min Sample introduction amount: 20 μL
Eluent: water, acetonitrile gradient: 5-40% (35 minutes)
Detector: PDA detector

（２）Ｐｄ／ＴＰＰＴＳの不活性化条件の検討
ＭＰＡＡによるＰｄ／ＴＰＰＴＳの不活性化の条件を検討した。具体的には、０．６ｍＬチューブにおいてＮＣＬ緩衝溶液（６Ｍ 塩酸グアニジン、０．２Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１００ｍＭ ４−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）、４０ｍＭ トリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、ｐＨ７．０）２５μＬに、４ｍＭ、８ｍＭまたは１２ｍＭとなるようにＰｄ／ＴＰＰＴＳを添加した。Ｐｄ／ＴＰＰＴＳを不活性化するため、反応溶液を室温で１時間撹拌した。次いで、各反応溶液にＮ末端がＡｌｏｃ基で保護されたペプチドを２ｍＭとなるように添加し、室温で１０分間撹拌した。(2) Examination of the conditions for inactivating Pd / TPPTS The conditions for inactivating Pd / TPPTS by MPAA were examined. Specifically, in a 0.6 mL tube, NCL buffer solution (6M guanidine hydrochloride, 0.2M NaH ₂ PO ₄ , 100 mM 4-mercaptophenylacetic acid (MPAA), 40 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP), 3 mM). _{MgCl 2 · 6H 2 O, pH7.0} ) to 25 [mu] L, was 4 mM, the Pd / TPPTS so that 8mM or 12mM added. The reaction solution was stirred at room temperature for 1 hour to inactivate Pd / TPPTS. Then, a peptide having an N-terminal protected by an Aloc group was added to each reaction solution so as to be 2 mM, and the mixture was stirred at room temperature for 10 minutes.

Ｐｄ／ＴＰＰＴＳを添加した各反応溶液中のＡｌｏｃ基が脱保護されたペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣで分析したところ、それぞれの変換収率は０％、０％および０％であった。この結果は、Ｐｄ／ＴＰＰＴＳ添加量が増えてもＡｌｏｃ基の脱保護反応は進行していないことを示している。すなわち、Ｐｄ／ＴＰＰＴＳを含む反応溶液の不活性化は、Ｐｄ／ＴＰＰＴＳ添加量によらず、Ｐｄ／ＴＰＰＴＳを添加したＮＣＬ緩衝溶液を室温で１時間攪拌することにより達成されることが確認された。 When the peptide in which the Aloc group was deprotected in each reaction solution to which Pd / TPPTS was added was analyzed by RP-HPLC, the conversion yields were 0%, 0% and 0%, respectively. This result indicates that the deprotection reaction of the Aloc group does not proceed even if the amount of Pd / TPPTS added increases. That is, it was confirmed that the inactivation of the reaction solution containing Pd / TPPTS was achieved by stirring the NCL buffer solution containing Pd / TPPTS at room temperature for 1 hour regardless of the amount of Pd / TPPTS added. ..

例２：ワンポットにおけるペプチド断片のＮＣＬ
（１）ペプチド断片の合成
ペプチド１：ＬＥＮＶＷＲＤ（配列番号１）、ペプチド２：ＣＶＴＹＴＥＨ（配列番号２）、ペプチド３：ＣＫＲＫＴＶＴ（配列番号３）、ペプチド４：ＣＲＤＶＴＹ（配列番号４）、ペプチド５：ＣＬＫＲＱＧＲＴＬＹＧＦＧＧ（配列番号５）をペプチド合成機ＲｅｓＰｅｐ ＳＬ（ＩＮＴＡＶＩＳ社製）を用いてＦｍｏｃ法による固相合成法により合成した。Ｎ末端のシステイン残基がＡｌｏｃ基で保護されたペプチドは、Ａｌｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（Ｃａｓ：９６８６５−７２−４、Ｌ０１８０７、渡辺化学工業社製）を用いて上記固相合成法を行うことにより調製した。Ｃ末端がチオエステル化されたペプチドは、上記固相合成法を行うことにより調製したペプチドに２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（ＭＥＳＮａ）を反応させ、次いで、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製することにより調製した。 Example 2: NCL of peptide fragments in one pot
(1) Synthesis of Peptide Fragment Peptide 1: LENVWRD (SEQ ID NO: 1), Peptide 2: CVTYTEH (SEQ ID NO: 2), Peptide 3: CKRKTVT (SEQ ID NO: 3), Peptide 4: CRDVTY (SEQ ID NO: 4), Peptide 5: CLKRQGRTLYGFGG (SEQ ID NO: 5) was synthesized by a solid-phase synthesis method by the Fmoc method using a peptide synthesizer ResPep SL (manufactured by INTAVIS). For peptides in which the N-terminal cysteine residue is protected by an Aloc group, the above solid-phase synthesis method is performed using Aloc-Cys (Trt) -OH (Cas: 96865-72-4, L01807, manufactured by Watanabe Chemical Industry Co., Ltd.). Prepared by doing. The C-terminal thioesterified peptide was prepared by reacting the peptide prepared by the above solid phase synthesis method with sodium 2-mercaptoethanesulfonate (MESNa) and then purifying by RP-HPLC.

（２）ペプチド４とペプチド５との連結
ＮＣＬ法によるペプチドの連結

(2) Linkage of peptide 4 and peptide 5
Peptide linkage by NCL method

２ｍＬチューブにおいてＮＣＬ緩衝溶液（６Ｍ 塩酸グアニジン、０．２Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ３．０）、１００ｍＭ ４−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）、４０ｍＭ トリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、６ｍＭ ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ）２００μＬに、ペプチド５を２ｍＭとなるように溶解した。この緩衝溶液に、Ｎ末端のシステイン残基がＡｌｏｃ基により保護され、Ｃ末端がチオエステル化されたペプチド４を２ｍＭとなるように添加した。反応溶液を６Ｎ 水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．０に調整した後、３７℃で２時間攪拌することによりＮＣＬ法による連結反応を実施し、ペプチド４とペプチド５とが連結されたペプチドＣＲＤＶＴＹＣＬＫＲＱＧＲＴＬＹＧＦＧＧ（配列番号６）（以下、ペプチド４−５という）を得た。得られたペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析し、変換収率が９７％であることを確認した。なお、実施例を通してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳは以下の条件で実施した。NCL buffer solution (6M guanidine hydrochloride, 0.2M NaH ₂ PO ₄ (pH 3.0), 100 mM 4-mercaptophenylacetic acid (MPAA), 40 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP), 6 mM MgCl _{2 in a} 2 mL tube. -Peptide 5 was dissolved in 200 μL of 6H ₂ O) to 2 mM. To this buffer solution, peptide 4 in which the N-terminal cysteine residue was protected by an Aloc group and the C-terminal was thioesterified was added so as to be 2 mM. After adjusting the reaction solution to pH 7.0 with 6N sodium hydroxide solution, the ligation reaction was carried out by the NCL method by stirring at 37 ° C. for 2 hours, and the peptide CRDVTYCLKRQGRTYGFGG (SEQ ID NO:) in which peptide 4 and peptide 5 were linked was carried out. 6) (hereinafter referred to as peptide 4-5) was obtained. The obtained peptide was analyzed by RP-HPLC and MALDI-TOF MS, and it was confirmed that the conversion yield was 97%. Throughout the examples, MALDI-TOF MS was carried out under the following conditions.

＜ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ＞
質量分析装置：ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ（ＢＲＵＫＥＲ社製）
測定モード：リフレクター・ポジティブ
マトリックス：α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）<MALDI-TOF MS>
Mass spectrometer: microflex (manufactured by BRUKER)
Measurement mode: Reflector positive matrix: α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)

ペプチドの脱保護Peptide deprotection

次いで、反応溶液のｐＨを６Ｎ 塩酸で６．０に低下させ、アルゴンガスでバブリングして酸素を脱気し、ペプチド４−５に対して２当量となるようにＰｄ／ＴＰＰＴＳを添加し、反応溶液を室温で１０分間攪拌することにより、Ｎ末端が脱保護（Deprotection）されたペプチド４−５を得た。また、サンプルの一部を上記と同様の条件でＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析し、変換収率が９９％であることを確認した。反応溶液を引き続いて室温で５０分間撹拌することにより、添加したＰｄ／ＴＰＰＴＳを不活性化した。 Next, the pH of the reaction solution was lowered to 6.0 with 6N hydrochloric acid, bubbling with argon gas to degas oxygen, and Pd / TPPTS was added so as to have 2 equivalents with respect to peptide 4-5, and the reaction was carried out. The solution was stirred at room temperature for 10 minutes to give peptide 4-5 with the N-terminus deprotected. In addition, a part of the sample was analyzed by RP-HPLC and MALDI-TOF MS under the same conditions as above, and it was confirmed that the conversion yield was 99%. The Pd / TPPTS added was subsequently inactivated by stirring the reaction solution at room temperature for 50 minutes.

（３）ペプチド３とペプチド４−５との連結
ＮＣＬ法によるペプチドの連結

(3) Linkage of peptide 3 and peptide 4-5
Peptide linkage by NCL method

ペプチド４−５を含む上記（２）の反応溶液に、Ｎ末端のシステイン残基がＡｌｏｃ基により保護され、Ｃ末端がチオエステル化されたペプチド３を２ｍＭとなるように添加した。反応溶液を６Ｎ 水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．０に調整した後、３７℃で２時間攪拌することによりＮＣＬ法による連結反応を実施し、ペプチド３とペプチド４−５とが連結されたペプチドＣＫＲＫＴＶＴＣＲＤＶＴＹＣＬＫＲＱＧＲＴＬＹＧＦＧＧ（配列番号７）（以下、ペプチド３−４−５という）を得た。得られたペプチドを上記と同様の条件でＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析し、変換収率が８２％であることを確認した。 To the reaction solution of (2) above containing peptide 4-5, peptide 3 in which the N-terminal cysteine residue was protected by an Aloc group and the C-terminal was thioesterified was added so as to be 2 mM. After adjusting the reaction solution to pH 7.0 with 6N sodium hydroxide solution, the ligation reaction was carried out by the NCL method by stirring at 37 ° C. for 2 hours, and the peptide CKRKTVTCRDVTYCLKRQGRTYGFGG in which peptide 3 and peptide 4-5 were linked was carried out. SEQ ID NO: 7) (hereinafter referred to as peptide 3-4-5) was obtained. The obtained peptide was analyzed by RP-HPLC and MALDI-TOF MS under the same conditions as above, and it was confirmed that the conversion yield was 82%.

ペプチドの脱保護Peptide deprotection

次いで、反応溶液のｐＨを６Ｎ 塩酸で６．０に低下させ、溶液をアルゴンガスでバブリングして酸素を脱気し、ペプチド３−４−５に対して２当量となるようにＰｄ／ＴＰＰＴＳを添加し、反応溶液を室温で１０分間攪拌することにより、Ｎ末端が脱保護（Deprotection）されたペプチド３−４−５を得た。また、サンプルの一部を上記と同様の条件でＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析し、変換収率が９８％であることを確認した。反応溶液を引き続いて室温で５０分間撹拌することにより、添加したＰｄ／ＴＰＰＴＳを不活性化した。 The pH of the reaction solution was then lowered to 6.0 with 6N hydrochloric acid, the solution was bubbled with argon gas to degas, and Pd / TPPTS was added to 2 equivalents relative to peptide 3-4-5. The mixture was added and the reaction solution was stirred at room temperature for 10 minutes to obtain a peptide 3-4-5 having the N-terminal deprotected. In addition, a part of the sample was analyzed by RP-HPLC and MALDI-TOF MS under the same conditions as above, and it was confirmed that the conversion yield was 98%. The Pd / TPPTS added was subsequently inactivated by stirring the reaction solution at room temperature for 50 minutes.

（４）ペプチド２とペプチド３−４−５との連結
ＮＣＬ法によるペプチドの連結

(4) Linkage of peptide 2 and peptide 3-4-5
Peptide linkage by NCL method

ペプチド３−４−５を含む上記（３）の反応溶液に、Ｎ末端のシステイン残基がＡｌｏｃ基により保護され、Ｃ末端がチオエステル化されたペプチド２を２ｍＭとなるように添加した。反応溶液を６Ｎ 水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．０に調整した後、３７℃で２時間攪拌することによりＮＣＬ法による連結反応を実施し、ペプチド２とペプチド３−４−５とが連結されたペプチドＣＶＴＹＴＥＨＣＫＲＫＴＶＴＣＲＤＶＴＹＣＬＫＲＱＧＲＴＬＹＧＦＧＧ（配列番号８）（以下、ペプチド２−３−４−５という）を得た。得られたペプチドを上記と同様の条件でＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析し、変換収率が９６％であることを確認した。 To the reaction solution of (3) above containing peptide 3-4-5, peptide 2 having an N-terminal cysteine residue protected by an Aloc group and a C-terminal thioesterified was added so as to be 2 mM. After adjusting the reaction solution to pH 7.0 with 6N sodium hydroxide solution, the ligation reaction was carried out by the NCL method by stirring at 37 ° C. for 2 hours, and the peptide in which peptide 2 and peptide 3-4-5 were ligated were linked. CVTYTEHCKRKTVTCRDVTYCLKRQGRTYGFGG (SEQ ID NO: 8) (hereinafter referred to as peptide 2-3-4-5) was obtained. The obtained peptide was analyzed by RP-HPLC and MALDI-TOF MS under the same conditions as above, and it was confirmed that the conversion yield was 96%.

ペプチドの脱保護Peptide deprotection

次いで、反応溶液のｐＨを６Ｎ 塩酸で６．０に低下させ、溶液をアルゴンガスでバブリングして酸素を脱気し、ペプチド２−３−４−５に対して２当量となるようにＰｄ／ＴＰＰＴＳを添加し、反応溶液を室温で１０分間攪拌することにより、Ｎ末端が脱保護（Deprotection）されたペプチド２−３−４−５を得た。また、サンプルの一部を上記と同様の条件でＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析し、変換収率が９７％であることを確認した。反応溶液を引き続いて室温で５０分間撹拌することにより、添加したＰｄ／ＴＰＰＴＳを不活性化した。 The pH of the reaction solution was then lowered to 6.0 with 6N hydrochloric acid, the solution was bubbled with argon gas to degas, and Pd / was 2 equivalents relative to peptide 2-3-4-5. TPPTS was added and the reaction solution was stirred at room temperature for 10 minutes to obtain peptide 2-3-4-5 with N-terminal deprotection. In addition, a part of the sample was analyzed by RP-HPLC and MALDI-TOF MS under the same conditions as above, and it was confirmed that the conversion yield was 97%. The Pd / TPPTS added was subsequently inactivated by stirring the reaction solution at room temperature for 50 minutes.

（５）ペプチド１とペプチド２−３−４−５との連結
ＮＣＬ法によるペプチドの連結

(5) Linkage of peptide 1 and peptide 2-3-4-5
Peptide linkage by NCL method

ペプチド２−３−４−５を含む上記（４）の反応溶液に、Ｃ末端がチオエステル化されたペプチド１を２ｍＭとなるように添加した。反応溶液を６Ｎ 水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．０に調整した後、３７℃で２時間攪拌することによりＮＣＬ法による連結反応を実施し、ペプチド１とペプチド２−３−４−５とが連結されたペプチドＬＥＮＶＷＲＤＣＶＴＹＴＥＨＣＫＲＫＴＶＴＣＲＤＶＴＹＣＬＫＲＱＧＲＴＬＹＧＦＧＧ（配列番号９）（以下、ペプチド１−２−３−４−５という）を得た。得られたペプチドを上記と同様の条件でＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析し、変換収率が９８％であることを確認した。 Peptide 1 having a thioesterified C-terminal was added to the reaction solution of (4) above containing peptide 2-3-4-5 so as to have a concentration of 2 mM. After adjusting the reaction solution to pH 7.0 with 6N sodium hydroxide solution, the ligation reaction by the NCL method was carried out by stirring at 37 ° C. for 2 hours, and peptide 1 and peptide 2-3-4-5 were ligated. The peptide LENVWRDCVTYTEHCKRKTVTCRDVTYCLKRQGRTYGFGG (SEQ ID NO: 9) (hereinafter referred to as peptide 1-2-3-4-5) was obtained. The obtained peptide was analyzed by RP-HPLC and MALDI-TOF MS under the same conditions as above, and it was confirmed that the conversion yield was 98%.

（６）ＭＰＡＡ除去および脱硫処理
ペプチド１−２−３−４−５を含む上記（５）の反応溶液を、６Ｎ 塩酸を用いてｐＨ０．５〜１．０に調整した。次いで、脱硫反応を阻害するＭＰＡＡを除去するため、ジエチルエーテルを反応溶液に添加し１０秒間激しく攪拌した後、エーテル層を除去した。これらの操作を４回繰り返した後、加熱することによってエーテルを完全に除去した。(6) MPAA Removal and Desulfurization Treatment The reaction solution of (5) above containing the peptide 1-2-3-4-5 was adjusted to pH 0.5 to 1.0 with 6N hydrochloric acid. Then, in order to remove MPAA that inhibits the desulfurization reaction, diethyl ether was added to the reaction solution, and the mixture was vigorously stirred for 10 seconds, and then the ether layer was removed. After repeating these operations four times, the ether was completely removed by heating.

ペプチド１−２−３−４−５を脱硫するため、反応溶液に６Ｎ 水酸化ナトリウム溶液を添加し、反応溶液のｐＨ値を中性に調整し、５００ｍＭ ＴＣＥＰ、５％ ２−メチル−２−プロパンチオール（ｔＢｕＳＨ）および２０ｍＭ ２、２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二塩酸塩（ＶＡ−０４４、和光純薬工業社製）を添加し、３７℃で７時間撹拌した。生成物をＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（測定モード：リニアー・ポジティブとした以外は上記（２）と同様の条件）により確認した。脱硫されたペプチドＬＥＮＷＩＲＤＡＶＴＹＴＥＨＡＫＲＫＴＶＴＡＭＤＶＴＹＡＬＫＲＱＧＲＴＬＹＧＦＧＧ（配列番号１０）が確認され、また、４回のＮＣＬ、３回のＡｌｏｃ基脱保護および脱硫処理実施後のペプチド（配列番号１０）の総収率（ペプチド５に対する配列番号１０のペプチドのモル比）（total yield）は約２９．５％であることを確認した。 In order to desulfurize peptide 1-2-3-4-5, 6N sodium hydroxide solution was added to the reaction solution, the pH value of the reaction solution was adjusted to neutral, and 500 mM TCEP, 5% 2-methyl-2-. Propanethiol (tBuSH) and 20 mM 2,2'-azobis [2- (2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride (VA-044, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were added, and 7 at 37 ° C. Stirred for hours. The product was confirmed by RP-HPLC and MALDI-TOF MS (measurement mode: the same conditions as in (2) above except that it was linear positive). Desulfurized peptide LENWIRDAVTYTEHAKRKTTVTAMDVTYALKRQGRTLYGFGG (SEQ ID NO: 10) was confirmed, and the total yield of peptide (SEQ ID NO: 10) after performing 4 NCL, 3 Aloc group deprotection and desulfurization treatments (SEQ ID NO: 10 relative to peptide 5). It was confirmed that the total yield of 10 peptides was about 29.5%.

例３：ワンポットにおけるペプチド断片の連結によるヒストンＨ３の化学合成
（１）ヒストンＨ３のリジン残基のトリメチル化
ヒストンＨ３のＫ９位置のリジン残基（Ｋ）のトリメチル化（ｍｅ３）（以下、「Ｈ３Ｋ９ｍｅ３」ということがある。）は、最も有名なヒストン修飾の１つであり、遺伝子サイレンシングの重要な特徴である。この修飾は、ヘテロクロマチンの形成に寄与する。ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）は、π−カチオン相互作用によってそのクロモドメイン（ＣＤ）によってＨ３Ｋ９ｍｅ３を認識し、クロモシャドウドメイン（ＣＳＤ）を介して二量体化する。豊富なヒストンＨ３Ｋ９ｍｅ３マーカーが存在すると、ＨＰ１はそのＣＤおよびＣＳＤドメインを介してヘテロクロマチン形成を誘導する。 Example 3: Chemical synthesis of histone H3 by ligation of peptide fragments in one pot (1) Trimethylation of lysine residue of histone H3 Trimethylation of lysine residue (K) at K9 position of histone H3 (me3) (hereinafter, "H3K9me3" Is one of the most famous histone modifications and is an important feature of gene silence. This modification contributes to the formation of heterochromatin. Heterochromatin protein 1 (HP1) recognizes H3K9me3 by its chromodomain (CD) by π-cation interaction and dimerizes via the chromoshadow domain (CSD). In the presence of abundant histone H3K9me3 markers, HP1 induces heterochromatin formation via its CD and CSD domains.

最近、低温ＥＭ法によって決定されたＨＰ１−Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ダイヌクレオソーム複合体の構造が報告されている（Machida S. et al., Mol Cell. 69(3):385-397(2018)）。この報告によると、Ｋ９位置でリジン残基の代わりにシステイン残基を導入し、Ｋｍｅ３アナログを使用してこの複合体を再構成した。しかし、他のグループによると、このＫｍｅ３類似体が元のＫｍｅ３と同じ性質を有していないことが報告されている。化学的タンパク質合成は、突然変異なしにＫ９ｍｅ３を有するヒストンＨ３を合成する唯一の方法である。そこで、ワンポットライゲーション法によりＫ９ｍｅ３を有するヒストンＨ３を合成することにした。 Recently, the structure of the HP1-H3K9me3 dinucleosome complex determined by the low temperature EM method has been reported (Machida S. et al., Mol Cell. 69 (3): 385-397 (2018)). According to this report, a cysteine residue was introduced at the K9 position instead of a lysine residue and the Kme3 analog was used to reconstitute this complex. However, other groups have reported that this Kme3 analog does not have the same properties as the original Kme3. Chemical protein synthesis is the only way to synthesize histone H3 with K9me3 without mutation. Therefore, we decided to synthesize histone H3 having K9me3 by the one-pot ligation method.

ヒストンＨ３の全配列は、３つのペプチド断片に分割され、ヒストンＨ３の元のシステイン残基はＡｃｍ（アセトアミドメチル）基によって保護される。ライゲーション部位のシステイン残基をアラニン残基に変換するための脱硫後、Ａｃｍ基は除去されるべきである。最も広く使用されている方法はヨウ素による酸化であるが、この反応条件はしばしばメチオニン（Ｍｅｔ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ）の酸化を引き起こす。他の方法は、ＡｃＯＨ／水＝１：１の条件で酢酸銀を使用する。しかしながら、過剰の銀イオンは、反応中に容易にタンパク質の凝集を引き起こす。最近、変性バッファー中におけるパラジウム錯体によるＡｃｍ基の脱保護が報告されている（Maity SK et al., Angew Chem Int Ed Engl. 55(28):8108-12(2016)）。この脱保護反応は迅速に進行し、１時間以内に完了した。しかしながら、Ａｌｏｃ基の脱保護に用いられるＰｄ／ＴＰＰＴＳ複合体がシステイン（Ａｃｍ）の脱保護を誘導した可能性があった。 The entire sequence of histone H3 is divided into three peptide fragments, and the original cysteine residue of histone H3 is protected by an Acm (acetamide methyl) group. The Acm group should be removed after desulfurization to convert cysteine residues at the ligation site to alanine residues. The most widely used method is oxidation with iodine, but this reaction condition often causes oxidation of methionine (Met) and tryptophan (Trp). Another method uses silver acetate under the condition of AcOH / water = 1: 1. However, excess silver ions easily cause protein aggregation during the reaction. Recently, deprotection of Acm groups by palladium complexes in denaturing buffer has been reported (Maity SK et al., Angew Chem Int Ed Engl. 55 (28): 8108-12 (2016)). This deprotection reaction proceeded rapidly and was completed within 1 hour. However, it is possible that the Pd / TPPTS complex used to deprotect the Aloc group induced deprotection of cysteine (Acm).

（２）Ａｌｏｃ基およびＡｃｍ基の除去の検討
Ｎ末端システイン残基の保護のためのＡｌｏｃ基および内部システイン残基の保護のためのＡｃｍ基が選択的に除去できるかどうかを試験した。ＮＣＬ条件下で２当量のＰｄ／ＴＰＰＴＳ錯体でＡｌｏｃ基が除去されたことが確認された。一方、Ａｃｍ基は同じ条件下で全く脱保護されなかった。次に、ＰｄＣｌ_２錯体を用いてＡｃｍ基を除去した。この保護基は１０当量のＰｄＣｌ_２錯体で２０分以内に除去された。Ａｌｏｃ基も同じ条件下で除去されたが、反応速度はＡｃｍ基に比べて非常に遅かった。(2) Examination of removal of Aloc group and Acm group Whether or not the Aloc group for protection of N-terminal cysteine residue and Acm group for protection of internal cysteine residue can be selectively removed was tested. It was confirmed that the Aloc group was removed by 2 equivalents of Pd / TPPTS complex under NCL conditions. On the other hand, the Acm group was not deprotected at all under the same conditions. Next, the Acm group was removed using a PdCl ₂ complex. This protecting group was removed within 20 minutes with 10 equivalents of PdCl ₂ complex. The Aloc group was also removed under the same conditions, but the reaction rate was much slower than the Acm group.

要約すると、Ａｌｏｃ基はＰｄ／ＴＰＰＴＳ錯体で除去され、Ａｃｍ基はＰｄＣｌ_２錯体で選択的に除去された。Ｐｄ／ＴＰＰＴＳ錯体は電子が豊富であり、辻−トロスト反応を含むいくつかのクロスカップリング反応に適している。さらに、その非常に立体障害のある特性は、Ａｃｍ基のチオエーテルへの配位を妨げる。対照的に、ＰｄＣｌ_２錯体は電子求引性分子によって取り囲まれ、ルイス酸として機能する。立体障害の少ない構造は、Ａｃｍ基の除去を誘発するチオエーテル基への配位を可能にする。したがって、Ａｌｏｃ基およびＡｃｍ基は、パラジウム錯体の電子および立体特性に依存して選択的に除去された。In summary, the Aloc group was removed with the Pd / TPPTS complex and the Acm group was selectively removed with the PdCl ₂ complex. The Pd / TPPTS complex is electron-rich and suitable for several cross-coupling reactions, including the Tsuji-Trost reaction. Moreover, its highly sterically hindered properties prevent the coordination of Acm groups to thioethers. In contrast, the PdCl ₂ complex is surrounded by electron-attracting molecules and functions as a Lewis acid. The structure with less steric hindrance allows coordination to thioether groups that induce removal of Acm groups. Therefore, the Aloc and Acm groups were selectively removed depending on the electron and steric properties of the palladium complex.

（３）バリン残基−システイン残基間連結の促進
通常、バリン残基−システイン残基間のＮＣＬ法による連結は、β−分枝形成の立体障害が原因でチオエステル交換が妨げられたため非常に遅かった。従前のヒストンＨ３の化学合成では、この連結を完了するのに約４８時間かかった。本発明では標準的なバリン残基の代わりにペニシラミンを導入した。側鎖のチオール基はＣ末端チオエステルを攻撃して４員環を形成することが確認された。この状態は、４員環上に２つのメチル基が存在することによるソープ・インゴールド効果（Thorpe-Ingold Effect）によって安定化される（Y. Wang et al., Chem. Sci., 9:1940-1946(2018）参照）。この歪んだチオエステル形成は、バリン残基とシステイン残基の間の連結を容易にした。(3) Promotion of valine residue-cysteine residue ligation Normally, valine residue-cysteine residue ligation by the NCL method is very difficult because thioester exchange is hindered due to steric hindrance of β-branching formation. It was late. In the conventional chemical synthesis of histone H3, it took about 48 hours to complete this ligation. In the present invention, penicillamine was introduced instead of the standard valine residue. It was confirmed that the thiol group in the side chain attacks the C-terminal thioester to form a 4-membered ring. This condition is stabilized by the Thorpe-Ingold Effect due to the presence of two methyl groups on the 4-membered ring (Y. Wang et al., Chem. Sci., 9: 1940). -1946 (2018)). This distorted thioester formation facilitated the ligation between valine and cysteine residues.

（４）ペプチド断片の合成
下記のペプチド６、ペプチド７およびペプチド８をペプチド合成機ＲｅｓＰｅｐ ＳＬ（ＩＮＴＡＶＩＳ社製）を用いてＦｍｏｃ法による固相合成法により合成した。(4) Synthesis of Peptide Fragment The following peptides 6, peptide 7 and peptide 8 were synthesized by a solid phase synthesis method by the Fmoc method using a peptide synthesizer ResPep SL (manufactured by INTAVIS).

ペプチド６：ＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡＴＫＡＡＲＫＳＡＰＡＴＧＧＶＫＫＰＨＲＹＲＰＧＴＸ（配列番号１１）
（９番目のアミノ酸残基はトリメチル化リジンである。４６番目のＸはペニシラミン（Ｄ−ｐｅｎｉｃｉｌｌａｍｉｎｅ、（２Ｓ）−２−アミノ−３−メチル−３−スルファニルブタン酸）を表す。）
ペプチド７：ＣＬＲＥＩＲＲＹＱＫＳＴＥＬＬＩＲＫＬＰＦＱＲＬＶＲＥＩＡＱＤＦＫＴＤＬＲＦＱＳＳ（配列番号１２）
ペプチド８：ＣＶＭＡＬＱＥＡＣＥＡＹＬＶＧＬＦＥＤＴＮＬＣＡＩＨＡＫＲＶＴＩＭＰＫＤＩＱＬＡＲＲＩＲＧＥＲＡ（配列番号１３）
（９番目および２３番目のアミノ酸残基はＡｃｍ基で保護されたシステイン残基である。）Peptide 6: ARTKQTALKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGTX (SEQ ID NO: 11)
(The 9th amino acid residue is trimethylated lysine. The 46th X represents penicillamine (D-penicillamine, (2S) -2-amino-3-methyl-3-sulfanilic acid).)
Peptide 7: CLREIRRYQKSTELLIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQSS (SEQ ID NO: 12)
Peptide 8: CVMALQEACEAYLVGLFEDTNLCAIHAKRVTIMPKDIQLARRRGERA (SEQ ID NO: 13)
(The 9th and 23rd amino acid residues are cysteine residues protected by Acm groups.)

Ｎ末端のシステイン残基がＡｌｏｃ基で保護されたペプチドは、Ａｌｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（Ｃａｓ：９６８６５−７２−４、Ｌ０１８０７、渡辺化学工業社製）を用いて上記固相合成法を行うことにより調製した。Ｃ末端がチオエステル化されたペプチドは、上記固相合成法を行うことにより調製したペプチドに２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（ＭＥＳＮａ）を反応させ、次いで、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製することにより調製した。 For peptides in which the N-terminal cysteine residue is protected by an Aloc group, the above solid-phase synthesis method is performed using Aloc-Cys (Trt) -OH (Cas: 96865-72-4, L01807, manufactured by Watanabe Chemical Industry Co., Ltd.). Prepared by doing. The C-terminal thioesterified peptide was prepared by reacting the peptide prepared by the above solid phase synthesis method with sodium 2-mercaptoethanesulfonate (MESNa) and then purifying by RP-HPLC.

ペプチド６の９番目のアミノ酸残基は、トリメチルリジンのＦｍｏｃ体（α炭素に結合したアミノ基が９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）により保護されたトリメチルリジン）を用いて上記固相合成法を行うことにより導入した。トリメチルリジンのＦｍｏｃ体は公知の方法（R Wieneke et al., Org. Biomol. Chem., 9: 5482-5486(2011)およびR. Baba et al., J. Am. Chem. Soc., 134 (35):14310-14313( 2012)参照、市販品を利用可能）に従って合成した。ペプチド６の４６番目のアミノ酸残基は、Ｓ−トリチル−Ｌ−ペニシラミンのＦｍｏｃ体（α炭素に結合したアミノ基がＦｍｏｃ基により保護されたＳ−トリチル−Ｌ−ペニシラミン）を用いて上記固相合成法を行うことにより導入した（Y. Wang et al., Chem. Sci., 9:1940-1946(2018）参照）。Ｓ−トリチル−Ｌ−ペニシラミンのＦｍｏｃ体は市販品（SIGMA-ALDRICH社製）を用いた。ペプチド８の９番目および２３番目のアミノ酸残基は、Ａｃｍ基で保護されたシステイン残基であり、チオール基がＡｃｍ基で保護されたシステインのＦｍｏｃ体（α炭素に結合したアミノ基がＦｍｏｃ基により保護されたＳ−アセトアミドメチル−Ｌ−システイン）を用いて上記固相合成法を行うことにより導入した。Ｓ−アセトアミドメチル−Ｌ−システインのＦｍｏｃ体は市販品（渡辺化学工業社製）を用いた。 The 9th amino acid residue of peptide 6 is the above-mentioned solid using the Fmoc form of trimethyllysine (trimethyllysine in which the amino group bonded to α carbon is protected by a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group (Fmoc group)). It was introduced by performing a phase synthesis method. The Fmoc form of trimethyllysine is a known method (R Wieneke et al., Org. Biomol. Chem., 9: 5482-5486 (2011) and R. Baba et al., J. Am. Chem. Soc., 134 ( 35): Synthesized according to 14310-14313 (2012), commercially available). The 46th amino acid residue of peptide 6 is the above solid phase using the Fmoc form of S-trityl-L-penicillamine (S-trityl-L-penicillamine in which the amino group bonded to α carbon is protected by the Fmoc group). It was introduced by performing a synthetic method (see Y. Wang et al., Chem. Sci., 9: 1940-1946 (2018)). A commercially available product (manufactured by SIGMA-ALDRICH) was used as the Fmoc form of S-trityl-L-penicillamine. The 9th and 23rd amino acid residues of peptide 8 are cysteine residues protected by an Acm group, and the Fmoc form of cysteine in which the thiol group is protected by an Acm group (the amino group bonded to α carbon is an Fmoc group). It was introduced by performing the above-mentioned solid phase synthesis method using S-acetamide methyl-L-cysteine protected by. A commercially available product (manufactured by Watanabe Chemical Industry Co., Ltd.) was used as the Fmoc form of S-acetamide methyl-L-cysteine.

（５）ペプチド７とペプチド８との連結
ＮＣＬ法によるペプチドの連結

(5) Linkage of peptide 7 and peptide 8
Peptide linkage by NCL method

２ｍＬチューブにおいてＮＣＬ緩衝溶液（例２（２）と同様）２００μＬに、ペプチド８を２ｍＭとなるように溶解した。この緩衝溶液に、Ｎ末端のシステイン残基がＡｌｏｃ基により保護され、Ｃ末端がチオエステル化されたペプチド７を２ｍＭとなるように添加した。反応溶液を６Ｎ 水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．０に調整した後、３７℃で２時間攪拌することによりＮＣＬ法による連結反応を実施し、ペプチド７とペプチド８とが連結されたペプチドＣＬＲＥＩＲＲＹＱＫＳＴＥＬＬＩＲＫＬＰＦＱＲＬＶＲＥＩＡＱＤＦＫＴＤＬＲＦＱＳＳＣＶＭＡＬＱＥＡＣＥＡＹＬＶＧＬＦＥＤＴＮＬＣＡＩＨＡＫＲＶＴＩＭＰＫＤＩＱＬＡＲＲＩＲＧＥＲＡ（配列番号１４）（以下、ペプチド７−８という。５０番目および６４番目のアミノ酸残基はＡｃｍ基で保護されたシステイン残基である。）を得た。なお、ＮＣＬ法による連結反応の開始から１時間後、２つの出発物質が完全に消失した。 Peptide 8 was dissolved in 200 μL of NCL buffer solution (similar to Example 2 (2)) in a 2 mL tube to 2 mM. To this buffer solution, peptide 7 in which the N-terminal cysteine residue was protected by an Aloc group and the C-terminal was thioesterified was added so as to be 2 mM. The reaction solution was adjusted to pH 7.0 with a 6N sodium hydroxide solution, and then the ligation reaction was carried out by the NCL method by stirring at 37 ° C. for 2 hours. 14) (hereinafter referred to as peptide 7-8. The 50th and 64th amino acid residues are Acm group-protected cysteine residues) were obtained. One hour after the start of the ligation reaction by the NCL method, the two starting materials completely disappeared.

ペプチドのＡｌｏｃ基の脱保護Deprotection of the Aloc group of the peptide

次いで、反応溶液のｐＨを６Ｎ 塩酸で６．０に低下させ、アルゴンガスでバブリングして酸素を脱気し、ペプチド７−８に対して２当量となるようにＰｄ／ＴＰＰＴＳを添加し、反応溶液を室温で１０分間攪拌することにより、Ｎ末端が脱保護（Deprotection）されたペプチド７−８を得た。反応溶液を引き続いて室温で５０分間撹拌することにより、添加したＰｄ／ＴＰＰＴＳを不活性化した。 Next, the pH of the reaction solution was lowered to 6.0 with 6N hydrochloric acid, bubbling with argon gas to degas oxygen, and Pd / TPPTS was added so as to be 2 equivalents with respect to peptide 7-8, and the reaction was carried out. The solution was stirred at room temperature for 10 minutes to give peptide 7-8 with the N-terminus deprotected. The Pd / TPPTS added was subsequently inactivated by stirring the reaction solution at room temperature for 50 minutes.

（６）ペプチド６とペプチド７−８との連結
ＮＣＬ法によるペプチドの連結

(6) Linkage of peptide 6 and peptide 7-8
Peptide linkage by NCL method

Ｃ末端がチオエステル化されたペプチド６は、ソープ・インゴールド効果（Y. Wang et al., Chem. Sci., 9:1940-1946(2018）参照）により、該ペプチドのＣ末端で４員環を安定的に形成した。 The C-terminal thioesterified peptide 6 has a 4-membered ring at the C-terminal of the peptide due to the soap-in-gold effect (see Y. Wang et al., Chem. Sci., 9: 1940-1946 (2018)). Was formed stably.

Ｃ末端で４員環を形成させたペプチド６をペプチド７−８を含む上記（５）の反応溶液に２ｍＭとなるように添加した。反応溶液を６Ｎ 水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．０に調整した後、３７℃で２時間攪拌することによりＮＣＬ法による連結反応を実施し、ペプチド６とペプチド７−８とが連結されたＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡＴＫＡＡＲＫＳＡＰＡＴＧＧＶＫＫＰＨＲＹＲＰＧＴＸＣＬＲＥＩＲＲＹＱＫＳＴＥＬＬＩＲＫＬＰＦＱＲＬＶＲＥＩＡＱＤＦＫＴＤＬＲＦＱＳＳＣＶＭＡＬＱＥＡＣＥＡＹＬＶＧＬＦＥＤＴＮＬＣＡＩＨＡＫＲＶＴＩＭＰＫＤＩＱＬＡＲＲＩＲＧＥＲＡ（配列番号１５）（以下、ペプチド６−７−８という。９６番目および１１０番目のアミノ酸残基はＡｃｍ基で保護されたシステイン残基である。Ｘはペニシラミン残基を表す。）を得た。 Peptide 6 having a 4-membered ring formed at the C-terminal was added to the reaction solution of (5) above containing peptide 7-8 so as to have a concentration of 2 mM. After adjusting to pH7.0 with 6N sodium hydroxide solution and the reaction solution was carried out ligation by NCL method by stirring for 2 hours at 37 ℃, ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGTXCLREIRRYQKSTELLIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQSSCVMALQEACEAYLVGLFEDTNLCAIHAKRVTIMPKDIQLARRIRGERA that the peptide 6 and peptide 7-8 are connected (SEQ No. 15) (hereinafter referred to as peptide 6-7-8. The 96th and 110th amino acid residues are cysteine residues protected by an Acm group. X represents a peniciramine residue).

混合物を水−アセトニトリル混合物で希釈し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物を３９％の単離収率（ペプチド７−８に対する配列番号１５のペプチドのモル比）（isolated yield）で得た。ペプチドの純度はＲＰ−ＨＰＬＣで確認し、分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（測定モード：リニアー・ポジティブとした以外は例２（２）と同様の条件）によって同定した。 The mixture is diluted with a water-acetonitrile mixture and purified by RP-HPLC to give the desired product in isolated yield of 39% (molar ratio of peptide of SEQ ID NO: 15 to peptide 7-8). Obtained. The purity of the peptide was confirmed by RP-HPLC, and the molecular weight was identified by MALDI-TOF MS (measurement mode: the same conditions as in Example 2 (2) except that it was linear positive).

（７）脱硫処理

(7) Desulfurization treatment

粉末化したペプチド６−７−８に、５００ｍＭ ＴＣＥＰ、ＧＳＨ（グルタチオン、ナカライテスク社製）および２０ｍＭ ２、２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二塩酸塩（ＶＡ−０４４、和光純薬工業社製）を変性条件下で添加して、全てのシステイン変異をアラニン残基に、またペニシラミンをバリン残基に変換した。２．５時間後、反応が完了し、反応混合物をＲＰ−ＨＰＬＣで精製して、脱硫（Desulfurization）されたペプチドＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡＴＫＡＡＲＫＳＡＰＡＴＧＧＶＫＫＰＨＲＹＲＰＧＴＶＡＬＲＥＩＲＲＹＱＫＳＴＥＬＬＩＲＫＬＰＦＱＲＬＶＲＥＩＡＱＤＦＫＴＤＬＲＦＱＳＳＡＶＭＡＬＱＥＡＣＥＡＹＬＶＧＬＦＥＤＴＮＬＣＡＩＨＡＫＲＶＴＩＭＰＫＤＩＱＬＡＲＲＩＲＧＥＲＡ（配列番号１６）を得た。脱硫の収率（脱硫前のペプチドに対する脱硫後のペプチドのモル比）は６５％であった。ペプチドの純度をＲＰ−ＨＰＬＣで確認し、分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって同定した。 Powdered peptides 6-7-8 with 500 mM TCEP, GSH (glutathione, manufactured by Nacalai Tesque) and 20 mM 2,2'-azobis [2- (2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride (VA). -044, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added under denatured conditions to convert all cysteine mutations to alanine residues and peniciramine to valine residues. After 2.5 hours, the reaction was completed and the reaction mixture was purified by RP-HPLC to obtain the desulfurized peptide ARTKQTALKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGTVALREIRRYQKSTELLIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFLS, which is the sequence number The yield of desulfurization (molar ratio of peptide after desulfurization to peptide before desulfurization) was 65%. The purity of the peptide was confirmed by RP-HPLC and the molecular weight was identified by MALDI-TOF MS.

（８）Ａｃｍ基の脱保護およびＭＰＡＡ除去

(8) Deprotection of Acm group and removal of MPAA

粉末化したペプチド６−７−８に対して１０当量のＰｄＣｌ_２錯体を、ｐＨ３．０の変性条件下で加えて、内部システイン残基のＡｃｍ保護基を除去した。１時間後、反応が完了し、中性ｐＨで反応混合物にＰｄＣｌ_２錯体に対して５００当量のＤＴＴを添加して、全てのパラジウムをペプチド６−７−８から分離した。次いで、反応混合物を水−アセトニトリル混合物で希釈し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製してＡｃｍ基が脱保護された配列番号１７のペプチドを得た。ＨＰＬＣによりペプチド６−７−８の純度を確認し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分子量を確認した。Ａｃｍ基の脱保護の収率（脱保護前のペプチドに対する脱保護後のペプチドのモル比）は８２％であった。また、２回のＮＣＬ、１回のＡｌｏｃ基脱保護、脱硫処理およびＡｃｍ基脱保護実施後のペプチド（配列番号１７）の総収率（ペプチド８に対する配列番号１７のペプチドのモル比）は約２１％であることを確認した。10 equivalents of PdCl ₂ complex to the powdered peptide 6-7-8 was added under denaturing conditions at pH 3.0 to remove the Acm protecting group of the internal cysteine residue. After 1 hour, the reaction was complete and 500 equivalents of DTT to the PdCl ₂ complex was added to the reaction mixture at neutral pH to separate all palladium from peptide 6-7-8. The reaction mixture was then diluted with a water-acetonitrile mixture and purified by RP-HPLC to give the peptide of SEQ ID NO: 17 with the Acm group deprotected. The purity of peptide 6-7-8 was confirmed by HPLC, and the molecular weight was confirmed by MALDI-TOF MS. The yield of deprotection of the Acm group (molar ratio of peptide after deprotection to peptide before deprotection) was 82%. The total yield of the peptide (SEQ ID NO: 17) after two NCLs, one Aloc group deprotection, desulfurization treatment and Acm group deprotection (molar ratio of peptide of SEQ ID NO: 17 to peptide 8) is about. It was confirmed that it was 21%.

Claims (11)

ペプチド結合を有する高分子の製造方法であって、
（Ａ）未保護のシステイン残基を有する高分子断片１：

（上記式中、Ｃｙｓはシステイン残基を表す。）
と、保護されたシステイン残基を有し、かつ、活性化された任意のアミノ酸残基を有する高分子断片２：

（上記式中、Ｃｙｓはシステイン残基を表し、ＡＡは任意のアミノ酸残基を表し、Ｐｒはアミノ基の保護基を表し、Ｘはカルボキシル基の活性化基を表す。）
とを、ネイティブケミカルライゲーション法により連結させて保護されたシステイン残基を有する高分子断片１−２：

（上記式中、Ｃｙｓはシステイン残基を表し、ＡＡは任意のアミノ酸残基を表し、Ｐｒはアミノ基の保護基を表す。）
を得る工程、
（Ｂ）前記工程（Ａ）の後に、脱保護剤を添加して、未保護のシステイン残基を有する高分子断片１−２：

（上記式中、Ｃｙｓはシステイン残基を表し、ＡＡは任意のアミノ酸残基を表す。）
を得る工程を含んでなり、工程（Ａ）および（Ｂ）を脱保護剤の不活性化剤が存在する反応系で実施する、製造方法。A method for producing a polymer having a peptide bond.
(A) Polymer fragment with unprotected cysteine residue 1:

(In the above formula, Cys represents a cysteine residue.)
And a polymer fragment with a protected cysteine residue and any activated amino acid residue 2:

(In the above formula, Cys represents a cysteine residue, AA represents an arbitrary amino acid residue, Pr represents a protecting group of an amino group, and X represents an activating group of a carboxyl group.)
And are linked by the native chemical ligation method to have a protected cysteine residue.

(In the above formula, Cys represents a cysteine residue, AA represents an arbitrary amino acid residue, and Pr represents a protecting group of an amino group.)
The process of getting
(B) After the step (A), a deprotecting agent is added to polymer fragment 1-2 having an unprotected cysteine residue.

(In the above formula, Cys represents a cysteine residue and AA represents an arbitrary amino acid residue.)
A production method comprising the steps of obtaining the above, wherein steps (A) and (B) are carried out in a reaction system in which an inactivating agent for a deprotecting agent is present. 工程（Ｂ）の後に、（Ｃ）脱保護剤を不活性化させる工程をさらに含む、請求項１に記載の製造方法。 The production method according to claim 1, further comprising (C) a step of inactivating the deprotecting agent after the step (B). 不活性化剤を脱保護剤の添加量を上回る量で存在させる、請求項１または２に記載の製造方法。 The production method according to claim 1 or 2, wherein the inactivating agent is present in an amount exceeding the addition amount of the deprotecting agent. 工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）をさらに１回以上繰り返す、請求項２または３に記載の製造方法。 The manufacturing method according to claim 2 or 3, wherein the step (A), the step (B) and the step (C) are repeated one or more times. 工程（Ｃ）の後に、得られた高分子断片を精製する工程を実施せずに、次の工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）を実施する、請求項４に記載の製造方法。 The production according to claim 4, wherein the following steps (A), (B) and (C) are carried out after the step (C) without carrying out the step of purifying the obtained polymer fragment. Method. 工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）を４回または５回繰り返して実施した場合に、ペプチド結合を有する高分子の収率が２５〜３５％である、請求項４または５に記載の製造方法。 According to claim 4 or 5, the yield of the polymer having a peptide bond is 25 to 35% when the step (A), the step (B) and the step (C) are repeated 4 or 5 times. The manufacturing method described. ペプチド結合を有する高分子が、ペプチドであり、
高分子断片１が、アミノ基が未保護のシステイン残基をＮ末端に有するペプチド断片１であり、
高分子断片２が、アミノ基が保護基により保護されたシステイン残基をＮ末端に有し、かつ、カルボキシル基が活性化された任意のアミノ酸残基をＣ末端に有するペプチド断片２であり、
保護されたシステイン残基を有する高分子断片１−２が、アミノ基が保護基により保護されたシステイン残基をＮ末端に有するペプチド断片１−２であり、
未保護のシステイン残基を有する高分子断片１−２が、アミノ基が未保護のシステイン残基をＮ末端に有するペプチド断片１−２である、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。A polymer having a peptide bond is a peptide,
The polymer fragment 1 is a peptide fragment 1 having an unprotected cysteine residue at the N-terminal of the amino group.
The polymer fragment 2 is a peptide fragment 2 having a cysteine residue having an amino group protected by a protective group at the N-terminal and an arbitrary amino acid residue having an activated carboxyl group at the C-terminal.
The polymer fragment 1-2 having a protected cysteine residue is a peptide fragment 1-2 having an amino group-protected cysteine residue at the N-terminal.
The polymer fragment 1-2 having an unprotected cysteine residue is a peptide fragment 1-2 having an unprotected cysteine residue at the N-terminal of the amino group.
The manufacturing method according to any one of claims 1 to 6. 脱保護剤が、リン系配位子、窒素系配位子、酸素系配位子または硫黄系配位子が配位結合した金属錯体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法。 The invention according to any one of claims 1 to 7, wherein the deprotecting agent is a metal complex in which a phosphorus-based ligand, a nitrogen-based ligand, an oxygen-based ligand, or a sulfur-based ligand is coordinated. Manufacturing method. 保護基が、請求項８に記載の脱保護剤により脱保護される基である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法。 The production method according to any one of claims 1 to 8, wherein the protecting group is a group that is deprotected by the deprotecting agent according to claim 8. 不活性化剤が、チオール系化合物である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の製造方法。 The production method according to any one of claims 1 to 9, wherein the inactivating agent is a thiol compound. 反応系において、工程（Ａ）で得られた高分子断片に対する脱保護剤の１回当たりの添加量の比率（モル比）が、１〜３０である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の製造方法。 Any one of claims 1 to 10, wherein in the reaction system, the ratio (molar ratio) of the amount of the deprotecting agent added at one time to the polymer fragment obtained in the step (A) is 1 to 30. The manufacturing method described in.

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