JP2008150393A - Extended native chemical ligation - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide native chemical ligation with a peptide-amide bond. <P>SOLUTION: Provided is an N-substituted amide compound expressed by formula I: J1-C(O)-N(C1(R1)-C2-SH)-J2, or formula II: J1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-J2, wherein J1 and J2 express each individually a peptide having ≥1 arbitrarily protected amino acid side chains, R1, R2 and R3 express each individually H or an electron donating group complexed with C1 through a covalent bond, C2 and C3 express each carbon, with the proviso that at least one of R1, R2 or R3 comprises the electron donating group complexed with C1. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本出願は、米国仮（ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ）特許出願第６０／２３１，３３９号（２０００年９月８日出願）に基づく優先権を主張するものである。 This application claims priority based on US provisional patent application No. 60 / 231,339 (filed Sep. 8, 2000).

本発明は、部分的に、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）ポストドクター特別研究員補助金（Ｐｏｓｔｄｏｃｔｏｒａｌ Ｆｅｌｌｏｗｓｈｉｐ ｇｒａｎｔ）ＧＮ１９０４０２による援助を受けてなされたものである。合衆国政府は、一部の権利を保有しうる。 This invention was made in part with the support of the National Institute of Health Postdoctoral Fellowship Grant GN190402. The United States government may have some rights.

本発明は、幅広い範囲のペプチド、ポリペプチド、その他のポリマー、及びその他の分子のアミド結合によるライゲーションを可能にする天然型化学的ライゲーション（ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ）技術の拡張のための方法及び組成物に関する。 The present invention relates to methods and compositions for the extension of native chemical ligation technology that allows ligation of a wide range of peptides, polypeptides, other polymers, and other molecules by amide bonds. .

化学的ライゲーションは、第一の化学要素と第二の化学要素との間に選択的共有結合を形成させることを含む。第一及び第二の成分上に存在するそれぞれ一意性の相互反応性官能基を、ライゲーション反応を化学選択性とするために使用することができる。たとえば、ペプチド及びポリペプチドの化学的ライゲーションは、ペプチドまたはポリペプチドセグメントを有する、両立する一意性の相互反応性Ｃ末端及びＮ末端アミノ酸残基の化学選択反応を含む。いくつかの異なる化学反応がこの目的のために使用されており、その例として、天然型化学的ライゲーション（Ｄａｗｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６：７７６−７７９；Ｋｅｎｔ ｅｔ．ａｌ．，ＷＯ９６／３４８７８；Ｋｅｎｔ ｅｔ．ａｌ．，ＷＯ９８／２８４３４）、オキシム生成化学的ライゲーション（Ｒｏｓｅ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９４）１１６：３０−３４）、チオエステル生成ライゲーション（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：２２１−２２５）、チオエーテル生成ライゲーション（Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｓｅｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｓ．（１９９５）３６（４８）：８８７１−８８７４）、ヒドラゾン生成ライゲーション（Ｇａｅｒｔｎｅｒ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）５（４）：３３３−３３８）、ならびにチアゾリジン生成ライゲーション及びオキサゾリジン生成ライゲーション（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９８）９５（１６）：９１８４−９１８９；Ｔａｍ，ｅｔ．ａｌ．，ＷＯ９５／００８４６；米国特許第５，５８９，３５６号明細書）がある。 Chemical ligation involves forming a selective covalent bond between a first chemical element and a second chemical element. Each unique interactive functional group present on the first and second components can be used to make the ligation reaction chemoselective. For example, chemical ligation of peptides and polypeptides involves a chemoselective reaction of compatible and uniquely interacting C-terminal and N-terminal amino acid residues having a peptide or polypeptide segment. Several different chemical reactions have been used for this purpose, examples of which include natural chemical ligation (Dawson, et al., Science (1994) 266: 776-779; Kent et.al., WO96). Kent et.al., WO 98/28434), oxime-generating chemical ligation (Rose, et.al., J. Amer. Chem. Soc. (1994) 116: 30-34), thioester-generating ligation (Schnolzer). , Et.al., Science (1992) 256: 221-225), thioether formation ligation (Englebretsen, et.al., Tet.Letts. (1995) 36 (48): 8871-8874), hydrazone formation. Igation (Gaertner, et.al., Bioconj. Chem. (1994) 5 (4): 333-338), and thiazolidine production ligation and oxazolidine production ligation (Zhang, et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1998) 95 (16): 9184-9189; Tam, et.al., WO 95/00846; U.S. Patent No. 5,589,356).

これらの方法のうち、天然型化学的ライゲーション法のみがライゲーション部位に天然アミド（すなわち、ペプチド）結合を有するライゲーション生成物を与える。初期の天然型化学的ライゲーション法（Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，前記；及びＷＯ９６／３４８７８）は、ライゲーション部位に天然アミド結合を生成するための強力な方法であることがわかっている。天然型化学的ライゲーションは、Ｃ末端αカルボキシチオエステル成分を有する第一のペプチドまたはポリペプチドセグメントとＮ末端システイン残基を有する第二のペプチドまたはポリペプチドとの間の化学選択反応を含む。チオール交換反応により、チオエステル結合初期中間体が生成され、この中間体は、自発的に転位して、ライゲーション部位に天然アミド結合を与え、一方、システイン側鎖チオールを再生させる。初期の天然型化学的ライゲーション法の主要な欠点は、この方法が、Ｎ末端システインを必要とするということ、すなわちこの方法が、ライゲーション部位にシステインを有するペプチド及びポリペプチドセグメントの結合を可能にするだけであるということ、である。 Of these methods, only the natural chemical ligation method yields a ligation product having a natural amide (ie, peptide) bond at the ligation site. Early natural chemical ligation methods (Dawson et. Al., Supra; and WO 96/34878) have been found to be powerful methods for generating natural amide bonds at ligation sites. Natural chemical ligation involves a chemoselective reaction between a first peptide or polypeptide segment having a C-terminal α-carboxythioester component and a second peptide or polypeptide having an N-terminal cysteine residue. The thiol exchange reaction generates a thioester bond initial intermediate that spontaneously rearranges to give a natural amide bond at the ligation site while regenerating the cysteine side chain thiol. A major disadvantage of the initial natural chemical ligation method is that it requires an N-terminal cysteine, ie, this method allows the coupling of peptides and polypeptide segments that have a cysteine at the ligation site. It is only that.

この欠点にもかかわらず、システインではないＮ末端アミノ酸とのペプチドの天然型化学的ライゲーションが提案されている（ＷＯ９８／２８４３４）。この方法においては、ライゲーションは、Ｃ末端αカルボキシチオエステルを有する第一のペプチドまたはポリペプチドセグメントと、式 ＨＳ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−ＮＨ−［ペプチド］ で表されるＮ末端Ｎ−｛チオール置換補助｝基を有する第二のペプチドまたはポリペプチドセグメントとを使用して実施される。ライゲーションの後、Ｎ−｛チオール置換補助｝基は、ＨＳ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−補助基を開裂してライゲーション部位に天然アミド結合を生成させることによって、除去される。この方法における一つの制限は、メルカプトエトキシ補助基の使用がグリシン残基においてのみアミド結合を首尾よく生じさせうる、ということである。そのため、開裂において、第二のペプチドまたはポリペプチドセグメントのＮ置換アミノ酸の位置にグリシン残基が生じるライゲーション生成物が作られる。したがって、前記方法の実施が適当であるのは、反応のライゲーション生成物が前記位置にグリシン残基を有することが望ましい場合だけであり、とにかく、ライゲーション収率、前駆体の安定性、Ｏ結合補助基の除去能力に関して問題が起こりうる。他の補助基、たとえばＨＳＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ−［ペプチド］も、グリシン残基におけるライゲーションための反応を制限することなしに使用できるが、そのような補助基は、ライゲーション生成物から除去することができない。 Despite this drawback, natural chemical ligation of peptides with an N-terminal amino acid that is not cysteine has been proposed (WO 98/28434). In this method, the ligation comprises a first peptide or polypeptide segment having a C-terminal α-carboxythioester and an N-terminal N- {represented by the formula HS—CH ₂ —CH ₂ —O—NH— [peptide] And a second peptide or polypeptide segment having a thiol substitution aid} group. After ligation, N-{thiol substituted auxiliary} group, by generating a native amide bond at the ligation site cleaves HS-CH ₂ -CH ₂ -O- auxiliary group is removed. One limitation in this method is that the use of mercaptoethoxy auxiliary groups can successfully produce amide bonds only at glycine residues. Thus, a ligation product is created that, upon cleavage, produces a glycine residue at the N-substituted amino acid position of the second peptide or polypeptide segment. Therefore, the implementation of the method is appropriate only when it is desired that the ligation product of the reaction has a glycine residue at the position, and anyway, the ligation yield, the stability of the precursor, the O-bonding aid Problems can arise regarding the ability to remove groups. Other auxiliary groups such as HSCH ₂ CH ₂ NH- [peptide] also can be used without limiting the reaction to ligation at a glycine residue, such auxiliary groups can be removed from the ligation product Can not.

したがって、必要なことは、有効な容易に除去できるチオール含有補助基によって、天然型化学的ライゲーションを、いろいろな種類のアミノ酸残基、ペプチド、ポリペプチド、ポリマー、及びその他の分子、にまで拡張し、かつそのような分子をライゲーション部位における天然アミド結合によって結合する、幅広く適用できる強力な化学的ライゲーション法である。本発明は、これら及びその他の要望に応えるものである。 Therefore, what is needed is the extension of natural chemical ligation to a wide variety of amino acid residues, peptides, polypeptides, polymers, and other molecules with an effective, easily removable thiol-containing auxiliary group. And a widely applicable and powerful chemical ligation method in which such molecules are linked by natural amide bonds at the ligation site. The present invention addresses these and other needs.

本発明は、拡張天然型化学的ライゲーションに関係する方法と組成物とにかかわる。本発明の拡張天然型化学的ライゲーション法は、
Ｎ置換アミド結合初期ライゲーション生成物であって、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−Ｊ２ Ｉ
または
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）
−Ｊ２ ＩＩ
を有し、
これらの式において、
Ｊ１が、それぞれ個別に、随意に保護された一つ以上のアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分、ポリマー、染料、好適に官能基を有する（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）表面、リンカーもしくは検出可能なマーカー、または化学的ペプチド合成もしくは拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の他の化学成分であり、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、それぞれ個別に、Ｃ１に複合したＨまたは電子供与基であるが、ただし前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち少なくとも一つがＣ１に複合した前記電子供与基から成り、
Ｊ２が、それぞれ個別に、随意に保護された一つ以上のアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分、ポリマー、染料、好適に官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカー、または化学的ペプチド合成もしくは拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の他の化学成分である、
Ｎ置換アミド結合初期ライゲーション生成物、
を生成させることから成る。 The present invention relates to methods and compositions related to extended natural chemical ligation. The extended natural chemical ligation method of the present invention comprises:
An N-substituted amide bond initial ligation product comprising:
Formula J1-C (O) -N (C1 (R1) -C2-SH) -J2 I
Or J1-C (O) -N (C1 (R1) -C2 (R2) -C3 (R3) -SH)
-J2 II
Have
In these equations,
J1 each independently has a peptide or polypeptide having one or more amino acid side chains optionally protected, or a component, polymer, dye, preferably functional group of such peptide or polypeptide. Surface, linker or detectable marker, or any other chemical moiety compatible with chemical peptide synthesis or extended natural chemical ligation,
R1, R2, and R3 are each independently H or an electron donating group conjugated to C1, provided that at least one of R1, R2, and R3 is composed of the electron donating group conjugated to C1,
J2 is a peptide or polypeptide having one or more amino acid side chains, each optionally protected, or a component, polymer, dye, suitably functional surface, linker, such a peptide or polypeptide Or a detectable marker, or any other chemical moiety compatible with chemical peptide synthesis or extended natural chemical ligation,
N-substituted amide bond initial ligation product,
Generating.

ライゲーション生成物は、
式 Ｊ１−Ｃ（Ｏ）ＳＲ のカルボキシルチオエステルから成る第一の要素を、
式
ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−ＨＮ−Ｊ２ ＩＩＩ
または
ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−ＨＮ−Ｊ２ ＩＶ
を有し、これらの式において、Ｊ２、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、前記のとおりである、酸安定なＮ置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールから成る第二の要素に、結合させ、
その後、随意に、２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールを、Ｎ置換アミド結合ライゲーション生成物から除去する、
プロセスによって生成される。好ましい実施形態においては、そのような開裂は、ペプチドに適合する開裂条件下でＣ１に共鳴安定化陽イオンを生成させることによって促進される。Ｎからのアルキルまたはアリールチオール鎖の除去により、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−ＨＮ−Ｊ２ Ｖ
を有し、この式において、Ｊ１、Ｊ２、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が前記のとおりである最終ライゲーション生成物が得られる。 The ligation product is
A first element consisting of a carboxyl thioester of formula J1-C (O) SR
Formula HS-C2-C1 (R1) -HN-J2 III
Or HS-C3 (R3) -C2 (R2) -C1 (R1) -HN-J2 IV
Wherein J2, R1, R2, and R3 are conjugated to a second element consisting of an acid stable N-substituted 2 or 3 carbon chain aminoalkyl or aryl thiol, as described above. ,
Thereafter, optionally, the 2 or 3 carbon chain alkyl or aryl thiol is removed from the N-substituted amide bond ligation product.
Generated by the process. In preferred embodiments, such cleavage is facilitated by generating a resonance-stabilizing cation at C1 under cleavage conditions compatible with the peptide. Removal of the alkyl or aryl thiol chain from N
Formula J1-C (O) -HN-J2 V
And in this formula, a final ligation product is obtained wherein J1, J2, R1, R2, and R3 are as described above.

本発明は、また、前記のような拡張天然型化学的ライゲーションを実施するための組成物及び該組成物を収容するカートリッジ及びキットにも関する。この組成物は、完全保護、部分保護、または完全非保護の酸安定なＮ置換，好ましくはＮα置換，２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールであって、
式
ＳＸ２−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−Ｘ１Ｎ−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２
ＶＩ
または
ＳＸ２−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−Ｘ１Ｎ―ＣＨ
（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ ＶＩＩ
を有する。これらの式において、Ｘ１は、Ｈまたはアミノ保護基、Ｘ２は、Ｈまたはチオール保護基、Ｊ２、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は前記のとおりであり、Ｚ２は、化学的ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の化学成分（単なる例示として、たとえば、アミノ酸側鎖）である。本発明は、また、実質的にラセミ混合物またはジアステレオマーを含まない本発明の前記化合物のキラル形にも関する。 The present invention also relates to a composition for carrying out the extended natural chemical ligation as described above, and a cartridge and a kit containing the composition. The composition is a fully protected, partially protected, or fully unprotected acid stable N-substituted, preferably Nα-substituted, 2 or 3 carbon chain aminoalkyl or aryl thiol,
Formula SX2-C2-C1 (R1) -X1N-CH (Z2) -C (O) -J2
VI
Or SX2-C3 (R3) -C2 (R2) -C1 (R1) -X1N-CH
(Z2) -C (O) -J2 VII
Have In these formulas, X1 is H or amino protecting group, X2 is H or thiol protecting group, J2, R1, R2, and R3 are as described above, and Z2 is chemical peptide synthesis or extended natural chemistry. Any chemical moiety that is compatible with general ligation (for example, amino acid side chains only). The invention also relates to chiral forms of said compounds of the invention that are substantially free of racemic mixtures or diastereomers.

本発明は、さらに、前記の完全保護、部分保護、または完全非保護のＮ置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールの、溶液相及び固相での生成法にも関する。これらの化合物を生成する方法には、固相ペプチド合成法に適合するＮα保護、Ｎアルキル化、Ｓ保護、アミノアルキルまたはアリール−チオールアミノ酸前駆体のハロゲン仲介アミノアルキル化、還元アミノ化、及び生成が含まれる。 The invention further relates to methods for the production of the fully protected, partially protected, or fully unprotected N-substituted 2 or 3 carbon chain aminoalkyl or aryl thiols in solution and solid phases. Methods for producing these compounds include Nα protection, N alkylation, S protection, halogen mediated aminoalkylation of aminoalkyl or aryl-thiol amino acid precursors, reductive amination, and generation compatible with solid phase peptide synthesis methods. Is included.

カルボキシチオエステル要素のＪ１成分は、該カルボキシチオエステルと拡張天然型化学的ライゲーションのための反応条件とに適合する任意の化学成分から成ることができ、また本発明のＮ置換要素は、単独で提供することができ、あるいはいろいろな化学成分、たとえばアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、核酸、または他の化学成分（たとえば、染料、ハプテン、炭水化物、脂質、固体支持体、生体適合性のポリマーもしくは他のポリマー、その他）と結合させることができる。本発明の拡張天然型化学的ライゲーション法は、強力であり、中性に近いｐＨとある範囲の温度との条件下で水性の系で実施することができる。本発明のＮ置換要素を生成する方法も強力なものであり、これらの新しい化合物を得るためのいろいろな合成経路により、予想外の高い収率で純粋の生成物を与える。本発明のＮα保護、Ｎアルキル化、Ｓ保護、アミノアルキルまたはアリール−チオールアミノ酸前駆体は、通常のペプチド合成及び他の有機合成方策を使用する、高速の自動合成のために特に有効である。さらに、本発明の保護されたＮ置換要素は、化学的ライゲーションの用途を多要素のライゲーション法まで拡張するものであり、たとえば、多重ライゲーション法たとえば三つ以上のセグメントのライゲーション法または収束的（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ）ライゲーション合成法によって、ポリペプチドを生成する場合の、多要素のライゲーション法まで拡張するものである。たとえば、本発明の方法と組成物は、カルボキシチオエステルとＮ置換要素との第一の対を使用して所望の分子の第一の部分を合成し、またカルボキシチオエステルとＮ置換要素との別の対を使用して該分子の別の部分を合成することを可能にするものである。次に、そのようにして合成されたそれぞれのライゲーション生成物を、結合させて（適当な脱保護及び／または改質の後）所望の分子を生成させることができる。 The J1 component of the carboxythioester element can consist of any chemical moiety that is compatible with the carboxythioester and reaction conditions for extended natural chemical ligation, and the N-substituted element of the present invention is provided alone Various chemical components such as amino acids, peptides, polypeptides, nucleic acids, or other chemical components such as dyes, haptens, carbohydrates, lipids, solid supports, biocompatible polymers or other polymers, Other). The extended natural chemical ligation method of the present invention is powerful and can be performed in aqueous systems under conditions of near neutral pH and a range of temperatures. The method of generating the N-substituted element of the present invention is also powerful and the various synthetic routes to obtain these new compounds give pure products in unexpectedly high yields. The Nα-protected, N-alkylated, S-protected, aminoalkyl or aryl-thiol amino acid precursors of the present invention are particularly effective for fast automated synthesis using conventional peptide synthesis and other organic synthesis strategies. Furthermore, the protected N-substitution elements of the present invention extend the use of chemical ligation to multi-element ligation methods, such as multi-ligation methods such as ligation methods of three or more segments or convergent methods. ) It extends to the multi-element ligation method in the case of producing a polypeptide by the ligation synthesis method. For example, the methods and compositions of the present invention use a first pair of a carboxythioester and an N-substitution element to synthesize a first portion of the desired molecule and another carboxythioester and N-substitution element. It is possible to synthesize another part of the molecule using pairs. Each ligation product so synthesized can then be combined (after appropriate deprotection and / or modification) to produce the desired molecule.

したがって、本発明の方法と組成物は、天然型化学的ライゲーションの範囲を大いに拡張するものであり、また本発明の出発、中間、及び最終生成物は、広範囲の用途を有する。 Thus, the methods and compositions of the present invention greatly extend the range of natural chemical ligation, and the starting, intermediate, and final products of the present invention have a wide range of applications.

本発明は、拡張天然型化学的ライゲーションに関係する方法と組成物にかかわる。一般に、この方法は、カルボキシルチオエステル、好ましくはα−カルボキシルチオエステル、から成る第一の要素を、酸安定なＮ置換、好ましくはＮα置換、２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールから成る第二の要素と結合させることを含む。第一の要素のカルボキシチオエステルと第二の要素のＮ置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールのチオールとの間の化学選択的反応が、チオエステル結合中間体を介して進行し、初期ライゲーション生成物に変化する。もっと詳しく言うと、ＣＯＳＲチオエステル要素とアミノアルキルチオール要素との間で起こるチオール交換により、チオエステル結合中間ライゲーション生成物が生じ、該生成物は、５員環または６員環中間体を通過する自発転位の後、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−Ｊ２ Ｉ
または
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）
−Ｊ２ ＩＩ
を有する第一のアミド結合ライゲーション生成物を生じる。これらの式において、Ｊ１、Ｊ２、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は上で定義したものである。 The present invention relates to methods and compositions related to extended natural chemical ligation. In general, this method involves replacing a first element consisting of a carboxyl thioester, preferably an α-carboxyl thioester, with a second, consisting of an acid stable N-substituted, preferably Nα-substituted, 2 or 3 carbon chain aminoalkyl or aryl thiol. Includes combining with elements. A chemoselective reaction between the carboxythioester of the first element and the thiol of the N-substituted 2 or 3 carbon chain alkyl or aryl thiol of the second element proceeds via the thioester-linked intermediate to produce an initial ligation product To change. More specifically, the thiol exchange that occurs between the COSR thioester element and the aminoalkyl thiol element yields a thioester-linked intermediate ligation product that undergoes spontaneous rearrangement through a 5-membered or 6-membered ring intermediate. After,
Formula J1-C (O) -N (C1 (R1) -C2-SH) -J2 I
Or J1-C (O) -N (C1 (R1) -C2 (R2) -C3 (R3) -SH)
-J2 II
Resulting in a first amide bond ligation product having In these formulas, J1, J2, R1, R2, and R3 are as defined above.

ライゲーション部位にあるＮ置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］または［ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−］は、ペプチドに適合する条件下で、生成物の損傷なしで、除去されやすく、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−ＨＮ−Ｊ２ Ｖ
を有する最終ライゲーション生成物を生じる。この式において、Ｊ１、Ｊ２、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、上で定義したものである。この最終ライゲーション生成物はライゲーション部位に天然アミド結合を有する。 N-substituted 2 or 3 carbon chain alkyl or aryl thiol [HS-C2-C1 (R1)-] or [HS-C3 (R3) -C2 (R2) -C1 (R1)-] at the ligation site is attached to the peptide Easy to remove under compliant conditions, without product damage,
Formula J1-C (O) -HN-J2 V
To produce a final ligation product having In this formula, J1, J2, R1, R2, and R3 are as defined above. This final ligation product has a natural amide bond at the ligation site.

さらに詳しく言うと、本発明の拡張天然型化学的ライゲーション法は、（ｉ）式 Ｊ１−Ｃ（Ｏ）ＳＲ を有するα−カルボキシルチオエステルから成る第一の要素と、（ｉｉ）酸安定なＮ置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールから成る第二の要素であって、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−Ｊ２ Ｉ
または
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）
−Ｊ２ ＩＩ
を有する第二の要素との化学的ライゲーションから成る。これらの式において、Ｊ１、Ｊ２、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、上で定義したものである。 More specifically, the extended natural chemical ligation method of the present invention comprises (i) a first element consisting of an α-carboxylthioester having the formula J1-C (O) SR and (ii) an acid stable N-substitution. A second element consisting of a 2 or 3 carbon chain aminoalkyl or aryl thiol,
Formula J1-C (O) -N (C1 (R1) -C2-SH) -J2 I
Or J1-C (O) -N (C1 (R1) -C2 (R2) -C3 (R3) -SH)
-J2 II
Consisting of a chemical ligation with a second element having In these formulas, J1, J2, R1, R2, and R3 are as defined above.

Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３基は、ペプチドに適合する開裂条件下で、Ｎ−Ｃ１結合の開裂を容易にするように選択する。たとえば、電子供与基を、特にＣ１に複合させる場合、Ｃ１に開裂を容易にする共鳴安定化陽イオンを生成させるために使用することができる。この化学的ライゲーション反応は、好ましくは、賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）としてチオール触媒を含み、水性または有機−水性混合条件下で、中性付近のｐＨ条件で実施される。第一の要素と第二の要素との化学的ライゲーションは、自発転位してＮ置換アミド結合ライゲーション生成物を生じる５員環または６員環を通じて進行させることができる。第一及び第二の要素がペプチドまたはポリペプチドである場合、Ｎ置換アミド結合ライゲーション生成物は、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎａ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−ＣＨ（Ｚ２）
−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ ＶＩＩＩ
または
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎａ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）
−ＳＨ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ ＩＸ
を有する。これらの式において、Ｊ１、Ｊ２、及びＲ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＺ２は、上で定義したものである。 The R1, R2, and R3 groups are selected to facilitate cleavage of the N-C1 bond under cleavage conditions compatible with the peptide. For example, when an electron donating group is conjugated, particularly to C1, it can be used to generate a resonance stabilized cation that facilitates cleavage at C1. This chemical ligation reaction preferably comprises a thiol catalyst as an excipient and is carried out under aqueous or organic-aqueous mixed conditions at near neutral pH conditions. Chemical ligation of the first and second elements can proceed through a 5-membered or 6-membered ring that spontaneously rearranges to yield an N-substituted amide bond ligation product. When the first and second elements are peptides or polypeptides, the N-substituted amide bond ligation product is
Formula J1-C (O) -Na (C1 (R1) -C2-SH) -CH (Z2)
-C (O) -J2 VIII
Or J1-C (O) -Na (C1 (R1) -C2 (R2) -C3 (R3)
-SH) -CH (Z2) -C (O) -J2 IX
Have In these formulas, J1, J2, and R1, R2, R3, and Z2 are as defined above.

Ｎ置換アミド結合ライゲーション生成物の複合電子供与基Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｎ置換アミド結合ライゲーション生成物からの、Ｎ−Ｃ１結合の開裂及び２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの除去を容易にする。ペプチドに適合する開裂条件下でのＮのアルキルまたはアリールチオール鎖の除去により、ライゲーション部位に天然アミド結合を有するライゲーション生成物が生じる。第一及び第二の要素がペプチドまたはポリペプチドである場合、ライゲーション生成物は、
式
Ｊ１−ＣＯＮａＨ−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ Ｘ
を有する。 Complex electron donating groups R1, R2, and R3 of N-substituted amide bond ligation products facilitate cleavage of N-C1 bonds and removal of 2 or 3 carbon chain alkyl or aryl thiols from N-substituted amide bond ligation products To. Removal of the N alkyl or aryl thiol chain under cleavage conditions compatible with the peptide yields a ligation product with a natural amide bond at the ligation site. When the first and second elements are peptides or polypeptides, the ligation product is
Formula J1-CONaH—CH (Z2) —C (O) —J2 X
Have

本発明は、従来の化学的ライゲーション法に比して、多くの利点を与える。そのような利点のうちいくつかは、本発明のＮ置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール要素の精密に調整された性質に関係する。第一に、結合されていないＮ置換要素は、酸性条件に対して安定であり、それによって強力な合成と安定した貯蔵とが行われる。第二に、該要素は、カルボキシチオエステル要素と選択的に反応して、ライゲーション部位にＮ置換アミド結合を有する初期ライゲーション生成物を生じる。第三に、初期ライゲーション生成物のライゲーション部位のＮα位置にある再生アルキルまたはアリールチオール成分は、非保護、部分保護、または完全保護ペプチド、ポリペプチド、またはその他の成分に十分に適合する条件下で、選択的に除去することができる。すなわち、アルキルまたはアリールチオール成分を、所望のライゲーション生成物に損傷を与えることなく、除去することができる。この選択的開裂反応は、ライゲーションのために選択した特定のＮ置換アルキルまたはアリールチオール成分に応じた、標準的なペプチド適合性の開裂条件下、たとえば酸性、光分解、または還元性条件下で、容易に実施することができる。したがって、本発明のもう一つの利点は、ライゲーション要素の残留部分上の一つ以上の基（存在する場合）を、意図する最終用途に応じて、非保護、部分保護、または完全保護とすることができる、ということである。さらに、与えられた、カルボキシルチオエステル及びＮ置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの化学選択的性質と溶解度特性との下で、ライゲーション反応は、室温付近において、水性条件下で、ｐＨ７付近で、高速かつ正確に実施して、高い生成物収率を得ることができる。したがって、本発明においては、穏やかな条件下で、部分または完全非保護ペプチド、ポリペプチド、またはその他のポリマーのライゲーションが非常に柔軟に行われる。 The present invention offers many advantages over conventional chemical ligation methods. Some of such advantages relate to the fine-tuned nature of the N-substituted 2 or 3 carbon chain alkyl or aryl thiol elements of the present invention. First, unbound N-substitution elements are stable to acidic conditions, thereby providing strong synthesis and stable storage. Second, the element selectively reacts with a carboxythioester element to yield an initial ligation product having an N-substituted amide bond at the ligation site. Third, the regenerated alkyl or aryl thiol component at the Nα position of the ligation site of the initial ligation product is subject to conditions that are well compatible with unprotected, partially protected, or fully protected peptides, polypeptides, or other components. , Can be selectively removed. That is, the alkyl or aryl thiol component can be removed without damaging the desired ligation product. This selective cleavage reaction can be performed under standard peptide-compatible cleavage conditions, such as acidic, photolytic, or reducing conditions, depending on the particular N-substituted alkyl or aryl thiol moiety selected for ligation. It can be easily implemented. Accordingly, another advantage of the present invention is that one or more groups (if any) on the remaining portion of the ligation element are unprotected, partially protected, or fully protected, depending on the intended end use. Is that you can. In addition, under the chemoselective and solubility properties of the given carboxyl thioesters and N-substituted 2 or 3 carbon chain alkyl or aryl thiols, the ligation reaction is near room temperature, under aqueous conditions, near pH 7, High speed and accuracy can be achieved to obtain high product yields. Thus, in the present invention, ligation of partially or fully unprotected peptides, polypeptides, or other polymers is very flexible under mild conditions.

本発明のＮ置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール要素を有するペプチド要素の場合、この化合物は、下記の表Ｉに示すように、
式
ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−ＮＨａ−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２
ＸＩ
を有する。Ｊ２及びＲ２は、前記のものであり、Ｚ２は、Ｎ置換アミノ酸に適合する任意の側鎖基、たとえばアミノ酸の側鎖、である。Ｒ１は、好ましくは、Ｃ１に対するオルトまたはパラ位置において電子供与基で置換されたフェニル基、またはピコリル基（非置換、またはＣ１に対するオルトまたはパラ位置においてヒドロキシルまたはチオールで置換されたもの）である。 In the case of a peptide element having an N-substituted 2-carbon chain alkyl or aryl thiol element of the present invention, the compound is as shown in Table I below:
Formula HS-C2-C1 (R1) -NHa-CH (Z2) -C (O) -J2
XI
Have J2 and R2 are as described above, and Z2 is any side chain group compatible with an N-substituted amino acid, such as the side chain of an amino acid. R1 is preferably a phenyl group substituted with an electron donating group at the ortho or para position relative to C1, or a picolyl group (unsubstituted or substituted with hydroxyl or thiol at the ortho or para position relative to C1).

オルトまたはパラ位置のフェニル及びピコリル電子供与置換基Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'の配置は、ライゲーション後のＮ−Ｃ１結合の開裂を容易にするためのＣ１炭素への電子的複合を維持するのに必要である。Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'として好ましい電子供与基の例としては、強力な電子供与基たとえばメトキシ（−ＯＣＨ₃）、チオール（−ＳＨ）、ヒドロキシル（−ＯＨ）、メチルチオ（−ＳＣＨ₃）、及び中程度の電子供与体（ｄｏｎａｔｏｒ）たとえばメチル（−ＣＨ₃）、エチル（−ＣＨ₂−ＣＨ₃）、プロピル（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₃）、イソプロピル（−ＣＨ₂（ＣＨ₃）₃）がある。ただし、Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'の任意のものまたはすべてをＨとすることができる。一般的な観察結果によれば、強力な電子供与基は、２炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの、ライゲーション後の開裂に対する敏感性を高める。Ｒ１'、Ｒ３'、またはＲ５'置換基として単一の電子供与基が存在する場合、ライゲーション反応は高速で進行しうるが、開裂はゆっくりであり、あるいはより厳しい開裂条件が必要である。Ｒ１'、Ｒ３'、またはＲ５'置換基として、二つ以上の電子供与基が存在する場合、ライゲーション反応はゆっくりでありうるが、開裂は高速であり、あるいはより厳しくない開裂条件が必要である。したがって、条件に応じて特定の電子供与基を選択することができる。 The configuration of phenyl and picolyl electron donating substituents R1 ′, R3 ′, and R5 ′ in the ortho or para position maintains electronic conjugation to the C1 carbon to facilitate cleavage of the N—C1 bond after ligation. Is necessary. Examples of preferred electron donating groups for R1 ′, R3 ′, and R5 ′ include strong electron donating groups such as methoxy (—OCH ₃ ), thiol (—SH), hydroxyl (—OH), methylthio (—SCH ₃ ). , And medium electron donors such as methyl (—CH ₃ ), ethyl (—CH ₂ —CH ₃ ), propyl (—CH ₂ —CH ₂ —CH ₃ ), isopropyl (—CH ₂ (CH _{3) 3} ) There is. However, any or all of R1 ′, R3 ′, and R5 ′ can be H. According to common observations, strong electron donating groups increase the sensitivity of 2-carbon chain alkyl or aryl thiols to post-ligation cleavage. When a single electron donating group is present as the R1 ′, R3 ′, or R5 ′ substituent, the ligation reaction can proceed fast, but the cleavage is slow or requires more stringent cleavage conditions. When two or more electron donating groups are present as R1 ′, R3 ′, or R5 ′ substituents, the ligation reaction can be slow, but the cleavage is fast or requires less severe cleavage conditions. . Therefore, a specific electron donating group can be selected according to conditions.

本発明のもう一つの実施形態は、Ｎ置換２炭素鎖化合物に関する。該化合物は、Ｒ１'及びＲ５'位置にＲ１の置換基としてチオールを含む。Ｃ１に複合した電子供与基に加えて、これらの位置の一つまたは両方にチオールを導入することにより、Ｒ１基に仲介される６員環を通過して結合する化合物が生じる（また、Ｎα−２炭素鎖アルキルチオールの場合５員環を通過する）。また、この導入により、αカルボキシチオエステルとの反応のために使用できるチオールの局所濃度も増大し、構造的条件に関してさらに適当なライゲーションを良くできる立体配座が与えられる。 Another embodiment of the invention is directed to an N-substituted two carbon chain compound. The compound contains a thiol as a substituent of R1 at the R1 ′ and R5 ′ positions. In addition to the electron donating group conjugated to C1, introduction of a thiol at one or both of these positions yields a compound that binds through a six-membered ring mediated by the R1 group (also Nα- In the case of a 2-carbon chain alkylthiol, it passes through a 5-membered ring). This introduction also increases the local concentration of thiols that can be used for reaction with the α-carboxythioester, providing a conformation that allows for better ligation with respect to structural conditions.

本発明のＮα置換３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール要素に関して述べると、この化合物は、下記の表ＩＩに示す式 ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−ＮＨα−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ を有している。 Referring to the Nα-substituted 3-carbon chain alkyl or aryl thiol element of the present invention, this compound has the formula HS-C3 (R3) -C2 (R2) -C1 (R1) -NHα-CH (Z2 shown in Table II below. ) -C (O) -J2.

前述のように、Ｊ２は、化学的ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の化学成分とすることができ、Ｚ２は、Ｎ置換アミノ酸に適合する任意の側鎖基たとえばアミノ酸の側鎖である。Ｒ１が水素でない場合、Ｒ２とＲ３は水素であり、Ｒ１は、非置換の、またはより好ましくはＣ１に対するオルトもしくはパラ位置において電子供与基で置換されたフェニル成分であるか、またはピコリル（非置換、またはＣ１に対するオルトもしくはパラ位置においてヒドロキシルもしくはチオールで置換されたもの）である。Ｒ２とＲ３が水素でない場合、Ｒ１は水素であり、Ｒ３とＲ２は、Ｃ１に対するオルトもしくはパラ位置において電子供与基で置換されたベンジル基であるか、またはピコリル（非置換、またはＣ１に対するオルトもしくはパラ位置においてヒドロキシルもしくはチオールで置換されたもの）である。 As noted above, J2 can be any chemical moiety compatible with chemical peptide synthesis or extended natural chemical ligation, and Z2 can be any side chain group compatible with N-substituted amino acids such as the amino acid side. Is a chain. When R1 is not hydrogen, R2 and R3 are hydrogen and R1 is a phenyl moiety that is unsubstituted or more preferably substituted with an electron donating group in the ortho or para position to C1, or picolyl (unsubstituted Or substituted with hydroxyl or thiol at the ortho or para position relative to C1). When R2 and R3 are not hydrogen, R1 is hydrogen and R3 and R2 are benzyl groups substituted with an electron donating group in the ortho or para position relative to C1 or picolyl (unsubstituted or ortho or relative to C1). Substituted in the para position with hydroxyl or thiol).

Ｎ置換２炭素鎖化合物の場合と同様に、オルトまたはパラ位置のフェニル及びピコリル電子供与置換基Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'の配置は、ライゲーション後のＮα−Ｃ１結合の確かな開裂のためのＣ１炭素への電子的複合を維持するのに必要である。しかし、Ｒ２及びＲ３がＣ２及びＣ３を有するベンジル基である場合、Ｒ１'とＲ３'のうち少なくとも一つが強力な電子供与基であり、このとき、Ｒ１'またはＲ３'がメトキシ（−ＯＣＨ₃）、チオール（−ＳＨ）、ヒドロキシル（−ＯＨ）、及びチオメチル（−ＳＣＨ₃）から選択される。Ｒ２とＲ３が水素であるＮ置換３炭素鎖チオールの場合、Ｒ１はフェニルまたはピコリル基から成り、このときＲ１'、Ｒ３'、及びＲ５'は、強力もしくは中程度の電子供与基またはこれらの組合せを含む。Ｎ置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの場合と同様に、強力な電子供与基は、３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの、ライゲーション後の開裂に対する敏感性を高める。したがって、条件に応じて特定の電子供与基またはその組合せを選択することができる。 As in the case of N-substituted two carbon chain compounds, the configuration of the phenyl and picolyl electron donating substituents R1 ′, R3 ′, and R5 ′ in the ortho or para position is due to the reliable cleavage of the Nα-C1 bond after ligation. Necessary to maintain the electronic complexation of C1 to the C1 carbon. However, when R2 and R3 are benzyl groups having C2 and C3, at least one of R1 ′ and R3 ′ is a strong electron donating group, in which case R1 ′ or R3 ′ is methoxy (—OCH ₃ ). , Thiol (—SH), hydroxyl (—OH), and thiomethyl (—SCH ₃ ). In the case of an N-substituted three carbon chain thiol where R2 and R3 are hydrogen, R1 consists of a phenyl or picolyl group, where R1 ′, R3 ′, and R5 ′ are strong or moderate electron donating groups or combinations thereof including. As in the case of N-substituted 2-carbon chain alkyl or aryl thiols, strong electron donating groups increase the sensitivity of the 3-carbon chain alkyl or aryl thiols to post-ligation cleavage. Therefore, a specific electron donating group or a combination thereof can be selected depending on conditions.

本発明のＮ置換３炭素鎖化合物は、Ｎ置換２炭素鎖化合物の場合と同様に、問題の構造における置換に使用できる場合、Ｒ１'及びＲ５'位置におけるＲ１の置換基として、チオールを含むことができる。この場合も、電子供与チオール基はＣ１に複合しており、前記位置へのこの基の導入により、この化合物は、６員環形成ライゲーション現象への二つの経路を有することができる。また、この導入により、αカルボキシチオエステルとの反応のために使用できるチオールの局所濃度も増大し、構造的条件に関してさらに適当なライゲーションを良くできる配列が与えられる The N-substituted 3-carbon chain compound of the present invention contains a thiol as a substituent of R1 at the R1 ′ and R5 ′ positions when it can be used for substitution in the structure in question as in the case of the N-substituted 2-carbon chain compound Can do. Again, the electron donating thiol group is complexed to C1, and by introduction of this group at the position, the compound can have two pathways to the six-membered ring-forming ligation phenomenon. This introduction also increases the local concentration of thiols that can be used for reaction with α-carboxythioesters, giving sequences that can be better ligated in terms of structural conditions.

本発明のＮ末端Ｎ置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールアミノ酸の合成は、ここでたとえば方法Ｉ及び方法ＩＩ、ならびに実施例に述べるようにして、当業者に公知の標準的な有機化学技術を用いて、実施することができる。たとえば、"Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，"４^thＥｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｍａｒｃｈ（Ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９２；"Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，"Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ（Ｅｄ．），ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８９，を参照されたい。これらのアミノ酸は、溶液中において、ポリマー支持合成により、またはこれらの組合せによって合成することができる。好ましい方法においては、Ｎα保護Ｎアルキル化Ｓ保護アミノアルキルまたはアリールチオールアミノ酸前駆体を使用する。合成のために使用する反応物質は商業的供給源のどこからでも得ることができる。また、十分に理解されるように、出発要素及びいろいろな中間体たとえばそれぞれのアミノ酸誘導体は、キットその他に入れて、あとからの使用のために保存することができる。 The synthesis of the N-terminal N-substituted 2 or 3 carbon chain alkyl or aryl thiol amino acids of the present invention can now be accomplished using standard organic chemistry techniques known to those skilled in the art, eg, as described in Method I and Method II, and the Examples. Can be used. See, for example, “Advanced Organic Chemistry, Reactions, Mechanisms, and Structures,” 4th Edition, J. ^MoI . March (Ed.), John Wiley & Sons, New York, NY, 1992; "Comprehensive Organic Transformations, A Guide to Functional Group preparations," R. See Larock (Ed.), VCH Publishers, New York, NY, 1989. These amino acids can be synthesized in solution, by polymer-supported synthesis, or a combination thereof. In a preferred method, Nα protected N alkylated S protected aminoalkyl or aryl thiol amino acid precursors are used. The reactants used for the synthesis can be obtained from any commercial source. Also, as will be appreciated, the starting elements and various intermediates such as the respective amino acid derivatives can be stored in a kit or the like for later use.

本発明のＮ末端Ｎα置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールアミノ酸の生成においては、保護基法が使用される。いろいろな合成方策において使用するのに好ましい保護基（ＰＧ）は、一般に、固相ペプチド合成（"ＳＰＰＳ"）に適合するものである。場合によっては、いろいろな条件下で除去できる直交（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）保護基の使用も必要になる。多くのそのような保護基が公知であり、ここでの目的のために適当である（たとえば、"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９；ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ． Ｃａｔａｌｏｇ ２０００；"Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅｒ'ｓ Ｇｕｉｄｅ，"Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９２；"Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ ＆ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，"Ｗ．Ｄ．．Ｂｅｎｎｅｔ，Ｊ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．Ｋ．Ｈａｍａｋｅｒ，Ｍ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．Ｒｈｏｄｅｓ，ａｎｄ Ｈ．Ｈ．Ｓａｎｅｉｉ，Ｅｄｓ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ，１９９８；"Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，"Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９３；"Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，"Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ａｎｄ Ａ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９４；"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ，"Ｐ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ，Ｅｄ．，Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９４，を参照されたい）。イオウ成分の場合、適当な保護基の単なる例示としては、ベンジル、４−メチルベンジル、４−メトキシベンジル、トリチル（ｔｒｉｔｙｌ）、Ａｃｍ、ＴＡＣＡＭ、キサンチル（ｘａｎｔｈｙｌ）、ジスルフィド誘導体、ピコリル、及びフェナシル（ｐｈｅｎａｃｙｌ）がある。 In the generation of the N-terminal Nα substituted 2 or 3 carbon chain alkyl or aryl thiol amino acids of the present invention, the protecting group method is used. Preferred protecting groups (PG) for use in various synthetic strategies are generally those that are compatible with solid phase peptide synthesis ("SPPS"). In some cases, it may also be necessary to use orthogonal protecting groups that can be removed under a variety of conditions. Many such protecting groups are known and suitable for purposes herein (eg, “Protecting Groups in Organic Synthesis”, 3rd Edition, TW Greene and PGM Wuts, Eds. , John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem. Catalog 2000; "Synthetic Peptides, A User's Guide," GA Grant, Ed., W. H. Freeman & N 1992; "Advanced Chemtech Handbook of Combination & Solid Phase Organic Chemistry," WD. Bennet, JW Christensen, LK Hamaker, ML Peterson, MR Rhodes, and H. H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; , "M. Bodanzsky, Ed., Springer-Verlag, 1993;" The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed., "M. Bodanzky and A. Bodanzky, Ed., Vrszky, Eds. P. J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stut gart, Germany, 1994, see). In the case of the sulfur component, merely examples of suitable protecting groups are benzyl, 4-methylbenzyl, 4-methoxybenzyl, trityl, Acm, TACAM, xanthyl, disulfide derivatives, picolyl, and phenacyl. )

もっと詳しく言うと、Ｎα置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールは、方法Ｉ（Ｎα置換前駆体の固相生成）、方法ＩＩ（Ｎα置換前駆体の溶液相生成）にしたがって生成することができる。方法Ｉの場合、Ｎα置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールは、ポリマー支持有機合成の標準的方法により、固相上で直接に集成されるが、一方、方法ＩＩのＮα保護、Ｎアルキル化、Ｓ保護、アミノアルキルまたはアリールチオールアミノ酸前駆体は、標準的な結合手順により、樹脂に結合される。方法Ｉの場合、Ｘは、水素であり、Ｒ１及びＲ２は、前記のもので、保護または非保護成分として予備生成させるかまたは樹脂上で合成することができ、Ｊ２は、好ましくはＸ−ＣＨ（Ｒ）−Ｊ２−樹脂の形にハロゲンに結合させる。この式で、Ｒは、ハロゲンまたはその他の側鎖である。容易に理解しうるように、たとえばβもしくはγアミノ酸または類似の分子の合成において、たとえば、ハロゲンＸとＪ２−樹脂とが複数の炭素によって分離される場合には、Ｊ２はいろいろな基とすることができる。グリオキサル成分（ＨＣ（Ｏ）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２−樹脂）が使用される場合、生成される側鎖Ｒは水素である。方法ＩＩの場合、Ｘは、ハロゲンであり、Ｒ１及びＲ２は、前記のもので、保護または非保護成分として予備生成させるかまたは溶液中もしくは樹脂上で合成することができ、ここで、Ｒは、ハロゲンまたはその他の側鎖である。グリオキサル酸成分（ＨＣ（Ｏ）−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ）が使用される場合、生成される側鎖Ｒは水素である。前記のことから、方法ＩとＩＩが、３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの合成に使用することができるということは明らかであろう。ラセミまたはジアステレオマー生成物が生じる場合、拡張天然型化学的ライゲーションに使用する前に、これらを標準的な方法によって分離することが必要になりうる。 More specifically, Nα substituted 2 or 3 carbon chain alkyl or aryl thiols can be generated according to Method I (solid phase generation of Nα substituted precursors), Method II (solution phase generation of Nα substituted precursors). . In Method I, Nα-substituted 2 or 3 carbon chain alkyl or aryl thiols are assembled directly on the solid phase by standard methods of polymer-supported organic synthesis, whereas Method II Nα protection, N alkylation , S-protected, aminoalkyl or aryl thiol amino acid precursors are coupled to the resin by standard coupling procedures. In the case of Method I, X is hydrogen and R1 and R2 are as described above and can be preformed as a protected or unprotected component or synthesized on the resin, J2 is preferably X-CH (R) -J2-bonded to halogen in the form of a resin. In this formula, R is a halogen or other side chain. As can be easily understood, for example in the synthesis of β or γ amino acids or similar molecules, for example, when halogen X and J2-resin are separated by multiple carbons, J2 can be a different group. Can do. When the glyoxal component (HC (O) -C (O) -J2-resin) is used, the side chain R produced is hydrogen. In Method II, X is a halogen and R1 and R2 are as described above and can be preformed as protected or unprotected components or synthesized in solution or on a resin, where R is , Halogen or other side chain. When the glyoxalic acid component (HC (O) —C (O) —OH) is used, the side chain R produced is hydrogen. From the foregoing it will be clear that Methods I and II can be used for the synthesis of three carbon chain alkyl or aryl thiols. If racemic or diastereomeric products occur, it may be necessary to separate them by standard methods prior to use in extended natural chemical ligation.

本発明の拡張天然型化学的ライゲーション法のために使用する第一の要素のカルボキシチオエステル成分について述べると、この化合物は式 Ｊ１−ＣＯ−ＳＲ を有する。より好ましいカルボキシチオエステル要素は、式 Ｊ１−ＮＨ−Ｃ（Ｚ１）−ＣＯ−ＳＲ のα−カルボキシルチオエステルアミノ酸から成る。基Ｊ１は、化学選択反応に適合する任意の化学成分、たとえば保護もしくは非保護アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、その他のポリマー、染料、リンカー、その他とすることができる。Ｚ１は、αＣＯ−ＳＲチオエステルに適合する任意の側鎖基たとえばアミノ酸の側鎖である。Ｒは、チオエステル基に適合する任意の基であり、たとえば単なる例示として、アリール、ベンジル、及びアルキル基がある。Ｒの例としては、３−カルボキシ−４−ニトロフェニルチオエステル、ベンジルチオエステル、及びメルカプトプロピオン酸ロイシンチオエステルがある（たとえば、Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６：７７６−７７９；Ｃａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９９５）３６：１２１７−１２２０；Ｋｅｎｔ，ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９６／３４８７８；Ｋｅｎｔ，ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９８／２８４３４；Ｉｎｇｅｎｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＣＳ（１９９９）１２１（４９）：１１３６９−１１３７４；Ｈａｃｋｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９９）９６：１００６８−１００７３，を参照されたい）。その他の例としては、インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）仲介生物学的方法によって生成できる、ジチオトレイトール、またはアルキルもしくはアリールチオエステルがあり、これらも公知である（たとえば、Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９９７）１９２：２７７−２８１；Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９８）２６：５１０９−５１１５：Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）７：２２５６−２２６４；Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）６（９）：２４７−２５６，を参照されたい）。 Referring to the first component carboxythioester component used for the extended natural chemical ligation process of the present invention, the compound has the formula J1-CO-SR. More preferred carboxythioester elements consist of α-carboxythioester amino acids of formula J1-NH—C (Z1) —CO—SR. The group J1 can be any chemical moiety compatible with the chemoselective reaction, such as protected or unprotected amino acids, peptides, polypeptides, other polymers, dyes, linkers, etc. Z1 is any side chain group compatible with the αCO-SR thioester, for example the side chain of an amino acid. R is any group compatible with a thioester group, for example, aryl, benzyl, and alkyl groups by way of example only. Examples of R include 3-carboxy-4-nitrophenyl thioester, benzyl thioester, and mercaptopropionic leucine thioester (eg, Dawson et al., Science (1994) 266: 776-779; Canne et al. Tetrahedron). (1995) 36: 1217-1220; Kent, et al., WO 96/34878; Kent, et al., WO 98/28434; Ingenito et al., JACS (1999) 121 (49): 11369-11374; et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96: 10068-10073). Other examples include dithiothreitol, or alkyl or aryl thioesters that can be produced by intein mediated biological methods, also known (eg, Chong et al., Gene (1997) 192: Chong et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26: 5109-5115: Evans et al., Protein Science (1998) 7: 2256-2264; Cotton et al., Chemistry & 99 (1997). 6 (9): 247-256).

αカルボキシチオエステルは、当業者に公知の標準的な技術に従い、化学的または生物学的方法、たとえばここで述べる方法たとえば実施例に含まれるもの、によって生成することができる。化学的合成の場合、α−カルボキシチオエステルペプチドは、溶液中またはチオエステル生成樹脂によって生成することができる。その技術は公知である（たとえば、Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，前記；Ｃａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．，前記；Ｈａｃｋｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，前記；Ｈｏｊｏ Ｈ，Ａｉｍｏｔｏ，Ｓ．（１９９１）Ｂｕｌｌ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｊｐｎ ６４：１１１−１１７を参照されたい）。たとえば、化学合成チオエステルペプチドは、対応するペプチドα−チオ酸から作ることができ、α−チオ酸は、チオエステル樹脂上または溶液中で合成することができるが、樹脂法が好ましい。ペプチド−α−チオ酸は、対応する３−カルボキシ−４−ニトロフェニルチオエステル、対応するベンジルエステル、またはいろいろなアルキルチオエステルの任意のものに転化させることができる。これらのチオエステルは、すべて、ライゲーション反応のために十分な離脱基を与え、３−カルボキシ−４−ニトロフェニルチオエステルのほうが対応するベンジルチオエステルよりもやや大きな反応速度を示し、ベンジルチオエステルは、アルキルチオエステルよりも反応性が大きくなりうる。別の例として、トリチル会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）メルカプトプロピオン酸（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｒｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）ロイシンチオエステル生成樹脂を、Ｃ末端チオエステルの生成のために使用することができる（Ｈａｃｋｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，前記）。Ｃ末端チオエステル合成は、３−カルボキシプロパンスルホンアミド安全捕捉（ｓａｆｅｔｙ ｃａｔｃｈ）リンカーを使用し、ジアゾメタンまたはヨードアセトニトリルによる活性化の後、適当なチオールによる置換を行うことによっても、実現することができる（Ｉｎｇｅｎｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，前記；Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１，１１６８４−１１６８９）。 Alpha carboxythioesters can be produced according to standard techniques known to those skilled in the art by chemical or biological methods, such as those described herein, such as those included in the examples. For chemical synthesis, the α-carboxy thioester peptide can be produced in solution or by a thioester-generating resin. The technology is known (see, for example, Dawson et al., Supra; Canne et al., Supra; Hackeng et al., Supra; Hojo H, Aimoto, S. (1991) Bull Chem Soc Jpn 64: 111-117. See). For example, a chemically synthesized thioester peptide can be made from the corresponding peptide α-thioacid, which can be synthesized on the thioester resin or in solution, with the resin method being preferred. The peptide-α-thioic acid can be converted to the corresponding 3-carboxy-4-nitrophenyl thioester, the corresponding benzyl ester, or any of a variety of alkyl thioesters. All of these thioesters provide sufficient leaving groups for the ligation reaction, with 3-carboxy-4-nitrophenyl thioester showing a slightly higher reaction rate than the corresponding benzyl thioester, which is more symmetric than the alkyl thioester. Can be more reactive. As another example, a trityl associated mercaptopropionic acid leucine thioester generating resin can be used for the generation of C-terminal thioesters (Hackeng et al., Supra). C-terminal thioester synthesis can also be achieved using a 3-carboxypropanesulfonamide safe catch linker and activating with diazomethane or iodoacetonitrile followed by substitution with an appropriate thiol ( Ingenito et al., Supra; Shin et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121, 11684-11688).

ペプチドまたはポリペプチドＣ末端α−カルボキシエステルも、生物学的方法によって生成することができる。たとえば、インテイン発現系（ｉｎｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を、標識、たとえば親和性標識、あり、またはなしで使用して、Ｃ末端チオエステルペプチドまたはポリペプチドセグメントを生成するのに適当なチオールの存在下で、"インテイン"たんぱく質スプライシング要素の誘導できる自己開裂活性を使用することができる。特に、インテインは、Ｃ末端チオエステルを有するペプチドセグメントを生成するチオールたとえばＤＴＴ、β−メルカプトエタノール、β−メルカプトエタンスルホン酸、またはシステインの存在下で、独特の自己開裂を引起こす。たとえば、Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）前記；Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）前記；Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，前記；及びＣｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，前記、を参照されたい。 Peptide or polypeptide C-terminal α-carboxyesters can also be produced by biological methods. For example, an intein expression system may be used with or without a label, such as an affinity label, in the presence of a suitable thiol to produce a C-terminal thioester peptide or polypeptide segment. The inducible self-cleaving activity of the intein “protein splicing element can be used. In particular, inteins cause unique self-cleavage in the presence of thiols such as DTT, β-mercaptoethanol, β-mercaptoethanesulfonic acid, or cysteine, which generate peptide segments with a C-terminal thioester. For example, Chong et al. (1997) supra; Chong et al. (1998) supra; Evans et al. , Supra; and Cotton et al. , See above.

図１は、ペプチドの拡張天然型化学的ライゲーションを仲介する能力を示すことによって、本発明を説明するものであり、同じ方法は、任意の適当な分子のライゲーションの実施のために使用することができる。図示されているように、第一の要素は、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−αＣＯ−ＳＲ のα−カルボキシルチオエステルを有し、第二の要素は、式 ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−ＮＨα−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ のＮ末端の酸安定なＮα置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオールを有する。要素Ｊ１及びＪ２は、化学選択的ライゲーション反応に適合する任意の化学成分たとえば保護または非保護アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、その他のポリマー、染料、リンカー、その他とすることができる。Ｚ１は、αＣＯ−ＳＲチオエステルに適合する任意の側鎖基、たとえばアミノ酸の保護または非保護側鎖である。Ｚ２は、Ｎα置換アミノ酸に適合する任意の側鎖基、たとえばアミノ酸の保護または非保護側鎖である。Ｒ１は、Ｃ１に対する好ましくはオルトまたはパラ位置において電子供与基で置換されたベンジル成分（Ｃ１に関して述べる場合にはベンジルであり、他の場合にはフェニルである）、またはピコリル（ｐｉｃｏｌｙｌ）（非置換、またはＣ１に対するオルトまたはパラ位置においてヒドロキシルまたはチオールで置換されたもの）である。 FIG. 1 illustrates the present invention by illustrating the ability of peptides to mediate extended natural chemical ligation, and the same method can be used for performing any suitable molecular ligation. it can. As shown, the first element has an α-carboxyl thioester of the formula J1-HN—CH (Z1) -αCO—SR and the second element has the formula HS-C2-C1 (R1) -NHα-CH (Z2) -C (O) -J2 has an N-terminal acid stable Nα-substituted 2-carbon chain alkyl or aryl thiol. Elements J1 and J2 can be any chemical moiety that is compatible with chemoselective ligation reactions, such as protected or unprotected amino acids, peptides, polypeptides, other polymers, dyes, linkers, and the like. Z1 is any side chain group compatible with the αCO-SR thioester, for example a protected or unprotected side chain of an amino acid. Z2 is any side chain group compatible with the Nα-substituted amino acid, for example a protected or unprotected side chain of an amino acid. R1 is preferably a benzyl moiety substituted with an electron donating group in the ortho or para position relative to C1 (benzyl when mentioned with respect to C1, otherwise phenyl), or picolyl (unsubstituted) Or substituted with hydroxyl or thiol at the ortho or para position relative to C1).

チオール交換が、αＣＯＳＲチオエステル要素とアミノＮ−｛アルキルチオール｝要素との間で起こる。この交換により、チオエステル結合中間ライゲーション生成物が生じ、この生成物は、５員環中間体を通過する自発転位の後、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−Ｃ（Ｏ）−Ｎα（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ の第一のライゲーション生成物を生じ、この生成物はライゲーション部位に除去できるＮα置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］を有する。ライゲーション部位のこのＮα置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］は、ペプチドに適合する条件下で、除去しやすく、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（Ｚ２）−ＣＯ−Ｊ２ の最終ライゲーション生成物を生じ、この生成物はライゲーション部位に天然アミド結合を有する。 Thiol exchange occurs between the αCOSR thioester element and the amino N- {alkylthiol} element. This exchange yields a thioester-linked intermediate ligation product that, after spontaneous rearrangement through a five-membered ring intermediate, has the formula J1-HN—CH (Z1) —C (O) —Nα (C1 ( R1) -C2-SH) -CH (Z2) -C (O) -J2 yields a first ligation product which can be removed at the ligation site by an Nα-substituted 2-carbon chain alkyl or aryl thiol [HS- C2-C1 (R1)-]. This Nα-substituted 2-carbon chain alkyl or aryl thiol [HS-C2-C1 (R1)-] at the ligation site is easy to remove under conditions compatible with the peptide and has the formula J1-HN-CH (Z1) -CO- This results in a final ligation product of NH-CH (Z2) -CO-J2, which has a natural amide bond at the ligation site.

図２は、ペプチドの拡張天然型化学的ライゲーションを仲介する能力を示すことによって、本発明を説明するものであり、同じ方法は任意の適当な分子のライゲーションの実施のために使用することができる。図示されているように、第一の要素は、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−αＣＯ−ＳＲ のα−カルボキシルチオエステルを有し、第二の要素は、式 ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−ＮＨα−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ の酸安定なＮα置換３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールを有する。要素Ｊ１及びＪ２は、化学選択的ライゲーション反応に適合する任意の化学成分たとえば保護または非保護アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、その他のポリマー、染料、リンカー、その他とすることができる。Ｚ１は、αＣＯ−ＳＲチオエステルに適合する任意の側鎖基、たとえばアミノ酸の保護または非保護側鎖である。Ｚ２は、Ｎα置換アミノ酸に適合する任意の側鎖基、たとえばアミノ酸の保護または非保護側鎖である。Ｒ１が水素でない場合、Ｒ２とＲ３は水素であり、Ｒ１は、非置換の、またはＣ１に対するオルトまたはパラ位置において電子供与基で置換されたフェニル成分、ピコリル（非置換、またはＣ１に対するオルトまたはパラ位置においてヒドロキシルまたはチオールで置換されたもの）、メタンチオール、またはスルホキシメチルである。Ｒ２とＲ３が水素でない場合、Ｒ１は水素であり、Ｒ３とＲ２は、Ｃ１に対するオルトまたはパラ位置において電子供与基で置換されたベンジル基、またはピコリル（非置換、またはＣ１に対するオルトまたはパラ位置においてヒドロキシルまたはチオールで置換されたもの）である。 FIG. 2 illustrates the present invention by illustrating the ability of peptides to mediate extended natural chemical ligation, and the same method can be used for performing any suitable molecular ligation. . As shown, the first element has an α-carboxyl thioester of the formula J1-HN—CH (Z1) -αCO—SR and the second element has the formula HS-C3 (R3) -C2 (R2) -C1 (R1) -NH [alpha] -CH (Z2) -C (O) -J2 has an acid stable N [alpha] substituted 3-carbon chain alkyl or aryl thiol. Elements J1 and J2 can be any chemical moiety that is compatible with chemoselective ligation reactions, such as protected or unprotected amino acids, peptides, polypeptides, other polymers, dyes, linkers, and the like. Z1 is any side chain group compatible with the αCO-SR thioester, for example a protected or unprotected side chain of an amino acid. Z2 is any side chain group compatible with the Nα-substituted amino acid, for example a protected or unprotected side chain of an amino acid. When R1 is not hydrogen, R2 and R3 are hydrogen and R1 is a phenyl moiety unsubstituted or substituted with an electron donating group in the ortho or para position relative to C1, picolyl (unsubstituted, or ortho or para to C1). Substituted at the position with hydroxyl or thiol), methanethiol, or sulfoxymethyl. When R2 and R3 are not hydrogen, R1 is hydrogen and R3 and R2 are benzyl groups substituted with an electron donating group at the ortho or para position relative to C1, or picolyl (unsubstituted, or at the ortho or para position relative to C1). Substituted with hydroxyl or thiol).

チオール交換が、ＣＯＳＲチオエステル要素とアミノアルキルチオール要素との間で起こる。この交換により、チオエステル結合中間ライゲーション生成物が生じ、この生成物は、６員環中間体を通過する自発転位の後、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−Ｃ（Ｏ）−Ｎα（Ｃ１−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｊ２ の第一のライゲーション生成物を生じ、この生成物はライゲーション部位に除去できるＮα置換３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−］を有する。ライゲーション部位のこのＮα置換３炭素鎖アリールチオール［ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−］は、ペプチドに適合する条件下で、除去しやすく、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（Ｚ２）−ＣＯ−Ｊ２ の最終ライゲーション生成物を生じ、この生成物はライゲーション部位に天然アミド結合を有する。 Thiol exchange occurs between the COSR thioester element and the aminoalkylthiol element. This exchange yields a thioester-linked intermediate ligation product that, after spontaneous rearrangement through a 6-membered ring intermediate, has the formula J1-HN—CH (Z1) —C (O) —Nα (C1- Yields a first ligation product of C2 (R2) -C3 (R3) -SH) -CH (Z2) -J2, which product can be removed at the ligation site by an Nα-substituted three carbon chain alkyl or aryl thiol [HS- C3 (R3) -C2 (R2) -C1 (R1)-]. This Nα-substituted 3-carbon chain aryl thiol [HS-C3 (R3) -C2 (R2) -C1 (R1)-] at the ligation site is easy to remove under conditions compatible with the peptide and has the formula J1-HN-CH This yields the final ligation product of (Z1) -CO-NH-CH (Z2) -CO-J2, which has a natural amide bond at the ligation site.

図３は多要素の拡張天然型化学的ライゲーション法を示す。図１に示すような式 ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−Ｎα（ＰＧ１）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ のＮα保護Ｎ末端ポリペプチドＮα置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオールを有するポリペプチドα−カルボキシルチオエステルが、Ｎ末端Ｃｙｓ残基を含むペプチドと反応する。Ｒ１は、非置換のフェニル、もしくは好ましくはＣ１に対するオルトまたはパラ位置において電子供与基で置換されたフェニル、またはピコリル（非置換、またはＣ１に対するオルトまたはパラ位置においてヒドロキシルもしくはチオールで置換されたもの）である。保護基（ＰＧ１）は、任意の適当な保護基，たとえばアルキルカルボニル保護基（たとえば、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、Ｂｏｃ、Ｂｐｏｃ、Ｆｍｏｃ、その他）、トリフェニルメチル保護基（Ｔｒｔ）、２−ニトロフェニルスルフェニル保護基（Ｎｐｓ）、その他とすることができる。この保護基は第一のライゲーション反応後に除去される。 FIG. 3 shows a multi-element extended natural chemical ligation method. Nα-protected N-terminal polypeptide Nα-substituted 2-carbon chain alkyl or aryl thiol of formula HS-C2-C1 (R1) -Nα (PG1) -CH (Z2) -C (O) -J2 as shown in FIG. The polypeptide α-carboxyl thioester reacts with a peptide containing an N-terminal Cys residue. R1 is unsubstituted phenyl, or preferably phenyl substituted with an electron donating group at the ortho or para position relative to C1, or picolyl (unsubstituted or substituted with hydroxyl or thiol at the ortho or para position relative to C1) It is. The protecting group (PG1) can be any suitable protecting group, such as an alkylcarbonyl protecting group (eg, benzyloxycarbonyl (Z), Boc, Bpoc, Fmoc, etc.), a triphenylmethyl protecting group (Trt), 2-nitro. It can be a phenylsulfenyl protecting group (Nps), etc. This protecting group is removed after the first ligation reaction.

第一の天然型化学的ライゲーション反応は、図１に示すような式 ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−Ｎα（ＰＧ１）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ のＮα保護Ｎ末端ポリペプチドＮα置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオールを有するポリペプチドα−カルボキシルチオエステルと、Ｎ末端Ｃｙｓ−ペプチドとの間で行われ、式 ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−Ｎα（ＰＧ１）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−ペプチド２−ペプチド３ の第一ライゲーション生成物を与える。次に、保護基ＰＧ１が除去され、式 ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−Ｎα（Ｈ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−ペプチド２−ペプチド３ のライゲーション生成物が与えられる。次に、この生成物は第三のチオエステル含有要素と反応させられる。ＣＯＳＲチオエステル要素とアミノＮ−｛アルキルチオール｝要素との間で、チオール交換が行われる。この交換により、チオエステル結合中間ライゲーション生成物が生じ、該生成物は、５員環中間体を通過する自発転位の後、式 ペプチド１−Ｃ（Ｏ）−Ｎα（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）ペプチド２−Ｃｙｓ−ペプチド３ の第二のライゲーション生成物を生じ、該生成物は、第二のライゲーション部位に除去できるＮα置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］を有する。第二のライゲーション部位のこのＮα置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］は、ペプチドに適合する条件下で、除去されやすく、第一及び第二のライゲーション部位に天然アミド結合を有する、式 ペプチド１−Ｃ（Ｏ）−ＮαＨ−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）ペプチド２−Ｃｙｓ−ペプチド３ の最終ライゲーション生成物を生じる。 The first natural chemical ligation reaction is a Nα-protected N-terminal polypeptide of formula HS-C2-C1 (R1) -Nα (PG1) -CH (Z2) -C (O) -J2 as shown in FIG. Performed between a polypeptide α-carboxyl thioester having an Nα-substituted 2-carbon chain alkyl or aryl thiol and an N-terminal Cys-peptide, formula HS-C2-C1 (R1) -Nα (PG1) -CH (Z2) The first ligation product of -C (O) -peptide2-peptide3 is given. The protecting group PG1 is then removed to give the ligation product of formula HS-C2-C1 (R1) -N [alpha] (H) -CH (Z2) -C (O) -peptide2-peptide3. This product is then reacted with a third thioester-containing element. A thiol exchange takes place between the COSR thioester element and the amino N- {alkylthiol} element. This exchange yields a thioester-linked intermediate ligation product, which, after spontaneous rearrangement through a 5-membered ring intermediate, has the formula peptide 1-C (O) -Nα (C1 (R1) -C2-SH ) -CH (Z2) -C (O) peptide 2-Cys-peptide 3 resulting in a second ligation product, which can be removed at the second ligation site, an Nα substituted 2-carbon chain alkyl or aryl thiol. [HS-C2-C1 (R1)-]. This Nα-substituted 2-carbon chain alkyl or aryl thiol [HS-C2-C1 (R1)-] at the second ligation site is easy to remove under conditions compatible with the peptide, and at the first and second ligation sites. The final ligation product of the formula peptide 1-C (O) -NαH-CH (Z2) -C (O) peptide 2-Cys-peptide 3 with a natural amide bond is produced.

図１、２、及び３に示すように、第一のカルボキシチオエステル要素を有する本発明のＮ置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール要素は、ライゲーション部位にＮ置換アミド結合を有するライゲーション生成物を生じる。反応のライゲーション条件は、Ｎ置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール成分とのチオエステルの選択的反応性が維持されるように、選択される。好ましい実施形態の場合、ライゲーション反応は、ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ６．５〜７．５、を有する緩衝液中で実施される。この緩衝液は水性、有機、またはこれらの混合物とすることができる。ライゲーション反応は、また、一つ以上の触媒及び／または一つ以上の還元剤、脂質、界面活性剤、その他の変性剤または可溶化剤、ならびにその他を含むことができる。好ましい触媒の例としては、チオール及びホスフィン含有成分たとえばチオフェノール、ベンジルメルカプタン、ＴＣＥＰ、及びアルキルホスフィンがある。変性剤及び／または可溶化剤の例としては、グアニジニウム、尿素の水溶液もしくは尿素を有機溶剤たとえばＴＦＥ、ＨＦＩＰ、ＤＭＦ、ＮＭＰに溶解させたもの、アセトニトリルと水との混合物、またはアセトニトリルをグアニジニウムと尿素との水溶液と混合したもの、がある。温度も、ライゲーション反応の速度の調節のために使用することができる。温度は、通常５〜５５℃、好ましくは１５〜４０℃、とする。一例として、ライゲーション反応は、６Ｍのグアニジニウム中に２％のチオフェノールを含むｐＨ６．８〜７．８の反応系において、十分に進行する。 As shown in FIGS. 1, 2, and 3, an N-substituted 2 or 3 carbon chain alkyl or aryl thiol element of the present invention having a first carboxythioester element can produce a ligation product having an N-substituted amide bond at the ligation site. Arise. The ligation conditions for the reaction are selected such that the selective reactivity of the thioester with the N-substituted 2 or 3 carbon chain alkyl or aryl thiol component is maintained. In a preferred embodiment, the ligation reaction is performed in a buffer having a pH of 6-8, preferably a pH of 6.5-7.5. The buffer can be aqueous, organic, or a mixture thereof. The ligation reaction can also include one or more catalysts and / or one or more reducing agents, lipids, surfactants, other modifiers or solubilizers, and others. Examples of preferred catalysts include thiol and phosphine containing components such as thiophenol, benzyl mercaptan, TCEP, and alkyl phosphines. Examples of denaturing and / or solubilizing agents include guanidinium, aqueous urea solutions or urea dissolved in organic solvents such as TFE, HFIP, DMF, NMP, a mixture of acetonitrile and water, or acetonitrile in guanidinium and urea. And mixed with an aqueous solution. Temperature can also be used to adjust the rate of the ligation reaction. The temperature is usually 5 to 55 ° C, preferably 15 to 40 ° C. As an example, the ligation reaction proceeds sufficiently in a reaction system having a pH of 6.8 to 7.8 containing 2% thiophenol in 6M guanidinium.

Ｎ置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの場合、ライゲーション現象は、ＣＯＳＲチオエステル要素とアミノアルキルチオール要素との間で起こるチオール交換によって生じる。この交換によりチオエステル結合中間ライゲーション生成物が生じ、該生成物は、５員環中間体を通過する自発転位の後、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−Ｃ（Ｏ）−Ｎα（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｊ２ を有する第一のライゲーション生成物を生じ、この生成物は、ライゲーション部位に除去できるＮ置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］を有する。ここで、置換基は前記のとおりである。ライゲーション部位にあるＮ置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］は、ペプチドに適合する条件下で除去されやすく、ライゲーション部位に天然アミド結合を有する、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（Ｚ２）−ＣＯ−Ｊ２ の最終ライゲーション生成物を生じる。 In the case of N-substituted 2-carbon chain alkyl or aryl thiols, the ligation phenomenon occurs by thiol exchange that occurs between the COSR thioester element and the aminoalkyl thiol element. This exchange yields a thioester-linked intermediate ligation product that, after spontaneous rearrangement through a 5-membered ring intermediate, is of formula J1-HN—CH (Z1) —C (O) —Nα (C1 (R1 ) -C2-SH) -CH (Z2) -J2 resulting in a first ligation product, which is an N-substituted 2-carbon chain alkyl or aryl thiol [HS-C2-C1 (HS R1)-]. Here, the substituents are as described above. An N-substituted 2-carbon chain alkyl or aryl thiol [HS-C2-C1 (R1)-] at the ligation site is easily removed under conditions compatible with the peptide and has a natural amide bond at the ligation site. The final ligation product of —CH (Z1) —CO—NH—CH (Z2) —CO—J2 is produced.

Ｎ置換３炭素鎖アリールまたはアルキルチオールの場合、ＣＯＳＲチオエステル要素とアミノアルキルチオール要素との間のチオール交換によって、チオエステル結合中間ライゲーション生成物が生じ、該生成物は、６員環中間体を通過する自発転位の後、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−Ｃ（Ｏ）−Ｎα（Ｃ１−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｊ２ を有する第一のライゲーション生成物を生じ、この生成物は、ライゲーション部位に除去できるＮ置換３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−］を有する。ライゲーション部位にあるＮ置換３炭素鎖アリールチオール［ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−］は、ペプチドに適合する条件下で除去されやすく、ライゲーション部位に天然アミド結合を有する、式 Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（Ｚ２）−ＣＯ−Ｊ２ の最終ライゲーション生成物を生じる。 In the case of an N-substituted three carbon chain aryl or alkyl thiol, a thiol exchange between the COSR thioester element and the aminoalkyl thiol element yields a thioester-linked intermediate ligation product that passes through a 6-membered ring intermediate. After spontaneous rearrangement, a first ligation formation having the formula J1-HN-CH (Z1) -C (O) -N [alpha] (C1-C2 (R2) -C3 (R3) -SH) -CH (Z2) -J2 This product has an N-substituted 3-carbon chain alkyl or aryl thiol [HS-C3 (R3) -C2 (R2) -C1 (R1)-] that can be removed at the ligation site. The N-substituted 3-carbon chain aryl thiol [HS-C3 (R3) -C2 (R2) -C1 (R1)-] at the ligation site is easily removed under conditions compatible with the peptide, and a natural amide bond is added to the ligation site. Having a final ligation product of formula J1-HN-CH (Z1) -CO-NH-CH (Z2) -CO-J2.

Ｎ置換アルキルまたはアリールチオール基の除去は、好ましくは、Ｎ−Ｃ１結合の開裂を促進する酸性条件下で実施し、ライゲーション部位に安定化された非置換アミド結合を生じるようにする。"ペプチドに適合する開裂条件"という言葉は、ペプチドに適合し、またライゲーション生成物からのＮ結合アルキルまたはアリールチオール成分の開裂に適した物理化学的条件を意味するものとする。ペプチドに適合する開裂条件は、一般に、使用するＮαアルキルまたはアリールチオール成分に合わせて選択する。これらの成分は、定型的な周知の方法によって容易に誘導することができる（たとえば、"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９；ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ． Ｃａｔａｌｏｇ ２０００；"Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅｒ'ｓ Ｇｕｉｄｅ，"Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９２；"Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ ＆ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，"Ｗ．Ｄ．．Ｂｅｎｎｅｔ，Ｊ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．Ｋ．Ｈａｍａｋｅｒ，Ｍ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．Ｒｈｏｄｅｓ，ａｎｄ Ｈ．Ｈ．Ｓａｎｅｉｉ，Ｅｄｓ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ，１９９８；"Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，"Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９３；"Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，"Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ａｎｄ Ａ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９４；"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ，"Ｐ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ，Ｅｄ．，Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９４，を参照されたい）。 Removal of the N-substituted alkyl or aryl thiol group is preferably performed under acidic conditions that promote cleavage of the N-C1 bond, resulting in a stabilized unsubstituted amide bond at the ligation site. The term “cleavage conditions compatible with the peptide” shall mean physicochemical conditions compatible with the peptide and suitable for cleavage of the N-linked alkyl or aryl thiol component from the ligation product. Cleavage conditions compatible with the peptide are generally selected for the Nα alkyl or aryl thiol component used. These components can be easily derived by routine well-known methods (eg, “Protecting Groups in Organic Synthesis” 3rd Edition, TW Greene and PGM Wuts, Eds., John). Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem. Catalog 2000; "Synthetic Peptides, A User's Guide," GA Grant, Ed., WH Freeman & Company, NewYork; Advanced Chemtech Handbook of Combination & Solid Phase Organic Chemistry, “WD Bennett, JW Christensen, LK Hamaker, ML Peterson, MR Rhodes, and HH Saneii, Eds., Advanced Chemntech, 1998; ed., “M. Bodanzsky, Ed., Springer-Verlag, 1993;“ The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed., ”M. Bodanzky and A. Bodanzaky, Eds. "PJ Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stu tgart, Germany, 1994, see).

たとえば、Ｒ１'、Ｒ２'、またはＲ３'置換基が、メトキシ、ヒドロキシル、チオールまたはチオメチル、メチル、及びその他から成る場合、除去のためのより汎用的な方法は、ペプチド合成化学において一般的な酸性開裂条件を含む。この条件は、強酸性条件下または水−酸の条件下で、還元剤及び／またはスカベンジャー系（たとえば、酸、たとえば無水フッ化水素（ＨＦ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、またはトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）、その他）ありまたはなしで、Ｎ−Ｃ１結合を開裂させることを含む。それぞれの酸性開裂系は、所定の構造のためにアリールまたはアルキルチオール成分を除去するために、Ｎα−Ｃ１結合の開裂が最適化されるように選択することができる。そのような条件は、周知であり、ペプチドの完全性を維持するのに適合したものである。開裂のための別の方法においては、ペプチドまたはポリへプチド配列にトリプトファンが存在する場合にチオールスカベンジャーを使用し、トリプトファン側鎖と遊離したアリールまたはアルキルチオール成分との反応が起こらないようにする。チオールスカベンジャーの例としては、エタンジオール、システイン、β−メルカプトエタノール、及びチオクレゾールがある。したがって、本発明の別の実施形態は、アリールまたはアルキルチオール成分を除去するためにＮ−Ｃ１結合を開裂させる場合に、チオールスカベンジャーの添加を含むものである。 For example, if the R1 ′, R2 ′, or R3 ′ substituent consists of methoxy, hydroxyl, thiol or thiomethyl, methyl, and others, a more versatile method for removal is the acidity common in peptide synthesis chemistry. Includes cleavage conditions. This condition can be achieved under strongly acidic conditions or water-acid conditions, such as reducing agents and / or scavenger systems (eg, acids such as anhydrous hydrogen fluoride (HF), trifluoroacetic acid (TFA), or trifluoromethanesulfonic acid). (TFMSA), etc.) with or without N-C1 bond cleavage. Each acidic cleavage system can be selected such that cleavage of the Nα-C1 bond is optimized to remove the aryl or alkyl thiol component for a given structure. Such conditions are well known and are adapted to maintain peptide integrity. In another method for cleavage, a thiol scavenger is used when tryptophan is present in the peptide or polypeptide sequence to prevent reaction of the tryptophan side chain with the free aryl or alkyl thiol moiety. Examples of thiol scavengers are ethanediol, cysteine, β-mercaptoethanol, and thiocresol. Thus, another embodiment of the invention involves the addition of a thiol scavenger when cleaving the N-C1 bond to remove the aryl or alkyl thiol component.

その他の特別の開裂条件は、ピコリル基が置換基である場合、光または還元開裂条件を含む。一例として、Ｒ１、またはＲ２及びＲ３置換基がピコリル成分から成る場合、光分解（たとえば、紫外線）、亜鉛／酢酸または電解還元を、標準的な手順に従う開裂に使用することができる。Ｎ置換２炭素鎖チオールのＲ１がＲ１にあるチオメタンから成る場合、水銀（ＩＩ）またはＨＦ開裂が使用できる。この開裂系は、また、第一または第二のライゲーション要素が他の保護基を有する場合、固体支持体からの同時開裂のため、及び／または脱保護反応物質として、使用することができる。たとえば、Ｎ−ピコリル基は、活性化亜鉛（〜０．５ｇ／ｍｌ）を含む１０％酢酸／水溶液にポリペプチドを溶解させることによって除去することができる。チオメタン基たとえば２−メルカプト，１−メチルスルフィニルエタン基（ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３）−Ｎα）は、ライゲーションの後、還元及び水銀、メルカプタン仲介開裂によって除去することができる。一例として、メチルスルフィニルエタン基は、チオメタン形への還元のために、Ｎ−メチルメルカプトアセトアミド（ＭＭＡ）を含む３％酢酸水溶液にポリペプチドを溶解させ（たとえば、０．５ｍｌの酢酸／水と０．０５ｍｌのＭＭＡとに１ｍｇのポリペプチド）、一晩の反応後、混合物を凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）することによって除去することができる。その後、還元された補助基を、酢酸水銀（Ｈｇ（ＯＡＣ）₂）を含む３％水溶液中で（たとえば、水に０．５ｍｌの酢酸を加えた溶液に１０ｍｇのＨｇ（ＯＡＣ）₂を添加したものに、約１時間）処理してから、β−メルカプトエタノール（たとえば、０．２ｍｌのβメルカプトエタノール）を添加することによって、除去することができる。次に、生成物を、標準的な方法たとえば逆相ＨＰＬＣ（ＲＰＨＰＬＣ）によって精製することができる。 Other special cleavage conditions include photo or reductive cleavage conditions when the picolyl group is a substituent. As an example, if R1, or the R2 and R3 substituents consist of a picolyl moiety, photolysis (eg, UV), zinc / acetic acid or electroreduction can be used for cleavage according to standard procedures. Mercury (II) or HF cleavage can be used when the N-substituted two carbon chain thiol R1 consists of thiomethane in R1. This cleavage system can also be used for simultaneous cleavage from a solid support and / or as a deprotection reactant when the first or second ligation element has other protecting groups. For example, the N-picolyl group can be removed by dissolving the polypeptide in a 10% acetic acid / water solution containing activated zinc (˜0.5 g / ml). Thiomethane groups such as 2-mercapto, 1-methylsulfinylethane group (HS-C2-C1 (S (O) -CH3) -Nα) can be removed after ligation by reduction and mercury, mercaptan mediated cleavage. As an example, a methylsulfinylethane group can be prepared by dissolving a polypeptide in a 3% aqueous acetic acid solution containing N-methylmercaptoacetamide (MMA) for reduction to the thiomethane form (eg, 0.5 ml acetic acid / water plus 0%). (1 mg polypeptide in .05 ml MMA), after overnight reaction, the mixture can be removed by lyophilization and lyophilization. The reduced auxiliary group was then added in a 3% aqueous solution containing mercury acetate (Hg (OAC) ₂ ) (eg, 10 mg Hg (OAC) ₂ was added to a solution of 0.5 ml acetic acid in water. It can be removed by treating it with about 1 hour and then adding β-mercaptoethanol (eg, 0.2 ml of β-mercaptoethanol). The product can then be purified by standard methods such as reverse phase HPLC (RPHPLC).

容易に理解しうるであろうが、開裂系には、一つ以上の触媒及び／または賦形剤、たとえば一つ以上のスカベンジャー、界面活性剤、溶剤、金属、その他をも使用することができる。一般に、特定スカベンジャーの選択は存在するアミノ酸に応じてなされる。たとえば、スカベンジャーの存在は、開裂時に生じるカルボニウムイオンがある種のアミノ酸（たとえば、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒ）に対して及ぼしうる損傷効果を抑えるために、使用することができる。その他の添加剤たとえば界面活性剤、ポリマー、塩、有機溶剤、その他も、溶解度を調節して開裂を改善するために使用することができる。レドックス系を調節する触媒その他の化学物質も、有効なものでありうる。また、容易に理解しうるように、いろいろな他の物理−化学的条件たとえば緩衝系、ｐＨ、及び温度を通常のように調節して、所定の開裂系を最適化することができる。 As will be readily appreciated, the cleavage system may also use one or more catalysts and / or excipients, such as one or more scavengers, surfactants, solvents, metals, etc. . In general, the selection of a particular scavenger is made according to the amino acids present. For example, the presence of scavengers can be used to reduce the damaging effects that can be exerted on certain amino acids (eg, Met, Cys, Trp, and Tyr) by the carbonium ions that occur upon cleavage. Other additives such as surfactants, polymers, salts, organic solvents, etc. can also be used to adjust the solubility and improve cleavage. Catalysts and other chemicals that regulate the redox system may also be effective. Also, as can be readily appreciated, various other physico-chemical conditions such as buffer systems, pH, and temperature can be adjusted as usual to optimize a given cleavage system.

本発明は、また、保護された形の、本発明のＮα置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールを与える。これらの化合物は、自動ペプチド合成ならびに直交及び収束（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ａｎｄ ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ）ライゲーション法において、特に有用である。これらの化合物は、下記の表ＩＩＩ及び表ＩＶに示す、式 （ＰＧ２）Ｓ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−Ｎα（ＰＧ１）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ または （ＰＧ２）Ｓ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−Ｎα（ＰＧ１）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２ の、完全保護、部分保護、または完全非保護酸安定Ｎα置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールから成る。特に、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち一つ以上がＣ１に複合した電子供与基を有し、該基は、Ｎα置換アミノアルキルまたはアリールチオールの、Ｎα置換アミドアルキルまたはアリールチオールへの転化の後、Ｃ１において共鳴安定陽イオンを形成することができ、該イオンはペプチドに適合する開裂条件下でＮα−Ｃ１結合の開裂を促進する。ＰＧ１及びＰＧ２は保護基であって、これらは個別または組合せで存在し、あるいは存在しない場合もあり、同じかまたは異なるものであることができる。ここで、Ｚ２は、化学的ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の化学成分であり、またここで、Ｊ２は、化学的ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の化学成分である。 The present invention also provides protected forms of the Nα substituted 2 or 3 carbon chain alkyl or aryl thiols of the present invention. These compounds are particularly useful in automated peptide synthesis and orthogonal and convergent ligation methods. These compounds have the formula (PG2) S-C2-C1 (R1) -N [alpha] (PG1) -CH (Z2) -C (O) -J2 or (PG2) S- shown in Table III and Table IV below. C3 (R3) -C2 (R2) -C1 (R1) -Nα (PG1) -CH (Z2) -C (O) -J2 fully protected, partially protected, or fully unprotected acid stable Nα substituted 2 or 3 Consists of carbon chain aminoalkyl or aryl thiol. In particular, one or more of R 1, R 2, and R 3 have an electron donating group conjugated to C 1, which group after conversion of an Nα-substituted aminoalkyl or aryl thiol to an Nα-substituted amidoalkyl or aryl thiol. , C1 can form a resonance stable cation that promotes cleavage of the Nα-C1 bond under cleavage conditions compatible with the peptide. PG1 and PG2 are protecting groups, which may be present individually or in combination, may or may not be present, and can be the same or different. Where Z2 is any chemical moiety compatible with chemical peptide synthesis or extended natural chemical ligation, and where J2 is any chemical moiety compatible with chemical peptide synthesis or extended natural chemical ligation. It is a chemical component.

ＰＧ１（またはＸ１）は、アミンを保護するための基である。ＰＧ２（またはＸ２）は、チオールを保護するための基である。多くのそのような保護基が公知であり、ここでの目的のために適当である（たとえば、"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９；ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ． Ｃａｔａｌｏｇ ２０００；"Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅｒ'ｓ Ｇｕｉｄｅ，"Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９２；"Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ ＆ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，"Ｗ．Ｄ．．Ｂｅｎｎｅｔ，Ｊ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．Ｋ．Ｈａｍａｋｅｒ，Ｍ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．Ｒｈｏｄｅｓ，ａｎｄ Ｈ．Ｈ．Ｓａｎｅｉｉ，Ｅｄｓ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ，１９９８；"Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，"Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９３；"Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，"Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ａｎｄ Ａ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９４；"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ，"Ｐ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ，Ｅｄ．，Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９４，を参照されたい）。 PG1 (or X1) is a group for protecting an amine. PG2 (or X2) is a group for protecting a thiol. Many such protecting groups are known and suitable for purposes herein (eg, “Protecting Groups in Organic Synthesis”, 3rd Edition, TW Greene and PGM Wuts, Eds. , John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem. Catalog 2000; "Synthetic Peptides, A User's Guide," GA Grant, Ed., W. H. Freeman & N 1992; "Advanced Chemtech Handbook of Combination & Solid Phase Organic Chemistry," WD. Bennet, JW Christensen, LK Hamaker, ML Peterson, MR Rhodes, and H. H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; , "M. Bodanzsky, Ed., Springer-Verlag, 1993;" The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed., "M. Bodanzky and A. Bodanzky, Ed., Vrszky, Eds. P. J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stut gart, Germany, 1994, see).

ＰＧ１及びＸ１として好ましい保護基の単なる例示としては、［Ｂｏｃ（ｔ−ブチルカルバメート）、Ｔｒｏｃ（２，２，２，−トリクロロエチルカルバメート）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルカルバメート）、Ｂｒ−ＺまたはＣｌ−Ｚ（Ｂｒ−またはＣｌ−ベンジルカルバメート）、Ｄｄｅ（４，４，−ジメチル−２，６−ジオキソシクロエクス１−イリデン）、ＭｓＺ（４−メチルスルフィニルベンジルカルバメート）、Ｍｓｃ（２−メチルスルホエチルカルバメート）、Ｎｓｃ（４−ニトロフェニルエチルスルホニル−エチルオキシカルボニル）がある。好ましいＰＧ１及びＸ１保護基は、"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，"Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｗｕｔｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９９）から選択され、もっとも好ましいのはＦｍｏｃ及びＮｓｃである。ＰＧ２として好ましい保護基の単なる例示としては、［Ａｃｍ（アセトアミドメチル）、ＭｅＯＢｚｌまたはＭｏｂ（ｐ−メトキシベンジル）、ＭｅＢｚｌ（ｐ−メチルベンジル）、Ｔｒｔ（トリチル）、Ｘａｎ（キサンテニル）、ｔＢｕｔｈｉｏ（ｓ−ｔ−ブチル）、Ｍｍｔ（ｐ−メトキシトリチル）、２または４ピコリル（２または４ピリジル）］、Ｆｍ（９−フルオレニルメチル）、ｔＢｕ（ｔ−ブチル）、Ｔａｃａｍ（トリメチルアセトアミドメチル）］がある。好ましい保護基ＰＧ２及びＸ２は、"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，"Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｗｕｔｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９９），から選択され、もっとも好ましいのは、Ａｃｍ、Ｍｏｂ、ＭｅＢｚｌ、ピコリルである。 Examples of preferred protecting groups for PG1 and X1 include [Boc (t-butyl carbamate), Troc (2,2,2, -trichloroethyl carbamate), Fmoc (9-fluorenylmethyl carbamate), Br-Z. Or Cl-Z (Br- or Cl-benzylcarbamate), Dde (4,4, -dimethyl-2,6-dioxocycloex1-ylidene), MsZ (4-methylsulfinylbenzylcarbamate), Msc (2- Methylsulfoethylcarbamate), Nsc (4-nitrophenylethylsulfonyl-ethyloxycarbonyl). Preferred PG1 and X1 protecting groups are selected from "Protective Groups in Organic Synthesis," Green and Wuts, Third Edition, Wiley-Interscience, (1999), most preferred are Fmoc and Nsc. Examples of preferred protecting groups for PG2 include [Acm (acetamidomethyl), MeOBzl or Mob (p-methoxybenzyl), MeBzl (p-methylbenzyl), Trt (trityl), Xan (xanthenyl), tButio (s- t-butyl), Mmt (p-methoxytrityl), 2 or 4 picolyl (2 or 4 pyridyl)], Fm (9-fluorenylmethyl), tBu (t-butyl), Tacam (trimethylacetamidomethyl)] is there. Preferred protecting groups PG2 and X2 are selected from "Protective Groups in Organic Synthesis," Green and Wuts, Third Edition, Wiley-Interscience, (1999), most preferred are Acm, Mob, MeBzl, and CoBl.

直交保護法は、異なる化学的機構によって除去される二つ以上の種または基を含み、したがって任意の順序で、他の種の存在下で、除去することができる。直交法は相当に穏やかな全体的条件の可能性を与える。選択性を、反応速度ではなく、化学的性質の違いにもとづいて実現できるからである。 Orthogonal protection methods involve two or more species or groups that are removed by different chemical mechanisms and can therefore be removed in any order in the presence of other species. The orthogonal method gives the possibility of a fairly mild overall condition. This is because the selectivity can be realized not based on the reaction rate but on the difference in chemical properties.

本発明の保護された形のＮα置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールは、前記の方法ＩまたはＩＩにしたがって生成することができる。 Protected forms of Nα substituted 2 or 3 carbon chain alkyl or aryl thiols of the present invention can be generated according to Methods I or II above.

図４は、二つの異なる１−フェニル−２−メルカプトエチル補助基を使用する、本発明のライゲーション方策の概要を示す。 FIG. 4 outlines the ligation strategy of the present invention using two different 1-phenyl-2-mercaptoethyl auxiliary groups.

図５Ａ及び５Ｂは、Ｎα−１−（４−メトキシフェニル）−２−メルカプトエチル補助基を使用する、実施例２１で述べるようなシトクロムｂ５６２に対するライゲーション反応に関する、分析高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の結果を示す。図５Ａは、時刻＝０におけるライゲーション反応の状態を示す。図５Ｂは、反応を一晩進行させたあとのライゲーションの状態を示す。また、図５Ｂに示されているように、Ｎα−１−（４−メトキシフェニル）−２−メルカプトエチル補助基のＣ１の非キラル中心から生じる二つのライゲーション生成物が観察される。 FIGS. 5A and 5B show analytical high performance liquid chromatography (HPLC) for ligation reaction to cytochrome b562 as described in Example 21, using the Nα-1- (4-methoxyphenyl) -2-mercaptoethyl auxiliary group. Results are shown. FIG. 5A shows the state of the ligation reaction at time = 0. FIG. 5B shows the state of ligation after the reaction was allowed to proceed overnight. Also, as shown in FIG. 5B, two ligation products arising from the C1 achiral center of the Nα-1- (4-methoxyphenyl) -2-mercaptoethyl auxiliary group are observed.

図６Ａ及び６Ｂは、Ｎα−｛１−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタノ｝改質Ｎ末端セグメントとの拡張天然型化学的ライゲーションを使用することによって生成されたライゲーション生成物シトクロムｂ５６２残基１−１０６の再構成エレクトロスプレー（ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）質量分析（ＭＳ）の結果を示す。Ｃ末端αチオエステルを有するシトクロムｂ５６２残基１−６３が、Ｎ末端Ｎα−｛１−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタノ｝グリシンを有するシトクロムｂ５６２残基６４−１０６と結合している。図６Ａは、ライゲーション部位に除去できるＮα−｛１−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタノ｝基を有する初期ライゲーション生成物のＭＳ再構成を示す。図６Ｂは、ライゲーション部位に天然アミド結合を生成させるためにＮα−｛１−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタノ｝基を除去するフッ化水素（ＨＦ）処理後のライゲーション生成物のＭＳ再構成を示す。測定された質量は、１１９４８±１Ｄａ（ＨＦ処理前）及び１１７８１±１Ｄａ（ＨＦ処理後）であって、損失は１６７±２Ｄａであり、これは、１−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタノ補助基の除去に関して予想される１６６Ｄａの損失とよく一致している。 6A and 6B show the ligation product cytochrome b562 residue generated by using extended natural chemical ligation with Nα- {1- (4-methoxyphenyl) 2-mercaptoethano} modified N-terminal segment. 1-106 shows the results of reconstructed electrospray mass spectrometry (MS) of 1-106. Cytochrome b562 residue 1-63 with C-terminal α-thioester is linked to cytochrome b562 residue 64-106 with N-terminal Nα- {1- (4-methoxyphenyl) 2-mercaptoethano} glycine. FIG. 6A shows the MS reconstitution of the initial ligation product with a Nα- {1- (4-methoxyphenyl) 2-mercaptoethano} group that can be removed at the ligation site. FIG. 6B shows the MS reactivation of the ligation product after treatment with hydrogen fluoride (HF) to remove the Nα- {1- (4-methoxyphenyl) 2-mercaptoethano} group to form a natural amide bond at the ligation site. The configuration is shown. The measured masses are 11948 ± 1 Da (before HF treatment) and 11781 ± 1 Da (after HF treatment) with a loss of 167 ± 2 Da, which is 1- (4-methoxyphenyl) 2-mercaptoethanol This is in good agreement with the expected loss of 166 Da for removal of auxiliary groups.

図７Ａ及び７Ｂは、図６Ｂに示す直鎖状シトクロムｂ５６２物質の代表的な分析ＨＰＬＣの結果（図７Ａ）、及び折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）後の該物質のイオン交換クロマトグラム（図７Ｂ）を示す。 FIGS. 7A and 7B show representative analytical HPLC results (FIG. 7A) of the linear cytochrome b562 material shown in FIG. 6B, and an ion exchange chromatogram (FIG. 7B) of the material after folding.

本発明の化合物は、いろいろな手段のいずれか、たとえばハロゲン仲介アミノアルキル化、還元アミノ化によって、また固相または溶液アミノ酸またはペプチド合成法に適合する、Ｎα保護、Ｎアルキル化、Ｓ保護、アミノアルキルまたはアリールチオールアミノ酸前駆体を用いることによって生成することができる。必要な場合には、許容されるキラル純度の化合物を与えるために、生成されるラセミ混合物またはジアステレオマーの分離を、標準的な方法によって実施することができる。 The compounds of the present invention may be synthesized by any of a variety of means such as halogen-mediated aminoalkylation, reductive amination, and compatible with solid phase or solution amino acid or peptide synthesis methods, Nα protection, N alkylation, S protection, amino It can be produced by using an alkyl or aryl thiol amino acid precursor. If necessary, separation of the resulting racemic mixture or diastereomer can be carried out by standard methods to give compounds of acceptable chiral purity.

上述のように、場合によっては、許容されるキラル純度のＮα置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールが好ましい。実施例２１及び図５Ｂに示すように、シトクロムｂ５６２の生成におけるＮα−１−（４−メトキシフェニル）−２−メルカプトエチル補助基の使用により、精製プロファイルの重なった二つのライゲーション生成物（ジアステレオマー）が生じた。Ｎα補助基の除去により、単一の主生成物が生じるが、小さなパーセンテージの欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）と副反応生成物とが最終生成物に存在し、これは好ましくないと思われる。たとえば、ｃｙｔ ｂ５６２の合成に使用するＮα−１−（４−メトキシフェニル）−２−メルカプトエチル補助基の合成に使用される実施例４〜６に述べるような還元アミノ化合成法の場合、必ず、キラル中心Ｃ１に二つのエピマーの生成がもたらされる。必要な場合、前記のように、許容されるキラル純度の化合物を与えるために、生成されるラセミ混合物及びジアステレオマーの分離を、標準的な方法によって実施することができる。 As noted above, in some cases, an acceptable chiral purity Nα substituted 2 or 3 carbon chain alkyl or aryl thiol is preferred. As shown in Example 21 and FIG. 5B, the use of the Nα-1- (4-methoxyphenyl) -2-mercaptoethyl auxiliary group in the production of cytochrome b562 resulted in two ligation products with overlapping purification profiles (diastereo ). Removal of the Nα auxiliary group yields a single major product, but a small percentage of deletions and side reaction products are present in the final product, which seems undesirable. For example, in the case of the reductive amination synthesis method as described in Examples 4 to 6 used for the synthesis of Nα-1- (4-methoxyphenyl) -2-mercaptoethyl auxiliary group used for the synthesis of cyt b562, , Resulting in the formation of two epimers at chiral center C1. If necessary, separation of the resulting racemic mixture and diastereomers can be carried out by standard methods, as described above, to give compounds of acceptable chiral purity.

許容されるキラル純度の本発明のＮα補助基を得るための標準的な方法は、（１）キラルクロマトグラフィー、（２）キラル合成、（３）共有ジアステレオマー抱合体の使用、及び（４）鏡像体的に純粋なキラル補助基を与えるための結晶化または他の通常の分離法、である。（たとえば、Ａｈｕｊａ，Ｓａｔｉｎｄｅｒ．'Ｃｈｉｒａｌ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．'ＡＣＳ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．（１９９１），４７１（Ｃｈｉｒａｌ Ｓｅｐ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），１−２６；Ｃｏｌｌｅｔ，Ａｎｄｒｅ．"Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ ｂｙ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ，"Ｉｎ：Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ（１９９９）４：１５７−１７２；Ｌｏｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｍｉｎｉｐｐｒｉｎｔ（１９８４）１０：２９３０−２９６２；Ｌｏｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．（１９８４）１０：２９５３−２９７３；Ａｈｕｊａ，Ｓａｔｉｎｄｅｒ．'Ｃｈｉｒａｌ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．'Ｃｈｉｒａｌ Ｓｅｐ．（１９９７），１−７；Ｃｈｉｒａｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ａｈｕｊａ Ｓａｔｉｎｄｅｒ；Ｅｄｉｔｏｒ．ＵＳＡ．（１９９７），３４９ｐｐ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：（ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）を参照されたい）。これらの標準的な方法のやり方はすべて、許容されるキラル純度の化合物を得るために、ラセミ混合物またはジアステレオマーの分離に使用することができる。たとえば、結晶化を、鏡像体（鏡像異性体）の光学的分離のために使用することができる。キラルクロマトグラフィーの場合、周知のように、ラセミ混合物を、キラル媒質を使用する分離（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）クロマトグラフィーによって、キラル的に純粋な鏡像体に分離することができる。たとえば、キラルＮα補助基の全体的合成のための還元アミノ化法によって生成されるラセミ混合物を使用して、キラル的に純粋な形のそれぞれの鏡像体を生成することができる。これは、たとえば、下にアミノ酸補助基に関して示すように、なされる（ここでＲは、たとえば、アミノ酸側鎖である）。

Standard methods for obtaining the Nα auxiliary groups of the present invention of acceptable chiral purity are (1) chiral chromatography, (2) chiral synthesis, (3) use of covalent diastereomeric conjugates, and (4 ) Crystallization or other conventional separation methods to give enantiomerically pure chiral auxiliary groups. (For example, Ahuja, Sainder. 'Chiral separations. An overview.' ACS Symp. Ser. (1991), 471 (Chiral Sep. Liq. Chromatogr.) And 1-26; Collet, Andre. Crystallization Methods, "In: Enantiomer (1999) 4: 157-172; Lopata et al., J. Chem. Res. Miniprint (1984) 10: 2930-2962; Lopata et al., J. Chem. ) 10: 2953-2973; Ahuja, Satinder.'Chirals (Parts and technology: an overview.'Chiral Sep. (1997), 1-7; Chiral Separations: Applications and Technology. Ahuja Sat., 1997. USA.P. ) All of these standard method approaches can be used to separate racemic mixtures or diastereomers to obtain compounds of acceptable chiral purity. For example, crystallization can be used for optical separation of enantiomers (enantiomers). In the case of chiral chromatography, as is well known, racemic mixtures can be separated into chirally pure enantiomers by preparative chromatography using a chiral medium. For example, racemic mixtures produced by reductive amination methods for the overall synthesis of chiral Nα auxiliary groups can be used to produce each enantiomer in chirally pure form. This is done, for example, as shown below for amino acid auxiliary groups (where R is, for example, an amino acid side chain).

どちらか一方の鏡像体をキラル的に純粋の形で得ることができ、あるいは両方をキラル的に純粋の形で得ることができる。どちらの鏡像体も、キラル的に純粋な補助基で改質した要素たとえばペプチドセグメント（すなわち、二つのキラル的に純粋なエピマー）の生成に使用することができ、これらの要素は、他のエピマー及び不純物の存在による妨害なしで厳重に精製することができる。両方の鏡像体を使用するという何らかの備えがなされない限り、補助基の全量の５０％が無駄になるということに注意されたい。このとき、たとえば、二つのキラル的に純粋な補助基で改質されたペプチドセグメントを、別々のＥＮＣＬ反応に使用して、キラル的に純粋な補助基で改質されたライゲーション生成物の混合物を得ることができる。分離精製の後、補助基をエピマーライゲーション生成物から除去し（個別に、または化合させたあと）、同じ天然構造のライゲーション生成物を得る。その後、これを精製する。 Either one of the enantiomers can be obtained in chirally pure form, or both can be obtained in chirally pure form. Both enantiomers can be used to generate elements modified with chirally pure auxiliary groups, such as peptide segments (ie, two chirally pure epimers), which elements And can be purified rigorously without interference due to the presence of impurities. Note that 50% of the total amount of auxiliary groups is wasted unless some provision is made to use both enantiomers. In this case, for example, peptide segments modified with two chirally pure auxiliary groups are used in separate ENCL reactions to produce a mixture of ligation products modified with chirally pure auxiliary groups. Obtainable. After separation and purification, the auxiliary groups are removed from the epimer ligation product (either individually or after combination) to obtain a ligation product of the same natural structure. Then it is purified.

キラル合成の場合、好ましい方法においては、鏡像体的に純粋なキラル出発材料を使用する。これを、下にパラ−メトキシフェニル置換Ｎα−２炭素補助基に関して示す。

得られるキラル的に純粋な前駆体化合物を、次に、どちらかの保護された（Ｎ置換）アミノ酸を作るために使用することができる。すなわち、下記のようである。

または、前記化合物を、直接に'サブモノマー'ペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄ）法で使用して、ポリマー支持体上に補助基で改質したペプチドを生成させることができる。すなわち、下記のようである。

その後の脱保護／開裂により、キラル的に純粋な形の補助基改質ペプチドセグメントが得られる。すなわち、下記のようである。

たとえば、本発明のキラル的に純粋なＮα補助基を、容易に得られるキラリティー既知のパラ置換フェニルグリシンから作ることができる。この場合、キラリティーが既知なので、得られる補助基のキラリティーとキラル純度をあらかじめ見積もることができる。 For chiral synthesis, the preferred method uses enantiomerically pure chiral starting materials. This is shown below for the para-methoxyphenyl substituted Nα-2 carbon auxiliary group.

The resulting chirally pure precursor compound can then be used to make either protected (N-substituted) amino acid. That is, it is as follows.

Alternatively, the compounds can be used directly in the 'submonomer' peptoid method to produce peptides modified with auxiliary groups on a polymer support. That is, it is as follows.

Subsequent deprotection / cleavage yields an auxiliary group modified peptide segment in chirally pure form. That is, it is as follows.

For example, the chirally pure Nα auxiliary groups of the present invention can be made from para-substituted phenylglycines of known chirality that are readily obtained. In this case, since the chirality is known, the chirality and chiral purity of the resulting auxiliary group can be estimated in advance.

あるいは、別の好ましい実施形態では、非対称還元を使用して補助基を生成させる鏡像体選択合成を使用する。たとえば、下記のようである。

非対称還元は、Ｎα補助基改質アミノ酸を生成させるための鏡像体選択合成にも使用することができる。たとえば、グリシンの場合、下記のようである。

適当に実施された非対称合成の場合、一つの鏡像体が他の鏡像体に対してかなり過剰に生成されるが、それでもかなりの量の他の鏡像体が存在すると予想される。後者は、純粋な形の主要鏡像体を得るためのキラル精製ステップにより処理することができる。鏡像体選択合成法の主要な利点は、キラルクロマトグラフィー分離が容易であり、また大量の材料が廃棄（浪費）されない、ということである。 Alternatively, another preferred embodiment uses an enantioselective synthesis that uses asymmetric reduction to generate auxiliary groups. For example:

Asymmetric reduction can also be used for enantioselective synthesis to generate Nα auxiliary group modified amino acids. For example, in the case of glycine, it is as follows.

With a properly implemented asymmetric synthesis, one enantiomer is produced in considerable excess relative to the other, but it is still expected that there will be a significant amount of other enantiomers. The latter can be processed by a chiral purification step to obtain the pure form of the main enantiomer. The main advantage of the enantioselective synthesis method is that chiral chromatographic separation is easy and a large amount of material is not wasted (wasted).

もう一つの好ましい標準的方法は、共有ジアステレオマー抱合体を使用する分離である。一般に、この方法では、たとえば下記のように、キラルアミノ酸（たとえば、Ａｌａ）を使用して、ラセミ補助基混合物を改質し、また標準的な（非キラル）クロマトグラフィー法により生成されたジアステレオマーを分離する。たとえば、ラセミ補助基１を、第二のキラル中心の共有取り込みにより、ジアステレオマーの混合物に転化させることができる。すなわち、下記のようである。

この場合、ラセミ混合物は、ＳＮ求核反応（反転（ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）を伴う）によって、（Ｒ）２−Ｂｒ−プロピオン酸と反応し、示されている一対のジアステレオマーを生成する。ここでは、実際に、Ｎ結合キラルチオール含有補助基によって、Ｌ−Ａｌａを生成させた。 Another preferred standard method is separation using covalent diastereomeric conjugates. In general, this method modifies a racemic auxiliary group mixture using, for example, a chiral amino acid (eg, Ala), as described below, and produces a diastereoisomer produced by standard (non-chiral) chromatographic methods. Separate the mer. For example, racemic auxiliary group 1 can be converted to a mixture of diastereomers by covalent incorporation of a second chiral center. That is, it is as follows.

In this case, the racemic mixture reacts with (R) 2-Br-propionic acid via an SN nucleophilic reaction (with inversion) to produce the pair of diastereomers shown. Here, L-Ala was actually produced by an N-linked chiral thiol-containing auxiliary group.

一般に、これら二つの化合物は、ジアステレオマーとしては、非キラル（ａｃｈｒａｌ）クロマトグラフィー条件下で、異なるクロマトグラフィー挙動を示し、したがって実用的な分離条件下で分離して、純粋のエピマーを別々に得ることができる。Ｎα成分の適当な保護の後、それぞれの化合物を使用して、非保護または部分保護された、Ｎ末端Ａｌａ残基を有する、キラル的に純粋の補助基で改質されたペプチドセグメントを生成させることができる。 In general, these two compounds, as diastereomers, exhibit different chromatographic behaviors under achiral chromatographic conditions and are therefore separated under practical separation conditions to separate pure epimers separately. Obtainable. After appropriate protection of the Nα component, each compound is used to generate a peptide segment modified with a chirally pure auxiliary group having an N-terminal Ala residue that is unprotected or partially protected. be able to.

本発明の保護されたＮα置換要素は、通常のペプチド合成を使用する高速自動合成及びその他の有機合成法において、特に有効である。また、これらの要素は、化学的ライゲーションの使用を多要素ライゲーション法にまで拡張するものであり、たとえば、直交ライゲーション法、たとえば三つ以上のセグメントのライゲーション法または収束ライゲーション合成法、が関与するポリペプチドの生成の場合にまで拡張するものである。 The protected Na-substitution element of the present invention is particularly effective in high speed automated synthesis using conventional peptide synthesis and other organic synthesis methods. These elements also extend the use of chemical ligation to multi-element ligation methods, such as orthogonal ligation methods such as ligation methods of three or more segments or convergent ligation synthesis methods. It extends to the case of peptide production.

たとえば、本発明の拡張天然型化学的ライゲーション法と組成物とは、求核物質に対して安定なチオエステル生成法及びチオエステル安全捕捉（ｓａｆｅｔｙ ｃａｔｃｈ）法と組合わせて、たとえば本願と同時係属中のＰＣＴ出願番号［未付与］明細書（２００１年８月３１日出願）、及び米国仮特許出願第６０／２２９，２９５号明細書（２０００年９月１日出願）に記載されているオルトチオロエステル及びカルボキシエステルチオールとともに、使用することができる。なお、これらの明細書は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。簡単に言えば、求核物質に対して安定なチオエステル生成化合物は、オルトチオロエステルまたはカルボキシエステルチオールから成り、これらの化合物は、有機合成、たとえばペプチドチオエステル、ポリペプチドチオエステル、及びその他のポリマーチオエステルの生成、において幅広い用途を有する。求核物質に対して安定なチオエステル生成化合物は、強力な求核物質（たとえば、Ｆｍｏｃ ＳＰＰＳによって生成されたペプチドまたはポリペプチド）が使用される条件下で生成される前駆体から活性化チオエステルを生成させる場合、また意図する特定のライゲーションまたは複合反応を導くための両立する選択保護法が必要な（または、その使用により利益を受ける）多段階ライゲーションまたは複合法の場合に、特に有用である。求核物質に対して安定なオルトチオロエステルは、式 Ｘ−Ｃ（ＯＲ'）₂−Ｓ−Ｒ を有し、ここでＸは、意図する標的分子であり、随意に一つ以上の求核物質によって開裂することのできる保護基を有し、Ｒ'は、非求核開裂条件下で除去することのできる求核物質に対して安定な保護基であり、Ｒは、オルトチオロエステル−Ｃ（ＯＲ'）−Ｓ−に適合する任意の基である。求核物質に対して安定なオルトチオロエステルチオエステル生成樹脂も存在し、これは、式 Ｘ−Ｃ（ＯＲ'）₂−Ｓ−Ｒ−リンカー−樹脂 または Ｘ−Ｃ（（ＯＲ₁'−リンカー−樹脂（ＯＲ₂'））−ＳＲ を有する。ここで、Ｘ、Ｒ'、及びＲは、前記のとおりであり、リンカーと樹脂は、固相有機合成で使用するのに適当な求核物質に対して安定な任意のリンカーと樹脂、たとえば、後で開裂のために求核物質に対して不安定なリンカーに転化させることのできる安全捕捉リンカーである。求核物質に対して安定なオルトチオロエステルは、いろいろな非求核条件たとえば酸加水分解条件によって、活性チオエステルに転化させることができる。求核物質に対して安定なカルボキシエステルチオールは、式 Ｘ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ（Ｒ''）−（ＣＨ₂）_n−Ｓ−Ｒ''' を有し、ここでＸは、求核物質に対して不安定な保護基を一つ以上有する、意図する標的分子であり、Ｒ''は、非求核物質に対して安定な基であり、ｎは、１または２であり、ｎ＝１が好ましく、Ｒ'''は、水素、保護基、または、非求核条件下で除去できる、樹脂または保護基に結合した、酸もしくは還元不安定なリンカーもしくは安全捕捉リンカーである。求核物質に対して安定なカルボキシエステルチオール基材のチオエステル生成樹脂も存在して、式 Ｘ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ（Ｒ''）−（ＣＨ₂）_n−Ｓ−リンカー−樹脂 または Ｘ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ（Ｒ''−リンカー−樹脂）−（ＣＨ₂）_n−Ｓ−Ｒ''' を有し、これらの式において、Ｘ、Ｒ''、ｎ、及びＲ'''は、前記のものであり、リンカー及び樹脂は、固相有機合成での使用に適した求核物質に対して安定な任意のリンカー及び樹脂である。この求核物質に対して安定なカルボキシエステルチオールは、チオール触媒、たとえばチオフェノール、の添加により、活性チオエステルに転化させることができる。したがって、本発明の拡張天然型化学的ライゲーション法と組成物は、多セグメントの収束ライゲーション法において使用することができる。このとき、標的化合物の一端が本発明の保護または非保護Ｎα−２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールを有することができ、他端が活性チオエステルへの後続の転化とライゲーションとのためのオルトチオロエステルまたはカルボキシエステルチオール成分を有することができる。 For example, the extended natural chemical ligation method and composition of the present invention can be combined with nucleophilic stable thioester production methods and thioester safety catch methods, for example, co-pending with this application. Orthothiolo described in PCT application number [unassigned] specification (filed on August 31, 2001) and US Provisional Patent Application No. 60 / 229,295 (filed on September 1, 2000) Can be used with esters and carboxy ester thiols. In addition, these specifications shall be integrated in this specification by reference. Briefly, nucleophilic stable thioester-generating compounds consist of orthothioloesters or carboxyester thiols, which are organic syntheses such as peptide thioesters, polypeptide thioesters, and other polymeric thioesters. Have a wide range of uses. Thioester generating compounds that are stable to nucleophiles generate activated thioesters from precursors generated under conditions where strong nucleophiles (eg, peptides or polypeptides generated by Fmoc SPPS) are used. And is particularly useful in the case of multi-step ligation or combination methods that require (or benefit from the use of) compatible selective protection methods to direct the intended specific ligation or combination reaction. Orthothioloesters that are stable to nucleophiles have the formula X—C (OR ′) ₂ —S—R, where X is the intended target molecule and optionally one or more Has a protecting group that can be cleaved by a nuclear material, R ′ is a nucleophile-stable protecting group that can be removed under non-nucleophilic cleavage conditions, and R is an orthothioloester Any group compatible with -C (OR ')-S-. Stable ortho thio b Este thioester-generating resin to nucleophilic substances present, which has the formula _{X-C (OR ') 2} -S-R- linker - resin or _{X-C ((OR 1'} - Linker - resin (oR ₂ ')) -. with the SR here, X, R', and R is the is as suitable nucleophiles for use in the linker and the resin, solid phase organic synthesis A safe capture linker that can be converted to any linker and resin that is stable to, eg, a nucleophile labile linker for later cleavage. Thioloesters can be converted to active thioesters by a variety of non-nucleophilic conditions, such as acid hydrolysis conditions.Carboxyester thiols that are stable to nucleophiles have the formula X—C (O) —O—. CH (R ″) − 'Has, where X has one or more labile protecting group to nucleophilic substance, is a target molecule _{intended, R' CH 2) n -S} -R ''' is non Resin that is a stable group for nucleophiles, n is 1 or 2, preferably n = 1, and R ′ ″ can be removed under hydrogen, protecting groups, or non-nucleophilic conditions Or an acid or reduction labile linker or a safe capture linker attached to a protecting group There is also a carboxyester thiol-based thioester generating resin that is stable to nucleophiles and has the formula X-C (O) -O-CH (R '') - (CH 2) n -S- linker - resin or X-C (O) -O- CH (R '' - linker - resin) - (CH _{2) n} -S- In these formulas, X, R ″, n, and R ′ ″ are as defined above, and the linker and resin are solid Any linker and resin that is stable to nucleophiles suitable for use in organic synthesis, which is active by the addition of a thiol catalyst, such as thiophenol. The extended natural chemical ligation method and composition of the present invention can therefore be used in a multi-segment convergent ligation method, where one end of the target compound is protected according to the present invention. Or it can have an unprotected Nα-2 or 3 carbon chain alkyl or aryl thiol and the other end can have an ortho thioloester or carboxyester thiol component for subsequent conversion and ligation to an active thioester .

やはり容易に理解しうるであろうが、本発明のＮα−２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールは、他のライゲーション法、たとえば天然型化学的ライゲーション（Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６：７７６−７７９；Ｋｅｎｔ ｅｔ．ａｌ．，ＷＯ ９６／３４８７８）、拡張された一般化学的ライゲーション（Ｋｅｎｔ ｅｔ．ａｌ．，ＷＯ９８／２８４３４）、オキシム生成化学的ライゲーション（Ｒｏｓｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，（１９９４）１１６：３０−３３）、チオエステル生成ライゲーション（Ｓｃｈｎｏｌｚｏｒ，ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：２２１−２２５）、チオエーテル生成化学的ライゲーション（Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｓｅｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｓ．（１９９５）３６（４８）：８８７１−８８７４）、ヒドラゾン生成ライゲーション（Ｇａｅｒｔｎｅｒ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）５（４）：３３３−３３８）、ならびにチアゾリジン生成ライゲーション及びオキサゾリジン生成ライゲーション（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９８）９５（１６）：９１８４−９１８９；Ｔａｍ ｅｔ．ａｌ．，ＷＯ９５／００８４６）、または他の方法（Ｙａｎ，Ｌ．Ｚ．ａｎｄ Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．，"Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｂｙ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ Ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ，"Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１，１２３，５２６−５３３（参照により本明細書に組み込むものとする。）；Ｇｉｅｓｅｌｎａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００１ ３（９）：１３３１−１３３４；Ｓａｘｏｎ，Ｅ．ｅｔ．ａｌ．，"Ｔｒａｃｅｌｅｓｓ" Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ａｍｉｄｅ Ｂｏｎｄｓ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０００，２，２１４１−２１４３）と組合せて、使用することができる。さらに、本発明で意図するのは、本発明のＮα−２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールにおいてチオールイオウをセレンで置換することである。 As will also be readily appreciated, the Nα-2 or 3 carbon chain alkyl or aryl thiols of the present invention may be synthesized by other ligation methods such as natural chemical ligation (Dawson et.al., Science (1994) 266). : 776- 779; Kent et.al., WO 96/34878), extended general chemical ligation (Kent et.al., WO 98/28434), oxime-generating chemical ligation (Rose et.al., J. MoI. Amer.Chem.Soc, (1994) 116: 30-33), thioester formation ligation (Schnolzor, et.al., Science (1992) 256: 221-225), thioether formation chemical ligation (Englebretse). , Et.al., Tet.Letts. (1995) 36 (48): 8871-8874), hydrazone production ligation (Gaertner, et.al., Bioconj. Chem. (1994) 5 (4): 333-338). , And thiazolidine- and oxazolidine-generating ligations (Zhang, et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1998) 95 (16): 9184-9189; Tam et.al., WO 95/00846), etc. (Yan, LZ and Dawson, P.E., "Synthesis of Peptides and Proteins without Kitchen Residues by Native Chemical Li ation Combined with Desulfurization, "J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 526-533 (incorporated herein by reference); Gieselnan et.al., Org.Lett. 2001 3 (9). 1331-1334; Saxon, E. et al., "Traceless" Stauder Ligation for the Chemoselective Synthesis of Bonds. Org. Lett. 2000, 2, 214-1143). Furthermore, it is contemplated by the present invention to replace thiol sulfur with selenium in the Nα-2 or 3 carbon chain alkyl or aryl thiols of the present invention.

本発明の方法と組成物は、多くの用途を有する。本発明の方法と組成物は、特に、ペプチド、ポリペプチド、及びその他のポリマーのライゲーションに有効である。実質的にすべてのアミノ酸、たとえば天然に産するアミノ酸及び非天然のアミノ酸及び誘導体において天然型化学的ライゲーションを実行しうる能力により、適正なシステインライゲーション部位を欠く標的に対する天然型化学的ライゲーションの範囲が拡大される。本発明は、また、ペプチドまたはポリペプチドセグメントのほか、ポリマー成分を、Ｎα置換アミド結合または全部天然のアミド結合を有するリンカーによってライゲーション部位に結合するのが望ましい場合に、そのような成分のライゲーションにも使用することができる。本発明は、また、発現たんぱく質ライゲーション（ＥＰＬ）用のいろいろな種類のペプチド標識の生成にも使用することができる。たとえば、ＥＰＬ生成チオエステルポリペプチドは、意図する最終用途に応じて、Ｎα置換アルキルもしくはアリールチオールアミド結合または完全に天然のアミド結合により、いろいろな種類のペプチドに結合させることができる。本発明は、また、システインを有しないペプチドまたはポリペプチドの場合でも、環化点（ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｏｉｎｔ）に天然アミド結合を有するいろいろな環状ペプチド及びポリペプチドの生成に使用することができる。これは、たとえば、大部分の環状ペプチド、たとえば産業標準規格に従って生成される抗生物質及びその他の薬剤、は、環化（すなわち、頭から尾まで）ライゲーション部位に天然アミド結合を形成するのに使用できるシステイン残基を有しないので、重要である。 The methods and compositions of the present invention have many uses. The methods and compositions of the present invention are particularly useful for ligation of peptides, polypeptides, and other polymers. The ability to perform natural chemical ligation on virtually all amino acids, such as naturally occurring and non-natural amino acids and derivatives, allows a range of natural chemical ligations to targets that lack the proper cysteine ligation site. Enlarged. The present invention also provides for the ligation of such components, in addition to peptide or polypeptide segments, where it is desirable to attach a polymer component to a ligation site via a linker with an Nα-substituted amide bond or an all-natural amide bond. Can also be used. The present invention can also be used to generate various types of peptide labels for expression protein ligation (EPL). For example, an EPL-generating thioester polypeptide can be conjugated to various types of peptides, depending on the intended end use, by Na-substituted alkyl or aryl thiol amide linkages or fully natural amide linkages. The present invention can also be used to generate various cyclic peptides and polypeptides having a natural amide bond at the cyclization point, even in the case of peptides or polypeptides that do not have cysteine. This means, for example, that most cyclic peptides, such as antibiotics and other drugs produced according to industry standards, are used to form a natural amide bond at the cyclization (ie head to tail) ligation site. It is important because it has no cysteine residues that can be made.

本明細書で挙げるすべての公刊物及び特許明細書は、それぞれの公刊物及び特許明細書が個別に参照により本明細書に組み込まれると述べるのと同様に、参照により本明細書に組み込まれるものとする。 All publications and patent specifications mentioned herein are hereby incorporated by reference as if each publication and patent specification were individually incorporated herein by reference. And

（実施例）
下記の生成法と実施例は、当業者が、本発明をより明瞭に理解し、本発明を実施できるようにするために示すものである。これらは、本発明の権利範囲を限定するものと解釈してはならない。これらは、単に、本発明の説明のために、代表例を示すものと解釈すべきである。 (Example)
The following production methods and examples are presented to enable those skilled in the art to more clearly understand and to practice the present invention. These should not be construed as limiting the scope of the invention. These should be construed as merely representative for the purpose of illustrating the present invention.

実施例１： 共通の材料と方法
ペプチドは、標準的な手順（Ｈａｃｋｅｎｇ ｅｔ．ａｌ．，前記；Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ ｅｔ．ａｌ．，（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，４０：１８０−１９３；Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７，９５７−９８４）に従い、ＰＡＭ樹脂またはチオエステル生成樹脂上でのＢｏｃ化学作用のためのその場中和／ＨＢＴＵ活性化手順により、ＳＰＰＳによって、改造ＡＢＩ４３０Ａペプチド合成装置を使用して段階的に合成した。鎖集成の後、５％のｐ−クレゾールを含む無水フッ酸（ＨＦ）による処理によって、ペプチドを脱保護すると同時に開裂させ、それから凍結乾燥して、分離ＨＰＬＣによって精製した。Ｂｏｃ保護アミノ酸は、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｍｉｄｗｅｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈから入手した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Ｈａｌｏｃａｒｂｏｎから購入した。その他の化学薬品は、ＦｌｕｋａまたはＡｌｄｒｉｃｈから購入した。分析及び分離ＨＰＬＣは、２１４ｎｍ ＵＶ検出を使用するＲａｉｎｉｎ ＨＰＬＣシステムにより、Ｖｙｄａｃ Ｃ４分析剤または分離剤を用いて、実施した。ペプチド及びたんぱく質の質量分析は、Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ−Ｉエレクトロスプレー質量分析計によって実施した。 Example 1: Common Materials and Methods Peptides were prepared using standard procedures (Hackeng et. Al., Supra; Schnolzer et. Al., (1992) Int. J. Pept. Prot. Res., 40: 180-193. In situ neutralization / HBTU activation procedure for Boc chemistry on PAM resins or thioester-generating resins according to Kent, S. B. H. (1988) Ann. Rev. Biochem. 57, 957-984); Were stepwise synthesized by SPPS using a modified ABI430A peptide synthesizer. After chain assembly, the peptide was deprotected and cleaved simultaneously by treatment with hydrofluoric acid (HF) containing 5% p-cresol, then lyophilized and purified by separation HPLC. Boc protected amino acids were obtained from Peptides International and Midwest Biotech. Trifluoroacetic acid (TFA) was purchased from Halocarbon. Other chemicals were purchased from Fluka or Aldrich. Analytical and separation HPLC was performed with Vydac C4 analytical or separation agent by a Rainin HPLC system using 214 nm UV detection. Peptide and protein mass spectrometry was performed with a Sciex API-I electrospray mass spectrometer.

実施例２： ２（４'メトキシベンジルチオ）ベンジルブロミドの合成
２−ヒドロキシメチルチオフェノール（１０ｍｍｏｌ １．４ｇ）を、室温で、１０ｍｌのＤＦＭ中で、１０ｍｍｏｌの４−メトキシベンジルクロリド及び１．７５ｍｌのＤＩＥＡと反応させた。この反応を１０分で終わらせた。ｐＨ３の５０ｍｌの水を添加した。生成物を酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。次に、得られた粗製油（ｃｒｕｄｅ ｏｉｌ）を、２０ｍｌのＴＨＦで、１１ｍｍｏｌの四臭化炭素（３．６４ｇ）及び１１ｍｍｏｌのトリフェニルホスフィン（２．８８ｇ）と反応させた。一晩の反応の後、ＴＨＦを蒸発させた。生成物を、移動相としてヘキサン／酢酸エチル（６／１）を使用して、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。１．８ｇが採取された。 Example 2: Synthesis of 2 (4'methoxybenzylthio) benzyl bromide 2-Hydroxymethylthiophenol (10 mmol 1.4 g) in 10 ml DFM at room temperature in 10 ml DFM and 1.75 ml Reacted with DIEA. The reaction was completed in 10 minutes. 50 ml of water at pH 3 was added. The product was extracted with ethyl acetate and dried over sodium sulfate. The resulting crude oil was then reacted with 11 mmol carbon tetrabromide (3.64 g) and 11 mmol triphenylphosphine (2.88 g) in 20 ml THF. After overnight reaction, the THF was evaporated. The product was purified by silica gel chromatography using hexane / ethyl acetate (6/1) as the mobile phase. 1.8 g was collected.

実施例３： Ｎα（２−メルカプトベンジル）グリシン−ペプチドの生成
Ｎ末端Ｂｏｃ保護Ａｌａを有する樹脂に束縛されたペプチド（７８ｍｇ）に、純粋の（ｎｅａｔ）ＴＦＡを添加し、Ｂｏｃ基を除去した。標準的な化学手順を使用し、ＢｏｃグリシンＯスクシンイミドを、樹脂に結合させた。結合が完了したあと、Ｂｏｃ基を除去してから、樹脂を、ＤＭＦに１０％のジイソプロピルエチルアミンを溶解させた溶液で２回洗浄して、中和した。次に、樹脂をＤＭＦとＤＭＳＯで洗浄した。次に、０．２ｍｌのＤＭＳＯと０．０１ｍｌのジイソプロピルエチルアミンに、９ｍｇの２（４'メトキシベンジルチオ）ベンジルブロミドを添加した。この混合物を、室温で１２時間反応させた。標準的な手順により、ＨＦ条件下で、ペプチドを開裂させ、脱保護した。正しい質量２，０７９Ｄａのピークが、全ペプチド物質の約１２％（ＨＰＬＣによって測定）に存在した。この正しいペプチドを、標準的な半分離（ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）ＨＰＬＣによって精製した。 Example 3: Generation of Nα (2-mercaptobenzyl) glycine-peptide To a resin-bound peptide (78 mg) with an N-terminal Boc protected Ala, neat TFA was added to remove the Boc group. Boc glycine O succinimide was coupled to the resin using standard chemical procedures. After the coupling was complete, the Boc group was removed and the resin was neutralized by washing twice with a solution of 10% diisopropylethylamine in DMF. The resin was then washed with DMF and DMSO. Next, 9 mg of 2 (4′methoxybenzylthio) benzyl bromide was added to 0.2 ml of DMSO and 0.01 ml of diisopropylethylamine. The mixture was allowed to react for 12 hours at room temperature. The peptide was cleaved and deprotected under HF conditions by standard procedures. The correct mass 2,079 Da peak was present in about 12% of all peptide material (measured by HPLC). The correct peptide was purified by standard semi-preparative HPLC.

実施例４： ４'−メトキシ２（４'メチルベンジルチオ）アセトフェノンの生成
４−メチルベンジルメルカプタン４ｍｍｏｌ（０．５４２ｍｌ）と、４'メトキシ２ブロモアセトフェノン４ｍｍｏｌ（９１６．３ｍｇ）を、４ｍｌのＤＭＦに溶解させた。次に、ジイソプロピルエチルアミン４ｍｍｏｌ（０．７ｍｌ）を添加した。この混合物を室温で１時間撹拌した。混合物を希塩酸に注ぎ、酢酸エチルによって抽出してから、硫酸ナトリウム上で乾燥した。油（ｏｉｌ）を、酢酸エチルに溶解させ、石油エーテルの添加によって沈殿させた。４５０ｍｇの白色固体が採取された。 Example 4: Formation of 4'-methoxy 2 (4'methylbenzylthio) acetophenone 4 mmol (0.542 ml) of 4-methylbenzyl mercaptan and 4 mmol (916.3 mg) of 4 'methoxy 2 bromoacetophenone in 4 ml of DMF Dissolved. Next, 4 mmol (0.7 ml) of diisopropylethylamine was added. The mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The mixture was poured into dilute hydrochloric acid, extracted with ethyl acetate and then dried over sodium sulfate. The oil was dissolved in ethyl acetate and precipitated by the addition of petroleum ether. 450 mg of white solid was collected.

実施例５： １アミノ，１（４−メトキシフェニル），２（４−メチルベンジルチオ）エタンの生成
４'−メトキシ２（４'メチルベンジルチオ）アセトフェノン１．４４ｍｍｏｌ（４１１ｍｇ）とアミノオキシ酢酸４．３ｍｍｏｌ（９４１ｍｇ）を、２０ｍｌのＴＭＯＦに溶解させ、０．０４７ｍｌのメタンスルホン酸を、触媒として、室温で添加した。４８時間後、溶剤を蒸発させ、残留物を酢酸エチルで採取し、１Ｍの硫酸一水素カリウムで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。粗製物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、２００ｍｇのオキシム複合体を得た。この２００ｍｇのオキシム複合体０．５５６ｍｍｏｌを、２ｍｌのＴＨＦに溶解させてから、１．６７ｍｌの１Ｍ ＢＨ３／ＴＨＦ複合体を添加した。２７時間後、出発材料は残っていなかった。３ｍｌの水を添加し、また１．５ｍｌの１０Ｎ水酸化ナトリウムを添加した。混合物を１時間還流させた（ｒｅｆｌｕｘｅｄ）。次に、混合物を、酢酸エチル（４×）で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。次に、最終生成物（４０ｍｇ）を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。 Example 5: Formation of 1 amino, 1 (4-methoxyphenyl), 2 (4-methylbenzylthio) ethane 4'-methoxy2 (4'methylbenzylthio) acetophenone 1.44 mmol (411 mg) and aminooxyacetic acid 4 .3 mmol (941 mg) was dissolved in 20 ml TMOF and 0.047 ml methanesulfonic acid was added as catalyst at room temperature. After 48 hours, the solvent was evaporated and the residue was taken up with ethyl acetate, washed with 1M potassium monohydrogen sulfate and dried over sodium sulfate. The crude product was purified by silica gel chromatography to give 200 mg of oxime complex. This 200 mg of oxime complex 0.556 mmol was dissolved in 2 ml of THF and then 1.67 ml of 1M BH3 / THF complex was added. After 27 hours, no starting material remained. 3 ml of water was added and 1.5 ml of 10N sodium hydroxide was added. The mixture was refluxed for 1 hour. The mixture was then extracted with ethyl acetate (4x) and dried over sodium sulfate. The final product (40 mg) was then purified by silica gel chromatography.

実施例６： Ｎα １−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドの生成
Ｎ末端Ｂｏｃ保護Ａｌａを有する、樹脂に束縛されたモデルペプチド（７８ｇ）に、純粋のＴＦＡを加えて、Ｂｏｃ基を除去した。標準的な化学的手順に従って、ブロモ酢酸を樹脂に結合させた。次に、１アミノ，１（４−メトキシフェニル），２（４−メチルベンジルチオ）エタン１７ｍｇを、０．０１０ｍｌのジイソプロピルエチルアミンを含む０．３ｍｌのＤＭＳＯに溶解させたものを、樹脂に加えた。一晩の反応ののち、樹脂を洗浄し、標準的なＨＦ手順により、ペプチドを開裂させ、脱保護した。次に、半分離ＨＰＬＣにより、所望の生成物を生成した。 Example 6: Generation of Nα 1- (4-methoxyphenyl) 2-mercaptoethaneglycine-peptide To a resin-bound model peptide (78 g) with an N-terminal Boc protected Ala, pure TFA was added to add Boc The group was removed. Bromoacetic acid was coupled to the resin according to standard chemical procedures. Next, 17 mg of 1 amino, 1 (4-methoxyphenyl), 2 (4-methylbenzylthio) ethane dissolved in 0.3 ml of DMSO containing 0.010 ml of diisopropylethylamine was added to the resin. . After overnight reaction, the resin was washed and the peptide was cleaved and deprotected by standard HF procedures. The desired product was then produced by semi-separation HPLC.

別のＮα １−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドの生成
標準的な結合手順により、配列 Ｓ−Ｙ−Ｒ−Ｆ−Ｌ−ポリマー のモデルペプチド樹脂０．１ｍｍｏｌに、ブロモ酢酸を結合させた。結合の後、樹脂をＤＭＳＯで洗浄した。次に、１アミノ，１（４−メトキシフェニル），２（４−メチルベンジルチオ）エタン３２．５ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）を０．３ｍｌのＤＭＳＯと０．０２５ｍｌのジイソプロピルエチルアミンに溶解させたものを、加えた。混合物を一晩放置して反応を進行させた。標準的なＨＦ手順により、ペプチドを開裂させ、脱保護した。粗製開裂生成物のＨＰＬＣにより、全生成物の６０％が所望の生成物（ＭＷ ２，１２２）であることがわかった。ｎ−アルキルエタンチオール基はＨＦ中で９７％が安定であった。 Formation of another Nα 1- (4-methoxyphenyl) 2-mercaptoethaneglycine-peptide Standard peptide coupling procedure is carried out to 0.1 mmol of model peptide resin of sequence S—Y—R—F—L-polymer to bromoacetic acid. Were combined. After conjugation, the resin was washed with DMSO. Next, 1amino, 1 (4-methoxyphenyl), 2 (4-methylbenzylthio) ethane (32.5 mg, 0.12 mmol) dissolved in 0.3 ml of DMSO and 0.025 ml of diisopropylethylamine ,added. The mixture was left overnight to allow the reaction to proceed. The peptide was cleaved and deprotected by standard HF procedures. HPLC of the crude cleavage product showed that 60% of the total product was the desired product (MW 2,122). The n-alkylethanethiol group was 97% stable in HF.

実施例７： ２'，４'−ジメトキシ２（４'メチルベンジルチオ）アセトフェノンの生成
４−メチルベンジルメルカプタン３．９４ｍｍｏｌ（０．５３４ｍｌ）と２'，４'ジメトキシ２−ブロモアセトフェノン３．８６ｍｍｏｌ（１ｇ）を、４ｍｌのＤＭＦに溶解させた。次に、ジイソプロピルエチルアミン３．９４ｍｍｏｌ（０．６８８ｍｌ）を加えた。混合物を、室温で２４時間撹拌した。混合物を、硫酸一水素カリウムの１Ｍ溶液に注ぎ、酢酸エチルで抽出して、硫酸ナトリウム上で乾燥した。蒸発ののち、残留油を酢酸エチルに溶解させ、石油エーテルの添加により沈殿させた。これにより、６１６ｍｇの白色固体が得られた。 Example 7: Formation of 2 ', 4'-dimethoxy 2 (4'methylbenzylthio) acetophenone 3.94 mmol (0.534 ml) 4-methylbenzyl mercaptan and 3.86 mmol (2', 4 'dimethoxy 2-bromoacetophenone ( 1 g) was dissolved in 4 ml DMF. Next, 3.94 mmol (0.688 ml) of diisopropylethylamine was added. The mixture was stirred at room temperature for 24 hours. The mixture was poured into a 1M solution of potassium monohydrogen sulfate, extracted with ethyl acetate and dried over sodium sulfate. After evaporation, the residual oil was dissolved in ethyl acetate and precipitated by the addition of petroleum ether. This gave 616 mg of white solid.

実施例８： １アミノ，１（２，４−ジメトキシフェニル），２（４−メチルベンジルチオ）エタンの生成
２'，４'−ジメトキシ２（４'メチルベンジルチオ）アセトフェノン０．５２６ｍｍｏｌ（１６６ｍｇ）とアミノオキシ酢酸１．５９ｍｍｏｌ（３４５ｍｇ）を、６ｍｌのＴＭＯＦに溶解させ、室温で、０．０３４ｍｌのメタンスルホン酸を触媒として加えた。３１時間後、溶剤を蒸発させてから、酢酸エチルに取込み、１Ｍの硫酸一水素カリウムで洗浄して、硫酸ナトリウム上で乾燥した。次に、粗製物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、１２６ｍｇ（収率６１％）のオキシム複合体を得た。この１２６ｍｇのオキシム複合体０．３２４ｍｍｏｌを、１．５ｍｌのＴＨＦに溶解させた。次に、０．９７３ｍｌの１Ｍ ＢＨ３／ＴＨＦ複合体を添加した。 Example 8: Formation of 1 amino, 1 (2,4-dimethoxyphenyl), 2 (4-methylbenzylthio) ethane 2 ', 4'-dimethoxy2 (4'methylbenzylthio) acetophenone 0.526 mmol (166 mg) And 1.59 mmol (345 mg) of aminooxyacetic acid were dissolved in 6 ml of TMOF and 0.034 ml of methanesulfonic acid was added as a catalyst at room temperature. After 31 hours, the solvent was evaporated, then taken up in ethyl acetate, washed with 1M potassium monohydrogen sulfate and dried over sodium sulfate. The crude product was then purified by silica gel chromatography to give 126 mg (61% yield) of oxime complex. This 126 mg of oxime complex 0.324 mmol was dissolved in 1.5 ml of THF. Then 0.973 ml of 1M BH3 / THF complex was added.

５４時間後、出発材料がまだ存在していたので、０．５ｍｌの１Ｍ ＢＨ３／ＴＨＦ複合体を添加した。３日後（合計６日の反応）、３ｍｌの水を添加し、１ｍｌの１０Ｎ水酸化ナトリウムを加えた。混合物を、１時間還流させた。次に、混合物を、酢酸エチル（４×）で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。次に、最終生成物（４３ｍｇ）を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。 After 54 hours, starting material was still present, so 0.5 ml of 1M BH3 / THF complex was added. After 3 days (6 days total reaction), 3 ml of water was added and 1 ml of 10N sodium hydroxide was added. The mixture was refluxed for 1 hour. The mixture was then extracted with ethyl acetate (4x) and dried over sodium sulfate. The final product (43 mg) was then purified by silica gel chromatography.

実施例９： Ｎα １−（２，４−ジメトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドの生成
標準的な結合手順により、配列 Ｓ−Ｙ−Ｒ−Ｆ−Ｌ−ポリマー の樹脂束縛ペプチド０．１ｍｍｏｌに、ブロモ酢酸を結合させた。結合の後、樹脂をＤＭＳＯで洗浄した。次に、１アミノ，１（２'，４'−ジメトキシフェニル），２（４−メチルベンジルチオ）エタン３６ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）を、０．３ｍｌのＤＭＳＯと０．０２５ｍｌのジイソプロピルエチルアミンに溶解させたものを、加えた。混合物を一晩放置して反応を進行させた。標準的なＨＦ手順により、ペプチドを開裂させ、脱保護した。粗製開裂生成物のＨＰＬＣにより、全生成物の４２％が所望の生成物（ＭＷ ９３８）であることがわかった。ｎ−アルキルエタンチオール基はＨＦ中で９２％が安定であった。 Example 9: Generation of Nα 1- (2,4-dimethoxyphenyl) 2-mercaptoethaneglycine-peptide 0.1 mmol of resin-bound peptide of sequence S—Y—R—F—L-polymer according to standard coupling procedures Was bound with bromoacetic acid. After conjugation, the resin was washed with DMSO. Next, 36 mg (0.12 mmol) of 1 amino, 1 (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl), 2 (4-methylbenzylthio) ethane was dissolved in 0.3 ml of DMSO and 0.025 ml of diisopropylethylamine. Added. The mixture was left overnight to allow the reaction to proceed. The peptide was cleaved and deprotected by standard HF procedures. HPLC of the crude cleavage product showed that 42% of the total product was the desired product (MW 938). The n-alkylethanethiol group was 92% stable in HF.

実施例１０： Ｃ末端ＳＤＦ１−アラニン−チオエステルとＮ末端Ｎα（２−メルカプトベンジル）グリシン−ペプチドとのＡｌａ−Ｇｌｙ化学的ライゲーション
６員転位ライゲーション（６−ｍｅｍｂｅｒ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｌｉｇａｔｉｏｎ）のために、ＳＤＦ１−αのＣ末端Ａｌａチオエステルフラグメント（ＭＷ ４４２９）１ｍｇと、ＳＤＦ１−αのＮ末端Ｎα（２−メルカプトベンジル）グリシンフラグメント（ＭＷ ２０７９）０．６ｍｇとを、１００μｌの６Ｍグアニジニウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させ、１μｌのチオフェノールを加えた。室温（〜２５℃）で、２日経過したあと、所望のライゲーション生成物（ＭＷ ５４７２）の形成を、ＥＳ−ＭＳによって確認した。次に、反応混合物を、さらに２４時間、４０℃に定温放置し、所望のライゲーション生成物の収率を、ＨＰＬＣ積分（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）によって測定した、生成物と非反応Ｃ末端フラグメントとの比にもとづいて決定した。観測された収率は、約４０％であった。 Example 10: SDF1-α for Ala-Gly chemical ligation 6-member rearrangement ligation of C-terminal SDF1-alanine-thioester and N-terminal Nα (2-mercaptobenzyl) glycine-peptide 1 mg of C-terminal Ala thioester fragment (MW 4429) and 0.6 mg of SDF1-α N-terminal Nα (2-mercaptobenzyl) glycine fragment (MW 2079) in 100 μl of 6M guanidinium buffer (pH 7.0). Once dissolved, 1 μl of thiophenol was added. After 2 days at room temperature (˜25 ° C.), formation of the desired ligation product (MW 5472) was confirmed by ES-MS. The reaction mixture is then allowed to incubate for an additional 24 hours at 40 ° C., and the yield of the desired ligation product is determined based on the ratio of product to unreacted C-terminal fragment as determined by HPLC integration. Decided. The observed yield was about 40%.

実施例１１： Ｃ末端ＳＤＦ１−アラニン−チオエステルとＮ末端Ｎα １−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドとのＡｌａ−Ｇｌｙ化学的ライゲーション
５員転位ライゲーションのために、ＳＤＦ１のＣ末端アラニン−チオエステルフラグメント（ＭＷ ４４２９）１ｍｇと、Ｎα １−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタン基を有するＮ末端グリシンを有するＮ末端ペプチドモデル（ＭＷ ２１２２）１ｍｇとを、１００μｌの６Ｍグアニジニウム緩衝液（ｐＨ７．０）［及び１μｌのチオフェノール］に溶解させた。反応混合物を、室温（〜２５℃）で、定温放置し、ライゲーション反応を調べた。８時間後、所望のライゲーション生成物（ＭＷ ５５１５）の形成を、ＥＳ−ＭＳによって確認した。３日後、生成物と非反応Ｎ末端フラグメントとの比にもとづく所望のライゲーション生成物の収率は、約４５％であった。室温で３日経過したあと、さらに２４時間、４０℃に定温放置したあとでは、収率は、６５％であった。室温で３日経過したあと、さらに４８時間、４０℃に定温放置したあと、収率は、約７０％に上昇した。 Example 11: Ala-Gly chemical ligation of C-terminal SDF1-alanine-thioester with N-terminal Nα 1- (4-methoxyphenyl) 2-mercaptoethaneglycine-peptide C-terminal of SDF1 for 5-membered rearrangement ligation 1 mg of an alanine-thioester fragment (MW 4429) and 1 mg of an N-terminal peptide model (MW 2122) having an N-terminal glycine having an Nα 1- (4-methoxyphenyl) 2-mercaptoethane group, 100 μl of 6M guanidinium buffer (PH 7.0) [and 1 μl thiophenol]. The reaction mixture was left at room temperature (˜25 ° C.) to examine the ligation reaction. After 8 hours, formation of the desired ligation product (MW 5515) was confirmed by ES-MS. After 3 days, the yield of the desired ligation product based on the ratio of product to unreacted N-terminal fragment was about 45%. After 3 days at room temperature and after standing at 40 ° C. for another 24 hours, the yield was 65%. After 3 days at room temperature, after a further 48 hours of incubation at 40 ° C., the yield increased to about 70%.

５員転位ライゲーションのために、ＳＤＦ１−αのＣ末端Ａｌａチオエステルフラグメント（ＭＷ ４４２９）０．５ｍｇと、Ｎα １−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタン基を有するＮ末端グリシンを有するＮ末端フラグメント（ＭＷ ２１２２）０．５ｍｇとを、１００μｌの６Ｍグアニジニウム緩衝液（ｐＨ８．２）及び１μｌのチオフェノールに溶解させた。次に、反応混合物を、室温（〜２５℃）で、定温放置し、６時間後、さらに１μｌのチオフェノールを加えた。２４時間後、所望の生成物の収率は、約６０％であった。 For 5-membered rearrangement ligation, 0.5 mg of SDF1-α C-terminal Ala thioester fragment (MW 4429) and N-terminal fragment with N-terminal glycine with Nα 1- (4-methoxyphenyl) 2-mercaptoethane group 0.5 mg of (MW 2122) was dissolved in 100 μl of 6M guanidinium buffer (pH 8.2) and 1 μl of thiophenol. The reaction mixture was then allowed to incubate at room temperature (˜25 ° C.) and after 6 hours an additional 1 μl of thiophenol was added. After 24 hours, the yield of the desired product was about 60%.

実施例１２： Ｃ末端グリシン−チオエステルとＮ末端Ｎα−（２−メルカプトベンジル）グリシン−ペプチドとのＧｌｙ−Ｇｌｙ化学的ライゲーション
６員転位ライゲーションのために、デカマー（ｄｅｃａｍｅｒ）モデルペプチドのＣ末端Ｇｌｙチオエステルフラグメント（ＭＷ １３５７）３．５ｍｇと、３ ＨｉｓＤｎｐを有するモデルペプチドのＮ末端Ｎα（２−メルカプトベンジル）グリシンフラグメント（ＭＷ ２０７９）２ｍｇとを、２００μｌの６Ｍグアニジニウム緩衝液（ｐＨ７．９）に溶解させ、２μｌのチオフェノールを添加した。混合物を、３３℃で、６０時間、定温放置した。所望のライゲーション生成物（ＭＷ ２６３１）の形成を、ＥＳ−ＭＳによって確認した。生成物と非反応Ｎ末端フラグメントとの比にもとづく実測収率は、約４０％であった。 Example 12: Gly-Gly chemical ligation of C-terminal glycine-thioester and N-terminal Nα- (2-mercaptobenzyl) glycine-peptide For 6-membered rearrangement ligation, C-terminal Gly thioester of decamer model peptide Fragment (MW 1357) 3.5 mg and 3 mg N-terminal Nα (2-mercaptobenzyl) glycine fragment (MW 2079) 2 mg model peptide with HisDnp were dissolved in 200 μl of 6M guanidinium buffer (pH 7.9). 2 μl of thiophenol was added. The mixture was incubated at 33 ° C. for 60 hours. Formation of the desired ligation product (MW 2631) was confirmed by ES-MS. The measured yield based on the ratio of product to unreacted N-terminal fragment was about 40%.

Ｃ末端グリシン−チオエステルペプチドとＮα １−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドとの化学的ライゲーション
５員転位ライゲーションのために、Ｃ末端Ｇｌｙチオエステルフラグメント（ＭＷ １３５７）２ｍｇと、Ｎα １−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタン基を有する、３ ＨｉｓＤｎｐを有するモデルペプチドのＮ末端フラグメント（ＭＷ ２１２２）２．５ｍｇとを、１μｌのチオフェノールを含む１００μｌの６Ｍグアニジニウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた。反応混合物を、室温（〜２５℃）で、定温放置し、ライゲーション反応を調べた。定温放置の３及び８時間後、所望のライゲーション生成物（ＭＷ ２６７５．９）の形成を、ＥＳ−ＭＳによって確認した。２４時間後、生成物と非反応Ｎ末端フラグメントとの比にもとづく所望のライゲーション生成物の収率は、約４０％であった。次に、固体の炭酸水素ナトリウムを添加することにより、ｐＨを、８．２に上昇させてから、反応混合物を、さらに２４時間定温放置し、収率８８％を得た。 Chemical ligation of C-terminal glycine-thioester peptide and Nα 1- (4-methoxyphenyl) 2-mercaptoethaneglycine-peptide For 5-membered rearrangement ligation, 2 mg of C-terminal Gly thioester fragment (MW 1357) and Nα 1 -2.5 mg of an N-terminal fragment (MW 2122) of a model peptide with 3 HisDnp having a (4-methoxyphenyl) 2-mercaptoethane group and 100 μl of 6 M guanidinium buffer (pH 7. 5) containing 1 μl of thiophenol. 0). The reaction mixture was left at room temperature (˜25 ° C.) to examine the ligation reaction. After 3 and 8 hours of incubation, the formation of the desired ligation product (MW 2675.9) was confirmed by ES-MS. After 24 hours, the yield of the desired ligation product based on the ratio of product to unreacted N-terminal fragment was about 40%. Next, the pH was raised to 8.2 by adding solid sodium bicarbonate, and then the reaction mixture was allowed to incubate for an additional 24 hours, yielding 88% yield.

実施例１３： Ｌａｒｃ−アラニン−チオエステルとＮα １−，（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドとのＡｌａ−Ｇｌｙ化学的ライゲーション
マウスのＬａｒｃ １−３１ Ａｌａ Ｃ末端ペプチドチオエステル３ｍｇ（ＭＷ ３６０９）と、モデルペプチドＮα １−，（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−Ｓ−Ｙ−Ｒ−Ｆ−Ｌ １ｍｇ（ＭＷ ９０８）とを、０．１５ｍｌの６ｍｏｌグアニジニウム緩衝液（ｐＨ８．２）及び０．０３ｍｌのチオフェノールに溶解させた。ペプチドチオエステルの消費から見積もって、一晩の撹拌の後、ライゲーションは、８１％完了し、４０時間後、９２％完了した。予想されるライゲーション生成物は、４３１２Ｄａであり、実際は４３１２Ｄａであった。 Example 13: Ala-Gly Chemical Ligation of Larc-Alanine-Thioester and Nα 1-, (4-Methoxyphenyl) 2-mercaptoethaneglycine-peptide 3 mg of Lac 1-31 Ala C-terminal Peptide Thioester (MW 3609) ) And 1 mg (MW 908) of the model peptide Nα1-, (4-methoxyphenyl) 2-mercaptoethaneglycine-S—Y—R—F—L (MW 908), 0.15 ml of 6 mol guanidinium buffer (pH 8.2). ) And 0.03 ml thiophenol. As estimated from consumption of the peptide thioester, after overnight stirring, the ligation was 81% complete and after 40 hours it was 92% complete. The expected ligation product was 4312 Da and was actually 4312 Da.

実施例１４： Ｌａｒｃ１−３１−アラニン−チオエステルとＮα １−（２，４−ジメトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドとのＡｌａ−Ｇｌｙ化学的ライゲーション
マウスのＬａｒｃ １−３１ Ａｌａ Ｃ末端ペプチドチオエステル３ｍｇ（ＭＷ ３６０９）と、モデルペプチドＮα １−（２，４−ジメトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−Ｓ−Ｙ−Ｒ−Ｆ−Ｌ １ｍｇ（ＭＷ ９３８）とを、０．１５ｍｌの６ｍｏｌグアニジニウム緩衝液（ｐＨ８．２）及び０．０３ｍｌのチオフェノールに溶解させた。ペプチドチオエステルの消費から見積もって、一晩の撹拌の後、ライゲーションは７３％完了し、４０時間後、８５％完了した。計算予想されるライゲーション生成物の質量と実験によるそれとは、ともに４３４２Ｄａであった。 Example 14: Lala 1-31 Ala C-terminal peptide thioester of Ala-Gly chemical ligation mouse with Larc 1-31-alanine-thioester and Nα 1- (2,4-dimethoxyphenyl) 2-mercaptoethaneglycine-peptide 3 mg (MW 3609) and model peptide Nα 1- (2,4-dimethoxyphenyl) 2-mercaptoethaneglycine-S—Y—R—F—L 1 mg (MW 938), 0.15 ml of 6 mol guanidinium buffer (PH 8.2) and 0.03 ml thiophenol. Estimated from the consumption of peptide thioester, after overnight stirring, the ligation was 73% complete and after 40 hours 85% complete. The calculated mass of the ligation product and that from the experiment were both 4342 Da.

実施例１５： Ｃ末端トリペプチドグリシン−チオエステルとＮ末端Ｎα−１−（２，４−ジメトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドとのＧｌｙ−Ｇｌｙ化学的ライゲーション
ペプチドフラグメントＦＧＧ−チオエステル０．８ｍｇと、モデルペプチドＮα １−（２，４−ジメトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−Ｓ−Ｙ−Ｒ−Ｆ−Ｌ １ｍｇ（ＭＷ ９３８）とを、０．１ｍｌの６Ｍグアニジニウム緩衝液（ｐＨ８．２）及び０．０２ｍｌのチオフェノールに溶解させた。一晩の撹拌の後、反応は実質的に完了した。計算予想されるライゲーション生成物の質量と実験によるそれとは、それぞれ１１９９．４Ｄａ及び１１９５．５Ｄａであった。 Example 15: Gly-Gly chemical ligation peptide fragment FGG-thioester 0.8 mg with C-terminal tripeptide glycine-thioester and N-terminal Nα-1- (2,4-dimethoxyphenyl) 2-mercaptoethaneglycine-peptide Model peptide Nα 1- (2,4-dimethoxyphenyl) 2-mercaptoethaneglycine-S—Y—R—F—L 1 mg (MW 938) and 0.1 ml of 6 M guanidinium buffer (pH 8.2) And dissolved in 0.02 ml of thiophenol. After overnight stirring, the reaction was substantially complete. The calculated ligation product mass and experimental one were 1199.4 Da and 1195.5 Da, respectively.

実施例１６： １−（２，４−ジメトキシフェニル）２−メルカプトエタンのライゲーション生成物からの除去
実施例１５の精製ライゲーション生成物１ｍｇを、０．９５ｍｌのＴＦＡ及び０．０２５ｍｌの水及び０．０２５ｍｌのＴＩＳに溶解させた。１時間後、溶剤を蒸発させ、水／アセトニトリルの５０％溶液を添加し、混合物を凍結乾燥させた。ＨＰＬＣによれば、開裂は９５％よりも多く完了していた。計算予想される質量と実験によるそれとは、１００３Ｄａであった。 Example 16: Removal of 1- (2,4-dimethoxyphenyl) 2-mercaptoethane from the ligation product 1 mg of the purified ligation product of Example 15 was added 0.95 ml TFA and 0.025 ml water and 0. Dissolved in 025 ml TIS. After 1 hour, the solvent was evaporated, a 50% solution of water / acetonitrile was added and the mixture was lyophilized. According to HPLC, the cleavage was more than 95% complete. The calculated mass and the experimental value were 1003 Da.

実施例１７： Ｃ末端トリペプチドグリシン−チオエステルとＮ末端Ｎα １−，（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドとのＧｌｙ−Ｇｌｙ化学的ライゲーション
トリペプチドペプチドフラグメントチオエステル、ＦＧＧ−チオエステル１．６ｍｇと、モデルペプチドＮα １−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−Ｓ−Ｙ−Ｒ−Ｆ−Ｌ ２ｍｇ（ＭＷ ９０８）とを、０．２ｍｌの６Ｍグアニジニウム緩衝液（ｐＨ８．２）及び０．０４ｍｌのチオフェノールに溶解させた。一晩の撹拌の後、反応は実質的に完了した。予想されるライゲーション生成物のＭＷは、１１６９．４Ｄａであり、実際は１１６９．５Ｄａであった。 Example 17: Gly-Gly Chemical Ligation Tripeptide Peptide Fragment Thioester with C-terminal Tripeptide Glycine-Thioester and N-terminal Nα 1-, (4-Methoxyphenyl) 2-mercaptoethaneglycine-peptide, FGG-Thioester 6 mg and model peptide Nα 1- (4-methoxyphenyl) 2-mercaptoethaneglycine-S—Y—R—F—L 2 mg (MW 908), 0.2 ml of 6 M guanidinium buffer (pH 8.2) And dissolved in 0.04 ml of thiophenol. After overnight stirring, the reaction was substantially complete. The MW of the expected ligation product was 1169.4 Da and was actually 1169.5 Da.

実施例１８： ライゲーション後の１−（，４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタン基の除去
実施例１７の精製ライゲーション生成物を、−２℃で、１時間、ＨＦ ｐクレゾールで処理した。ＨＦを蒸発させた後、ライゲーション生成物をエーテルによって、沈殿させた。粗製ペプチドを、０．１％ ＴＦＡを含む水／アセトニトリル５０％溶液に取込み、ＨＰＬＣ上に噴射した。＞８０％の主ピークは、開裂ペプチドに関して予想される分子量を示した（予想質量１００３Ｄａ、実際１００３Ｄａ）。 Example 18: Removal of 1-(, 4-methoxyphenyl) 2-mercaptoethane group after ligation The purified ligation product of Example 17 was treated with HF p-cresol at -2 ° C for 1 hour. After evaporating the HF, the ligation product was precipitated with ether. The crude peptide was taken up in a 50% water / acetonitrile solution containing 0.1% TFA and sprayed onto the HPLC. The main peak of> 80% showed the expected molecular weight for the cleaved peptide (expected mass 1003 Da, indeed 1003 Da).

実施例１９： Ｃ末端ヒスチジン−チオエステルとＮ末端Ｎα １−（２，４−ジメトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドとのＨｉｓ−Ｇｌｙ化学的ライゲーション
ペプチドフラグメントＴＢＰ−Ａ １−６７ ＣαＨｉｓチオエステル４ｍｇと、モデルペプチドＮα １−（２，４−ジメトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−Ｓ−Ｙ−Ｒ−Ｆ−Ｌ １ｍｇ（ＭＷ ９３８）とを、０．１ｍｌの６Ｍグアニジニウム緩衝液（ｐＨ８．２）及び０．０２ｍｌのチオフェノールに溶解させた。一晩の撹拌の後、ペプチドチオエステルの消費から見積もって、反応は８７％完了した。予想されるライゲーション生成物の分子量は、９２２０Ｄａであり、実際は、９２２０Ｄａであった。 Example 19: His-Gly chemical ligation peptide fragment TBP-A 1-67 CαHis thioester with C-terminal histidine-thioester and N-terminal Nα 1- (2,4-dimethoxyphenyl) 2-mercaptoethaneglycine-peptide Model peptide Nα 1- (2,4-dimethoxyphenyl) 2-mercaptoethaneglycine-S—Y—R—F—L 1 mg (MW 938) and 0.1 ml of 6 M guanidinium buffer (pH 8.2) And dissolved in 0.02 ml of thiophenol. After overnight stirring, the reaction was 87% complete as estimated from consumption of the peptide thioester. The expected molecular weight of the ligation product was 9220 Da, and in fact it was 9220 Da.

実施例２０： ライゲーション後の１−（２，４−ジメトキシフェニル）２−メルカプトエタン基の除去
Ｈ−Ｇライゲーション後の精製ペプチドフラグメント２ｍｇを、０．９５ｍｌのＴＦＡ及び０．０２５ｍｌの水及び０．０２５ｍｌのＴＩＳに溶解させた。１時間後、溶剤を蒸発させ、残留物に水／アセトニトリルの５０％溶液を添加し、混合物を凍結乾燥させた。ＨＰＬＣによれば、開裂は９０％よりも多く完了していた。予想されるＭＷは９０２３Ｄａであり、実際は９０２４Ｄａであった。 Example 20: Removal of 1- (2,4-dimethoxyphenyl) 2-mercaptoethane group after ligation 2 mg of purified peptide fragment after HG ligation was added to 0.95 ml TFA and 0.025 ml water and 0. Dissolved in 025 ml TIS. After 1 hour, the solvent was evaporated, a 50% solution of water / acetonitrile was added to the residue and the mixture was lyophilized. According to HPLC, the cleavage was more than 90% complete. The expected MW was 9023 Da, and in fact 9024 Da.

実施例２１： 拡張天然型化学的ライゲーションによるシトクロムｂ５６２の合成
３ｍｇ（０．４μｍｏｌ）のシトクロム１−６３ Ｃ末端チオエステル（ＭＷ ７３４９）と１．５ｍｇ（０．３μｍｏｌ）のＮ末端Ｎα １−，（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシンシトクロムｂ５６２残基６４−１０６（ＭＷ ４９７０）を、触媒としての０．００２ｍｌのチオフェノールとともに、０．１ｍｌの６Ｍグアニジニウムライゲーション緩衝液（ｐＨ７）に、溶解させた。図５Ａを参照されたい。２４時間後、０．０２５ｍｌの２−メルカプトエタノールを混合物に添加し、そのまま４５分間反応を進行させた。その後、１５ｍｇのＴＣＥＰを添加し、３０分の撹拌ののち、ライゲーション混合物を半分離ＨＰＬＣにかけた。漏出物（ｂｒｅａｋ ｔｈｒｏｕｇｈ）を溶離し、混合物を脱塩してから、ライゲーション混合物のすべての成分を、６５％Ｂの傾斜まで傾けて溶離し、単一のバイアルに集めた。脱塩された物質の分析ＨＰＬＣによれば、ライゲーションは、Ｃ末端ペプチドの消費にもとづく見積もりでは、９０％よりも多く完了していた。このＨＰＬＣは、二つの主ピーク（ジアステレオマー）を示し、計算質量と予想質量は１１，９４６Ｄａであった。図５Ｂと６Ａを参照されたい。 Example 21: Synthesis of cytochrome b562 by extended natural chemical ligation 3 mg (0.4 μmol) cytochrome 1-63 C-terminal thioester (MW 7349) and 1.5 mg (0.3 μmol) N-terminal Nα 1-, ( 4-Methoxyphenyl) 2-mercaptoethaneglycine cytochrome b562 residue 64-106 (MW 4970) in 0.1 ml 6M guanidinium ligation buffer (pH 7) with 0.002 ml thiophenol as catalyst. Dissolved. See FIG. 5A. After 24 hours, 0.025 ml of 2-mercaptoethanol was added to the mixture and the reaction was allowed to proceed for 45 minutes. Then 15 mg of TCEP was added and after 30 minutes of stirring, the ligation mixture was subjected to semi-separation HPLC. The breakthrough was eluted and the mixture was desalted before all components of the ligation mixture were eluted with a tilt of 65% B and collected in a single vial. According to analytical HPLC of the desalted material, the ligation was more than 90%, as estimated based on consumption of the C-terminal peptide. This HPLC showed two main peaks (diastereomers) with a calculated and expected mass of 11,946 Da. See Figures 5B and 6A.

シトクロムｂ５６２（１−１０６）のアミノ酸配列は下記の通りである。

The amino acid sequence of cytochrome b562 (1-106) is as follows.

実施例２２： ライゲーションシトクロムｂ５６２残基１−１０６からの１−，（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタン基の除去と、天然たんぱく質の生成
次に、脱塩した溶液を、１−，（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタン基の除去に先立って、凍結乾燥した。凍結乾燥した物質を、−２℃で、１時間、ＨＦ ９５％ ５％アニソールと１ｍｍｏｌのシステイン（１２１ｍｇ）で処理した。標準的手順により、ＨＦを蒸発させてから、１００ｍｌの５０％緩衝液Ｂを添加し、混合物を凍結乾燥した。次に、混合物を半分離ＨＰＬＣによって精製し、２ｍｇの精製単一ピーク天然シトクロム１−１０６（５６％の精製後収率）を得た。計算質量及び実際の質量は１１，７８０Ｄａであった。図６Ｂ及び７Ａを参照されたい。 Example 22: Removal of 1-, (4-methoxyphenyl) 2-mercaptoethane group from ligation cytochrome b562 residue 1-106 and production of natural protein Next, the desalted solution was treated with 1-, (4 Prior to removal of the -methoxyphenyl) 2-mercaptoethane group, it was lyophilized. The lyophilized material was treated with HF 95% 5% anisole and 1 mmol cysteine (121 mg) at −2 ° C. for 1 hour. HF was evaporated by standard procedures, then 100 ml of 50% buffer B was added and the mixture was lyophilized. The mixture was then purified by semi-separated HPLC to give 2 mg of purified single peak natural cytochrome 1-106 (56% yield after purification). The calculated mass and actual mass was 11,780 Da. See Figures 6B and 7A.

野生型のシトクロムｂ５６２の類似体も、同じやり方で合成した。これを、Ｓｌｍ７ ｃｙｔ ｂ５６２で示す。このＳｌｍ７ ｃｙｔ ｂ５６２突然変異体は、位置７のメチオニンをセレノメチオニン（メチオニンのイオウをそれより低位の同種のセレニウムで置き換えたもの）で置き換えている点が野生型と異なる。円偏光二色性分光分析を行い、大きなαらせん成分が、アポ野生型ｂ５６２とアポＳｌｍ ｂ５６２との両方に含まれていることを示した（データ示さず）。ＥＳＭＳによっても、アポ野生型ｂ５６２とアポＳｌｍ ｂ５６２との両方が予想される分子質量を有することが示された（データ示さず）。これらのアポたんぱく質を、ヘムによって再構成し（室温で、ヘムｐＨ７ ＮａＰｉによって一晩）、得られたたんぱく質をイオン交換ＦＰＬＣによって精製した（ＦＰＬＣ精製リソースＱ、トリスＨＣＬ ｐＨ８、ＮａＣｌ勾配）。たとえば、図７Ｂを参照されたい。ヘム再構成たんぱく質のＵＶによって見ることのできる（光）スペクトルは、Ｆｅに対するイオウまたはセレンの配位に一致することがわかった（データ示さず）。非配位アイソスターノルロイシン（ｎｏｎ−ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ ｉｓｏｔｅｒｅ ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）によるｃｙｔ ｂ５６２突然変異体も、同じやり方で生成した。これから、合成シトクロムを、拡張天然型化学的ライゲーションによって生成し、そのヘム活性部位を再構成して、生物物理学的方法で完全に特性決定した。それによると、この実施例は、さらに、初期の天然型化学的ライゲーション法に対して適当なシステインを欠くペプチド及びたんぱく質を、拡張天然型化学的ライゲーション法で生成し、また非標準的なアミノ酸を導入することができる、ということを示した。たとえば、多くのｃｙｔ ｂ５６２突然変異体の折りたたみと反応性とを調べたが、天然にはない軸配位子はまだ調べていない。拡張天然型化学的ライゲーションとともに、使用できる非天然アミノ酸の莫大な量の配列を使用して、これら及びその他のたんぱく質の性質を系統的に調節できるはずである。 An analog of wild type cytochrome b562 was synthesized in the same manner. This is indicated by Slm7 cyt b562. This Slm7 cyt b562 mutant differs from the wild type in that the methionine at position 7 is replaced with selenomethionine (the methionine sulfur is replaced by a lower level of the same selenium). Circular dichroism spectroscopy was performed and showed that a large α-helical component was contained in both apo wild type b562 and apo Slm b562 (data not shown). ESMS also showed that both apo wild type b562 and apo Slm b562 had the expected molecular mass (data not shown). These apoproteins were reconstituted with heme (at room temperature overnight with heme pH7 NaPi) and the resulting protein was purified by ion exchange FPLC (FPLC purification resource Q, Tris HCL pH8, NaCl gradient). For example, see FIG. 7B. It was found that the (light) spectrum visible by UV of the heme reconstitution protein is consistent with the coordination of sulfur or selenium to Fe (data not shown). The cyt b562 mutant with non-coordinating isoter norleucine was also generated in the same manner. From this, synthetic cytochromes were generated by extended natural chemical ligation, the heme active site reconstituted and fully characterized by biophysical methods. According to this, this example further produces peptides and proteins lacking cysteine suitable for the initial natural chemical ligation method, with the extended natural chemical ligation method, and non-standard amino acids. It was shown that it can be introduced. For example, the fold and reactivity of many cyt b562 mutants were examined, but the non-natural axial ligands have not yet been investigated. With extended natural chemical ligation, the vast amount of unnatural amino acid sequences that can be used should be used to systematically control the properties of these and other proteins.

実施例２３： ＭＣＰ １−３５−リシン−チオエステルと、Ｎα １−，（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−ペプチドとのＬｙｓ−Ｇｌｙ化学的ライゲーション
３ｍｇのＭＣＰ １−３５ Ｌｙｓ Ｃ末端ペプチドチオエステルと１ｍｇのモデルペプチドＮα １−，（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタングリシン−Ｓ−Ｙ−Ｒ−Ｆ−Ｌ（ＭＷ ９０８）を、０．１５ｍｌの６Ｍグアニジニウム緩衝液（ｐＨ７）に溶解させ、トリエチルアミンと０．０３ｍｌのトリフェノールとの添加によってｐＨ７．２に調節した。一晩の撹拌の後、ライゲーションは、ペプチドチオエステルの消費から見積もって、６９％完了しており、４０時間後、７６％が完了していた。予想されるライゲーション生成物は４８９３Ｄａであり、実際は、４８９３Ｄａｗであった。 Example 23: Lys-Gly chemical ligation of MCP 1-35-lysine-thioester with Nα 1-, (4-methoxyphenyl) 2-mercaptoethaneglycine-peptide 3 mg of MCP 1-35 Lys C-terminal peptide thioester And 1 mg of model peptide Nα 1-, (4-methoxyphenyl) 2-mercaptoethaneglycine-S—Y—R—F-L (MW 908) were dissolved in 0.15 ml of 6 M guanidinium buffer (pH 7). The pH was adjusted to 7.2 by the addition of triethylamine and 0.03 ml of triphenol. After overnight stirring, ligation was 69% complete, estimated from consumption of peptide thioester, and after 40 hours, 76% was complete. The expected ligation product was 4893 Da, and in fact 4893 Daw.

実施例２４： ライゲーション後の１−（，４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタン基の除去
実施例２３（Ｌｙｓ−Ｇｌｙライゲーション）の凍結乾燥脱塩粗製物を、１ｍｇのＴＦＡ、２５μｌのエタンジチオール、５０μｌのＴＩＳに溶解させた。次に、１５０μｌのブロモトリメチルシランを添加した。反応を、室温（"ｒｔ"）で２時間進行させた。混合物の揮発性成分を真空中で蒸発させ、残留油を６Ｍのグアニジニウム緩衝液ｐＨ７．５に取込んだ。有機物質をＣＨＣｌ３で抽出した。ＨＰＬＣはもはや出発物質を示さず、したがって補助基の除去がうまくいったことを示している。天然配列の場合に予想される質量は４７２６Ｄａであり、実際は４７２５Ｄａであった。 Example 24: Removal of 1-(, 4-methoxyphenyl) 2-mercaptoethane group after ligation The lyophilized desalted crude product of Example 23 (Lys-Gly ligation) was treated with 1 mg TFA, 25 μl ethanedithiol, Dissolved in 50 μl TIS. Next, 150 μl of bromotrimethylsilane was added. The reaction was allowed to proceed for 2 hours at room temperature ("rt"). The volatile components of the mixture were evaporated in vacuo and the residual oil was taken up in 6M guanidinium buffer pH 7.5. The organic material was extracted with CHCl3. HPLC no longer shows starting material, thus indicating successful removal of auxiliary groups. The expected mass for the native sequence was 4726 Da and was actually 4725 Da.

実施例２５： ＧＳＹＲＦＬペプチドに対するライゲーションの比較検討
実施例１３〜２０及び２４のＧＳＹＲＦＬペプチドに対する５員転位ライゲーションの比較検討を、下記の表Ｖにまとめて示す。 Example 25: Comparative Study of Ligation against GSYRFL Peptide Comparative study of 5-membered rearrangement ligation against GSYRFL peptides of Examples 13-20 and 24 is summarized in Table V below.

実施例２６： ＢｏｃグリシンＮ−１（４'−メトキシフェニル），２（４'−メチルベンジルチオ）エタンの生成
４'−メトキシ ２（４'メチルベンジルチオ）アセトフェノン２ｍｍｏｌ（５７２ｍｇ）と、グリシンエチルエステルＨＣｌ塩２ｍｍｏｌ（１３９．５ｍｇ）とを、１５ｍｌのＤＣＭ中に懸濁させた。ＤＩＥＡ ６ｍｍｏｌ（１ｇ）をゆっくりと添加し、窒素雰囲気で、１ｍｌの四塩化チタン（１Ｍ溶液）を添加した。 Example 26: Formation of Boc glycine N-1 (4'-methoxyphenyl), 2 (4'-methylbenzylthio) ethane 4'-methoxy 2 (4'methylbenzylthio) acetophenone 2mmol (572mg) and glycine ethyl Ester HCl salt 2mmol (139.5mg) was suspended in 15ml DCM. 6 mmol (1 g) of DIEA was slowly added and 1 ml of titanium tetrachloride (1M solution) was added under a nitrogen atmosphere.

反応を室温で２日間進行させた。次に、ナトリウムシアノボロヒドリド６ｍｍｏｌ（０．４ｇ）を２．５ｍｌの無水メタノールに溶解させたものを、添加した。ＴＬＣによれば、約４０％の少量の新しい生成物が生じており、これは、精製したあと、ＮＭＲにより、Ｎ−１（４−メトキシフェニル），２（４−メチルベンジルチオ）エタングリシンエチルエステルと確認された。 The reaction was allowed to proceed for 2 days at room temperature. Next, 6 mmol (0.4 g) of sodium cyanoborohydride dissolved in 2.5 ml of anhydrous methanol was added. According to TLC, a small amount of new product of about 40% was produced, which was purified by NMR and N-1 (4-methoxyphenyl), 2 (4-methylbenzylthio) ethaneglycine ethyl after purification. Identified as an ester.

次に、１ｍｍｏｌ（３７４ｍｇ）のＮ−１（４−メトキシフェニル），２（４−メチルベンジルチオ）エタングリシンエチルエステルを、２ｍｌのＴＨＦに溶解させ、得られる溶液に、２ｍｍｏｌ（８３ｍｇ）のＬｉＯＨ水和物を添加した。一晩の撹拌の後、エステルは完全に加水分解されていた。ＴＨＦを真空中で除去し、生成物を２ｍｌのＤＭＦに取込み、５ｍｍｏｌ（１．１ｇ）のジブチルジカーボネートを添加し、最後に、３ｍｍｏｌ（０．４５ｍｌ）のＤＩＥＡを加えた。一晩の反応の後、希釈したＨＣｌ水溶液を添加し、最終生成物を酢酸エチル（３×）によって抽出した。 Next, 1 mmol (374 mg) of N-1 (4-methoxyphenyl), 2 (4-methylbenzylthio) ethaneglycine ethyl ester was dissolved in 2 ml of THF, and 2 mmol (83 mg) of LiOH was added to the resulting solution. Hydrate was added. After overnight stirring, the ester was completely hydrolyzed. The THF was removed in vacuo, the product was taken up in 2 ml DMF, 5 mmol (1.1 g) dibutyl dicarbonate was added, and finally 3 mmol (0.45 ml) DIEA was added. After an overnight reaction, diluted aqueous HCl was added and the final product was extracted with ethyl acetate (3 ×).

以上、本発明を十分に説明したが、本発明の趣旨及び特許請求の範囲を逸脱することなく前記実施形態には多くの変形及び変更を加えることができることは、当業者には容易に理解しうるであろう。 Although the present invention has been fully described above, those skilled in the art will readily understand that many variations and modifications can be made to the embodiments without departing from the spirit and scope of the claims. It will be possible.

本発明におけるペプチドの拡張天然型化学的ライゲーションを説明する図である。It is a figure explaining the expansion natural type chemical ligation of the peptide in this invention. 本発明における他のペプチドの拡張天然型化学的ライゲーションを説明する図である。It is a figure explaining the extended natural type chemical ligation of the other peptide in this invention. 本発明における多要素の拡張天然型化学的ライゲーション法を説明する図である。It is a figure explaining the multi-element extended natural type chemical ligation method in this invention. 二つの異なる１−フェニル−２−メルカプトエチル補助基を使用する、本発明のライゲーション方策の概要を示す図である。FIG. 2 shows an overview of the ligation strategy of the present invention using two different 1-phenyl-2-mercaptoethyl auxiliary groups. Ｎα−１−（４−メトキシフェニル）−２−メルカプトエチル補助基を使用する、実施例２１で述べるようなシトクロムｂ５６２に対するライゲーション反応に関する、分析高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の結果を示す図であり、時刻＝０におけるライゲーション反応の状態を示す。FIG. 6 shows analytical high performance liquid chromatography (HPLC) results for a ligation reaction on cytochrome b562 as described in Example 21 using a Nα-1- (4-methoxyphenyl) -2-mercaptoethyl auxiliary group. , Shows the state of the ligation reaction at time = 0. 図５Ａと同様な図であり、反応を一晩進行させたあとのライゲーションの状態を示す。It is a figure similar to FIG. 5A, and shows the state of ligation after allowing the reaction to proceed overnight. Ｎα−｛１−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタノ｝改質Ｎ末端セグメントとの拡張天然型化学的ライゲーションを使用することによって生成されたライゲーション生成物シトクロムｂ５６２残基１−１０６の再構成エレクトロスプレー（ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）質量分析（ＭＳ）の結果を示す図であり、ライゲーション部位に除去できるＮα−｛１−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタノ｝基を有する初期ライゲーション生成物のＭＳ再構成を示す。Reconstitution of the ligation product cytochrome b562 residues 1-106 generated by using extended natural chemical ligation with Nα- {1- (4-methoxyphenyl) 2-mercaptoethano} modified N-terminal segment FIG. 5 is a diagram showing the results of electrosprayed electrospray mass spectrometry (MS), MS re-production of an initial ligation product having a Nα- {1- (4-methoxyphenyl) 2-mercaptoethano} group that can be removed at the ligation site. The configuration is shown. 図６Ａと同様な図であり、ライゲーション部位に天然アミド結合を生成させるためにＮα−｛１−（４−メトキシフェニル）２−メルカプトエタノ｝基を除去するフッ化水素（ＨＦ）処理後のライゲーション生成物のＭＳ再構成を示す。FIG. 6B is a diagram similar to FIG. 6A, and ligation after treatment with hydrogen fluoride (HF) to remove the Nα- {1- (4-methoxyphenyl) 2-mercaptoethano} group to form a natural amide bond at the ligation site. The MS reconstitution of the product is shown. 図６Ｂに示す直鎖状シトクロムｂ５６２物質の代表的な分析ＨＰＬＣの結果を示す図である。It is a figure which shows the result of the typical analytical HPLC of the linear cytochrome b562 substance shown to FIG. 6B. 折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）後の該物質のイオン交換クロマトグラムを示す図である。It is a figure which shows the ion exchange chromatogram of this substance after folding (folding).

Claims (45)

Ｎ置換アミド化合物であって、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−Ｊ２ Ｉ
または
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）
−Ｊ２ ＩＩ
を有し、
これらの式において、
Ｊ１及びＪ２が、それぞれ個別に、随意に保護された一つ以上のアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分、ポリマー、染料、官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカーであり、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、それぞれ個別に、共有結合によってＣ１に複合したＨまたは電子供与基であり、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換されていない、あるいは、オルソ位置あるいはパラ位置でヒドロキシルあるいはチオールで置換された、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択され、
Ｃ２及びＣ３は炭素であるが、
ただし前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち少なくとも一つが、Ｃ１に複合した前記電子供与基から成る、
ことを特徴とするＮ置換アミド化合物。 An N-substituted amide compound comprising:
Formula J1-C (O) -N (C1 (R1) -C2-SH) -J2 I
Or J1-C (O) -N (C1 (R1) -C2 (R2) -C3 (R3) -SH)
-J2 II
Have
In these equations,
J1 and J2 are each independently a peptide or polypeptide having one or more amino acid side chains optionally protected, or a component, polymer, dye, functional group surface, linker of such peptide or polypeptide Or a detectable marker,
R 1, R 2, and R 3 are each independently H or an electron donating group conjugated to C 1 through a covalent bond, substituted or unsubstituted, phenyl; unsubstituted, or ortho-position or para- Picolyl substituted with hydroxyl or thiol in position; selected from the group consisting of methaneethiol, sulfoxymethyl, methoxy, thiol, hydroxyl, methylthio, methyl, ethyl, propyl, and isopropyl;
C2 and C3 are carbon,
Provided that at least one of R1, R2 and R3 comprises the electron donating group conjugated to C1,
N-substituted amide compound characterized by the above-mentioned. 当該式Ｉを有することを特徴とする請求項１に記載のＮ置換アミド化合物。   The N-substituted amide compound according to claim 1, which has the formula I. Ｃ１（Ｒ１）が、下記のＡ、Ｂ、及びＣ

から成る群から選択され、
これらの式において、
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'が、同じかまたは異なることのできる電子供与基から成り、水素、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択される、
ことを特徴とする請求項２に記載のＮ置換アミド化合物。 C1 (R1) is the following A, B, and C

Selected from the group consisting of
In these equations,
R1 ′, R3 ′, and R5 ′ consist of electron donor groups that can be the same or different and are selected from the group consisting of hydrogen, methoxy, thiol, hydroxyl, methylthio, methyl, ethyl, propyl, and isopropyl;
The N-substituted amide compound according to claim 2. 当該式ＩＩを有することを特徴とする請求項１に記載のＮ置換アミド化合物。   The N-substituted amide compound according to claim 1, which has the formula II. Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）が、下記のＤ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＩ

から成る群から選択され、
これらの式において、
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち一つ以上が、同じかまたは異なることのできる電子供与基から成り、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択される、
ことを特徴とする請求項４に記載のＮ置換アミド化合物。 C1 (R1) -C2 (R2) -C3 (R3) is represented by the following D, E, F, G, H and I

Selected from the group consisting of
In these equations,
One or more of R1 ′, R3 ′, and R5 ′ are composed of electron donor groups that can be the same or different and are selected from the group consisting of methoxy, thiol, hydroxyl, methylthio, methyl, ethyl, propyl, and isopropyl To be
The N-substituted amide compound according to claim 4. 当該置換されたＮが、Ｎα置換アミドであることを特徴とする請求項１から５の中のいずれか１つに記載のＮ置換アミド化合物。   The N-substituted amide compound according to claim 1, wherein the substituted N is an Nα-substituted amide. Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち少なくとも一つが、メトキシ（−ＯＣＨ₃）、チオール（−ＳＨ）、ヒドロキシル（−ＯＨ）、及びチオメチル（−ＳＣＨ₃）から成る群から選択されることを特徴とする請求項３または５に記載のＮ置換アミド化合物。 At least one of R1 ′, R3 ′, and R5 ′ is selected from the group consisting of methoxy (—OCH ₃ ), thiol (—SH), hydroxyl (—OH), and thiomethyl (—SCH ₃ ). The N-substituted amide compound according to claim 3 or 5, Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち少なくとも一つが、メチル（−ＣＨ₃）、エチル（−ＣＨ₂−ＣＨ₃）、プロピル（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₃）、及びイソプロピル（−ＣＨ₂（ＣＨ₃）₃）から成ることを特徴とする請求項３または５に記載のＮ置換アミド化合物。 At least one of R1 ′, R3 ′, and R5 ′ is methyl (—CH ₃ ), ethyl (—CH ₂ —CH ₃ ), propyl (—CH ₂ —CH ₂ —CH ₃ ), and isopropyl (—CH _2. The N-substituted amide compound according to claim 3, which comprises ₂ (CH ₃ ) ₃ ). Ｊ１が、一つ以上の随意に保護されたアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチドであるか、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分であることを特徴とする請求項１、２、または４に記載のＮ置換アミド化合物。   J1, is a peptide or polypeptide having one or more optionally protected amino acid side chains, or is a component of such a peptide or polypeptide. N-substituted amide compounds described in 1. Ｊ１が、ポリマーであることを特徴とする請求項１、２、または４に記載のＮ置換アミド化合物。   The N-substituted amide compound according to claim 1, 2, or 4, wherein J1 is a polymer. Ｊ２が、一つ以上の随意に保護されたアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチドであるか、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分であることを特徴とする請求項１、２、または４に記載のＮ置換アミド化合物。   A peptide or polypeptide having one or more optionally protected amino acid side chains, or a component of such a peptide or polypeptide, wherein J2 is a peptide or polypeptide. N-substituted amide compounds described in 1. Ｊ２が、ポリマー、染料、官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカー、または化学的ペプチド合成もしくは拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の他の化学成分であることを特徴とする請求項１、２、または４に記載のＮ置換アミド化合物。   J2 is a polymer, dye, functional surface, linker or detectable marker, or any other chemical moiety compatible with chemical peptide synthesis or extended natural chemical ligation. The N-substituted amide compound according to 1, 2, or 4. 酸安定なＮ置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオール化合物であって、
式
ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−ＨＮ−Ｊ２ ＩＩＩ
または
ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−ＨＮ−Ｊ２ ＩＶ
を有し、
これらの式において、
Ｊ１及びＪ２が、それぞれ個別に、随意に保護された一つ以上のアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分、ポリマー、染料、官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカー、または化学的ペプチド合成もしくは拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の他の化学成分であり、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、それぞれ個別に、共有結合によってＣ１に複合したＨまたは電子供与基であり、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換された、あるいは置換されていない、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択されるが、
ただしＲ１、Ｒ２、及びＲ３のうち少なくとも一つが、共有結合によってＣ１に複合した電子供与基から成る、
ことを特徴とする酸安定なＮ置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオール化合物。 An acid stable N-substituted 2 or 3 carbon chain aminoalkyl or aryl thiol compound comprising:
Formula HS-C2-C1 (R1) -HN-J2 III
Or HS-C3 (R3) -C2 (R2) -C1 (R1) -HN-J2 IV
Have
In these equations,
J1 and J2 are each independently a peptide or polypeptide having one or more amino acid side chains optionally protected, or a component, polymer, dye, functional group surface, linker of such peptide or polypeptide Or a detectable marker, or any other chemical moiety compatible with chemical peptide synthesis or extended natural chemical ligation,
R1, R2, and R3 are each independently H or an electron donating group conjugated to C1 by a covalent bond, substituted or unsubstituted, phenyl; substituted or unsubstituted, picolyl Selected from the group consisting of methaneethiol, sulfoxymethyl, methoxy, thiol, hydroxyl, methylthio, methyl, ethyl, propyl, and isopropyl;
Provided that at least one of R1, R2 and R3 comprises an electron donating group conjugated to C1 by a covalent bond,
An acid stable N-substituted 2 or 3 carbon chain aminoalkyl or aryl thiol compound characterized in that 当該化合物が式ＩＩＩを有することを特徴とする請求項１３に記載の酸安定なＮ置換化合物。   14. The acid stable N-substituted compound according to claim 13, wherein the compound has the formula III. Ｃ１（Ｒ１）が、下記のＡ、Ｂ、及びＣ

から成る群から選択され、
これらの式において、
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち一つ以上が、同じかまたは異なることのできる電子供与基から成り、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換された、あるいは置換されていない、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択される、
ことを特徴とする請求項１４に記載の酸安定なＮ置換化合物。 C1 (R1) is the following A, B, and C

Selected from the group consisting of
In these equations,
One or more of R 1 ′, R 3 ′, and R 5 ′ are composed of electron-donating groups that can be the same or different and are substituted or unsubstituted, phenyl; substituted or unsubstituted , Picolyl; selected from the group consisting of methaneethiol, sulfoxymethyl, methoxy, thiol, hydroxyl, methylthio, methyl, ethyl, propyl, and isopropyl;
The acid-stable N-substituted compound according to claim 14. 当該化合物が式ＩＶを有することを特徴とする請求項１３に記載の酸安定なＮ置換化合物。   14. Acid stable N-substituted compound according to claim 13, characterized in that the compound has the formula IV. Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）が、下記のＤ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＩ

から成る群から選択され、
これらの式において、
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち一つ以上が、同じかまたは異なることのできる電子供与基から成り、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換された、あるいは置換されていない、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択される、
ことを特徴とする請求項１６に記載の酸安定なＮ置換化合物。 C3 (R3) -C2 (R2) -C1 (R1) is the following D, E, F, G, H and I

Selected from the group consisting of
In these equations,
One or more of R 1 ′, R 3 ′, and R 5 ′ are composed of electron-donating groups that can be the same or different and are substituted or unsubstituted, phenyl; substituted or unsubstituted , Picolyl; selected from the group consisting of methaneethiol, sulfoxymethyl, methoxy, thiol, hydroxyl, methylthio, methyl, ethyl, propyl, and isopropyl;
The acid-stable N-substituted compound according to claim 16. 当該置換ＮがＮα置換化合物であることを特徴とする請求項１３から１７の中のいずれか１つに記載の酸安定なＮ置換化合物。   The acid-stable N-substituted compound according to any one of claims 13 to 17, wherein the substituted N is an Nα-substituted compound. Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち少なくとも一つが、メトキシ（−ＯＣＨ₃）、チオール（−ＳＨ）、ヒドロキシル（−ＯＨ）、及びチオメチル（−ＳＣＨ₃）から成る群から選択されることを特徴とする請求項１５または１７に記載の酸安定なＮ置換化合物。 At least one of R1 ′, R3 ′, and R5 ′ is selected from the group consisting of methoxy (—OCH ₃ ), thiol (—SH), hydroxyl (—OH), and thiomethyl (—SCH ₃ ). 18. An acid stable N-substituted compound according to claim 15 or 17 characterized in. 中程度の電子供与基が、メチル（−ＣＨ₃）、エチル（−ＣＨ₂−ＣＨ₃）、プロピル（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₃）、及びイソプロピル（−ＣＨ₂（ＣＨ₃）₃）から成ることを特徴とする請求項１５または１７に記載の酸安定なＮ置換化合物。 Medium electron donating groups are methyl (—CH ₃ ), ethyl (—CH ₂ —CH ₃ ), propyl (—CH ₂ —CH ₂ —CH ₃ ), and isopropyl (—CH ₂ (CH ₃ ) ₃ ). 18. The acid stable N-substituted compound according to claim 15 or 17, characterized in that Ｊ２が、一つ以上の随意に保護されたアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチドであるか、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分であることを特徴とする請求項１３、１４、または１６に記載の酸安定なＮ置換化合物。   17. J13 is a peptide or polypeptide having one or more optionally protected amino acid side chains, or is a component of such a peptide or polypeptide. An acid stable N-substituted compound as described in 1. Ｊ２が、ポリマー、染料、官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカー、または化学的ペプチド合成もしくは拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の他の化学成分であることを特徴とする請求項１３、１４、または１６に記載の酸安定なＮ置換化合物。   J2 is a polymer, dye, functional surface, linker or detectable marker, or any other chemical moiety compatible with chemical peptide synthesis or extended natural chemical ligation. The acid stable N-substituted compound according to 13, 14, or 16. Ｎ置換アミド化合物であって、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−Ｊ２ Ｉ
または
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）
−Ｊ２ ＩＩ
を有し、
これらの式において、
Ｊ１及びＪ２が、それぞれ個別に、随意に保護された一つ以上のアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分、ポリマー、染料、官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカーであり、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、それぞれ個別に、共有結合によってＣ１に複合したＨまたは電子供与基であり、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換されていない、あるいは、オルソ位置あるいはパラ位置でヒドロキシルあるいはチオールで置換された、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択され、
式 Ｊ１−Ｃ（Ｏ）ＳＲ のα−カルボキシルチオエステルから成る第一の要素を、
式
ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−ＨＮ−Ｊ２ ＩＩＩ
または
ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−ＨＮ−Ｊ２ ＩＶ
を有する酸安定なＮ置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールから成る第二の要素と結合するプロセスによって生成され、
式ＩＩＩ及びＩＶにおいて、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、それぞれ個別に、共有結合によってＣ１に複合したＨまたは電子供与基であり、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換された、あるいは置換されていない、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択されるが、ただしＲ１、Ｒ２、及びＲ３のうち少なくとも一つが、共有結合によってＣ１に複合した電子供与基から成る、
ことを特徴とするＮ置換アミド化合物。 An N-substituted amide compound comprising:
Formula J1-C (O) -N (C1 (R1) -C2-SH) -J2 I
Or J1-C (O) -N (C1 (R1) -C2 (R2) -C3 (R3) -SH)
-J2 II
Have
In these equations,
J1 and J2 are each independently a peptide or polypeptide having one or more amino acid side chains optionally protected, or a component, polymer, dye, functional group surface, linker of such peptide or polypeptide Or a detectable marker,
R 1, R 2, and R 3 are each independently H or an electron donating group conjugated to C 1 through a covalent bond, substituted or unsubstituted, phenyl; unsubstituted, or ortho-position or para- Picolyl substituted with hydroxyl or thiol in position; selected from the group consisting of methaneethiol, sulfoxymethyl, methoxy, thiol, hydroxyl, methylthio, methyl, ethyl, propyl, and isopropyl;
A first element consisting of an α-carboxylthioester of formula J1-C (O) SR
Formula HS-C2-C1 (R1) -HN-J2 III
Or HS-C3 (R3) -C2 (R2) -C1 (R1) -HN-J2 IV
Produced by a process combining with a second element consisting of an acid stable N-substituted 2 or 3 carbon chain aminoalkyl or aryl thiol having
In formulas III and IV,
R1, R2, and R3 are each independently H or an electron donating group conjugated to C1 by a covalent bond, substituted or unsubstituted, phenyl; substituted or unsubstituted, picolyl Selected from the group consisting of methaneethiol, sulfoxymethyl, methoxy, thiol, hydroxyl, methylthio, methyl, ethyl, propyl, and isopropyl, provided that at least one of R1, R2, and R3 is covalently bonded to C1; Consisting of complex electron donating groups,
N-substituted amide compound characterized by the above-mentioned. 当該酸安定なＮ置換化合物が、式ＩＩＩを有することを特徴とする請求項２３に記載のＮ置換アミド化合物。   24. The N-substituted amide compound of claim 23, wherein the acid stable N-substituted compound has the formula III. 当該酸安定なＮ置換化合物のＣ１（Ｒ１）が、下記のＡ、Ｂ、及びＣ

から成る群から選択され、
これらの式において、
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち一つ以上が、同じかまたは異なることのできる電子供与基から成り、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換された、あるいは置換されていない、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択される、
ことを特徴とする請求項２４に記載のＮ置換アミド化合物。 C1 (R1) of the acid-stable N-substituted compound is represented by the following A, B, and C

Selected from the group consisting of
In these equations,
One or more of R 1 ′, R 3 ′, and R 5 ′ are composed of electron-donating groups that can be the same or different and are substituted or unsubstituted, phenyl; substituted or unsubstituted , Picolyl; selected from the group consisting of methaneethiol, sulfoxymethyl, methoxy, thiol, hydroxyl, methylthio, methyl, ethyl, propyl, and isopropyl;
25. The N-substituted amide compound according to claim 24. 当該酸安定なＮ置換化合物が、前記式ＩＶを有することを特徴とする請求項２３に記載のＮ置換アミド化合物。   24. The N-substituted amide compound of claim 23, wherein the acid stable N-substituted compound has the formula IV. Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）が、下記のＤ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＩ

から成る群から選択され、
これらの式において、Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち一つ以上が、同じかまたは異なることのできる電子供与基から成り、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換された、あるいは置換されていない、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択される、
ことを特徴とする請求項２６に記載のＮ置換アミド化合物。 C1 (R1) -C2 (R2) -C3 (R3) is represented by the following D, E, F, G, H and I

Selected from the group consisting of
In these formulas, one or more of R1 ′, R3 ′, and R5 ′ consist of electron-donating groups that can be the same or different, substituted or unsubstituted, phenyl; Or unsubstituted, picolyl; selected from the group consisting of methaneethiol, sulfoxymethyl, methoxy, thiol, hydroxyl, methylthio, methyl, ethyl, propyl, and isopropyl;
27. The N-substituted amide compound according to claim 26. 当該置換Ｎが、Ｎα置換化合物であることを特徴とする請求項２３から２６の中のいずれか１つに記載のＮ置換アミド化合物。   27. The N-substituted amide compound according to any one of claims 23 to 26, wherein the substituted N is an Nα-substituted compound. Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち少なくとも一つが、メトキシ（−ＯＣＨ₃）、チオール（−ＳＨ）、ヒドロキシル（−ＯＨ）、及びチオメチル（−ＳＣＨ₃）から成る群から選択されることを特徴とする請求項２５または２７に記載のＮ置換アミド化合物。 At least one of R1 ′, R3 ′, and R5 ′ is selected from the group consisting of methoxy (—OCH ₃ ), thiol (—SH), hydroxyl (—OH), and thiomethyl (—SCH ₃ ). 28. The N-substituted amide compound according to claim 25 or 27. Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち少なくとも一つが、メチル（−ＣＨ₃）、エチル（−ＣＨ₂−ＣＨ₃）、プロピル（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₃）、及びイソプロピル（−ＣＨ₂（ＣＨ₃）₃）から成る群から選択されることを特徴とする請求項２５または２７に記載のＮ置換アミド化合物。 At least one of R1 ′, R3 ′, and R5 ′ is methyl (—CH ₃ ), ethyl (—CH ₂ —CH ₃ ), propyl (—CH ₂ —CH ₂ —CH ₃ ), and isopropyl (—CH The N-substituted amide compound according to claim 25 or 27, which is selected from the group consisting of ₂ (CH ₃ ) ₃ ). Ｊ１が、一つ以上の随意に保護されたアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチドであるか、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分であることを特徴とする請求項２３、２４、または２６に記載のＮ置換アミド化合物。   27. 24, or 26, wherein J1 is a peptide or polypeptide having one or more optionally protected amino acid side chains, or is a component of such a peptide or polypeptide. N-substituted amide compounds described in 1. Ｊ２が、一つ以上の随意に保護されたアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチドであるか、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分であることを特徴とする請求項２３、２４、または２６に記載のＮ置換アミド化合物。   27. 24, or 26, wherein J2 is a peptide or polypeptide having one or more optionally protected amino acid side chains, or is a component of such a peptide or polypeptide. N-substituted amide compounds described in 1. Ｊ２が、ポリマー、染料、官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカーであることを特徴とする請求項２３、２４、または２６に記載のＮ置換アミド化合物。   27. N-substituted amide compound according to claim 23, 24 or 26, wherein J2 is a polymer, dye, functional surface, linker or detectable marker. 式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−ＨＮ−Ｊ２ Ｖ
を有し、
この式において、
Ｊ１及びＪ２が、それぞれ個別に、随意に保護された一つ以上のアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分、ポリマー、染料、官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカーである、
化合物を生成する方法であって、
ステップ（Ａ） 式 Ｊ１−Ｃ（Ｏ）ＳＲ のα−カルボキシルチオエステルから成る第一の要素を、
式
ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−ＨＮ−Ｊ２ ＩＩＩ
を有する酸安定なＮ置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールから成る第二の要素と結合させて、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−Ｊ２ Ｉ
を有するＮ置換アミド結合ライゲーション生成物を生成し、
式ＩＩＩにおいて、
Ｒ１は共有結合によってＣ１に複合した電子供与基であり、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換されていない、あるいは、オルソ位置あるいはパラ位置でヒドロキシルあるいはチオールで置換された、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択され、
ステップ（Ｂ） 前記２炭素鎖アルキルまたはアリールチオールを、前記Ｎ置換アミド結合ライゲーション生成物から、Ｎα−Ｃ１結合の開裂によって除去する、
各ステップから成る、
ことを特徴とする方法。 Formula J1-C (O) -HN-J2 V
Have
In this formula:
J1 and J2 are each independently a peptide or polypeptide having one or more amino acid side chains optionally protected, or a component, polymer, dye, functional group surface, linker of such peptide or polypeptide Or a detectable marker,
A method of producing a compound comprising:
Step (A) A first element consisting of an α-carboxylthioester of formula J1-C (O) SR
Formula HS-C2-C1 (R1) -HN-J2 III
In combination with a second element consisting of an acid stable N-substituted 2 or 3 carbon chain aminoalkyl or aryl thiol having
Formula J1-C (O) -N (C1 (R1) -C2-SH) -J2 I
Producing an N-substituted amide bond ligation product having
In Formula III,
R1 is an electron donating group conjugated to C1 by a covalent bond, substituted or unsubstituted, phenyl; unsubstituted or picolyl substituted with hydroxyl or thiol in the ortho or para position; Selected from the group consisting of methaneethiol, sulfoxymethyl, methoxy, thiol, hydroxyl, methylthio, methyl, ethyl, propyl, and isopropyl;
Step (B) The 2-carbon chain alkyl or aryl thiol is removed from the N-substituted amide bond ligation product by cleavage of the Nα-C1 bond.
Consisting of each step,
A method characterized by that. 式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−ＨＮ−Ｊ２ Ｖ
を有し、
この式において、
Ｊ１及びＪ２が、それぞれ個別に、随意に保護された一つ以上のアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分、ポリマー、染料、官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカー、または化学的ペプチド合成もしくは拡張天然型化学的ライゲーションに適合する任意の他の化学成分である、
化合物を生成する方法であって、
ステップ（Ａ） 式 Ｊ１−Ｃ（Ｏ）ＳＲ のα−カルボキシルチオエステルから成る第一の要素を、
式
ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−ＨＮ−Ｊ２ ＩＶ
を有する酸安定なＮ置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールから成る第二の要素と結合させて、
式
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）
−Ｊ２ ＩＩ
を有するＮ置換アミド結合ライゲーション生成物を生成し、
式ＩＶにおいて、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、それぞれ個別に、Ｃ１に複合したＨまたは電子供与基であり、ただし、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、共有結合によってＣ１に複合した電子供与基から成り、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換されていない、あるいは、オルソ位置あるいはパラ位置でヒドロキシルあるいはチオールで置換された、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択され、
ステップ（Ｂ） 前記３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールを、前記Ｎ置換アミド結合ライゲーション生成物から、Ｎα−Ｃ１結合の開裂によって除去する、
各ステップから成る、
ことを特徴とする方法。 Formula J1-C (O) -HN-J2 V
Have
In this formula:
J1 and J2 are each independently a peptide or polypeptide having one or more amino acid side chains optionally protected, or a component, polymer, dye, functional group surface, linker of such peptide or polypeptide Or a detectable marker, or any other chemical moiety compatible with chemical peptide synthesis or extended natural chemical ligation,
A method of producing a compound comprising:
Step (A) A first element consisting of an α-carboxylthioester of formula J1-C (O) SR
Formula HS-C3 (R3) -C2 (R2) -C1 (R1) -HN-J2 IV
In combination with a second element consisting of an acid stable N-substituted 2 or 3 carbon chain aminoalkyl or aryl thiol having
Formula J1-C (O) -N (C1 (R1) -C2 (R2) -C3 (R3) -SH)
-J2 II
Producing an N-substituted amide bond ligation product having
In formula IV:
R1, R2, and R3 are each independently H or an electron donating group conjugated to C1, provided that R1, R2, and R3 consist of an electron donating group conjugated to C1 by a covalent bond and are substituted. , Or unsubstituted, phenyl; unsubstituted, or substituted with hydroxyl or thiol in the ortho or para position, picolyl; methaneethiol, sulfoxymethyl, methoxy, thiol, hydroxyl, methylthio, methyl, ethyl, Selected from the group consisting of propyl and isopropyl;
Step (B) The 3-carbon chain alkyl or aryl thiol is removed from the N-substituted amide bond ligation product by cleavage of the Nα-C1 bond.
Consisting of each step,
A method characterized by that. 当該酸安定なＮ置換化合物のＣ１（Ｒ１）が、下記のＡ、Ｂ、及びＣ

から成る群から選択され、
これらの式において、
Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち一つ以上が、同じかまたは異なることのできる電子供与基から成り、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換された、あるいは置換されていない、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択される
ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。 C1 (R1) of the acid-stable N-substituted compound is represented by the following A, B, and C

Selected from the group consisting of
In these equations,
One or more of R 1 ′, R 3 ′, and R 5 ′ are composed of electron-donating groups that can be the same or different and are substituted or unsubstituted, phenyl; substituted or unsubstituted 35. The method of claim 34, wherein the method is selected from the group consisting of: metholethiol, sulfoxymethyl, methoxy, thiol, hydroxyl, methylthio, methyl, ethyl, propyl, and isopropyl. 当該酸安定なＮ置換化合物のＣ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）が、下記のＤ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＩ

から成る群から選択され、
これらの式において、Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち一つ以上が、同じかまたは異なることのできる電子供与基から成り、置換された、あるいは置換されていない、フェニル；置換された、あるいは置換されていない、ピコリル；メタンエチオル、スルホキシメチル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、メチルチオ、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルから成る群から選択される、
ことを特徴とする請求項３５に記載の方法。 The acid-stable N-substituted compound C1 (R1) -C2 (R2) -C3 (R3) is represented by the following D, E, F, G, H and I

Selected from the group consisting of
In these formulas, one or more of R1 ′, R3 ′, and R5 ′ consist of electron-donating groups that can be the same or different, substituted or unsubstituted, phenyl; Or unsubstituted, picolyl; selected from the group consisting of methaneethiol, sulfoxymethyl, methoxy, thiol, hydroxyl, methylthio, methyl, ethyl, propyl, and isopropyl;
36. The method of claim 35. 当該Ｎ置換化合物が、Ｎα置換化合物であることを特徴とする請求項３４から３７の中のいずれか１つに記載の方法。   38. The method according to any one of claims 34 to 37, wherein the N-substituted compound is a Nα-substituted compound. Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち少なくとも一つが、メトキシ（−ＯＣＨ₃）、チオール（−ＳＨ）、ヒドロキシル（−ＯＨ）、及びチオメチル（−ＳＣＨ₃）から成る群から選択されることを特徴とする請求項３６または３７に記載の方法。 At least one of R1 ′, R3 ′, and R5 ′ is selected from the group consisting of methoxy (—OCH ₃ ), thiol (—SH), hydroxyl (—OH), and thiomethyl (—SCH ₃ ). 38. A method as claimed in claim 36 or 37. Ｒ１'、Ｒ３'、及びＲ５'のうち少なくとも一つが、メチル（−ＣＨ₃）、エチル（−ＣＨ₂−ＣＨ₃）、プロピル（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₃）、及びイソプロピル（−ＣＨ₂（ＣＨ₃）₃）から成る群から選択されることを特徴とする請求項３６または３７に記載の方法。 At least one of R1 ′, R3 ′, and R5 ′ is methyl (—CH ₃ ), ethyl (—CH ₂ —CH ₃ ), propyl (—CH ₂ —CH ₂ —CH ₃ ), and isopropyl (—CH the method of claim 36 or 37, characterized in ₂ (CH _{3) 3)} is selected from the group consisting of. Ｊ１が、一つ以上の随意に保護されたアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドまたはポリペプチドの成分であることを特徴とする請求項３６または３７に記載の方法。   38. The method of claim 36 or 37, wherein J1 is a peptide or polypeptide having one or more optionally protected amino acid side chains, or a component of such a peptide or polypeptide. Ｊ２が、一つ以上の随意に保護されたアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチドであるか、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分であることを特徴とする請求項３６または３７に記載の方法。   38. The peptide of claim 36 or 37, wherein J2 is a peptide or polypeptide having one or more optionally protected amino acid side chains, or is a component of such a peptide or polypeptide. Method. Ｊ２が、ポリマー、染料、官能基を有する表面、リンカーもしくは検出可能なマーカーであることを特徴とする請求項３６または３７に記載の方法。   38. A method according to claim 36 or 37, wherein J2 is a polymer, a dye, a functional surface, a linker or a detectable marker. 当該化合物が溶液中で合成されることを特徴とする請求項３６または３７に記載の方法。   38. A method according to claim 36 or 37, wherein the compound is synthesized in solution. 当該化合物が、固体支持体に固定されて合成されることを特徴とする請求項３６または３７に記載の方法。   38. The method according to claim 36 or 37, wherein the compound is synthesized by being immobilized on a solid support.

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