JPWO2018194134A1 - Anti-periostin antibody-immobilized carrier, periostin measuring reagent, and method for stabilizing antibodies on anti-periostin antibody-immobilized carrier - Google Patents
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Abstract
【課題】安定化された抗ペリオスチン抗体固定化担体を提供すること、安定化されたペリオスチン測定試薬を提供すること、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗体の安定化方法を提供する。【解決手段】担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、界面活性剤及び糖、界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩、又は界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩を接触させたことを特徴とするものである。【選択図】なしAn object of the present invention is to provide a stabilized carrier for immobilizing an anti-periostin antibody, a stabilized reagent for measuring periostin, and a method for stabilizing an antibody in the carrier for immobilizing an anti-periostin antibody. An anti-periostin antibody immobilized on a carrier is contacted with a surfactant and sugar, a surfactant and arginine or a salt thereof, or a surfactant, a sugar and arginine or a salt thereof. It is. [Selection diagram] None
Description
本発明は、アレルギー疾患や他の疾患のマーカーとなりうるペリオスチン（骨芽細胞特異因子２又はＯＳＦ２とも呼ばれる）の測定に使用される抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチン測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体の安定化方法に関するものである。
本発明は、臨床検査、臨床病理学、免疫学及び医学などの生命科学分野、並びに分析化学などの化学分野等において有用なものである。The present invention provides an anti-periostin antibody-immobilized carrier, a periostin-measuring reagent, and an anti-periostin antibody-immobilized carrier used for measuring periostin (also referred to as osteoblast-specific factor 2 or OSF2) which can be a marker for allergic diseases and other diseases. The present invention relates to a method for stabilizing a carrier.
INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is useful in the field of life science such as clinical examination, clinical pathology, immunology and medicine, and in the field of chemistry such as analytical chemistry.
ペリオスチンは、細胞外マトリックスタンパク質であり、そのＮ末端側よりＣ末端側にかけて順に、ＥＭＩ領域、Ｒ１領域、Ｒ２領域、Ｒ３領域、Ｒ４領域及びＣ末端領域よりなるものであるが、このペリオスチン遺伝子の発現レベルの測定がアレルギー性疾患の検査方法として有用であることが開示され、そして、アレルギー疾患の検査方法の発明が開示された（特許文献１及び非特許文献１参照。）。
また、このペリオスチン遺伝子の発現レベルの測定が特発性間質性肺炎の検査方法としても有用であることが開示された（特許文献２参照。）。
そして、抗ペリオスチンモノクローナル抗体の使用により、ペリオスチン測定の正確性が改善されることが開示され（特許文献３参照。）、更に、ペリオスチンの特定領域を検出することによる正確性の改善された肺線維症又は間質性肺炎の検査方法等が開示された（特許文献４参照。）。Periostin is an extracellular matrix protein, consisting of an EMI region, an R1 region, an R2 region, an R3 region, an R4 region, and a C-terminal region in order from the N-terminal side to the C-terminal side. It has been disclosed that the measurement of the expression level is useful as a method for testing an allergic disease, and an invention of a method for testing an allergic disease has been disclosed (see Patent Document 1 and Non-Patent Document 1).
Further, it has been disclosed that the measurement of the expression level of the periostin gene is also useful as a method for testing for idiopathic interstitial pneumonia (see Patent Document 2).
It is disclosed that the use of an anti-periostin monoclonal antibody improves the accuracy of periostin measurement (see Patent Document 3), and furthermore, lung fibers with improved accuracy by detecting a specific region of periostin. A method for examining disease or interstitial pneumonia has been disclosed (see Patent Document 4).
なお、他に、ＯＳＦ２（ペリオスチン）に対するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びこれらの抗体を用いる診断方法等が開示され（特許文献５参照。）、Ｏｓｆ２／Ｃｂｆａ１と命名される新規造骨細胞特異的転写因子を測定するのに抗ＯＳＦ２（ペリオスチン）抗体を用いた免疫測定法が開示され（特許文献６参照。）、ヒトペリオスチンに対して特異的に結合する精製抗体及びこの抗体を用いる乳癌の骨への転移等を調べる診断アッセイ法等が開示され（特許文献７参照。）、そして、抗細胞接着活性を有するペリオスチンに対する抗体及びこの抗体を用いるペリオスチンの定量方法等が開示されている（特許文献８参照。）。 In addition, a polyclonal antibody against OSF2 (periostin), a monoclonal antibody, a diagnostic method using these antibodies, and the like are disclosed (see Patent Document 5), and a novel osteoblast-specific transcription factor named Osf2 / Cbfa1 is disclosed. An immunoassay method using an anti-OSF2 (periostin) antibody to measure the amount of osteoporosis is disclosed (see Patent Document 6), a purified antibody that specifically binds to human periostin, and a method for using the antibody to treat breast cancer bone. A diagnostic assay for examining metastasis and the like is disclosed (see Patent Document 7), and an antibody against periostin having anti-cell adhesion activity and a method for quantifying periostin using this antibody are disclosed (see Patent Document 8). .).
しかしながら、このように種々の疾患の検査に有用なペリオスチンの測定に使用するペリオスチン測定試薬は必ずしも安定なものではなく、その安定化が望まれていた。
特に、ペリオスチン測定試薬における抗ペリオスチン抗体が乾燥状態におかれた場合には、著しく不安定となり、その安定化が切望されていた。However, the reagent for measuring periostin used for the measurement of periostin useful for testing various diseases as described above is not always stable, and its stabilization has been desired.
In particular, when the anti-periostin antibody in the periostin measurement reagent is in a dry state, it becomes extremely unstable, and stabilization thereof has been desired.
前述した通り、ペリオスチンの測定に使用されるペリオスチン測定試薬は必ずしも安定なものではなく、その安定化が望まれていた。
これに対して、本発明の課題は、安定化された抗ペリオスチン抗体固定化担体を提供すること、安定化されたペリオスチン測定試薬を提供すること、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗体の安定化方法を提供することである。
特に、乾燥状態におかれた抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法等を提供することである。As described above, the periostin measurement reagent used for the measurement of periostin is not always stable, and its stabilization has been desired.
In contrast, an object of the present invention is to provide a stabilized anti-periostin antibody-immobilized carrier, to provide a stabilized periostin measurement reagent, and to stabilize an antibody in the anti-periostin antibody-immobilized carrier. Is to provide a way.
In particular, it is an object of the present invention to provide a method for stabilizing an anti-periostin antibody in an anti-periostin antibody-immobilized carrier in a dry state.
本発明者らは、抗ペリオスチン抗体固定化担体及びペリオスチン測定試薬並びにこれらに用いる抗ペリオスチン抗体の安定化方法について検討を重ねたところ、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、界面活性剤及び糖、界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩、又は界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩を接触させることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors have repeatedly studied an anti-periostin antibody-immobilized carrier and a periostin measurement reagent and a method for stabilizing an anti-periostin antibody used for them.The anti-periostin antibody immobilized on the carrier has a surfactant and a sugar, The present inventors have found that the above problems can be solved by bringing a surfactant and arginine or a salt thereof or a surfactant, sugar and arginine or a salt thereof into contact, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は、以下の発明よりなる。
［１］抗ペリオスチン抗体を担体に固定化した抗ペリオスチン抗体固定化担体であって、この担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（１）〜（３）から選択される安定化物質を接触させたことを特徴とする抗ペリオスチン抗体固定化担体。
（１）界面活性剤及び糖
（２）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
（３）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩
［２］前記［１］記載の抗ペリオスチン抗体固定化担体を含むペリオスチンの測定試薬。
［３］抗ペリオスチン抗体を担体に固定化した抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法であって、この担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（１）〜（３）から選択される安定化物質を接触させたことを特徴とする抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法。
（１）界面活性剤及び糖
（２）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
（３）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩That is, the present invention includes the following inventions.
[1] An anti-periostin antibody-immobilized carrier in which an anti-periostin antibody is immobilized on a carrier, and a stabilizing substance selected from the following (1) to (3) is contacted with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier. An anti-periostin antibody-immobilized carrier, characterized in that:
(1) Surfactant and sugar (2) Surfactant and arginine or salt thereof (3) Surfactant, sugar and arginine or salt thereof [2] Periostin containing anti-periostin antibody-immobilized carrier as described in [1] above Measuring reagent.
[3] A method for stabilizing an anti-periostin antibody in an anti-periostin antibody-immobilized carrier in which an anti-periostin antibody is immobilized on a carrier, wherein the anti-periostin antibody immobilized on the carrier includes the following (1) to (3) A method for stabilizing an anti-periostin antibody on an anti-periostin antibody-immobilized carrier, which comprises contacting a selected stabilizing substance.
(1) Surfactant and sugar (2) Surfactant and arginine or salt thereof (3) Surfactant, sugar and arginine or salt thereof
本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチン測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法は、その抗ペリオスチン抗体固定化担体、及びペリオスチン測定試薬、並びに抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体が安定化されたものである。
特に、乾燥状態におかれた抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化に好適である。
以上のことより、本発明においては、抗ペリオスチン抗体固定化担体、及びペリオスチン測定試薬、並びに抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体は、長期間使用することができ、そして、長期間正確なペリオスチン測定値を提供することができるものである。The anti-periostin antibody-immobilized carrier, the periostin measurement reagent, and the method of stabilizing an anti-periostin antibody in the anti-periostin antibody-immobilized carrier of the present invention include the anti-periostin antibody-immobilized carrier, the periostin measurement reagent, and the anti-periostin antibody immobilized. The anti-periostin antibody in the carrier is stabilized.
In particular, it is suitable for stabilizing an anti-periostin antibody in a carrier for immobilizing an anti-periostin antibody in a dry state.
As described above, in the present invention, the anti-periostin antibody-immobilized carrier, and the periostin measurement reagent, and the anti-periostin antibody in the anti-periostin antibody-immobilized carrier can be used for a long time, and long-term accurate periostin It can provide measurements.
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。Hereinafter, the present invention will be described in detail. The following embodiment is an exemplification for describing the present invention, and is not intended to limit the present invention to only this embodiment. The present invention can be implemented in various forms without departing from the gist thereof.
All publications cited in this specification, such as prior art references, publications, patent publications, and other patent references, are incorporated herein by reference.
Ｉ．抗ペリオスチン抗体固定化担体
〔１〕総論
本発明における抗ペリオスチン抗体固定化担体は、抗ペリオスチン抗体を担体に固定化した抗ペリオスチン抗体固定化担体であって、この担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（１）〜（３）から選択される安定化物質を接触させたことを特徴とするものである。
（１）界面活性剤及び糖
（２）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
（３）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩I. Anti-periostin antibody-immobilized carrier [1] General The anti-periostin antibody-immobilized carrier in the present invention is an anti-periostin antibody-immobilized carrier in which an anti-periostin antibody is immobilized on a carrier. And a stabilizing substance selected from the following (1) to (3).
(1) Surfactant and sugar (2) Surfactant and arginine or salt thereof (3) Surfactant, sugar and arginine or salt thereof
本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体は、上記の構成により安定化されたものである。 The anti-periostin antibody-immobilized carrier of the present invention is stabilized by the above configuration.
〔２〕抗ペリオスチン抗体
１．抗体
本発明における抗ペリオスチン抗体は、ペリオスチンに特異的に結合する抗体である。[2] Anti-periostin antibody Antibody The anti-periostin antibody in the present invention is an antibody that specifically binds to periostin.
本発明において、抗ペリオスチン抗体は、ペリオスチンに特異的に結合することができる抗体であればよく、特に限定はない。 In the present invention, the anti-periostin antibody is not particularly limited as long as it can specifically bind to periostin.
この抗ペリオスチン抗体としては、例えば、ペリオスチンに結合することができるモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗血清、抗体の断片〔Ｆａｂ及びＦ(ａｂ’)２など〕、又は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）等を挙げることができる。Examples of the anti-periostin antibody include a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, an antiserum, an antibody fragment [such as Fab and F (ab ') 2 ] that can bind to periostin, a single-chain antibody (scFv), and the like. Can be mentioned.
なお、この抗ペリオスチン抗体は、遺伝子組み換え技術等により免疫原を免疫する動物とは異なる動物種のアミノ酸配列に変化させた抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト化抗体等）であってもよい。 The anti-periostin antibody is an antibody (a chimeric antibody, a humanized antibody, a fully humanized antibody, etc.) obtained by changing the amino acid sequence of an animal species different from that of the animal to which the immunogen is immunized by genetic recombination technology or the like. Is also good.
そして、抗ペリオスチン抗体としては、モノクローナル抗体であることが好ましい。 And, it is preferable that the anti-periostin antibody is a monoclonal antibody.
また、本発明においては、２種以上の、抗ペリオスチン抗体を用いてもよい。 In the present invention, two or more anti-periostin antibodies may be used.
２．免疫原
本発明における抗ペリオスチン抗体を産生させるための免疫原について、以下説明を行う。
本発明における抗ペリオスチン抗体を産生させるための免疫原として、ペリオスチンの全部又は一部を用いることができる。
すなわち、ヒト又はウシ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス若しくはラットなどの哺乳動物又はニワトリなどの鳥類等由来のペリオスチン、又は遺伝子組み換え操作により得たペリオスチン等のペリオスチンの全部又は一部を用いることができる。2. Immunogen An immunogen for producing an anti-periostin antibody in the present invention will be described below.
As an immunogen for producing an anti-periostin antibody in the present invention, all or a part of periostin can be used.
That is, it is possible to use all or a part of periostin such as human or bovine, porcine, dog, cat, periostin derived from mammals such as mice or rats or birds such as chickens, or periostin obtained by genetic engineering. .
前記のペリオスチンの全部又は一部を免疫原とすることにより、本発明における抗ペリオスチン抗体を取得することができる。
なお、この抗ペリオスチン抗体を産生させるための免疫原は、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部又は一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１〜８個、好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜２個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、又は修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等であってもよい。By using all or a part of the above periostin as an immunogen, the anti-periostin antibody of the present invention can be obtained.
In addition, the immunogen for producing the anti-periostin antibody contains one or several (usually 1 to 8, preferably 1 to 6, more preferably 1 to 7, amino acid sequences in all or part of the amino acid sequence of periostin). Peptides or proteins containing an amino acid sequence obtained by deletion, substitution, insertion, addition or modification of up to 4 (particularly preferably 1 to 2) amino acid residues may be used.
また、抗体は、３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を認識できるとの報告（Ｆ．Ｈｕｄｅｃｚら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４７巻，２０１〜２１０頁，１９９２年発行）がある。
よって、本発明における抗ペリオスチン抗体の免疫原のアミノ酸配列の最小単位としては、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１〜８個、好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜２個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列の内、連続する３つのアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列を考えることができるので、これらの連続する３つのアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列からなるトリペプチド、又はこれに他のアミノ酸若しくはペプチドが付加したもの等を、本発明における抗ペリオスチン抗体の免疫原の最小単位として考えることができる。Also, there is a report that an antibody can recognize an amino acid sequence consisting of three amino acids (F. Hudecz et al., J. Immunol. Methods, 147, 201-210, published in 1992).
Therefore, the minimum unit of the amino acid sequence of the immunogen of the anti-periostin antibody in the present invention may be one or several amino acid sequences of all or part of the amino acid sequence of periostin, or all or part of the amino acid sequence of these amino acid sequences. (Usually 1 to 8, preferably 1 to 6, more preferably 1 to 4, particularly preferably 1 to 2) of amino acid residues by deletion, substitution, insertion, addition or modification. Among the obtained amino acid sequences, an amino acid sequence consisting of three consecutive amino acid residues can be considered, so that a tripeptide consisting of an amino acid sequence consisting of these three consecutive amino acid residues, The addition of a peptide can be considered as the minimum unit of the immunogen of the anti-periostin antibody in the present invention. .
前記の免疫原としての、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等、又はペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１〜８個、好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜２個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等は、ヒト等の体液、細胞、組織もしくは臓器等より、公知の方法等により抽出、精製等して、取得することができる。 As the immunogen, a peptide or protein containing the entire or partial amino acid sequence of periostin, or 1 to several (usually 1 to 8) amino acids in the entire or partial amino acid sequence of periostin (Preferably 1 to 6, more preferably 1 to 4, and particularly preferably 1 to 2) amino acid residues, the peptide comprising an amino acid sequence obtained by deletion, substitution, insertion, addition or modification. Alternatively, proteins and the like can be obtained by extracting, purifying, and the like from body fluids, cells, tissues, organs, and the like of humans and the like by known methods and the like.
なお、本発明において、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質を取得する方法としては特に限定はなく、如何なる方法によるものでもよく、例えば、公知の方法により取得することができる。 In the present invention, the method for obtaining a peptide or protein containing the amino acid sequence of all or part of the amino acid sequence of periostin is not particularly limited, and may be by any method, for example, by a known method. Can be.
例えば、ヒトのペリオスチンを取得する方法として、次の方法（“Ｇ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１８巻，１号，７１３〜７２３頁，２００６年発行”）等を挙げることができる。
（ａ） まず、ペリオスチン（ポリヌクレオチドの塩基配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮｕｍｂｅｒＤ１３６６６；アミノ酸配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮｕｍｂｅｒＢＡＡ０２８３７）にＶ５／Ｈｉｓタグを付加させたリコンビナントペリオスチンタンパク質を昆虫細胞であるＳ２細胞において発現させた上で精製する。For example, as a method for obtaining human periostin, the following method (“G. Takayama et al., J. Allergy Clin. Immunol., Vol. 118, No. 1, pp. 713-723, 2006”) and the like can be mentioned. it can.
(A) First, a recombinant periostin protein obtained by adding a V5 / His tag to periostin (base sequence of polynucleotide: Accession Number D13666 of nucleic acid database GenBank; amino acid sequence: Accession Number BAA02837 of nucleic acid database GenBank) was used in S2 cells as insect cells. After expression, it is purified.
（ｂ） すなわち、具体的には、Ｓ２細胞の形質転換体は次のように調製する。
ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）にペリオスチンの上記部分をコードするｃＤＮＡを挿入して、これをｐＭＴ／Ｂｉｐ／ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ−Ｖ５−ＨｉｓＡとする。
Ｓ２細胞にｐＭＴ／Ｂｉｐ／ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ−Ｖ５−ＨｉｓＡ及びハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドであるｐＡｃＨｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を公知の方法で共導入し、形質転換させる。
ハイグロマイシンにより形質転換体を選択し、安定形質転換体を得る。
そして、Ｓ２細胞の形質転換体では、カルボキシ末端にＶ５エピトープ／Ｈｉｓタグの結合したペリオスチンを発現させる。(B) That is, specifically, a transformant of S2 cells is prepared as follows.
A cDNA encoding the above-described portion of periostin is inserted into a pMT / Bip / V5-HisA plasmid (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA), and this is designated as pMT / Bip / periostin-V5-HisA.
S2 cells are cotransfected with pMT / Bip / periostin-V5-HisA and pAcHygro (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA), a plasmid that expresses the hygromycin resistance gene, by a known method and transformed.
Transformants are selected with hygromycin to obtain stable transformants.
Then, in the transformant of S2 cells, periostin having a V5 epitope / His tag bound to the carboxy terminus is expressed.
（ｃ） Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の精製は次のように行う。
ペリオスチン遺伝子安定形質転換体Ｓ２細胞の培地に硫酸銅を加えることにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の発現を誘導する。
これにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質は培養上清中に発現分泌される。
この培養上清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に透析した後、ニッケルレジン（Ｎｉ−ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ、Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ国Ｈｉｌｄｅｎ）と混合して、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をレジンに結合させる。
レジンを洗浄して夾雑物を取り除き、イミダゾール含有緩衝液にてＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質を溶出させる。
溶出されたＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をＰＢＳ等に透析し、精製されたヒトのペリオスチンタンパク質を取得する。(C) Purification of the S2 recombinant periostin protein is performed as follows.
The expression of S2 recombinant periostin protein is induced by adding copper sulfate to the medium of the periostin gene stable transformant S2 cells.
Thereby, the S2 recombinant periostin protein is expressed and secreted into the culture supernatant.
The culture supernatant is dialyzed against phosphate buffered saline (PBS), and then mixed with nickel resin (Ni-NTA Agarose, Qiagen, Hilden, Germany) to bind the S2 recombinant periostin protein to the resin.
The resin is washed to remove impurities, and the S2 recombinant periostin protein is eluted with a buffer containing imidazole.
The eluted S2 recombinant periostin protein is dialyzed against PBS or the like to obtain a purified human periostin protein.
また、ヒトのペリオスチンは、次の方法によっても取得することができる。
すなわち、ペリオスチンのｃＤＮＡを、ＧＥＸ−ＫＧベクター（“ＫＬ．Ｇｕａｎら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９２巻，２６２〜２６７頁，１９９１年発行”）に組み込んで、大腸菌ＢＬ２１にトランスフェクションする。
これをアンピシリン入りＬＢ培地にて培養し、菌体よりグルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、英国）により、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を付加したペリオスチンを精製する。
これにトロンビンにてＧＳＴを切断し、ＧＳＴを付加しないペリオスチンを取得する。
これをブラッドフォード法にて定量して、その量（濃度）が明確となったヒトのペリオスチンを取得することができる。Human periostin can also be obtained by the following method.
That is, the periostin cDNA is incorporated into a GEX-KG vector ("KL. Guan et al., Anal. Biochem., 192, 262 to 267, published in 1991") and transfected into E. coli BL21.
This is cultured in an LB medium containing ampicillin, and periostin to which glutathione S-transferase (GST) has been added is purified from the cells using Glutathione Sepharose 4B (GE Healthcare, Little Chalfont, UK).
GST is cleaved with thrombin, and periostin to which GST is not added is obtained.
This is quantified by the Bradford method, and human periostin whose amount (concentration) is clear can be obtained.
更に、ヒトのペリオスチンは、例えば、“Ｉ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４６巻，５号，７１３〜７２３頁，２００９年発行”などに記載された方法等によっても取得することができる。 Furthermore, human periostin can also be obtained, for example, by the method described in "I. Takayama et al., J. Biochem., 146, 5, 713-723, 2009" and the like.
なお、ヒトのペリオスチンのＥＭＩ領域は、例えば、“Ｉ．Ｋｉｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８５巻，３号，２０２８〜２０３９頁，２０１０年発行”、又は“Ｔ．Ｍａｒｕｈａｓｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８５巻，１７号，１３２９４〜１３３０３頁，２０１０年発行”などに記載された方法等により取得することができる。 The EMI region of human periostin is described in, for example, "I. Kii et al., J. Biol. Chem., 285, No. 3, pp. 2028-2039, 2010", or "T. Maruhashi et al., J. Biol. Biol. Chem., Vol. 285, No. 17, pages 13294-13303, published in 2010 ”and the like.
また、ヒトのペリオスチンのＲ１領域、Ｒ２領域又はＲ３領域はそれぞれ、“Ｉ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１４６巻，５号，７１３〜７２３頁，２００９年発行”などに記載された方法等により取得することができる。 Further, the R1, R2, or R3 region of human periostin can be obtained by the method described in “I. Takayama et al., J. Biochem, Vol. 146, No. 5, pp. 713-723, 2009” and the like, respectively. Can be obtained.
また、ヒトのペリオスチンのＲ４領域及びＣ末端領域のアミノ酸配列はそれぞれ、“Ｉ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１４６巻，５号，７１３〜７２３頁，２００９年発行”などに記載された方法等により取得することができる。 In addition, the amino acid sequences of the R4 region and the C-terminal region of human periostin are described in, for example, “I. Takayama et al., J. Biochem, 146, 5, 713-723, published in 2009” and the like. Can be obtained.
なお、前記の免疫原は、液相法及び固相法等のペプチド合成の方法により合成することができ、更にペプチド自動合成装置を用いてもよく、日本生化学会編「生化学実験講座１ タンパク質の化学ＩＶ」，東京化学同人，１９７５年、泉屋ら「ペプチド合成の基礎と実験」，丸善，１９８５年、日本生化学会編「続生化学実験講座２ タンパク質の化学 下」，東京化学同人，１９８７年等に記載された方法に従い合成することができ、前記のアミノ酸配列に、欠失、置換、挿入又は付加を施した変異体を作製することも容易である。
また、非天然型アミノ酸の導入、各アミノ酸残基の化学修飾やシステイン残基を導入することにより分子内を環化させて構造を安定化させる等の修飾を施してもよい。The above immunogen can be synthesized by a peptide synthesis method such as a liquid phase method and a solid phase method. Further, an automatic peptide synthesizer may be used. Chemistry IV ", Tokyo Kagaku Dojin, 1975, Izumiya et al.," Basics and Experiments of Peptide Synthesis ", Maruzen, 1985. For example, it can be synthesized according to the methods described in the literature, and it is easy to produce a mutant in which the above amino acid sequence has been deleted, substituted, inserted or added.
Further, modifications such as introduction of unnatural amino acids, chemical modification of each amino acid residue, and introduction of a cysteine residue to cyclize the molecule to stabilize the structure may be performed.
更に、前記の免疫原は、対応する核酸塩基配列を持つＤＮＡ又はＲＮＡより遺伝子工学技術を用いて調製してもよく、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法Ｉ」，東京化学同人，１９８６年、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法ＩＩ」，東京化学同人，１９８６年、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法ＩＩＩ」，東京化学同人，１９８７年等を参照して調製すればよい。 Further, the above-mentioned immunogen may be prepared from DNA or RNA having a corresponding nucleic acid base sequence by using genetic engineering technology. Doujin, 1986, The Biochemical Society of Japan, "Sequence Chemistry Experimental Course 1 Gene Research Method II", Tokyo Chemistry Dojin, 1986, The Biochemical Society of Japan, "Seizoku Chemistry Experimental Course 1, Gene Research Method III", Tokyo Chemical Dojin, It may be prepared by referring to 1987 or the like.
ところで、免疫原が低分子物質の場合には、免疫原に担体（キャリア）を結合させたものを動物等に免疫するのが一般的ではあるが、アミノ酸数５のペプチドを免疫原としてこれに対する特異抗体を産生させたとの報告（木山ら，「日本薬学会第１１２回年会講演要旨集３」，１２２頁，１９９２年発行）もあるので、担体を使用することは必須ではない。 When the immunogen is a low-molecular substance, it is common to immunize an animal or the like with a carrier (carrier) bound to the immunogen. However, a peptide having 5 amino acids is used as an immunogen. Since there is a report that a specific antibody was produced (Kiyama et al., "Summary of the 112th Annual Meeting of the Pharmaceutical Society of Japan 3", p. 122, published in 1992), it is not essential to use a carrier.
なお、抗体を産生させる際に担体（キャリア）を使用する場合の担体としては、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ニワトリ血清アルブミン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリアラニルリシン、ジパルミチルリシン、破傷風トキソイド又は多糖類等の担体として公知なものを用いることができる。 In addition, when a carrier (carrier) is used for producing antibodies, examples of the carrier include keyhole limpet hemocyanin (KLH), bovine serum albumin (BSA), chicken serum albumin, poly-L-lysine, polyalanyl lysine, Known carriers such as dipalmityl lysine, tetanus toxoid or polysaccharide can be used.
免疫原と担体の結合法は、グルタルアルデヒド法、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド法、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル法、ビスジアゾ化ベンジジン法又はＮ−サクシミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸法等の公知の結合法を用いることができる。
また、ニトロセルロース粒子、ポリビニルピロリドン又はリポソーム等の担体に免疫原を吸着させたものを免疫原とすることもできる。Glutaraldehyde method, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide method, maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester method, bisdiazonated benzidine method, or N-succimidyl- A known binding method such as a 3- (2-pyridyldithio) propionic acid method can be used.
Alternatively, an immunogen can be used as an immunogen adsorbed on a carrier such as nitrocellulose particles, polyvinylpyrrolidone or liposome.
３．ポリクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体の調製方法
ペリオスチンに特異的に結合することができるポリクローナル抗体、すなわち、ポリクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体は、以下の操作により調製することができる。3. Method for Preparing Anti-Periostin Antibody as Polyclonal Antibody A polyclonal antibody capable of specifically binding to periostin, that is, an anti-periostin antibody as a polyclonal antibody can be prepared by the following operation.
このポリクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体の産生用の免疫原としては、前記の免疫原を用いることができる。 As the immunogen for producing the anti-periostin antibody, which is a polyclonal antibody, the above-mentioned immunogen can be used.
前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体（キャリア）の結合物を、哺乳動物（マウス、モルモット、ハムスター、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ロバ、若しくはラクダなど）又は鳥類（ニワトリ、アヒル、若しくはダチョウなど）等に免疫する。 The above-mentioned immunogen, or the conjugate of the above-mentioned immunogen and a carrier (carrier) is used for mammals (such as mice, guinea pigs, hamsters, rabbits, rats, sheep, goats, cows, horses, donkeys, or camels) or birds ( Immunize chickens, ducks or ostriches).
なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫する免疫動物としては、その体内でのペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた、すなわちペリオスチンの生産に関わる遺伝子をノックアウトした動物がより好ましい。 As the immunized animal immunized with the immunogen or the conjugate of the immunogen and the carrier, a gene involved in periostin production in the body is inactivated or deleted, that is, a gene involved in periostin production. Animals in which the gene has been knocked out are more preferred.
その理由は、その動物の体内で生産されたペリオスチンが、ペリオスチンなどの免疫原等の免疫により体内に産生した抗ペリオスチン抗体と結合してしまうことにより、抗ペリオスチン抗体の抗体活性が低下してしまう可能性が、前記のノックアウト動物においては低いからである。
また、前記のノックアウト動物においては、その動物の体内でペリオスチンが生産されないため、免疫されたペリオスチンを異物と認識し易く、よって抗体の産生が高くなるためである。The reason is that the antibody activity of the anti-periostin antibody decreases because the periostin produced in the body of the animal binds to the anti-periostin antibody produced in the body by immunization with an immunogen such as periostin. The probability is low in the knockout animals.
In addition, in the knockout animal, since periostin is not produced in the body of the animal, the immunized periostin is easily recognized as a foreign substance, and thus the production of antibodies is increased.
このペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた動物としては、例えば、ペリオスチンについてのノックアウトマウス（“Ｈ．Ｒｉｏｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２５巻，２４号，１１１３１〜１１１４４頁，２００５年発行”）等を挙げることができる。 Examples of the animal in which the gene involved in periostin production is inactivated or deleted include, for example, a knockout mouse for periostin (“H. Rios et al., Molecular and Cellular Biology, 25, 24, 11131-11144, 2005”). Year issuance ”).
ところで、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物の免疫量は、免疫原、担体、免疫動物の種類、免疫注射部位等により決められるものであるが、マウスの場合には一匹当り一回につき０．１μｇ〜５ｍｇの前記免疫原、又は前記免疫原と担体の結合物を免疫注射するのが好ましい。 The amount of immunity of the immunogen or the conjugate of the immunogen and the carrier is determined by the immunogen, the carrier, the type of the immunized animal, the immunization injection site, and the like. It is preferable to inject 0.1 to 5 mg of the immunogen, or a conjugate of the immunogen and a carrier, once per animal.
なお、この前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントと添加混合して免疫注射することが好ましい。
アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、化学合成アジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知のものを用いることができる。
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。It is preferable that the immunogen or the conjugate of the immunogen and the carrier is added and mixed with an adjuvant for immunization.
Known adjuvants such as Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, aluminum hydroxide adjuvant, chemically synthesized adjuvant, or B. pertussis adjuvant can be used.
The immunization injection may be performed at a site such as subcutaneous, intravenous, intraperitoneal, or back.
初回免疫後、１〜２週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射する。
この追加免疫注射の回数としては、２〜６回が一般的である。
この場合も、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら全採血を行い、血清を分離して抗体を含む抗血清を得る。After the first immunization, booster injections of the above-mentioned immunogen or the conjugate of the above-mentioned immunogen and a carrier are given to the site such as subcutaneous, intravenous, intraperitoneal or back at intervals of 1 to 2 weeks.
The number of times of this booster injection is generally 2 to 6 times.
Also in this case, it is preferable that the above-mentioned immunogen or the above-mentioned conjugate of the immunogen and the carrier is additionally mixed with an adjuvant and then subjected to booster injection.
After the initial immunization, the antibody titer in the serum of the immunized animal is repeatedly measured by ELISA or the like. When the antibody titer reaches a plateau, whole blood is collected, and the serum is separated to obtain an antiserum containing the antibody.
この抗血清を、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィー等の方法、あるいはこれらの方法を組み合わせて抗体の精製を行い、ポリクローナル抗体を得る。 The antiserum is purified by a salting-out method using ammonium sulfate, sodium sulfate, or the like, ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography, or the like, or a combination of these methods to purify the antibody to obtain a polyclonal antibody.
以上の操作により、ペリオスチンに結合することができるポリクローナル抗体（ポリクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体）を得ることができる。 By the above operation, a polyclonal antibody that can bind to periostin (an anti-periostin antibody that is a polyclonal antibody) can be obtained.
ところで、免疫原と担体の結合物を用いて動物等に免疫した場合には、得られたポリクローナル抗体中に、この担体に対する抗体が存在するので、このような担体に対する抗体の除去処理を行うことが好ましい。 By the way, when an animal or the like is immunized using a conjugate of an immunogen and a carrier, an antibody against the carrier is present in the obtained polyclonal antibody. Is preferred.
この除去処理方法としては、担体を、得られたポリクローナル抗体の溶液中に添加して生成した凝集物を取り除くか、担体を不溶化固相に固定化してアフィニティークロマトグラフィーにより除去する方法等を用いることができる。 As the removal treatment method, a method in which a carrier is added to a solution of the obtained polyclonal antibody to remove aggregates generated, or a method in which the carrier is immobilized on an insolubilized solid phase and removed by affinity chromatography is used. Can be.
４．モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体の調製方法
ペリオスチンに結合することができるモノクローナル抗体、すなわち、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体は、以下の操作により調製することができる。4. Method for Preparing Monoclonal Anti-Periostin Antibody A monoclonal antibody capable of binding to periostin, ie, a monoclonal antibody, anti-periostin antibody, can be prepared by the following procedure.
このモノクローナル抗体は、ケラーらの細胞融合法（Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６巻，４９５〜４９７頁，１９７５年発行）によるハイブリドーマ、又はエプスタン−バーウイルス等のウイルスによる腫瘍化細胞等の抗体産生細胞により得ることができる。 This monoclonal antibody is produced by the cell fusion method of Keller et al. (G. Koehler et al., Nature, 256, 495-497, 1975), and is used for antibody production of tumor cells and the like by viruses such as hybridomas or Epstan-Barr virus. It can be obtained by cells.
更に、抗体遺伝子のｃＤＮＡライブラリーから、マカフェティーらのファージディスプレイ法（Ｍ．ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３４８巻，５５２〜５５４頁，１９９０年発行）を用いてモノクローナル抗体を作製することも可能である。 Further, a monoclonal antibody can be prepared from a cDNA library of the antibody gene using the phage display method of McCaffety et al. (M. McCafferty et al., Nature, 348, 552-554, published in 1990). is there.
なお、例えば、細胞融合法によるモノクローナル抗体の調製は、下記の操作により行うことができる。 In addition, for example, preparation of a monoclonal antibody by a cell fusion method can be performed by the following operation.
（１） まず、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を、哺乳動物（マウス、ハムスター、ラット、又はラビットなど、例えば近交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）又は鳥類（ニワトリなど）等に免疫する。 (1) First, the immunogen, or the conjugate of the immunogen and a carrier, is converted into a mammal (mouse, hamster, rat, rabbit, etc., for example, BALB / c of an inbred mouse) or a bird (chicken, etc.). ) Etc.
なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫する免疫動物としては、その体内でのペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた、すなわちペリオスチンの生産に関わる遺伝子をノックアウトした動物がより好ましい。 As the immunized animal immunized with the immunogen or the conjugate of the immunogen and the carrier, a gene involved in periostin production in the body is inactivated or deleted, that is, a gene involved in periostin production. Animals in which the gene has been knocked out are more preferred.
その理由は、その動物の体内で生産されたペリオスチンが、ペリオスチンなどの免疫原等の免疫により体内に産生した抗ペリオスチン抗体と結合してしまうことにより、抗ペリオスチン抗体の抗体活性が低下してしまう可能性が、前記のノックアウト動物においては低いからである。
また、前記のノックアウト動物においては、その動物の体内でペリオスチンが生産されないため、免疫されたペリオスチンを異物と認識し易く、よって抗体の産生が高くなるためである。The reason is that the antibody activity of the anti-periostin antibody decreases because the periostin produced in the body of the animal binds to the anti-periostin antibody produced in the body by immunization with an immunogen such as periostin. The probability is low in the knockout animals.
In addition, in the knockout animal, since periostin is not produced in the body of the animal, the immunized periostin is easily recognized as a foreign substance, and thus the production of antibodies is increased.
このペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた動物としては、例えば、ペリオスチンについてのノックアウトマウス（“Ｈ．Ｒｉｏｓら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２５巻，２４号，１１１３１〜１１１４４頁，２００５年発行”）等を挙げることができる。 Examples of an animal in which the gene involved in periostin production is inactivated or deleted include, for example, a knockout mouse for periostin (“H. Rios et al., Mol. Cell. Biol., 25, 24, 11131-11144”). , 2005 issued)).
ところで、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物の免疫量は、免疫動物の種類、免疫注射部位等により適宜決められるものであるが、例えば、マウスの場合には一匹当り一回につき０．１μｇ〜５ｍｇの前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫注射するのが好ましい。 By the way, the amount of immunity of the immunogen or the conjugate of the immunogen and the carrier is appropriately determined depending on the type of the immunized animal, the site of immunization injection, and the like. Preferably, 0.1 μg to 5 mg of the immunogen or a combination of the immunogen and the carrier is injected at a time.
なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して免疫注射することが好ましい。
アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、化学合成アジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知なものを用いることができる。
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内、足蹠又は背部等の部位に行えばよい。The immunogen or the combination of the immunogen and the carrier is preferably added with an adjuvant and mixed for immunization.
Known adjuvants such as Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, aluminum hydroxide adjuvant, chemically synthesized adjuvant, or B. pertussis adjuvant can be used.
The immunization injection may be performed at a site such as subcutaneous, intravenous, intraperitoneal, footpad or back.
（２） 初回免疫後、１〜２週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内、足蹠又は背部等の部位に、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射する。
この追加免疫注射の回数としては２〜６回が一般的である。
この場合も前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。(2) After the first immunization, the above-mentioned immunogen or the above-mentioned conjugate of the immunogen and the carrier is additionally injected into the site such as subcutaneous, intravenous, intraperitoneal, footpad or back at intervals of 1 to 2 weeks. .
The number of times of this booster injection is generally 2 to 6 times.
Also in this case, it is preferable that the above-mentioned immunogen, or the above-mentioned conjugate of the immunogen and the carrier, is added with an adjuvant, mixed, and subjected to booster injection.
（３） 初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解したものを静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。 (3) After the initial immunization, the antibody titer in the serum of the immunized animal is repeatedly measured by ELISA or the like, and when the antibody titer reaches a plateau, the immunogen or the conjugate of the immunogen and the carrier is purified. A solution dissolved in a physiological saline (0.9% aqueous sodium chloride solution) is injected intravenously or intraperitoneally for final immunization.
（４） この最終免疫の３〜５日後に、免疫動物の脾細胞、リンパ節細胞又は末梢リンパ球等の抗体産生能を有する細胞を取得する。 (4) Three to five days after the final immunization, cells having antibody-producing ability such as spleen cells, lymph node cells, or peripheral lymphocytes of the immunized animal are obtained.
（５） この免疫動物より得られた抗体産生能を有する細胞と哺乳動物等（マウス、ヌードマウス、ラットなど）の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを細胞融合させるのであるが、ミエローマ細胞としてはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）等の酵素を欠損した細胞株のものが好ましく、例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＨＧＰＲＴ欠損細胞株である、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク〔ＪＣＲＢ〕９０８５）、Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１株（ＪＣＲＢ ０００９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・６５３株（ＪＣＲＢ ００２８）又はＳＰ２／Ｏ−Ａｇ−１４株（ＪＣＲＢ ００２９）等を用いることができる。 (5) Cell fusion of cells having antibody-producing ability obtained from the immunized animal and myeloma cells (myeloma cells) of mammals (mouse, nude mouse, rat, etc.) is performed. Cell lines deficient in enzymes such as hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) or thymidine kinase (TK) are preferable. For example, P3-X63-Ag8 is a HGPRT-deficient cell line derived from a BALB / c mouse. Strain (ATCC TIB9), P3-X63-Ag8-U1 strain (Cancer Research Research Source Bank [JCRB] 9085), P3-NS1-1-Ag4-1 strain (JCRB 0009), P3-X63-Ag8.653 strain ( JCRB 0028) or SP2 / O-Ag-14 strain (JCRB 0029) Etc. can be used.
細胞融合は、各種分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リポソームもしくはセンダイウイルス（ＨＶＪ）等の融合促進剤を用いて行うか、又は電気融合法により行うことができる。
ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はＴＫ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選別用培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエローマ細胞との融合細胞（ハイブリドーマ）のみを選択的に培養し、増殖させることができる。Cell fusion can be performed using a fusion promoter such as polyethylene glycol (PEG), liposome or Sendai virus (HVJ) having various molecular weights, or can be performed by an electrofusion method.
When the myeloma cell is a HGPRT-deficient strain or a TK-deficient strain, the cell having antibody-producing ability and the myeloma cell can be separated by using a selection medium (HAT medium) containing hypoxanthine / aminopterin / thymidine. Only the fused cells (hybridomas) can be selectively cultured and expanded.
（６） このようにして得られたハイブリドーマの培養上清を、ヒト又はウシ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス、ラット若しくはニワトリなどの動物等（例えば、ヒトのペリオスチンの測定に用いる場合にはヒト由来のものが好ましく、ウシのペリオスチンの測定に用いる場合にはウシ由来のものが好ましく、イヌのペリオスチンの測定に用いる場合にはイヌ由来のものが好ましい）のペリオスチンの全部又は一部よりなるタンパク質又はペプチド等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法などの免疫学的測定法等により測定することにより、「ペリオスチンに結合することができるモノクローナル抗体（モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体）」を産生するハイブリドーマを選択することができる。 (6) The culture supernatant of the hybridoma thus obtained is used as a human or animal such as cow, pig, dog, cat, mouse, rat or chicken (for example, when human is used for measurement of human periostin, Derived from bovine, preferably bovine-derived when used for measurement of bovine periostin, and preferably dog-derived when used for measurement of canine periostin). Or a hybridoma that produces a “monoclonal antibody capable of binding to periostin (monoclonal anti-periostin antibody)” by measuring it using a peptide or the like by immunoassay such as ELISA or Western blotting. Can be selected.
（７） このハイブリドーマ選択方法と限界希釈法等の公知のクローニングの方法を組み合わせて行うことにより、本発明における、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体の産生細胞株を単離して得ることができる。 (7) By combining this hybridoma selection method with a known cloning method such as a limiting dilution method, a cell line producing an anti-periostin antibody as a monoclonal antibody in the present invention can be isolated and obtained.
（８） このモノクローナル抗体産生細胞株を適当な培地で培養して、その培養上清から本発明における、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体を得ることができるが、培地としては無血清培地又は低濃度血清培地等を用いてもよく、この場合は抗体の精製が容易となる点で好ましく、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地又はＡＳＦ培地１０３等の培地を用いることができる。
また、このモノクローナル抗体産生細胞株を、これに適合性がありプリスタン等であらかじめ刺激した哺乳動物の腹腔内に注入し、一定期間の後、腹腔にたまった腹水より本発明における、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体を得ることもできる。(8) The monoclonal antibody-producing cell line is cultured in an appropriate medium, and the anti-periostin antibody, which is a monoclonal antibody of the present invention, can be obtained from the culture supernatant. A serum medium or the like may be used. In this case, it is preferable because the antibody can be easily purified, and a medium such as a DMEM medium, an RPMI1640 medium, or an ASF medium 103 can be used.
In addition, this monoclonal antibody-producing cell line is injected into the abdominal cavity of a mammal which is compatible therewith and previously stimulated with pristane or the like, and after a certain period of time, the ascites accumulated in the abdominal cavity is the monoclonal antibody of the present invention. Anti-periostin antibodies can also be obtained.
（９） このようにして得られた、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィーなどの方法、あるいはこれらの方法を組み合わせること等により、精製された、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体を得ることができる。 (9) The anti-periostin antibody which is a monoclonal antibody thus obtained can be obtained by a method such as a salting out method using ammonium sulfate, sodium sulfate, or the like, an ion exchange chromatography, a gel filtration method, or an affinity chromatography, or any of these methods. By combining the above, a purified anti-periostin antibody, which is a monoclonal antibody, can be obtained.
（１０）なお、前記（６）の通り、得られたハイブリドーマの培養上清を、ヒト又はイヌ等の動物のペリオスチンの全部又は一部よりなるタンパク質又はペプチド等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法などの免疫学的測定法等により測定することにより、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。 (10) As described in (6) above, the obtained culture supernatant of the hybridoma is subjected to ELISA or Western blotting using a protein or peptide consisting of all or a part of periostin of an animal such as human or dog. A hybridoma producing an anti-periostin antibody, which is a monoclonal antibody, can be selected by immunoassay or the like.
（１１） この「モノクローナル抗体である、抗ペリオスチン抗体」を産生するハイブリドーマより、前記（７）〜（９）のようにして、「モノクローナル抗体である、抗ペリオスチン抗体」を得ることができる。 (11) From the hybridoma producing this "monoclonal antibody, anti-periostin antibody", "monoclonal antibody, anti-periostin antibody" can be obtained as described in (7) to (9) above.
なお、得られた「モノクローナル抗体である、抗ペリオスチン抗体」は、ペリオスチンに特異的に結合することができる抗体である。 The obtained “monoclonal antibody, anti-periostin antibody” is an antibody that can specifically bind to periostin.
〔３〕抗ペリオスチン抗体固定化担体
１．担体
本発明における担体は、抗ペリオスチン抗体を固定化するものである。[3] Anti-periostin antibody-immobilized carrier Carrier The carrier in the present invention is for immobilizing an anti-periostin antibody.
本発明において担体は、抗ペリオスチン抗体を固定化することができるものであればよく、特に限定はない。 In the present invention, the carrier is not particularly limited as long as it can immobilize the anti-periostin antibody.
この担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるマイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）、試験管、スティック又は試験片等の形状の担体を挙げることができる。 As this carrier, for example, polystyrene, polycarbonate, polyvinyltoluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, polyacrylamide, latex, liposome, gelatin, agarose, cellulose, sepharose, glass, metal, ceramics or magnetic material Carriers in the form of microcapsules, beads, microplates (microtiter plates), test tubes, sticks or test pieces made of the above materials can be used.
また、この担体としては、例えば、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸共重合体、ポリアクロレイン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリル酸共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、赤血球、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子等の担体を挙げることができる。 Examples of the carrier include polystyrene, styrene-styrene sulfonate copolymer, acrylonitrile-butadiene-styrene copolymer, vinyl chloride-acrylate copolymer, vinyl acetate-acrylic acid copolymer, and polystyrene. Acrolein, styrene-methacrylic acid copolymer, styrene-glycidyl (meth) acrylic acid copolymer, styrene-butadiene copolymer, methacrylic acid polymer, acrylic acid polymer, latex, gelatin, liposome, microcapsule, erythrocyte, Carriers such as particles made of materials such as silica, alumina, carbon black, metal compounds, metals, ceramics and magnetic materials can be mentioned.
２．抗ペリオスチン抗体の担体への固定化
本発明における抗ペリオスチン抗体の担体への固定化は、固定化をすることができるのであればよく、特に限定はない。2. Immobilization of anti-periostin antibody on carrier The immobilization of the anti-periostin antibody on the carrier in the present invention is not particularly limited as long as it can be immobilized.
本発明においては、抗ペリオスチン抗体と担体とを物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により吸着、結合させて抗ペリオスチン抗体を担体に固定化することができる。 In the present invention, the anti-periostin antibody can be immobilized on the carrier by adsorbing and binding the anti-periostin antibody and the carrier by a known method such as a physical adsorption method, a chemical bonding method, or a combination thereof.
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗ペリオスチン抗体と担体を緩衝液などの溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液などに溶解した抗ペリオスチン抗体と担体を接触させたりすること等により行うことができる。 In the case of the physical adsorption method, according to a known method, the anti-periostin antibody and the carrier are mixed and contacted in a solution such as a buffer, or the anti-periostin antibody dissolved in the buffer or the like is contacted with the carrier. And the like.
また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗ペリオスチン抗体と担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗ペリオスチン抗体と担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。 In addition, in the case of performing by the chemical bonding method, the Japanese Society of Clinical Pathology, “Special Issue on Clinical Pathology Extraordinary Issue No. 53, Immunoassay for Clinical Examinations-Techniques and Applications-”, Clinical Pathology Publishing Association, 1983; In accordance with the well-known method described in “Shinsei Kagaku Jikken Kozai 1 Protein IV”, Tokyo Kagaku Dojin, published in 1991, a divalent cross-linking reagent such as glutaraldehyde, carbodiimide, imide ester or maleimide is used. And contacting the antiperiostin antibody with the respective amino group, carboxyl group, thiol group, aldehyde group or hydroxyl group of the carrier.
また、更に非特異的反応や担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗ペリオスチン抗体を固定化させた担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。 Further, if it is necessary to perform a treatment for suppressing non-specific reaction or spontaneous aggregation of the carrier, bovine serum albumin (BSA), human bovine serum albumin (BSA) may be applied to the surface or inner wall surface of the carrier on which the anti-periostin antibody is immobilized. The carrier is treated by a known method such as contacting with serum albumin (HSA), casein, gelatin, protein such as ovalbumin or a salt thereof, or skim milk powder to coat, and the carrier is subjected to a blocking treatment (masking treatment). Is also good.
〔４〕安定化物質
１．総論
本発明における抗ペリオスチン抗体固定化担体は、抗ペリオスチン抗体を担体に固定化した抗ペリオスチン抗体固定化担体であって、この担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（１）〜（３）から選択される安定化物質を接触させたことを特徴とするものである。
（１）界面活性剤及び糖
（２）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
（３）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩[4] Stabilizing substance General The anti-periostin antibody-immobilized carrier in the present invention is an anti-periostin antibody-immobilized carrier in which an anti-periostin antibody is immobilized on a carrier, and the anti-periostin antibody immobilized on the carrier includes the following (1) to (3) A stabilizing substance selected from the group consisting of:
(1) Surfactant and sugar (2) Surfactant and arginine or salt thereof (3) Surfactant, sugar and arginine or salt thereof
２．担体に固定化した抗ペリオスチン抗体への安定化物質の接触
本発明において、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に本発明における安定化物質を接触させる方法は、当該接触を行うことができるのであればよく、特に限定はない。2. Contact of stabilizing substance to anti-periostin antibody immobilized on a carrier In the present invention, the method of contacting the stabilizing substance of the present invention with an anti-periostin antibody immobilized on a carrier is applicable if the contact can be performed. Well, there is no particular limitation.
当該接触の方法としては、例えば、本発明における安定化物質を含む溶液を担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に注ぐことにより接触させたり、本発明における安定化物質を含む溶液を担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に塗布することにより接触させたり、又は担体に固定化した抗ペリオスチン抗体を本発明における安定化物質を含む溶液に含浸させて接触させたりする方法等を挙げることができる。 As a method of the contact, for example, by contacting the solution containing the stabilizing substance of the present invention by pouring it to an anti-periostin antibody immobilized on a carrier, or immobilizing the solution containing the stabilizing substance of the present invention on the carrier Examples of the method include applying the anti-periostin antibody by applying it to the anti-periostin antibody, or impregnating the anti-periostin antibody immobilized on a carrier with a solution containing the stabilizing substance of the present invention and bringing the antibody into contact.
３．界面活性剤及び糖の接触
本発明において、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤及び糖を接触させるに当たっては、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤を接触させた後に糖を接触させてもよく、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に糖を接触させた後に界面活性剤を接触させてもよく、又は担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤と糖を同時に接触させてもよい。3. In the present invention, in bringing the surfactant and the saccharide into contact with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier, in the present invention, the saccharide is contacted with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier after contacting the surfactant. May be brought into contact, the surfactant may be brought into contact with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier, and then the surfactant may be brought into contact with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier. You may.
本発明においては、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤と糖を同時に接触させること、又は担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に糖を接触させた後に界面活性剤を接触させることが好ましく、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に糖を接触させた後に界面活性剤を接触させることがより好ましい。 In the present invention, it is preferable that the surfactant and the sugar are simultaneously contacted with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier, or that the surfactant is contacted after the sugar is contacted with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier. More preferably, the sugar is brought into contact with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier, and then the surfactant is brought into contact.
４．界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩の接触
本発明において、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩を接触させるに当たっては、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤を接触させた後にアルギニン若しくはその塩を接触させてもよく、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体にアルギニン若しくはその塩を接触させた後に界面活性剤を接触させてもよく、又は担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤とアルギニン若しくはその塩を同時に接触させてもよい。4. In the present invention, when the surfactant and arginine or its salt are brought into contact with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier, the surfactant is contacted with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier in the present invention. Arginine or a salt thereof may be contacted after the contact, arginine or a salt thereof may be contacted with an anti-periostin antibody immobilized on a carrier, and then a surfactant may be contacted. A surfactant and arginine or a salt thereof may be simultaneously contacted with the periostin antibody.
本発明においては、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤とアルギニン若しくはその塩を同時に接触させること、又は担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に糖を接触させた後に界面活性剤を接触させることが好ましく、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体にアルギニン若しくはその塩を接触させた後に界面活性剤を接触させることがより好ましい。 In the present invention, the surfactant and arginine or a salt thereof are simultaneously contacted with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier, or the surfactant is contacted after the sugar is contacted with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier. More preferably, it is more preferable that arginine or a salt thereof is brought into contact with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier, followed by contact with a surfactant.
５．界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩
の接触
本発明において、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩を接触させるに当たっては、その順序は問わない。
そして、界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩から選ばれる二つ以上の本発明における安定化物質を、同時に担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に接触させてもよい。5. Contact of Surfactant, Sugar and Arginine or a Salt Thereof In the present invention, the order of contacting the surfactant, sugar and arginine or a salt thereof with the anti-periostin antibody immobilized on a carrier does not matter.
Then, two or more stabilizing substances of the present invention selected from a surfactant, a sugar, and arginine or a salt thereof may be simultaneously contacted with an anti-periostin antibody immobilized on a carrier.
本発明においては、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に糖とアルギニン若しくはその塩を同時又は別々に接触させた後に、界面活性剤を接触させることが好ましい。 In the present invention, it is preferable that the sugar and arginine or a salt thereof are simultaneously or separately contacted with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier, and then the surfactant is contacted.
〔５〕界面活性剤
１．界面活性剤
本発明における界面活性剤としては、例えば、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、及び両性界面活性剤等を挙げることができる。[5] Surfactant Surfactant Examples of the surfactant in the present invention include a nonionic surfactant, an anionic surfactant, a cationic surfactant, and an amphoteric surfactant.
（１）非イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ） ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリスチリルフェニルエーテル、又はポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレンエーテル化合物。(1) Examples of the nonionic surfactant include the following.
(A) polyoxyalkylene such as polyoxyethylene alkyl ether, polyoxypropylene alkyl ether, polyoxyethylene alkyl phenyl ether, polyoxypropylene alkyl phenyl ether, polyoxyethylene polystyryl phenyl ether, or polyoxyethylene polyoxypropylene glycol Ether compounds.
（ｂ） グリセリン脂肪酸部分エステル、ソルビタン脂肪酸部分エステル、ペンタエリスリトール脂肪酸部分エステル、プロピレングリコールモノ脂肪酸エステル、又はショ糖脂肪酸部分エステルなどの多価アルコール部分エステル化合物。 (B) Polyhydric alcohol partial ester compounds such as glycerin fatty acid partial ester, sorbitan fatty acid partial ester, pentaerythritol fatty acid partial ester, propylene glycol monofatty acid ester, and sucrose fatty acid partial ester.
（ｃ） ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸部分エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸部分エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸部分エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸部分エステル、又はポリオキシエチレン化ひまし油などのポリオキシエチレン化多価アルコール脂肪酸エステル。 (C) polyoxyethylenation such as polyoxyethylene sorbitan fatty acid partial ester, polyoxyethylene sorbitol fatty acid partial ester, polyoxyethylene glycerin fatty acid partial ester, polyethylene glycol fatty acid ester, polyglycerin fatty acid partial ester, or polyoxyethylenated castor oil Polyhydric alcohol fatty acid esters.
（ｄ） 脂肪酸ジエタノールアミド、Ｎ，Ｎ−ビス−２−ヒドロキシアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルキルアミン、トリエタノールアミン脂肪酸エステル、又はトリアルキルアミンオキシドなどのアミド若しくはアミン化合物。 (D) Amide or amine compounds such as fatty acid diethanolamide, N, N-bis-2-hydroxyalkylamine, polyoxyethylene alkylamine, triethanolamine fatty acid ester, and trialkylamine oxide.
（２）陰イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ） 脂肪族モノカルボン酸塩、Ｎ−アシロイルサルコシン塩、Ｎ−アシロイル−β−アラニン塩、若しくはＮ−アシロイルグルタミン酸塩などの脂肪族化合物カルボン酸塩；又はアビエチン酸塩などの環式化合物カルボン酸塩。(2) Examples of the anionic surfactant include the following.
(A) aliphatic monocarboxylic acid salt, aliphatic compound carboxylic acid salt such as N-acyloylsarcosine salt, N-acyloyl-β-alanine salt or N-acyloylglutamate salt; or cyclic compound such as abietic acid salt Compound carboxylate.
（ｂ） ジアルキルスルホコハク酸塩、アルカンスルホン酸塩、若しくはヒドロキシアルカンスルホン酸塩などの脂肪族化合物スルホン酸塩；直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル（分岐鎖）ベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルキルフェノキシポリオキシエチレンプロピルスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェノールスルホン酸塩、若しくはナフタレンスルホン酸塩−ホルムアルデヒド縮合物などの環式化合物スルホン酸塩；又はＮ−メチル−Ｎ−オレイルタウリンナトリウム、若しくはＮ−アルキルスルホコハク酸モノアミド二ナトリウム塩などの含窒素化合物スルホン酸塩。 (B) Aliphatic compound sulfonates such as dialkyl sulfosuccinates, alkane sulfonates, or hydroxyalkane sulfonates; linear alkyl benzene sulfonates, alkyl (branched chain) benzene sulfonates, alkyl naphthalene sulfonates Or a cyclic compound sulfonate such as alkylphenoxypolyoxyethylenepropyl sulfonate, polyoxyethylene alkylphenol sulfonate, or naphthalene sulfonate-formaldehyde condensate; or N-methyl-N-oleyltaurine sodium, or N -Nitrogen-containing compound sulfonates such as alkylsulfosuccinic acid monoamide disodium salt.
（ｃ） 硫酸化ひまし油、硫酸化牛脚油、脂肪酸アルキルエステル・硫酸エステル塩、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、脂肪酸モノグリセリド硫酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンアルキロイルアミド硫酸塩などの脂肪族化合物硫酸エステル塩；又はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル硫酸エステル塩などの環式化合物硫酸エステル塩。 (C) sulfated castor oil, sulfated beef leg oil, fatty acid alkyl ester / sulfate, alkyl sulfate, polyoxyethylene alkyl ether sulfate, fatty acid monoglyceride sulfate, or polyoxyethylene alkylylamide sulfate And sulfates of cyclic compounds such as polyoxyethylene alkyl phenyl ether sulfate or polyoxyethylene styryl phenyl ether sulfate.
（ｄ） アルキルリン酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸エステル塩などの脂肪族化合物リン酸エステル塩；又はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸エステル塩などの環式化合物リン酸エステル塩。 (D) an aliphatic compound phosphate such as an alkyl phosphate or a polyoxyethylene alkyl ether phosphate; or a cyclic compound phosphate such as a polyoxyethylene alkyl phenyl ether phosphate.
（ｅ） スチレン−無水マレイン酸共重合物の部分けん化物、又はオレフィン−無水マレイン酸共重合物の部分けん化物などの重合型高分子化合物のけん化物。 (E) A saponified polymerizable polymer compound such as a partially saponified styrene-maleic anhydride copolymer or a partially saponified olefin-maleic anhydride copolymer.
（ｆ） ナフタレンスルホン酸塩−ホルマリン縮合物などの重縮合型高分子化合物。 (F) Polycondensation type polymer compounds such as naphthalene sulfonate-formalin condensate.
（３）陽イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ） モノアルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、又はトリアルキルアミン塩などの脂肪族化合物アミン塩。(3) Examples of the cationic surfactant include the following.
(A) An aliphatic compound amine salt such as a monoalkylamine salt, a dialkylamine salt, or a trialkylamine salt.
（ｂ） テトラアルキルアンモニウム塩などの脂肪族化合物第四級アンモニウム塩；又はトリアルキルベンジルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩、２−アルキル−１−アルキル−１−ヒドロキシエチルイミダゾリニウム塩、若しくはＮ，Ｎ−ジアルキルモルホリニウム塩などの環状化合物第四級アンモニウム塩。 (B) quaternary ammonium salts of aliphatic compounds such as tetraalkylammonium salts; or trialkylbenzylammonium salts, alkylpyridinium salts, 2-alkyl-1-alkyl-1-hydroxyethylimidazolinium salts, or N, N -Quaternary ammonium salts of cyclic compounds such as dialkylmorpholinium salts.
（ｃ） ポリエチレンポリアミン脂肪族アミド塩、ポリエチレンポリアミン脂肪族アミドの尿素縮合物の塩、又はポリエチレンポリアミン脂肪族アミド尿素縮合物の第四級アンモニウム塩などのポリエチレンポリアミン誘導体。 (C) Polyethylene polyamine derivatives such as polyethylene polyamine aliphatic amide salts, salts of urea condensates of polyethylene polyamine aliphatic amides, and quaternary ammonium salts of polyethylene polyamine aliphatic amide urea condensates.
（４）両性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ） Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−アルキル−Ｎ−カルボキシアルキレンアンモニウムベタインなどのカルボキシベタイン化合物。(4) Examples of the amphoteric surfactant include the following.
(A) Carboxybetaine compounds such as N, N-dimethyl-N-alkyl-N-carboxyalkyleneammonium betaine.
（ｂ） Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキレンカルボン酸塩などのアミノカルボン酸化合物。 (B) Aminocarboxylic acid compounds such as N, N-dialkylaminoalkylenecarboxylic acid salts.
（ｃ） Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキル−Ｎ−スルホアルキレンアンモニウムベタインなどのスルホベタイン化合物。 (C) Sulfobetaine compounds such as N, N, N-trialkyl-N-sulfoalkyleneammonium betaine.
（ｄ） Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ビスポリオキシエチレン硫酸エステル塩などのアミノ硫酸エステル化合物。 (D) Aminosulfate compounds such as N-alkyl-N, N-bispolyoxyethylene sulfate salts.
（ｅ） ２−アルキル−１−ヒドロキシエチル−１−カルボキシメチルイミダゾリニウム塩などのイミダゾリン化合物。 (E) imidazoline compounds such as 2-alkyl-1-hydroxyethyl-1-carboxymethylimidazolinium salts.
本発明においては、１種類の界面活性剤だけを用いてもよく、又は２種類以上の界面活性剤を組み合わせて用いてもよい。 In the present invention, only one type of surfactant may be used, or two or more types of surfactants may be used in combination.
本発明における界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が好ましく、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸部分エステルがより好ましく、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートが特に好ましい。 As the surfactant in the present invention, a nonionic surfactant is preferable, a polyoxyethylene sorbitan fatty acid partial ester is more preferable, and polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate is particularly preferable.
２．濃度
本発明において、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤を接触させる際の界面活性剤の濃度は、特に限定されないが、当該接触時に、０．００１％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましい。2. Concentration In the present invention, the concentration of the surfactant when the surfactant is brought into contact with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier is not particularly limited, but is 0.001% (w / v) or more at the time of the contact. Is preferred.
なお、当該接触時の界面活性剤の好ましい濃度の下限は、より好ましくは０．００５％（ｗ／ｖ）以上であり、更に好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上であり、特に好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以上である。 The lower limit of the preferable concentration of the surfactant at the time of the contact is more preferably 0.005% (w / v) or more, still more preferably 0.01% (w / v) or more, and particularly preferably. Is 0.05% (w / v) or more.
また、当該接触時の界面活性剤の好ましい濃度であるが、上限は特にはないが、コスト等のことを考えると５％（ｗ／ｖ）迄で十分である。 Further, although the concentration of the surfactant at the time of the contact is preferable, there is no particular upper limit. However, considering the cost and the like, up to 5% (w / v) is sufficient.
なお、当該接触時の界面活性剤の好ましい濃度の上限は、より好ましくは１％（ｗ／ｖ）以下であり、特に好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以下である。 The upper limit of the preferred concentration of the surfactant at the time of the contact is more preferably 1% (w / v) or less, and particularly preferably 0.5% (w / v) or less.
なお、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤を接触させる場合、界面活性剤を含有する溶液（試薬）を用いるときは、当該担体に固定化した抗ペリオスチン抗体と界面活性剤との接触時に、当該界面活性剤の濃度が前記の濃度となるよう、当該界面活性剤を当該溶液（試薬）に含有させることが好ましい。 When the surfactant is brought into contact with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier, when a solution (reagent) containing the surfactant is used, the contact between the anti-periostin antibody immobilized on the carrier and the surfactant is not performed. Sometimes, it is preferable to include the surfactant in the solution (reagent) so that the concentration of the surfactant becomes the above-described concentration.
３．温度及び時間
担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤を接触させる場合、その際の温度及び時間は、適宜選択すればよい。3. Temperature and time When the surfactant is brought into contact with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier, the temperature and time at that time may be appropriately selected.
なお、この接触時の温度は、界面活性剤を含有する溶液が凍結する温度より上の温度であって、適宜適した温度であればよい。
また、この接触時の温度が高すぎると抗ペリオスチン抗体等の成分が変性、失活してしまうので、当該接触時の温度は、関係する成分が変性、失活する温度未満の温度とする必要がある。
この接触時の温度は、２〜４０℃が好ましく、２〜３０℃がより好ましく、２〜２０℃が更に好ましく、２〜１０℃が特に好ましい。The temperature at the time of this contact is higher than the temperature at which the solution containing the surfactant freezes, and may be any suitable temperature.
In addition, if the temperature at the time of this contact is too high, components such as the anti-periostin antibody will be denatured and deactivated. Therefore, the temperature at the time of the contact must be lower than the temperature at which the relevant components are denatured and deactivated. There is.
The temperature at the time of this contact is preferably 2 to 40C, more preferably 2 to 30C, still more preferably 2 to 20C, and particularly preferably 2 to 10C.
そして、前記接触の時間は、適宜適した時間接触させればよいが、通常、６時間以上が好ましく、１２時間以上がより好ましく、１８時間以上が特に好ましい。 The contact time may be appropriately set for a suitable time, but is usually preferably 6 hours or more, more preferably 12 hours or more, and particularly preferably 18 hours or more.
なお、この接触時間の上限は特にはない。
但し、強いて挙げるとすると、作業時間が長くなることによりコストが上昇するとの観点に立てば、接触時間は２０日以内とすることが好ましく、１５日以内とすることがより好ましく、１０日以内とすることが特に好ましい。There is no particular upper limit for the contact time.
However, if it is forcibly mentioned, from the viewpoint that the cost increases due to a longer working time, the contact time is preferably within 20 days, more preferably within 15 days, and more preferably within 10 days. It is particularly preferred to do so.
４．乾燥
担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤を接触させた後、当該抗ペリオスチン抗体を乾燥状態とすることが、抗ペリオスチン抗体固定化担体の運搬等の取扱い上都合が良い。4. Drying After bringing the surfactant into contact with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier, the anti-periostin antibody is brought into a dry state, which is convenient for handling such as transportation of the carrier having the anti-periostin antibody immobilized thereon.
当該抗ペリオスチン抗体を乾燥状態とする方法としては、例えば、凍結乾燥、真空乾燥、風を当てての乾燥、又は自然乾燥等を挙げることができるが、自然乾燥が好ましい。 Examples of a method for putting the anti-periostin antibody in a dry state include freeze-drying, vacuum drying, drying by blowing air, and natural drying. Natural drying is preferable.
〔６〕糖
１．糖[6] Sugar 1. sugar
本発明における糖としては、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、又はオリゴ糖等を挙げることができる。 Examples of the saccharide in the present invention include a monosaccharide, a disaccharide, a trisaccharide, a tetrasaccharide, and an oligosaccharide.
また、本発明における糖としては、例えば、三炭糖、四炭糖、五炭糖、又は六炭糖等を構成成分とするものを挙げることができる。 In addition, examples of the saccharide in the present invention include those containing tri-, tetra-, pentose, or hexose as constituents.
そして、本発明における糖として、より具体的には、例えば、グルコース、ガラクトース、アラビノース、キシロース、エリトロース、フルクトース、リブロース、フコース、マンノース、ラムノース、リボース、キシロース、スクロース（サッカロース）、トレハロース、イソトレハロース、ラクトース、マルトース、セロビオース、イソマルトース、フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、又は乳果オリゴ糖等を挙げることができる。 More specifically, as the sugar in the present invention, for example, glucose, galactose, arabinose, xylose, erythrose, fructose, ribulose, fucose, mannose, rhamnose, ribose, xylose, sucrose (saccharose), trehalose, isotrehalose, Lactose, maltose, cellobiose, isomaltose, fructooligosaccharides, galactooligosaccharides, dairy oligosaccharides and the like can be mentioned.
本発明における糖としては、二糖が好ましく、スクロース及びトレハロースがより好ましく、スクロースが特に好ましい。 The saccharide in the present invention is preferably a disaccharide, more preferably sucrose and trehalose, and particularly preferably sucrose.
２．濃度
本発明において、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に糖を接触させる際の糖の濃度は、特に限定されないが、当該接触時に、０．１％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましい。2. Concentration In the present invention, the concentration of the saccharide when bringing the saccharide into contact with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier is not particularly limited, but is preferably 0.1% (w / v) or more at the time of the contact.
なお、当該接触時の糖の好ましい濃度の下限は、より好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以上であり、更に好ましくは１％（ｗ／ｖ）以上であり、特に好ましくは５％（ｗ／ｖ）以上である。 In addition, the lower limit of the preferable concentration of the sugar at the time of the contact is more preferably 0.5% (w / v) or more, still more preferably 1% (w / v) or more, and particularly preferably 5% (w / v). w / v).
また、当該接触時の糖の好ましい濃度であるが、上限は特にはないが、コスト等のことを考えると２０％（ｗ／ｖ）迄で十分である。 The preferred concentration of the sugar at the time of the contact is not particularly limited, but considering the cost and the like, a concentration of up to 20% (w / v) is sufficient.
なお、当該接触時の糖の好ましい濃度の上限は、より好ましくは１５％（ｗ／ｖ）以下であり、特に好ましくは１０％（ｗ／ｖ）以下である。 The upper limit of the preferred concentration of the sugar at the time of the contact is more preferably 15% (w / v) or less, and particularly preferably 10% (w / v) or less.
なお、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に糖を接触させる場合、糖を含有する溶液（試薬）を用いるときは、当該担体に固定化した抗ペリオスチン抗体と糖との接触時に、当該糖の濃度が前記の濃度となるよう、当該糖を当該溶液（試薬）に含有させることが好ましい。 When the sugar is brought into contact with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier, when a solution (reagent) containing the sugar is used, when the anti-periostin antibody immobilized on the carrier is brought into contact with the sugar, the concentration of the sugar is measured. It is preferable that the sugar is contained in the solution (reagent) so that the above concentration is as described above.
３．温度及び時間
担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に糖を接触させる場合、その際の温度及び時間は、適宜選択すればよい。3. Temperature and time When the sugar is brought into contact with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier, the temperature and time at that time may be appropriately selected.
なお、この接触時の温度は、糖を含有する溶液が凍結する温度より上の温度であって、適宜適した温度であればよい。
また、この接触時の温度が高すぎると抗ペリオスチン抗体等の成分が変性、失活してしまうので、当該接触時の温度は、関係する成分が変性、失活する温度未満の温度とする必要がある。
この接触時の温度は、２〜４０℃が好ましく、２〜３０℃がより好ましく、２〜２０℃が更に好ましく、２〜１０℃が特に好ましい。The temperature at the time of this contact may be higher than the temperature at which the sugar-containing solution freezes, and may be any suitable temperature.
In addition, if the temperature at the time of this contact is too high, components such as the anti-periostin antibody will be denatured and deactivated. Therefore, the temperature at the time of the contact must be lower than the temperature at which the relevant components are denatured and deactivated. There is.
The temperature at the time of this contact is preferably 2 to 40C, more preferably 2 to 30C, still more preferably 2 to 20C, and particularly preferably 2 to 10C.
そして、前記接触の時間は、適宜適した時間接触させればよいが、通常、６時間以上が好ましく、１２時間以上がより好ましく、１８時間以上が特に好ましい。
なお、この接触時間の上限は特にはない。
但し、強いて挙げるとすると、作業時間が長くなることによりコストが上昇するとの観点に立てば、接触時間は２０日以内とすることが好ましく、１５日以内とすることがより好ましく、１０日以内とすることが特に好ましい。The contact time may be appropriately set for a suitable time, but is usually preferably 6 hours or more, more preferably 12 hours or more, and particularly preferably 18 hours or more.
There is no particular upper limit for the contact time.
However, if it is forcibly mentioned, from the viewpoint that the cost increases due to a longer working time, the contact time is preferably within 20 days, more preferably within 15 days, and more preferably within 10 days. It is particularly preferred to do so.
４．乾燥
担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に糖を接触させた後、当該抗ペリオスチン抗体を乾燥状態とすることが、抗ペリオスチン抗体固定化担体の運搬等の取扱い上都合が良い。4. It is convenient for handling such as transportation of the anti-periostin antibody-immobilized carrier to bring the anti-periostin antibody into a dry state after the sugar is brought into contact with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier.
当該抗ペリオスチン抗体を乾燥状態とする方法としては、例えば、凍結乾燥、真空乾燥、風を当てての乾燥、又は自然乾燥等を挙げることができるが、自然乾燥が好ましい。 Examples of a method for putting the anti-periostin antibody in a dry state include freeze-drying, vacuum drying, drying by blowing air, and natural drying. Natural drying is preferable.
〔７〕アルギニン又はその塩
１．アルギニンの塩
本発明において、アルギニンとしては、Ｌ−アルギニン又はＤ−アルギニンのいずれでもよい。
また、本発明において、アルギニンの塩としては、例えば、塩酸塩等を挙げることができる。[7] Arginine or a salt thereof Arginine Salt In the present invention, arginine may be either L-arginine or D-arginine.
In the present invention, examples of arginine salts include, for example, hydrochlorides.
２．濃度
本発明において、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体にアルギニン又はその塩を接触させる際のアルギニン又はその塩の濃度は、特に限定されないが、当該接触時に、１０ｍＭ以上であることが好ましい。2. Concentration In the present invention, the concentration of arginine or a salt thereof when contacting arginine or a salt thereof with the anti-periostin antibody immobilized on a carrier is not particularly limited, but is preferably 10 mM or more at the time of the contact.
なお、当該接触時のアルギニン又はその塩の好ましい濃度の下限は、より好ましくは５０ｍＭ以上であり、更に好ましくは１００ｍＭ以上であり、特に好ましくは２００ｍＭ以上である。 In addition, the lower limit of the preferable concentration of arginine or a salt thereof at the time of the contact is more preferably 50 mM or more, further preferably 100 mM or more, and particularly preferably 200 mM or more.
また、当該接触時のアルギニン又はその塩の好ましい濃度であるが、上限は特にはないが、コスト等のことを考えると８５０ｍＭ迄で十分である。 Further, the concentration of arginine or a salt thereof at the time of the contact is preferable, but there is no particular upper limit, but considering the cost and the like, 850 mM is sufficient.
なお、当該接触時のアルギニン又はその塩の好ましい濃度の上限は、より好ましくは７００ｍＭ以下であり、特に好ましくは５００ｍＭ以下である。 The upper limit of the preferred concentration of arginine or a salt thereof at the time of the contact is more preferably 700 mM or less, and particularly preferably 500 mM or less.
なお、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体にアルギニン又はその塩を接触させる場合、アルギニン又はその塩を含有する溶液（試薬）を用いるときは、当該担体に固定化した抗ペリオスチン抗体とアルギニン又はその塩との接触時に、当該アルギニン又はその塩の濃度が前記の濃度となるよう、当該アルギニン又はその塩を当該溶液（試薬）に含有させることが好ましい。 When arginine or a salt thereof is brought into contact with an anti-periostin antibody immobilized on a carrier, when a solution (reagent) containing arginine or a salt thereof is used, the anti-periostin antibody immobilized on the carrier and arginine or a salt thereof are used. It is preferable that the arginine or a salt thereof is contained in the solution (reagent) so that the concentration of the arginine or a salt thereof at the time of contact with the arginine or the salt thereof becomes the aforementioned concentration.
３．温度及び時間
担体に固定化した抗ペリオスチン抗体にアルギニン又はその塩を接触させる場合、その際の温度及び時間は、適宜選択すればよい。3. Temperature and time When arginine or a salt thereof is brought into contact with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier, the temperature and time at that time may be appropriately selected.
なお、この接触時の温度は、アルギニン又はその塩を含有する溶液が凍結する温度より上の温度であって、適宜適した温度であればよい。
また、この接触時の温度が高すぎると抗ペリオスチン抗体等の成分が変性、失活してしまうので、当該接触時の温度は、関係する成分が変性、失活する温度未満の温度とする必要がある。
この接触時の温度は、２〜４０℃が好ましく、２〜３０℃がより好ましく、２〜２０℃が更に好ましく、２〜１０℃が特に好ましい。The temperature at the time of this contact may be higher than the temperature at which the solution containing arginine or a salt thereof freezes, and may be any suitable temperature.
In addition, if the temperature at the time of this contact is too high, components such as the anti-periostin antibody will be denatured and deactivated. Therefore, the temperature at the time of the contact must be lower than the temperature at which the relevant components are denatured and deactivated. There is.
The temperature at the time of this contact is preferably 2 to 40C, more preferably 2 to 30C, still more preferably 2 to 20C, and particularly preferably 2 to 10C.
そして、前記接触の時間は、適宜適した時間接触させればよいが、通常、６時間以上が好ましく、１２時間以上がより好ましく、１８時間以上が特に好ましい。 The contact time may be appropriately set for a suitable time, but is usually preferably 6 hours or more, more preferably 12 hours or more, and particularly preferably 18 hours or more.
なお、この接触時間の上限は特にはない。
但し、強いて挙げるとすると、作業時間が長くなることによりコストが上昇するとの観点に立てば、接触時間は２０日以内とすることが好ましく、１５日以内とすることがより好ましく、１０日以内とすることが特に好ましい。There is no particular upper limit for the contact time.
However, if it is forcibly mentioned, from the viewpoint that the cost increases due to a longer working time, the contact time is preferably within 20 days, more preferably within 15 days, and more preferably within 10 days. It is particularly preferred to do so.
４．乾燥
担体に固定化した抗ペリオスチン抗体にアルギニン又はその塩を接触させた後、当該抗ペリオスチン抗体を乾燥状態とすることが、抗ペリオスチン抗体固定化担体の運搬等の取扱い上都合が良い。4. Drying After bringing arginine or a salt thereof into contact with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier, the anti-periostin antibody is brought into a dry state, which is convenient for handling such as transport of the anti-periostin antibody-immobilized carrier.
当該抗ペリオスチン抗体を乾燥状態とする方法としては、例えば、凍結乾燥、真空乾燥、風を当てての乾燥、又は自然乾燥等を挙げることができるが、自然乾燥が好ましい。 Examples of a method for putting the anti-periostin antibody in a dry state include freeze-drying, vacuum drying, drying by blowing air, and natural drying. Natural drying is preferable.
〔８〕．ペリオスチンの測定試薬
１．総論
本発明のペリオスチンの測定試薬は、前記の抗ペリオスチン抗体固定化担体を含むものである。[8]. Reagent for measuring periostin General The periostin measurement reagent of the present invention contains the above-mentioned anti-periostin antibody-immobilized carrier.
本発明のペリオスチンの測定試薬は、上記の構成により安定化されたものである。 The reagent for measuring periostin of the present invention is stabilized by the above configuration.
２．ペリオスチンの測定試薬
本発明のペリオスチンの測定試薬は、前記の抗ペリオスチン抗体固定化担体を含むものであるが、このようなものであれば、特にその測定原理に限定されるものではなく、所期の効果を奏するものである。2. The reagent for measuring periostin The reagent for measuring periostin of the present invention includes the above-described anti-periostin antibody-immobilized carrier, but if such a reagent is used, the measurement principle is not particularly limited, and the desired effect can be obtained. Is played.
本発明のペリオスチンの測定試薬は、試料に含まれるペリオスチンを抗ペリオスチン抗体との抗原抗体反応を利用して測定する測定試薬である。 The reagent for measuring periostin of the present invention is a reagent for measuring periostin contained in a sample using an antigen-antibody reaction with an anti-periostin antibody.
この試料に含まれるペリオスチンを抗ペリオスチン抗体との抗原抗体反応を利用して測定する測定試薬の測定原理としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法、特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報などに記載された測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定され、これで被覆された面を有する担体、及び測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる測定法、又はＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｌｉｇａｎｄｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻，７６７〜７７２頁，１９９８年発行；国際公開第９８／２３９６３号パンフレット）等を挙げることができる。 As a measurement principle of a measurement reagent for measuring periostin contained in this sample by using an antigen-antibody reaction with an anti-periostin antibody, for example, enzyme immunoassay (ELISA, EIA), fluorescence immunoassay (FIA), radiation Immunoassay (RIA), luminescence immunoassay (LIA), enzyme antibody method, fluorescent antibody method, immunochromatography method, immunoturbidimetry, latex nephelometry, latex agglutination assay, hemagglutination, particle agglutination A carrier having a surface on which a specific binding substance to a substance to be measured (test substance) described in, for example, a reaction method, JP-A-9-229936 and JP-A-10-132819 is fixed and coated with the substance; And a measurement method using particles to which a specific binding substance to a substance to be measured (test substance) is immobilized, or ELS shown by Dahlbeak et al. Law (Enzyme-linked Ligandsorbent Assay) (Thromb.Haemost, 79, pp. 767-772, 1998 issue;. WO 98/23963 pamphlet), and the like.
そして、本発明のペリオスチンの測定試薬による測定は、サンドイッチ法、競合法又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの手法をも、適用することができる。
また、本発明のペリオスチンの測定試薬による測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。For the measurement of the periostin of the present invention with the measuring reagent, any method such as a sandwich method, a competitive method, or a homogeneous method (homogeneous method) can be applied.
In addition, the measurement of the periostin of the present invention with the measurement reagent may be performed by a manual technique or may be performed using an apparatus such as an analyzer.
本発明のペリオスチンの測定試薬は、二つ以上の測定試薬より構成されるものであってよい。 The periostin measurement reagent of the present invention may be composed of two or more measurement reagents.
なお、本発明のペリオスチンの測定試薬の溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。 In addition, various aqueous solvents can be used as a solvent of the reagent for measuring periostin of the present invention.
この水系溶媒としては、例えば、水、若しくは生理食塩水等を挙げることができ、又は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔Ｔｒｉｓ緩衝液〕、リン酸緩衝液、若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。 Examples of the aqueous solvent include water and physiological saline, or a tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer [Tris buffer], a phosphate buffer, or a phosphate buffered saline. And various buffer solutions.
この緩衝液のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、ｐＨ５〜ｐＨ１０の範囲内のｐＨを選択して用いることが一般的である。 The pH of the buffer solution may be appropriately selected and used, and is not particularly limited. However, it is general to select and use a pH in the range of pH 5 to pH 10.
また、本発明のペリオスチンの測定試薬には、抗ペリオスチン抗体固定化担体の他に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質；カルシウムイオンなどの各種金属イオン；カルシウム塩などの各種塩類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；又は、非特異的反応抑制物質等の１種又は２種以上を適宜含有させてもよい。 The reagent for measuring periostin of the present invention includes proteins such as bovine serum albumin (BSA), human serum albumin (HSA), casein or a salt thereof, and various metals such as calcium ions, in addition to the anti-periostin antibody-immobilized carrier. Various salts such as calcium salts; skim milk powder; various animal sera such as normal rabbit serum; various preservatives such as sodium azide or antibiotics; activators; reaction accelerating substances; sensitivity increasing substances such as polyethylene glycol; , A non-specific reaction inhibitor or the like may be appropriately contained.
なお、これらを本発明のペリオスチンの測定試薬に含有させる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。 The concentration of these components in the periostin measurement reagent of the present invention is not particularly limited, but is preferably 0.001 to 10% (w / v), particularly 0.01 to 5% (w / v). / V) is preferred.
なお、本発明のペリオスチンの測定試薬は、そのもの単独にて、販売し、又は試料に含まれるペリオスチンの測定に使用することができる。
また、本発明のペリオスチンの測定試薬は、他の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料に含まれるペリオスチンの測定に使用することもできる。In addition, the reagent for measuring periostin of the present invention can be sold alone or used for measuring periostin contained in a sample.
In addition, the reagent for measuring periostin of the present invention can be sold in combination with other reagents or used for measuring periostin contained in a sample.
前記の他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、標識物質を含有する試薬、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試薬、又は校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。 As the other reagent, for example, a buffer, a sample diluent, a reagent diluent, a reagent containing a labeling substance, a reagent containing a substance that generates a signal such as color development, or for performing calibration (calibration) And the like.
なお、本発明のペリオスチンの測定試薬は、測定試薬キットであることが好ましい。 The reagent for measuring periostin of the present invention is preferably a measurement reagent kit.
３．抗ペリオスチン抗体
本発明のペリオスチンの測定試薬においては、抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体とは別に、上記「〔１〕抗ペリオスチン抗体」の項に記載された抗体を使用することができ、例えば、以下の抗体を使用することができる。
（ｉ） ペリオスチンに特異的に結合することができる抗体
（ｉｉ） ペリオスチンに特異的に結合することができるポリクローナル抗体
（ｉｉｉ） ペリオスチンに特異的に結合することができるモノクローナル抗体3. Anti-periostin antibody In the reagent for measuring periostin of the present invention, apart from the anti-periostin antibody in the anti-periostin antibody-immobilized carrier, the antibody described in the above section “[1] Anti-periostin antibody” can be used, For example, the following antibodies can be used.
(I) an antibody capable of specifically binding to periostin (ii) a polyclonal antibody capable of specifically binding to periostin (iii) a monoclonal antibody capable of specifically binding to periostin
なお、本発明のペリオスチンの測定試薬において、例えば、ペリオスチン一分子に二分子の抗体を抗原抗体反応させる場合、これらの抗体のいずれもが抗ペリオスチン抗体である必要がある。
例えば、酵素標識抗体と固定化抗体を用いるＥＬＩＳＡ法のサンドイッチ法の測定試薬においては、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる酵素標識抗体及び固定化抗体のいずれもが、この抗ペリオスチン抗体である必要がある。
なお、この場合、この固定化抗体は、前記の担体に固定化した抗ペリオスチン抗体である。In the periostin measurement reagent of the present invention, for example, when one molecule of periostin is allowed to undergo an antigen-antibody reaction, each of these antibodies must be an anti-periostin antibody.
For example, in a measurement reagent of a sandwich method of an ELISA method using an enzyme-labeled antibody and an immobilized antibody, both the enzyme-labeled antibody and the immobilized antibody that bind to periostin contained in the sample are the anti-periostin antibodies. There is a need.
In this case, the immobilized antibody is an anti-periostin antibody immobilized on the carrier.
ところで、前記の抗ペリオスチン抗体は、１種類のものだけではなく、複数種類のものを含有してもよい。 Incidentally, the above-mentioned anti-periostin antibody may contain not only one kind but also a plurality of kinds.
なお、この抗ペリオスチン抗体の詳細については、前記の「〔１〕抗ペリオスチン抗体」の項に記載した通りである。 The details of the anti-periostin antibody are as described in the above section “[1] Anti-periostin antibody”.
４．標識抗体を用いた免疫学的測定方法を測定原理とする測定試薬
本発明のペリオスチンの測定試薬が、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、発光免疫測定法又はイムノクロマトグラフィー法等の標識抗体を用いた免疫学的測定方法、すなわち標識抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法を測定原理とする場合には、サンドイッチ法又は競合法等により行うことができるが、サンドイッチ法により実施する時には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる固定化抗体（担体に固定化した抗ペリオスチン抗体）及び標識抗体のいずれもの抗体が抗ペリオスチン抗体である必要がある。4. Measuring reagent based on an immunological measuring method using a labeled antibody The measuring reagent for periostin of the present invention is an enzyme immunoassay, a fluorescent immunoassay, a radioimmunoassay, a luminescence immunoassay or an immunochromatography method. When the measurement principle is an immunological measurement method using a labeled antibody, that is, a measurement method using an antigen-antibody reaction using a labeled antibody, it can be performed by a sandwich method or a competition method. When performing, it is necessary that both the immobilized antibody (anti-periostin antibody immobilized on a carrier) and the labeled antibody to be bound to periostin contained in the sample are anti-periostin antibodies.
標識物質としては、酵素免疫測定法の測定試薬の場合には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素又はアミラーゼ等を用いることができる。
また、蛍光免疫測定法の測定試薬の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート又はジクロロトリアジンイソチオシアネート等を用いることができる。
そして、放射免疫測定法の測定試薬の場合には、トリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１等を用いることができる。
また、発光免疫測定法の測定試薬においては、ＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ２−ルシフェラーゼ系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、アクリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等を用いることができる。
また、イムノクロマトグラフィー法の測定試薬の場合には、金コロイド粒子等を用いることができる。As a labeling substance, in the case of a measuring reagent of an enzyme immunoassay, peroxidase (POD), alkaline phosphatase (ALP), β-galactosidase, urease, catalase, glucose oxidase, lactate dehydrogenase or amylase, etc. should be used. Can be.
In the case of a fluorescent immunoassay measurement reagent, fluorescein isothiocyanate, tetramethylrhodamine isothiocyanate, substituted rhodamine isothiocyanate or dichlorotriazine isothiocyanate can be used.
Then, in the case of a measurement reagent for a radioimmunoassay, tritium, iodine-125, iodine-131, or the like can be used.
As a measurement reagent for the luminescence immunoassay, NADH-FMNH 2 -luciferase system, luminol-hydrogen peroxide-POD system, acridinium ester system, dioxetane compound system, or the like can be used.
In the case of a reagent for immunochromatography, colloidal gold particles or the like can be used.
抗ペリオスチン抗体と酵素等の標識物質との結合法は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗ペリオスチン抗体と標識物質をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗ペリオスチン抗体と標識物質のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより結合を行うことができる。 The method for binding an anti-periostin antibody to a labeling substance such as an enzyme is described in “Clinical Pathology Extra Edition, Special Issue No. 53, Immunoassay for Clinical Testing -Technology and Application-”, edited by The Japanese Society of Clinical Pathology, Clinical Pathology Publishing Association, 1983. An anti-periostin antibody and a labeling substance, such as glutaraldehyde, carbodiimide, imide ester, and maleimide, according to a known method described in “Chemical Experiment Laboratory Course 1 Protein IV”, edited by The Biochemical Society of Japan, Tokyo Kagaku Dojin, 1991. The binding can be carried out by mixing and contacting with a valent crosslinking reagent and reacting the anti-periostin antibody with the respective amino group, carboxyl group, thiol group, aldehyde group or hydroxyl group of the labeling substance.
測定の操作法は公知の方法等（日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；石川榮治ら編「酵素免疫測定法」，第３版，医学書院，１９８７年発行；北川常廣ら編「蛋白質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１ 酵素免疫測定法」，共立出版，１９８７年発行）等により行うことができる。 The operation method of the measurement is a known method, etc. (edited by the Japanese Society of Clinical Pathology, “Special Issue of Clinical Pathology Extraordinary Issue No. 53, Immunoassay for Clinical Examinations-Techniques and Applications-”, Clinical Pathology Publishing Association, 1983; Ed. Ishikawa et al.) Enzyme immunoassay, 3rd edition, published by Medical Shoin, 1987; edited by Tsunehiro Kitagawa et al., “Enzyme Immunoassay for Protein Nucleic Acid Enzyme, Supplement No.31, Kyoritsu Shuppan, 1987”, etc. .
例えば、抗ペリオスチン抗体固定化担体（担体＝抗ペリオスチン抗体）と試料を反応させ、同時に標識抗体を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体を反応させることにより、「担体＝抗ペリオスチン抗体＝ペリオスチン＝標識抗体」の複合体を抗原抗体反応により形成させる。
なお、この抗ペリオスチン抗体固定化担体は、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（１）〜（３）から選択される安定化物質を接触させる処理を行っておいたものである。
（１）界面活性剤及び糖
（２）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
（３）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩For example, by reacting a sample with an anti-periostin antibody-immobilized carrier (carrier = anti-periostin antibody) and simultaneously reacting with a labeled antibody, or reacting with a labeled antibody after washing, “carrier = anti-periostin antibody = periostin = A complex of “labeled antibody” is formed by an antigen-antibody reaction.
The anti-periostin antibody-immobilized carrier has been subjected to a treatment in which a stabilizing substance selected from the following (1) to (3) is brought into contact with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier.
(1) Surfactant and sugar (2) Surfactant and arginine or salt thereof (3) Surfactant, sugar and arginine or salt thereof
そして、未結合の標識抗体を洗浄分離して、「担体＝抗ペリオスチン抗体＝ペリオスチン」を介して担体に結合した標識抗体の量又は未結合の標識抗体の量より試料に含まれていたペリオスチンの量（濃度）のみを測定することができる。 Then, the unbound labeled antibody is separated by washing, and the amount of periostin contained in the sample is determined from the amount of the labeled antibody bound to the carrier via the “carrier = anti-periostin antibody = periostin” or the amount of the unbound labeled antibody. Only the amount (concentration) can be measured.
具体的には、酵素免疫測定法の測定試薬の場合は、例えば抗体に標識した酵素に、その至適条件下で基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法等により測定する。
また、蛍光免疫測定法の測定試薬の場合には蛍光物質標識による蛍光強度等を、放射免疫測定法の測定試薬の場合には放射性物質標識による放射線量等を測定する。
そして、発光免疫測定法の測定試薬の場合は発光反応系による発光量等を測定する。Specifically, in the case of a reagent for enzyme immunoassay, for example, an enzyme labeled with an antibody is allowed to react with a substrate under optimal conditions, and the amount of the enzyme reaction product is measured by an optical method or the like. .
In the case of a measurement reagent of the fluorescence immunoassay, the fluorescence intensity or the like by the fluorescent substance label is measured, and in the case of the measurement reagent of the radioimmunoassay, the radiation dose or the like by the radioactive substance label is measured.
Then, in the case of a measurement reagent for luminescence immunoassay, the amount of luminescence by a luminescence reaction system is measured.
なお、前記の抗ペリオスチン抗体は、１種類のものだけではなく、複数種類のものを使用してもよい。 The above-mentioned anti-periostin antibody is not limited to one kind, and a plurality of kinds may be used.
５．凝集反応法による免疫学的測定方法を測定原理とする測定試薬
本発明のペリオスチンの測定試薬が、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、又は目視的に測る測定方法により実施する場合には、すなわち、抗原抗体反応による複合体の凝集物の生成を測る測定方法（凝集反応法）を測定原理とする場合には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる抗体が「担体に固定化した抗ペリオスチン抗体」である必要がある。5. Measuring reagent based on immunological measurement method by agglutination method The measuring reagent for periostin of the present invention is an immunocomplex agglutination method such as latex turbidimetry, latex agglutination method, hemagglutination method or particle agglutination method. When the production of a substance is measured by an optical method of measuring the transmitted light or scattered light or by a measurement method of measuring visually, that is, a measurement method of measuring the formation of an aggregate of a complex by an antigen-antibody reaction When (agglutination reaction) is used as the measurement principle, the antibody to be bound to periostin contained in the sample needs to be an “anti-periostin antibody immobilized on a carrier”.
なお、前記の凝集反応法による測定試薬においては、溶媒として、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔Ｔｒｉｓ緩衝液〕又はグッド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませてもよい。 In the measurement reagent by the agglutination reaction method, a phosphate buffer, a glycine buffer, a tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer [Tris buffer], a Good buffer, or the like can be used as a solvent. Further, a reaction accelerator such as polyethylene glycol or a non-specific reaction inhibitor may be contained.
なお、ラテックス比濁法を測定原理とする測定試薬の場合、担体として用いるラテックス粒子の粒径については、特に制限はないものの、ラテックス粒子が測定対象物質（ペリオスチン）を介して結合し、凝集塊を生成する程度、及びこの生成した凝集塊の測定の容易さ等の理由より、ラテックス粒子の粒径は、その平均粒径が、０．０４〜１μｍであることが好ましい。 In the case of a measurement reagent based on a latex turbidimetric method, there is no particular limitation on the particle size of latex particles used as a carrier, but latex particles are bound via a substance to be measured (periostin) to form aggregates. It is preferable that the average particle size of the latex particles is 0.04 to 1 [mu] m for reasons such as the degree to which the latex particles are formed and the ease of measurement of the formed aggregates.
また、ラテックス比濁法を測定原理とする測定試薬の場合、抗ペリオスチン抗体を固定化させたラテックス粒子を含ませる濃度については、試料中のペリオスチンの濃度、抗ペリオスチン抗体のラテックス粒子表面上での分布密度、ラテックス粒子の粒径、試料と測定試薬の混合比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概にいうことはできない。 In addition, in the case of a measurement reagent using a latex turbidimetry as a measurement principle, the concentration of the latex particles in which the anti-periostin antibody is immobilized is determined by the concentration of the periostin in the sample and the concentration of the anti-periostin antibody on the latex particle surface. Since the optimum concentration varies depending on various conditions such as the distribution density, the particle size of latex particles, and the mixing ratio of the sample and the measuring reagent, it cannot be described unconditionally.
しかし、通常は、試料と測定試薬が混合され、ラテックス粒子に固定化された「抗ペリオスチン抗体」と試料に含まれていた「ペリオスチン」との抗原抗体反応時（測定反応時）に、「抗ペリオスチン抗体」を固定化させたラテックス粒子の濃度が、反応混合液中において０．００５〜１％（ｗ／ｖ）となるようにするのが一般的であり、この場合、反応混合液中においてこのような濃度になるような濃度の「抗ペリオスチン抗体を固定化させたラテックス粒子」を測定試薬に含ませることが好ましい。 However, usually, when the sample and the measurement reagent are mixed and the “anti-periostin antibody” immobilized on the latex particles and the “periostin” contained in the sample react with the antigen-antibody (at the time of the measurement reaction), In general, the concentration of the latex particles on which the “periostin antibody” is immobilized is adjusted to 0.005 to 1% (w / v) in the reaction mixture. It is preferable to include a “latex particle on which an anti-periostin antibody is immobilized” at such a concentration as to the concentration in the measurement reagent.
また、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合、担体として用いる粒子の粒径については、特に制限はないものの、その平均粒子径が０．０１〜１００μｍの範囲内にあることが好ましく、０．５〜１０μｍの範囲内にあることがより好ましい。そして、これらの粒子の比重は、１〜１０の範囲内にあることが好ましく、１〜２の範囲内にあることがより好ましい。 When the measurement principle is an indirect agglutination reaction method such as a latex agglutination reaction method, a hemagglutination reaction method or a particle agglutination reaction method, the particle size of the particles used as the carrier is not particularly limited, but the average particle size is not limited. It is preferably in the range of 0.01 to 100 μm, more preferably in the range of 0.5 to 10 μm. The specific gravity of these particles is preferably in the range of 1 to 10, and more preferably in the range of 1 to 2.
なお、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合の測定に使用する容器としては、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリメタクリレートなどからなる、試験管、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）又はトレイ等を挙げることができる。
これらの容器の溶液収容部分（マイクロプレートのウェル等）の底面は、Ｕ型、Ｖ型又はＵＶ型等の底面中央から周辺にかけて傾斜を持つ形状であることが好ましい。In addition, as a container used for measurement when the measurement principle is based on an indirect agglutination reaction method such as a latex agglutination reaction method, a hemagglutination reaction method or a particle agglutination reaction method, for example, glass, polystyrene, polyvinyl chloride or polymethacrylate, etc. , A test tube, a microplate (microtiter plate) or a tray.
It is preferable that the bottom surface of the solution accommodating portion (well of a microplate or the like) of these containers has a shape having a slope from the center to the periphery of the bottom surface such as a U-shaped, V-shaped or UV-shaped.
測定の操作法は公知の方法等により行うことができるが、例えば、光学的方法により測定する場合には、試料と「担体に固定化した抗ペリオスチン抗体」を反応させ、エンドポイント法又はレート法により、透過光や散乱光を測定する。
また、目視的に測定する場合には、プレートやマイクロプレート等の前記容器中で、試料と「担体に固定化した抗ペリオスチン抗体」を反応させ、凝集の状態を目視的に測定する。
なお、この目視的に測定する代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて測定を行ってもよい。The measurement can be performed by a known method.For example, when the measurement is performed by an optical method, the sample is allowed to react with an “anti-periostin antibody immobilized on a carrier”, and an endpoint method or a rate method is used. To measure transmitted light and scattered light.
When the measurement is carried out visually, the sample is allowed to react with the “anti-periostin antibody immobilized on a carrier” in the container such as a plate or a microplate, and the state of aggregation is visually measured.
The measurement may be performed by using a device such as a microplate reader instead of the visual measurement.
測定の操作法の例を以下挙げる。
例えば、まず、本発明の「抗ペリオスチン抗体固定化担体」を含むペリオスチン測定試薬等を調製し、準備する。
なお、この抗ペリオスチン抗体固定化担体は、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（１）〜（３）から選択される安定化物質を接触させる処理を行っておいたものである。
（１）界面活性剤及び糖
（２）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
（３）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩The following is an example of a measurement operation method.
For example, first, a periostin measurement reagent or the like containing the “anti-periostin antibody-immobilized carrier” of the present invention is prepared and prepared.
The anti-periostin antibody-immobilized carrier has been subjected to a treatment in which a stabilizing substance selected from the following (1) to (3) is brought into contact with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier.
(1) Surfactant and sugar (2) Surfactant and arginine or salt thereof (3) Surfactant, sugar and arginine or salt thereof
次に、例えば、「抗ペリオスチン抗体固定化担体」を含むペリオスチン測定試薬と、試料とを混合し、これにより、「抗ペリオスチン抗体固定化担体」の抗ペリオスチン抗体と試料とを接触させる。 Next, for example, a periostin measurement reagent containing an “anti-periostin antibody-immobilized carrier” and a sample are mixed, thereby bringing the sample into contact with the anti-periostin antibody of the “anti-periostin antibody-immobilized carrier”.
これにより、「抗ペリオスチン抗体固定化担体」の「抗ペリオスチン抗体」と、試料に含まれていた「ペリオスチン」との、抗原抗体反応を行わせる。 Thus, an antigen-antibody reaction is performed between the “anti-periostin antibody” of the “anti-periostin antibody-immobilized carrier” and the “periostin” contained in the sample.
そして、これより生成した、「抗ペリオスチン抗体固定化担体」（抗ペリオスチン抗体＝担体＝抗ペリオスチン抗体）と「ペリオスチン」との複合体凝集物（…〔ペリオスチン〕−〔抗ペリオスチン抗体＝担体＝抗ペリオスチン抗体〕−〔ペリオスチン〕−〔抗ペリオスチン抗体＝担体＝抗ペリオスチン抗体〕−〔ペリオスチン〕…）を測定する。 Then, a complex aggregate of the “anti-periostin antibody-immobilized carrier” (anti-periostin antibody = carrier = anti-periostin antibody) and “periostin” (... [periostin] − [anti-periostin antibody = carrier = anti-antibody) Periostin antibody]-[periostin]-[anti-periostin antibody = carrier = anti-periostin antibody]-[periostin] ...).
この生成した複合体凝集物の測定は、この複合体凝集物が存在する測定反応時の反応混合液の透過光又は散乱光などの吸光度等の測定を、エンドポイント法又はレート法等により行うことにより、実施する。 The measurement of the formed composite aggregate is performed by measuring the absorbance such as transmitted light or scattered light of the reaction mixture during the measurement reaction in which the composite aggregate is present, by an endpoint method, a rate method, or the like. It is carried out by
そして、試料を測定して得た吸光度等の測定値を、標準物質（ペリオスチンの濃度が既知の試料）を測定して得た吸光度等の測定値と比較して、試料中に含まれていたペリオスチンの濃度（定量値）を算出する。 Then, the measured value such as the absorbance obtained by measuring the sample was compared with the measured value such as the absorbance obtained by measuring a standard substance (a sample having a known concentration of periostin), and was included in the sample. Calculate the concentration (quantitative value) of periostin.
なお、透過光又は散乱光などの吸光度等の測定は、透過光を測定しても、又は散乱光を測定してもよく、そして、１波長測定であっても、又は２波長測定（２つの波長による差又は比）であってもよい。
なお、測定波長は、３４０ｎｍから１，０００ｎｍの中から選ばれるのが一般的である。In addition, the measurement of the absorbance of transmitted light or scattered light or the like may be performed by measuring transmitted light or scattered light, and may be one-wavelength measurement or two-wavelength measurement (two wavelengths). Wavelength difference or ratio).
The measurement wavelength is generally selected from 340 nm to 1,000 nm.
なお、本発明におけるペリオスチンの測定は、用手法により行ってもよいし、又は測定装置等の装置を用いて行ってもよい。
測定装置は、汎用自動分析装置であっても、専用の測定装置（専用機）であってもよい。In addition, the measurement of periostin in the present invention may be performed by a manual technique, or may be performed using a device such as a measuring device.
The measuring device may be a general-purpose automatic analyzer or a dedicated measuring device (dedicated machine).
また、本発明におけるペリオスチンの測定は、１ステップ法（１試薬法）により行ってもよいし、又は２ステップ法（２試薬法）等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施してもよい。 Further, the measurement of periostin in the present invention may be performed by a one-step method (one-reagent method) or a method performed by a plurality of operation steps such as a two-step method (two-reagent method).
なお、本発明におけるペリオスチンの測定において、抗ペリオスチン抗体は、１種類のものだけではなく、複数種類のものを使用してもよい。 In the measurement of periostin in the present invention, not only one kind of anti-periostin antibody but also plural kinds of anti-periostin antibodies may be used.
なお、以下、ラテックス比濁法を測定原理とする方法によりペリオスチンの測定を行う場合を例にとって、より具体的に説明を行う。 Hereinafter, the case where periostin is measured by a method using a latex turbidimetric method as a measurement principle will be described more specifically.
（１） まず、ペリオスチンの測定試薬として、以下のものを調製し、準備する。
第１試薬：緩衝液（水系溶媒）(1) First, the following are prepared and prepared as a reagent for measuring periostin.
First reagent: buffer solution (aqueous solvent)
第２試薬：本発明の「抗ペリオスチン抗体固定化ラテックス粒子」を含有する緩衝液
なお、この抗ペリオスチン抗体固定化ラテックス粒子は、ラテックス粒子（担体）に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（ａ）〜（ｃ）から選択される安定化物質を接触させる処理を行っておいたものである。
（ａ）界面活性剤及び糖
（ｂ）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
（ｃ）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩Second reagent: a buffer containing the "anti-periostin antibody-immobilized latex particles" of the present invention. The anti-periostin antibody-immobilized latex particles are added to the anti-periostin antibody immobilized on latex particles (carrier) by the following (a) ) To (c) in which a stabilizing substance selected from the group is contacted.
(A) Surfactant and sugar (b) Surfactant and arginine or salt thereof (c) Surfactant, sugar and arginine or salt thereof
（２） 血清等の試料の一定量と前記の第１試薬の一定量を混合し、一定温度下で一定時間静置する。
なお、試料と第１試薬の混合比率（量比）は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温（１℃〜３０℃）又は微温（３０℃〜４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい。（例えば、３７℃等）(2) A certain amount of a sample such as serum and a certain amount of the first reagent are mixed and allowed to stand at a certain temperature for a certain time.
The mixing ratio (quantity ratio) between the sample and the first reagent may be appropriately selected.
Further, the temperature at the time of standing is preferably a constant temperature in the range of room temperature (1 ° C. to 30 ° C.) or low temperature (30 ° C. to 40 ° C.). (For example, 37 ° C.)
（３） 一定時間後、前記の試料と第１試薬との混合液に、前記の第２試薬の一定量を添加、混合し、反応混合液として、一定温度下で一定時間静置する。
これにより、「抗ペリオスチン抗体固定化ラテックス粒子」と試料とを接触させる。
なお、第２試薬の添加量は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温（１℃〜３０℃）又は微温（３０℃〜４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい。（例えば、３７℃等）
そして、前記の静置の時間は、１分間以上、かつ１０分間以下の一定時間であることが好ましく、３分間以上、かつ５分間以下の一定時間であることがより好ましい。(3) After a certain time, a certain amount of the second reagent is added to and mixed with the mixture of the sample and the first reagent, and the mixture is left as a reaction mixture at a constant temperature for a certain time.
As a result, the “anti-periostin antibody-immobilized latex particles” are brought into contact with the sample.
The addition amount of the second reagent may be appropriately selected.
Further, the temperature at the time of standing is preferably a constant temperature in the range of room temperature (1 ° C. to 30 ° C.) or low temperature (30 ° C. to 40 ° C.). (For example, 37 ° C.)
The standing time is preferably a fixed time of 1 minute or more and 10 minutes or less, more preferably a fixed time of 3 minutes or more and 5 minutes or less.
試料と第１試薬との混合液への第２試薬の添加、混合により、ラテックス粒子に固定化した抗ペリオスチン抗体と、試料に含まれていたペリオスチンとの抗原抗体反応を行わせる。 By adding and mixing the second reagent to the mixture of the sample and the first reagent, an antigen-antibody reaction between the anti-periostin antibody immobilized on the latex particles and periostin contained in the sample is performed.
そして、この抗原抗体反応により、「…〔ペリオスチン〕−〔抗ペリオスチン抗体＝ラテックス粒子＝抗ペリオスチン抗体〕−〔ペリオスチン〕−〔抗ペリオスチン抗体＝ラテックス粒子＝抗ペリオスチン抗体〕−〔ペリオスチン〕…」等の架橋が形成され、ペリオスチンを介した、「抗ペリオスチン抗体を固定化したラテックス粒子」同士の複合体凝集物が生成する。 Then, by this antigen-antibody reaction, "... [periostin]-[anti-periostin antibody = latex particles = anti-periostin antibody]-[periostin]-[anti-periostin antibody = latex particles = anti-periostin antibody]-[periostin] ..." Is formed, and a complex aggregate of "latex particles having immobilized anti-periostin antibody" is formed via periostin.
（４） そして、分析装置又は分光光度計等において、反応混合液に光を照射して、生成したラテックス粒子同士の複合体凝集物により生じるシグナルである適当な波長の透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加を測定することにより、生成した前記複合体凝集物の量、すなわち、試料に含まれていたペリオスチンの量を求める。 (4) Then, by irradiating the reaction mixture with light in an analyzer or a spectrophotometer or the like, a decrease in transmitted light intensity (absorbance) of an appropriate wavelength, which is a signal generated by a composite aggregate of the generated latex particles. By measuring the increase in the intensity of scattered light) or the increase in scattered light intensity to determine the amount of the formed complex aggregate, that is, the amount of periostin contained in the sample.
（５） そして、「試料の測定を行って得た測定値〔透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値〕」と、「標準液又は標準血清等の標準物質〔濃度既知のペリオスチンを含む試料〕の測定を行って得た測定値〔透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値〕」とを比較することにより、測定を行った試料に含まれるペリオスチンの量（濃度）の算出を行う。 (5) Then, “a measurement value obtained by measuring the sample [decrease in transmitted light intensity (increase in absorbance) or increase in scattered light intensity]” and “a standard substance such as a standard solution or a standard serum [ Sample containing periostin with a known concentration] and the measured value [decreased transmitted light intensity (increased absorbance) or increased scattered light intensity] The amount (concentration) of periostin contained in is calculated.
〔９〕．試料
本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチンの測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体の安定化方法における試料としては、血液、血清、血漿、尿、***、髄液、唾液、涙液、鼻汁、鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液、糞便、腹水若しくは羊水などの体液；あるいは血管若しくは肝臓などの臓器、組織又は細胞などの抽出液等、ペリオスチンが含まれる可能性のある生体試料等の試料であれば対象となる。[9]. Samples The anti-periostin antibody-immobilized carrier of the present invention, a reagent for measuring periostin, and a sample in the method for stabilizing an anti-periostin antibody-immobilized carrier include blood, serum, plasma, urine, semen, cerebrospinal fluid, saliva, tear fluid, Biological fluids that may contain periostin, such as nasal secretions, nasal washings, alveolar washings, feces, body fluids such as ascites or amniotic fluid; or extracts such as organs such as blood vessels or liver, tissues or cells, etc. If it is targeted.
なお、測定に用いる試料の形態は、液体であることが好ましいので、もし試料が液体でない場合には、抽出処理又は可溶化処理等の処理を既知の方法に従って行い、液体試料としてもよい。 Since the form of the sample used for the measurement is preferably a liquid, if the sample is not a liquid, a process such as an extraction process or a solubilization process may be performed according to a known method to obtain a liquid sample.
また、必要に応じて、試料は濃縮処理を行ってもよい。 If necessary, the sample may be subjected to a concentration treatment.
また、試料は、その測定の前に、希釈液を添加することにより希釈処理を行ってもよい。
例えば、試料を抗ペリオスチン抗体固定化担体と接触させ、結合させる前に、試料に希釈液を添加することにより希釈処理を行ってもよい。
この希釈液として、各種水系溶媒を用いることができる。
例えば、水、生理食塩水又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔Ｔｒｉｓ緩衝液〕、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等の水系溶媒を用いることができる。
なお、この緩衝液のｐＨについては、ｐＨ５〜ｐＨ１０の範囲にあることが好ましい。Further, the sample may be subjected to a dilution treatment by adding a diluent before the measurement.
For example, the sample may be contacted with an anti-periostin antibody-immobilized carrier, and the sample may be diluted by adding a diluent before binding.
Various aqueous solvents can be used as the diluent.
For example, aqueous solvents such as water, physiological saline, or various buffers such as Tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer [Tris buffer], phosphate buffer or phosphate buffered saline can be used.
The pH of the buffer is preferably in the range of pH 5 to pH 10.
また、試料が血液（全血）である場合、この全血試料を、水又は界面活性剤を含有する水系溶媒等の低張液と混合し、赤血球を破裂させる処理を行うことが、その後の測定を支障なく行う上で、好ましい。 When the sample is blood (whole blood), the whole blood sample may be mixed with a hypotonic solution such as water or a water-based solvent containing a surfactant to perform a process of bursting red blood cells. This is preferable for performing the measurement without any trouble.
〔１０〕．測定対象物質
本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチンの測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体の安定化方法における測定対象物質はペリオスチンである。[10]. Substance to be Measured The substance to be measured in the carrier for immobilizing an anti-periostin antibody, the reagent for measuring periostin, and the method for stabilizing a carrier for immobilizing an anti-periostin antibody of the present invention is periostin.
この本発明における測定対象物質としてのペリオスチンとしては、特に限定はなく、ヒト又はウシ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス若しくはラットなどの哺乳動物又はニワトリなどの鳥類等由来のペリオスチン等を挙げることができる。 There is no particular limitation on periostin as the substance to be measured in the present invention, and examples thereof include periostin derived from humans or mammals such as cows, pigs, dogs, cats, mice or rats, and birds such as chickens. .
この測定対象物質としてのペリオスチンとしては、ヒトのペリオスチンが特に好ましい。 As periostin as the substance to be measured, human periostin is particularly preferred.
〔１１〕．抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法
本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法は、抗ペリオスチン抗体を担体に固定化した抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法であって、この担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（１）〜（３）から選択される安定化物質を接触させたことを特徴とするものである。
（１）界面活性剤及び糖
（２）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
（３）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩[11]. Method for Stabilizing Anti-Periostin Antibody in Anti-Periostin Antibody-Immobilized Carrier The method for stabilizing an anti-periostin antibody in an anti-periostin antibody-immobilized carrier according to the present invention employs an anti-periostin antibody-immobilized carrier in which an anti-periostin antibody is immobilized on a carrier. A method for stabilizing a periostin antibody, characterized in that a stabilizing substance selected from the following (1) to (3) is brought into contact with an anti-periostin antibody immobilized on the carrier.
(1) Surfactant and sugar (2) Surfactant and arginine or salt thereof (3) Surfactant, sugar and arginine or salt thereof
本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法は、上記の構成により、抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体を安定化することができるものである。 The method for stabilizing an anti-periostin antibody in a carrier on which an anti-periostin antibody is immobilized according to the present invention is capable of stabilizing an anti-periostin antibody in a carrier on which an anti-periostin antibody is immobilized, by the above configuration.
なお、本発明における抗ペリオスチン抗体、抗ペリオスチン抗体固定化担体、糖、界面活性剤、アルギニン及びその接触方法等の詳細は、前記の通りである。 The details of the anti-periostin antibody, the anti-periostin antibody-immobilized carrier, the saccharide, the surfactant, the arginine and the method of contacting the same in the present invention are as described above.
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
〔実施例１〕（本発明の効果の確認−１）
ヒト血清中のペリオスチンの測定を行い、本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチンの測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法の効果を確かめた。[Example 1] (Confirmation of effect of the present invention-1)
Periostin in human serum was measured to confirm the effects of the anti-periostin antibody-immobilized carrier of the present invention, the reagent for measuring periostin, and the method of stabilizing an anti-periostin antibody on an anti-periostin antibody-immobilized carrier.
１．ペリオスチンの調製
ペリオスチン（ヌクレオチド配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮｕｍｂｅｒＤ１３６６６のヌクレオチド配列、アミノ酸配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮｕｍｂｅｒＢＡＡ０２８３７のアミノ酸配列）にＶ５／Ｈｉｓタグを付加させたリコンビナントペリオスチンタンパク質を昆虫細胞であるＳ２細胞において発現させた上で精製した。1. Preparation of Periostin An insect cell is a recombinant periostin cell which is a recombinant periostin cell obtained by adding a V5 / His tag to periostin (nucleotide sequence: nucleotide sequence of Accession Number D13666 of nucleic acid database GenBank, amino acid sequence: amino acid sequence of Accession Number BAA02837 of nucleic acid database GenBank). And purified.
具体的には、Ｓ２細胞の形質転換体は次のように調製した。
ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）にペリオスチンの上記部分をコードするｃＤＮＡを挿入して、これをｐＭＴ／Ｂｉｐ／ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ−Ｖ５−ＨｉｓＡとした。Specifically, a transformant of S2 cells was prepared as follows.
The cDNA encoding the above-described portion of periostin was inserted into a pMT / Bip / V5-HisA plasmid (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), and this was designated as pMT / Bip / periostin-V5-HisA.
次に、Ｓ２細胞にこのｐＭＴ／Ｂｉｐ／ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ−Ｖ５−ＨｉｓＡ及びハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドであるｐＡｃＨｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を公知の方法で共導入し、形質転換した。 Next, S2 cells were co-transfected with pMT / Bip / periostin-V5-HisA and pAcHygro (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA), which is a plasmid expressing the hygromycin resistance gene, by a known method, followed by transformation.
次に、ハイグロマイシンにより形質転換体を選択し、安定形質転換体を得た。
そして、Ｓ２細胞の形質転換体では、カルボキシ末端にＶ５／Ｈｉｓタグの結合したペリオスチンを発現させた。Next, transformants were selected with hygromycin to obtain stable transformants.
Then, in the S2 cell transformant, periostin having a V5 / His tag bound to the carboxy terminus was expressed.
そして、このＣ末端に６個のヒスチジンが結合したＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の精製は次のように行った。
まず、ペリオスチン遺伝子安定形質転換体Ｓ２細胞の培地に硫酸銅を加えることにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の発現を誘導した。
これにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質は培養上清中に発現分泌された。Then, purification of the S2 recombinant periostin protein having six histidines bonded to the C-terminal was performed as follows.
First, the expression of S2 recombinant periostin protein was induced by adding copper sulfate to the medium of the periostin gene stable transformant S2 cells.
As a result, the S2 recombinant periostin protein was expressed and secreted into the culture supernatant.
次に、この培養上清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕に透析した後、ニッケルレジン（Ｎｉ−ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ、Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ国Ｈｉｌｄｅｎ）と混合して、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をレジンに結合させた。
次に、レジンを洗浄して夾雑物を取り除き、イミダゾール含有緩衝液にてＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質を溶出することにより、ペリオスチンを取得した。
なお、作成したプラスミドのＤＮＡの配列を確認し、組み込まれた配列が目的通りのものであることを確認した。Next, the culture supernatant was washed with phosphate buffered saline (PBS) [137 mM sodium chloride, 2.68 mM potassium chloride, 1.47 mM potassium dihydrogen phosphate, and 8.04 mM disodium hydrogen phosphate. , And then mixed with nickel resin (Ni-NTA Agarose, Qiagen, Hilden, Germany) to bind the S2 recombinant periostin protein to the resin.
Next, the resin was washed to remove impurities, and periostin was obtained by eluting the S2 recombinant periostin protein with an imidazole-containing buffer.
In addition, the sequence of the DNA of the prepared plasmid was confirmed, and it was confirmed that the inserted sequence was as intended.
２．抗ペリオスチンモノクローナル抗体
〔１〕抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製−１回目
以下の手順により、抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製を行った。（１回目）2. Anti-periostin monoclonal antibody [1] Preparation of anti-periostin monoclonal antibody-first round An anti-periostin monoclonal antibody was prepared by the following procedure. (The first)
（１） 前記１で調製したペリオスチン溶液１容量に対して、化学合成アジュバントとしてのＴｉｔｅｒ Ｍａｘ Ｇｏｌｄ（フナコシ社、日本国東京都）を１容量の割合で混合した。 (1) One volume of the periostin solution prepared in 1 above was mixed with 1 volume of Titer Max Gold (Funakoshi, Tokyo, Japan) as a chemically synthesized adjuvant.
（２） 次に、雌ラットの足蹠に免疫原として、１０〜５０μｇの前記のペリオスチン溶液とＴｉｔｅｒ Ｍａｘ Ｇｏｌｄとの混合物を皮下注射し、１０日〜２週間後、再度ラットの足蹠に免疫原として、１０〜５０μｇの前記のペリオスチン溶液とＴｉｔｅｒ Ｍａｘ Ｇｏｌｄとの混合物を皮下注射した。
なお、ここで、ラットは、Ｗｉｓｔａｒラット〔雌、６〜８週齢〕（日本チャールズリバー社、日本国神奈川県横浜市）を用いた。(2) Next, a mixture of 10 to 50 μg of the above periostin solution and Titer Max Gold was injected subcutaneously into the footpad of a female rat as an immunogen, and 10 days to 2 weeks later, the rat footpad was immunized again. As a starting material, a mixture of 10 to 50 μg of the above periostin solution and Titer Max Gold was injected subcutaneously.
Here, Wistar rats [female, 6 to 8 weeks old] (Charles River Japan, Yokohama, Kanagawa, Japan) were used as rats.
（３） 最終免疫より３〜４日後に、免疫したラットの膝窩、鼠径、腸骨リンパ節内の細胞と、ミエローマ細胞（Ｓｐ２／Ｏ細胞）を１対１から１０対１の割合で混合し、一般的な方法でポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００、Ｒｏｃｈｅ社、スイス国）を加えて細胞融合させ、生育したハイブリドーマコロニーを選別した。 (3) Three to four days after the final immunization, cells in the popliteal, inguinal, and iliac lymph nodes of the immunized rat are mixed with myeloma cells (Sp2 / O cells) at a ratio of 1: 1 to 10: 1. Then, polyethylene glycol (PEG 1500, Roche, Switzerland) was added by a general method to cause cell fusion, and the growing hybridoma colonies were selected.
具体的には、細胞融合は次のように行った。
混合した前記リンパ節細胞とミエローマ細胞（Ｓｐ２／Ｏ細胞）を遠心して上清を除き、室温でポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００、Ｒｏｃｈｅ社、スイス国）１ｍＬに１分間かけて懸濁した後、３７℃で１分間撹拌した。
血清不含培地１ｍＬを１分間かけて加え、その後、血清不含培地１０ｍＬを１分間かけて加えた。
細胞を数回洗浄した後、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン含有培地に懸濁して９６穴マイクロタイタープレートに分注して、３７℃において５％ＣＯ２存在下で培養した。Specifically, cell fusion was performed as follows.
The mixed lymph node cells and myeloma cells (Sp2 / O cells) were centrifuged to remove the supernatant, suspended in 1 mL of polyethylene glycol (PEG 1500, Roche, Switzerland) for 1 minute at room temperature, and then suspended at 37 ° C. Stir for 1 minute.
1 mL of serum-free medium was added over 1 minute, and then 10 mL of serum-free medium was added over 1 minute.
After washing the cells several times, the cells were suspended in a medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine, dispensed into a 96-well microtiter plate, and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 .
生育したモノクローナル抗体産生細胞株（融合細胞株）の選別の方法としては、細胞融合から７〜１４日後、免疫原に使用した前記のペリオスチンを固定化し、融合細胞培養上清を一次抗体としたＥＬＩＳＡ法の系にて行った。 As a method for selecting the grown monoclonal antibody-producing cell line (fused cell line), 7 to 14 days after cell fusion, the above-described periostin used as an immunogen was immobilized, and an ELISA using the fused cell culture supernatant as a primary antibody was used. It was performed in the system of the method.
このＥＬＩＳＡ法は具体的には、次のように行った。
１μｇ／ｍＬの前記のペリオスチンを９６穴マイクロタイタープレートに分注し、数時間固定化させた。
この固定化溶液を洗浄した後、融合細胞培養上清を各ウェルに加え、１時間室温にて静置した。Specifically, this ELISA method was performed as follows.
1 μg / mL of the above periostin was dispensed into a 96-well microtiter plate and immobilized for several hours.
After washing the immobilization solution, the culture supernatant of the fused cells was added to each well, and left at room temperature for 1 hour.
融合細胞培養上清を洗浄して、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、英国）を加え１時間室温に静置した。 The culture supernatant of the fused cells was washed, and a peroxidase-labeled goat anti-rat IgG antibody (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) was added as a secondary antibody, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour.
この二次抗体を洗浄後、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ社、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、米国）を加えて発色させ、４０５ｎｍの吸光度を測定した。 After washing the secondary antibody, an ABTS peroxidase substrate (KPL, Gaithersburg, MD, USA) was added for color development, and the absorbance at 405 nm was measured.
生育した融合細胞株の中から一つのクローンを確立し、ＳＳ１８Ａ株と命名した。 One clone was established from the grown fusion cell lines and named SS18A strain.
（４） この選別したモノクローナル抗体産生細胞株からＩｇＧを次のように精製した。
このモノクローナル抗体産生細胞株を、ＧＩＴ培地（日本製薬社、日本国東京都）を用いてＣＯ２インキュベータ内３７℃で培養した。(4) IgG was purified from the selected monoclonal antibody producing cell line as follows.
This monoclonal antibody-producing cell line was cultured at 37 ° C. in a CO 2 incubator using GIT medium (Nihon Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan).
培養後、上清中のＩｇＧをプロテインＧカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、英国）に結合させた。
結合させたＩｇＧを、５０ｍＭクエン酸水溶液（ｐＨ２．６）で溶出した。After the culture, the IgG in the supernatant was bound to a protein G column (GE Healthcare, Little Chalfont, UK).
The bound IgG was eluted with a 50 mM aqueous citric acid solution (pH 2.6).
溶出液４容量に対して、１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔Ｔｒｉｓ緩衝液〕１容量を添加し、精製ＩｇＧとして、ラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体を前記のモノクローナル抗体産生細胞株より取得した。 One volume of 1 M Tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer [Tris buffer] was added to 4 volumes of the eluate, and rat anti-periostin monoclonal antibody was obtained from the above-mentioned monoclonal antibody producing cell line as purified IgG.
すなわち、ＳＳ１８Ａ株のモノクローナル抗体産生細胞株からラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体（以下、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」という）を得ることができた。 That is, rat anti-periostin monoclonal antibody (hereinafter referred to as “anti-periostin monoclonal antibody (SS18A)”) could be obtained from the monoclonal antibody-producing cell line of SS18A strain.
〔２〕抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製−２回目
前記〔１〕とは別の時に、前記〔１〕の（１）〜（４）の記載の通りに操作を行い、再度、抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製を行った。（２回目）[2] Preparation of anti-periostin monoclonal antibody-Second time At a different time from [1], the operation is performed as described in (1) to (4) of [1], and again, Preparation was performed. (The second)
その結果、生育した融合細胞株の中から一つのクローンを確立し、ＳＳ１７Ｂ株と命名した。 As a result, one clone was established from the grown fusion cell lines and named SS17B strain.
そして、ＳＳ１７Ｂ株のモノクローナル抗体産生細胞株からラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体（以下、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１７Ｂ）」という）を得ることができた。 Then, a rat anti-periostin monoclonal antibody (hereinafter referred to as “anti-periostin monoclonal antibody (SS17B)”) was obtained from the SS17B monoclonal antibody-producing cell line.
３．試料
５種類のヒトの血清試料を各々試料として用いた。
これらをそれぞれ、血清１、血清２、血清３、血清４及び血清５とした。3. Samples Five types of human serum samples were used as samples.
These were designated as serum 1, serum 2, serum 3, serum 4 and serum 5, respectively.
４．測定試薬
〔１〕抗体固定化担体試薬
５種類の抗体固定化担体試薬を、下記の通り調製した。
［１］抗体固定化担体試薬（対照１）
（１） 前記２の〔１〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これを９６穴マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ社、イリノイ州、米国）の各ウェルに１００μＬずつ注入した後、２５℃で１８〜２４時間静置し、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固相化した。4. Measurement reagents [1] Antibody-immobilized carrier reagent Five kinds of antibody-immobilized carrier reagents were prepared as follows.
[1] Antibody-immobilized carrier reagent (Control 1)
(1) The anti-periostin monoclonal antibody (SS18A) of [2] was used in phosphate buffered saline (PBS) [137 mM sodium chloride, 2.68 mM potassium chloride, 1.47 mM diphosphate. 2 μg / mL with an aqueous solution (pH 7.4) containing potassium hydrogen and 8.04 mM disodium hydrogen phosphate, and dilute it to a 96-well microtiter plate (Thermo Fisher Scientific Inc, Illinois) , USA), the mixture was allowed to stand at 25 ° C for 18 to 24 hours, and “anti-periostin monoclonal antibody (SS18A)” was immobilized on each well of this microtiter plate.
（２） 次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルに、ブロッキング液〔０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕を各ウェルに２００μＬ注入し、４℃で１８〜２４時間静置した。 (2) Next, a blocking solution [0.5% (w / v) casein, 100 mM sodium chloride, and 0.1% (w / v)] was added to each well of the microtiter plate of (1). 200 μL of 50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer [Tris buffer] (pH 8.0) containing sodium azide was injected into each well, and left still at 4 ° C. for 18 to 24 hours.
（３） 次に、前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルを０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で３回洗浄した後、この液を吸い出し、除去し、その後真空乾燥して、抗体固定化担体試薬（対照１）を調製した。 (3) Next, each well of the microtiter plate of the above (2) was subjected to phosphate buffer containing 0.05% (w / v) of polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20]. After washing with physiological saline [PBS] three times, this solution was sucked out, removed, and then dried under vacuum to prepare an antibody-immobilized carrier reagent (Control 1).
［２］抗体固定化担体試薬（対照２）
（１） 前記２の〔１〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これを９６穴マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ社、イリノイ州、米国）の各ウェルに１００μＬずつ注入した後、２５℃で１８〜２４時間静置し、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固相化した。[2] Antibody-immobilized carrier reagent (Control 2)
(1) The anti-periostin monoclonal antibody (SS18A) of [2] was used in phosphate buffered saline (PBS) [137 mM sodium chloride, 2.68 mM potassium chloride, 1.47 mM diphosphate. 2 μg / mL with an aqueous solution (pH 7.4) containing potassium hydrogen and 8.04 mM disodium hydrogen phosphate, and dilute it to a 96-well microtiter plate (Thermo Fisher Scientific Inc, Illinois) , USA), the mixture was allowed to stand at 25 ° C for 18 to 24 hours, and “anti-periostin monoclonal antibody (SS18A)” was immobilized on each well of this microtiter plate.
（２） 次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルに、ブロッキング液〔０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕を各ウェルに２００μＬ注入し、４℃で１８〜２４時間静置した。 (2) Next, a blocking solution [0.5% (w / v) casein, 100 mM sodium chloride, and 0.1% (w / v)] was added to each well of the microtiter plate of (1). 200 μL of 50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer [Tris buffer] (pH 8.0) containing sodium azide was injected into each well, and left still at 4 ° C. for 18 to 24 hours.
（３） 次に、前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルよりブロッキング液を吸い出し、除去した。 (3) Next, the blocking solution was sucked out from each well of the microtiter plate of (2) and removed.
（４） 次に、前記（３）のマイクロタイタープレートの各ウェルに０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］の３００μＬを注入し、４℃で１８〜２４時間静置した。 (4) Next, phosphate buffer containing 0.05% (w / v) polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20] in each well of the microtiter plate of (3). 300 μL of physiological saline [PBS] was injected, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 18 to 24 hours.
（５） 次に、前記（４）のマイクロタイタープレートの各ウェル中の溶液を吸い出し、除去し、その後真空乾燥して、抗体固定化担体試薬（対照２）を調製した。 (5) Next, the solution in each well of the microtiter plate of (4) was sucked out, removed, and then dried under vacuum to prepare an antibody-immobilized carrier reagent (Control 2).
［３］抗体固定化担体試薬（本発明１）
前記［２］の（４）における０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を、０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］及び１０％（ｗ／ｖ）のスクロースを含有する１００ｍＭリン酸緩衝液に替えること以外は、前記［２］の（１）〜（５）の通りに操作を行い、抗体固定化担体試薬（本発明１）を調製した。[3] Antibody-immobilized carrier reagent (Invention 1)
The 0.05% (w / v) polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20] in the above (2) (4) was replaced with 0.05% (w / v) polyoxyethylene. (20) Except for changing to 100 mM phosphate buffer containing sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20] and 10% (w / v) sucrose, The operation was performed as described above to prepare an antibody-immobilized carrier reagent (the present invention 1).
［４］抗体固定化担体試薬（本発明２）
前記［２］の（４）における０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を、０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］及び５００ｍＭのアルギニン塩酸塩を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液に替えること以外は、前記［２］の（１）〜（５）の通りに操作を行い、抗体固定化担体試薬（本発明２）を調製した。[4] Antibody-immobilized carrier reagent (Invention 2)
The 0.05% (w / v) polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20] in the above (2) (4) was replaced with 0.05% (w / v) polyoxyethylene. (20) Except for changing to 100 mM phosphate buffer containing sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20] and 500 mM arginine hydrochloride, the operation was performed as in (1) to (5) of [2]. As a result, an antibody-immobilized carrier reagent (the present invention 2) was prepared.
［５］抗体固定化担体試薬（本発明３）
前記［２］の（４）における０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を、０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース及び５００ｍＭのアルギニン塩酸塩を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液に替えること以外は、前記［２］の（１）〜（５）の通りに操作を行い、抗体固定化担体試薬（本発明３）を調製した。[5] Antibody-immobilized carrier reagent (the present invention 3)
The 0.05% (w / v) polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20] in the above (2) (4) was replaced with 0.05% (w / v) polyoxyethylene. (20) Sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20] (1) of the above-mentioned [2] except that the buffer was replaced with a 100 mM phosphate buffer containing 10% (w / v) sucrose and 500 mM arginine hydrochloride. ) To (5) to prepare an antibody-immobilized carrier reagent (the present invention 3).
〔２〕標識抗体試薬
前記２の〔２〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１７Ｂ）」にパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）を公知の方法により結合させてＰＯＤ標識抗ペリオスチンモノクローナル抗体を調製した。
これを標識抗体試薬とした。[2] Labeled Antibody Reagent A POD-labeled anti-periostin monoclonal antibody was prepared by binding peroxidase (POD) to the “anti-periostin monoclonal antibody (SS17B)” of 2) above by a known method.
This was used as a labeled antibody reagent.
５．抗体固定化担体試薬の保存
〔１〕２〜８℃保存
前記４の〔１〕の［１］〜［５］のそれぞれの抗体固定化担体試薬について２〜８℃で１週間保存した。
〔２〕３７℃保存
前記４の〔１〕の［１］〜［５］のそれぞれの抗体固定化担体試薬について３７℃で１週間保存した。5. Storage of antibody-immobilized carrier reagent [1] Storage at 2 to 8 ° C Each antibody-immobilized carrier reagent of the above [4] [1] [1] to [5] was stored at 2 to 8 ° C for one week.
[2] Storage at 37 ° C. Each of the antibody-immobilized carrier reagents of the above [1] [1] to [5] was stored at 37 ° C. for one week.
６．測定
（１） 前記３の試料それぞれについて、その１００μＬを前記５の〔１〕の２〜８℃で１週間保存した各々の抗体固定化担体試薬のマイクロタイタープレートのウェルに注入し、２５℃にて１８〜２４時間静置し、反応を行わせた。
これにより、試料に含まれるペリオスチンを、前記のウェルに固定化した「抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）」に結合させた。6. Measurement (1) For each of the three samples, 100 μL thereof was injected into the well of the microtiter plate of each antibody-immobilized carrier reagent stored in the above [1] at 2 to 8 ° C. for one week, and then cooled to 25 ° C. For 18 to 24 hours.
This allowed the periostin contained in the sample to bind to the “anti-periostin antibody (SS18A)” immobilized in the well.
（２） 次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルを０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で５回洗浄した。 (2) Next, each well of the microtiter plate of the above (1) was subjected to phosphate buffered saline [PBS] containing 0.05% of polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20]. ] For 5 times.
（３） 前記４の〔２〕の標識抗体試薬を、０．５％のカゼイン及び１００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）で５０ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、その１００μＬを前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルに注入し、２５℃にて９０分間静置し、反応を行わせた。 (3) The labeled antibody reagent of [4] above was used as a 50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer [Tris buffer] (pH 8.0) containing 0.5% casein and 100 mM sodium chloride. Then, 100 μL of the solution was injected into each well of the microtiter plate described in (2) above, and allowed to stand at 25 ° C. for 90 minutes to perform a reaction.
これにより、前記の固定化した「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」に結合しているペリオスチンに、ＰＯＤを標識した「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１７Ｂ）」を結合させた。 Thus, the POD-labeled “anti-periostin monoclonal antibody (SS17B)” was bound to the periostin bound to the immobilized “anti-periostin monoclonal antibody (SS18A)”.
（４） 次に、前記（３）のマイクロタイタープレートの各ウェルを０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で５回洗浄した。 (4) Next, each well of the microtiter plate of the above (3) was subjected to phosphate buffered saline [PBS containing 0.05% polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20]. ] For 5 times.
（５） 次に、ＰＯＤの基質液〔０．８ｍＭの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、２．５ｍＭの過酸化水素、及び３０ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．９）〕の１００μＬを前記（４）のマイクロタイタープレートの各ウェルに注入し、２５℃にて１０分間静置し、反応を行わせ、発色させた。 (5) Next, a POD substrate solution [containing 0.8 mM 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMBZ), 2.5 mM hydrogen peroxide, and 30 mM disodium hydrogen phosphate Of a 20 mM citrate buffer solution (pH 3.9) was added to each well of the microtiter plate described in (4), and the mixture was allowed to stand at 25 ° C. for 10 minutes to allow the reaction to proceed to develop color.
（６） その後、前記（５）のマイクロタイタープレートの各ウェルに０．７Ｎの硫酸を注入し、この反応を停止させた。 (6) Thereafter, 0.7 N sulfuric acid was injected into each well of the microtiter plate of (5) to stop the reaction.
（７） 次に、分光光度計を用いて、前記（６）のマイクロタイタープレートの各ウェルについて、４５０ｎｍ（主波長）及び５５０ｎｍ（副波長）それぞれにおける吸光度の測定を行った。
そして、測定した４５０ｎｍ（主波長）における吸光度から５５０ｎｍ（副波長）における吸光度を差し引いた吸光度差の値を求めた。(7) Next, the absorbance of each well of the microtiter plate of (6) was measured at 450 nm (main wavelength) and 550 nm (sub wavelength) using a spectrophotometer.
Then, the value of the absorbance difference obtained by subtracting the absorbance at 550 nm (sub-wavelength) from the measured absorbance at 450 nm (main wavelength) was obtained.
なお、この吸光度差の値は、試料に含まれていたペリオスチンの濃度に基づくものである。 The value of the absorbance difference is based on the concentration of periostin contained in the sample.
（８） 前記１で調製したペリオスチンを試料希釈液〔０．５％のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕で希釈して、ペリオスチンの希釈系列を作成し、これらを標準試料とした。 (8) Using periostin prepared in 1 above as a sample diluent [50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer containing 0.5% casein, 100 mM sodium chloride, and 0.1% sodium azide] [Tris buffer] (pH 8.0)] to prepare a dilution series of periostin, which was used as a standard sample.
次に、これらの標準試料のそれぞれについて、前記（１）〜（７）の記載の通りに測定を行い、前記の抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）における「ペリオスチン濃度−吸光度差」の標準曲線（検量線）を作成した。 Next, the measurement of each of these standard samples was performed as described in (1) to (7) above, and the “periostin concentration−” in the enzyme immunoassay (ELISA) using the anti-periostin monoclonal antibody described above. A standard curve (calibration curve) of "absorbance difference" was created.
（９） 前記（７）において測定したマイクロタイタープレートの各ウェルの吸光度差の値を、前記（８）で作成した「ペリオスチン濃度−吸光度差」の標準曲線（検量線）に当てはめ、各試料に含まれていたペリオスチンの濃度を求めた。 (9) The value of the absorbance difference of each well of the microtiter plate measured in (7) is applied to the standard curve (calibration curve) of “periostin concentration-absorbance difference” created in (8), and The concentration of periostin contained was determined.
（１０） また、前記（１）における「２〜８℃で１週間保存した各々の抗体固定化担体試薬のマイクロタイタープレート」に替えて、前記５の〔２〕の「３７℃で１週間保存した各々の抗体固定化担体試薬のマイクロタイタープレート」を用いること以外は、前記（１）〜（９）の記載の通りに操作を行い、各試料に含まれていたペリオスチンの濃度を求めた。 (10) Also, in place of the “microtiter plate of each antibody-immobilized carrier reagent stored at 2 to 8 ° C. for 1 week” in (1), “5. The operations were performed as described in (1) to (9) above, except that the above-described microtiter plate of each antibody-immobilized carrier reagent was used, and the concentration of periostin contained in each sample was determined.
７．測定結果
前記６における試料に含まれていたペリオスチンの測定結果を表１に示した。7. Measurement Results Table 1 shows the measurement results of periostin contained in the sample in the above 6.
この表において、左側より、２〜８℃で保存した抗体固定化担体試薬を使用した場合のペリオスチン測定値（ｎｇ／ｍＬ）、３７℃で保存した抗体固定化担体試薬を使用した場合のペリオスチン測定値（ｎｇ／ｍＬ）、そして、「３７℃で保存した抗体固定化担体試薬を使用した場合のペリオスチン測定値」を「２〜８℃で保存した抗体固定化担体試薬を使用した場合のペリオスチン測定値」で除したときの百分率（％）［以下、「３７℃／２〜８℃比率」という］をそれぞれ示す。 In this table, from the left side, the measured value of periostin (ng / mL) when the antibody-immobilized carrier reagent stored at 2 to 8 ° C was used, and the measurement of periostin when the antibody-immobilized carrier reagent stored at 37 ° C was used Value (ng / mL) and "Periostin measurement value when using antibody-immobilized carrier reagent stored at 37 ° C" was changed to "Periostin measurement when using antibody-immobilized carrier reagent stored at 2 to 8 ° C" Values (%) [hereinafter referred to as “37 ° C./2 to 8 ° C. ratio”].
８．考察
本実施例の測定結果である、表１の「３７℃／２〜８℃比率」より、次のことが分かる。8. Consideration The following can be seen from the “results of 37 ° C./2 to 8 ° C.” in Table 1, which are the measurement results of this example.
（１） 抗体固定化担体試薬（対照１）の使用時に比べて、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤を接触させた抗体固定化担体試薬（対照２）の使用時は、「３７℃／２〜８℃比率」は下がっている。 (1) Compared with the use of the antibody-immobilized carrier reagent (Control 1), the use of the antibody-immobilized carrier reagent (Control 2) in which a surfactant was contacted with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier resulted in “37 "C / 2 to 8C ratio" has been lowered.
（２） 抗体固定化担体試薬（対照１）の使用時に比べて、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤及び糖を接触させた抗体固定化担体試薬（本発明１）の使用時は、「３７℃／２〜８℃比率」は大幅に上がっている。 (2) Compared with the use of the antibody-immobilized carrier reagent (Control 1), the antibody-immobilized carrier reagent (the present invention 1) in which a surfactant and a saccharide were contacted with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier was , The “37 ° C./2 to 8 ° C. ratio” has greatly increased.
（３） 抗体固定化担体試薬（対照１）の使用時に比べて、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤及びアルギニン塩酸塩を接触させた抗体固定化担体試薬（本発明２）の使用時は、「３７℃／２〜８℃比率」は大幅に上がっている。 (3) Use of the antibody-immobilized carrier reagent (the present invention 2) in which a surfactant and arginine hydrochloride were brought into contact with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier, as compared with the use of the antibody-immobilized carrier reagent (Control 1). At that time, the “37 ° C./2 to 8 ° C. ratio” has risen significantly.
（４） 抗体固定化担体試薬（対照１）の使用時に比べて、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤、糖及びアルギニン塩酸塩を接触させた抗体固定化担体試薬（本発明３）の使用時は、「３７℃／２〜８℃比率」は大幅に上がっている。 (4) An antibody-immobilized carrier reagent obtained by contacting a surfactant, sugar and arginine hydrochloride with an anti-periostin antibody immobilized on a carrier as compared with the use of an antibody-immobilized carrier reagent (Control 1) (the present invention 3) At the time of use, the “37 ° C./2 to 8 ° C. ratio” is greatly increased.
以上のことより、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤及び糖を接触させた場合、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤及びアルギニン塩酸塩を接触させた場合、並びに担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤、糖及びアルギニン塩酸塩を接触させた場合は、抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体が安定化されることが確かめられた。 From the above, when the surfactant and saccharide are brought into contact with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier, when the surfactant and arginine hydrochloride are brought into contact with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier, and on the carrier. It was confirmed that when a surfactant, sugar and arginine hydrochloride were brought into contact with the immobilized anti-periostin antibody, the anti-periostin antibody in the anti-periostin antibody-immobilized carrier was stabilized.
〔実施例２〕（本発明の効果の確認−２）
ヒト血清中のペリオスチンの測定を行い、本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチンの測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法の効果を再度確かめた。[Example 2] (Confirmation of effect of the present invention-2)
Periostin in human serum was measured to confirm again the effects of the anti-periostin antibody-immobilized carrier of the present invention, the reagent for measuring periostin, and the method of stabilizing an anti-periostin antibody on an anti-periostin antibody-immobilized carrier.
１．試料
１種類のヒトの血清試料を試料として用いた。1. Sample One human serum sample was used as a sample.
２．測定試薬
〔１〕抗体固定化担体試薬
２種類の抗体固定化担体試薬を、下記の通り調製した。
［１］抗体固定化担体試薬（対照）
（１） 前記実施例１の２の〔１〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これを９６穴マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ社、イリノイ州、米国）の各ウェルに１００μＬずつ注入した後、２５℃で１８〜２４時間静置し、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固定化した。2. Assay Reagent [1] Antibody-immobilized carrier reagent Two types of antibody-immobilized carrier reagents were prepared as follows.
[1] Antibody-immobilized carrier reagent (control)
(1) The anti-periostin monoclonal antibody (SS18A) of [1] of Example 1 was used in phosphate buffered saline (PBS) [137 mM sodium chloride, 2.68 mM potassium chloride, 1.47 mM] Aqueous solution (pH 7.4) containing potassium dihydrogen phosphate and 8.04 mM disodium hydrogen phosphate] at a concentration of 2 μg / mL, and this was diluted to a 96-well microtiter plate (Thermo Fisher Scientific Inc.). (Illinois, U.S.A.), 100 μL was injected into each well and allowed to stand at 25 ° C. for 18 to 24 hours to immobilize “anti-periostin monoclonal antibody (SS18A)” in each well of this microtiter plate.
（２） 次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルに、ブロッキング液〔０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕を各ウェルに２００μＬ注入し、４℃で１８〜２４時間静置した。 (2) Next, a blocking solution [0.5% (w / v) casein, 100 mM sodium chloride, and 0.1% (w / v)] was added to each well of the microtiter plate of (1). 200 μL of 50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer [Tris buffer] (pH 8.0) containing sodium azide was injected into each well, and left still at 4 ° C. for 18 to 24 hours.
（３） 次に、前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルを０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で３回洗浄した後、この液を吸い出し、除去し、その後真空乾燥して、抗体固定化担体試薬（対照）を調製した。 (3) Next, each well of the microtiter plate of the above (2) was subjected to phosphate buffer containing 0.05% (w / v) of polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20]. After washing with physiological saline [PBS] three times, this solution was sucked out, removed, and then dried under vacuum to prepare an antibody-immobilized carrier reagent (control).
［２］抗体固定化担体試薬（本発明）
（１） 前記実施例１の２の〔１〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これを９６穴マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ社、イリノイ州、米国）の各ウェルに１００μＬずつ注入した後、２５℃で１８〜２４時間静置し、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固相化した。[2] Antibody-immobilized carrier reagent (the present invention)
(1) The anti-periostin monoclonal antibody (SS18A) of [1] of Example 1 was used in phosphate buffered saline (PBS) [137 mM sodium chloride, 2.68 mM potassium chloride, 1.47 mM] Aqueous solution (pH 7.4) containing potassium dihydrogen phosphate and 8.04 mM disodium hydrogen phosphate] at a concentration of 2 μg / mL, and this was diluted to a 96-well microtiter plate (Thermo Fisher Scientific Inc.). (Illinois, U.S.A.), 100 μL each, and allowed to stand at 25 ° C. for 18 to 24 hours to immobilize “anti-periostin monoclonal antibody (SS18A)” on each well of this microtiter plate. .
（２） 次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルに、ブロッキング液〔０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕を各ウェルに２００μＬ注入し、４℃で１８〜２４時間静置した。 (2) Next, a blocking solution [0.5% (w / v) casein, 100 mM sodium chloride, and 0.1% (w / v)] was added to each well of the microtiter plate of (1). 200 μL of 50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer [Tris buffer] (pH 8.0) containing sodium azide was injected into each well, and left still at 4 ° C. for 18 to 24 hours.
（３） 次に、前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルよりブロッキング液を吸い出し、除去した。 (3) Next, the blocking solution was sucked out from each well of the microtiter plate of (2) and removed.
（４） 次に、前記（３）のマイクロタイタープレートの各ウェルに０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース及び５００ｍＭのアルギニン塩酸塩を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液の３００μＬを注入し、４℃で１８〜２４時間静置した。 (4) Next, 0.05% (w / v) of polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20], 10% (w / v) was added to each well of the microtiter plate of (3). 300 μL of 100 mM phosphate buffer containing sucrose and 500 mM arginine hydrochloride in v) was injected and allowed to stand at 4 ° C. for 18 to 24 hours.
（５） 次に、前記（４）のマイクロタイタープレートの各ウェル中の溶液を吸い出し、除去し、その後真空乾燥して、抗体固定化担体試薬（本発明）を調製した。 (5) Next, the solution in each well of the microtiter plate of (4) was sucked out, removed, and then dried under vacuum to prepare an antibody-immobilized carrier reagent (the present invention).
〔２〕標識抗体試薬
前記実施例１の２の〔２〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１７Ｂ）」にパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）を公知の方法により結合させてＰＯＤ標識抗ペリオスチンモノクローナル抗体を調製した。
これを標識抗体試薬とした。[2] Labeled antibody reagent Peroxidase (POD) was bound to "anti-periostin monoclonal antibody (SS17B)" of [2] of Example 1 by a known method to prepare a POD-labeled anti-periostin monoclonal antibody.
This was used as a labeled antibody reagent.
３．抗体固定化担体試薬の保存
前記２の〔１〕の［１］及び［２］のそれぞれの抗体固定化担体試薬について５℃で１２０日間保存した。3. Storage of Antibody-Immobilized Carrier Reagent The respective antibody-immobilized carrier reagents of [2] [1] and [2] were stored at 5 ° C. for 120 days.
４．測定
前記２の〔１〕の［１］の抗体固定化担体試薬（対照）については、５℃保存１９日目に以下の測定を行った。
また、前記２の〔１〕の［２］の抗体固定化担体試薬（本発明）については、５℃保存１９日目、７７日目及び１２０日目にそれぞれ以下の測定を行った。4. Measurement The following measurement was performed on the 19th day of storage at 5 ° C. for the antibody-immobilized carrier reagent (control) of [1] [2].
For the antibody-immobilized carrier reagent (2) [1] [2] (the present invention), the following measurements were performed on the 19th, 77th, and 120th days at 5 ° C storage.
（１） 前記１の試料について、その１００μＬを前記２の〔１〕の［１］の抗体固定化担体試薬（対照）のマイクロタイタープレートのウェルに注入し、２５℃にて１８〜２４時間静置し、反応を行わせた。
これにより、試料に含まれるペリオスチンを、前記のウェルに固定化した「抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）」に結合させた。(1) With respect to the sample (1), 100 μL of the sample was injected into a well of a microtiter plate containing the antibody-immobilized carrier reagent (control) of item (1) of [2] and left at 25 ° C. for 18 to 24 hours. To allow the reaction to take place.
This allowed the periostin contained in the sample to bind to the “anti-periostin antibody (SS18A)” immobilized in the well.
（２） 次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルを０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で５回洗浄した。 (2) Next, each well of the microtiter plate of the above (1) was subjected to phosphate buffered saline [PBS] containing 0.05% of polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20]. ] For 5 times.
（３） 前記２の〔２〕の標識抗体試薬を、０．５％のカゼイン及び１００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）で５０ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、その１００μＬを前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルに注入し、２５℃にて９０分間静置し、反応を行わせた。 (3) The labeled antibody reagent of the above [2] was used as a 50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer [Tris buffer] (pH 8.0) containing 0.5% casein and 100 mM sodium chloride. Then, 100 μL of the solution was injected into each well of the microtiter plate described in (2) above, and allowed to stand at 25 ° C. for 90 minutes to perform a reaction.
これにより、前記の固定化した「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」に結合しているペリオスチンに、ＰＯＤを標識した「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１７Ｂ）」を結合させた。 Thus, the POD-labeled “anti-periostin monoclonal antibody (SS17B)” was bound to the periostin bound to the immobilized “anti-periostin monoclonal antibody (SS18A)”.
（４） 次に、前記（３）のマイクロタイタープレートの各ウェルを０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で５回洗浄した。 (4) Next, each well of the microtiter plate of the above (3) was subjected to phosphate buffered saline [PBS containing 0.05% polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20]. ] For 5 times.
（５） 次に、ＰＯＤの基質液〔０．８ｍＭの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、２．５ｍＭの過酸化水素、及び３０ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．９）〕の１００μＬを前記（４）のマイクロタイタープレートの各ウェルに注入し、２５℃にて１０分間静置し、反応を行わせ、発色させた。 (5) Next, a POD substrate solution [containing 0.8 mM 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMBZ), 2.5 mM hydrogen peroxide, and 30 mM disodium hydrogen phosphate Of a 20 mM citrate buffer solution (pH 3.9) was added to each well of the microtiter plate described in (4), and the mixture was allowed to stand at 25 ° C. for 10 minutes to allow the reaction to proceed to develop color.
（６） その後、前記（５）のマイクロタイタープレートの各ウェルに０．７Ｎの硫酸を注入し、この反応を停止させた。 (6) Thereafter, 0.7 N sulfuric acid was injected into each well of the microtiter plate of (5) to stop the reaction.
（７） 次に、分光光度計を用いて、前記（６）のマイクロタイタープレートの各ウェルについて、４５０ｎｍ（主波長）及び５５０ｎｍ（副波長）それぞれにおける吸光度の測定を行った。
そして、測定した４５０ｎｍ（主波長）における吸光度から５５０ｎｍ（副波長）における吸光度を差し引いた吸光度差の値を求めた。(7) Next, the absorbance of each well of the microtiter plate of (6) was measured at 450 nm (main wavelength) and 550 nm (sub wavelength) using a spectrophotometer.
Then, the value of the absorbance difference obtained by subtracting the absorbance at 550 nm (sub-wavelength) from the measured absorbance at 450 nm (main wavelength) was obtained.
なお、この吸光度差の値は、試料に含まれていたペリオスチンの濃度に基づくものである。 The value of the absorbance difference is based on the concentration of periostin contained in the sample.
（８） 前記実施例１の１で調製したペリオスチンを試料希釈液〔０．５％のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕で希釈して、ペリオスチンの希釈系列を作成し、これらを標準試料とした。 (8) The periostin prepared in Example 1-1 was used as a sample diluent [50 mM tris (hydroxymethyl) amino acid containing 0.5% casein, 100 mM sodium chloride, and 0.1% sodium azide. It was diluted with methane buffer [Tris buffer] (pH 8.0)] to prepare a dilution series of periostin, which was used as a standard sample.
次に、これらの標準試料のそれぞれについて、前記（１）〜（７）の記載の通りに測定を行い、前記の抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）における「ペリオスチン濃度−吸光度差」の標準曲線（検量線）を作成した。 Next, the measurement of each of these standard samples was performed as described in (1) to (7) above, and the “periostin concentration−” in the enzyme immunoassay (ELISA) using the anti-periostin monoclonal antibody described above. A standard curve (calibration curve) of "absorbance difference" was created.
（９） 前記（７）において測定したマイクロタイタープレートの各ウェルの吸光度差の値を、前記（８）で作成した「ペリオスチン濃度−吸光度差」の標準曲線（検量線）に当てはめ、各試料に含まれていたペリオスチンの濃度を求めた。 (9) The value of the absorbance difference of each well of the microtiter plate measured in (7) is applied to the standard curve (calibration curve) of “periostin concentration-absorbance difference” created in (8), and The concentration of periostin contained was determined.
（１０） また、前記（１）における「抗体固定化担体試薬（対照）のマイクロタイタープレート」に替えて、前記２の〔１〕の［２］の「抗体固定化担体試薬（本発明）のマイクロタイタープレート」を用いること以外は、前記（１）〜（９）の記載の通りに操作を行い、試料に含まれていたペリオスチンの濃度を求めた。 (10) Further, instead of the “microtiter plate of the antibody-immobilized carrier reagent (control)” in the above (1), the “2. Except for using the “microtiter plate”, the operation was performed as described in the above (1) to (9), and the concentration of periostin contained in the sample was determined.
５．測定結果
前記４における試料に含まれていたペリオスチンの測定結果を表２に示した。5. Measurement results Table 2 shows the measurement results of periostin contained in the sample in 4 above.
なお、この表において、（カッコ）内の数値は、５℃保存後のペリオスチン測定値を保存開始時のペリオスチン測定値で除したときの百分率（％）をそれぞれ示す。 In this table, the values in parentheses indicate percentages (%) when the measured value of periostin after storage at 5 ° C. was divided by the measured value of periostin at the start of storage.
６．考察
この表より、「抗体固定化担体試薬（本発明）のマイクロタイタープレート」を用いる本発明の場合は、５℃保存１２０日目迄、ペリオスチンの測定値に変化がないことが分かる。6. Discussion From this table, it can be seen that in the case of the present invention using the “microtiter plate of the antibody-immobilized carrier reagent (the present invention)”, the measured value of periostin does not change until 120 days of storage at 5 ° C.
これに対して、「抗体固定化担体試薬（対照）のマイクロタイタープレート」を用いる対照の場合は、５℃保存１９日目で、ペリオスチンの測定値が大幅に低下してしまっていることが分かる。 On the other hand, in the case of the control using the “microtiter plate of the antibody-immobilized carrier reagent (control)”, the measured value of periostin significantly decreased on the 19th day of storage at 5 ° C. .
以上のことより、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤、糖及びアルギニンを接触させた場合は、抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体が安定化されることが再度確かめられた。 From the above, it was again confirmed that when the surfactant, sugar and arginine were brought into contact with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier, the anti-periostin antibody in the carrier with the anti-periostin antibody immobilized was stabilized.
〔実施例３〕（本発明の効果の確認−３）
ヒト血清中のペリオスチンの測定を行い、本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチンの測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法の効果を再度確かめた。[Example 3] (Confirmation of effect of the present invention-3)
Periostin in human serum was measured to confirm again the effects of the anti-periostin antibody-immobilized carrier of the present invention, the reagent for measuring periostin, and the method of stabilizing an anti-periostin antibody on an anti-periostin antibody-immobilized carrier.
１．抗ペリオスチンモノクローナル抗体
〔１〕抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製−３回目
前記実施例１の２とは別の時に、前記実施例１の２の〔１〕の（１）〜（４）の記載の通りに操作を行い、再度、抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製を行った。（３回目）1. Anti-periostin monoclonal antibody [1] Preparation of anti-periostin monoclonal antibody-Third time As described in (1) to (4) of [1] of Example 1 at a time different from 2 of Example 1 The operation was repeated to prepare an anti-periostin monoclonal antibody again. (The third)
その結果、生育した融合細胞株の中から一つのクローンを確立し、ＳＳ２０Ａ株と命名した。 As a result, one clone was established from the grown fusion cell lines and named SS20A strain.
そして、ＳＳ２０Ａ株のモノクローナル抗体産生細胞株からマウス抗ペリオスチンモノクローナル抗体（以下、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ２０Ａ）」という）を得ることができた。 Then, a mouse anti-periostin monoclonal antibody (hereinafter referred to as “anti-periostin monoclonal antibody (SS20A)”) was obtained from the SS20A monoclonal antibody-producing cell line.
〔２〕抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製−４回目
前記実施例１の２及び前記〔１〕とは別の時に、前記実施例１の２の〔１〕の（１）〜（４）の記載の通りに操作を行い、再度、抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製を行った。（４回目）[2] Preparation of Anti-Periostin Monoclonal Antibody—Fourth Time The preparation described in (1) to (4) of [1] of Example 1 at a different time from [2] of Example 1 and [1]. The operation was performed as described above, and the anti-periostin monoclonal antibody was prepared again. (The fourth)
その結果、生育した融合細胞株の中から一つのクローンを確立し、ＳＳ１９Ｄ株と命名した。 As a result, one clone was established from the grown fusion cell lines and named SS19D strain.
そして、ＳＳ１９Ｄ株のモノクローナル抗体産生細胞株からマウス抗ペリオスチンモノクローナル抗体（以下、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１９Ｄ）」という）を得ることができた。 Then, a mouse anti-periostin monoclonal antibody (hereinafter, referred to as “anti-periostin monoclonal antibody (SS19D)”) was obtained from the SS19D strain-producing cell line.
２．試料
１種類のヒトの血清試料を試料として用いた。2. Sample One human serum sample was used as a sample.
３．測定試薬
〔１〕抗体固定化担体試薬
２種類の抗体固定化担体試薬を、下記の通り調製した。
［１］抗体固定化担体試薬（対照）
（１） 前記１の〔１〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ２０Ａ）」を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これを９６穴マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ社、イリノイ州、米国）の各ウェルに１００μＬずつ注入した後、２５℃で１８〜２４時間静置し、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ２０Ａ）」をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固定化した。3. Assay Reagent [1] Antibody-immobilized carrier reagent Two types of antibody-immobilized carrier reagents were prepared as follows.
[1] Antibody-immobilized carrier reagent (control)
(1) The anti-periostin monoclonal antibody (SS20A) of the above item [1] was added to phosphate buffered saline (PBS) [137 mM sodium chloride, 2.68 mM potassium chloride, 1.47 mM diphosphate. 2 μg / mL with an aqueous solution (pH 7.4) containing potassium hydrogen and 8.04 mM disodium hydrogen phosphate, and dilute it to a 96-well microtiter plate (Thermo Fisher Scientific Inc, Illinois) , USA), the mixture was allowed to stand at 25 ° C for 18 to 24 hours, and “anti-periostin monoclonal antibody (SS20A)” was immobilized on each well of this microtiter plate.
（２） 次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルに、ブロッキング液〔０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕を各ウェルに２００μＬ注入し、４℃で１８〜２４時間静置した。 (2) Next, a blocking solution [0.5% (w / v) casein, 100 mM sodium chloride, and 0.1% (w / v)] was added to each well of the microtiter plate of (1). 200 μL of 50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer [Tris buffer] (pH 8.0) containing sodium azide was injected into each well, and left still at 4 ° C. for 18 to 24 hours.
（３） 次に、前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルを０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で３回洗浄した後、この液を吸い出し、除去し、その後真空乾燥して、抗体固定化担体試薬（対照）を調製した。 (3) Next, each well of the microtiter plate of the above (2) was subjected to phosphate buffer containing 0.05% (w / v) of polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20]. After washing with physiological saline [PBS] three times, this solution was sucked out, removed, and then dried under vacuum to prepare an antibody-immobilized carrier reagent (control).
［２］抗体固定化担体試薬（本発明）
（１） 前記１の〔１〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ２０Ａ）」を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これを９６穴マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ社、イリノイ州、米国）の各ウェルに１００μＬずつ注入した後、２５℃で１８〜２４時間静置し、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ２０Ａ）」をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固相化した。[2] Antibody-immobilized carrier reagent (the present invention)
(1) The anti-periostin monoclonal antibody (SS20A) of the above item [1] was added to phosphate buffered saline (PBS) [137 mM sodium chloride, 2.68 mM potassium chloride, 1.47 mM diphosphate. 2 μg / mL with an aqueous solution (pH 7.4) containing potassium hydrogen and 8.04 mM disodium hydrogen phosphate, and dilute it to a 96-well microtiter plate (Thermo Fisher Scientific Inc, Illinois) , USA), the mixture was allowed to stand at 25 ° C for 18 to 24 hours, and “anti-periostin monoclonal antibody (SS20A)” was immobilized on each well of this microtiter plate.
（２） 次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルに、ブロッキング液〔０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕を各ウェルに２００μＬ注入し、４℃で１８〜２４時間静置した。 (2) Next, a blocking solution [0.5% (w / v) casein, 100 mM sodium chloride, and 0.1% (w / v)] was added to each well of the microtiter plate of (1). 200 μL of 50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer [Tris buffer] (pH 8.0) containing sodium azide was injected into each well, and left still at 4 ° C. for 18 to 24 hours.
（３） 次に、前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルよりブロッキング液を吸い出し、除去した。 (3) Next, the blocking solution was sucked out from each well of the microtiter plate of (2) and removed.
（４） 次に、前記（３）のマイクロタイタープレートの各ウェルに０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース及び５００ｍＭのアルギニン塩酸塩を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液の３００μＬを注入し、４℃で１８〜２４時間静置した。 (4) Next, 0.05% (w / v) of polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20], 10% (w / v) was added to each well of the microtiter plate of (3). 300 μL of 100 mM phosphate buffer containing sucrose and 500 mM arginine hydrochloride in v) was injected and allowed to stand at 4 ° C. for 18 to 24 hours.
（５） 次に、前記（４）のマイクロタイタープレートの各ウェル中の溶液を吸い出し、除去し、その後真空乾燥して、抗体固定化担体試薬（本発明）を調製した。 (5) Next, the solution in each well of the microtiter plate of (4) was sucked out, removed, and then dried under vacuum to prepare an antibody-immobilized carrier reagent (the present invention).
〔２〕標識抗体試薬
前記１の〔２〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１９Ｄ）」にパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）を公知の方法により結合させてＰＯＤ標識抗ペリオスチンモノクローナル抗体を調製した。
これを標識抗体試薬とした。[2] Labeled antibody reagent Peroxidase (POD) was bound to the aforementioned [2] "anti-periostin monoclonal antibody (SS19D)" by a known method to prepare a POD-labeled anti-periostin monoclonal antibody.
This was used as a labeled antibody reagent.
３．抗体固定化担体試薬の保存
前記３の〔１〕の［１］及び［２］のそれぞれの抗体固定化担体試薬について５℃及び３０℃各々の温度で１５０日間保存した。3. Storage of the antibody-immobilized carrier reagent The antibody-immobilized carrier reagents of [1] [1] and [2] were stored at 5 ° C. and 30 ° C. for 150 days.
４．測定
前記３の〔１〕の［１］の抗体固定化担体試薬（対照）については、保存開始日、保存３０日目及び１５０日目にそれぞれ以下の測定を行った。
また、前記３の〔１〕の［２］の抗体固定化担体試薬（本発明）については、保存開始日、保存３０日目、５５日目及び１５０日目にそれぞれ以下の測定を行った。4. Measurement For the antibody-immobilized carrier reagent (control) of [3] [1], the following measurements were performed on the storage start date, and on the 30th and 150th days of storage.
For the antibody-immobilized carrier reagent (3) [1] and [2] (the present invention), the following measurements were performed on the storage start date, and on the 30th, 55th and 150th days of storage.
（１） 前記２の試料について、その１００μＬを前記３の〔１〕の［１］の抗体固定化担体試薬（対照）のマイクロタイタープレートのウェルに注入し、２５℃にて１８〜２４時間静置し、反応を行わせた。
これにより、試料に含まれるペリオスチンを、前記のウェルに固定化した「抗ペリオスチン抗体（ＳＳ２０Ａ）」に結合させた。(1) With respect to the sample (2), 100 μL thereof was injected into the well of a microtiter plate containing the antibody-immobilized carrier reagent (control) of [1] [1] described above in [3] and allowed to stand at 25 ° C. for 18 to 24 hours. To allow the reaction to take place.
Thus, the periostin contained in the sample was bound to the “anti-periostin antibody (SS20A)” immobilized in the well.
（２） 次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルを０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で５回洗浄した。 (2) Next, each well of the microtiter plate of the above (1) was subjected to phosphate buffered saline [PBS] containing 0.05% of polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20]. ] For 5 times.
（３） 前記３の〔２〕の標識抗体試薬を、０．５％のカゼイン及び１００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）で５０ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、その１００μＬを前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルに注入し、２５℃にて９０分間静置し、反応を行わせた。 (3) The labeled antibody reagent of [2] above was used as a 50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer [Tris buffer] (pH 8.0) containing 0.5% casein and 100 mM sodium chloride. Then, 100 μL of the solution was injected into each well of the microtiter plate described in (2) above, and allowed to stand at 25 ° C. for 90 minutes to perform a reaction.
これにより、前記の固定化した「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ２０Ａ）」に結合しているペリオスチンに、ＰＯＤを標識した「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１９Ｄ）」を結合させた。 As a result, POD-labeled “anti-periostin monoclonal antibody (SS19D)” was bound to periostin bound to the immobilized “anti-periostin monoclonal antibody (SS20A)”.
（４） 次に、前記（３）のマイクロタイタープレートの各ウェルを０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で５回洗浄した。 (4) Next, each well of the microtiter plate of the above (3) was subjected to phosphate buffered saline [PBS containing 0.05% polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20]. ] For 5 times.
（５） 次に、ＰＯＤの基質液〔０．８ｍＭの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、２．５ｍＭの過酸化水素、及び３０ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．９）〕の１００μＬを前記（４）のマイクロタイタープレートの各ウェルに注入し、２５℃にて１０分間静置し、反応を行わせ、発色させた。 (5) Next, a POD substrate solution [containing 0.8 mM 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMBZ), 2.5 mM hydrogen peroxide, and 30 mM disodium hydrogen phosphate Of a 20 mM citrate buffer solution (pH 3.9) was added to each well of the microtiter plate described in (4), and the mixture was allowed to stand at 25 ° C. for 10 minutes to allow the reaction to proceed to develop color.
（６） その後、前記（５）のマイクロタイタープレートの各ウェルに０．７Ｎの硫酸を注入し、この反応を停止させた。 (6) Thereafter, 0.7 N sulfuric acid was injected into each well of the microtiter plate of (5) to stop the reaction.
（７） 次に、分光光度計を用いて、前記（６）のマイクロタイタープレートの各ウェルについて、４５０ｎｍ（主波長）及び５５０ｎｍ（副波長）それぞれにおける吸光度の測定を行った。
そして、測定した４５０ｎｍ（主波長）における吸光度から５５０ｎｍ（副波長）における吸光度を差し引いた吸光度差の値を求めた。(7) Next, the absorbance of each well of the microtiter plate of (6) was measured at 450 nm (main wavelength) and 550 nm (sub wavelength) using a spectrophotometer.
Then, the value of the absorbance difference obtained by subtracting the absorbance at 550 nm (sub-wavelength) from the measured absorbance at 450 nm (main wavelength) was obtained.
なお、この吸光度差の値は、試料に含まれていたペリオスチンの濃度に基づくものである。 The value of the absorbance difference is based on the concentration of periostin contained in the sample.
（８） 前記実施例１の１で調製したペリオスチンを試料希釈液〔０．５％のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕で希釈して、ペリオスチンの希釈系列を作成し、これらを標準試料とした。 (8) The periostin prepared in Example 1-1 was used as a sample diluent [50 mM tris (hydroxymethyl) amino acid containing 0.5% casein, 100 mM sodium chloride, and 0.1% sodium azide. It was diluted with methane buffer [Tris buffer] (pH 8.0)] to prepare a dilution series of periostin, which was used as a standard sample.
次に、これらの標準試料のそれぞれについて、前記（１）〜（７）の記載の通りに測定を行い、前記の抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）における「ペリオスチン濃度−吸光度差」の標準曲線（検量線）を作成した。 Next, the measurement of each of these standard samples was performed as described in (1) to (7) above, and the “periostin concentration−” in the enzyme immunoassay (ELISA) using the anti-periostin monoclonal antibody described above. A standard curve (calibration curve) of "absorbance difference" was created.
（９） 前記（７）において測定したマイクロタイタープレートの各ウェルの吸光度差の値を、前記（８）で作成した「ペリオスチン濃度−吸光度差」の標準曲線（検量線）に当てはめ、各試料に含まれていたペリオスチンの濃度を求めた。 (9) The value of the absorbance difference of each well of the microtiter plate measured in (7) is applied to the standard curve (calibration curve) of “periostin concentration-absorbance difference” created in (8), and The concentration of periostin contained was determined.
（１０） また、前記（１）における「抗体固定化担体試薬（対照）のマイクロタイタープレート」に替えて、前記３の〔１〕の［２］の「抗体固定化担体試薬（本発明）のマイクロタイタープレート」を用いること以外は、前記（１）〜（９）の記載の通りに操作を行い、試料に含まれていたペリオスチンの濃度を求めた。 (10) Further, instead of the “microtiter plate of the antibody-immobilized carrier reagent (control)” in the above (1), the “antibody-immobilized carrier reagent (the present invention) of the above [3] [1] [2] is used. Except for using the “microtiter plate”, the operation was performed as described in the above (1) to (9), and the concentration of periostin contained in the sample was determined.
５．測定結果
前記４における試料に含まれていたペリオスチンの測定結果を表３に示した。5. Measurement results Table 3 shows the measurement results of periostin contained in the sample in 4 above.
なお、この表において、（カッコ）内の数値は、保存後のペリオスチン測定値を保存開始日のペリオスチン測定値で除したときの百分率（％）をそれぞれ示す。 In this table, numerical values in parentheses indicate percentages (%) obtained by dividing the measured value of periostin after storage by the measured value of periostin on the day of storage.
６．考察
この表より、「抗体固定化担体試薬（本発明）のマイクロタイタープレート」を用いる本発明の場合は、５℃保存１５０日目迄、ペリオスチンの測定値にほとんど変化がないことが分かる。6. From this table, it can be seen that, in the case of the present invention using the “microtiter plate of the antibody-immobilized carrier reagent (the present invention)”, the measured value of periostin hardly changes until 150 days of storage at 5 ° C.
また、この表より、「抗体固定化担体試薬（本発明）のマイクロタイタープレート」を用いる本発明の場合は、３０℃保存１５０日目迄、ペリオスチンの測定値の低下を抑制できていることが分かる。 From this table, it can be seen that in the case of the present invention using the “microtiter plate of the antibody-immobilized carrier reagent (the present invention)”, a decrease in the measured value of periostin was suppressed up to 150 days after storage at 30 ° C. I understand.
これに対して、「抗体固定化担体試薬（対照）のマイクロタイタープレート」を用いる対照の場合は、５℃保存時及び３０℃保存時とも１５０日目で、ペリオスチンの測定値が大幅に低下してしまっていることが分かる。 On the other hand, in the case of the control using the “microtiter plate of the antibody-immobilized carrier reagent (control)”, the measured value of periostin decreased significantly at 150 days both when stored at 5 ° C. and at 30 ° C. You can see that it's gone.
以上のことより、本発明の場合は、抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体が安定化されることが再度確かめられた。 From the above, it was again confirmed that in the case of the present invention, the anti-periostin antibody in the anti-periostin antibody-immobilized carrier was stabilized.
〔実施例４〕（本発明の効果の確認−４）
本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチンの測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法の効果を再度確かめた。[Example 4] (Confirmation of effect of the present invention-4)
The effects of the anti-periostin antibody-immobilized carrier, the periostin measurement reagent, and the anti-periostin antibody-stabilizing method of the anti-periostin antibody-immobilized carrier of the present invention were confirmed again.
１．測定試薬
２種類の抗体固定化担体試薬を、下記の通り調製した。
［１］抗体固定化担体試薬（対照）
（１） 前記実施例１の２の〔１〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これを９６穴マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ社、イリノイ州、米国）の各ウェルに１００μＬずつ注入した後、２５℃で１８〜２４時間静置し、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固定化した。1. Measurement Reagents Two types of antibody-immobilized carrier reagents were prepared as follows.
[1] Antibody-immobilized carrier reagent (control)
(1) The anti-periostin monoclonal antibody (SS18A) of [1] of Example 1 was used in phosphate buffered saline (PBS) [137 mM sodium chloride, 2.68 mM potassium chloride, 1.47 mM] Aqueous solution (pH 7.4) containing potassium dihydrogen phosphate and 8.04 mM disodium hydrogen phosphate] at a concentration of 2 μg / mL, and this was diluted to a 96-well microtiter plate (Thermo Fisher Scientific Inc.). (Illinois, U.S.A.), 100 μL was injected into each well and allowed to stand at 25 ° C. for 18 to 24 hours to immobilize “anti-periostin monoclonal antibody (SS18A)” in each well of this microtiter plate.
（２） 次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルに、ブロッキング液〔０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕を各ウェルに２００μＬ注入し、４℃で１８〜２４時間静置した。 (2) Next, a blocking solution [0.5% (w / v) casein, 100 mM sodium chloride, and 0.1% (w / v)] was added to each well of the microtiter plate of (1). 200 μL of 50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer [Tris buffer] (pH 8.0) containing sodium azide was injected into each well, and left still at 4 ° C. for 18 to 24 hours.
（３） 次に、前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルよりブロッキング液を吸い出し、除去した。 (3) Next, the blocking solution was sucked out from each well of the microtiter plate of (2) and removed.
（４） 次に、前記（３）のマイクロタイタープレートの各ウェルに、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース及び５００ｍＭのアルギニン塩酸塩を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液の３００μＬを注入し、４℃で２４時間静置した。 (4) Next, 300 μL of a 100 mM phosphate buffer containing 10% (w / v) sucrose and 500 mM arginine hydrochloride was injected into each well of the microtiter plate of the above (3), and 4 ° C. For 24 hours.
（５） 次に、前記（４）のマイクロタイタープレートの各ウェル中の溶液を吸い出し、除去し、その後真空乾燥して、抗体固定化担体試薬（対照１）を調製した。 (5) Next, the solution in each well of the microtiter plate of (4) was sucked out, removed, and then dried under vacuum to prepare an antibody-immobilized carrier reagent (Control 1).
［２］抗体固定化担体試薬（本発明）
（１） 前記実施例１の２の〔１〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これを９６穴マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ社、イリノイ州、米国）の各ウェルに１００μＬずつ注入した後、２５℃で１８〜２４時間静置し、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固相化した。[2] Antibody-immobilized carrier reagent (the present invention)
(1) The anti-periostin monoclonal antibody (SS18A) of [1] of Example 1 was used in phosphate buffered saline (PBS) [137 mM sodium chloride, 2.68 mM potassium chloride, 1.47 mM] Aqueous solution (pH 7.4) containing potassium dihydrogen phosphate and 8.04 mM disodium hydrogen phosphate] at a concentration of 2 μg / mL, and this was diluted to a 96-well microtiter plate (Thermo Fisher Scientific Inc.). (Illinois, U.S.A.), 100 μL each, and allowed to stand at 25 ° C. for 18 to 24 hours to immobilize “anti-periostin monoclonal antibody (SS18A)” on each well of this microtiter plate. .
（２） 次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルに、ブロッキング液〔０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕を各ウェルに２００μＬ注入し、４℃で１８〜２４時間静置した。 (2) Next, a blocking solution [0.5% (w / v) casein, 100 mM sodium chloride, and 0.1% (w / v)] was added to each well of the microtiter plate of (1). 200 μL of 50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer [Tris buffer] (pH 8.0) containing sodium azide was injected into each well, and left still at 4 ° C. for 18 to 24 hours.
（３） 次に、前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルよりブロッキング液を吸い出し、除去した。 (3) Next, the blocking solution was sucked out from each well of the microtiter plate of (2) and removed.
（４） 次に、前記（３）のマイクロタイタープレートの各ウェルに０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース及び５００ｍＭのアルギニン塩酸塩を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液の３００μＬを注入し、４℃で１８〜２４時間静置した。 (4) Next, 0.05% (w / v) of polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20], 10% (w / v) was added to each well of the microtiter plate of (3). 300 μL of 100 mM phosphate buffer containing sucrose and 500 mM arginine hydrochloride in v) was injected and allowed to stand at 4 ° C. for 18 to 24 hours.
（５） 次に、前記（４）のマイクロタイタープレートの各ウェル中の溶液を吸い出し、除去し、その後真空乾燥して、抗体固定化担体試薬（本発明）を調製した。 (5) Next, the solution in each well of the microtiter plate of (4) was sucked out, removed, and then dried under vacuum to prepare an antibody-immobilized carrier reagent (the present invention).
２．抗体固定化担体試薬の乾燥
前記１の［１］及び［２］のそれぞれの抗体固定化担体試薬について、室温で２４時間、真空乾燥により乾燥処理を行った。2. Drying of Antibody-Immobilized Carrier Reagent Each of the antibody-immobilized carrier reagents [1] and [2] was dried by vacuum drying at room temperature for 24 hours.
３．観察
前記１の［１］及び［２］のそれぞれの抗体固定化担体試薬について、前記２において乾燥処理を行った後のマイクロタイタープレートのウェルを観察した。3. Observation With respect to each of the antibody-immobilized carrier reagents of [1] and [2], the wells of the microtiter plate after the drying treatment in [2] were observed.
４．測定結果
前記３における観察結果であるそれぞれの画像を図１に示した。4. Measurement Results Each image as the observation result in the above 3 is shown in FIG.
５．考察
本実施例の測定結果である図１より、「抗体固定化担体試薬（対照）のマイクロタイタープレート」のウェルにおいては乾燥処理後に抗体固定化層が結晶化により凸状となってしまっているのに対して、「抗体固定化担体試薬（本発明）のマイクロタイタープレート」のウェルにおいては乾燥処理後に抗体固定化層が結晶化せず平滑であることが分かる。5. DISCUSSION From FIG. 1, which is the measurement result of this example, in the wells of the "microtiter plate of the antibody-immobilized carrier reagent (control)", the antibody-immobilized layer becomes convex due to crystallization after the drying treatment. On the other hand, in the wells of the “microtiter plate of the antibody-immobilized carrier reagent (the present invention)”, it can be seen that the antibody-immobilized layer is smooth without being crystallized after the drying treatment.
以上のことより、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤を接触させた場合は、抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体が結晶化されず平滑に固定化されることが確かめられた。
From the above, it was confirmed that when the surfactant was brought into contact with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier, the anti-periostin antibody in the anti-periostin antibody-immobilized carrier was smoothly crystallized without being crystallized. .
Claims (3)
（１）界面活性剤及び糖
（２）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
（３）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩An anti-periostin antibody-immobilized carrier having an anti-periostin antibody immobilized on a carrier, wherein the anti-periostin antibody immobilized on the carrier is contacted with a stabilizing substance selected from the following (1) to (3): An anti-periostin antibody-immobilized carrier, characterized by comprising:
(1) Surfactant and sugar (2) Surfactant and arginine or salt thereof (3) Surfactant, sugar and arginine or salt thereof
（１）界面活性剤及び糖
（２）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
（３）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩
A method for stabilizing an antibody in an anti-periostin antibody-immobilized carrier in which an anti-periostin antibody is immobilized on a carrier, wherein the anti-periostin antibody immobilized on the carrier has a stabilization selected from the following (1) to (3): A method for stabilizing an antibody in an anti-periostin antibody-immobilized carrier, which comprises contacting a substance.
(1) Surfactant and sugar (2) Surfactant and arginine or salt thereof (3) Surfactant, sugar and arginine or salt thereof
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