JPWO2018174253A1 - Nitrobenzene derivatives or their salts and their uses - Google Patents
Nitrobenzene derivatives or their salts and their uses Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2018174253A1 JPWO2018174253A1 JP2019507026A JP2019507026A JPWO2018174253A1 JP WO2018174253 A1 JPWO2018174253 A1 JP WO2018174253A1 JP 2019507026 A JP2019507026 A JP 2019507026A JP 2019507026 A JP2019507026 A JP 2019507026A JP WO2018174253 A1 JPWO2018174253 A1 JP WO2018174253A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- cells
- gstp1
- compound
- fluorescent probe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Abstract
【課題】ＧＳＴＰ１の活性を選択的に検出することができる蛍光プローブを提供する。【解決手段】下記一般式（１）：式中、符号の定義は、明細書に記載の通りである、で表されるニトロベンゼン誘導体またはその塩を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＰ１（ＧＳＴＰ１）測定用蛍光プローブとして用いる。【選択図】図１５A fluorescent probe capable of selectively detecting the activity of GSTP1 is provided. A nitrobenzene derivative represented by the following general formula (1): wherein the symbols are defined as described in the specification, or a salt thereof, is used for measuring glutathione-S-transferase P1 (GSTP1). Used as a fluorescent probe. [Selection diagram] FIG.
Description
本発明は、ニトロベンゼン誘導体またはその塩およびそれらの用途に関する。 The present invention relates to nitrobenzene derivatives or salts thereof and uses thereof.
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（本明細書中、「ＧＳＴ」とも称する）は、親電子性化合物と還元型グルタチオン（本明細書中、「ＧＳＨ」とも称する）との抱合体の生成反応を触媒する酵素であり、薬物代謝酵素として薬物や内在性活性代謝物のグルタチオン抱合に関与していることが知られている。生体内において、ＧＳＴは、これら抱合体を生成することにより、例えば、親電子性化合物を無毒化したり、排出したりする役割を担っている。また、ＧＳＴはこれ以外にも、ステロイドホルモンの生合成・アミノ酸の分解・プロスタグランジンの生合成など、多岐にわたる機能をもつ。 Glutathione-S-transferase (also referred to herein as "GST") is an enzyme that catalyzes a reaction for forming a conjugate of an electrophilic compound and reduced glutathione (also referred to herein as "GSH"). It is known that it is involved in glutathione conjugation of drugs and endogenous active metabolites as drug metabolizing enzymes. In the living body, GST plays a role of, for example, detoxifying or excreting an electrophilic compound by generating these conjugates. In addition, GST has various other functions such as steroid hormone biosynthesis, amino acid degradation, and prostaglandin biosynthesis.
従来提案されているＧＳＴ活性の測定方法としては、吸光法（比色法）、生物発光法、蛍光法などがある。なかでも、高感度での測定が可能である蛍光法に基づくＧＳＴ活性の測定方法として、いくつかの蛍光プローブが開発されている。 Conventionally proposed methods for measuring GST activity include an absorption method (colorimetric method), a bioluminescence method, and a fluorescence method. Among them, several fluorescent probes have been developed as a method for measuring GST activity based on a fluorescence method capable of measuring with high sensitivity.
例えば非特許文献１には、４９０ｎｍに極大吸収波長、５１０ｎｍ付近に極大蛍光波長をそれぞれ有するプローブとして、ＤＮＡＦ類やＤＮＡＴ−Ｍｅといった一連の蛍光プローブが開示されている。これらの蛍光プローブはＧＳＴ活性によるグルタチオン化と、これに伴う脱ニトロ化反応によって大きな蛍光強度上昇を示す。ただし、非特許文献６に開示された蛍光プローブ（ＤＮＡＦ類やＤＮＡＴ−Ｍｅ）は、ＧＳＴ非依存的なグルタチオンとの反応性が高いことから、十分なＳ／Ｎ比が得られないという問題があり、また、反応後の蛍光量子収率が低いという問題があった。さらに、ＤＮＡＦ類を蛍光プローブとして用いると、弱酸性領域のｐＨ条件下では生成物の蛍光強度が大幅に減少するという問題もあった。そして、これらの問題を解決することを目的とした技術として、特許文献１によれば、ＤＮＡＦ類におけるフルオレセイン構造のキサンテン環の特定部位にフッ素原子または塩素原子を導入したフルオレセイン誘導体をＧＳＴ活性測定用蛍光プローブとして用いることが提案されている。 For example, Non-Patent Document 1 discloses a series of fluorescent probes such as DNAFs and DNAT-Me as probes having a maximum absorption wavelength at 490 nm and a maximum fluorescence wavelength near 510 nm, respectively. These fluorescent probes show a large increase in fluorescence intensity due to glutathione formation by GST activity and accompanying denitration reaction. However, the fluorescent probes (DNAFs and DNAT-Me) disclosed in Non-Patent Document 6 have a problem that a sufficient S / N ratio cannot be obtained because of high reactivity with GST-independent glutathione. In addition, there is a problem that the fluorescence quantum yield after the reaction is low. Furthermore, when DNAFs are used as a fluorescent probe, there is a problem that the fluorescence intensity of the product is significantly reduced under a pH condition in a weakly acidic region. As a technique aimed at solving these problems, according to Patent Document 1, a fluorescein derivative in which a fluorine atom or a chlorine atom is introduced at a specific site of a xanthene ring of a fluorescein structure in DNAFs is used for GST activity measurement. It has been proposed for use as a fluorescent probe.
ところで、ＧＳＴは、細胞質型、ミトコンドリア型、ミクロソーム型の３種類に分類され、ヒトの細胞質型ＧＳＴにはＡｌｐｈａ、Ｍｕ、Ｐｉ、Ｓｉｇｍａ、Ｔｈｅｔａ、Ｏｍｅｇａ、Ｚｅｔａの７種類のクラスが存在し、それぞれに最大５種類の分子種が存在する（非特許文献２）。なかでも、胎盤をはじめとした限られた正常組織に発現しているＰｉクラスの分子種ＧＳＴＰ１は、多くのがん細胞で過剰発現しており（非特許文献３）、がん細胞の抗がん剤耐性に寄与していることが報告されている（非特許文献４）。さらにＧＳＴＰ１は、ＪＮＫ（ｃ−ｊｕｎ−Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ）と相互作用して複合体を形成し、ストレスシグナルによるＪＮＫの活性化を阻害している。酸化ストレスや抗がん剤といった刺激が加わることで、この複合体からＧＳＴＰ１が解離し、ＪＮＫが活性化される（非特許文献５）。すなわち、ＧＳＴＰ１は、抗がん剤によるＪＮＫの活性化を介したアポトーシスを抑制していると考えられている。これまでに開発されてきたＧＳＴＰ１阻害剤は、細胞内ＧＳＴＰ１に結合し、ＧＳＴＰ１−ＪＮＫ複合体の形成を阻害することでＪＮＫを活性化し、アポトーシスを誘導する（非特許文献６）。このように、多くのがん細胞で過剰発現していることと抗がん剤耐性の獲得に寄与していることから、ＧＳＴＰ１はがんマーカーとして、また抗がん剤の標的分子として期待されている。従来、がん細胞で過剰発現しているβ−ガラクトシダーゼやγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）を標的とした蛍光プローブのＨＭＲｅｆ−ｂＧａｌやｇＧｌｕ−ＨＭＲＧが開発され、微小がんの検出に成功している（非特許文献７、８）。しかしながら、これらの酵素はすべてのがん細胞で過剰発現しているわけではなく、発現量の低いがん細胞を検出することは困難である。一方、ＧＳＴＰ１は前立腺がんを除くほぼ全てのがん細胞で過剰発現しているため、ＧＳＴＰ１の過剰発現を捉えることでより多くのがん細胞を検出することが可能であると考えられる。がんの病理診断においては組織免疫染色等が行われるが、ＧＳＴＰ１の活性を検出可能な蛍光プローブを開発できれば、生検組織にこの蛍光プローブを塗布することでＧＳＴＰ１活性を指標としたがんの有無の評価が可能となる。また、生細胞で利用可能なＧＳＴＰ１活性を検出する蛍光プローブは、新たな研究ツールとしての使用が期待される。 By the way, GST is classified into three types: cytoplasmic type, mitochondrial type, and microsomal type. Human cytoplasmic type GST has seven types of classes, Alpha, Mu, Pi, Sigma, Theta, Omega, and Zeta. There are at most five types of molecular species (Non-Patent Document 2). Above all, the GSTP1 molecular species of the Pi class, which is expressed in limited normal tissues such as the placenta, is overexpressed in many cancer cells (Non-Patent Document 3). It has been reported that it contributes to drug resistance (Non-patent Document 4). Further, GSTP1 interacts with JNK (c-jun-N-terminal kinase) to form a complex and inhibits activation of JNK by a stress signal. When a stimulus such as oxidative stress or an anticancer agent is applied, GSTP1 is dissociated from this complex, and JNK is activated (Non-Patent Document 5). That is, GSTP1 is considered to suppress apoptosis through activation of JNK by an anticancer agent. The GSTP1 inhibitor that has been developed so far binds to intracellular GSTP1, activates JNK by inhibiting the formation of the GSTP1-JNK complex, and induces apoptosis (Non-Patent Document 6). Thus, GSTP1 is expected to serve as a cancer marker and as a target molecule for anticancer drugs because it is overexpressed in many cancer cells and contributes to the acquisition of anticancer drug resistance. ing. Conventionally, fluorescent probes HMRef-bGal and gGlu-HMRG, which target β-galactosidase or γ-glutamyl transpeptidase (GGT), which are overexpressed in cancer cells, have been developed, and have successfully detected small cancers. (Non-Patent Documents 7 and 8). However, these enzymes are not overexpressed in all cancer cells, and it is difficult to detect cancer cells with low expression levels. On the other hand, since GSTP1 is overexpressed in almost all cancer cells except prostate cancer, it is considered that more cancer cells can be detected by capturing the overexpression of GSTP1. In the pathological diagnosis of cancer, tissue immunostaining and the like are performed. However, if a fluorescent probe capable of detecting the activity of GSTP1 can be developed, this fluorescent probe can be applied to a biopsy tissue to detect the GSTP1 activity. The presence or absence can be evaluated. In addition, fluorescent probes that can be used in living cells to detect GSTP1 activity are expected to be used as new research tools.
非特許文献１や特許文献１に開示された蛍光プローブは、ＧＳＴ分子種の選択性が低い（すなわち、ＧＳＴＰ１に対する選択性を有しない）。また、当該蛍光プローブはＧＳＨとの反応性が高いことから、非酵素的な反応速度が大きい。このため、非特許文献１や特許文献１に開示されたＧＳＴ活性測定用蛍光プローブを用いたとしても、がん細胞において過剰発現しているＧＳＴＰ１の存在を特異的に検出することはできないという問題がある。 The fluorescent probes disclosed in Non-Patent Document 1 and Patent Document 1 have low selectivity for GST molecular species (that is, they do not have selectivity for GSTP1). In addition, since the fluorescent probe has high reactivity with GSH, the nonenzymatic reaction rate is high. For this reason, even if the fluorescent probe for measuring GST activity disclosed in Non-Patent Document 1 or Patent Document 1 is used, it is not possible to specifically detect the presence of GSTP1 overexpressed in cancer cells. There is.
そこで本発明は、ＧＳＴＰ１の活性を選択的に検出することが可能な蛍光プローブを提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a fluorescent probe capable of selectively detecting the activity of GSTP1.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、驚くべきことに、所定の化学構造を有するニトロベンゼン誘導体（またはその塩）が、上記課題を解決可能な蛍光プローブとして有用であることを見出し、本発明を完成させるに至った。 The present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems. As a result, they have surprisingly found that a nitrobenzene derivative (or a salt thereof) having a predetermined chemical structure is useful as a fluorescent probe that can solve the above-mentioned problems, and have completed the present invention.
すなわち、本発明の一形態によれば、下記一般式（１）： That is, according to one embodiment of the present invention, the following general formula (1):
式中、Ｌは蛍光団を表し、ＥＷＧ基は０．６６以上０．７８未満のハメット定数を有する電子求引性基を表し、ベンゼン環に結合したニトロ（ＮＯ２）基はベンゼン環に結合したアミド結合に対してオルト位またはパラ位に位置し、前記ＥＷＧ基は、前記ニトロ（ＮＯ２）基に対してオルト位またはパラ位に位置している、
で表されるニトロベンゼン誘導体またはその塩が提供される。In the formula, L represents a fluorophore, an EWG group represents an electron-withdrawing group having a Hammett constant of 0.66 or more and less than 0.78, and a nitro (NO 2 ) group bonded to a benzene ring is bonded to a benzene ring. Wherein the EWG group is located ortho or para to the nitro (NO 2 ) group,
Or a salt thereof.
また、本発明の他の形態によれば、上記ニトロベンゼン誘導体またはその塩を含む、ＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブが提供される。 According to another aspect of the present invention, there is provided a fluorescent probe for GSTP1 measurement, comprising the above nitrobenzene derivative or a salt thereof.
さらに、本発明のさらに他の形態によれば、上記ＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブを含む、がん細胞またはがん組織の検出用組成物、およびがん診断用組成物、並びに上記ＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブまたは上記検出用組成物を用いたがん診断用キットが提供される。 Further, according to still another aspect of the present invention, a composition for detecting a cancer cell or cancer tissue, a composition for diagnosing cancer, and a fluorescent probe for GSTP1 measurement, comprising the GSTP1 measurement fluorescent probe. Alternatively, a kit for cancer diagnosis using the above composition for detection is provided.
また、本発明のさらに他の形態によれば、上記ＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブまたは上記検出用組成物を組織に適用する工程と、適用後の前記組織に対して励起光を照射する工程と、前記組織からの蛍光を検出する工程と含む、がん細胞またはがん組織の検出方法、および、上記ＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブまたは上記検出用組成物を、生体から採取した血液中の細胞と接触させる工程と、前記細胞に対して励起光を照射する工程と、前記細胞からの蛍光を検出する工程とを含む、血液中におけるがん細胞の検出方法が提供される。 According to still another aspect of the present invention, a step of applying the fluorescent probe for measuring GSTP1 or the composition for detection to a tissue, irradiating the tissue with excitation light after the application, A method for detecting a cancer cell or cancer tissue, including a step of detecting fluorescence from a tissue, and a step of contacting the fluorescent probe for measuring GSTP1 or the composition for detection with cells in blood collected from a living body And a step of irradiating the cells with excitation light, and a step of detecting fluorescence from the cells.
さらに、本発明のさらに他の形態によれば、下記一般式（４）： According to still another embodiment of the present invention, there is provided the following general formula (4):
式中、ＥＷＧ基は０．６６以上０．７８未満のハメット定数を有する電子求引性基を表し、ベンゼン環に結合したニトロ（ＮＯ２）基はベンゼン環に結合したアミド結合に対してオルト位またはパラ位に位置し、前記ＥＷＧ基は、前記ニトロ（ＮＯ２）基に対してオルト位またはパラ位に位置し、Ｒ１は、置換もしくは非置換の炭素数１〜２０のアルキル基、置換もしくは非置換の炭素数１〜２０のアルコキシ基、またはアミド基（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２基）を表し、ｍは０〜５の整数を表す、
で表されるニトロベンゼン誘導体またはその塩もまた、提供される。In the formula, the EWG group represents an electron-withdrawing group having a Hammett constant of 0.66 or more and less than 0.78, and the nitro (NO 2 ) group bonded to the benzene ring is ortho to the amide bond bonded to the benzene ring. The EWG group is located ortho or para to the nitro (NO 2 ) group, R 1 is a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, Represents a substituted or unsubstituted alkoxy group having 1 to 20 carbon atoms or an amide group (—C (＝ O) NH 2 group), and m represents an integer of 0 to 5,
A nitrobenzene derivative represented by or a salt thereof is also provided.
本発明によれば、ＧＳＴＰ１の活性を選択的に検出することが可能な蛍光プローブが提供される。本発明に係る蛍光プローブは、がん細胞またはがん組織の検出やがんの診断といった用途に用いられうる。 According to the present invention, there is provided a fluorescent probe capable of selectively detecting the activity of GSTP1. The fluorescent probe according to the present invention can be used for applications such as detection of cancer cells or cancer tissues and diagnosis of cancer.
以下、本発明の実施形態を説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described.
本発明の一形態は、下記一般式（１）： One embodiment of the present invention provides the following general formula (1):
で表されるニトロベンゼン誘導体またはその塩である。 Or a salt thereof.
一般式（１）において、ＥＷＧ基は電子求引性基（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ−Ｗｉｔｈｄｒａｗｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ）であって、０．６６以上０．７８未満のハメット（Ｈａｍｍｅｔ）定数を有するものである。なお、本明細書において「ハメット（Ｈａｍｍｅｔ）定数（σｐ）」とは、ＥＷＧ基の電子求引性を示す指標であり、この値が大きいほど、電子求引性が高いことを示す。ここで、文献（Ｈａｎｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ， １９９１， Ｖｏｌ，９１， Ｎｏ． ２， １６５−１９５）に記載されているＥＷＧ基のハメット定数（σｐ）の値についてはその値を用いるものとする。一方、文献に記載されていないＥＷＧ基については、別途、従来公知のソフトウェアパッケージを利用し、無置換安息香酸の酸解離定数（ｐＫａ）との差を算出することでハメット定数（σｐ）の値を得ることができる。また、「酸解離定数（ｐＫａ）」とは、水溶液中での酸解離定数（ｐＫａ）を意味し、この値が小さいほど酸強度が大きいことを示す。ここで、水溶液中での酸解離定数（ｐＫａ）は、具体的には、無限希釈水溶液を用い、２５℃での酸解離定数を測定することにより実測することができる。また、従来公知のソフトウェアパッケージを用いることで、公知文献値のデータベースに基づいた値を計算により求めることもできる。 In the general formula (1), the EWG group is an electron-withdrawing group, and has a Hammett constant of 0.66 or more and less than 0.78. In the present specification, the “Hammet constant (σp)” is an index indicating the electron withdrawing property of the EWG group, and the larger the value, the higher the electron withdrawing property. Here, the value of the Hammett constant (σp) of the EWG group described in the literature (Hansch et al., Chemical Reviews, 1991, Vol. 91, No. 2, 165-195) is to be used. I do. On the other hand, for the EWG group not described in the literature, the value of the Hammett's constant (σp) is calculated separately from the acid dissociation constant (pKa) of unsubstituted benzoic acid using a conventionally known software package. Can be obtained. Further, “acid dissociation constant (pKa)” means an acid dissociation constant (pKa) in an aqueous solution, and a smaller value indicates a larger acid strength. Here, the acid dissociation constant (pKa) in the aqueous solution can be specifically measured by measuring the acid dissociation constant at 25 ° C. using an infinitely diluted aqueous solution. Further, by using a conventionally known software package, a value based on a database of known document values can be obtained by calculation.
本発明において、ＥＷＧ基のハメット定数を「０．６６以上０．７８未満」としたのは、ＥＷＧ基のハメット定数が、ニトロ基（−ＮＯ２基）の値（０．７８）よりも小さく、シアノ基（−Ｃ≡Ｎ基）の値（０．６６）以上であることを示したものである。また、一般式（１）において、ＥＷＧ基は共鳴効果を示すものであることが好ましい。ここで、ＥＷＧ基が「共鳴効果を示す」とは、本発明に係るニトロベンゼン誘導体をＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブとして用いた場合において、当該ニトロベンゼン誘導体がＧＳＨと反応する際の上記ベンゼン環に対する芳香族求核置換反応の反応中間体であるマイゼンハイマー錯体の構造を安定化するように、当該ベンゼン環に結合したニトロ基上へ電子が局在化した共鳴構造が存在することを意味する。なお、本発明におけるＥＷＧ基の例としては、例えば、メシル基（−ＳＯ２ＣＨ３基；ハメット定数＝０．７２であり、共鳴効果を示す）やシアノ基（−Ｃ≡Ｎ基；ハメット定数＝０．６６であり、共鳴効果を示す）などが挙げられるが、これらに限定されない。In the present invention, the reason why the Hammett constant of the EWG group is “0.66 or more and less than 0.78” is that the Hammett constant of the EWG group is smaller than the value (0.78) of the nitro group (—NO 2 group). , And cyano group (-C≡N group) (0.66) or more. In the general formula (1), the EWG group preferably has a resonance effect. Here, the expression “the EWG group exhibits a resonance effect” means that when the nitrobenzene derivative according to the present invention is used as a fluorescent probe for GSTP1 measurement, the aromatic reaction of the benzene ring when the nitrobenzene derivative reacts with GSH. It means that there is a resonance structure in which electrons are localized on the nitro group bonded to the benzene ring so as to stabilize the structure of the Meisenheimer complex which is a reaction intermediate of the nuclear substitution reaction. Examples of the EWG group in the present invention include, for example, a mesyl group (—SO 2 CH 3 group; Hammett constant = 0.72, which shows a resonance effect) and a cyano group (—C≡N group; Hammett constant). = 0.66, indicating a resonance effect), but is not limited thereto.
また、一般式（１）において、ベンゼン環に結合したニトロ（ＮＯ２）基はベンゼン環に結合したアミド結合に対してオルト位またはパラ位に位置し、前記ＥＷＧ基は、前記ニトロ（ＮＯ２）基に対してオルト位またはパラ位に位置している。このような配置とすることにより、ニトロベンゼン誘導体はＧＳＴＰ１選択的な蛍光プローブとして機能することができる。なお、一般式（１）においてベンゼン環に結合したアミド結合の当該ベンゼン環への結合位置を１位としたときに、上記の規定を満足するニトロ（ＮＯ２）基およびＥＷＧ基の結合位置の組み合わせを列挙すると以下の通りである：
・２位＝ニトロ（ＮＯ２）基、３位＝ＥＷＧ基；
・２位＝ニトロ（ＮＯ２）基、５位＝ＥＷＧ基；
・４位＝ニトロ（ＮＯ２）基、３位＝ＥＷＧ基。In the general formula (1), the nitro (NO 2 ) group bonded to the benzene ring is located at the ortho position or the para position with respect to the amide bond bonded to the benzene ring, and the EWG group is bonded to the nitro (NO 2). ) Is located ortho or para to the group. With such an arrangement, the nitrobenzene derivative can function as a GSTP1-selective fluorescent probe. In addition, when the bonding position of the amide bond bonded to the benzene ring in the general formula (1) to the benzene ring is the first position, the bonding position of the nitro (NO 2 ) group and the EWG group that satisfies the above rule is satisfied. The combinations are listed below:
· # 2 = nitro (NO 2) group, 3-position = EWG group;
· # 2 = nitro (NO 2) group, 5-position = EWG group;
· 4-position = nitro (NO 2) group, 3-position = EWG group.
一般式（１）において、Ｌは蛍光団を表す。ここで「蛍光団」とは、蛍光を発する発色団を意味し、本発明においては蛍光標識化合物として使用されうる蛍光性官能基であれば特に限定されない。当該蛍光団としては、例えば、フルオレセイン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ（ボロン−ジピロメテン）、クマリン、ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ、ＴｏｋｙｏＭａｇｅｎｔａ、ＳｉｎｇａｐｏｒｅＧｒｅｅｎ、ナフタルイミドおよびロドール（Ｒｈｏｄｏｌ）からなる群から選択される母核を有するものが挙げられる。なかでも、脂溶性が高く細胞膜透過性を有するという観点からは、クマリン、ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ、ＴｏｋｙｏＭａｇｅｎｔａ、およびＳｉｎｇａｐｏｒｅ Ｇｒｅｅｎからなる群から選択される母核を有するものが好ましく、ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎを母核として有するものが特に好ましい。ここで、一般式（１）で表されるニトロベンゼン誘導体において、蛍光団Ｌは、好ましくは下記一般式（２）： In the general formula (1), L represents a fluorophore. Here, “fluorophore” means a chromophore that emits fluorescence, and is not particularly limited as long as it is a fluorescent functional group that can be used as a fluorescent labeling compound in the present invention. Examples of the fluorophore include those having a mother nucleus selected from the group consisting of fluorescein, rhodamine, BODIPY (boron-dipyrromethene), coumarin, TokyoGreen, TokyoMagenta, Singaporepore Green, naphthalimide, and rhodol (Rhodol). Among them, from the viewpoint of high lipid solubility and cell membrane permeability, those having a mother nucleus selected from the group consisting of coumarin, Tokyo Green, Tokyo Magenta, and Singapore Green are preferable, and those having Tokyo Green as a mother nucleus are particularly preferable. preferable. Here, in the nitrobenzene derivative represented by the general formula (1), the fluorophore L is preferably represented by the following general formula (2):
で表される構造を有するものであり、ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎを母核として有する化合物はこの形態に包含される。 And a compound having Tokyo Green as a mother nucleus is included in this form.
一般式（２）において、Ｒ１は、置換もしくは非置換の炭素数１〜２０（好ましくは炭素数１〜１２、より好ましくは炭素数１〜８、さらに好ましくは炭素数１〜４、特に好ましくは炭素数１〜２、最も好ましくは炭素数１）のアルキル基、置換もしくは非置換の炭素数１〜２０（好ましくは炭素数１〜１２、より好ましくは炭素数１〜８、さらに好ましくは炭素数１〜４、特に好ましくは炭素数１〜２、最も好ましくは炭素数１）のアルコキシ基、またはアミド基（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２基）を表す。また、ｎはベンゼン環に結合したＲ１の数であり、０〜４の整数を表す。ｎは、好ましくは０〜３の整数であり、より好ましくは０〜２の整数であり、さらに好ましくは０または１である。In the general formula (2), R 1 is a substituted or unsubstituted carbon atom having 1 to 20 (preferably 1 to 12 carbon atoms, more preferably 1 to 8 carbon atoms, still more preferably 1 to 4 carbon atoms, and particularly preferably Is an alkyl group having 1 to 2 carbon atoms, most preferably 1 carbon atom, substituted or unsubstituted 1 to 20 carbon atoms (preferably 1 to 12 carbon atoms, more preferably 1 to 8 carbon atoms, and still more preferably Represents an alkoxy group having 1 to 4, particularly preferably 1 to 2 carbon atoms, and most preferably 1 carbon atom, or an amide group (—C (＝ O) NH 2 group). N is the number of R 1 bonded to the benzene ring, and represents an integer of 0 to 4. n is preferably an integer of 0 to 3, more preferably an integer of 0 to 2, and still more preferably 0 or 1.
一般式（２）において、Ｒ２は、水素原子または炭素数２〜２０（好ましくは炭素数２〜１２、より好ましくは炭素数２〜８、さらに好ましくは炭素数２〜４、特に好ましくは炭素数２〜３、最も好ましくは炭素数２）のアシル基を表す。なかでも、ＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブとして用いられた際の脂溶性（すなわち、細胞膜透過性）が高いという観点からは、Ｒ２は炭素数２〜２０のアシル基であることが好ましい。In the general formula (2), R 2 is a hydrogen atom or a carbon atom having 2 to 20 carbon atoms (preferably having 2 to 12 carbon atoms, more preferably having 2 to 8 carbon atoms, further preferably having 2 to 4 carbon atoms, and particularly preferably having 2 to 4 carbon atoms. Represents an acyl group having the number of 2 to 3, most preferably 2) carbon atoms. Among them, from the viewpoint of high lipophilicity (that is, cell membrane permeability) when used as a fluorescent probe for GSTP1 measurement, R 2 is preferably an acyl group having 2 to 20 carbon atoms.
一般式（２）において、Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、水素原子またはハロゲン原子を表す。ハロゲン原子はフッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子のいずれであってもよいが、Ｘ１および／またはＸ２がハロゲン原子である場合、当該ハロゲン原子はフッ素原子または塩素原子であることが好ましく、塩素原子であることが特に好ましい。また、ＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブとして用いられた場合のＧＳＴＰ１選択性の観点からは、Ｘ１およびＸ２の少なくとも一方が水素原子であることが好ましく、Ｘ１およびＸ２がともに水素原子であることがより好ましい。In the general formula (2), X 1 and X 2 each independently represent a hydrogen atom or a halogen atom. The halogen atom may be any of a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom. When X 1 and / or X 2 is a halogen atom, the halogen atom is a fluorine atom or a chlorine atom Is preferable, and a chlorine atom is particularly preferable. In view of GSTP1 selectivity when used as a fluorescent probe for GSTP1 measurement, it is preferable that at least one of X 1 and X 2 are hydrogen atom, it X 1 and X 2 are both hydrogen atoms Is more preferred.
本明細書において、「アルキル基」は直鎖状、分枝鎖状、環状、またはそれらの組み合わせからなるアルキル基のいずれであってもよい。Ｒ１がアルキル基である場合、その炭素数は上述したように１〜２０であるが、好ましくは炭素数１〜１２であり、より好ましくは炭素数１〜８であり、さらに好ましくは炭素数１〜４であり、特に好ましくは炭素数１〜２（メチル基またはエチル基）であり、最も好ましくは炭素数１（メチル基）である。In the present specification, the “alkyl group” may be any of a linear, branched, cyclic, or a combination thereof. When R 1 is an alkyl group, it has 1 to 20 carbon atoms as described above, but preferably has 1 to 12 carbon atoms, more preferably 1 to 8 carbon atoms, and still more preferably 1 to 8 carbon atoms. 1 to 4, particularly preferably 1 to 2 carbon atoms (methyl group or ethyl group), and most preferably 1 carbon atom (methyl group).
本明細書において、「アルコキシ基」は、−Ｏ−アルキル基を意味し、ここで「アルキル基」は上述した定義および好ましい形態を有する基である。 As used herein, an “alkoxy group” refers to an —O-alkyl group, where the “alkyl group” is a group having the above-described definition and preferred form.
本明細書において、「アシル基」は、脂肪族アシル基または芳香族アシル基のいずれであってもよく、芳香族基を置換基として有する脂肪族アシル基であってもよい。アシル基は１個または２個以上のヘテロ原子を含んでいてもよい。例えば、アシル基としてアルキルカルボニル基（アセチル基など）、アルキルオキシカルボニル基（アセトキシカルボニル基など）、アリールカルボニル基（ベンゾイル基など）、アリールオキシカルボニル基（フェニルオキシカルボニル基など）、アラルキルカルボニル基（ベンジルカルボニル基など）、アルキルチオカルボニル基（メチルチオカルボニル基など）、アルキルアミノカルボニル基（メチルアミノカルボニル基など）、アリールチオカルボニル基（フェニルチオカルボニル基など）、またはアリールアミノカルボニル基（フェニルアミノカルボニル基など）などのアシル基が挙げられるが、これらに限定されることはない。 In the present specification, the “acyl group” may be either an aliphatic acyl group or an aromatic acyl group, and may be an aliphatic acyl group having an aromatic group as a substituent. An acyl group may contain one or more heteroatoms. For example, as an acyl group, an alkylcarbonyl group (such as an acetyl group), an alkyloxycarbonyl group (such as an acetoxycarbonyl group), an arylcarbonyl group (such as a benzoyl group), an aryloxycarbonyl group (such as a phenyloxycarbonyl group), an aralkylcarbonyl group (such as Benzylcarbonyl group), alkylthiocarbonyl group (methylthiocarbonyl group, etc.), alkylaminocarbonyl group (methylaminocarbonyl group, etc.), arylthiocarbonyl group (phenylthiocarbonyl group, etc.), or arylaminocarbonyl group (phenylaminocarbonyl group, etc.) And the like, but is not limited thereto.
本明細書において、上述したＲ１としてのアルキル基やアルコキシ基、Ｒ２としてのアシル基は、任意の置換基を１個以上有していてもよい。前記置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子のいずれであってもよい）、アミノ基、モノもしくはジ置換アミノ基、置換シリル基、またはアシル基などが挙げられるが、これらに限定されることはない。上記の官能基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは互いに同一でも異なっていてもよい。ただし、Ｒ１としてのアルキル基およびアルコキシ基は非置換のものであることが好ましく、Ｒ１が存在する場合（ｎが１〜４の整数である場合）、当該Ｒ１は非置換のアルキル基であることが好ましい。同様に、Ｒ２としてのアシル基は非置換のものであることが好ましい。In the present specification, the above-described alkyl group or alkoxy group as R 1 and the acyl group as R 2 may have one or more arbitrary substituents. Examples of the substituent include an alkoxy group, a halogen atom (which may be any of a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom), an amino group, a mono- or di-substituted amino group, a substituted silyl group, or Examples include an acyl group, but are not limited thereto. When the above functional groups have two or more substituents, they may be the same or different from each other. However, the alkyl group and the alkoxy group as R 1 are preferably unsubstituted. When R 1 is present (when n is an integer of 1 to 4), the R 1 is an unsubstituted alkyl group It is preferred that Similarly, the acyl group as R 2 is preferably unsubstituted.
本発明の好ましい実施形態において、一般式（２）で表される蛍光団Ｌを有する化合物において、上述したＮＯ２基とＥＷＧ基との結合部位の組み合わせのうち、「２位＝ニトロ（ＮＯ２）基、５位＝ＥＷＧ基」の組み合わせのものであることが好ましく、この際、ＥＷＧ基がメシル基またはシアノ基であることがより好ましく、ＥＷＧ基がメシル基であることが最も好ましい。すなわち、本発明の好ましい実施形態において、一般式（１）で表されるニトロベンゼン化合物またはその塩は、下記一般式（３）：In a preferred embodiment of the present invention, in the compound having a fluorophore L represented by the general formula (2), among the combinations of the above-described binding sites between the NO 2 group and the EWG group, “2-position = nitro (NO 2 ) Group, 5-position = EWG group ". In this case, the EWG group is more preferably a mesyl group or a cyano group, and most preferably the EWG group is a mesyl group. That is, in a preferred embodiment of the present invention, the nitrobenzene compound represented by the general formula (1) or a salt thereof is represented by the following general formula (3):
で表されるものである。なお、一般式（３）における符号の定義は、上記と同様である。 It is represented by In addition, the definition of the code | symbol in general formula (3) is the same as the above.
上記一般式（１）で表される化合物は塩として存在する場合がある。塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などが挙げられる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、またはトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩が挙げられる。また、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩が挙げられる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などが例示されうる。ただし、本発明に係る化合物の塩はこれらに限定されることはない。 The compound represented by the general formula (1) may exist as a salt in some cases. Salts include base addition salts, acid addition salts, amino acid salts and the like. Examples of the base addition salt include metal salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt and magnesium salt; ammonium salts; and organic amine salts such as triethylamine salt, piperidine salt and morpholine salt. Examples of the acid addition salt include mineral salts such as hydrochloride, sulfate and nitrate, and organic acid salts such as methanesulfonate, paratoluenesulfonate, citrate and oxalate. Examples of the amino acid salt include a glycine salt. However, the salt of the compound according to the present invention is not limited to these.
一般式（１）で表される本発明の化合物は、置換基の種類に応じて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合があり、エナンチオマーまたはジアステレオマーなどの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。 The compound of the present invention represented by the general formula (1) may have one or more asymmetric carbon atoms depending on the type of the substituent, and there are stereoisomers such as enantiomers and diastereomers. May be. Pure stereoisomers, any mixtures of stereoisomers, racemates and the like are all included in the scope of the present invention.
一般式（１）で表される本発明の化合物またはその塩は、水和物または溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の技術的範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒が挙げられる。 The compound of the present invention represented by the general formula (1) or a salt thereof may exist as a hydrate or a solvate, and these substances are all included in the technical scope of the present invention. The type of the solvent that forms the solvate is not particularly limited, and examples thereof include solvents such as ethanol, acetone, and isopropanol.
なお、本発明に係るニトロベンゼン化合物またはその塩は、生体内環境であるｐＨ７．４（好ましくはｐＨ７．０〜８．０）の条件下において非イオン性の状態で存在するものであることが好ましい。このような条件を満たす化合物であれば、細胞膜透過性に特に優れることから、後述するような生細胞に対して用いられる蛍光プローブとして特に有用である。 In addition, it is preferable that the nitrobenzene compound or its salt according to the present invention exists in a nonionic state under the condition of pH 7.4 (preferably pH 7.0 to 8.0) which is an in vivo environment. . A compound that satisfies such conditions is particularly useful as a fluorescent probe used for living cells as described below, because it is particularly excellent in cell membrane permeability.
一般式（１）で表される本発明の化合物は、例えば、従来公知の文献（Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ． ２００８， １３０（４４）：１４５３３−１４５４３（非特許文献１））に記載の手法を参照しつつ、合成することが可能である。また、本明細書の実施例の欄には、一般式（１）で表される本発明の化合物に包含される代表的化合物についての製造方法が具体的に示されており、当業者は本明細書の開示を参照し、また、必要に応じて本願出願時の技術常識を参酌することで出発原料や試薬、反応条件などを適宜選択することにより、一般式（１）に包含される任意の化合物を容易に製造することができる。 For the compound of the present invention represented by the general formula (1), for example, refer to the method described in a conventionally known document (J Am Chem Soc. 2008, 130 (44): 14533-14543 (Non-Patent Document 1)). It is possible to synthesize while performing. In addition, the column of Examples in the present specification specifically shows a production method for a representative compound included in the compound of the present invention represented by the general formula (1), and those skilled in the art The starting materials, reagents, reaction conditions, and the like are appropriately selected by referring to the disclosure in the specification and, if necessary, by taking into consideration the technical common sense at the time of filing the present application, so that any of the general formula (1) is included. Can be easily produced.
一般式（１）で表される本発明の化合物は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐ１測定用の蛍光プローブとして使用することができる。本発明の化合物は、中性領域（例えばｐＨ５〜９の範囲）では実質的に無蛍光である。一方、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐ１の存在下では、本発明の化合物におけるベンゼン環（の２位または４位）に結合しているニトロ基（−ＮＯ２基）が脱離するとともにこの位置がグルタチオン化され、強蛍光性の化合物となる。例えば、一般式（１）で表される化合物またはその塩は、中性領域において例えば４９０ｎｍ程度の励起光を照射した場合にはほとんど蛍光を発しないが、上記のようにグルタチオン化された化合物は同じ条件下において極めて強い蛍光（例えば、蛍光波長５１０ｎｍ）を発する性質を有している。そして、この反応はＧＳＴＰ１のみに対して選択的に起こり、他のＧＳＴ分子種が存在してもこの反応は進行しない。したがって、本発明の化合物をＧＳＴＰ１測定用の蛍光プローブとして使用することにより、ＧＳＴＰ１の存在を、蛍光強度の変化に基づいて選択的に測定することが可能になる。なお、一般に「蛍光プローブ」とは、特定のタンパク質、細胞、または組織などに特異的に結合または分布して蛍光を発することにより、特定のタンパク質、細胞、または組織の観察を容易にすることができる物質を意味する。通常、「蛍光プローブ」といった場合は、その物質自体が蛍光を発する物質をいうが、本発明では、それ自体蛍光を発しないが、分解などにより蛍光を発するようになる前駆物質もまた、「蛍光プローブ」の概念に含まれるものとする。The compound of the present invention represented by the general formula (1) can be used as a fluorescent probe for measuring glutathione-S-transferase (GST) P1. The compounds of the present invention are substantially non-fluorescent in the neutral region (eg, in the range of pH 5-9). On the other hand, in the presence of reduced glutathione (GSH) and glutathione-S-transferase (GST) P1, a nitro group (—NO 2 group) bonded to (the 2- or 4-position of) the benzene ring in the compound of the present invention. ) Is released and this position is converted to glutathione, resulting in a strong fluorescent compound. For example, the compound represented by the general formula (1) or a salt thereof hardly emits fluorescence when irradiated with excitation light of, for example, about 490 nm in a neutral region. Under the same conditions, it has a property of emitting extremely strong fluorescence (for example, a fluorescence wavelength of 510 nm). This reaction occurs selectively only for GSTP1, and does not proceed even if other GST molecular species are present. Therefore, by using the compound of the present invention as a fluorescent probe for GSTP1 measurement, the presence of GSTP1 can be selectively measured based on a change in fluorescence intensity. In general, a “fluorescent probe” is a substance that specifically binds or distributes to a specific protein, cell, or tissue to emit fluorescence, thereby facilitating observation of a specific protein, cell, or tissue. Means a substance that can be made. In general, the term "fluorescent probe" refers to a substance that itself emits fluorescence. In the present invention, a precursor that does not emit fluorescence by itself but emits fluorescence by decomposition or the like is also referred to as a "fluorescent probe". It is included in the concept of “probe”.
ここで、ＧＳＴＰ１は、前立腺がんを除くほぼ全てのがん細胞で過剰発現していることが知られている。このため、本発明に係るＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブを用いてＧＳＴＰ１の過剰発現を捉えることにより、がん細胞を検出することが可能である。例えば、ＧＳＴＰ１の活性を検出可能な本発明に係る蛍光プローブを生検組織に塗布することでＧＳＴＰ１活性を指標としたがんの有無の評価が可能である。すなわち、本発明に係るＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブは、がん細胞検出用のプローブとして利用可能であり、がん細胞またはがん組織の検出用組成物のほか、がん診断用組成物やがん診断用キットにおいて、さらにはがんの検出、判定、または診断方法においても使用することができる。なお、がんの検出、判定、または診断方法はｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる方法であってもよいし、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行われる方法であってもよい。 Here, it is known that GSTP1 is overexpressed in almost all cancer cells except prostate cancer. Therefore, cancer cells can be detected by capturing the overexpression of GSTP1 using the fluorescent probe for measuring GSTP1 according to the present invention. For example, by applying a fluorescent probe according to the present invention capable of detecting the activity of GSTP1 to a biopsy tissue, the presence or absence of cancer can be evaluated using the GSTP1 activity as an index. That is, the fluorescent probe for measuring GSTP1 according to the present invention can be used as a probe for detecting cancer cells, and in addition to a composition for detecting cancer cells or cancer tissues, a composition for cancer diagnosis or cancer. It can be used in a diagnostic kit and also in a method for detecting, determining or diagnosing cancer. The method for detecting, determining, or diagnosing cancer may be a method performed in vitro, or may be a method performed ex vivo or in vivo.
本発明に係る化合物、蛍光プローブ、または検出もしくは診断用組成物は、プレパラート、ガラスボトムディッシュやスライドガラス、マルチウェルプレートなど、生体イメージングの手法において一般的に用いられる観察容器に保持した生体試料に対して作用させることができるが、国際公開第２０１１／１４９０３２号パンフレットなどに記載の生体試料固定装置に保持した生体試料に対して作用させることもできる。すなわち、本発明の他の形態によれば、本発明に係る化合物、蛍光プローブまたは検出もしくは診断用組成物、並びに生体試料固定装置を含むがん診断用キットが提供される。保持された生体試料に対して、本発明に係る化合物、蛍光プローブ、あるいは検出もしくは診断用組成物、またはその溶液を加えることにより接触させ、所定の時間インキュベートした後に、蛍光顕微鏡やマイクロプレートリーダーを用いて励起光を生体試料に照射し、生じた蛍光を検出することができ、これを通じて蛍光を発する細胞をがん細胞と判定することができる。本発明では、試料の取得の容易性の観点から、生体試料の好ましい一例は血液であり、この場合において好ましくは、血液から得られた細胞群である。がんを患う患者から採取された血液の細胞群には、大量の血球細胞および少数のがん細胞が含まれているが、本発明に係る化合物、蛍光プローブ、または検出もしくは診断用組成物を用いることにより、大量の細胞の中からがん細胞を精度よく検出することが可能になる。これにより、被験者の血液細胞中にがん細胞が存在した場合には、当該被験者ががんを患っていると判定または診断することができる。別法では、インキュベート後に、フローサイトメトリーや蛍光顕微鏡による画像取得とそれに続くマイクロピペットによる細胞分取技法を用いて、がん細胞数の計測およびがん細胞の取得を行うこともできる。被験者の血液細胞中のがん細胞数を計測することにより、ＣＴなどの画像診断では発見不可能な微小な固形がんの存在を診断することが可能となり、これによりがんの早期診断も可能になる。さらに、被験者の所定体積の血液中の血液細胞におけるがん細胞数を一定期間ごとに計測することにより、被験者に対する外科手術、放射線治療などによる局所治療、または化学療法などによる全身治療、または分子標的薬の投与などによる治療の効果を判定することが可能となる。また、被験者の血液細胞中のがん細胞を検出後、取得することにより、がん細胞に対して別途解析手法を適用することが可能となり、遺伝子解析、発現解析、局在解析などの性状解析が可能となる。なお、生体試料の由来は血液に特に制限されず、血液以外の生体由来の試料であってもよいし、非生体由来の試料であってもよい。血液以外の生体由来の試料の種類は特に制限されないが、例えば、リンパ液、髄液その他の体液；細胞抽出物（ホモジネート）などが挙げられる。 The compound according to the present invention, a fluorescent probe, or a composition for detection or diagnosis is prepared in a biological sample held in an observation container generally used in a biological imaging technique, such as a preparation, a glass bottom dish, a slide glass, and a multiwell plate. Although it can act on the biological sample held in the biological sample fixing device described in WO 2011/149032 or the like, it can also act on the biological sample. That is, according to another aspect of the present invention, there is provided a cancer diagnostic kit including the compound according to the present invention, a fluorescent probe or a composition for detection or diagnosis, and a biological sample fixing device. The compound according to the present invention, a fluorescent probe, or a composition for detection or diagnosis, or a solution thereof is brought into contact with the retained biological sample by adding the solution, and after incubating for a predetermined time, a fluorescence microscope or a microplate reader is used. It can be used to irradiate a biological sample with excitation light and detect the generated fluorescence, through which cells that emit fluorescence can be determined as cancer cells. In the present invention, from the viewpoint of easy sample acquisition, a preferred example of the biological sample is blood, and in this case, a group of cells obtained from blood is preferred. The cell group of blood collected from a patient suffering from cancer contains a large amount of blood cells and a small number of cancer cells, but the compound according to the present invention, a fluorescent probe, or a composition for detection or diagnosis. By using it, cancer cells can be accurately detected from a large number of cells. Thus, when cancer cells are present in the blood cells of the subject, it can be determined or diagnosed that the subject has cancer. Alternatively, after the incubation, the number of cancer cells can be counted and the cancer cells can be obtained by using flow cytometry or fluorescence microscopy followed by image collection using a micropipette. By measuring the number of cancer cells in the blood cells of a subject, it is possible to diagnose the presence of minute solid cancers that cannot be detected by CT or other image diagnostics, thereby enabling early diagnosis of cancer become. In addition, by measuring the number of cancer cells in the blood cells in a predetermined volume of blood of the subject at regular intervals, surgery on the subject, local treatment such as radiation treatment, or systemic treatment such as chemotherapy, or molecular target It is possible to determine the effect of treatment by administration of a drug or the like. In addition, by detecting and obtaining cancer cells in the blood cells of a subject, it becomes possible to apply analysis methods separately to cancer cells, and to analyze properties such as gene analysis, expression analysis, and localization analysis Becomes possible. The origin of the biological sample is not particularly limited to blood, and may be a biological sample other than blood or a non-biological sample. The type of the sample derived from a living body other than blood is not particularly limited, and examples thereof include lymph fluid, cerebrospinal fluid, and other body fluids; and cell extracts (homogenates).
本発明に係るがん細胞またはがん組織の検出用組成物、並びにがん診断用組成物は、生体イメージングの他に、手術または検査において、手術もしくは検査前または手術もしくは検査中に本発明に係るがん細胞またはがん組織の検出用組成物を非経口投与することにより適用するか、または肉眼下または鏡視下における手術野の一部または全体に本発明に係る組成物を噴霧、塗布または注入などの方法により適用し、数十秒から数分後に励起光を適用部位に照射することにより、がん細胞またはがん組織を検出するために用いられてもよい。本発明に係る検出用または診断用組成物が適用された部位にがん組織が含まれる場合には、その組織が蛍光を発することから、その蛍光を発している部位ががん組織であると特定することができ、そこを含めた周囲組織と共に切除をすることが可能になる。ここで、「手術」とは、例えば開創を伴う開頭手術、開胸手術、もしくは開腹手術、または皮膚手術などのほか、胃内視鏡、大腸内視鏡、腹腔鏡、または胸腔鏡などの鏡視下手術などを含めて、がんの治療のために適用される任意の手術を包含する。これにより、がんを切除する外科治療において、がんの形態や触覚に頼って決定されていたがん組織の範囲を、より明確に精度良く決定することができ、切除範囲の確定が容易になる。また、「検査」の用語は、胃内視鏡や大腸内視鏡などの内視鏡を用いた検査、および検査に伴う切除や採取などの処置のほか、生体から分離・採取された組織に対して行う検査などを包含する。内視鏡を用いた検査に用いた場合、がん組織が蛍光を発することにより、がん組織の特定が極めて容易になる。内視鏡検査においてがん組織が確認できた場合には、その組織について検査切除や治療的な切除を行うこともできる。手術や検査といった用語は最も広義に解釈しなければならず、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。 The composition for detecting a cancer cell or cancer tissue according to the present invention, and the composition for diagnosing cancer, according to the present invention, in addition to biological imaging, in surgery or examination, before surgery or examination, or during surgery or examination. The composition for detecting cancer cells or cancer tissues is applied by parenteral administration, or the composition according to the present invention is sprayed or applied to a part or the whole of a surgical field under the naked eye or under the microscope. Alternatively, it may be used for detecting cancer cells or cancer tissues by applying the method by injection or the like and irradiating the application site with excitation light after several tens of seconds to several minutes. When the detection or diagnostic composition according to the present invention contains a cancer tissue at the site to which the composition is applied, the tissue emits fluorescence, so that the site emitting the fluorescence is a cancer tissue. It can be identified and the resection can be performed together with the surrounding tissue including the same. Here, the term “surgery” refers to, for example, craniotomy surgery with a wound, thoracotomy surgery, or laparotomy surgery, or skin surgery, as well as gastroscopy, colonoscopy, laparoscopy, or thoracoscopy. Includes any surgery applied for the treatment of cancer, including paroscopy and the like. As a result, in surgical treatment to remove the cancer, the range of the cancer tissue that had been determined based on the form and touch of the cancer can be more clearly and accurately determined, and the removal range can be easily determined. Become. In addition, the term `` examination '' refers to examinations using endoscopy such as gastroscopy and colonoscopy, procedures such as resection and collection accompanying the examination, and tissues separated and collected from the living body. Inspections and the like. When used in an examination using an endoscope, the cancer tissue emits fluorescence, which makes it extremely easy to identify the cancer tissue. If endoscopic examination reveals cancerous tissue, the tissue can be subjected to laboratory resection or therapeutic resection. Terms such as surgery and examination must be interpreted in the broadest sense and not in any way restrictive.
本発明に係るがん細胞またはがん組織の検出用組成物、並びにがん診断用組成物の適用濃度は、特に限定されないが、がん組織の存在が疑われる組織に対して、例えば、１〜１０００μＭ程度の濃度の溶液を適用することができる。組成物のｐＨについては、例えばｐＨ７．０〜７．５の範囲で使用することが好ましい。本発明の検出用組成物及び診断用組成物としては、上述した本発明に係る化合物（またはその塩）をそのまま用いてもよいが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合してもよい。例えば生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、一般的には粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒、錠剤、液剤など任意の形態の組成物として提供されるが、使用時に注射用滅菌水や、適宜の緩衝液に溶解して適用すればよい。 The application concentration of the composition for detecting a cancer cell or cancer tissue according to the present invention and the composition for cancer diagnosis are not particularly limited. A solution having a concentration of about 1000 μM can be applied. As for the pH of the composition, it is preferable to use, for example, in the range of pH 7.0 to 7.5. As the composition for detection and the composition for diagnosis of the present invention, the above-mentioned compound according to the present invention (or a salt thereof) may be used as it is, but if necessary, additives usually used for preparation of reagents may be used. You may mix. For example, as an additive for using the reagent in a physiological environment, additives such as a solubilizing agent, a pH adjuster, a buffer, and an isotonic agent can be used, and the amount of these can be appropriately selected by those skilled in the art. It is. These compositions are generally provided as a composition in any form such as a mixture in the form of a powder, a lyophilized product, granules, tablets, and a liquid preparation, and are used at the time of use in sterile water for injection or an appropriate buffer. What is necessary is just to melt | dissolve and apply.
本発明の他の形態によれば、本発明に係る化合物、蛍光プローブ、または検出用もしくは診断用組成物を用いたがん細胞またはがん組織の検出方法が提供される。当該検出方法では、本発明に係る化合物、蛍光プローブ、または検出もしくは診断用組成物を、細胞または組織に適用し、適用後の細胞または組織に対して所定の励起光を照射することにより、細胞または組織における蛍光を検出することを含む。好ましくはかかる方法は、血液中におけるがん細胞を検出する方法であり、その場合、血液中の細胞は、プレパラートなどの観察容器に固定されていてもよいし、上で説明した生体試料固定装置により固定された診断チップであってもよい。一方で、このような検出方法を、生体の組織に適用して、手術時におけるがん組織の確定診断に用いることもできる。その場合の適用方法としては、細胞または組織に対して噴霧または塗布することにより適用してもよいし、注射や輸液により適用されてもよい。 According to another aspect of the present invention, there is provided a method for detecting a cancer cell or cancer tissue using the compound, the fluorescent probe, or the composition for detection or diagnosis according to the present invention. In the detection method, the compound according to the present invention, a fluorescent probe, or a composition for detection or diagnosis is applied to cells or tissues, and the cells or tissues after application are irradiated with a predetermined excitation light to obtain cells. Or detecting the fluorescence in the tissue. Preferably, such a method is a method for detecting cancer cells in blood, in which case the cells in blood may be fixed to an observation container such as a preparation, or the biological sample fixing device described above. The diagnostic chip may be fixed by the following. On the other hand, such a detection method can be applied to a living tissue to be used for definitive diagnosis of cancer tissue at the time of surgery. As an application method in that case, it may be applied by spraying or applying to cells or tissues, or may be applied by injection or infusion.
本発明のさらに他の形態によれば、本発明に係るがん細胞またはがん組織の検出方法を用いて、がんの切除領域を決定し、当該領域を切除する工程を含む、手術・治療方法に関してもよい。 According to yet another aspect of the present invention, there is provided a method for detecting a cancer cell or cancer tissue according to the present invention, comprising the steps of determining a resection region of a cancer, and resecting the region. The method is also good.
本発明に係るがん細胞の検出方法は、がんの判定または診断方法に用いることができる。すなわち、本発明に係るがん細胞の検出方法により、指標となる蛍光よりも高い蛍光が検出された場合に、がんが存在すると判定または診断することができる。ここで、判定方法とは、指標との比較をすることにより、医師をはじめとした医療従事者による判断を含まずに特定する方法をいう。例えば指標となる蛍光として、蛍光を有する細胞を選択することができ、この場合、蛍光を有する細胞が検出された場合に、対象ががんを有すると決定することができる。別の形態では、蛍光強度や蛍光を有する細胞の数を指標とすることにより、がんの重篤度を判定することもできる。 The method for detecting a cancer cell according to the present invention can be used for a method for determining or diagnosing cancer. That is, when the cancer cell detection method according to the present invention detects fluorescence higher than the fluorescence serving as an indicator, it can be determined or diagnosed that cancer exists. Here, the determination method refers to a method of specifying an index by comparing with an index without including a determination by a medical professional such as a doctor. For example, a cell having fluorescence can be selected as the indicator fluorescence. In this case, when the cell having fluorescence is detected, it can be determined that the subject has cancer. In another embodiment, the severity of cancer can be determined by using the fluorescence intensity or the number of cells having fluorescence as an index.
本明細書において、「がん組織」の用語はがん細胞を含む任意の組織を意味している。「組織」の用語は、臓器の一部または全体を含めて最も広義に解釈することができ、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。本発明に係るがん診断薬は、がん組織において特異的に強発現しているＧＳＴＰ１の活性を検出する作用を有していることから、がん組織の中でも、ＧＳＴＰ１を高発現している組織が好ましく、このようながん組織は、前立腺がんの組織を除くほとんどのがん組織である。がんの例としては、例えば、大腸がん、乳がん、肺がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆道がん、脾臓がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん、卵巣がん、精巣がん、甲状腺がん、膵臓がん、脳腫瘍、造血器腫瘍などが挙げられるが、これらのがん種に限定されることを意図するものではない。また、後述する実施例の欄において実証されているように、本発明に係る蛍光プローブを用いることで、ＧＳＴＰ１遺伝子のプロモーター領域の脱メチル化に基づくＧＳＴＰ１タンパク質発現の有無を検出することが可能である。ここで、正常上皮細胞においてはＧＳＴＰ１が発現しているが、がん化によってＧＳＴＰ１遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧ部分がメチル化されることでＧＳＴＰ１の発現が見られなくなることが知られている。したがって、本発明に係る蛍光プローブをそのような系へ適用することができれば、蛍光の有無を指標として、前立腺がん細胞（ＧＳＴＰ１が過剰発現していない）の検出を行うことも可能である。 As used herein, the term “cancer tissue” refers to any tissue including cancer cells. The term "tissue" can be interpreted in the broadest sense, including part or all of an organ, and should not be interpreted in any way as limiting. Since the cancer diagnostic agent according to the present invention has an activity of detecting the activity of GSTP1 that is specifically strongly expressed in cancer tissues, it also highly expresses GSTP1 in cancer tissues. Tissue is preferred and such cancerous tissue is most cancerous tissue except prostate cancerous tissue. Examples of cancer include, for example, colon cancer, breast cancer, lung cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer , Testicular cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, brain tumor, hematopoietic tumor, and the like, but are not intended to be limited to these cancer types. Further, as demonstrated in the Examples section described later, it is possible to detect the presence or absence of GSTP1 protein expression based on demethylation of the promoter region of the GSTP1 gene by using the fluorescent probe according to the present invention. is there. Here, although GSTP1 is expressed in normal epithelial cells, it is known that GSTP1 expression is not observed due to methylation of the CpG portion of the promoter region of the GSTP1 gene due to canceration. Therefore, if the fluorescent probe according to the present invention can be applied to such a system, it is possible to detect prostate cancer cells (GSTP1 is not overexpressed) using the presence or absence of fluorescence as an index.
以下、実施例を用いて本発明の好ましい実施形態についてより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲が下記の実施例によって限定されるわけではない。 Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the technical scope of the present invention is not limited to the following Examples.
［ＧＳＴＰ１選択的な基質の探索］
本実験では、ＧＳＴＰ１選択的な蛍光プローブを構築するにあたり、いくつかのニトロベンゼン誘導体を対象として、ＧＳＴＰ１選択的な基質を探索した。[Search for GSTP1 selective substrate]
In this experiment, in constructing a GSTP1-selective fluorescent probe, a GSTP1-selective substrate was searched for several nitrobenzene derivatives.
ここで、上述したようにヒトの細胞質型ＧＳＴにはＡｌｐｈａ、Ｍｕ、Ｐｉなど７種類のクラスが存在するが、本実験ではこれらのうち生体内の発現量が多く論文としても多くの報告があるＧＳＴＡ１、ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＰ１の３種類の細胞質型ＧＳＴを用いてアッセイを行うことにより、各種ニトロベンゼン誘導体のＧＳＴの基質としての反応性および選択性を評価した。非特許文献１では、ニトロベンゼン誘導体においてニトロ基（高い電子求引性を有する）がグルタチオン（弱い電子供与性を有する）へと置換されると吸収スペクトルが大きく変化することを利用して、アッセイを行っている。ここではまず、非特許文献１と同様の手法を用いて、非特許文献１で提案されているＧＳＴ活性検出蛍光プローブ（ＤＮＡＴ−Ｍｅ）のＧＳＴ基質部位である以下の化合物（Ａ）（３，４−ジニトロベンズアニリド（３，４−ＮＮＢＡ））を基準物質として合成した。また、合成原料を変更することにより、化合物（Ａ）と同様の手法により以下の化合物（Ｂ）〜（Ｇ）を合成した。 Here, as described above, there are seven classes of human cytoplasmic GST such as Alpha, Mu, and Pi, but in this experiment, the expression level in vivo is large among these, and there are many reports as papers. Assays were performed using three types of cytoplasmic GSTs, GSTA1, GSTM1, and GSTP1, to evaluate the reactivity and selectivity of various nitrobenzene derivatives as GST substrates. Non-Patent Document 1 describes an assay that utilizes the fact that when a nitro group (having a high electron-withdrawing property) is replaced with glutathione (having a weak electron-donating property) in a nitrobenzene derivative, the absorption spectrum changes significantly. Is going. Here, first, the following compound (A) (3, which is the GST substrate site of the GST activity detecting fluorescent probe (DNAT-Me) proposed in Non-Patent Document 1, It was synthesized using 4-dinitrobenzanilide (3,4-NNBA)) as a reference substance. The following compounds (B) to (G) were synthesized in the same manner as for compound (A) by changing the synthesis raw materials.
なお、ここでは、安息香酸誘導体を出発物質とした、化合物（Ｆ）の合成スキーム（下記の反応スキーム１）、化合物（Ｇ）の合成スキーム（下記の反応スキーム２）、および化合物（Ｄ）の合成スキーム（下記の反応スキーム３）について説明する。その後、化合物（Ｂ）および化合物（Ｃ）の合成方法についても、説明する。 Here, a synthesis scheme of compound (F) (reaction scheme 1 below), a synthesis scheme of compound (G) (reaction scheme 2 below), and a compound (D) starting from a benzoic acid derivative as a starting material. The synthesis scheme (reaction scheme 3 below) is described. Thereafter, a method for synthesizing the compound (B) and the compound (C) will also be described.
［反応スキーム１］ [Reaction Scheme 1]
（化合物（ａ）の合成；５−メチルチオ−２−ニトロ安息香酸）
５−フルオロ−２−ニトロ安息香酸（３０５ｍｇ，１．７ｍｍｏｌ），ナトリウムメタンチオラート（６２０ｍｇ，８．８ｍｍｏｌ）をイソプロパノール（１０ｍＬ）に懸濁し、室温で３０分間撹拌した。反応溶液に１Ｎ ＨＣｌを加えて反応を止め、酢酸エチルで分液し、１Ｎ ＨＣｌで２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。酢酸エチル−ヘキサンで再結晶させて、目的化合物を得た（２４６ｍｇ，収率７０％）。(Synthesis of compound (a); 5-methylthio-2-nitrobenzoic acid)
5-Fluoro-2-nitrobenzoic acid (305 mg, 1.7 mmol) and sodium methanethiolate (620 mg, 8.8 mmol) were suspended in isopropanol (10 mL) and stirred at room temperature for 30 minutes. 1N HCl was added to the reaction solution to stop the reaction, liquid separation was performed with ethyl acetate, and the mixture was washed twice with 1N HCl and once with saturated saline. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. The target compound was obtained by recrystallization from ethyl acetate-hexane (246 mg, yield 70%).
（化合物（ａ）の機器データ）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ６）δ：７．９６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５，１．６Ｈｚ），７．５８−７．５６（２Ｈ，ｍ），２．６５（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ６）δ：１６６．５，１４８．５，１４５．１，１３０．０，１２７．９，１２５．９，１２５．４，１４．７。(Instrument data of compound (a))
1 H-NMR (400 MHz, Acetone-d 6 ) δ: 7.96 (1H, dd, J = 7.5, 1.6 Hz), 7.58-7.56 (2H, m), 2.65 ( 3H, s)
13 C-NMR (100MHz, Acetone -d 6) δ: 166.5,148.5,145.1,130.0,127.9,125.9,125.4,14.7.
（化合物（ｂ）の合成；５−メシル−２−ニトロ安息香酸）
５−メチルチオ−２−ニトロ安息香酸（ａ）（９７ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ），３０％ Ｈ２Ｏ２（４ｍＬ，３９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４ｍＬ）に懸濁し、泡が出るまでリン酸三カリウムを加え、室温で２０分間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加え、１Ｎ ＨＣｌで２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。酢酸エチル−ヘキサンで再結晶させて、目的化合物を得た（７９ｍｇ，収率６８％）。(Synthesis of compound (b); 5-mesyl-2-nitrobenzoic acid)
5-Methylthio-2-nitrobenzoic acid (a) (97 mg, 0.47 mmol) and 30% H 2 O 2 (4 mL, 39 mmol) were suspended in acetonitrile (4 mL), and tripotassium phosphate was added until bubbles appeared. And stirred at room temperature for 20 minutes. Ethyl acetate was added to the reaction solution, and the mixture was washed twice with 1N HCl and once with saturated saline. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. The target compound was obtained by recrystallization from ethyl acetate-hexane (79 mg, yield 68%).
（化合物（ｂ）の機器データ）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ６）δ：８．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），８．３８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．１Ｈｚ），８．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），３．３２（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ６）δ：１６４．３，１５２．９，１４５．５，１３３．０，１３０．７，１２８．０，１２５．９，４３．９
ＬＲＭＳ（ＥＩ＋）；２４６。(Equipment data of compound (b))
1 H-NMR (400 MHz, Acetone-d 6 ) δ: 8.47 (1 H, d, J = 2.3 Hz), 8.38 (1 H, dd, J = 8.5, 2.1 Hz), 8. 20 (1H, d, J = 8.2 Hz), 3.32 (3H, s)
13 C-NMR (100 MHz, Acetone-d 6 ) δ: 164.3, 152.9, 145.5, 133.0, 130.7, 128.0, 125.9, 43.9
LRMS (EI <+> );
（化合物（Ｆ）の合成；５−メシル−２−ニトロ安息香酸アニリド）
５−メシル−２−ニトロ安息香酸（ｂ）（２７ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ），ＷＳＣＤ・ＨＣｌ（５０ｍｇ，０．２６ｍｍｏｌ），アニリン（１５．２μＬ，０．１７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５ｍＬ）に懸濁し、室温で１５分間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加え、０．１Ｎ ＨＣｌで２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。酢酸エチル−ヘキサンで再結晶させて、目的化合物を得た（２１ｍｇ，収率５８％）。(Synthesis of Compound (F); 5-Mesyl-2-nitrobenzoic acid anilide)
5-Mesyl-2-nitrobenzoic acid (b) (27 mg, 0.11 mmol), WSCD.HCl (50 mg, 0.26 mmol), and aniline (15.2 μL, 0.17 mmol) were suspended in acetonitrile (5 mL). Stirred at room temperature for 15 minutes. Ethyl acetate was added to the reaction solution, and the mixture was washed twice with 0.1N HCl and once with saturated saline. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. The target compound was obtained by recrystallization from ethyl acetate-hexane (21 mg, yield 58%).
（化合物（Ｆ）の機器データ）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ６）δ：８．３６−８．２９（３Ｈ，ｍ），７．７４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．３８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．１６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），３．３２（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ６）δ：１６３．２，１５１．１，１４６．１，１３９．５，１３４．３，１３０．９，１２９．７，１２９．１，１２６．４，１２５．３，１２０．７，４３．８
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１４Ｈ１２Ｎ２Ｏ５ＳＮａ［Ｍ＋Ｎａ］＋：３２３．０３６７，ｆｏｕｎｄ：３４３．０３６７（＋０．０ｍｍｕ）。(Equipment data of compound (F))
1 H-NMR (400 MHz, Acetone-d 6 ) δ: 8.36-8.29 (3H, m), 7.74 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.38 (2H, t, J = 7.5 Hz), 7.16 (2H, t, J = 7.3 Hz), 3.32 (3H, s)
13 C-NMR (100 MHz, Acetone-d 6 ) δ: 163.2, 151.1, 146.1, 139.5, 134.3, 130.9, 129.7, 129.1, 126.4. 125.3, 120.7, 43.8
HRMS (ESI-TOF) m / z calcd for C 14 H 12 N 2 O 5 SNa [M + Na] +: 323.0367, found: 343.0367 (+ 0.0mmu).
（化合物（ｃ）の合成；５−メシル−２−メチルチオ安息香酸アニリド）
５−メシル−２−ニトロ安息香酸アニリド（Ｆ）（４６ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ），ナトリウムメタンチオラート（１００ｍｇ，１．４ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（５ｍＬ）に懸濁し、室温で１０分間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加え、１Ｎ ＨＣｌで２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。酢酸エチル−ヘキサンで再結晶させて、目的化合物を得た（３４ｍｇ，収率７３％）。(Synthesis of Compound (c); 5-Mesyl-2-methylthiobenzoic acid anilide)
5-Mesyl-2-nitrobenzoic acid anilide (F) (46 mg, 0.14 mmol) and sodium methanethiolate (100 mg, 1.4 mmol) were suspended in dimethyl sulfoxide (5 mL) and stirred at room temperature for 10 minutes. Ethyl acetate was added to the reaction solution, and the mixture was washed twice with 1N HCl and once with saturated saline. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. Recrystallization from ethyl acetate-hexane gave the target compound (34 mg, yield 73%).
（化合物（ｃ）の機器データ）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），７．９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８Ｈｚ），７．６９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．３６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３），３．２５（３Ｈ，ｓ），２．５２（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１６４．８，１４５．５，１３８．７，１３６．１，１３５．１，１２８．８，１２８．４，１２５．９，１２５．６，１２４．０，１１９．９，４３．６，１４．８
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１５Ｈ１５ＮＯ３Ｓ２Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋：３４４．０３９１，ｆｏｕｎｄ：３４４．０３９３（＋０．２ｍｍｕ）。(Equipment data of compound (c))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.98 (1 H, d, J = 1.8 Hz), 7.95 (1 H, dd, J = 8.2, 1.8 Hz), 7.69 ( 2H, d, J = 7.8 Hz), 7.62 (1H, d, J = 8.7 Hz), 7.36 (2H, t, J = 8.0 Hz), 7.12 (1H, t, J) = 7.3), 3.25 (3H, s), 2.52 (3H, s)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 164.8, 145.5, 138.7, 136.1, 135.1, 128.8, 128.4, 125.9, 125.6, 124.0, 119.9, 43.6, 14.8
HRMS (ESI-TOF) m / z calcd for C 15 H 15 NO 3 S 2 Na [M + Na] +: 344.0391, found: 344.0393 (+ 0.2mmu).
［反応スキーム２］ [Reaction Scheme 2]
（化合物（ｄ）の合成；２−メチルチオ−５−ニトロ安息香酸）
２−フルオロ−５−ニトロ安息香酸（２３５ｍｇ，１．３ｍｍｏｌ）とナトリウムメタンチオラート（４５０ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）をイソプロパノール（６ｍＬ）に懸濁し、室温で１時間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加え、１Ｎ ＨＣｌで２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。酢酸エチル−ヘキサンで再結晶させて、目的化合物を得た（１７３ｍｇ，収率６４％）。(Synthesis of compound (d); 2-methylthio-5-nitrobenzoic acid)
2-Fluoro-5-nitrobenzoic acid (235 mg, 1.3 mmol) and sodium methanethiolate (450 mg, 0.42 mmol) were suspended in isopropanol (6 mL) and stirred at room temperature for 1 hour. Ethyl acetate was added to the reaction solution, and the mixture was washed twice with 1N HCl and once with saturated saline. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. The target compound was obtained by recrystallization from ethyl acetate-hexane (173 mg, yield 64%).
（化合物（ｄ）の機器データ）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ６）δ：７．９６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５，１．６Ｈｚ），７．５８−７．５６（２Ｈ，ｍ），２．６５（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ６）δ：１６６．５，１４８．５，１４５．１，１３０．０，１２７．９，１２５．９，１２５．４，１４．７。(Instrument data of compound (d))
1 H-NMR (400 MHz, Acetone-d 6 ) δ: 7.96 (1H, dd, J = 7.5, 1.6 Hz), 7.58-7.56 (2H, m), 2.65 ( 3H, s)
13 C-NMR (100MHz, Acetone -d 6) δ: 166.5,148.5,145.1,130.0,127.9,125.9,125.4,14.7.
（化合物（ｅ）の合成；２−メチルスルフィニル−５−ニトロ安息香酸）
２−メチルスルチオ−５−ニトロ安息香酸（ｄ）（９７ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ），３０％Ｈ２Ｏ２（４ｍＬ，３９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１ｍＬ）に懸濁し、泡が出るまでリン酸三カリウムを加え、室温で３０分間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加え、１Ｎ ＨＣｌで２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。酢酸エチル−ヘキサンで再結晶させて、目的化合物を得た（３３ｍｇ，収率２９％）。(Synthesis of compound (e); 2-methylsulfinyl-5-nitrobenzoic acid)
2 Mechirusuruchio 5-nitrobenzoic acid (d) (97mg, 0.47mmol) , 30% H 2 O 2 and (4 mL, 39 mmol) was suspended in acetonitrile (1 mL), tripotassium phosphate added until the foam comes out And stirred at room temperature for 30 minutes. Ethyl acetate was added to the reaction solution, and the mixture was washed twice with 1N HCl and once with saturated saline. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. Recrystallization from ethyl acetate-hexane gave the target compound (33 mg, 29% yield).
（化合物（ｅ）の機器データ）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：８．６９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．５Ｈｚ），８．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），８．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），２．８２（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１６５．０，１５７．５，１４８．６，１２９．１，１２７．９，１２５．８，１２５．２，４３．７。(Equipment data of compound (e))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 8.69 (1 H, dd, J = 8.5, 2.5 Hz), 8.65 (1 H, d, J = 2.7 Hz), 8. 35 (1H, d, J = 8.7 Hz), 2.82 (3H, s)
13 C-NMR (100MHz, DMSO -d 6) δ: 165.0,157.5,148.6,129.1,127.9,125.8,125.2,43.7.
（化合物（Ｇ）の合成；２−メチルスルフィニル−５−ニトロ安息香酸アニリド）
２−メチルスルフィニル−５−ニトロ安息香酸（ｅ）（１６．９ｍｇ，０．０６９ｍｍｏｌ），ＷＳＣＤ・ＨＣｌ（３９．９ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ），アニリン（９．３９μＬ，０．１０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４ｍＬ）に懸濁し、室温で１０分間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加え、０．１Ｎ ＨＣｌで２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。酢酸エチル−ヘキサンで再結晶させて、目的化合物を得た（１１ｍｇ，収率４９％）。(Synthesis of compound (G); 2-methylsulfinyl-5-nitrobenzoic acid anilide)
2-methylsulfinyl-5-nitrobenzoic acid (e) (16.9 mg, 0.069 mmol), WSCD.HCl (39.9 mg, 0.21 mmol), aniline (9.39 μL, 0.10 mmol) were added to acetonitrile (4 mL). ) And stirred at room temperature for 10 minutes. Ethyl acetate was added to the reaction solution, and the mixture was washed twice with 0.1N HCl and once with saturated saline. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. Recrystallization from ethyl acetate-hexane gave the target compound (11 mg, yield 49%).
（化合物（Ｇ）の機器データ）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１０．８（１Ｈ，ｓ），８．５６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，２．３Ｈｚ），８．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），８．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．７２−７．６３（２Ｈ，ｍ），７．４３−７．３２（２Ｈ，ｍ），７．１８−７．１１（１Ｈ，ｍ），３．４８（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１６３．９，１５０．０，１４３．０，１３８．７，１３８．５，１３１．７，１２８．８，１２５．２，１２４．３，１２３．７，１２０．１，４４．８
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１４Ｈ１２Ｎ２Ｏ４ＳＮａ［Ｍ＋Ｎａ］＋：３２７．０４１５，ｆｏｕｎｄ：３２７．０４２３（＋０．８ｍｍｕ）。(Instrument data of compound (G))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 10.8 (1 H, s), 8.56 (1 H, dd, J = 8.2, 2.3 Hz), 8.53 (1 H, d, J = 1.8 Hz), 8.29 (1 H, d, J = 8.2 Hz), 7.72-7.63 (2H, m), 7.43-7.32 (2H, m), 7. 18-7.11 (1H, m), 3.48 (3H, s)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 163.9, 150.0, 143.0, 138.7, 138.5, 131.7, 128.8, 125.2, 124.3. 123.7, 120.1, 44.8
HRMS (ESI-TOF) m / z calcd for C 14 H 12 N 2 O 4 SNa [M + Na] +: 327.0415, found: 327.0423 (+ 0.8mmu).
［反応スキーム３］ [Reaction Scheme 3]
（化合物（ｆ）の合成；３−ブロモ−４−ニトロ安息香酸アニリド）
３−ブロモ−４−ニトロ安息香酸（２．１８ｇ，８．９ｍｍｏｌ）と触媒量のＤＭＦを塩化チオニル（１５ｍＬ）に懸濁し、３時間加熱還流した。トルエンを加え、余剰の塩化チオニルを留去した。残渣のジクロロメタン懸濁液（１０ｍＬ）に対して、アニリン（１．２５ｇ，１４ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（２．８ｇ，２８ｍｍｏｌ）の溶解したジクロロメタン（５ｍＬ）を、氷上で滴下し、室温で１時間撹拌した。反応を１Ｎ ＨＣｌで止め、ジクロロメタンを加えた。有機層を１Ｎ ＨＣｌで３回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ジクロロメタンを留去した。ジクロロメタン−ヘキサンで再結晶させて、目的化合物を得た（１．４７ｇ，収率５１％）。(Synthesis of compound (f); 3-bromo-4-nitrobenzoic acid anilide)
3-Bromo-4-nitrobenzoic acid (2.18 g, 8.9 mmol) and a catalytic amount of DMF were suspended in thionyl chloride (15 mL) and heated under reflux for 3 hours. Toluene was added and excess thionyl chloride was distilled off. To a dichloromethane suspension (10 mL) of the residue, dichloromethane (5 mL) in which aniline (1.25 g, 14 mmol) and triethylamine (2.8 g, 28 mmol) were dissolved was added dropwise on ice, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. . The reaction was quenched with 1N HCl and dichloromethane was added. The organic layer was washed three times with 1N HCl and once with saturated saline. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and dichloromethane was distilled off. The target compound was obtained by recrystallization from dichloromethane-hexane (1.47 g, yield: 51%).
（化合物（ｆ）の機器データ）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１０．５（１Ｈ，ｓ），８．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），８．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），８．１２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８Ｈｚ），７．７９−７．７２（２Ｈ，ｍ），７．４３−７．３３（２Ｈ，ｍ），７．１９−７．１０（１Ｈ，ｍ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１６２．５，１５１．１，１３９．３，１３８．５，１３３．６，１２８．７，１２８．６，１２５．５，１２４．３，１２０．５，１１３．０
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１３Ｈ１０ＢｒＮ２Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋：３２０．９８７５，ｆｏｕｎｄ：３２０．９８６５（−１．０ｍｍｕ）。(Instrument data of compound (f))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 10.5 (1 H, s), 8.42 (1 H, d, J = 1.8 Hz), 8.17 (1 H, d, J = 8. 2 Hz), 8.12 (1H, dd, J = 8.2, 1.8 Hz), 7.79-7.72 (2H, m), 7.43-7.33 (2H, m), 7. 19-7.10 (1H, m)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 162.5, 151.1, 139.3, 138.5, 133.6, 128.7, 128.6, 125.5, 124.3, 120.5, 113.0
HRMS (ESI-TOF) m / z calcd for C 13 H 10 BrN 2 O 3 [M + H] +: 320.9875, found: 320.9865 (-1.0mmu).
（化合物（Ｄ）の合成；３ーシアノ−４−ニトロ安息香酸アニリド）
３−ブロモ−４−ニトロ安息香酸アニリド（８０５ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）とシアン化ナトリウム（２９１ｍｇ，２．９ｍｍｏｌ）をＮ−メチルピロリドンに溶解させて、１５０℃で３．５時間撹拌した。反応溶液を室温まで冷却し、水を加えて沈殿を濾取した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン）で精製し、目的化合物を得た（５１８ｍｇ，収率７７％）。(Synthesis of Compound (D); 3-cyano-4-nitrobenzoic acid anilide)
3-Bromo-4-nitrobenzoic acid anilide (805 mg, 2.5 mmol) and sodium cyanide (291 mg, 2.9 mmol) were dissolved in N-methylpyrrolidone, and the mixture was stirred at 150 ° C for 3.5 hours. The reaction solution was cooled to room temperature, water was added, and the precipitate was collected by filtration. The residue was purified by silica gel column chromatography (dichloromethane) to obtain the desired compound (518 mg, yield: 77%).
（化合物（Ｄ）の機器データ）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１０．６６（１Ｈ，ｓ），８．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），８．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），８．４２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，１．８Ｈｚ），７．８０−７．７２，（２Ｈ，ｍ），７．４４−７．３５（２Ｈ，ｍ），７．２０−７．１０（１Ｈ，ｍ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ６）１６２．１，１４９．５，１４０．０，１３８．４，１３４．６，１３３．７，１２８．８，１２６．１，１２４．４，１２０．４，１１５．３，１０７．１
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１４Ｈ１０Ｎ３Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋：２６８．０７２２，ｆｏｕｎｄ：２６８．０７１４（−０．８ｍｍｕ）。(Instrument data of compound (D))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 10.66 (1 H, s), 8.66 (1 H, d, J = 1.8 Hz), 8.52 (1 H, d, J = 8. 7 Hz), 8.42 (1H, dd, J = 8.8, 1.8 Hz), 7.80-7.72, (2H, m), 7.44-7.35 (2H, m), 7 .20-7.10 (1H, m)
13 C-NMR (100MHz, Acetone -d 6) 162.1,149.5,140.0,138.4,134.6,133.7,128.8,126.1,124.4,120. 4,115.3,107.1
HRMS (ESI-TOF) m / z calcd for C 14 H 10 N 3 O 3 [M + H] +: 268.0722, found: 268.0714 (-0.8mmu).
（化合物（Ｂ）の合成；２，５−ジニトロ安息香酸アニリド）
２，５−ジニトロ安息香酸（４３ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ），ＷＳＣＤ・ＨＣｌ（８１ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ），アニリン（２２．４μＬ，０．２５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１ｍＬ）に懸濁し、室温で１時間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加え、１Ｎ ＨＣｌで３回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。酢酸エチル−ヘキサンで再沈殿させて、目的化合物を得た（２７ｍｇ，収率４５％）。(Synthesis of Compound (B); 2,5-dinitrobenzoic acid anilide)
2,5-Dinitrobenzoic acid (43 mg, 0.20 mmol), WSCD.HCl (81 mg, 0.42 mmol), and aniline (22.4 μL, 0.25 mmol) are suspended in acetonitrile (1 mL) and stirred at room temperature for 1 hour. did. Ethyl acetate was added to the reaction solution, and the mixture was washed three times with 1N HCl and once with saturated saline. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. The desired compound was obtained by reprecipitation with ethyl acetate-hexane (27 mg, yield: 45%).
（化合物（Ｂ）の機器データ）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１０．８９（１Ｈ，ｓ），８．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），８．５５（１Ｈ，ｍ，Ｊ＝８．７，２．３Ｈｚ），８．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ），７．６６−７．６４（２Ｈ，ｍ），７．４０−７．３６（２Ｈ，ｍ），７．１７−７．１５（１Ｈ，ｍ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１６１．７，１５０．１，１４９．３，１３８．４，１３３．２，１２８．９，１２６．３，１２６．２，１２４．６，１２４．４，１１９．９。(Instrument data of compound (B))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 10.89 (1 H, s), 8.62 (1 H, d, J = 2.3 Hz), 8.55 (1 H, m, J = 8. 7, 2.3 Hz), 8.36 (1H, d, J = 9.1 Hz), 7.66-7.64 (2H, m), 7.40-7.36 (2H, m), 7. 17-7.15 (1H, m)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 161.7, 150.1, 149.3, 138.4, 133.2, 128.9, 126.3, 126.2, 124.6. 124.4, 119.9.
（化合物（Ｃ）の合成；３−トリフルオロメチル−４-ニトロ安息香酸アニリド
３−トリフルオロメチル−４-ニトロ安息香酸（７８５ｍｇ，３．３ｍｍｏｌ）と触媒量のＤＭＦを塩化チオニル（３ｍＬ）に懸濁し、２時間加熱還流した。反応溶液を室温まで冷却し、トルエンを加えて余剰の塩化チオニルを共沸により留去した。残渣のジクロロメタン懸濁液（２ｍＬ）に対して、アニリン（３０５μＬ，３．３ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（９４０μＬ，６．６ｍｍｏｌ）の溶解したジクロロメタン（５ｍＬ）を、氷上で滴下し、室温で３０分間撹拌した。反応を１Ｎ ＨＣｌで止め、ジクロロメタンを加えた。有機層を１Ｎ ＨＣｌで３回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ジクロロメタンを留去した。ジクロロメタン−ヘキサンで再結晶させて、目的化合物を得た（６１３ｍｇ，収率５９％）。(Synthesis of compound (C); 3-trifluoromethyl-4-nitrobenzoic acid anilide 3-trifluoromethyl-4-nitrobenzoic acid (785 mg, 3.3 mmol) and a catalytic amount of DMF were added to thionyl chloride (3 mL). The reaction solution was cooled to room temperature, and excess thionyl chloride was distilled off by azeotropic distillation, and aniline (305 μL, 3.3 mmol) and dichloromethane (5 mL) in which triethylamine (940 μL, 6.6 mmol) were dissolved were added dropwise on ice, stirred at room temperature for 30 minutes, quenched with 1N HCl, and dichloromethane was added. The extract was washed with HCl three times and saturated saline once, and the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and dichloromethane was distilled off. Dichloromethane - was recrystallized with hexane to obtain the desired compound (613 mg, 59% yield).
（化合物（Ｃ）の機器データ）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１０．６７（１Ｈ，ｓ），８．５０（１Ｈ，ｍ，８．５０−８．４９），８．４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８Ｈｚ），８．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．７９−７．７１（２Ｈ，ｍ），７．４４−７．３４（２Ｈ，ｍ），７．２０−７．１１（１Ｈ，ｍ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１６３．０，１４９．２，１３９．５，１３９．０，１３４．４，１２９．３，１２７．９，１２６．３，１２４．９，１２３．８，１２２．０，１２１．７，１２１．１
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１４Ｈ１０Ｆ３Ｎ２Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋：３１１．０６４４，ｆｏｕｎｄ：３１１．０６３６（−０．８ｍｍｕ）。(Equipment data of compound (C))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 10.67 (1H, s), 8.50 (1H, m, 8.50-8.49), 8.46 (1H, dd, J = 8.2, 1.8 Hz), 8.33 (1H, d, J = 8.2 Hz), 7.79-7.71 (2H, m), 7.44-7.34 (2H, m), 7.20-7.11 (1H, m)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 163.0, 149.2, 139.5, 139.0, 134.4, 129.3, 127.9, 126.3, 124.9, 123.8, 122.0, 121.7, 121.1
HRMS (ESI-TOF) m / z calcd for C 14 H 10 F 3 N 2 O 3 [M + H] +: 311.0644, found: 311.0636 (-0.8mmu).
（ＧＳＴ存在下における吸収スペクトルの変化の測定）
次いで、上記で合成した７種類のニトロベンゼン誘導体（化合物（Ａ）〜（Ｇ））をそれぞれ、５．０μｇ／ｍＬの各ＧＳＴ分子種および１ｍＭ ＧＳＨの存在下、２５℃にて３０分間インキュベーションし、吸収スペクトルの変化を指標としたアッセイを行った。なお、本アッセイにおける各化合物の添加濃度は５０μＭとし、アッセイの溶媒としては１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ０．１％を共溶媒として含む）を用いた。また、吸収スペクトルの測定には、紫外・可視分光光度計（Ｖ−５５０、日本分光株式会社製）を用いた。(Measurement of change in absorption spectrum in the presence of GST)
Next, each of the seven nitrobenzene derivatives (compounds (A) to (G)) synthesized above was incubated at 25 ° C. for 30 minutes in the presence of 5.0 μg / mL of each GST molecular species and 1 mM GSH, An assay was performed using the change in the absorption spectrum as an index. The concentration of each compound added in this assay was 50 μM, and a 100 mM phosphate buffer (pH 7.4; containing 0.1% DMSO as a cosolvent) was used as a solvent for the assay. In addition, an ultraviolet / visible spectrophotometer (V-550, manufactured by JASCO Corporation) was used for the measurement of the absorption spectrum.
結果を図１Ａ〜図１Ｇに示す。なお、これらの図において、（Ａ）は各化合物の構造を示し、（Ｂ）は３０分間のインキュベーション終了時点における吸収スペクトルを示し、（Ｃ）は各化合物の吸収波長（各図に記載）における吸光度の時間変化を示すグラフである。また、各図の（Ｂ）において、「Ｂｅｆｏｒｅ」はＧＳＨおよびＧＳＴ添加前の吸収スペクトルであり、各図の（Ｂ）および（Ｃ）における「ＧＳＨ」並びに「ＧＳＴＡ１」「ＧＳＴＭ１」および「ＧＳＴＰ１」は、ＧＳＨのみを添加した系並びにＧＳＴＡ１、ＧＳＴＭ１およびＧＳＴＰ１のいずれかを添加した系の結果をそれぞれ示す。 The results are shown in FIGS. 1A to 1G. In these figures, (A) shows the structure of each compound, (B) shows the absorption spectrum at the end of the 30 minute incubation, and (C) shows the absorption wavelength of each compound (described in each figure). It is a graph which shows a time change of absorbance. Further, in (B) of each figure, “Before” is an absorption spectrum before addition of GSH and GST, and “GSH” and “GSTA1,” “GSTM1,” and “GSTP1” in (B) and (C) of each figure. Shows the results of the system to which only GSH was added and the system to which any of GSTA1, GSTM1, and GSTP1 was added.
図１Ａに示すように、化合物（Ａ）はＧＳＴの存在下において速やかに吸収スペクトルが変化したが、ＧＳＨのみが存在している酵素非存在下においても吸収スペクトルが変化した。また、ＧＳＴＰ１に対する選択性は示さなかった。 As shown in FIG. 1A, the absorption spectrum of the compound (A) rapidly changed in the presence of GST, but also changed in the absence of the enzyme containing only GSH. Also, no selectivity for GSTP1 was shown.
図１Ｂに示すように、化合物（Ａ）の位置異性体である化合物（Ｂ）は、ＧＳＨのみが存在している酵素非存在下における吸収スペクトル変化が遅いなど、化合物（Ａ）に比べて反応性の低下が見られたが、ＧＳＴ分子種の選択性の傾向に変化は見られなかった。 As shown in FIG. 1B, the compound (B), which is a positional isomer of the compound (A), has a slower absorption spectrum change in the absence of an enzyme in which only GSH is present, and has a lower reaction rate than the compound (A). However, there was no change in the selectivity of GST species.
図１Ｃに示すように、化合物（Ｃ）はＧＳＴの有無により吸収スペクトルの変化を示さなかった（図１Ｃの（Ｂ））。ここで、ＧＳＴが触媒する芳香族求核置換反応では反応中間体であるマイゼンハイマー錯体の形成が律速段階であると考えられている。また、トリフルオロメチル（ＣＦ３）基のハメット定数は０．５４であり、化合物（Ｄ）で用いられるシアノ基（０．６６）や化合物（Ｆ）で用いられるメシル基（０．７２）よりも小さい。このため、トリフルオロメチル基による反応中間体（マイゼンハイマー錯体）の安定化への寄与はシアノ基やメシル基よりも小さいため、グルタチオン化反応が進行しなかったものと考えられる。As shown in FIG. 1C, Compound (C) did not show a change in absorption spectrum depending on the presence or absence of GST ((B) in FIG. 1C). Here, in the aromatic nucleophilic substitution reaction catalyzed by GST, it is considered that the formation of the reaction intermediate Meisenheimer complex is the rate-determining step. The Hammett constant of the trifluoromethyl (CF 3 ) group is 0.54, which is higher than the cyano group (0.66) used in the compound (D) and the mesyl group (0.72) used in the compound (F). Is also small. For this reason, the contribution of the trifluoromethyl group to the stabilization of the reaction intermediate (Meizenheimer complex) is smaller than that of the cyano group or mesyl group, and it is considered that the glutathione reaction did not proceed.
図１Ｄに示すように、化合物（Ｄ）はＧＳＴＰ１存在下で２９０ｎｍの吸光度の急速な上昇を示した。これに対し、ＧＳＴＰ１存在下以外の条件では、吸光度は時間とともに低下した。この違いはそれぞれの条件において異なる生成物が生成していることを示唆している。 As shown in FIG. 1D, compound (D) showed a rapid increase in absorbance at 290 nm in the presence of GSTP1. On the other hand, under conditions other than the presence of GSTP1, the absorbance decreased with time. This difference suggests that different products are produced under each condition.
図１Ｅに示すように、化合物（Ｅ）はＧＳＴＰ１存在下で速やかに吸収スペクトルが変化した。一方、ＧＳＨとの反応による吸収の変化はほとんど見られなかった。 As shown in FIG. 1E, the absorption spectrum of compound (E) rapidly changed in the presence of GSTP1. On the other hand, almost no change in absorption due to the reaction with GSH was observed.
図１Ｆに示すように、化合物（Ｅ）の位置異性体である化合物（Ｆ）は、ＧＳＴＰ１存在下で速やかに吸収スペクトルが変化し、かつ、ＧＳＴＡ１またはＧＳＴＭ１の存在下では吸収スペクトルの変化を示さなかった。また、酵素非依存的なＧＳＨとの反応もまったく見られなかった。このように、化合物（Ｆ）はＧＳＴＰ１選択的な基質としてきわめて有望である。 As shown in FIG. 1F, compound (F), which is a regioisomer of compound (E), has a rapidly changing absorption spectrum in the presence of GSTP1, and shows a change in the absorption spectrum in the presence of GSTA1 or GSTM1. Did not. In addition, no enzyme-independent reaction with GSH was observed. Thus, compound (F) is very promising as a GSTP1-selective substrate.
図１Ｇに示すように、ベンゼン環の２位にメチルスルフィニル基（−ＳＯＣＨ３基）を有する化合物（Ｇ）は、いずれの条件においても吸収スペクトルの変化を示さなかった。ここで、メチルスルフィニル基のハメット定数は０．４９であり、化合物（Ｄ）で用いられたシアノ基（０．６６）や化合物（Ｆ）で用いられたメシル基（０．７２）よりも小さい。このため、スルフィニル基による反応中間体（マイゼンハイマー錯体）の安定化への寄与はシアノ基やメシル基よりも小さいため、グルタチオン化反応が進行しなかったものと考えられる。なお、化合物（Ａ）〜（Ｇ）のそれぞれについて、各ＧＳＴ分子種の存在下での３０分間のインキュベーション終了時点の極大吸収波長における吸光度（Ａｂｓ）の値を、インキュベーション前の同じ波長における吸光度（Ａｂｓ０）の値で除して得られた値（Ａｂｓ／Ａｂｓ０）を比較した結果を図１Ｈのグラフに示す。図１Ｈに示すように、化合物（Ｄ）〜（Ｆ）ではＧＳＴＰ１存在下におけるＡｂｓ／Ａｂｓ０の値だけが大きい値を示した。As shown in FIG. 1G, the compound (G) having a methylsulfinyl group (—SOCH 3 group) at the 2-position of the benzene ring did not show any change in the absorption spectrum under any conditions. Here, the Hammett constant of the methylsulfinyl group is 0.49, which is smaller than the cyano group (0.66) used in the compound (D) and the mesyl group (0.72) used in the compound (F). . Therefore, the contribution of the sulfinyl group to the stabilization of the reaction intermediate (Meizenheimer complex) is smaller than that of the cyano group or the mesyl group, and it is considered that the glutathione reaction did not proceed. For each of the compounds (A) to (G), the value of the absorbance (Abs) at the maximum absorption wavelength at the end of the 30-minute incubation in the presence of each GST molecular species was calculated as the absorbance (Abs) at the same wavelength before the incubation. the result of comparison of abs 0 values divided by the value obtained by the) (abs / abs 0) shown in the graph of FIG. 1H. As shown in FIG. 1H, in the compounds (D) to (F), only the value of Abs / Abs 0 in the presence of GSTP1 showed a large value.
以上のことから、本実験において評価した化合物（Ａ）〜（Ｇ）のなかでは化合物（Ｄ）〜（Ｆ）がＧＳＴＰ１選択的な基質の候補となりうるものと結論付けた。これを一般化すれば、上記一般式（４）に示す構造において、以下の条件を満たすものであればＧＳＴＰ１選択的な基質となりうるものと考えられる。
・ＥＷＧ基が０．６６以上０．７８未満のハメット定数を有し、かつ共鳴効果を示す電子求引性基である；
・ベンゼン環に結合したニトロ（ＮＯ２）基はベンゼン環に結合したアミド結合に対してオルト位またはパラ位に位置する；および
・ＥＷＧ基は、ニトロ（ＮＯ２）基に対してオルト位またはパラ位に位置する。From the above, it was concluded that among the compounds (A) to (G) evaluated in this experiment, the compounds (D) to (F) could be candidates for a GSTP1-selective substrate. If this is generalized, in the structure represented by the above general formula (4), if the following conditions are satisfied, it is considered that the substrate can be a GSTP1 selective substrate.
An EWG group having a Hammett constant of 0.66 or more and less than 0.78, and an electron-withdrawing group exhibiting a resonance effect;
The nitro (NO 2 ) group attached to the benzene ring is located ortho or para to the amide bond attached to the benzene ring; and the EWG group is located ortho or to the nitro (NO 2 ) group. Located in the para position.
以下では、最も理想に近いＧＳＴＰ１選択性の可能性を示した化合物（Ｆ）（２−ニトロ−５−メシル安息香酸アニリド）を用いて、さらなる実験を行った。 In the following, further experiments were performed with compound (F) (2-nitro-5-mesylbenzoic anilide) which showed the most ideal GSTP1 selectivity.
まず、化合物（Ｆ）がＧＳＴＰ１存在下において実際にグルタチオン化されることを、ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳによって解析した。具体的に、ＨＰＬＣによる検討では、化合物（Ｆ）を１００ｍＭリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．４）中、５．０μｇ／ｍＬ ＧＳＴＰ１および１ｍＭ ＧＳＨの存在下、２５℃にて３０分間インキュベーションした反応液を、反応前のものと比較した。また、ＬＣ−ＭＳによる検討では、反応後の反応液を解析した。ここで、ＨＰＬＣ解析の結果を図２（Ａ）に示し、ＬＣ−ＭＳ解析の結果を図２（Ｂ）に示す。図２（Ａ）に示すように、反応前（上段）には見られた化合物（Ｆ）のピークが反応後（下段）には消失し、保持時間がより短い新たな化合物が生成することが確認された。また、新たに生成した化合物の吸収スペクトルは図１Ｆに示したものと同じであったことから、本ピークが反応生成物であると考えられる。さらに、図２（Ｂ）に示すように、ＬＣ−ＭＳ解析によれば、反応生成物のピークはニトロ基がグルタチオン（ＧＳＨ）に置換している化合物の分子量に相当することが確認された。 First, it was analyzed by HPLC and LC-MS that the compound (F) was actually converted into glutathione in the presence of GSTP1. Specifically, in the study by HPLC, the reaction solution obtained by incubating the compound (F) in a 100 mM sodium phosphate aqueous solution (pH 7.4) at 25 ° C. for 30 minutes in the presence of 5.0 μg / mL GSTP1 and 1 mM GSH was used. , And those before the reaction. In the examination by LC-MS, the reaction solution after the reaction was analyzed. Here, the results of the HPLC analysis are shown in FIG. 2 (A), and the results of the LC-MS analysis are shown in FIG. 2 (B). As shown in FIG. 2 (A), the peak of compound (F) observed before the reaction (upper part) disappears after the reaction (lower part), and a new compound having a shorter retention time may be generated. confirmed. Further, since the absorption spectrum of the newly generated compound was the same as that shown in FIG. 1F, it is considered that this peak was a reaction product. Furthermore, as shown in FIG. 2 (B), according to LC-MS analysis, it was confirmed that the peak of the reaction product corresponded to the molecular weight of the compound in which the nitro group was substituted with glutathione (GSH).
続いて、ＧＳＨとの反応に伴って化合物（Ｆ）からニトロ（ＮＯ２）基が脱離していることを、Ｇｒｉｅｓｓ法を用いて確認した。ここで、Ｇｒｉｅｓｓ法とは、亜硝酸イオンの検出・定量方法として知られており、酸性条件下でＮＯ２ −、スルファニルアミド、１−ナフチルエチレンジアミンのジアゾカップリングを利用し、生成したアゾ化合物の吸光度を測定することで間接的にＮＯ２ −を検出・定量する方法である。本実験では、化合物（Ｆ）を１００ｍＭリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．４）中、５．０μｇ／ｍＬ ＧＳＴＰ１および１ｍＭ ＧＳＨの存在下、２５℃にて３０分間インキュベーションした反応液に対して、亜硝酸イオンの定量を行った（反応機構を図３（Ａ）に示す）。この際、絶対濃度については、別途調製した濃度既知のＮＯ２ −を定量することで絶対濃度による検量線を作成し、反応によって生成した亜硝酸イオンを検量線法により定量した。その結果、図３（Ｂ）に示すように、用いた基質濃度とほぼ等濃度の亜硝酸イオンが反応液中に存在することが確認された。Subsequently, it was confirmed by the Griess method that the nitro (NO 2 ) group was eliminated from the compound (F) in association with the reaction with GSH. Here, the Griess method is known as a method for detecting and quantifying nitrite ions, and utilizes the diazo coupling of NO 2 − , sulfanilamide, and 1-naphthylethylenediamine under acidic conditions to produce an azo compound. This is a method of indirectly detecting and quantifying NO 2 − by measuring the absorbance. In this experiment, the reaction solution obtained by incubating the compound (F) in a 100 mM sodium phosphate aqueous solution (pH 7.4) at 25 ° C. for 30 minutes in the presence of 5.0 μg / mL GSTP1 and 1 mM GSH was used. The ion was quantified (the reaction mechanism is shown in FIG. 3A). At this time, the absolute concentration, the concentration known NO 2 which is separately prepared - to prepare a calibration curve by absolute concentration by quantifying nitrite ions produced by the reaction was quantified by a calibration curve method. As a result, as shown in FIG. 3 (B), it was confirmed that nitrite ions in the reaction solution had a concentration substantially equal to the used substrate concentration.
以上の結果から、ニトロベンゼン誘導体である化合物（Ｆ）はＧＳＴＰ１選択的な基質であることが示された。また、このことから、一般式（４）で表される化合物もまた、ＧＳＴＰ１選択的な基質として用いられうることが推認される。 From the above results, it was shown that the compound (F) which is a nitrobenzene derivative is a GSTP1-selective substrate. From this, it is inferred that the compound represented by the general formula (4) can also be used as a GSTP1 selective substrate.
［蛍光プローブの合成（１）］
ここでは、上述したスクリーニングによって得られたＧＳＴＰ１選択的な基質である５−メシル−２−ニトロ安息香酸アニリドを反応部位として有する蛍光プローブを合成した。なお、本実験では、キサンテン環を蛍光団として有するＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ（ＴＧ；Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ２００５， １２７， ４８８８−４８９４．）を母核として有する蛍光プローブを合成した（下記の反応スキーム４）。[Synthesis of fluorescent probe (1)]
Here, a fluorescent probe having 5-mesyl-2-nitrobenzoic acid anilide as a reaction site, which is a GSTP1-selective substrate obtained by the above-described screening, was synthesized. In this experiment, a fluorescent probe having a mother nucleus of Tokyo Green (TG; J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 4888-4894.) Having a xanthene ring as a fluorophore was synthesized (the following reaction scheme). 4).
具体的には、まず出発原料である２−メチル−４−ニトロ安息香酸（１）をボラン錯体によりアルコールに還元し、生成物をヘキサン／酢酸エチル（１０：１）混合溶媒より再結晶を行うことで２−メチル−４−ニトロベンジルアルコール（２）を収率８１％で得た。次に、２−メチル−４−ニトロベンジルアルコールをシリカゲルと混合し、クロロクロム酸ピリジニウム（ＰＣＣ）でアルデヒドに酸化した。不純物を取り除くために減圧下、シリカゲルにてろ過することにより、２−メチル−４−ニトロベンズアルデヒド（３）を単離した（収率９１％）。３ステップ目として、２−メチル−４−ニトロベンズアルデヒド（３）とレゾルシノールをメタンスルホン酸中で加熱し、Ｆｒｉｅｄｅｌ−Ｃｒａｆｔｓ型の縮合反応、脱水縮合および酸化反応を経て、２−メチル−４−ニトロＴＧ（４）を合成した。硫化ナトリウムおよび硫化水素ナトリウムの水和物で２−メチル−４−ニトロＴＧ（４）のニトロ基をアミノ基に還元し、４−アミノ−２−メチルＴＧ（６）を得た（２工程で収率４％）。最後に、得られた４−アミノ−２−メチルＴＧのアミノ基に５−メシル−２−ニトロ安息香酸を導入すべく、縮合剤（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ））とともにアセトニトリル中で反応させ、ヒドロキシ基にも導入された５−メシル−２−ニトロ安息香酸を水酸化ナトリウムで加水分解することにより最終生成物（８）（Ｐｓ−ＴＧ）を得た（収率５０％）。 Specifically, first, 2-methyl-4-nitrobenzoic acid (1), which is a starting material, is reduced to an alcohol with a borane complex, and the product is recrystallized from a mixed solvent of hexane / ethyl acetate (10: 1). Thereby, 2-methyl-4-nitrobenzyl alcohol (2) was obtained in a yield of 81%. Next, 2-methyl-4-nitrobenzyl alcohol was mixed with the silica gel and oxidized to the aldehyde with pyridinium chlorochromate (PCC). By filtering through silica gel under reduced pressure to remove impurities, 2-methyl-4-nitrobenzaldehyde (3) was isolated (yield 91%). As a third step, 2-methyl-4-nitrobenzaldehyde (3) and resorcinol are heated in methanesulfonic acid, and subjected to a Friedel-Crafts-type condensation reaction, dehydration condensation and oxidation reaction to give 2-methyl-4-nitrobenzaldehyde. TG (4) was synthesized. The nitro group of 2-methyl-4-nitroTG (4) was reduced to an amino group with hydrates of sodium sulfide and sodium hydrogensulfide to obtain 4-amino-2-methylTG (6) (in two steps). Yield 4%). Finally, a condensing agent (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride was added to introduce 5-mesyl-2-nitrobenzoic acid into the amino group of the obtained 4-amino-2-methylTG. Salt (EDC.HCl)) in acetonitrile, and hydrolyze the 5-mesyl-2-nitrobenzoic acid also introduced into the hydroxy group with sodium hydroxide to give the final product (8) (Ps-TG ) Was obtained (yield 50%).
なお、反応スキーム４に記載の化合物（１）〜（４）および（６）は、非特許文献１において既知の化合物であることから、非特許文献１において報告された合成法に従って合成した。また、その他の化合物（７）〜（９）および化合物（７）の合成中間体としての化合物（５）は、以下の手法により合成した。 Compounds (1) to (4) and (6) described in Reaction Scheme 4 are known compounds in Non-Patent Document 1, and were synthesized according to the synthesis method reported in Non-Patent Document 1. Compounds (7) to (9) and compound (5) as a synthetic intermediate of compound (7) were synthesized by the following method.
（化合物（８）の合成；Ｎ−（４−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−３−メチルフェニル）−５−（メチルスルホニル）−２−ニトロベンズアミド（Ｐｓ−ＴＧ）） (Synthesis of Compound (8); N- (4- (6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen-9-yl) -3-methylphenyl) -5- (methylsulfonyl) -2-nitrobenzamide (Ps -TG))
２−メチル−４−アミノＴＧ（６）（１０．２ｍｇ，０．０３２ｍｍｏｌ）、５−メシル−２−ニトロ安息香酸（１５．６ｍｇ，０．０６４ｍｍｏｌ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ；１２．５ｍｇ，０．０６５ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミドに懸濁し、室温にて１時間撹拌した。反応液に対して酢酸エチルを加え、１Ｎ塩酸で３回、飽和食塩水で１回洗浄した。これを無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、ろ液を留去した。混合物をアセトニトリルに懸濁し、４℃において撹拌しながら室温で１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加え、１０分間反応させた。反応液をｐＨ７．４、２００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液によって中和し、ＨＰＬＣの初期溶媒（下記）によって希釈し、分取ＨＰＬＣによって精製した。分取ＨＰＬＣでは移動相Ａとして１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）、移動相Ｂとしてアセトニトリルを用い、２０分間で組成比がＡ：Ｂ＝９０：１０から１０：９０となるように組成比の勾配をかけ、流速９ｍＬ／ｍｉｎで溶出させた。溶出液中に含まれるアセトニトリルを減圧下で留去した後、残渣を酢酸エチルに懸濁し、０．１Ｎ塩酸で３回洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。酢酸エチルを留去して、目的化合物８．５ｍｇを得た（収率５０％）
（化合物（８）の機器データ）
１Ｈ-ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．５６（２Ｈ，ｍ），７．４８（１Ｈ， ｄｄ，Ｊ＝１．６，８．８），６．９５（１Ｈ，ｓ），６．８６（１Ｈ，ｍ），６．４７ （１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４），６．０８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２），５．７７（４Ｈ，ｂｒ），２．５９（３Ｈ，ｓ），１．２０（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ-ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６３．３，１５９．１，１５０．１， １４５．２，１４０．８，１３７．２，１３３．２，１３０．６，１２８．８，１２７．６，１２６．３，１２１．８，１２１．３，１１７．８，１１６．８，１０３．１，６０．３，２１．６，２１．３，１４．６
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ Ｆｏｕｎｄ ５４５．１０１９ ［Ｍ＋Ｈ］＋，ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ５４５．１０１９ ｆｏｒ Ｃ２８Ｈ２１Ｎ２Ｏ８Ｓ （＋ ０．０ ｍｍｕ）。2-methyl-4-aminoTG (6) (10.2 mg, 0.032 mmol), 5-mesyl-2-nitrobenzoic acid (15.6 mg, 0.064 mmol) and 1-ethyl-3- (3-dimethyl (Aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC.HCl; 12.5 mg, 0.065 mmol) was suspended in dimethylformamide and stirred at room temperature for 1 hour. Ethyl acetate was added to the reaction solution, and the mixture was washed three times with 1N hydrochloric acid and once with a saturated saline solution. After drying this with anhydrous magnesium sulfate, the filtrate was distilled off. The mixture was suspended in acetonitrile, a 1N aqueous sodium hydroxide solution was added at room temperature with stirring at 4 ° C., and the mixture was reacted for 10 minutes. The reaction was neutralized with 200 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4, diluted with an HPLC initial solvent (described below) and purified by preparative HPLC. In the preparative HPLC, a 10 mM ammonium acetate buffer (pH 7.0) was used as the mobile phase A and acetonitrile was used as the mobile phase B, and the composition ratio was changed so that the composition ratio from A: B = 90: 10 to 10:90 in 20 minutes. And eluted at a flow rate of 9 mL / min. After acetonitrile contained in the eluate was distilled off under reduced pressure, the residue was suspended in ethyl acetate, washed with 0.1N hydrochloric acid three times, and dried over anhydrous magnesium sulfate. Ethyl acetate was distilled off to obtain 8.5 mg of the desired compound (yield 50%).
(Instrument data of compound (8))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.56 (2H, m), 7.48 (1 H, dd, J = 1.6, 8.8), 6.95 (1 H, s), 6 .86 (1H, m), 6.47 (1H, d, J = 8.4), 6.08 (2H, d, J = 9.2), 5.77 (4H, br), 2.59 (3H, s), 1.20 (3H, s)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ 163.3, 159.1, 150.1, 145.2, 140.8, 137.2, 133.2, 130.6, 128.8, 127. 6,126.3,121.8,121.3,117.8,116.8,103.1,60.3,21.6,21.3,14.6
HRMS (ESI-TOF) m / z Found 545.1019 [M + H] + , Calculated 545.1019 for C 28 H 21 N 2 O 8 S (+0.0 mmu).
（化合物（７）の合成；９−（４−アミノ−２−メチルフェニル）−２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３Ｈ−キサンテン−３−オン（２−メチル−４−アミノ−２’，７’−ジクロロ−ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ） (Synthesis of compound (7); 9- (4-amino-2-methylphenyl) -2,7-dichloro-6-hydroxy-3H-xanthen-3-one (2-methyl-4-amino-2 ′, 7'-dichloro-Tokyo Green)
２−メチル−４−ニトロベンズアルデヒド（５５９ｍｇ，３．４ｍｍｏｌ）およびクロロレゾルシノール（９８３ｍｇ，６．８ｍｍｏｌ）をメタンスルホン酸３ｍＬに懸濁し、１時間加熱還流した。室温に戻した後、水３０ｍＬを加えて生じた沈殿を濾取した後、水、酢酸エチルで洗浄した。固体を酢酸エチルに懸濁し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル６０Ｎ、酢酸エチル／２０％エタノール）にて精製して、化合物（５）（２−メチル−４−ニトロジクロロＴＧ）の赤褐色の粗生成物を得た。これを水１５ｍＬに懸濁し、硫化ナトリウム九水和物（２１６ｍｇ，０．８６ｍｍｏｌ）および硫化ナトリウムｎ水和物（３４７ｍｇ）を加えて２時間加熱還流した。反応液を４℃に冷却し、濃塩酸を滴下し反応液を酸性にすることで生じた暗赤色の沈殿を濾取し、水で洗浄した。これを酢酸エチルに懸濁し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製（移動相：酢酸エチル）して、目的化合物（４−アミノ−２−メチルジクロロＴＧ）１０４ｍｇを得た（収率８％）。 2-Methyl-4-nitrobenzaldehyde (559 mg, 3.4 mmol) and chlororesorcinol (983 mg, 6.8 mmol) were suspended in 3 mL of methanesulfonic acid and heated under reflux for 1 hour. After returning to room temperature, 30 mL of water was added and the resulting precipitate was collected by filtration and washed with water and ethyl acetate. The solid was suspended in ethyl acetate and purified by silica gel column chromatography (silica gel 60N, ethyl acetate / 20% ethanol) to obtain a crude red-brown product of compound (5) (2-methyl-4-nitrodichloroTG). I got This was suspended in water (15 mL), sodium sulfide nonahydrate (216 mg, 0.86 mmol) and sodium sulfide n-hydrate (347 mg) were added, and the mixture was heated under reflux for 2 hours. The reaction solution was cooled to 4 ° C., concentrated hydrochloric acid was added dropwise to make the reaction solution acidic, and a dark red precipitate produced by filtration was collected by filtration and washed with water. This was suspended in ethyl acetate and purified by silica gel column chromatography (mobile phase: ethyl acetate) to obtain 104 mg of the target compound (4-amino-2-methyldichloroTG) (yield: 8%).
（化合物（７）の機器データ）
１Ｈ-ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．１０（２Ｈ，ｓ），６．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），６．７５（２Ｈ，ｓ），６．６１（２Ｈ，ｍ），１．８７（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ-ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１５１．４，１５０．２，１３６．４，１３０．２，１２８．４，１１７．７，１１５．５，１１５．３，１１１．５，１０３．９，７９．２，１９．５
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ Ｆｏｕｎｄ ３８６．０３５１ ［Ｍ＋Ｈ］＋， ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ３８６．０３５１ ｆｏｒ Ｃ２０Ｈ１４ＮＯ３Ｃｌ２ （−０．１ ｍｍｕ）。(Instrument data of compound (7))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.10 (2H, s), 6.91 (1 H, d, J = 8.2), 6.75 (2H, s), 6.61 (2H) , M), 1.87 (3H, s)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ 151.4, 150.2, 136.4, 130.2, 128.4, 117.7, 115.5, 115.3, 111.5, 103. 9,79.2,19.5
HRMS (ESI-TOF) m / z Found 386.0351 [M + H] + , Calculated 386.0351 for C 20 H 14 NO 3 Cl 2 (−0.1 mmu).
（化合物（９）の合成；Ｎ−（４−（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−３−メチルフェニル）−５−（メチルスルホニル）−２−ニトロベンズアミド（Ｐｓ−ＤＣＴＧ）） (Synthesis of compound (9); N- (4- (2,7-dichloro-6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen-9-yl) -3-methylphenyl) -5- (methylsulfonyl)- 2-nitrobenzamide (Ps-DCTG)
２−メチル−４−ニトロ−ジクロロＴＧ（５）（８．７ｍｇ，０．０２３ｍｍｏｌ）、５−メシル−２−ニトロ安息香酸（１２．２ｍｇ，０．０５０ｍｍｏｌ）、および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ；１４．６ｍｇ，０．０７６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル１ｍＬ中にて２０分間、室温にて撹拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈した後、有機層を０．１Ｎ塩酸で３回、飽和食塩水で１回洗浄し、無水硫酸マグネシウムによって乾燥させ、減圧下で留去した。これをアセトニトリル２ｍＬに懸濁し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を氷上で加え、室温にて１０分間反応させた。反応液を中和し、セミ分取ＨＰＬＣによって精製した。分取ＨＰＬＣでは移動相ＡおよびＢとしてそれぞれ１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）、アセトニトリルを用い、２０分間で組成比がＡ：Ｂ＝９０：１０から１０：９０となるように組成比の勾配をかけ、流速９ｍＬ／ｍｉｎで溶出させた。溶出液中に含まれるアセトニトリルを減圧下で留去した後、残渣を酢酸エチルに懸濁し、０．１Ｎ塩酸で３回洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させて、目的化合物（Ｐｓ−ＤＣＴＧ）１１．１ｍｇを得た（収率７９％）。 2-methyl-4-nitro-dichloroTG (5) (8.7 mg, 0.023 mmol), 5-mesyl-2-nitrobenzoic acid (12.2 mg, 0.050 mmol), and 1-ethyl-3- ( 3-Dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC.HCl; 14.6 mg, 0.076 mmol) was stirred in 1 mL of acetonitrile for 20 minutes at room temperature. After diluting the reaction solution with ethyl acetate, the organic layer was washed three times with 0.1N hydrochloric acid and once with a saturated saline solution, dried over anhydrous magnesium sulfate, and distilled off under reduced pressure. This was suspended in 2 mL of acetonitrile, a 1N aqueous sodium hydroxide solution was added on ice, and the mixture was reacted at room temperature for 10 minutes. The reaction was neutralized and purified by semi-preparative HPLC. In the preparative HPLC, 10 mM ammonium acetate buffer (pH 7.0) and acetonitrile were used as the mobile phases A and B, respectively, and the composition ratio was adjusted so that the composition ratio from A: B = 90: 10 to 10:90 in 20 minutes. A gradient was applied and eluted at a flow rate of 9 mL / min. After the acetonitrile contained in the eluate was distilled off under reduced pressure, the residue was suspended in ethyl acetate, washed with 0.1N hydrochloric acid three times, and dried over anhydrous magnesium sulfate to obtain the target compound (Ps-DCTG) 11.1 mg were obtained (yield 79%).
（化合物（９）の機器データ）
１Ｈ-ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８），８．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），８．３１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８），７．８２（１Ｈ，ｓ），７．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７），７．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），７．０１（２Ｈ，ｓ），６．７７（２Ｈ，ｓ），３．４２（３Ｈ，ｓ），２．０５（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ-ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６２．７，１４９．５，１４９．３，１４４．８，１３９．９，１３６．８，１３２．８，１３１．７，１３０．０，１２９．１，１２８．３，１２７．９，１２６．９，１２５．７，１２５．１，１２１．３，１１７．４，１０４．１，５９．７，４２．９，２０．８，１９．８，１４．１
ＨＲＭＳ （ＥＳＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ Ｆｏｕｎｄ ６１３．０２４５ ［Ｍ＋Ｈ］＋，ｃａｌｕｃｕｌａｔｅｄ ６１３．０２３９ ｆｏｒ Ｃ２８Ｈ１９Ｎ２Ｏ８ＳＣｌ２ （＋０．６ ｍｍｕ）。(Instrument data of compound (9))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.43 (1 H, d, J = 1.8), 8.40 (1 H, d, J = 8.2), 8.31 (1 H, dd, J = 8.2, 1.8), 7.82 (1H, s), 7.75 (1H, d, J = 8.7), 7.33 (1H, d, J = 8.2), 7.01 (2H, s), 6.77 (2H, s), 3.42 (3H, s), 2.05 (3H, s)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ 162.7, 149.5, 149.3, 144.8, 139.9, 136.8, 132.8, 131.7, 130.0, 129. 1,128.3,127.9,126.9,125.7,125.1,121.3,117.4,104.1,59.7,42.9,20.8,19.8, 14.1
HRMS (ESI-TOF) m / z Found 613.0245 [M + H] + , Calculated 613.0239 for C 28 H 19 N 2 O 8 SCl 2 (+0.6 mmu).
［蛍光プローブの分光学的特性およびクラス選択性の評価（１）］
上記で合成した蛍光プローブＰｓ−ＴＧ（化合物（８））およびＰｓ−ＤＣＴＧ（化合物（９））の分光学的特性を評価した。また、これらの蛍光プローブについて、反応前後でのＨＰＬＣ解析およびＬＣ−ＭＳ解析により、ＧＳＴ存在下におけるＧＳＨとの反応生成物の同定を行った。そして、ＧＳＨおよび各種ＧＳＴ存在下での蛍光強度上昇を指標として、ＧＳＴクラス選択的な反応性を評価した。[Evaluation of spectroscopic characteristics and class selectivity of fluorescent probe (1)]
The spectroscopic characteristics of the fluorescent probes Ps-TG (compound (8)) and Ps-DCTG (compound (9)) synthesized above were evaluated. In addition, for these fluorescent probes, a reaction product with GSH in the presence of GST was identified by HPLC analysis and LC-MS analysis before and after the reaction. Then, GST class-selective reactivity was evaluated using an increase in fluorescence intensity in the presence of GSH and various GSTs as an index.
（Ｐｓ−ＴＧの評価）
まず、２．５μＭのＰｓ−ＴＧ（化合物（８））を１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ０．１％を共溶媒として含む）に溶解し、反応前の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定した。なお、吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルの測定には、それぞれ紫外・可視分光光度計（Ｖ−５５０、日本分光株式会社製）および蛍光分光光度計（ＲＦ−５３００ＰＣ；株式会社島津製作所製）を用いた。また、２．５μＭのＰｓ−ＴＧを１ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）および５μｇ／ｍＬのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴＰ１−１）を含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ１％を共溶媒として含む）中、室温（２５℃）にて撹拌しながら１日間反応させた。その後、上記と同様にして反応後の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定した。(Evaluation of Ps-TG)
First, 2.5 μM of Ps-TG (compound (8)) was dissolved in 100 mM phosphate buffer (pH 7.4; containing 0.1% of DMSO as a cosolvent), and the absorption spectrum and the fluorescence spectrum before the reaction were measured. . The absorption spectrum and the fluorescence spectrum were measured using an ultraviolet / visible spectrophotometer (V-550, manufactured by JASCO Corporation) and a fluorescence spectrophotometer (RF-5300PC; manufactured by Shimadzu Corporation), respectively. In addition, 2.5 μM Ps-TG was added to 100 mM phosphate buffer (pH 7.4; DMSO 1% containing 1 mM reduced glutathione (GSH) and 5 μg / mL glutathione-S-transferase (GSTP1-1) as a cosolvent). ) For 1 day with stirring at room temperature (25 ° C). Thereafter, the absorption spectrum and the fluorescence spectrum after the reaction were measured in the same manner as described above.
Ｐｓ−ＴＧ（化合物（８））についての吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルの測定結果を図４の（Ａ）および（Ｂ）にそれぞれ示す。図４の（Ｂ）に示す結果からわかるように、Ｐｓ−ＴＧは反応の前後で約６０倍の蛍光強度上昇を示した（反応前後の蛍光量子収率はそれぞれ０．０１６および０．９１３であった）。また、図４（Ａ）に示すように反応の前後において吸収スペクトルは変化せず、蛍光スペクトルのみが大きく変化した。これは、電子が基底状態から励起状態へと励起される過程には反応の前後で違いはないが、励起された電子の遷移過程に違いがあるためである。 The measurement results of the absorption spectrum and the fluorescence spectrum of Ps-TG (compound (8)) are shown in FIGS. 4A and 4B, respectively. As can be seen from the results shown in FIG. 4 (B), Ps-TG showed a 60-fold increase in fluorescence intensity before and after the reaction (the fluorescence quantum yields before and after the reaction were 0.016 and 0.913, respectively). there were). In addition, as shown in FIG. 4A, the absorption spectrum did not change before and after the reaction, and only the fluorescence spectrum changed significantly. This is because there is no difference in the process in which electrons are excited from the ground state to the excited state before and after the reaction, but there is a difference in the transition process of the excited electrons.
続いて、Ｐｓ−ＴＧがグルタチオン化反応を受けることで強蛍光性を示すようになっていることを確認するために、ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳによる解析を行った。具体的には、上記で吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定したサンプルを反応液としてＨＰＬＣ測定を行った。ＨＰＬＣによる分析には、ポンプとしてＬＣ−１０ＡＴ、吸収および蛍光検出器として、ＳＰＤ−Ｍ２０ＡおよびＲＦ−１０ＡｘＬ（株式会社島津製作所製）、分離用カラムとしてＩｎｔｅｒｓｕｓｔａｉｎ Ｃ１８カラム（ＧＬサイエンス社）から構成されたＨＰＬＣシステムを利用した。移動相としては、Ａ液およびＢ液に１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液、アセトニトリルをそれぞれ用い、２０分間でＡ：Ｂ＝９０：１０から５：９５の混合比を変化させ、流速は０．２ｍＬ／分の条件で分析を行った。 Subsequently, analysis by HPLC and LC-MS was performed to confirm that Ps-TG exhibited strong fluorescence by undergoing a glutathione reaction. Specifically, HPLC measurement was performed using the sample whose absorption spectrum and fluorescence spectrum were measured as a reaction solution. The HPLC analysis consisted of LC-10AT as a pump, SPD-M20A and RF-10AxL (manufactured by Shimadzu Corporation) as absorption and fluorescence detectors, and Interstain C18 column (GL Science) as a separation column. An HPLC system was utilized. As the mobile phase, a 10 mM aqueous solution of ammonium acetate and acetonitrile were used for the solution A and the solution B, respectively, and the mixing ratio of A: B = 90: 10 to 5:95 was changed in 20 minutes, and the flow rate was 0.2 mL / min. Analysis was performed under the conditions.
ＨＰＬＣによる解析結果を図４の（Ｃ）に示す。図４（Ｃ）に示す吸収クロマトグラムから、Ｐｓ−ＴＧの保持時間は反応に伴って短くなっていた。また、対応する蛍光測定モードでは、Ｐｓ−ＴＧに相当するピークはほぼ無蛍光であるのに対し、反応後は強蛍光性であった。 The analysis result by HPLC is shown in FIG. From the absorption chromatogram shown in FIG. 4C, the retention time of Ps-TG became shorter with the reaction. Further, in the corresponding fluorescence measurement mode, the peak corresponding to Ps-TG was almost non-fluorescent, but was strongly fluorescent after the reaction.
また、ＨＰＬＣ解析で確認できた強蛍光性ピークが実際にグルタチオン化された分子であることを確かめるため、反応生成物についてＬＣ−ＭＳ解析を行った。具体的には、ＨＰＬＣ測定と同じ反応液をＬＣ−ＭＳ解析に用いた。ＬＣ−ＭＳ解析には、ポンプとしてＬＣ−１０ＡＴ、吸収検出器としてＳＰＤ−Ｍ２０Ａ、ＭＳとして四重極型質量分析計ＬＣＭＳ−２０２０（株式会社島津製作所製）、分離用カラムとしてＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３カラム（ＧＬサイエンス社）から構成されたシステムを利用した。移動相としては、Ａ液には１０ｍＭ酢酸アンモニウム、Ｂ液にはアセトニトリルを用い、２０分間でＡ：Ｂ＝９０：１０から５：９５の混合比を変化させ、流速は０．２ｍＬ／分の条件で分析を行った。 In addition, LC-MS analysis was performed on the reaction product in order to confirm that the strong fluorescent peak confirmed by HPLC analysis was actually a molecule that was converted into glutathione. Specifically, the same reaction solution as used for the HPLC measurement was used for LC-MS analysis. For LC-MS analysis, LC-10AT was used as a pump, SPD-M20A was used as an absorption detector, a quadrupole mass spectrometer LCMS-2020 (manufactured by Shimadzu Corporation) was used as an MS, and an Inertsil ODS-3 column was used as a separation column. (GL Science) was used. As the mobile phase, 10 mM ammonium acetate was used for the solution A, and acetonitrile was used for the solution B. The mixing ratio of A: B = 90: 10 to 5:95 was changed in 20 minutes, and the flow rate was 0.2 mL / min. Analysis was performed under the conditions.
ＬＣ−ＭＳによる解析結果を図４（Ｄ）に示す。なお、図４（Ｄ）の上段は吸収クロマトグラムであり、下段は抽出イオンクロマトグラムである。図４（Ｄ）に示すように、ＬＣ−ＭＳ解析ではグルタチオン化生成物由来のＭＳピークが検出された（ｍ／ｚ＝８０２．７±０．５）。以上のことから、Ｐｓ−ＴＧのニトロ基がＧＳＨに置換されることで、強蛍光性を持つ反応生成物が生じることが示された。そして、Ｐｓ−ＴＧは、グルタチオン化に伴ってニトロ基が脱離することでＤ−ＰｅＴ機構による消光が解除されるという分子設計通りに機能することが確認された。 FIG. 4D shows an analysis result by LC-MS. The upper part of FIG. 4 (D) is the absorption chromatogram, and the lower part is the extracted ion chromatogram. As shown in FIG. 4 (D), in the LC-MS analysis, an MS peak derived from the product of glutathione was detected (m / z = 802.7 ± 0.5). From the above, it was shown that when the nitro group of Ps-TG was substituted with GSH, a reaction product having strong fluorescence was generated. And it was confirmed that Ps-TG functions according to the molecular design in which the quenching by the D-PeT mechanism is released by the elimination of the nitro group with the formation of glutathione.
次いで、Ｐｓ−ＴＧ（化合物（８））のＧＳＴＰ１選択性を評価した。具体的に、上記で合成したＰｓ−ＴＧについて、３種類のＧＳＴ（ＧＳＴＡ１−１、ＧＳＴＭ１−１、ＧＳＴＰ１−１）について異なる濃度のＧＳＴを用いてＧＳＴ活性を測定した場合の蛍光強度の経時的な変化を測定することで、特異活性を算出した。 Next, the GSTP1 selectivity of Ps-TG (compound (8)) was evaluated. Specifically, with respect to the Ps-TG synthesized as described above, the fluorescence intensity of the three types of GSTs (GSTA1-1, GSTM1-1, and GSTP1-1) measured over time when the GST activity was measured using different concentrations of GST. Specific activity was calculated by measuring various changes.
具体的には、１μＭのＰｓ−ＴＧを１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ ０．１％を共溶媒として含む）に溶解し、異なる濃度の各種ＧＳＴ（ＧＳＴＡ１−１；０．１〜１０．１μｇ／ｍＬ、ＧＳＴＭ１−１；０．４〜１０．１μｇ／ｍＬ、ＧＳＴＰ１−１；０．３〜９．８μｇ／ｍＬ）の存在下、１ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）と室温（２５℃）にて撹拌しながら反応させ、蛍光強度を３０秒ごとに３０分間記録した。なお、本実験における励起／蛍光波長は４９０／５１０ｎｍとし、ネガティブコントロールとしてＧＳＨのみを添加した系についても同様の実験を行った。また、本実験はマルチウェルプレートリーダー（ＳＨ−９０００、コロナ電気株式会社）を用いて行った。 Specifically, 1 μM of Ps-TG is dissolved in 100 mM phosphate buffer (pH 7.4; containing 0.1% of DMSO as a cosolvent), and various concentrations of various GSTs (GSTA1-1; 0.1 μg / mL, GSTM1-1; 0.4 to 10.1 μg / mL, GSTP1-1; 0.3 to 9.8 μg / mL) in the presence of 1 mM reduced glutathione (GSH) and room temperature (25 ° C.). The reaction was carried out with stirring in the above), and the fluorescence intensity was recorded every 30 seconds for 30 minutes. In this experiment, the excitation / fluorescence wavelength was 490/510 nm, and the same experiment was performed for a system to which only GSH was added as a negative control. This experiment was performed using a multi-well plate reader (SH-9000, Corona Electric Co., Ltd.).
結果を図５に示す。図５（Ａ）は、各種ＧＳＴの濃度を０．５μｇ／ｍＬとしたときのＰｓ−ＴＧの蛍光強度の経時的な変化を示すグラフである。また、図５（Ｂ）は、Ｐｓ−ＴＧの各種ＧＳＴとの反応初速度を、単位時間当たりの蛍光強度変化（ΔＦ．Ｉ．／ｓｅｃ）として示すグラフである。図５の（Ａ）および（Ｂ）に示すように、ＧＳＴの非存在下およびＧＳＴＡ１の存在下では、１ｍＭ ＧＳＨによって蛍光強度の上昇は見られなかった。一方、ＧＳＴＭ１またはＧＳＴＰ１の存在下では蛍光強度の上昇が見られ、単位時間当たりの蛍光強度変化（ΔＦ．Ｉ．／ｓｅｃ）はそれぞれ０．９および７．１であった。その差は約８倍程度であり、高いＧＳＴＰ１選択性を確認することができた。 FIG. 5 shows the results. FIG. 5 (A) is a graph showing the change over time in the fluorescence intensity of Ps-TG when the concentration of various GSTs is 0.5 μg / mL. FIG. 5B is a graph showing the initial reaction rate of Ps-TG with various GSTs as a change in fluorescence intensity per unit time (ΔFI / sec). As shown in (A) and (B) of FIG. 5, in the absence of GST and in the presence of GSTA1, no increase in fluorescence intensity was observed with 1 mM GSH. On the other hand, in the presence of GSTM1 or GSTP1, an increase in fluorescence intensity was observed, and the change in fluorescence intensity per unit time (ΔFI / sec) was 0.9 and 7.1, respectively. The difference was about 8 times, and high GSTP1 selectivity could be confirmed.
（Ｐｓ−ＤＣＴＧ）
続いて、Ｐｓ−ＤＣＴＧ（化合物（９））についても、上記と同様に評価を行ったところ、Ｐｓ−ＴＧ（化合物（８））と同様の結果が得られた（図６の（Ａ）〜（Ｄ）並びに図７の（Ａ）および（Ｂ））。ここで、図６（Ｂ）に示す蛍光スペクトルから算出される反応の前後での蛍光量子収率はそれぞれ０．０２２および０．８５１であり、Ｐｓ−ＤＣＴＧは反応前後で約４０倍の蛍光強度の上昇を示した。図６（Ｄ）に示すＬＣ−ＭＳ解析結果におけるｍ／ｚは８７０．７±０．５であった。さらに、図７（Ａ）に示すように、１ｍＭ ＧＳＨのみの存在下またはＧＳＨとＧＳＴＡ１との共存下においてＰｓ−ＤＣＴＧの蛍光強度に変化は見られなかった。一方、ＧＳＨとＧＳＴＭ１との共存下、およびＧＳＨとＧＳＴＰ１との共存下による反応初速度はそれぞれ３．７および１２．１であった。その差は約３倍程度であり、Ｐｓ−ＴＧと比較すると弱いもののＰｓ−ＤＣＴＧもまたＧＳＴＰ１選択性を示すことが明らかとなった。なお、図７に示す測定における励起／蛍光波長は５０５／５２５ｎｍとした。(Ps-DCTG)
Subsequently, Ps-DCTG (compound (9)) was evaluated in the same manner as described above, and the same results as Ps-TG (compound (8)) were obtained ((A) to FIG. 6A to FIG. 6). (D) and FIGS. 7A and 7B). Here, the fluorescence quantum yields before and after the reaction calculated from the fluorescence spectrum shown in FIG. 6 (B) are 0.022 and 0.851, respectively, and Ps-DCTG is about 40 times the fluorescence intensity before and after the reaction. Showed a rise. M / z in the LC-MS analysis result shown in FIG. 6 (D) was 870.7 ± 0.5. Further, as shown in FIG. 7 (A), no change was observed in the fluorescence intensity of Ps-DCTG in the presence of only 1 mM GSH or in the presence of GSH and GSTA1. On the other hand, the initial reaction rates in the presence of GSH and GSTM1 and in the presence of GSH and GSTP1 were 3.7 and 12.1, respectively. The difference was about three times, and it was found that Ps-DCTG also showed GSTP1 selectivity, although weaker than Ps-TG. The excitation / fluorescence wavelength in the measurement shown in FIG. 7 was 505/525 nm.
ここで、Ｐｓ−ＴＧおよびＰｓ−ＤＣＴＧのそれぞれに対する各種ＧＳＴの比活性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を測定した結果を下記の表１に示す。 Here, the results of measuring the specific activities (Specific activities) of various GSTs with respect to each of Ps-TG and Ps-DCTG are shown in Table 1 below.
［蛍光プローブのＧＳＨおよび各種還元活性種に対する反応性の評価（１）］
（Ｐｓ−ＴＧのＧＳＨに対する反応性）
従来のプローブ（ＤＮＡＦ−１，２、ＤＮＡＴ−Ｍｅおよび３，４−ＤＮＡＤＣＦ）は、その反応性の高さゆえ、ＧＳＴＰ１の非存在下においてもＧＳＨと非酵素的に反応し、蛍光強度の上昇を起こす。そこで、本実験では、このような特性がＰｓ−ＴＧにおいて改善しているかどうかを確かめるために、Ｐｓ−ＴＧとＧＳＨとの反応性を評価した。[Evaluation of reactivity of fluorescent probe to GSH and various reducing active species (1)]
(Reactivity of Ps-TG to GSH)
Conventional probes (DNAF-1,2, DNAT-Me and 3,4-DNADCF) react non-enzymatically with GSH even in the absence of GSTP1 due to their high reactivity, increasing the fluorescence intensity. Cause Therefore, in this experiment, the reactivity between Ps-TG and GSH was evaluated in order to confirm whether such characteristics were improved in Ps-TG.
具体的には、２μＭのＰｓ−ＴＧを１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ ０．１％を共溶媒として含む）に溶解し、異なる濃度のＧＳＨ（０．６２５〜２０ｍＭ）の存在下、室温（２５℃）にて３０分間反応させた。そして、反応後の蛍光強度をマイクロプレートリーダーで測定した。本実験における励起／蛍光波長は４９０／５１０ｎｍとし、ポジティブコントロール（ＧＳＨ／ＧＳＴＰ１）として、２．０μｇ／ｍＬ ＧＳＴＰ１−１と反応させた。また、ネガティブコントロール（Ｎｏｎｅ）としては、ＧＳＴＰ１もＧＳＨも添加せずに同様の実験を行った。なお、本実験はマルチウェルプレートリーダー（ＳＨ−９０００、コロナ電気株式会社）を用いて行った。 Specifically, 2 μM of Ps-TG is dissolved in 100 mM phosphate buffer (pH 7.4; containing 0.1% of DMSO as a cosolvent), and in the presence of different concentrations of GSH (0.625 to 20 mM), The reaction was performed at room temperature (25 ° C.) for 30 minutes. Then, the fluorescence intensity after the reaction was measured with a microplate reader. Excitation / fluorescence wavelength in this experiment was 490/510 nm, and a positive control (GSH / GSTP1) was reacted with 2.0 μg / mL GSTP1-1. In addition, as a negative control (None), the same experiment was performed without adding GSTP1 or GSH. This experiment was performed using a multi-well plate reader (SH-9000, Corona Electric Co., Ltd.).
結果を図８に示す。図８に示すように、Ｐｓ−ＴＧは、細胞内の生理的濃度（０．５〜１０ｍＭ）を超える濃度のＧＳＨともほとんど反応しないことがわかる。これは、Ｐｓ−ＴＧの蛍光強度の上昇には、ＧＳＨ存在下でのＧＳＴＰ１の活性が必要であることを意味する。 FIG. 8 shows the results. As shown in FIG. 8, it can be seen that Ps-TG hardly reacts with GSH at a concentration higher than the intracellular physiological concentration (0.5 to 10 mM). This means that GSTP1 activity in the presence of GSH is required for increasing the fluorescence intensity of Ps-TG.
（Ｐｓ−ＴＧの各種還元活性種に対する反応性）
細胞内には、ニトロ基との反応性があることが予想される酸化還元活性種が多数存在している。そこで、本実験では、これらの酸化還元活性種およびその関連物質について、Ｐｓ−ＴＧとの反応性を評価した。(Reactivity of Ps-TG to various reducing active species)
There are many redox-active species in cells that are expected to have reactivity with nitro groups. Therefore, in this experiment, the reactivity of these redox active species and their related substances with Ps-TG was evaluated.
具体的には、２μＭのＰｓ−ＴＧを１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ ０．１％を共溶媒として含む）に溶解し、１ｍＭの様々な酸化還元活性種の存在下、室温（２５℃）にて３０分間反応させた。その後、反応後の蛍光強度をマイクロプレートリーダーで測定した。ここで、酸化還元活性種としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、システイン、２−メルカプトエタノール（βＭＥ）、トリスルフィドナトリウム（Ｎａ２Ｓ３）、還元型および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨおよびＮＡＤ＋）、還元型および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰ＋）、アスコルビン酸（ＡＡ）を用いた。本実験における励起／蛍光波長は４９０／５１０ｎｍとし、ポジティブコントロール（ＧＳＨ／ＧＳＴＰ１）として、２．０μｇ／ｍｌＧＳＴＰ１−１と反応させた。また、ネガティブコントロール（Ｎｏｎｅ）としては、ＧＳＴＰ１もＧＳＨも添加せずに同様の実験を行った。なお、本実験はマルチウェルプレートリーダー（ＳＨ−９０００、コロナ電気株式会社）を用いて行った。Specifically, 2 μM of Ps-TG is dissolved in 100 mM phosphate buffer (pH 7.4, containing 0.1% of DMSO as a cosolvent), and room temperature (25%) in the presence of 1 mM of various redox active species. C) for 30 minutes. Thereafter, the fluorescence intensity after the reaction was measured with a microplate reader. Here, as the redox-active species, dithiothreitol (DTT), cysteine, 2-mercaptoethanol (βME), sodium trisulfide (Na 2 S 3 ), reduced and oxidized nicotinamide adenine dinucleotide (NADH and NAD + ), reduced and oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH and NADP + ), and ascorbic acid (AA) were used. The excitation / fluorescence wavelength in this experiment was set to 490/510 nm, and reacted with 2.0 μg / ml GSTP1-1 as a positive control (GSH / GSTP1). In addition, as a negative control (None), the same experiment was performed without adding GSTP1 or GSH. This experiment was performed using a multi-well plate reader (SH-9000, Corona Electric Co., Ltd.).
結果を図９に示す。図９に示すように、Ｐｓ−ＴＧは、上記で示した酸化還元活性種とはほとんど反応しないことがわかる。このことから、Ｐｓ−ＴＧは酸化還元活性種との反応による非特異的な蛍光強度の上昇を起こす恐れが少ない蛍光プローブであるといえる。 FIG. 9 shows the results. As shown in FIG. 9, it can be seen that Ps-TG hardly reacts with the redox-active species shown above. From this, it can be said that Ps-TG is a fluorescent probe that is less likely to cause nonspecific increase in fluorescence intensity due to reaction with a redox active species.
［細胞イメージング（１）］
上記で作製した２種類の蛍光プローブ（Ｐｓ−ＴＧ、Ｐｓ−ＤＣＴＧ）を培養細胞へ適用し、細胞内においてＧＳＴＰ１活性を検出することが可能か否かを調べた。なお、蛍光プローブの評価には内在的なＧＳＴＰ１の発現がほとんど見られないヒト乳がん由来細胞であるＭＣＦ−７細胞を用いた。また、ＭＣＦ−７細胞および後述するＨＴ−１０８０細胞については、いずれも１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃にて５％ＣＯ２条件下で培養し、３〜４日に１回継代しつつ培養した。[Cell imaging (1)]
The two types of fluorescent probes (Ps-TG, Ps-DCTG) prepared above were applied to cultured cells, and it was examined whether GSTP1 activity could be detected in the cells. For evaluation of the fluorescent probe, MCF-7 cells, which are human breast cancer-derived cells in which almost no endogenous GSTP1 expression was observed, were used. In addition, MCF-7 cells and HT-1080 cells described below were all treated at 37 ° C. in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin-streptomycin-glutamine at 37 ° C. The cells were cultured under the condition of% CO 2 , and subcultured once every 3 to 4 days.
本実験ではまず、ＭＣＦ−７細胞を３５ｍｍガラスボトムディッシュ（松波硝子工業株式会社）または８−ウェルチャンバー（ＩＷＡＫＩ）に３．０×１０５細胞／ディッシュまたは３．３×１０４細胞／ウェルとなるようにそれぞれ播種した。そして細胞が接着した後に、Ｎ末端が３ｘＦＬＡＧタグ化されたＧＳＴＰ１をコードするｃＤＮＡ（３ｘＦＬＡＧ−ＧＳＴＰ１）が挿入された発現ベクターｐＩＲＥＳ２−ＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ２／３ｘＦＬＡＧ−ＧＳＴＰ１をトランスフェクション試薬Ｆｕｇｅｎｅ６（プロメガ株式会社）により細胞内へ導入し、２４時間後以降に実験に使用した。なお、ｐＩＲＥＳ２−ＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ２／３ｘＦＬＡＧ−ＧＳＴＰ１ベクターでは、ＣＭＶプロモーターの下流において転写される１本のｍＲＮＡが３ｘＦＬＡＧ−ＧＳＴＰ１およびＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ２の両者のｍＲＮＡ配列をもつ。そして、両配列の間にはＩｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ） が存在し、３ｘＦＬＡＧ−ＧＳＴＰ１およびＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ２のそれぞれのタンパク質が発現する。すなわち、当該ベクターを用いることにより、赤色蛍光タンパク質であるＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ２が発する蛍光によって３ｘＦＬＡＧ−ＧＳＴＰ１の発現を確認することができるのである。In this experiment, first, MCF-7 cells were placed in a 35 mm glass bottom dish (Matsunami Glass Industry Co., Ltd.) or 8-well chamber (IWAKI) at 3.0 × 10 5 cells / dish or 3.3 × 10 4 cells / well. Seeding each. After the cells adhere, the expression vector pIRES2-DsRed Express2 / 3xFLAG-GSTP1 into which the cDNA encoding GSTP1 (3xFLAG-GSTP1) whose N-terminus has been tagged with 3xFLAG was inserted using the transfection reagent Fugene6 (Promega Corporation) The cells were introduced into cells and used for experiments after 24 hours. In the pIRES2-DsRed Express2 / 3xFLAG-GSTP1 vector, one mRNA transcribed downstream of the CMV promoter has both 3xFLAG-GSTP1 and DsRed Express2 mRNA sequences. An internal ribosomal entry site (IRES) exists between the two sequences, and the respective proteins of 3xFLAG-GSTP1 and DsRed Express2 are expressed. That is, by using the vector, the expression of 3xFLAG-GSTP1 can be confirmed by the fluorescence emitted from DsRed Express2, which is a red fluorescent protein.
次いで、上記発現ベクターが導入されたＭＣＦ−７細胞にプローブを負荷することによりイメージング実験を行った。具体的には、上記ベクターが導入されたＭＣＦ−７細胞に対し、２．５μＭのＰｓ−ＴＧまたはＰｓ−ＤＣＴＧを３７℃、５％ＣＯ２条件下で５分間インキュベーションして、その後に共焦点レーザー走査型顕微鏡下で観察を行った。なお、本実験において、共焦点レーザー走査型顕微鏡としてはＦＬＵＯＶＩＥＷ ＦＶ１０ｉ−ＤＯＣ（オリンパス株式会社製）を用い、蛍光プローブの蛍光は波長４７３ｎｍのＬＤレーザーにより励起させ、ＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ２の蛍光は波長５８４ｎｍのＬＤレーザーにより励起させて、対応する蛍光スペクトルにおける蛍光画像を取得した。Next, an imaging experiment was performed by loading a probe on MCF-7 cells into which the above-mentioned expression vector was introduced. Specifically, 2.5 μM of Ps-TG or Ps-DCTG was incubated with the above-introduced MCF-7 cells at 37 ° C. for 5 minutes at 5% CO 2 , and then confocal Observation was performed under a laser scanning microscope. In this experiment, FLUOVIEW FV10i-DOC (manufactured by Olympus Corporation) was used as a confocal laser scanning microscope, the fluorescence of the fluorescent probe was excited by an LD laser having a wavelength of 473 nm, and the fluorescence of DsRed Express2 was converted to an LD having a wavelength of 584 nm. Upon excitation by a laser, a fluorescence image in the corresponding fluorescence spectrum was obtained.
結果を図１０に示す。ここで、図１０の（Ａ）および（Ｃ）はそれぞれ、Ｐｓ−ＴＧおよびＰｓ−ＤＣＴＧの化学構造式である。また、図１０の（Ｂ）および（Ｄ）はそれぞれ、各蛍光プローブを投与したＭＣＦ−７細胞のイメージング画像であり、左から蛍光プローブの蛍光；ＤｓＲｅｄの蛍光；並びに、蛍光プローブの蛍光、ＤｓＲｅｄの蛍光および白色像の重ね合わせ（Ｍｅｒｇｅ）を示すものである（スケールバーはいずれも２０μｍである）。図１０に示すように、いずれの蛍光プローブを用いた場合であっても、ＤｓＲｅｄの赤色蛍光を示す細胞では蛍光プローブ由来の緑色蛍光が観察された。これに対し、赤色蛍光を示さない細胞における緑色蛍光の強度は弱いものであった。このことから、ＧＳＴＰ１が発現した細胞において選択的に蛍光プローブの蛍光強度の上昇が起こっていることが示された。 The results are shown in FIG. Here, (A) and (C) of FIG. 10 are chemical structural formulas of Ps-TG and Ps-DCTG, respectively. 10 (B) and (D) are imaging images of MCF-7 cells to which each fluorescent probe was administered. From the left, the fluorescent probe fluorescence; the DsRed fluorescence; and the fluorescent probe fluorescence, DsRed (Merge) of the fluorescence and white images of the sample (all scale bars are 20 μm). As shown in FIG. 10, no matter which fluorescent probe was used, green fluorescence derived from the fluorescent probe was observed in the cells showing the red fluorescence of DsRed. In contrast, the intensity of green fluorescence in cells that did not exhibit red fluorescence was weak. This indicated that the fluorescence intensity of the fluorescent probe was selectively increased in the cells in which GSTP1 was expressed.
ここで、図１０に示す結果では、細胞内における蛍光強度が比較的小さく、細胞膜に強い蛍光が観察された。すなわち、いずれの蛍光プローブについても、細胞膜透過性がそれほど高くないことが示唆された。これは、生体内環境（ｐＨ７．４）においてこれらの蛍光プローブはアニオン性を示して十分な脂溶性を有しない結果、細胞膜を透過しにくいものと考えられた。 Here, in the results shown in FIG. 10, the fluorescence intensity in the cells was relatively small, and strong fluorescence was observed in the cell membrane. That is, it was suggested that cell membrane permeability was not so high for any of the fluorescent probes. It was considered that these fluorescent probes were anionic and did not have sufficient lipophilicity in an in vivo environment (pH 7.4), and as a result, did not easily permeate the cell membrane.
［蛍光プローブの合成（２）］
続いて、上記で作製した蛍光プローブの細胞膜透過性を向上させることを目的として、さらなる誘導体化を試みた。ここでは具体的に、上記で作製した蛍光プローブ（Ｐｓ−ＴＧ、Ｐｓ−ＤＣＴＧ）をより脂溶性の高い化学構造へと改変すべく、蛍光団を構成するキサンテン環のフェノール性ヒドロキシ基をアセチル化した化合物を合成した（下記の反応スキーム２）。なお、Ｐｓ−ＴＧ（化合物（８））およびＰｓ−ＤＣＴＧ（化合物（９））のそれぞれに対応するアセチル化化合物を、以下では「Ｐｓ−ＴＡｃ」（化合物（１０））および「Ｐｓ−ＤＣＴＡｃ」（化合物（１１））とも称する。[Synthesis of fluorescent probe (2)]
Subsequently, for the purpose of improving the cell membrane permeability of the fluorescent probe prepared above, further derivatization was attempted. Specifically, in order to modify the fluorescent probe (Ps-TG, Ps-DCTG) prepared above into a more liposoluble chemical structure, the phenolic hydroxy group of the xanthene ring constituting the fluorophore is acetylated. Was synthesized (reaction scheme 2 below). The acetylated compounds corresponding to Ps-TG (compound (8)) and Ps-DCTG (compound (9)) are hereinafter referred to as “Ps-TAc” (compound (10)) and “Ps-DCTAc”. Also referred to as (compound (11)).
（化合物（１０）の合成；９−（２−メチル−４−（５−（メチルスルホニル）−２−ニトロベンズアミド）フェニル）−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−６−イルアセテート（Ｐｓ−ＴＡｃ）） (Synthesis of Compound (10); 9- (2-methyl-4- (5- (methylsulfonyl) -2-nitrobenzamido) phenyl) -3-oxo-3H-xanthen-6-yl acetate (Ps-TAc) )
Ｐｓ−ＴＧ（８）（２．１ｍｇ，０．００３９ｍｍｏｌ）および塩化アセチル（０．６μＬ，０．００８ｍｍｏｌ）を懸濁させたテトラヒドロフラン２ｍＬに対して、４℃条件下でＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＰＡ）（１．４μＬ，０．００８ｍｍｏｌ）を滴下し、氷上において２時間撹拌した。反応液に酢酸エチルを加えた後、有機層を１Ｎ塩酸で３回洗浄し、無水硫酸マグネシウムによって乾燥させた。減圧下、有機層を留去し、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１：２）によって精製して、目的化合物０．５ｍｇを得た（収率２２％）。 N, N′-diisopropylethylamine was added to 4 mL of tetrahydrofuran in which Ps-TG (8) (2.1 mg, 0.0039 mmol) and acetyl chloride (0.6 μL, 0.008 mmol) were suspended at 4 ° C. (DIEPA) (1.4 μL, 0.008 mmol) was added dropwise, and the mixture was stirred on ice for 2 hours. After adding ethyl acetate to the reaction solution, the organic layer was washed three times with 1N hydrochloric acid and dried over anhydrous magnesium sulfate. The organic layer was distilled off under reduced pressure and purified by silica gel chromatography (hexane / ethyl acetate = 1: 2) to obtain 0.5 mg of the desired compound (yield: 22%).
（化合物（１０）の機器データ）
１Ｈ-ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７），８．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８，），８．３１（１Ｈ，ｄｄ），７．８０（１Ｈ，ｓ，Ｊ＝８．２），７．７１（２Ｈ，ｍ），７．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８），７．３３（１Ｈ， ｄ，Ｊ＝８．２），７．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．１），６．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６），６．４９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．６，１．８），６．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３），３．４２（３Ｈ，ｓ），２．３２（３Ｈ，ｓ），２．０６（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ-ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１８４．４，１６８．７，１６２．７，１５８．１，１５４．２，１５２．４，１４９．５，１４７．５，１４４．８，１３９．６，１３６．８，１３２．９，１３０．８，１３０．５，１３０．８，１３０．１，１３．０，１２９．１，１２８．２，１２７．６，１２５．８，１２１．２，１１９．９，１１９．２，１１８．１，１１７．５，１１０．５，１０５．２，２９．０，２０．９，１９．５
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ Ｆｏｕｎｄ ５８７．１１２８ ［Ｍ＋Ｈ］＋，ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ５８７．１１２４ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ２３Ｎ２Ｏ９Ｓ（＋０．４ ｍｍｕ）。(Instrument data of compound (10))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.40 (1 H, d, J = 8.7), 8.39 (1 H, d, J = 1.8,), 8.31 (1 H, dd) ), 7.80 (1H, s, J = 8.2), 7.71 (2H, m), 7.50 (1H, d, J = 18), 7.33 (1H, d, J = 8) .2), 7.12 (1H, d, J = 4.1), 6.98 (1H, d, J = 9.6), 6.49 (1H, dd, J = 9.6, 1.. 8), 6.27 (1H, d, J = 2.3), 3.42 (3H, s), 2.32 (3H, s), 2.06 (3H, s)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ 184.4, 168.7, 162.7, 158.1, 154.2, 152.4, 149.5, 147.5, 144.8, 139. 6, 136.8, 132.9, 130.8, 130.5, 130.8, 130.1, 13.0, 129.1, 128.2, 127.6, 125.8, 121.2, 119.9, 119.2, 118.1, 117.5, 110.5, 105.2, 29.0, 20.9, 19.5
HRMS (ESI-TOF) m / z Found 587.1128 [M + H] + , Calculated 587.1124 for C 30 H 23 N 2 O 9 S (+0.4 mmu).
（化合物（１１）の合成；２，７−ジクロロ−９−（２−メチル−４−（５−（メチルスルホニル）−２−ニトロベンズアミド）フェニル）−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−６−イルアセテート（Ｐｓ−ＤＣＴＡｃ）） (Synthesis of Compound (11); 2,7-dichloro-9- (2-methyl-4- (5- (methylsulfonyl) -2-nitrobenzamido) phenyl) -3-oxo-3H-xanthen-6-yl Acetate (Ps-DCTAc)
Ｐｓ−ＤＣＴＧ（５．１ｍｇ，０．００８３ｍｍｏｌ）および塩化アセチル（１．２μｌ，０．０１７ｍｍｏｌ）を含むテトラヒドロフラン２ｍＬに対して、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（３．０μＬ，０．０１７ｍｍｏｌ）を氷上で加え、４℃にて２時間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加えた後、有機層を１Ｎ塩酸で３回、飽和食塩水で１回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１：２）により精製して、目的化合物（Ｐｓ−ＤＣＴＡｃ）１．２ｍｇを得た（２２％）。 To 2 mL of tetrahydrofuran containing Ps-DCTG (5.1 mg, 0.0083 mmol) and acetyl chloride (1.2 μL, 0.017 mmol), add N, N′-diisopropylethylamine (3.0 μL, 0.017 mmol) on ice. And stirred at 4 ° C. for 2 hours. After adding ethyl acetate to the reaction solution, the organic layer was washed three times with 1N hydrochloric acid and once with a saturated saline solution, and dried over anhydrous magnesium sulfate. Purification by silica gel chromatography (hexane / ethyl acetate = 1: 2) yielded 1.2 mg of the target compound (Ps-DCTAc) (22%).
（化合物（１１）の機器データ）
１Ｈ-ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６），８．４０（１Ｈ，ｓ），８．３３（１Ｈ，ｍ），７．８４（２Ｈ，ｓ），７．７７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０），７．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４），７．１４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８），６．５３（１Ｈ，ｓ），３．４２（３Ｈ，ｓ），２．３９（３Ｈ，ｓ），２．０９（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ-ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７２．５，１６８．４，１６３．３，１５８．１，１５１．６，１５０．０，１４８．２，１４５．３，１３０．７，１３０．５，１２８．８，１２８．３，１２８．２，１２６．３，１２３．３，１２１．８，１２０．９，１１８．０，１１３．９，１０５．６，６０．３，４３．４，２１．６，２１．３，２０．１
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ Ｆｏｕｎｄ ６５５．０３４９ ［Ｍ＋Ｈ］＋，ｃａｌｕｃｕｌａｔｅｄ ６５５．０３４５ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ２１Ｎ２Ｏ９ＳＣｌ２ （＋０．４ ｍｍｕ）。(Equipment data of compound (11))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.42 (1 H, d, J = 1.6), 8.40 (1 H, s), 8.33 (1 H, m), 7.84 (2 H , S), 7.77 (1H, d, J = 8.0), 7.36 (1H, d, J = 8.4), 7.14 (2H, d, J = 8.8), 6 .53 (1H, s), 3.42 (3H, s), 2.39 (3H, s), 2.09 (3H, s)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ 172.5, 168.4, 163.3, 158.1, 151.6, 150.0, 148.2, 145.3, 130.7, 130. 5,128.8,128.3,128.2,126.3,123.3,121.8,120.9,118.0,113.9,105.6,60.3,43.4 21.6, 21.3, 20.1
HRMS (ESI-TOF) m / z Found 655.0349 [M + H] + , Calculated 655.0345 for C 30 H 21 N 2 O 9 SCl 2 (+0.4 mmu).
［蛍光プローブの分光学的特性およびクラス選択性の評価（２）］
上記で合成したアセチル化蛍光プローブＰｓ−ＴＡｃ（化合物（１０））およびＰｓ−ＤＣＴＡｃ（化合物（１１））の分光学的特性を評価した。[Evaluation of spectroscopic properties and class selectivity of fluorescent probe (2)]
The spectroscopic properties of the acetylated fluorescent probes Ps-TAc (compound (10)) and Ps-DCTAc (compound (11)) synthesized above were evaluated.
具体的には、まず、Ｐｓ−ＴＡｃ（化合物（１０））について、上記と同様の手法により吸収スペクトルを測定した。その結果、図１１（Ａ）に記載の「反応前」の吸収スペクトルで示すように、Ｐｓ−ＴＡｃは波長４５０ｎｍおよび４９０ｎｍにピークをもつ吸収スペクトルを示した。これは、蛍光団を構成するキサンテン環のフェノール性ヒドロキシ基がアセチル基によって保護されているためであると考えられる。 Specifically, the absorption spectrum of Ps-TAc (compound (10)) was measured in the same manner as described above. As a result, as shown in the absorption spectrum “before reaction” shown in FIG. 11A, Ps-TAc showed absorption spectra having peaks at wavelengths of 450 nm and 490 nm. It is considered that this is because the phenolic hydroxy group of the xanthene ring constituting the fluorophore is protected by the acetyl group.
続いて、Ｐｓ−ＴＡｃを１０μＭの濃度で含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ０．１％を共溶媒として含む）溶液に、１０μｇ／ｍＬのブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）または１ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を添加し、室温（２５℃）にて撹拌しながら６０分間反応させた。ここで、ＰＬＥを添加した系について反応後に測定した吸収スペクトルが図１１（Ａ）の「反応後」のスペクトルである。また、ＧＳＨ添加系およびＰＬＥ添加系の双方について、反応の間、波長４９０ｎｍでの吸光度を経時的に記録した。これにより得られた結果を図１１（Ｂ）に示す。図１１（Ｂ）に示すように、ブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）の添加によってＰｓ−ＴＡｃの吸収スペクトルは速やかに変化し、６０分経過後には上述した図４（Ａ）と同様の吸収スペクトルを示した。このことから、蛍光団を構成するキサンテン環のフェノール性ヒドロキシ基とアセチル基とからなるエステル結合がＰＬＥの作用によって加水分解され、フェノール性ヒドロキシ基が露出した（すなわち、Ｐｓ−ＴＡｃはＰｓ−ＴＣへと変換された）ものと考えられる。また、図１１（Ｂ）に示すように、この変化は細胞内に比較的高濃度で（通常は１〜１０ｍＭ程度の量で）存在する還元型ＧＳＨの作用（エステル結合の開裂作用）によっても進行することが確認された。このため、本発明に係る一般式（２）で表される蛍光プローブのうち、フェノール性ヒドロキシ基がアシル化されたもの（置換基Ｒ２がアシル基であるもの；Ｐｓ−ＴＡｃやＰｓ−ＤＣＴＡｃなど）は、細胞内エステラーゼ活性が低い細胞においても、還元型ＧＳＨの作用によって酵素活性非依存的に、対応するフェノール性ヒドロキシ基含有蛍光プローブ（置換基Ｒ２が水素原子であるもの）へと変換されることが期待される。なお、Ｐｓ−ＤＣＴＡｃについても同様の実験を行った結果、図１１の（Ａ）および（Ｂ）に示すのと同様の結果が得られた。Subsequently, 10 μg / mL porcine liver esterase (PLE) or 1 mM reduced glutathione was added to a 100 mM phosphate buffer (pH 7.4; containing 0.1% DMSO as a cosolvent) solution containing Ps-TAc at a concentration of 10 μM. (GSH) was added and reacted at room temperature (25 ° C.) for 60 minutes with stirring. Here, the absorption spectrum measured after the reaction of the system to which PLE was added is the spectrum “after the reaction” in FIG. In addition, the absorbance at a wavelength of 490 nm was recorded with time for both the GSH-added system and the PLE-added system during the reaction. The result obtained is shown in FIG. As shown in FIG. 11 (B), the addition of porcine liver esterase (PLE) rapidly changed the absorption spectrum of Ps-TAc, and after 60 minutes, showed an absorption spectrum similar to that of FIG. 4 (A) described above. Was. From this, the ester bond consisting of the phenolic hydroxy group and the acetyl group of the xanthene ring constituting the fluorophore was hydrolyzed by the action of PLE, exposing the phenolic hydroxy group (that is, Ps-TAc was converted to Ps-TC Has been converted to Further, as shown in FIG. 11 (B), this change is also caused by the action of reduced GSH (ester cleavage action) present in cells at a relatively high concentration (usually in an amount of about 1 to 10 mM). It was confirmed to proceed. For this reason, among the fluorescent probes represented by the general formula (2) according to the present invention, those in which the phenolic hydroxy group is acylated (the one in which the substituent R 2 is an acyl group; Ps-TAc or Ps-DCTAc) And the like), even in cells with low intracellular esterase activity, are converted to the corresponding phenolic hydroxy group-containing fluorescent probe (substituent R 2 is a hydrogen atom) independently of enzyme activity by the action of reduced GSH. Expected to be converted. In addition, as a result of performing the same experiment for Ps-DCTAc, the same result as shown in FIGS. 11A and 11B was obtained.
以上の結果から、Ｐｓ−ＴＡｃおよびＰｓ−ＤＣＴＡｃは、生細胞に添加されると、図１２に示すような機構によってまず細胞膜を透過して細胞内へ取り込まれ、その後に細胞内に存在するエステラーゼの加水分解作用を受けて脱アセチル化されて、対応するアルコール（Ｐｓ−ＴＧやＰｓ−ＤＣＴＧ）へと変換される。そして、Ｐｓ−ＴＧやＰｓ−ＤＣＴＧはＧＳＴＰ１選択的な蛍光プローブであることから、取り込まれた細胞内にＧＳＴＰ１が存在すれば、その作用によりグルタチオン化を受けて強い蛍光を発するものと推定される。 From the above results, when Ps-TAc and Ps-DCTAc were added to living cells, they were first permeated through the cell membrane and taken up into cells by the mechanism shown in FIG. The compound is deacetylated by the hydrolysis of the compound, and is converted into the corresponding alcohol (Ps-TG or Ps-DCTG). Since Ps-TG and Ps-DCTG are GSTP1-selective fluorescent probes, it is presumed that if GSTP1 is present in the taken-in cells, it undergoes glutathione formation and emits strong fluorescence. .
［細胞イメージング（２）］
上記で作製した２種類のアセチル化蛍光プローブ（Ｐｓ−ＴＡｃ、Ｐｓ−ＤＣＴＡｃ）について、上述した「細胞イメージング（１）」と同様の発現ベクターｐＩＲＥＳ２−ＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ２を用いた手法により３種類のＧＳＴ分子種（ＧＳＴＰ１、ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＡ１）のそれぞれを発現させたＭＣＦ−７細胞へ適用した際の細胞イメージングを行った。[Cell imaging (2)]
Regarding the two types of acetylated fluorescent probes (Ps-TAc, Ps-DCTAc) prepared above, three types of GST molecules were obtained by the same method using the expression vector pIRES2-DsRed Express2 similar to the above “cell imaging (1)”. Cell imaging was performed when each of the seeds (GSTP1, GSTM1, GSTA1) was applied to MCF-7 cells expressing the same.
具体的には、上述した発現ベクターｐＩＲＥＳ２−ＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ２を用いて３種類のＧＳＴ分子種（ＧＳＴＰ１、ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＡ１）のそれぞれをＮ末端が３ｘＦＬＡＧタグ化されたｃＤＮＡとして発現させたＭＣＦ−７細胞に対し、２．５μＭのＰｓ−ＴＡｃまたはＰｓ−ＤＣＴＡｃを３７℃、５％ＣＯ２条件下で５分間インキュベーションした後に、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて観察を行った。その結果得られた画像から、ＧＳＴの発現を示すＤｓＲｅｄ発現細胞（赤色蛍光あり）を＋、非発現細胞を−として、それぞれの細胞における蛍光プローブ由来の緑色蛍光の蛍光強度を算出した。Specifically, MCF-7 cells in which each of the three GST molecular species (GSTP1, GSTM1, and GSTA1) was expressed as cDNA having an N-terminal 3xFLAG-tagged using the above-described expression vector pIRES2-DsRed Express2. On the other hand, 2.5 μM Ps-TAc or Ps-DCTAc was incubated at 37 ° C. for 5 minutes under 5% CO 2 conditions, and then observed using a confocal laser scanning microscope. From the resulting images, the fluorescence intensity of green fluorescence derived from the fluorescent probe in each cell was calculated, with DsRed expressing cells (with red fluorescence) indicating GST expression as + and non-expressing cells as −.
結果を図１３に示す。ここで、図１３の（Ａ）はＰｓ−ＴＡｃの化学構造式であり、（Ｂ）はイメージング画像（スケールバーはいずれも４０μｍである）であり、（Ｃ）は各種ＧＳＴが発現しているＤｓＲｅｄの発現細胞（＋）および非発現細胞（−）における緑色蛍光の蛍光強度を比較したグラフである。同様に、図１３の（Ｄ）はＰｓ−ＤＣＴＡｃの化学構造式であり、（Ｅ）はイメージング画像（スケールバーはいずれも４０μｍである）であり、（Ｆ）は各種ＧＳＴが発現しているＤｓＲｅｄの発現細胞（＋）および非発現細胞（−）における緑色蛍光の蛍光強度を比較したグラフである。 FIG. 13 shows the results. Here, (A) of FIG. 13 is a chemical structural formula of Ps-TAc, (B) is an imaging image (all scale bars are 40 μm), and (C) expresses various GSTs. It is the graph which compared the fluorescence intensity of green fluorescence in the cell (+) which expresses DsRed, and the cell which does not express (-). Similarly, (D) in FIG. 13 is a chemical structural formula of Ps-DCTAc, (E) is an imaging image (scale bars are all 40 μm), and (F) expresses various GSTs. It is the graph which compared the fluorescence intensity of green fluorescence in the cell (+) which expresses DsRed, and the cell which does not express (-).
図１３に示すように、ＧＳＴＰ１発現細胞において強い緑色蛍光が検出されたことから、Ｐｓ−ＴＡｃおよびＰｓ−ＤＣＴＡｃは細胞内におけるＧＳＴＰ１活性を選択的に検出していることが示された。なお、Ｐｓ−ＴＡｃとＰｓ−ＤＣＴＡｃとのシグナル／バックグラウンド比を比較すると、Ｐｓ−ＴＡｃの方が高い結果となった。したがって、以下の検討では、Ｐｓ−ＴＡｃを用いて実験を行った。 As shown in FIG. 13, strong green fluorescence was detected in the GSTP1-expressing cells, indicating that Ps-TAc and Ps-DCTAc selectively detected GSTP1 activity in the cells. When comparing the signal / background ratio between Ps-TAc and Ps-DCTAc, Ps-TAc showed a higher result. Therefore, in the following examination, an experiment was performed using Ps-TAc.
続いて、細胞質型ＧＳＴおよびミトコンドリア型ＧＳＴの各種分子種をＭＣＦ−７細胞に発現させ、蛍光プローブ（Ｐｓ−ＴＡｃ）のＧＳＴＰ１選択性を評価した。具体的には、上記と同様の手法により、異なる８クラス１８種類のＧＳＴのそれぞれを組み込んだｐＩＲＥＳ２−ＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ２／３ｘＦＬＡＧ−ＧＳＴをＭＣＦ−７細胞へトランスフェクションした。 Subsequently, various molecular species of cytoplasmic GST and mitochondrial GST were expressed in MCF-7 cells, and the GSTP1 selectivity of the fluorescent probe (Ps-TAc) was evaluated. Specifically, pIRES2-DsRed Express2 / 3xFLAG-GST incorporating each of eight different 18 classes of GST was transfected into MCF-7 cells by the same method as described above.
次いで、各ＧＳＴ分子種の発現をウエスタンブロッティングにより確認した。具体的には、等量のタンパク質（ＧＳＴ発現ＭＣＦ−７細胞由来）をＳＤＳ−ポリアクリルアミド（ＰＡＧＥ）ゲル電気泳動（１２．５％ポリアクリルアミド）によって分離した後、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレンに転写した。そして、０．１％ポンソーＳ染色液（株式会社ビークル製）にてＰＶＤＦメンブレン上へのタンパク転写を確認した後、３％スキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むトリス緩衝液）中、室温にて１時間振盪した。ＴＢＳ−Ｔで３回（各５分間）洗浄した後、一次抗体として抗ＦＬＡＧ−Ｍ２マウスＩｇＧ抗体（希釈倍率１：５０００、シグマアルドリッチジャパン合同会社）または抗β−アクチンウサギＩｇＧ抗体（希釈倍率１：４０００、生物医学研究所）を含むＴＢＳ−Ｔ（５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む）中、４℃にて一晩振盪した。ＴＢＳ−Ｔで３回（各５分間）洗浄して余分な抗体を取り除いた後、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウスＩｇＧ抗体または西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ウサギＩｇＧ抗体（両者ともに希釈倍率１：２５００、プロメガ株式会社）を含むＴＢＳ−Ｔ（５％ＢＳＡ含む）中にて室温で１時間振盪した。目的タンパク質の検出は、ルミノールおよび過酸化水素を含む発光試薬を用いた化学発光法により、冷却ＣＣＤカメラシステムＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ４０００（富士フイルム株式会社製）を用いて行った。 Next, the expression of each GST molecular species was confirmed by Western blotting. Specifically, after separating equal amounts of proteins (derived from GST-expressing MCF-7 cells) by SDS-polyacrylamide (PAGE) gel electrophoresis (12.5% polyacrylamide), the proteins were separated on a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane. Transcribed. Then, after confirming the transfer of the protein onto the PVDF membrane with 0.1% Ponceau S staining solution (manufactured by Vehicle Co., Ltd.), TBS-T containing 3% skim milk (Tris buffer containing 0.1% Tween-20) was used. Liquor) for 1 hour at room temperature. After washing with TBS-T three times (5 minutes each), an anti-FLAG-M2 mouse IgG antibody (dilution ratio 1: 5000, Sigma-Aldrich Japan GK) or an anti-β-actin rabbit IgG antibody (dilution ratio 1) was used as a primary antibody. : 4000, Biomedical Research Laboratories) in TBS-T (containing 5% bovine serum albumin (BSA)) at 4 ° C overnight. After washing three times (5 minutes each) with TBS-T to remove excess antibodies, a horseradish peroxidase (HRP) -conjugated anti-mouse IgG antibody or a horseradish peroxidase (HRP) -conjugated anti-rabbit IgG antibody (secondary antibody) was used. Both were shaken at room temperature for 1 hour in TBS-T (containing 5% BSA) containing a dilution ratio of 1: 2500, Promega Corporation. The target protein was detected by a chemiluminescence method using a luminescent reagent containing luminol and hydrogen peroxide, using a cooled CCD camera system ImageQuant LAS4000 (manufactured by FUJIFILM Corporation).
上記のようにして行ったウエスタンブロッティングの結果を図１４に示す。図１４に示すように、いずれのＧＳＴ分子種を発現させたＭＣＦ−７細胞においても、目的のＧＳＴタンパク質が発現していることが確認された。 FIG. 14 shows the results of Western blotting performed as described above. As shown in FIG. 14, it was confirmed that the target GST protein was expressed in MCF-7 cells expressing any of the GST molecular species.
続いて、ＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ２の赤色蛍光を示す細胞において確かにＧＳＴタンパク質が発現していることを確かめるため、蛍光免疫染色を行った。具体的には、各ＧＳＴ分子種を発現させたＭＣＦ−７細胞を４％パラホルムアルデヒドＰＢＳ溶液中、室温にて１５分間固定した。その後、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ溶液で３０分間処理することにより、細胞膜透過処理を施した。そして、抗体バッファー（１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）中、室温にて１時間インキュベーションした後、抗ＦＬＡＧ−Ｍ２マウスＩｇＧ抗体（希釈倍率１：５００、シグマアルドリッチジャパン合同会社）を加え、４℃にて一晩インキュベーションした。細胞をＰＢＳで５分間インキュベートして洗浄して、余分な一次抗体を除去した（合計５回）。次いで、細胞をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７ラベルされた抗マウスＩｇＧヤギ抗体（希釈倍率１：１０００、アブカム株式会社）を含む抗体バッファー中、室温にて１時間インキュベーションした後、ＰＢＳで５分間インキュベートして洗浄して、余分な二次抗体を除去した（合計５回）。そして、細胞を褪色防止用封入剤であるＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ（登録商標）Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）含有）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に封入した。そして、共焦点レーザー走査型顕微鏡下で観察を行った。なお、本実験において、共焦点レーザー走査型顕微鏡としてはＦＬＵＯＶＩＥＷ ＦＶ１０００（オリンパス株式会社製）を用いた。また、本実験において、ＤＡＰＩ、ＤｓＲｅｄおよびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の各蛍光色素について、それぞれ４０５ｎｍ、５８３ｎｍ、および６３５ｎｍの波長のレーザー光を用いて励起し、対応したフィルタセットを用いて検出を行った。 Subsequently, fluorescent immunostaining was performed to confirm that the GST protein was certainly expressed in the cells showing the red fluorescence of DsRed Express2. Specifically, MCF-7 cells expressing each GST molecular species were fixed in a 4% paraformaldehyde PBS solution at room temperature for 15 minutes. Thereafter, the cells were treated with a PBS solution containing 0.1% Triton X-100 for 30 minutes to perform a cell membrane permeation treatment. After incubation in an antibody buffer (PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Triton X-100 and 0.1% sodium azide) at room temperature for 1 hour, anti-FLAG-M2 mouse IgG An antibody (dilution ratio 1: 500, Sigma-Aldrich Japan GK) was added and incubated at 4 ° C. overnight. Cells were incubated with PBS for 5 minutes and washed to remove excess primary antibody (5 times in total). The cells were then incubated for 1 hour at room temperature in an antibody buffer containing AlexaFluor® 647-labeled anti-mouse IgG goat antibody (dilution factor 1: 1000, Abcam), followed by a 5 minute incubation with PBS. To remove excess secondary antibody (5 times in total). Then, the cells were sealed in ProLong Gold (registered trademark) Antifade Reagent (containing 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)) (Thermo Fisher Scientific), which is a mounting agent for preventing fading. Then, observation was performed under a confocal laser scanning microscope. In this experiment, FLUOVIEW FV1000 (manufactured by Olympus Corporation) was used as a confocal laser scanning microscope. In this experiment, each of the fluorescent dyes DAPI, DsRed, and AlexaFluor647 was excited using laser light having a wavelength of 405 nm, 583 nm, and 635 nm, respectively, and was detected using a corresponding filter set.
結果を図１５に示す。ここで、図１５において、「ＤＡＰＩ」、「ＤｓＲｅｄ」、「Ａｌｅｘａ６４７」はそれぞれの蛍光色素による発光を撮影した画像であり、「Ｍｅｒｇｅ」はこれらの重ね合わせ画像である。図１５に示すように、赤色蛍光を示したすべての細胞において３ｘＦＬＡＧ−ＧＳＴが発現していることが確認された。 FIG. 15 shows the results. Here, in FIG. 15, “DAPI”, “DsRed”, and “Alexa647” are images obtained by capturing the light emission of each fluorescent dye, and “Merge” is a superimposed image of these. As shown in FIG. 15, it was confirmed that 3xFLAG-GST was expressed in all cells that showed red fluorescence.
続いて、上記で各種ＧＳＴ分子種のいずれかを発現させたＭＣＦ−７細胞に対してＰｓ−ＴＡｃをインキュベーション後、落射蛍光顕微鏡を用いて蛍光イメージングを行った。具体的には、各種ＧＳＴ分子種のそれぞれを３ｘＦＬＡＧタグ化されたｃＤＮＡとして発現させたＭＣＦ−７細胞に対し、２．５μＭのＰｓ−ＴＡｃを３７℃、５％ＣＯ２条件下で５分間インキュベーションした後に、落射型蛍光顕微鏡ＩＸ８０（オリンパス株式会社）を用いた観察によって行った。なお、プローブ由来の蛍光およびＤｓＲｅｄ由来の蛍光は、それぞれＵ−ＭＮＩＢＡフィルタセット（励起波長：４７０〜４９５ｎｍ、蛍光波長：５１０〜５５０ｎｍ）およびＵ−ＭＷＩＧフィルタセット（励起波長：５３０〜５５０ｎｍ、蛍光波長：５７５ｎｍ以上）を用いて観察した。Subsequently, Ps-TAc was incubated with MCF-7 cells expressing any of the various GST molecular species as described above, and fluorescence imaging was performed using an epifluorescence microscope. Specifically, 2.5 μM Ps-TAc was incubated for 5 minutes at 37 ° C. and 5% CO 2 with respect to MCF-7 cells expressing various GST molecular species as 3 × FLAG-tagged cDNAs. After that, observation was performed using an epi-illumination type fluorescence microscope IX80 (Olympus Corporation). In addition, the fluorescence derived from the probe and the fluorescence derived from DsRed were respectively determined by using a U-MNIBA filter set (excitation wavelength: 470 to 495 nm, fluorescence wavelength: 510 to 550 nm) and a U-MWIG filter set (excitation wavelength: 530 to 550 nm, fluorescence wavelength). : 575 nm or more).
結果を図１６に示す。ここで、図１６の「ＦＩＴＣ」は蛍光プローブ（Ｐｓ−ＴＡｃ）由来の緑色蛍光の画像であり、「ＤｓＲｅｄ」はＤｓＲｅｄ由来の赤色蛍光の画像であり、「Ｍｅｒｇｅ」はこれらの重ね合わせ画像である（スケールバーはいずれも２０μｍである）。また、ＧＳＴＰ１発現細胞の観察画像を拡大したものを図１７（Ａ）に示し、各画像における緑色蛍光の強度を各ＧＳＴ発現細胞間で定量化したグラフを図１７（Ｂ）に示す（測定に用いた細胞数は２０個である）。図１６および図１７に示すように、ＧＳＴＰ１発現細胞のみにおいて蛍光プローブ由来の緑色蛍光が観察され、その他のＧＳＴ分子種を発現している細胞では緑色蛍光は観察されなかった。このことから、本発明に係る蛍光プローブ（Ｐｓ−ＴＡｃ）は高いＧＴＳＰ１選択性を示すことが確認された。 FIG. 16 shows the results. Here, “FITC” in FIG. 16 is an image of green fluorescence derived from the fluorescent probe (Ps-TAc), “DsRed” is an image of red fluorescence derived from DsRed, and “Merge” is a superimposed image of these. (All scale bars are 20 μm). FIG. 17 (A) shows an enlarged observation image of GSTP1-expressing cells, and FIG. 17 (B) shows a graph in which the intensity of green fluorescence in each image is quantified among the GST-expressing cells. The number of cells used is 20). As shown in FIGS. 16 and 17, green fluorescence derived from the fluorescent probe was observed only in the GSTP1-expressing cells, and green fluorescence was not observed in the cells expressing other GST molecular species. From this, it was confirmed that the fluorescent probe (Ps-TAc) according to the present invention exhibited high GTSP1 selectivity.
ところで、ＭＣＦ−７細胞においてはＧＳＴＰ１遺伝子のプロモーター領域がメチル化されており、これによってＧＳＴＰ１の発現が低いことが知られている。そこで、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤として利用されている５−アザシチジンを用いてＭＣＦ−７細胞を処理することによりＧＳＴＰ１を発現させ、このようにして発現したＧＳＴＰ１の活性をＰＳ−ＴＡｃを用いて捕えることが可能であるかどうかを検証した。 By the way, in the MCF-7 cell, the promoter region of the GSTP1 gene is methylated, and it is known that the expression of GSTP1 is low. Therefore, GSTP1 is expressed by treating MCF-7 cells with 5-azacytidine used as a DNA methyltransferase inhibitor, and the activity of GSTP1 thus expressed is captured using PS-TAc. We verified whether or not is possible.
具体的には、ＭＣＦ−７細胞を播種した翌日に、培地をベヒクルまたは５μＭの５−アザシチジンを含む培地へと交換した。そして、この培地交換から３日後に０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡによって細胞を剥がし、１．０×１０５細胞／ディッシュとなるように３５ｍｍガラスボトムディッシュに細胞を播種して、５−アザシチジン処理からの時間が９６時間を超えるまで静置した。その後、細胞培養用培地を除去し、ＰＢＳ（日水製薬株式会社）で細胞を２回洗浄し、２．５μＭの蛍光プローブ（Ｐｓ−ＴＡｃ）および１０μｇ／ｍＬの蛍光色素Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（ＤＮＡに結合するため生細胞の核を染色可能である）を含むＨａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ，ハンクス平衡塩溶液）（和光純薬工業株式会社）を加え、３７℃にて２０分間インキュベーションした。プローブ溶液を除去し、ＰＢＳで細胞を１回洗浄した後、再びＨＢＳＳを加えて共焦点レーザー走査型顕微鏡により観察を行った。なお、共焦点レーザー走査型顕微鏡としてはＦＬＵＯＶＩＥＷ ＦＶ１０ｉ−ＤＯＣ（オリンパス株式会社製）を用い、蛍光プローブの蛍光は波長４７３ｎｍのＬＤレーザーにより励起させ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８の蛍光は波長４０５ｎｍのＬＤレーザーにより励起させて、対応する蛍光スペクトルにおける蛍光画像を取得した。Specifically, the day after the seeding of the MCF-7 cells, the medium was replaced with a vehicle or a medium containing 5 μM of 5-azacytidine. Then, three days after the medium exchange, the cells were detached with 0.25% trypsin-EDTA, and the cells were seeded on a 35 mm glass bottom dish at 1.0 × 10 5 cells / dish, followed by treatment with 5-azacytidine. Was allowed to stand for more than 96 hours. Thereafter, the cell culture medium was removed, the cells were washed twice with PBS (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), and a 2.5 μM fluorescent probe (Ps-TAc) and 10 μg / mL fluorescent dye Hoechst 33258 (bound to DNA). Therefore, Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS, Hanks Balanced Salt Solution) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing viable cell nuclei (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added and incubated at 37 ° C. for 20 minutes. After removing the probe solution and washing the cells once with PBS, HBSS was added again and observation was performed with a confocal laser scanning microscope. In addition, FLUOVIEW FV10i-DOC (manufactured by Olympus Corporation) was used as the confocal laser scanning microscope, and the fluorescence of the fluorescent probe was excited by an LD laser having a wavelength of 473 nm, and the fluorescence of Hoechst 33258 was excited by an LD laser having a wavelength of 405 nm. And a fluorescence image at the corresponding fluorescence spectrum was obtained.
結果を図１８に示す。ここで、図１８（Ａ）は上記の処理を施したＭＣＦ−７細胞のイメージング画像であり、図１８（Ｂ）はコントロール群および５−アザシチジン投与群のそれぞれからランダムに抽出した６０個ずつの細胞における蛍光強度の分布を示す図である。図１８に示すように、コントロール群では蛍光プローブに由来する強蛍光性の細胞が観察されなかったのに対し、５−アザシチジン投与群では非常に高い蛍光強度を示す細胞が観察された。この結果は、５−アザシチジンの投与によってＤＮＡメチルトランスフェラーゼが阻害され、ＭＣＦ−７細胞におけるＧＳＴＰ１遺伝子のプロモーター領域のメチル化が解除される結果、ＧＳＴＰ１遺伝子の発現が誘導されたことによるものと推定された。 The results are shown in FIG. Here, FIG. 18 (A) is an imaging image of MCF-7 cells subjected to the above-described processing, and FIG. 18 (B) is a graph showing 60 randomly extracted MCF-7 cells from the control group and the 5-azacytidine administration group. It is a figure showing distribution of fluorescence intensity in a cell. As shown in FIG. 18, no strong fluorescent cells derived from the fluorescent probe were observed in the control group, whereas cells showing extremely high fluorescence intensity were observed in the 5-azacytidine-administered group. This result is presumed to be due to the fact that DNA methyltransferase was inhibited by administration of 5-azacytidine and methylation of the GSTP1 gene promoter region in MCF-7 cells was released, resulting in induction of GSTP1 gene expression. Was.
そこで、この仮説を検証することを目的として、５μＭの５−アザシチジンを培地中へ加えて処理したＭＣＦ−７細胞に対して、さらにｓｉＲＮＡを投与することでＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）を行い、ＧＳＴＰ１の発現を抑制することを試みた。具体的には、上記で強蛍光性の細胞が観察された５−アザシチジン投与群のＭＣＦ−７細胞に対し、３０ｐｍｏｌのコントロールｓｉＲＮＡまたはＧＳＴＰ１ ｓｉＲＮＡ（インビトロジェン社製）のそれぞれを４μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて細胞へ導入した。ｓｉＲＮＡの導入から２４時間後以降、細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡによって剥がし、全細胞を６〜１０ｍＬのＤＭＥＭに懸濁し、３５ｍｍガラスボトムディッシュに再播種して、再播種からさらに２４時間後以降に上記と同様の手法により共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて観察を行った。Therefore, for the purpose of verifying this hypothesis, RNAi (RNA interference) was performed by further administering siRNA to MCF-7 cells treated with 5 μM of 5-azacytidine added to the culture medium to perform GSTP1 An attempt was made to suppress expression. Specifically, 30 μmol of control siRNA or GSTP1 siRNA (manufactured by Invitrogen) were each added to 4 μL of Lipofectamine ™ RNAiMAX Transfection with respect to MCF-7 cells in the 5-azacytidine-administered group in which the strongly fluorescent cells were observed. The cells were introduced into the cells using Reagent (Thermo Fisher Scientific). After 24 hours from the introduction of siRNA, cells were detached with 0.25% trypsin-EDTA, all cells were suspended in 6 to 10 mL of DMEM, replated in a 35 mm glass bottom dish, and further 24 hours after replating. Thereafter, observation was performed using a confocal laser scanning microscope in the same manner as described above.
結果を図１９に示す。ここで、図１９（Ａ）は上記の処理を施したＭＣＦ−７細胞のイメージング画像であり、このうち「Ｍｅｒｇｅ（×１０）」は「Ｍｅｒｇｅ」画像の１０倍拡大画像である。また、図１９（Ｂ）はコントロールｓｉＲＮＡ投与群およびＧＳＴＰ１ ｓｉＲＮＡ投与群のそれぞれからランダムに抽出した６０個ずつの細胞における蛍光強度の分布を示す図である。図１９に示すように、ＧＳＴＰ１ ｓｉＲＮＡ投与群においては、蛍光プローブ（Ｐｓ−ＴＡｃ）由来の蛍光強度の顕著な減少が観察された。このことから、本発明に係る蛍光プローブ（Ｐｓ−ＴＡｃ）を用いることで、ＧＳＴＰ１遺伝子のプロモーター領域の脱メチル化に基づくＧＳＴＰ１タンパク質発現の有無を検出することが可能であることが示された。なお、正常上皮細胞においてはＧＳＴＰ１が発現しているが、がん化によってＧＳＴＰ１遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧ部分がメチル化されることでＧＳＴＰ１の発現が見られなくなることが知られている。したがって、本発明に係る蛍光プローブをそのような系へ適用することができれば、蛍光の有無を指標として、前立腺がん細胞（ＧＳＴＰ１が過剰発現していない）の検出を行うことも可能であると考えられる。 The results are shown in FIG. Here, FIG. 19 (A) is an imaging image of MCF-7 cells subjected to the above-described processing, and “Merge (× 10)” is a 10-times enlarged image of the “Merge” image. FIG. 19B is a diagram showing the distribution of the fluorescence intensity in 60 cells randomly extracted from each of the control siRNA administration group and the GSTP1 siRNA administration group. As shown in FIG. 19, in the GSTP1 siRNA administration group, a remarkable decrease in the fluorescence intensity derived from the fluorescent probe (Ps-TAc) was observed. This indicates that the use of the fluorescent probe (Ps-TAc) according to the present invention makes it possible to detect the presence or absence of GSTP1 protein expression based on the demethylation of the GSTP1 gene promoter region. In addition, although GSTP1 is expressed in normal epithelial cells, it is known that GSTP1 expression is not observed because the CpG portion of the promoter region of the GSTP1 gene is methylated by canceration. Therefore, if the fluorescent probe according to the present invention can be applied to such a system, it is possible to detect prostate cancer cells (GSTP1 is not overexpressed) using the presence or absence of fluorescence as an index. Conceivable.
さらに、がん細胞に発現する内在性のＧＳＴＰ１の発現を可視化することが可能かどうか評価することを目的として、ＧＳＴＰ１を発現している繊維芽肉腫由来細胞であるＨＴ１０８０細胞に対して本発明に係る蛍光プローブ（ＰＳ−ＴＡｃ）を適用した。この際、ＧＳＴＰ１特異性を調べることを目的として、上記と同様にｓｉＲＮＡをトランスフェクションして、ＨＴ１０８０細胞においてもＧＳＴＰ１がノックダウンされるかどうかの確認も併せて行った。 Furthermore, for the purpose of evaluating whether or not it is possible to visualize the expression of endogenous GSTP1 expressed in cancer cells, the present invention relates to HT1080 cells, which are GSTP1-expressing fibroblast sarcoma-derived cells, in the present invention. Such a fluorescent probe (PS-TAc) was applied. At this time, for the purpose of examining GSTP1 specificity, siRNA was transfected in the same manner as described above, and it was also confirmed whether GSTP1 was knocked down in HT1080 cells.
具体的には、６ウェルプレートに２．０×１０５細胞／ウェルとなるようにＨＴ１０８０細胞を播種した翌日、３０ｐｍｏｌのコントロールｓｉＲＮＡまたはＧＳＴＰ１ ｓｉＲＮＡ（インビトロジェン社製）のそれぞれを４μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて細胞へ導入した。ｓｉＲＮＡの導入から２４時間後以降、細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡによって剥がし、全細胞を６〜１０ｍＬのＤＭＥＭに懸濁し、３５ｍｍガラスボトムディッシュに再播種して、再播種からさらに２４時間後以降に上記と同様の手法により共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて観察を行った。また、やはり上記と同様の手法により、ウエスタンブロッティングによってＧＳＴＰ１のノックダウンを確認した。Specifically, the day after HT1080 cells were seeded at 2.0 × 10 5 cells / well in a 6-well plate, 30 μmol of control siRNA or GSTP1 siRNA (manufactured by Invitrogen) were each added to 4 μL of Lipofectamine ™ RNAiMAX Transfection. The cells were introduced into the cells using Reagent (Thermo Fisher Scientific). After 24 hours from the introduction of siRNA, cells were detached with 0.25% trypsin-EDTA, all cells were suspended in 6 to 10 mL of DMEM, replated in a 35 mm glass bottom dish, and further 24 hours after replating. Thereafter, observation was performed using a confocal laser scanning microscope in the same manner as described above. Also, knockdown of GSTP1 was confirmed by Western blotting in the same manner as described above.
結果を図２０に示す。ここで、図２０（Ａ）はウエスタンブロッティングの結果を示す電気泳動写真である。また、図２０（Ｂ）は上記の処理を施したＨＴ１０８０細胞のイメージング画像であり、このうち「Ｍｅｒｇｅ（ｗｉｄｅ ｆｉｅｌｄ）」は「Ｍｅｒｇｅ」画像の６倍拡大画像である。さらに、図２０（Ｃ）はコントロールｓｉＲＮＡ投与群およびＧＳＴＰ１ ｓｉＲＮＡ投与群のそれぞれからランダムに抽出した６０個ずつの細胞における蛍光強度の分布を示す図である。そして、図２０（Ｄ）はコントロールｓｉＲＮＡおよびＧＳＴＰ１ ｓｉＲＮＡをそれぞれ投与した細胞群におけるＰｓ−ＴＡｃの投与前並びに投与後６分、１０分および１５分経過後のイメージング画像（ｍｅｒｇｅ（ｗｉｄｅ ｆｉｅｌｄ）に対応）である。図２０（Ａ）に示す結果から、ＨＴ１０８０細胞において発現している内因性ＧＳＴＰ１の活性もまた、ＧＳＴＰ１ ｓｉＲＮＡの投与によってノックダウンを受けることが確認された。また、図２０の（Ｂ）および（Ｃ）に示すように、ＨＴ１０８０細胞においても、コントロールｓｉＲＮＡ投与群では蛍光プローブ（Ｐｓ−ＴＡｃ）由来の蛍光が観察され、この蛍光はＧＳＴＰ１ ｓｉＲＮＡの投与によって大きく減弱した。さらに、図２０（Ｄ）に示すように、本発明の蛍光プローブ（Ｐｓ−ＴＡｃ）の投与によって蛍光強度は時間依存的な上昇を示したが、その一方でＧＳＴＰ１ ｓｉＲＮＡの投与により、この蛍光強度の上昇は抑制された。 The results are shown in FIG. Here, FIG. 20 (A) is an electrophoresis photograph showing the result of Western blotting. FIG. 20B is an imaging image of the HT1080 cell subjected to the above-described processing, and “Merge (wide field)” is a 6-times enlarged image of the “Merge” image. Further, FIG. 20 (C) is a diagram showing the distribution of fluorescence intensity in 60 cells randomly extracted from each of the control siRNA administration group and the GSTP1 siRNA administration group. FIG. 20 (D) corresponds to imaging images (merge (wide field)) before administration of Ps-TAc and at 6, 10, and 15 minutes after administration in the cell group to which control siRNA and GSTP1 siRNA were respectively administered. ). The results shown in FIG. 20 (A) confirmed that the activity of endogenous GSTP1 expressed in HT1080 cells was also knocked down by administration of GSTP1 siRNA. Also, as shown in FIGS. 20 (B) and (C), in the HT1080 cells, fluorescence derived from the fluorescent probe (Ps-TAc) was observed in the control siRNA-administered group, and this fluorescence was increased by the administration of GSTP1 siRNA. Weakened. Further, as shown in FIG. 20 (D), the administration of the fluorescent probe of the present invention (Ps-TAc) showed a time-dependent increase in the fluorescence intensity, while the administration of the GSTP1 siRNA caused the increase in the fluorescence intensity. Was suppressed.
以上の結果から、本発明に係る蛍光プローブ（Ｐｓ−ＴＡｃなど）は、内在的にＧＳＴＰ１を発現するがん細胞においても、その活性を検出することが可能な蛍光プローブであることが確認された。 From the above results, it was confirmed that the fluorescent probe (such as Ps-TAc) according to the present invention was a fluorescent probe capable of detecting its activity even in cancer cells that intrinsically express GSTP1. .
続いて、Ｐｓ−ＴＡｃが様々ながん細胞のＧＳＴＰ１活性を捉えることができるか、また、ＧＳＴＰ１の発現の有無を評価できるか明らかとするために、Ｐｓ−ＴＡｃを各種がん細胞へ投与し、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。 Subsequently, in order to clarify whether Ps-TAc can capture GSTP1 activity of various cancer cells and evaluate the presence or absence of GSTP1 expression, Ps-TAc was administered to various cancer cells. And observed with a confocal laser microscope.
具体的には、まず、細胞を１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８を含むハンクス緩衝液中、３７℃にて、２０分間培養した。その後、培地を取り除き、リン酸ナトリウム緩衝液にて、細胞を洗浄した。続いて、２μＭのＰｓ−ＴＡｃを含むハンクス緩衝液を加え、さらに１５分間室温で培養した後、共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス）において、蛍光イメージングを行った。共焦点レーザー走査型顕微鏡としてはＦＬＵＯＶＩＥＷ ＦＶ１０ｉ−ＤＯＣ（オリンパス株式会社製）を用い、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８の蛍光は波長４０５ｎｍのＬＤレーザー、蛍光プローブの蛍光は波長４７３ｎｍのＬＤレーザーにより励起させ、それぞれ対応する蛍光スペクトルにおける蛍光画像を取得した。本実験では、ＧＳＴＰ１陽性細胞として、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９（大腸がん細胞）、ＨｕＣＣＴ１（胆管がん細胞）、ＤＵ１４５（前立腺がん細胞）、ＨＴ１０８０（線維肉腫細胞）を用い、また、ＧＳＴＰ１陰性細胞として、ＭＣＦ７（乳がん細胞）およびＬＮＣａＰ（前立腺がん細胞）を用いた。 Specifically, cells were first cultured in Hanks buffer containing 10 μg / mL Hoechst 33258 at 37 ° C. for 20 minutes. Thereafter, the medium was removed, and the cells were washed with a sodium phosphate buffer. Subsequently, a Hanks buffer containing 2 μM Ps-TAc was added, and the mixture was further cultured at room temperature for 15 minutes, and then fluorescence imaging was performed using a confocal laser microscope (Olympus). FLUOVIEW FV10i-DOC (manufactured by Olympus Corporation) was used as a confocal laser scanning microscope. Fluorescent images in the spectrum were acquired. In this experiment, HCT116, HT29 (colorectal cancer cells), HuCCT1 (bile duct cancer cells), DU145 (prostate cancer cells), and HT1080 (fibrosarcoma cells) were used as GSTP1-positive cells. , MCF7 (breast cancer cells) and LNCaP (prostate cancer cells).
結果を図２１に示す。なお、図２１に示す写真のうち、各細胞に対応する上段の写真は蛍光画像であり、下段の写真は白色光（ＢＦ）画像であり、ともに共焦点レーザー顕微鏡を用いて撮像したものである。図２１に示すように、細胞種によって蛍光強度、蛍光性生成物の細胞内分布などが異なるものの、本実験において用いた全てのＧＳＴＰ１発現細胞で、細胞内において蛍光を確認することができた。一方、ＧＳＴＰ１非発現細胞では、蛍光強度上昇が見られなかった。 The results are shown in FIG. In addition, among the photographs shown in FIG. 21, the upper photograph corresponding to each cell is a fluorescent image, the lower photograph is a white light (BF) image, both of which were taken using a confocal laser microscope. . As shown in FIG. 21, although the fluorescence intensity, the intracellular distribution of the fluorescent product, and the like differ depending on the cell type, the fluorescence was confirmed in the cells of all the GSTP1-expressing cells used in this experiment. On the other hand, in GSTP1 non-expressing cells, no increase in fluorescence intensity was observed.
［蛍光プローブの合成（３）］
上記とは異なる蛍光団を有する蛍光プローブの作製を試みた（下記の反応スキーム６）。[Synthesis of fluorescent probe (3)]
An attempt was made to produce a fluorescent probe having a fluorophore different from the above (reaction scheme 6 below).
（化合物（ｇ）の合成；２−（４−アミノフェニル）−６−ブロモ−１Ｈ−ベンゾ［デ］イソキノリン−１，３（２Ｈ）−ジオン）
４−ブロモ−１，８−ナフタル酸無水物（５０５．３ｍｇ，１．８ｍｍｏｌ）と１，４−ジアミノベンゼン（２４７．２ｍｇ，２．３ｍｍｏｌ）をエタノール（６．０ｍＬ）に懸濁させ、１０時間加熱還流を行なった。反応液を室温まで冷却し、沈殿を濾取し、目的化合物を収率９１％（６０９．８ｍｇ，１．６ｍｍｏｌ）で得た。(Synthesis of Compound (g); 2- (4-aminophenyl) -6-bromo-1H-benzo [de] isoquinoline-1,3 (2H) -dione)
4-Bromo-1,8-naphthalic anhydride (505.3 mg, 1.8 mmol) and 1,4-diaminobenzene (247.2 mg, 2.3 mmol) were suspended in ethanol (6.0 mL), and suspended in ethanol (6.0 mL). The mixture was heated under reflux for an hour. The reaction solution was cooled to room temperature, and the precipitate was collected by filtration to obtain the desired compound in a yield of 91% (609.8 mg, 1.6 mmol).
（化合物（ｇ）の機器データ）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．５３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），８．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８），８．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８），７．９８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０），６．９４（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．６，２．１），６．６４（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．６，２．１），５．２６（２Ｈ，ｓ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６３．４，１６３．７，１４８．６，１３２．５，１３１．５，１３１．３，１３０．９，１２９．８，１２９．１，１２８．９，１２８．８，１２８．６，１２３．４，１２２．７，１１３．７
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ） ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１８Ｈ１２Ｎ２Ｏ２Ｂｒ［Ｍ＋Ｈ］＋：３６７．００８２，ｆｏｕｎｄ；３６７．００７８（−０．４ｍｍｕ）。(Equipment data of compound (g))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.53 (2H, d, J = 8.2), 8.29 (1H, d, J = 7.8), 8.20 (1H, d, J = 7.8), 7.98 (1H, t, J = 8.0), 6.94 (2H, dd, J = 6.6, 2.1), 6.64 (2H, dd, J) = 6.6, 2.1), 5.26 (2H, s)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ 163.4, 163.7, 148.6, 132.5, 131.5, 131.3, 130.9, 129.8, 129.1, 128. 9, 128.8, 128.6, 123.4, 122.7, 113.7
HRMS (ESI-TOF) m / z calcd for C 18 H 12 N 2 O 2 Br [M + H] +: 367.0082, found; 367.0078 (-0.4mmu).
（化合物（ｈ）の合成；２−（４−アミノフェニル）−６−（アゼチジン−１−イル）−１Ｈ−ベンゾ［デ］イソキノリン−１，３（２Ｈ）−ジオン）
化合物（ｇ）（２００．０ｍｇ，０．５４ｍｍｏｌ）とアゼチジン塩酸塩（１５３．１ｍｇ，１．６ｍｍｏｌ）と炭酸セシウム（５６２．４ｍｇ，１．７ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（３．０ｍＬ）に懸濁させ、８０℃で８時間撹拌した。反応液を室温まで冷却し、水（１００ｍＬ）に注ぎ、沈殿を濾取し、目的化合物を収率９２％で得た。(Synthesis of Compound (h); 2- (4-aminophenyl) -6- (azetidin-1-yl) -1H-benzo [de] isoquinoline-1,3 (2H) -dione)
Compound (g) (200.0 mg, 0.54 mmol), azetidine hydrochloride (153.1 mg, 1.6 mmol) and cesium carbonate (562.4 mg, 1.7 mmol) are suspended in dimethyl sulfoxide (3.0 mL). And stirred at 80 ° C. for 8 hours. The reaction solution was cooled to room temperature, poured into water (100 mL), and the precipitate was collected by filtration to obtain the desired compound in a yield of 92%.
（化合物（ｈ）の機器データ）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．４１（２Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝７．９，１．１），８．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７），７．６２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，７．３），６．８６（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．６，２．１），６．６１（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．６，２．１），６．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７），５．２０（２Ｈ，ｓ），４．５０（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３），２．５３（２Ｈ，ｓ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６４．２，１６３．４，１５２．３，１４８．２，１３２．８，１３０．８，１３０．３，１２９．２，１２４．３，１２４．０，１２２．３，１２０．３，１１３．７，１０８．９，１０６．１，５５．２，４０．１，１６．５
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ） ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２１Ｈ１８Ｎ３Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋：３４４．１３９９，ｆｏｕｎｄ；３４４．１３９４（−０．５ｍｍｕ）。(Instrument data of compound (h))
1 H-NMR (400MHz, DMSO -d 6) δ8.41 (2H, td, J = 7.9,1.1), 8.20 (1H, d, J = 8.7), 7.62 ( 1H, dd, J = 8.2, 7.3), 6.86 (2H, dd, J = 6.6, 2.1), 6.61 (2H, dd, J = 6.6, 2.. 1), 6.50 (1H, d, J = 8.7), 5.20 (2H, s), 4.50 (4H, t, J = 7.3), 2.53 (2H, s)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ 164.2, 163.4, 152.3, 148.2, 132.8, 130.8, 130.3, 129.2, 124.3, 124. 0, 122.3, 120.3, 113.7, 108.9, 106.1, 55.2, 40.1, 16.5
HRMS (ESI-TOF) m / z calcd for C 21 H 18 N 3 O 2 [M + H] +: 344.1399, found; 344.1394 (-0.5mmu).
（Ｐｓ−Ｎａｐｈの合成；Ｎ−（４−（６−アゼチジン−１−イル）−１，３−ジオキソ−１Ｈ−ベンゾ［デ］イソキノリン−２（３Ｈ）−イル）フェニル）−５−（メチルスルホニル）−２−ニトロベンズアミド）
化合物（ｈ）（９．６ｍｇ，０．０２８ｍｍｏｌ）と５−メシル−２−ニトロ安息香酸（４．９ｍｇ，０．０２３ｍｍｏｌ）、ＷＳＣＤ・ＨＣｌ（７．４ｍｇ，０．０３９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２ｍＬ）とクロロホルム（２ｍＬ）の混合溶媒に懸濁し、室温にて２時間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加え、０．１Ｎ ＨＣｌで２回、飽和炭酸水素ナトリウムで１回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。残渣をアセトニトリル（３ｍＬ）に溶解させて、水（１０ｍＬ）に滴下し、沈殿を濾取した。得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／酢酸エチル＝４：１）で精製し、目的化合物（Ｐｓ−Ｎａｐｈ）を収率２０％で得た（２．６ｍｇ，０．００４６ｍｍｏｌ）。(Synthesis of Ps-Naph; N- (4- (6-azetidin-1-yl) -1,3-dioxo-1H-benzo [de] isoquinolin-2 (3H) -yl) phenyl) -5- (methyl Sulfonyl) -2-nitrobenzamide)
Compound (h) (9.6 mg, 0.028 mmol), 5-mesyl-2-nitrobenzoic acid (4.9 mg, 0.023 mmol), and WSCD.HCl (7.4 mg, 0.039 mmol) in acetonitrile (2 mL) And chloroform (2 mL), and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. Ethyl acetate was added to the reaction solution, and the mixture was washed twice with 0.1N HCl, once with saturated sodium bicarbonate, and once with saturated saline. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. The residue was dissolved in acetonitrile (3 mL), added dropwise to water (10 mL), and the precipitate was collected by filtration. The obtained solid was purified by silica gel column chromatography (chloroform / ethyl acetate = 4: 1) to obtain the desired compound (Ps-Naph) in a yield of 20% (2.6 mg, 0.0046 mmol).
（Ｐｓ−Ｎａｐｈの機器データ）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ９．１７（１Ｈ，ｓ），８．５１−８．４４（２Ｈ，ｍ），８．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝０．９），８．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７），８．２６−８．２２（２Ｈ，ｍ），７．７８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９），７．３１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），６．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），４．５５（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５），２．５４（２Ｈ，ｑｕｉｎ）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ） ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２９Ｈ２３Ｎ４Ｏ７Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋：５７１．１２８７，ｆｏｕｎｄ；５７１．１２８８（＋０．１ｍｍｕ）。(Ps-Naph device data)
1 H-NMR (400MHz, CD 3 CN) δ9.17 (1H, s), 8.51-8.44 (2H, m), 8.35 (1H, d, J = 0.9), 8. 31 (1H, d, J = 8.7), 8.26-8.22 (2H, m), 7.78 (2H, d, J = 6.9), 7.31 (2H, d, J) = 8.2), 6.50 (1H, d, J = 8.2), 4.55 (4H, t, J = 7.5), 2.54 (2H, quin)
HRMS (ESI-TOF) m / z calcd for C 29 H 23 N 4 O 7 S [M + H] +: 571.1287, found; 571.1288 (+ 0.1mmu).
［蛍光プローブの分光学的特性の評価（３）］
まず、２．５μＭのＰｓ−Ｎａｐｈ（図２２の（Ａ））を１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ ０．１％を共溶媒として含む）に溶解し、反応前の蛍光スペクトルを測定した。なお、蛍光スペクトルの測定には、蛍光分光光度計（ＲＦ−５３００ＰＣ；株式会社島津製作所製）を用いた。また、２．５μＭのＰｓ−Ｎａｐｈを１ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）および３μｇ／ｍＬのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴＰ１−１）を含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ １％を共溶媒として含む）中、室温（２５℃）にて撹拌しながら２時間反応させた。その後、上記と同様にして反応後の蛍光スペクトルを測定した。[Evaluation of spectroscopic properties of fluorescent probe (3)]
First, 2.5 μM Ps-Naph ((A) in FIG. 22) was dissolved in 100 mM phosphate buffer (pH 7.4; containing 0.1% DMSO as a cosolvent), and the fluorescence spectrum before the reaction was measured. . The fluorescence spectrum was measured using a fluorescence spectrophotometer (RF-5300PC; manufactured by Shimadzu Corporation). In addition, 2.5 mM Ps-Naph was added to 100 mM phosphate buffer (pH 7.4; DMSO 1%) containing 1 mM reduced glutathione (GSH) and 3 µg / mL glutathione-S-transferase (GSTP1-1). The reaction was carried out for 2 hours while stirring at room temperature (25 ° C.). Thereafter, the fluorescence spectrum after the reaction was measured in the same manner as described above.
Ｐｓ−Ｎａｐｈについての蛍光スペクトルの測定結果を図２２の（Ｂ）に示す。図２２の（Ｂ）に示す結果からわかるように、Ｐｓ−Ｎａｐｈは反応の前後で５５５ｎｍにおいて約２５倍の蛍光強度上昇を示した。 The measurement result of the fluorescence spectrum of Ps-Naph is shown in FIG. As can be seen from the results shown in FIG. 22 (B), Ps-Naph showed an approximately 25-fold increase in fluorescence intensity at 555 nm before and after the reaction.
［蛍光プローブの合成（４）］
上記とはさらに異なる蛍光団を有する蛍光プローブの作製を試みた（下記の反応スキーム７）。[Synthesis of fluorescent probe (4)]
An attempt was made to produce a fluorescent probe having a different fluorophore from the above (reaction scheme 7 below).
（化合物（ｉ）の合成；５（６）−アミノフルオレセイン）
４−ニトロフタル酸無水物（１．０２ｇ，５．３ｍｍｏｌ）とレゾルシノール（１．３２ｇ，１２．０ｍｍｏｌ）をメタンスルホン酸（１０ｍＬ）に懸濁し、８０℃にて一晩撹拌した。反応液を室温まで冷却し、氷水に注いだ。氷上にて、１０Ｎ ＮａＯＨを用いて、その懸濁液のｐＨを１４にして沈殿を溶解させた後、濃塩酸を用いて、その溶液のｐＨを３にし、生成した沈殿を回収した。硫化ナトリウム９水和物（２．４２ｇ）を溶解した精製水（４０ｍＬ）に沈殿を溶解させて、６０℃にて２時間撹拌した。反応溶液を室温まで冷却し、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液に注いだ。酢酸エチルで分液し、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液で２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝１：２から１：１）で精製し、目的化合物（５，６−異性体混合物）を収率７８％（１．４３ｇ，４．１２ｍｍｏｌ）で得た。(Synthesis of compound (i); 5 (6) -aminofluorescein)
4-Nitrophthalic anhydride (1.02 g, 5.3 mmol) and resorcinol (1.32 g, 12.0 mmol) were suspended in methanesulfonic acid (10 mL) and stirred at 80 ° C. overnight. The reaction was cooled to room temperature and poured into ice water. The suspension was adjusted to pH 14 using 10N NaOH on ice to dissolve the precipitate, and then the pH of the solution was adjusted to 3 using concentrated hydrochloric acid, and the generated precipitate was collected. The precipitate was dissolved in purified water (40 mL) in which sodium sulfide 9-hydrate (2.42 g) was dissolved, and the mixture was stirred at 60 ° C for 2 hours. The reaction solution was cooled to room temperature and poured into a saturated aqueous solution of sodium dihydrogen phosphate. The mixture was separated with ethyl acetate and washed twice with a saturated aqueous solution of sodium dihydrogen phosphate and once with a saturated saline solution. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. The residue was purified by silica gel column chromatography (chloroform / methanol = 1: 2 to 1: 1) to obtain the desired compound (mixture of 5,6-isomers) in a yield of 78% (1.43 g, 4.12 mmol). Was.
（化合物（ｉ）の機器データ）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），６．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８），６．９４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．１），６．８５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），６．７３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８），６．６５−６．６２（６Ｈ，ｍ），６．５９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７），６．５７−６．５０（４Ｈ，ｍ），６．２４（２Ｈ，ｓ），６．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８），５．７３（２Ｈ，ｓ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６９．４，１６９．０，１５９．２，１５９．１，１５６．３，１５５．５，１５１．９，１５１．５，１５０．５，１３９．７，１２９．０，１２９．０，１２７．５，１２５．９，１２４．１，１２１．７，１１５．４，１１２．５，１１２．４，１１２．１，１１０．７，１１０．６，１０６．１，１０５．５，１０２．１，１０２．０，８２．７，８０．６
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ） ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２０Ｈ１４ＮＯ５［Ｍ＋Ｈ］＋：３４８．０８７２，ｆｏｕｎｄ；３４８．０８６８（−０．４ｍｍｕ）。(Instrument data of compound (i))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.55 (1H, d, J = 8.2), 6.97 (1H, d, J = 1.8), 6.94 (1H, dd, J = 8.5, 2.1), 6.85 (1H, d, J = 8.2), 6.73 (1H, dd, J = 8.2, 1.8), 6.65-6 0.62 (6H, m), 6.59 (2H, d, J = 8.7), 6.57-6.50 (4H, m), 6.24 (2H, s), 6.08 (1H , D, J = 1.8), 5.73 (2H, s)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ 169.4, 169.0, 159.2, 159.1, 156.3, 155.5, 151.9, 151.5, 150.5, 139. 7, 129.0, 129.0, 127.5, 125.9, 124.1, 121.7, 115.4, 112.5, 112.4, 112.1, 110.7, 110.6, 106.1, 105.5, 102.1, 102.0, 82.7, 80.6
HRMS (ESI-TOF) m / z calcd for C 20 H 14 NO 5 [M + H] +: 348.0872, found; 348.0868 (-0.4mmu).
（化合物（ｊ）の合成；５（６）−アミノフルオレセインジアセテート）
化合物（ｉ）（５，６−異性体混合物）（２２２．２ｍｇ，０．６４ｍｍｏｌ）、無水酢酸（１２１μＬ，１．２８ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（２２３μＬ，１．２８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２．０ｍＬ）に溶解させ、４℃にて２時間攪拌した。反応溶液を酢酸エチルと飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液で分液し、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液で２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１：２）で精製し、目的化合物（５，６−異性体混合物）を収率７３％（２０２．８ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ）で得た。(Synthesis of Compound (j); 5 (6) -aminofluorescein diacetate)
Compound (i) (5,6-isomer mixture) (222.2 mg, 0.64 mmol), acetic anhydride (121 μL, 1.28 mmol), DIEA (223 μL, 1.28 mmol) are dissolved in DMF (2.0 mL). And stirred at 4 ° C. for 2 hours. The reaction solution was partitioned between ethyl acetate and a saturated aqueous solution of sodium dihydrogen phosphate, and washed twice with a saturated aqueous solution of sodium dihydrogen phosphate and once with a saturated saline solution. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. The residue was purified by silica gel column chromatography (hexane / ethyl acetate = 1: 2) to obtain the desired compound (5,6-isomeric mixture) in a yield of 73% (202.8 mg, 0.47 mmol).
（化合物（ｊ）の機器データ）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），７．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．４），７．１８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８），７．０６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３），７．０４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３），６．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），６．９５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７），６．８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７），６．８２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３），６．８０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３），６．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３），６．７６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８），６．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３），２．３１（６Ｈ，ｓ），２．３０（６Ｈ，ｓ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６９．４，１６９．０，１６８．９，１６８．９，１５６．３，１５３．０，１５１．９，１５１．８，１５１．６，１５１．３，１２９．１，１２７．８，１２６．８，１２５．０，１２４．４，１１７．６，１１７．０，１１６．７，１１６．５，１１５．０，１１０．３，１１０．１，１０７．５，８１．８，８０．２，７７．３，７７．０，７６．７，２１．１
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ） ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２４Ｈ１８ＮＯ７［Ｍ＋Ｈ］＋：４３２．１０８３，ｆｏｕｎｄ；４３２．１０８３（＋０．０ｍｍｕ）。(Equipment data of compound (j))
1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ7.74 (1H, d, J = 8.2), 7.46 (1H, d, J = 1.4), 7.18 (1H, dd, J = 8.2, 1.8), 7.06 (2H, d, J = 2.3), 7.04 (2H, d, J = 2.3), 6.99 (1H, d, J = 8) .2), 6.95 (2H, d, J = 8.7), 6.86 (2H, d, J = 8.7), 6.82 (2H, d, J = 2.3), 6 .80 (2H, d, J = 2.3), 6.78 (1H, d, J = 2.3), 6.76 (1H, dd, J = 8.2, 1.8), 6. 23 (1H, d, J = 2.3), 2.31 (6H, s), 2.30 (6H, s)
13 C-NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ 169.4, 169.0, 168.9, 168.9, 156.3, 153.0, 151.9, 151.8, 151.6, 151.3. 129.1, 127.8, 126.8, 125.0, 124.4, 117.6, 117.0, 116.7, 116.5, 115.0, 110.3, 110.1, 107. 5,81.8,80.2,77.3,77.0,76.7,21.1
HRMS (ESI-TOF) m / z calcd for C 24 H 18 NO 7 [M + H] +: 432.1083, found; 432.1083 (+ 0.0mmu).
（化合物（ｋ）の合成；５−（５−（メチルスルホニル）−２−ニトロベンズアミド）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイルジアセテート）
化合物（ｊ）（５，６−異性体混合物）（１００．６ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）、５−メシル−２−ニトロ安息香酸（４４．９ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）、ＷＳＣＤ・ＨＣｌ（５２．１ｍｇ，０．２７ｍｍｏｌ）をアセトニトリルに懸濁させ、室温で１時間攪拌した。反応溶液を酢酸エチルと飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液で分液し、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液で２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１：２）で精製し、目的化合物を収率４２％（６４．４ｍｇ，０．０９８ｍｍｏｌ）で得た。(Synthesis of Compound (k); 5- (5- (methylsulfonyl) -2-nitrobenzamide) -3-oxo-3H-spiro [isobenzofuran-1,9′-xanthen] -3 ′, 6′-diyl Diacetate)
Compound (j) (5,6-isomer mixture) (100.6 mg, 0.23 mmol), 5-mesyl-2-nitrobenzoic acid (44.9 mg, 0.21 mmol), WSCD.HCl (52.1 mg, 0.27 mmol) was suspended in acetonitrile and stirred at room temperature for 1 hour. The reaction solution was partitioned between ethyl acetate and a saturated aqueous solution of sodium dihydrogen phosphate, and washed twice with a saturated aqueous solution of sodium dihydrogen phosphate and once with a saturated saline solution. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. The residue was purified by silica gel column chromatography (hexane / ethyl acetate = 1: 2) to give the desired compound in a yield of 42% (64.4 mg, 0.098 mmol).
（化合物（ｋ）の機器データ）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．４１（１Ｈ，ｓ），８．４６−８．３９（３Ｈ，ｍ），８．３３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．１），７．９２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８），７．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），７．２９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．４），６．９４−６．７０（４Ｈ，ｍ），３．４２（３Ｈ，ｓ），２．２９（６Ｈ，ｓ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６９．４，１６９．０，１６８．９，１６８．９，１５６．３，１５３．０，１５１．９，１５１．８，１５１．６，１５１．３，１２９．１，１２７．８，１２６．８，１２５．０，１２４．４，１１７．６，１１７．０，１１６．７，１１６．５，１１５．０，１１０．３，１１０．１，１０７．５，８１．８，８０．２，７７．３，７７．０，７６．７，２１．１
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ） ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３２Ｈ２３Ｎ２Ｏ１２Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋：６５９．０９７２，ｆｏｕｎｄ；６５９．０９７４（＋０．２ｍｍｕ）。(Equipment data of compound (k))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 11.41 (1 H, s), 8.46-8.39 (3 H, m), 8.33 (1 H, dd, J = 8.5, 2. 1), 7.92 (1H, dd, J = 8.2, 1.8), 7.45 (1H, d, J = 8.2), 7.29 (2H, d, J = 1.4) ), 6.94-6.70 (4H, m), 3.42 (3H, s), 2.29 (6H, s).
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ 169.4, 169.0, 168.9, 168.9, 156.3, 153.0, 151.9, 151.8, 151.6, 151. 3, 129.1, 127.8, 126.8, 125.0, 124.4, 117.6, 117.0, 116.7, 116.5, 115.0, 110.3, 110.1, 107.5, 81.8, 80.2, 77.3, 77.0, 76.7, 21.1
HRMS (ESI-TOF) m / z calcd for C 32 H 23 N 2 O 12 S [M + H] +: 659.0972, found; 659.0974 (+ 0.2mmu).
（Ｐｓ−ＦＬの合成；Ｎ−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−イル）−５−（メチルスルホニル）−２−ニトロベンズアミド）
化合物（ｋ）（１４ｍｇ，０．０２１ｍｍｏｌ）を１Ｎ ＮａＯＨ（０．５ｍＬ）とジメチルスルホキシド（１．０ｍＬ）に溶解させて室温にて５分間攪拌した。反応液をｐＨ７．４、２００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液によって中和し、分取ＨＰＬＣによって精製した。分取ＨＰＬＣでは移動相Ａとして１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、移動相Ｂとしてアセトニトリルを用いて、２０分間で組成比がＡ：Ｂ＝９０：１０から１０：９０となるよう組成比のグラジエントをかけ、流速９ｍＬ／ｍｉｎで溶出させた。溶出液中に含まれるアセトニトリルを減圧下、留去した後、残渣を酢酸エチルに懸濁し、０．１Ｎ塩酸で３回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。酢酸エチルを減圧下留去し、目的化合物（Ｐｓ−ＦＬ）を収率６３％で得た（７．５ｍｇ，０．０１３ｍｍｏｌ）
（Ｐｓ−ＦＬの機器データ）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，１０％ＭｅＯＤ ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ８．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８），８．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８），８．２３−８．１２（４Ｈ，ｍ），７．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７），８．２３−８．１２（４Ｈ，ｍ），６．７２（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．７，２．３）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ） ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２８Ｈ１９Ｎ２Ｏ１０Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋：５７５．０７６０，ｆｏｕｎｄ；５７５．０７５７（−０．３ｍｍｕ）
［蛍光プローブの分光学的特性の評価（４）］
まず、２μＭのＰｓ−ＦＬ（図２３の（Ａ））を１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ０．１％を共溶媒として含む）に溶解し、反応前の蛍光スペクトルを測定した。なお、蛍光スペクトルの測定には、蛍光分光光度計（ＲＦ−５３００ＰＣ；株式会社島津製作所製）を用いた。また、２μＭのＰｓ−ＦＬを１ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）および３μｇ／ｍＬのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴＰ１−１）を含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ １％を共溶媒として含む）中、室温（２５℃）にて撹拌しながら２時間反応させた。その後、上記と同様にして反応後の蛍光スペクトルを測定した。(Synthesis of Ps-FL; N- (3 ′, 6′-dihydroxy-3-oxo-3H-spiro [isobenzofuran-1,9′-xanthen] -5-yl) -5- (methylsulfonyl) -2 -Nitrobenzamide)
Compound (k) (14 mg, 0.021 mmol) was dissolved in 1N NaOH (0.5 mL) and dimethyl sulfoxide (1.0 mL), and the mixture was stirred at room temperature for 5 minutes. The reaction was neutralized with 200 mM sodium phosphate buffer at pH 7.4 and purified by preparative HPLC. In the preparative HPLC, 10 mM ammonium acetate buffer (pH 7.0) was used as the mobile phase A, and acetonitrile was used as the mobile phase B. The composition ratio was changed from A: B = 90: 10 to 10:90 in 20 minutes. A gradient of the composition ratio was applied and elution was performed at a flow rate of 9 mL / min. After acetonitrile contained in the eluate was distilled off under reduced pressure, the residue was suspended in ethyl acetate, washed with 0.1N hydrochloric acid three times, and dried over anhydrous sodium sulfate. Ethyl acetate was distilled off under reduced pressure to obtain the target compound (Ps-FL) in a yield of 63% (7.5 mg, 0.013 mmol).
(Ps-FL device data)
1 H-NMR (400 MHz, 10% MeOD in CDCl 3 ) δ 8.33 (1H, d, J = 1.8), 8.26 (1H, d, J = 1.8), 8.23-8. 12 (4H, m), 7.16 (1H, d, J = 8.7), 8.23-8.12 (4H, m), 6.72 (2H, dd, J = 8.7, 2) .3)
HRMS (ESI-TOF) m / z calcd for C 28 H 19 N 2 O 10 S [M + H] +: 575.0760, found; 575.0757 (-0.3mmu)
[Evaluation of spectroscopic properties of fluorescent probe (4)]
First, 2 μM Ps-FL ((A) in FIG. 23) was dissolved in 100 mM phosphate buffer (pH 7.4; containing 0.1% DMSO as a cosolvent), and the fluorescence spectrum before the reaction was measured. The fluorescence spectrum was measured using a fluorescence spectrophotometer (RF-5300PC; manufactured by Shimadzu Corporation). In addition, 100 mM phosphate buffer (pH 7.4; DMSO 1%) containing 2 μM Ps-FL and 1 mM reduced glutathione (GSH) and 3 μg / mL glutathione-S-transferase (GSTP1-1) is included as a co-solvent. ), And reacted for 2 hours while stirring at room temperature (25 ° C). Thereafter, the fluorescence spectrum after the reaction was measured in the same manner as described above.
Ｐｓ−ＦＬについての蛍光スペクトルの測定結果を図２３の（Ｂ）に示す。図２３の（Ｂ）に示す結果からわかるように、Ｐｓ−ＦＬは反応の前後で５１５ｎｍにおいて約１５０倍の蛍光強度上昇を示した。 The measurement results of the fluorescence spectrum of Ps-FL are shown in FIG. As can be seen from the results shown in (B) of FIG. 23, Ps-FL showed about 150-fold increase in fluorescence intensity at 515 nm before and after the reaction.
［蛍光プローブの合成（５）］
上記とはさらに異なる蛍光団を有する蛍光プローブの作製を試みた（下記の反応スキーム８）。[Synthesis of fluorescent probe (5)]
An attempt was made to produce a fluorescent probe having a different fluorophore from the above (reaction scheme 8 below).
（化合物（ｌ）の合成；２−（８−ヒドロキシ−２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ，５Ｈ−ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリン−９−カルボニル）−５（６）−ニトロ安息香酸）
４−ニトロフタル酸無水物（２５７．１ｍｇ，１．３ｍｍｏｌ）と８−ヒドロキシジュロリジン（２５２．３ｍｇ，１．３ｍｍｏｌ）をトルエン（２０ｍＬ）に懸濁し、１００℃で３時間撹拌した後、加熱還流を行い、一晩撹拌した。反応液を室温まで冷却し、溶液に酢酸エチルを加え、飽和食塩水で３回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１：２，０．５％酢酸）で精製し、目的化合物（５，６−異性体混合物）を収率６７．６％（３４３．６ｍｇ，０．８９９ｍｍｏｌ）で得た。(Synthesis of Compound (1); 2- (8-hydroxy-2,3,6,7-tetrahydro-1H, 5H-pyrido [3,2,1-ij] quinoline-9-carbonyl) -5 (6) -Nitrobenzoic acid)
4-Nitrophthalic anhydride (257.1 mg, 1.3 mmol) and 8-hydroxyjulolidine (252.3 mg, 1.3 mmol) are suspended in toluene (20 mL), and the mixture is stirred at 100 ° C. for 3 hours, and then heated under reflux. And stirred overnight. The reaction solution was cooled to room temperature, ethyl acetate was added to the solution, and the mixture was washed three times with a saturated saline solution. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. The residue was purified by silica gel column chromatography (hexane / ethyl acetate = 1: 2, 0.5% acetic acid) to give the target compound (mixture of 5,6-isomers) in a yield of 67.6% (343.6 mg, 03.6%). .899 mmol).
（化合物（ｌ）の機器データ）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３），８．３６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．７，２．３），８．２７（１Ｈ，ｄｄ，８．７，２．３），８．１７（１Ｈ，ｄ，８．７），８．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３），７．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），６．３３（１Ｈ，ｓ），６．２７（１Ｈ，ｓ），３．２８−３．１５（８Ｈ，ｍ），２．６４（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．２），２．４０（４Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．７），１．９４−１．８４（４Ｈ，ｍ），１．８４−１．７４（４Ｈ，ｍ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１９５．５，１９４．９，１７４．０，１６６．０，１６５．４，１６０．２，１６０．１，１４９．６，１４９．５，１４９．１，１４７．６，１４６．５，１４２．３，１３４．９，１３１．９，１３０．８，１２９．８，１２９．７，１２９．２，１２６．４，１２５．８，１２３．５，１２２．９，１１３．３，１１３．３，１０８．３，１０８．３，１０５．４，１０５．４，６０．５，５０．１，４９．７，４９．４，４９．２，４９．０，４８．８，４８．６，４８．３，２７．０，２１．３，２０．８，２０．６，２０．３，１９．６，１３．９
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ） ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２０Ｈ１９Ｎ２Ｏ６［Ｍ＋Ｈ］＋：３８３．１２４３，ｆｏｕｎｄ；３８３．１２４１（−０．２ｍｍｕ）。(Instrument data of compound (l))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.86 (1 H, d, J = 2.3), 8.36 (1 H, dd, J = 8.7, 2.3), 8.27 ( 1H, dd, 8.7, 2.3), 8.17 (1H, d, 8.7), 8.11 (1H, d, J = 2.3), 7.45 (1H, d, J) = 8.2), 6.33 (1H, s), 6.27 (1H, s), 3.28-3.15 (8H, m), 2.64 (4H, t, J = 6.2). ), 2.40 (4H, q, J = 6.7), 1.94-1.84 (4H, m), 1.84-1.74 (4H, m).
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ 195.5, 194.9, 174.0, 166.0, 165.4, 160.2, 160.1, 149.6, 149.5, 149. 1,147.6,146.5,142.3,134.9,131.9,130.8,129.8,129.7,129.2,126.4,125.8,123.5, 122.9, 113.3, 113.3, 108.3, 108.3, 105.4, 105.4, 60.5, 50.1, 49.7, 49.4, 49.2, 49. 0,48.8,48.6,48.3,27.0,21.3,20.8,20.6,20.3,19.6,13.9
HRMS (ESI-TOF) m / z calcd for C 20 H 19 N 2 O 6 [M + H] +: 383.1243, found; 383.1241 (-0.2mmu).
（Ｐｓ−ｊＲｈｏｄの合成；Ｎ−（１２−ヒドロキシ−３’−オキソ−２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ，３’Ｈ，５Ｈ−スピロ［クロメノ［２，３−ｆ］ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリン−９，１’−イソベンゾフラン］−５’−イル）−５−（メチルスルホニル）−２−ニトロベンズアミド）
化合物（ｌ）（５，６−異性体混合物）（２０３．８ｍｇ，０．５３ｍｍｏｌ）とレゾルシノール（６６．７ｍｇ，０．６０６ｍｍｏｌ）をメタンスルホン酸（０．５ｍＬ）とトリフルオロ酢酸（０．５ｍＬ）に溶解させて、８０℃で一晩撹拌した。反応溶液を室温まで冷却し、１０Ｎ ＮａＯＨを用いて、ｐＨ２〜３にした。クロロホルムで分液し、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液で３回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝５：１）で粗精製した。得られた固体（１１５．２ｍｇ）、硫化ナトリウム９水和物（２７２．０ｍｇ，３．４８ｍｍｏｌ）を水（１０ｍＬ）に溶解させ、６０℃で１時間撹拌した。反応溶液を室温まで冷却し、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液を用いてｐＨ４にした。酢酸エチルで分液し、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液で３回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝４：１から１：１）で粗精製し、化合物（ｍ）を得た。(Synthesis of Ps-jRhod; N- (12-hydroxy-3′-oxo-2,3,6,7-tetrahydro-1H, 3′H, 5H-spiro [chromeno [2,3-f] pyrido [3 , 2,1-ij] quinoline-9,1'-isobenzofuran] -5'-yl) -5- (methylsulfonyl) -2-nitrobenzamide)
Compound (l) (a mixture of 5,6-isomers) (203.8 mg, 0.53 mmol) and resorcinol (66.7 mg, 0.606 mmol) were combined with methanesulfonic acid (0.5 mL) and trifluoroacetic acid (0.5 mL). ) And stirred at 80 ° C. overnight. The reaction solution was cooled to room temperature and adjusted to pH 2-3 using 10N NaOH. The mixture was separated with chloroform and washed three times with a saturated aqueous solution of sodium dihydrogen phosphate and once with a saturated saline solution. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. The residue was roughly purified by silica gel column chromatography (chloroform / methanol = 5: 1). The obtained solid (115.2 mg) and sodium sulfide nonahydrate (272.0 mg, 3.48 mmol) were dissolved in water (10 mL), and the mixture was stirred at 60 ° C. for 1 hour. The reaction solution was cooled to room temperature and adjusted to pH 4 using a saturated aqueous solution of sodium dihydrogen phosphate. The mixture was separated with ethyl acetate and washed three times with a saturated aqueous solution of sodium dihydrogen phosphate and once with a saturated saline solution. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. The residue was roughly purified by silica gel column chromatography (chloroform / methanol = 4: 1 to 1: 1) to obtain compound (m).
得られた化合物（ｍ）（１１ｍｇ）、５−メシル−２−ニトロ安息香酸（１４ｍｇ，０．０５７ｍｍｏｌ），ＷＳＣＤ・ＨＣｌ（１４ｍｇ，０．０７２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３ｍＬ）に懸濁し、室温で４５分間攪拌した。反応溶液に１Ｎ ＮａＯＨ（３ｍＬ）を加えて室温で５分間攪拌した。１Ｎ ＨＣｌでｐＨを３にして酢酸エチルを加えて分液し、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液で３回、飽和食塩水で１回洗浄した。酢酸エチルを減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝３：１から１：１）で精製した。残渣をジメチルスルホキシド（２００μＬ）とアセトニトリル（２００μＬ）の混合溶媒に溶解させて、酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０，４．０ｍＬ）を加えて、分取ＨＰＬＣによって精製した。分取ＨＰＬＣでは移動相Ａとして１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、移動相Ｂとしてアセトニトリルを用いて、２０分間で組成比がＡ：Ｂ＝９０：１０から１０：９０となるよう組成比のグラジエントをかけ、流速９ｍＬ／ｍｉｎで溶出させた。溶出液中に含まれるアセトニトリルを減圧下、留去した後、残渣を酢酸エチルに懸濁し、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液加えた。酢酸エチルで２回分液し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。酢酸エチルを減圧下留去し、目的化合物（Ｐｓ−ｊＲｈｏｄ）を得た（１．６ｍｇ，０．００２５ｍｍｏｌ）。 The obtained compound (m) (11 mg), 5-mesyl-2-nitrobenzoic acid (14 mg, 0.057 mmol) and WSCD.HCl (14 mg, 0.072 mmol) were suspended in acetonitrile (3 mL), and suspended at room temperature. Stirred for minutes. 1N NaOH (3 mL) was added to the reaction solution, and the mixture was stirred at room temperature for 5 minutes. The pH was adjusted to 3 with 1N HCl, ethyl acetate was added, and the layers were separated. Ethyl acetate was distilled off under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (chloroform / methanol = 3: 1 to 1: 1). The residue was dissolved in a mixed solvent of dimethyl sulfoxide (200 μL) and acetonitrile (200 μL), and ammonium acetate buffer (pH 7.0, 4.0 mL) was added, followed by purification by preparative HPLC. In the preparative HPLC, 10 mM ammonium acetate buffer (pH 7.0) was used as the mobile phase A, and acetonitrile was used as the mobile phase B. The composition ratio was changed from A: B = 90: 10 to 10:90 in 20 minutes. A gradient of the composition ratio was applied and elution was performed at a flow rate of 9 mL / min. After acetonitrile contained in the eluate was distilled off under reduced pressure, the residue was suspended in ethyl acetate, and a saturated aqueous solution of sodium dihydrogen phosphate was added. Liquid separation was performed twice with ethyl acetate, and the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate. Ethyl acetate was distilled off under reduced pressure to obtain the target compound (Ps-jRhod) (1.6 mg, 0.0025 mmol).
（Ｐｓ−ｊＲｈｏｄの機器データ）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ） ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３４Ｈ２８Ｎ３Ｏ９Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋：６５４．１５４６，ｆｏｕｎｄ；６５４．１５４８（＋０．２ｍｍｕ）。(Ps-jRhod device data)
HRMS (ESI-TOF) m / z calcd for C 34 H 28 N 3 O 9 S [M + H] +: 654.1546, found; 654.1548 (+ 0.2mmu).
［蛍光プローブの分光学的特性の評価（５）］
まず、２μＭのＰｓ−ｊＲｈｏｄ（図２４の（Ａ））を１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ ０．１％を共溶媒として含む）に溶解し、反応前の蛍光スペクトルを測定した。なお、蛍光スペクトルの測定には、蛍光分光光度計（ＲＦ−５３００ＰＣ；株式会社島津製作所製）を用いた。また、２μＭのＰｓ−ｊＲｈｏｄを１ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）および３μｇ／ｍＬのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴＰ１−１）を含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ１％を共溶媒として含む）中、室温（２５℃）にて撹拌しながら２時間反応させた。その後、上記と同様にして反応後の蛍光スペクトルを測定した。[Evaluation of spectroscopic properties of fluorescent probe (5)]
First, 2 μM Ps-jRhod ((A) in FIG. 24) was dissolved in 100 mM phosphate buffer (pH 7.4; containing 0.1% DMSO as a cosolvent), and the fluorescence spectrum before the reaction was measured. The fluorescence spectrum was measured using a fluorescence spectrophotometer (RF-5300PC; manufactured by Shimadzu Corporation). A 100 mM phosphate buffer (pH 7.4; containing 1% DMSO as a cosolvent) containing 2 μM Ps-jRhod and 1 mM reduced glutathione (GSH) and 3 μg / mL glutathione-S-transferase (GSTP1-1). The reaction was carried out for 2 hours while stirring at room temperature (25 ° C.). Thereafter, the fluorescence spectrum after the reaction was measured in the same manner as described above.
Ｐｓ−ｊＲｈｏｄについての蛍光スペクトルの測定結果を図２４の（Ｂ）に示す。図２４の（Ｂ）に示す結果からわかるように、Ｐｓ−ｊＲｈｏｄは反応の前後で５６５ｎｍにおいて約７５倍の蛍光強度上昇を示した。 The measurement result of the fluorescence spectrum of Ps-jRhod is shown in FIG. As can be seen from the results shown in (B) of FIG. 24, Ps-jRhod showed an approximately 75-fold increase in fluorescence intensity at 565 nm before and after the reaction.
Claims (14)
式中、Ｌは蛍光団を表し、ＥＷＧ基は０．６６以上０．７８未満のハメット定数を有する電子求引性基を表し、ベンゼン環に結合したニトロ（ＮＯ２）基はベンゼン環に結合したアミド結合に対してオルト位またはパラ位に位置し、前記ＥＷＧ基は、前記ニトロ（ＮＯ２）基に対してオルト位またはパラ位に位置している、
で表されるニトロベンゼン誘導体またはその塩。The following general formula (1):
In the formula, L represents a fluorophore, an EWG group represents an electron-withdrawing group having a Hammett constant of 0.66 or more and less than 0.78, and a nitro (NO 2 ) group bonded to a benzene ring is bonded to a benzene ring. Wherein the EWG group is located ortho or para to the nitro (NO 2 ) group,
Or a salt thereof.
式中、Ｒ１は、置換もしくは非置換の炭素数１〜２０のアルキル基、置換もしくは非置換の炭素数１〜２０のアルコキシ基、またはアミド基（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２基）を表し、ｎは０〜４の整数を表し、Ｒ２は水素原子または置換もしくは非置換の炭素数２〜２０のアシル基を表し、Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、水素原子またはハロゲン原子を表す、
で表される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のニトロベンゼン誘導体またはその塩。The L is represented by the following general formula (2):
In the formula, R 1 represents a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, a substituted or unsubstituted alkoxy group having 1 to 20 carbon atoms, or an amide group (—C (＝ O) NH 2 group). And n represents an integer of 0 to 4, R 2 represents a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted acyl group having 2 to 20 carbon atoms, and X 1 and X 2 each independently represent a hydrogen atom or a halogen. Represents an atom,
The nitrobenzene derivative or a salt thereof according to any one of claims 1 to 3, which is represented by:
式中、Ｒ１は、置換もしくは非置換の炭素数１〜２０のアルキル基、置換もしくは非置換の炭素数１〜２０のアルコキシ基、またはアミド基（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２基）を表し、ｎは０〜４の整数を表し、Ｒ２は水素原子または置換もしくは非置換の炭素数２〜２０のアシル基を表し、Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、水素原子またはハロゲン原子を表す、
で表される、請求項４に記載のニトロベンゼン誘導体またはその塩。The following general formula (3):
In the formula, R 1 represents a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, a substituted or unsubstituted alkoxy group having 1 to 20 carbon atoms, or an amide group (—C (＝ O) NH 2 group). And n represents an integer of 0 to 4, R 2 represents a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted acyl group having 2 to 20 carbon atoms, and X 1 and X 2 each independently represent a hydrogen atom or a halogen. Represents an atom,
The nitrobenzene derivative or a salt thereof according to claim 4, which is represented by the following formula:
適用後の前記組織に対して励起光を照射する工程と、
前記組織からの蛍光を検出する工程と、
含む、がん細胞またはがん組織の検出方法。Applying the fluorescent probe for measuring glutathione-S-transferase P1 according to claim 7 or the composition for detection according to claim 8 to a tissue,
Irradiating the tissue with excitation light after application,
Detecting fluorescence from the tissue,
Methods for detecting cancer cells or cancer tissues.
前記細胞に対して励起光を照射する工程と、
前記細胞からの蛍光を検出する工程と、
を含む、血液中におけるがん細胞の検出方法。Contacting the glutathione-S-transferase P1 measurement fluorescent probe according to claim 7 or the detection composition according to claim 8 with cells in blood collected from a living body;
Irradiating the cells with excitation light,
Detecting fluorescence from the cells,
A method for detecting cancer cells in blood, comprising:
生体試料固定装置と、
を含む、がん診断用キット。A fluorescent probe for measuring glutathione-S-transferase P1 according to claim 7, or the detection composition according to claim 8,
A biological sample fixing device;
A cancer diagnostic kit comprising:
式中、ＥＷＧ基は０．６６以上０．７８未満のハメット定数を有する電子求引性基を表し、ベンゼン環に結合したニトロ（ＮＯ２）基はベンゼン環に結合したアミド結合に対してオルト位またはパラ位に位置し、前記ＥＷＧ基は、前記ニトロ（ＮＯ２）基に対してオルト位またはパラ位に位置し、Ｒ１は、置換もしくは非置換の炭素数１〜２０のアルキル基、置換もしくは非置換の炭素数１〜２０のアルコキシ基、またはアミド基（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２基）を表し、ｍは０〜５の整数を表す、
で表されるニトロベンゼン誘導体またはその塩。The following general formula (4):
In the formula, the EWG group represents an electron-withdrawing group having a Hammett constant of 0.66 or more and less than 0.78, and the nitro (NO 2 ) group bonded to the benzene ring is ortho to the amide bond bonded to the benzene ring. The EWG group is located ortho or para to the nitro (NO 2 ) group, R 1 is a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, Represents a substituted or unsubstituted alkoxy group having 1 to 20 carbon atoms or an amide group (—C (＝ O) NH 2 group), and m represents an integer of 0 to 5,
Or a salt thereof.
式中、Ｒ１は、置換もしくは非置換の炭素数１〜２０のアルキル基、置換もしくは非置換の炭素数１〜２０のアルコキシ基、またはアミド基（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２基）を表し、ｍは０〜５の整数を表す、
からなる群から選択されるニトロベンゼン誘導体またはその塩。The following general formulas (5) to (7):
In the formula, R 1 represents a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, a substituted or unsubstituted alkoxy group having 1 to 20 carbon atoms, or an amide group (—C (＝ O) NH 2 group). And m represents an integer of 0 to 5,
A nitrobenzene derivative or a salt thereof selected from the group consisting of:
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017059526 | 2017-03-24 | ||
| JP2017059526 | 2017-03-24 | ||
| PCT/JP2018/011736 WO2018174253A1 (en) | 2017-03-24 | 2018-03-23 | Nitrobenzene derivative or salt thereof, and use of same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2018174253A1 true JPWO2018174253A1 (en) | 2020-01-30 |
| JP7140398B2 JP7140398B2 (en) | 2022-09-21 |
Family
ID=63584559
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2019507026A Active JP7140398B2 (en) | 2017-03-24 | 2018-03-23 | Nitrobenzene derivative or salt thereof and uses thereof |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP7140398B2 (en) |
| WO (1) | WO2018174253A1 (en) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109776390B (en) * | 2019-01-24 | 2022-04-12 | 滨州医学院 | Preparation method and application of fluorescence molecular probe for detecting glutathione mercaptotransferase |
| EP4328586A1 (en) * | 2022-01-06 | 2024-02-28 | Osaka University | Fluorescent staining method |
| CN114577929A (en) * | 2022-02-14 | 2022-06-03 | 北京优量云产业计量技术创新研究院有限公司 | Method for measuring reduced glutathione |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016108264A (en) * | 2014-12-04 | 2016-06-20 | 学校法人東京薬科大学 | Fluorescein derivative or salt of the same, fluorescent probe for measuring glutathione-s-transferase, and method for measuring glutathione-s-transferase activity using probe |
| CN106281304A (en) * | 2015-05-15 | 2017-01-04 | 武汉大学 | A kind of can be used for fluorescent probe of malonaldehyde imaging and preparation method thereof in living cells |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101281733B1 (en) * | 2010-11-18 | 2013-07-04 | 한국과학기술원 | Methods for the preparation of carbon nanotubes covalentely modified by poly(aryleneether)s |
-
2018
- 2018-03-23 JP JP2019507026A patent/JP7140398B2/en active Active
- 2018-03-23 WO PCT/JP2018/011736 patent/WO2018174253A1/en active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016108264A (en) * | 2014-12-04 | 2016-06-20 | 学校法人東京薬科大学 | Fluorescein derivative or salt of the same, fluorescent probe for measuring glutathione-s-transferase, and method for measuring glutathione-s-transferase activity using probe |
| CN106281304A (en) * | 2015-05-15 | 2017-01-04 | 武汉大学 | A kind of can be used for fluorescent probe of malonaldehyde imaging and preparation method thereof in living cells |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| "CAS Registry No.107943-45-3", FILE REGISTRY [ONLINE] ON STN INTERNATIONAL, JPN7018001887, 2 May 1987 (1987-05-02), ISSN: 0004742788 * |
| "CAS Registry No.1100482-31-2", FILE REGISTRY [ONLINE] ON STN INTERNATIONAL, JPN7022001531, 4 February 2009 (2009-02-04), ISSN: 0004742785 * |
| "CAS Registry No.1100488-14-9", FILE REGISTRY [ONLINE] ON STN INTERNATIONAL, JPN7022001530, 4 February 2009 (2009-02-04), ISSN: 0004742786 * |
| FUJIKAWA, YUUTA ET AL, JOURNAL OF AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. Vol.130(44), JPN6018028472, 2008, pages 14533 - 14543, ISSN: 0004742787 * |
| 藤川雄太 他: "Glutathione S-transferase(GST)活性検出蛍光プローブの開発と応用", 次世代を担う有機化学シンポジウム講演要旨集, vol. 6, JPN6018021202, 30 May 2008 (2008-05-30), pages 50 - 51, ISSN: 0004742790 * |
| 藤川雄太 他: "ＧＳＴ活性検出蛍光プローブの開発", 日本分析化学会年会講演要旨集, vol. 56, JPN6018021201, 5 September 2007 (2007-09-05), pages 325, ISSN: 0004742789 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2018174253A1 (en) | 2018-09-27 |
| JP7140398B2 (en) | 2022-09-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zeng et al. | A distinctive mitochondrion-targeting, in situ-activatable near-infrared fluorescent probe for visualizing sulfur dioxide derivatives and their fluctuations in vivo | |
| Gebremedhin et al. | Development of a red-light emission hypoxia-sensitive two-photon fluorescent probe for in vivo nitroreductase imaging | |
| JP6351511B2 (en) | Synthesis of asymmetric Si rhodamine and rhodol | |
| EP3096143B1 (en) | Iron(ii) ion detection agent and detection method using same | |
| JP5795963B2 (en) | Cancer diagnostics | |
| JP7140398B2 (en) | Nitrobenzene derivative or salt thereof and uses thereof | |
| Shu et al. | Synthesis and evaluation of a novel fluorescent chemosensor for glutathione based on a rhodamine B and N-[4-(carbonyl) phenyl] maleimide conjugate and its application in living cell imaging | |
| More et al. | Molecular design of fluorescent pH sensors based on reduced rhodol by structure-pKa relationship for imaging of lysosome | |
| Geng et al. | Si-rhodamine derivatives for brain fluorescence imaging and monitoring of H2S in the brain of schizophrenic mice before and after treatment | |
| Yang et al. | Imaging of formaldehyde in live cells and daphnia magna via Aza-Cope reaction utilizing fluorescence probe with large stokes shifts | |
| Zhang et al. | A near-infrared fluorescent probe for the ratiometric detection and living cell imaging of β-galactosidase | |
| Bao et al. | NIR absorbing DICPO derivatives applied to wide range of pH and detection of glutathione in tumor | |
| US20240053346A1 (en) | Fluorescent dye and method for detecting tumor cells | |
| CN114539183A (en) | Lipid drop targeting and biological thiol sensitive fluorescent probe for cancer cell tissue diagnosis, preparation and application | |
| JP2015203015A (en) | Fluorescence probe | |
| Proverbio et al. | Luminescent conjugates between dinuclear rhenium complexes and 17α-ethynylestradiol: synthesis, photophysical characterization, and cell imaging | |
| KR101261791B1 (en) | A fluorescent turn-on probe for the detection of alkaline phosphatase activity in living cells | |
| EP3551637B1 (en) | A compound for the detection of hno in biological systems | |
| WO2018105667A1 (en) | Fluorescent probe for aldh3a1 detection | |
| WO2021177060A1 (en) | Fluorescent probe which becomes substrate of lat1 | |
| Xia et al. | Imaging and inhibiting cyclooxygenase-2 using aspirin-based fluorescent reporter for the treatment of breast cancer | |
| EP4043435A1 (en) | Compound for detecting senescent cells and use thereof | |
| Lu et al. | Log P analyzation-based discovery of GSH activated biotin-tagged fluorescence probe for selective colorectal cancer imaging | |
| Wang et al. | Design, synthesis and application of near-infrared fluorescence probe IR-780-Crizotinib in detection of ALK positive tumors | |
| EP3831888B1 (en) | Drug that reacts with acrolein, use thereof and novel compound |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191007 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210304 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220405 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220526 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220830 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220901 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7140398 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |