JP7140398B2 - Nitrobenzene derivative or salt thereof and uses thereof - Google Patents
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本発明は、ニトロベンゼン誘導体またはその塩およびそれらの用途に関する。 The present invention relates to nitrobenzene derivatives or salts thereof and uses thereof.
グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（本明細書中、「ＧＳＴ」とも称する）は、親電子性化合物と還元型グルタチオン（本明細書中、「ＧＳＨ」とも称する）との抱合体の生成反応を触媒する酵素であり、薬物代謝酵素として薬物や内在性活性代謝物のグルタチオン抱合に関与していることが知られている。生体内において、ＧＳＴは、これら抱合体を生成することにより、例えば、親電子性化合物を無毒化したり、排出したりする役割を担っている。また、ＧＳＴはこれ以外にも、ステロイドホルモンの生合成・アミノ酸の分解・プロスタグランジンの生合成など、多岐にわたる機能をもつ。 Glutathione-S-transferase (also referred to herein as "GST") is an enzyme that catalyzes a conjugate formation reaction between an electrophilic compound and reduced glutathione (also referred to herein as "GSH"). and is known to be involved in glutathione conjugation of drugs and endogenous active metabolites as a drug-metabolizing enzyme. In vivo, GST plays a role in, for example, detoxification and excretion of electrophilic compounds by producing these conjugates. In addition, GST has a wide variety of other functions, such as steroid hormone biosynthesis, amino acid degradation, and prostaglandin biosynthesis.
従来提案されているＧＳＴ活性の測定方法としては、吸光法（比色法）、生物発光法、蛍光法などがある。なかでも、高感度での測定が可能である蛍光法に基づくＧＳＴ活性の測定方法として、いくつかの蛍光プローブが開発されている。 Conventionally proposed methods for measuring GST activity include an absorption method (colorimetric method), a bioluminescence method, a fluorescence method, and the like. In particular, several fluorescent probes have been developed as methods for measuring GST activity based on a fluorescence method that enables measurement with high sensitivity.
例えば非特許文献１には、４９０ｎｍに極大吸収波長、５１０ｎｍ付近に極大蛍光波長をそれぞれ有するプローブとして、ＤＮＡＦ類やＤＮＡＴ－Ｍｅといった一連の蛍光プローブが開示されている。これらの蛍光プローブはＧＳＴ活性によるグルタチオン化と、これに伴う脱ニトロ化反応によって大きな蛍光強度上昇を示す。ただし、非特許文献６に開示された蛍光プローブ（ＤＮＡＦ類やＤＮＡＴ－Ｍｅ）は、ＧＳＴ非依存的なグルタチオンとの反応性が高いことから、十分なＳ／Ｎ比が得られないという問題があり、また、反応後の蛍光量子収率が低いという問題があった。さらに、ＤＮＡＦ類を蛍光プローブとして用いると、弱酸性領域のｐＨ条件下では生成物の蛍光強度が大幅に減少するという問題もあった。そして、これらの問題を解決することを目的とした技術として、特許文献１によれば、ＤＮＡＦ類におけるフルオレセイン構造のキサンテン環の特定部位にフッ素原子または塩素原子を導入したフルオレセイン誘導体をＧＳＴ活性測定用蛍光プローブとして用いることが提案されている。
For example, Non-Patent
ところで、ＧＳＴは、細胞質型、ミトコンドリア型、ミクロソーム型の３種類に分類され、ヒトの細胞質型ＧＳＴにはＡｌｐｈａ、Ｍｕ、Ｐｉ、Ｓｉｇｍａ、Ｔｈｅｔａ、Ｏｍｅｇａ、Ｚｅｔａの７種類のクラスが存在し、それぞれに最大５種類の分子種が存在する（非特許文献２）。なかでも、胎盤をはじめとした限られた正常組織に発現しているＰｉクラスの分子種ＧＳＴＰ１は、多くのがん細胞で過剰発現しており（非特許文献３）、がん細胞の抗がん剤耐性に寄与していることが報告されている（非特許文献４）。さらにＧＳＴＰ１は、ＪＮＫ（ｃ－ｊｕｎ－Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ）と相互作用して複合体を形成し、ストレスシグナルによるＪＮＫの活性化を阻害している。酸化ストレスや抗がん剤といった刺激が加わることで、この複合体からＧＳＴＰ１が解離し、ＪＮＫが活性化される（非特許文献５）。すなわち、ＧＳＴＰ１は、抗がん剤によるＪＮＫの活性化を介したアポトーシスを抑制していると考えられている。これまでに開発されてきたＧＳＴＰ１阻害剤は、細胞内ＧＳＴＰ１に結合し、ＧＳＴＰ１－ＪＮＫ複合体の形成を阻害することでＪＮＫを活性化し、アポトーシスを誘導する（非特許文献６）。このように、多くのがん細胞で過剰発現していることと抗がん剤耐性の獲得に寄与していることから、ＧＳＴＰ１はがんマーカーとして、また抗がん剤の標的分子として期待されている。従来、がん細胞で過剰発現しているβ－ガラクトシダーゼやγ－グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）を標的とした蛍光プローブのＨＭＲｅｆ－ｂＧａｌやｇＧｌｕ－ＨＭＲＧが開発され、微小がんの検出に成功している（非特許文献７、８）。しかしながら、これらの酵素はすべてのがん細胞で過剰発現しているわけではなく、発現量の低いがん細胞を検出することは困難である。一方、ＧＳＴＰ１は前立腺がんを除くほぼ全てのがん細胞で過剰発現しているため、ＧＳＴＰ１の過剰発現を捉えることでより多くのがん細胞を検出することが可能であると考えられる。がんの病理診断においては組織免疫染色等が行われるが、ＧＳＴＰ１の活性を検出可能な蛍光プローブを開発できれば、生検組織にこの蛍光プローブを塗布することでＧＳＴＰ１活性を指標としたがんの有無の評価が可能となる。また、生細胞で利用可能なＧＳＴＰ１活性を検出する蛍光プローブは、新たな研究ツールとしての使用が期待される。 By the way, GST is classified into three types of cytoplasmic type, mitochondrial type and microsomal type, and human cytoplasmic GST has seven classes of Alpha, Mu, Pi, Sigma, Theta, Omega and Zeta. There are up to 5 types of molecular species in (Non-Patent Document 2). Among them, the Pi-class molecular species GSTP1, which is expressed in a limited number of normal tissues such as the placenta, is overexpressed in many cancer cells (Non-Patent Document 3), and the anti-cancer properties of cancer cells are high. It has been reported that it contributes to drug resistance (Non-Patent Document 4). Furthermore, GSTP1 interacts with JNK (c-jun-N-terminal kinase) to form a complex and inhibit JNK activation by stress signals. When stimulated by oxidative stress or anticancer drugs, GSTP1 dissociates from this complex and JNK is activated (Non-Patent Document 5). That is, GSTP1 is thought to suppress apoptosis mediated by JNK activation by anticancer drugs. GSTP1 inhibitors that have been developed so far bind to intracellular GSTP1 and inhibit the formation of GSTP1-JNK complex, thereby activating JNK and inducing apoptosis (Non-Patent Document 6). Thus, GSTP1 is expected as a cancer marker and as a target molecule for anticancer drugs because it is overexpressed in many cancer cells and contributes to the acquisition of anticancer drug resistance. ing. Fluorescent probes HMRef-bGal and gGlu-HMRG targeting β-galactosidase and γ-glutamyltranspeptidase (GGT) overexpressed in cancer cells have been developed and successfully detected microtumors. (Non-Patent Documents 7 and 8). However, these enzymes are not overexpressed in all cancer cells, making it difficult to detect cancer cells with low levels of expression. On the other hand, since GSTP1 is overexpressed in almost all cancer cells except prostate cancer, it is considered possible to detect more cancer cells by detecting overexpression of GSTP1. Tissue immunostaining is performed in the pathological diagnosis of cancer. Presence/absence can be evaluated. In addition, fluorescent probes that detect GSTP1 activity available in living cells are expected to be used as new research tools.
非特許文献１や特許文献１に開示された蛍光プローブは、ＧＳＴ分子種の選択性が低い（すなわち、ＧＳＴＰ１に対する選択性を有しない）。また、当該蛍光プローブはＧＳＨとの反応性が高いことから、非酵素的な反応速度が大きい。このため、非特許文献１や特許文献１に開示されたＧＳＴ活性測定用蛍光プローブを用いたとしても、がん細胞において過剰発現しているＧＳＴＰ１の存在を特異的に検出することはできないという問題がある。
The fluorescent probes disclosed in
そこで本発明は、ＧＳＴＰ１の活性を選択的に検出することが可能な蛍光プローブを提供することを目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a fluorescent probe capable of selectively detecting GSTP1 activity.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、驚くべきことに、所定の化学構造を有するニトロベンゼン誘導体（またはその塩）が、上記課題を解決可能な蛍光プローブとして有用であることを見出し、本発明を完成させるに至った。 The present inventors have made intensive studies to solve the above problems. As a result, the inventors have surprisingly found that a nitrobenzene derivative (or a salt thereof) having a given chemical structure is useful as a fluorescent probe capable of solving the above problems, and have completed the present invention.
すなわち、本発明の一形態によれば、下記一般式（１）： That is, according to one aspect of the present invention, the following general formula (1):
式中、Ｌは蛍光団を表し、ＥＷＧ基は０．６６以上０．７８未満のハメット定数を有する電子求引性基を表し、ベンゼン環に結合したニトロ（ＮＯ２）基はベンゼン環に結合したアミド結合に対してオルト位またはパラ位に位置し、前記ＥＷＧ基は、前記ニトロ（ＮＯ２）基に対してオルト位またはパラ位に位置している、
で表されるニトロベンゼン誘導体またはその塩が提供される。In the formula, L represents a fluorophore, the EWG group represents an electron-withdrawing group having a Hammett constant of 0.66 or more and less than 0.78, and the nitro (NO 2 ) group attached to the benzene ring is attached to the benzene ring. is positioned ortho or para to the amide bond, and the EWG group is positioned ortho or para to the nitro (NO 2 ) group;
A nitrobenzene derivative represented by or a salt thereof is provided.
また、本発明の他の形態によれば、上記ニトロベンゼン誘導体またはその塩を含む、ＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブが提供される。 Moreover, according to another aspect of the present invention, there is provided a fluorescent probe for measuring GSTP1, containing the nitrobenzene derivative or a salt thereof.
さらに、本発明のさらに他の形態によれば、上記ＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブを含む、がん細胞またはがん組織の検出用組成物、およびがん診断用組成物、並びに上記ＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブまたは上記検出用組成物を用いたがん診断用キットが提供される。 Furthermore, according to still another aspect of the present invention, a composition for detecting cancer cells or cancer tissue, a composition for cancer diagnosis, and the above-described fluorescent probe for measuring GSTP1, which contain the above-described fluorescent probe for measuring GSTP1 Alternatively, a cancer diagnostic kit using the detection composition is provided.
また、本発明のさらに他の形態によれば、上記ＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブまたは上記検出用組成物を組織に適用する工程と、適用後の前記組織に対して励起光を照射する工程と、前記組織からの蛍光を検出する工程と含む、がん細胞またはがん組織の検出方法、および、上記ＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブまたは上記検出用組成物を、生体から採取した血液中の細胞と接触させる工程と、前記細胞に対して励起光を照射する工程と、前記細胞からの蛍光を検出する工程とを含む、血液中におけるがん細胞の検出方法が提供される。 Further, according to still another aspect of the present invention, the steps of applying the fluorescent probe for measuring GSTP1 or the composition for detection to a tissue, irradiating the tissue after application with excitation light, A method for detecting cancer cells or cancer tissue, comprising a step of detecting fluorescence from tissue, and a step of contacting the fluorescent probe for measuring GSTP1 or the composition for detection with cells in blood collected from a living body. , irradiating the cells with excitation light, and detecting fluorescence from the cells.
さらに、本発明のさらに他の形態によれば、下記一般式（４）： Furthermore, according to still another aspect of the present invention, the following general formula (4):
式中、ＥＷＧ基は０．６６以上０．７８未満のハメット定数を有する電子求引性基を表し、ベンゼン環に結合したニトロ（ＮＯ２）基はベンゼン環に結合したアミド結合に対してオルト位またはパラ位に位置し、前記ＥＷＧ基は、前記ニトロ（ＮＯ２）基に対してオルト位またはパラ位に位置し、Ｒ１は、置換もしくは非置換の炭素数１～２０のアルキル基、置換もしくは非置換の炭素数１～２０のアルコキシ基、またはアミド基（－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２基）を表し、ｍは０～５の整数を表す、
で表されるニトロベンゼン誘導体またはその塩もまた、提供される。In the formula, the EWG group represents an electron-withdrawing group having a Hammett constant of 0.66 or more and less than 0.78, and the nitro (NO 2 ) group attached to the benzene ring is ortho to the amide bond attached to the benzene ring. position or para position, the EWG group is positioned ortho or para to the nitro (NO 2 ) group, R 1 is a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, represents a substituted or unsubstituted alkoxy group having 1 to 20 carbon atoms, or an amide group (-C(=O) NH2 group), m represents an integer of 0 to 5,
A nitrobenzene derivative represented by or a salt thereof is also provided.
本発明によれば、ＧＳＴＰ１の活性を選択的に検出することが可能な蛍光プローブが提供される。本発明に係る蛍光プローブは、がん細胞またはがん組織の検出やがんの診断といった用途に用いられうる。 According to the present invention, a fluorescent probe capable of selectively detecting GSTP1 activity is provided. The fluorescent probe according to the present invention can be used for applications such as detection of cancer cells or cancer tissues and diagnosis of cancer.
以下、本発明の実施形態を説明する。 Embodiments of the present invention will be described below.
本発明の一形態は、下記一般式（１）： One aspect of the present invention is the following general formula (1):
で表されるニトロベンゼン誘導体またはその塩である。 is a nitrobenzene derivative or a salt thereof.
一般式（１）において、ＥＷＧ基は電子求引性基（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ－Ｗｉｔｈｄｒａｗｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ）であって、０．６６以上０．７８未満のハメット（Ｈａｍｍｅｔ）定数を有するものである。なお、本明細書において「ハメット（Ｈａｍｍｅｔ）定数（σｐ）」とは、ＥＷＧ基の電子求引性を示す指標であり、この値が大きいほど、電子求引性が高いことを示す。ここで、文献（Ｈａｎｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ， １９９１， Ｖｏｌ，９１， Ｎｏ． ２， １６５－１９５）に記載されているＥＷＧ基のハメット定数（σｐ）の値についてはその値を用いるものとする。一方、文献に記載されていないＥＷＧ基については、別途、従来公知のソフトウェアパッケージを利用し、無置換安息香酸の酸解離定数（ｐＫａ）との差を算出することでハメット定数（σｐ）の値を得ることができる。また、「酸解離定数（ｐＫａ）」とは、水溶液中での酸解離定数（ｐＫａ）を意味し、この値が小さいほど酸強度が大きいことを示す。ここで、水溶液中での酸解離定数（ｐＫａ）は、具体的には、無限希釈水溶液を用い、２５℃での酸解離定数を測定することにより実測することができる。また、従来公知のソフトウェアパッケージを用いることで、公知文献値のデータベースに基づいた値を計算により求めることもできる。 In general formula (1), the EWG group is an electron-withdrawing group and has a Hammett constant of 0.66 or more and less than 0.78. In the present specification, the "Hammet constant (σp)" is an index showing the electron-withdrawing property of the EWG group, and the larger this value, the higher the electron-withdrawing property. Here, the value of Hammett constant (σp) of the EWG group described in the literature (Hansch et al., Chemical Reviews, 1991, Vol, 91, No. 2, 165-195) is used. do. On the other hand, for the EWG group not described in the literature, the Hammett constant (σp) value was obtained by calculating the difference from the acid dissociation constant (pKa) of unsubstituted benzoic acid using a conventionally known software package. can be obtained. The term "acid dissociation constant (pKa)" means the acid dissociation constant (pKa) in an aqueous solution, and the smaller the value, the higher the acid strength. Here, the acid dissociation constant (pKa) in an aqueous solution can be specifically measured by measuring the acid dissociation constant at 25° C. using an infinitely diluted aqueous solution. Also, by using a conventionally known software package, it is possible to obtain a value by calculation based on a database of known literature values.
本発明において、ＥＷＧ基のハメット定数を「０．６６以上０．７８未満」としたのは、ＥＷＧ基のハメット定数が、ニトロ基（－ＮＯ２基）の値（０．７８）よりも小さく、シアノ基（－Ｃ≡Ｎ基）の値（０．６６）以上であることを示したものである。また、一般式（１）において、ＥＷＧ基は共鳴効果を示すものであることが好ましい。ここで、ＥＷＧ基が「共鳴効果を示す」とは、本発明に係るニトロベンゼン誘導体をＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブとして用いた場合において、当該ニトロベンゼン誘導体がＧＳＨと反応する際の上記ベンゼン環に対する芳香族求核置換反応の反応中間体であるマイゼンハイマー錯体の構造を安定化するように、当該ベンゼン環に結合したニトロ基上へ電子が局在化した共鳴構造が存在することを意味する。なお、本発明におけるＥＷＧ基の例としては、例えば、メシル基（－ＳＯ２ＣＨ３基；ハメット定数＝０．７２であり、共鳴効果を示す）やシアノ基（－Ｃ≡Ｎ基；ハメット定数＝０．６６であり、共鳴効果を示す）などが挙げられるが、これらに限定されない。In the present invention, the Hammett constant of the EWG group is set to “0.66 or more and less than 0.78” because the Hammett constant of the EWG group is smaller than the value (0.78) of the nitro group (—NO 2 group) , the value of the cyano group (-C≡N group) (0.66) or more. Moreover, in the general formula (1), the EWG group preferably exhibits a resonance effect. Here, the expression that the EWG group "exhibits a resonance effect" means that, when the nitrobenzene derivative according to the present invention is used as a fluorescent probe for measuring GSTP1, the nitrobenzene derivative reacts with GSH by an aromatic attraction to the benzene ring. It means that there is a resonance structure in which electrons are localized on the nitro group bonded to the benzene ring so as to stabilize the structure of the Meisenheimer complex, which is a reaction intermediate of the nuclear substitution reaction. Examples of the EWG group in the present invention include a mesyl group (--SO 2 CH 3 group; Hammett constant = 0.72, showing a resonance effect) and a cyano group (--C≡N group; Hammett constant = 0.66, indicating a resonance effect), but are not limited to these.
また、一般式（１）において、ベンゼン環に結合したニトロ（ＮＯ２）基はベンゼン環に結合したアミド結合に対してオルト位またはパラ位に位置し、前記ＥＷＧ基は、前記ニトロ（ＮＯ２）基に対してオルト位またはパラ位に位置している。このような配置とすることにより、ニトロベンゼン誘導体はＧＳＴＰ１選択的な蛍光プローブとして機能することができる。なお、一般式（１）においてベンゼン環に結合したアミド結合の当該ベンゼン環への結合位置を１位としたときに、上記の規定を満足するニトロ（ＮＯ２）基およびＥＷＧ基の結合位置の組み合わせを列挙すると以下の通りである：
・２位＝ニトロ（ＮＯ２）基、３位＝ＥＷＧ基；
・２位＝ニトロ（ＮＯ２）基、５位＝ＥＷＧ基；
・４位＝ニトロ（ＮＯ２）基、３位＝ＥＷＧ基。Further, in general formula (1), the nitro (NO 2 ) group bonded to the benzene ring is positioned ortho or para to the amide bond bonded to the benzene ring, and the EWG group is the nitro (NO 2 ) is positioned ortho or para to the group. With such arrangement, the nitrobenzene derivative can function as a GSTP1-selective fluorescent probe. In general formula (1), when the bonding position of the amide bond bonded to the benzene ring to the benzene ring is the 1-position, the bonding position of the nitro (NO 2 ) group and the EWG group that satisfies the above definition. The list of combinations is as follows:
- 2-position = nitro (NO 2 ) group, 3-position = EWG group;
- 2-position = nitro (NO 2 ) group, 5-position = EWG group;
- 4th-position = nitro (NO2) group, 3rd -position = EWG group.
一般式（１）において、Ｌは蛍光団を表す。ここで「蛍光団」とは、蛍光を発する発色団を意味し、本発明においては蛍光標識化合物として使用されうる蛍光性官能基であれば特に限定されない。当該蛍光団としては、例えば、フルオレセイン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ（ボロン－ジピロメテン）、クマリン、ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ、ＴｏｋｙｏＭａｇｅｎｔａ、ＳｉｎｇａｐｏｒｅＧｒｅｅｎ、ナフタルイミドおよびロドール（Ｒｈｏｄｏｌ）からなる群から選択される母核を有するものが挙げられる。なかでも、脂溶性が高く細胞膜透過性を有するという観点からは、クマリン、ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ、ＴｏｋｙｏＭａｇｅｎｔａ、およびＳｉｎｇａｐｏｒｅ Ｇｒｅｅｎからなる群から選択される母核を有するものが好ましく、ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎを母核として有するものが特に好ましい。ここで、一般式（１）で表されるニトロベンゼン誘導体において、蛍光団Ｌは、好ましくは下記一般式（２）： In general formula (1), L represents a fluorophore. Here, the term "fluorophore" means a chromophore that emits fluorescence, and in the present invention, it is not particularly limited as long as it is a fluorescent functional group that can be used as a fluorescent labeling compound. Examples of the fluorophore include those having a scaffold selected from the group consisting of fluorescein, rhodamine, BODIPY (boron-dipyrromethene), coumarin, TokyoGreen, TokyoMagenta, SingaporeGreen, naphthalimide and Rhodol. Among them, from the viewpoint of having high lipid solubility and cell membrane permeability, those having a scaffold selected from the group consisting of coumarin, TokyoGreen, TokyoMagenta, and Singapore Green are preferred, and those having TokyoGreen as a scaffold are particularly preferred. preferable. Here, in the nitrobenzene derivative represented by the general formula (1), the fluorophore L is preferably represented by the following general formula (2):
で表される構造を有するものであり、ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎを母核として有する化合物はこの形態に包含される。 Compounds having a structure represented by and having Tokyo Green as a mother nucleus are included in this form.
一般式（２）において、Ｒ１は、置換もしくは非置換の炭素数１～２０（好ましくは炭素数１～１２、より好ましくは炭素数１～８、さらに好ましくは炭素数１～４、特に好ましくは炭素数１～２、最も好ましくは炭素数１）のアルキル基、置換もしくは非置換の炭素数１～２０（好ましくは炭素数１～１２、より好ましくは炭素数１～８、さらに好ましくは炭素数１～４、特に好ましくは炭素数１～２、最も好ましくは炭素数１）のアルコキシ基、またはアミド基（－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２基）を表す。また、ｎはベンゼン環に結合したＲ１の数であり、０～４の整数を表す。ｎは、好ましくは０～３の整数であり、より好ましくは０～２の整数であり、さらに好ましくは０または１である。In general formula (2), R 1 is a substituted or unsubstituted C1 to C20 (preferably C1 to C12, more preferably C1 to C8, more preferably C1 to C4, particularly preferably is an alkyl group having 1 to 2 carbon atoms, most preferably 1) carbon atoms, a substituted or unsubstituted 1 to 20 carbon atoms (preferably 1 to 12 carbon atoms, more preferably 1 to 8 carbon atoms, more preferably carbon atoms It represents an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, particularly preferably 1 to 2 carbon atoms, most preferably 1 carbon atom, or an amide group (-C(=O)NH 2 group). Further, n is the number of R 1 bonded to the benzene ring and represents an integer of 0-4. n is preferably an integer of 0-3, more preferably an integer of 0-2, still more preferably 0 or 1.
一般式（２）において、Ｒ２は、水素原子または炭素数２～２０（好ましくは炭素数２～１２、より好ましくは炭素数２～８、さらに好ましくは炭素数２～４、特に好ましくは炭素数２～３、最も好ましくは炭素数２）のアシル基を表す。なかでも、ＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブとして用いられた際の脂溶性（すなわち、細胞膜透過性）が高いという観点からは、Ｒ２は炭素数２～２０のアシル基であることが好ましい。In general formula (2), R 2 is a hydrogen atom or 2 to 20 carbon atoms (preferably 2 to 12 carbon atoms, more preferably 2 to 8 carbon atoms, still more preferably 2 to 4 carbon atoms, particularly preferably carbon atoms It represents an acyl group having 2 to 3 carbon atoms, most preferably 2) carbon atoms. Among them, R 2 is preferably an acyl group having 2 to 20 carbon atoms from the viewpoint of high lipophilicity (that is, cell membrane permeability) when used as a fluorescent probe for measuring GSTP1.
一般式（２）において、Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、水素原子またはハロゲン原子を表す。ハロゲン原子はフッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子のいずれであってもよいが、Ｘ１および／またはＸ２がハロゲン原子である場合、当該ハロゲン原子はフッ素原子または塩素原子であることが好ましく、塩素原子であることが特に好ましい。また、ＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブとして用いられた場合のＧＳＴＰ１選択性の観点からは、Ｘ１およびＸ２の少なくとも一方が水素原子であることが好ましく、Ｘ１およびＸ２がともに水素原子であることがより好ましい。In general formula (2), X 1 and X 2 each independently represent a hydrogen atom or a halogen atom. A halogen atom may be a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom, but when X 1 and/or X 2 is a halogen atom, the halogen atom is a fluorine atom or a chlorine atom. is preferred, and a chlorine atom is particularly preferred. Further, from the viewpoint of GSTP1 selectivity when used as a fluorescent probe for measuring GSTP1, it is preferable that at least one of X 1 and X 2 is a hydrogen atom, and both X 1 and X 2 are hydrogen atoms. is more preferred.
本明細書において、「アルキル基」は直鎖状、分枝鎖状、環状、またはそれらの組み合わせからなるアルキル基のいずれであってもよい。Ｒ１がアルキル基である場合、その炭素数は上述したように１～２０であるが、好ましくは炭素数１～１２であり、より好ましくは炭素数１～８であり、さらに好ましくは炭素数１～４であり、特に好ましくは炭素数１～２（メチル基またはエチル基）であり、最も好ましくは炭素数１（メチル基）である。As used herein, the "alkyl group" may be linear, branched, cyclic, or a combination thereof. When R 1 is an alkyl group, it has 1 to 20 carbon atoms as described above, preferably 1 to 12 carbon atoms, more preferably 1 to 8 carbon atoms, and still more preferably 1 to 8 carbon atoms. 1 to 4 carbon atoms, particularly preferably 1 to 2 carbon atoms (methyl group or ethyl group), and most preferably 1 carbon atom (methyl group).
本明細書において、「アルコキシ基」は、－Ｏ－アルキル基を意味し、ここで「アルキル基」は上述した定義および好ましい形態を有する基である。 As used herein, an "alkoxy group" means an --O-alkyl group, where an "alkyl group" is a group having the definitions and preferred forms set forth above.
本明細書において、「アシル基」は、脂肪族アシル基または芳香族アシル基のいずれであってもよく、芳香族基を置換基として有する脂肪族アシル基であってもよい。アシル基は１個または２個以上のヘテロ原子を含んでいてもよい。例えば、アシル基としてアルキルカルボニル基（アセチル基など）、アルキルオキシカルボニル基（アセトキシカルボニル基など）、アリールカルボニル基（ベンゾイル基など）、アリールオキシカルボニル基（フェニルオキシカルボニル基など）、アラルキルカルボニル基（ベンジルカルボニル基など）、アルキルチオカルボニル基（メチルチオカルボニル基など）、アルキルアミノカルボニル基（メチルアミノカルボニル基など）、アリールチオカルボニル基（フェニルチオカルボニル基など）、またはアリールアミノカルボニル基（フェニルアミノカルボニル基など）などのアシル基が挙げられるが、これらに限定されることはない。 As used herein, the "acyl group" may be either an aliphatic acyl group or an aromatic acyl group, and may be an aliphatic acyl group having an aromatic group as a substituent. The acyl group may contain one or more heteroatoms. Examples of acyl groups include alkylcarbonyl groups (acetyl group, etc.), alkyloxycarbonyl groups (acetoxycarbonyl group, etc.), arylcarbonyl groups (benzoyl group, etc.), aryloxycarbonyl groups (phenyloxycarbonyl group, etc.), aralkylcarbonyl groups ( benzylcarbonyl group, etc.), alkylthiocarbonyl group (methylthiocarbonyl group, etc.), alkylaminocarbonyl group (methylaminocarbonyl group, etc.), arylthiocarbonyl group (phenylthiocarbonyl group, etc.), or arylaminocarbonyl group (phenylaminocarbonyl group and the like), but are not limited to these.
本明細書において、上述したＲ１としてのアルキル基やアルコキシ基、Ｒ２としてのアシル基は、任意の置換基を１個以上有していてもよい。前記置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子のいずれであってもよい）、アミノ基、モノもしくはジ置換アミノ基、置換シリル基、またはアシル基などが挙げられるが、これらに限定されることはない。上記の官能基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは互いに同一でも異なっていてもよい。ただし、Ｒ１としてのアルキル基およびアルコキシ基は非置換のものであることが好ましく、Ｒ１が存在する場合（ｎが１～４の整数である場合）、当該Ｒ１は非置換のアルキル基であることが好ましい。同様に、Ｒ２としてのアシル基は非置換のものであることが好ましい。In the present specification, the alkyl group or alkoxy group as R 1 and the acyl group as R 2 described above may have one or more optional substituents. Examples of the substituent include an alkoxy group, a halogen atom (which may be a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom), an amino group, a mono- or di-substituted amino group, a substituted silyl group, or Examples include acyl groups, but are not limited to these. When the above functional groups have two or more substituents, they may be the same or different. However, the alkyl group and alkoxy group as R 1 are preferably unsubstituted, and when R 1 exists (where n is an integer of 1 to 4), said R 1 is an unsubstituted alkyl group is preferably Likewise, acyl groups as R2 are preferably unsubstituted.
本発明の好ましい実施形態において、一般式（２）で表される蛍光団Ｌを有する化合物において、上述したＮＯ２基とＥＷＧ基との結合部位の組み合わせのうち、「２位＝ニトロ（ＮＯ２）基、５位＝ＥＷＧ基」の組み合わせのものであることが好ましく、この際、ＥＷＧ基がメシル基またはシアノ基であることがより好ましく、ＥＷＧ基がメシル基であることが最も好ましい。すなわち、本発明の好ましい実施形態において、一般式（１）で表されるニトロベンゼン化合物またはその塩は、下記一般式（３）：In a preferred embodiment of the present invention, in the compound having the fluorophore L represented by the general formula (2), among the combinations of the binding sites of the NO 2 group and the EWG group described above, "2-position = nitro (NO 2 ) group, 5-position=EWG group”, in which case the EWG group is more preferably a mesyl group or a cyano group, and most preferably the EWG group is a mesyl group. That is, in a preferred embodiment of the present invention, the nitrobenzene compound represented by general formula (1) or a salt thereof has the following general formula (3):
で表されるものである。なお、一般式（３）における符号の定義は、上記と同様である。 is represented by In addition, the definition of the code|symbol in General formula (3) is the same as that of the above.
上記一般式（１）で表される化合物は塩として存在する場合がある。塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などが挙げられる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、またはトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩が挙げられる。また、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩が挙げられる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などが例示されうる。ただし、本発明に係る化合物の塩はこれらに限定されることはない。 The compound represented by the general formula (1) may exist as a salt. Salts include base addition salts, acid addition salts, amino acid salts and the like. Base addition salts include, for example, metal salts such as sodium, potassium, calcium and magnesium salts, ammonium salts, or organic amine salts such as triethylamine, piperidine and morpholine salts. Examples of acid addition salts include mineral acid salts such as hydrochlorides, sulfates and nitrates, and organic acid salts such as methanesulfonates, p-toluenesulfonates, citrates and oxalates. Examples of amino acid salts include glycine salts. However, the salts of the compounds according to the present invention are not limited to these.
一般式（１）で表される本発明の化合物は、置換基の種類に応じて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合があり、エナンチオマーまたはジアステレオマーなどの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。 The compound of the present invention represented by general formula (1) may have one or more asymmetric carbon atoms depending on the type of substituent, and stereoisomers such as enantiomers or diastereomers are present. sometimes. All stereoisomers in pure form, any mixtures of stereoisomers, racemates, etc. are included within the scope of the present invention.
一般式（１）で表される本発明の化合物またはその塩は、水和物または溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の技術的範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒が挙げられる。 The compounds of the present invention represented by general formula (1) or salts thereof may exist as hydrates or solvates, and any of these substances are included within the technical scope of the present invention. Although the type of solvent that forms the solvate is not particularly limited, examples thereof include solvents such as ethanol, acetone, and isopropanol.
なお、本発明に係るニトロベンゼン化合物またはその塩は、生体内環境であるｐＨ７．４（好ましくはｐＨ７．０～８．０）の条件下において非イオン性の状態で存在するものであることが好ましい。このような条件を満たす化合物であれば、細胞膜透過性に特に優れることから、後述するような生細胞に対して用いられる蛍光プローブとして特に有用である。 The nitrobenzene compound or salt thereof according to the present invention preferably exists in a nonionic state under the in vivo environment of pH 7.4 (preferably pH 7.0 to 8.0). . A compound that satisfies these conditions is particularly useful as a fluorescent probe for living cells, as described below, since it has particularly excellent cell membrane permeability.
一般式（１）で表される本発明の化合物は、例えば、従来公知の文献（Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ． ２００８， １３０（４４）：１４５３３－１４５４３（非特許文献１））に記載の手法を参照しつつ、合成することが可能である。また、本明細書の実施例の欄には、一般式（１）で表される本発明の化合物に包含される代表的化合物についての製造方法が具体的に示されており、当業者は本明細書の開示を参照し、また、必要に応じて本願出願時の技術常識を参酌することで出発原料や試薬、反応条件などを適宜選択することにより、一般式（１）に包含される任意の化合物を容易に製造することができる。 For the compound of the present invention represented by the general formula (1), for example, refer to the method described in a conventionally known document (J Am Chem Soc. 2008, 130(44): 14533-14543 (non-patent document 1)). It is possible to synthesize In addition, in the Examples section of the present specification, production methods for representative compounds included in the compounds of the present invention represented by general formula (1) are specifically shown, and those skilled in the art will appreciate the present invention. By appropriately selecting starting materials, reagents, reaction conditions, etc. by referring to the disclosure of the specification and, if necessary, taking into consideration the common general knowledge at the time of filing of the present application, any of the can be easily produced.
一般式（１）で表される本発明の化合物は、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐ１測定用の蛍光プローブとして使用することができる。本発明の化合物は、中性領域（例えばｐＨ５～９の範囲）では実質的に無蛍光である。一方、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）およびグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐ１の存在下では、本発明の化合物におけるベンゼン環（の２位または４位）に結合しているニトロ基（－ＮＯ２基）が脱離するとともにこの位置がグルタチオン化され、強蛍光性の化合物となる。例えば、一般式（１）で表される化合物またはその塩は、中性領域において例えば４９０ｎｍ程度の励起光を照射した場合にはほとんど蛍光を発しないが、上記のようにグルタチオン化された化合物は同じ条件下において極めて強い蛍光（例えば、蛍光波長５１０ｎｍ）を発する性質を有している。そして、この反応はＧＳＴＰ１のみに対して選択的に起こり、他のＧＳＴ分子種が存在してもこの反応は進行しない。したがって、本発明の化合物をＧＳＴＰ１測定用の蛍光プローブとして使用することにより、ＧＳＴＰ１の存在を、蛍光強度の変化に基づいて選択的に測定することが可能になる。なお、一般に「蛍光プローブ」とは、特定のタンパク質、細胞、または組織などに特異的に結合または分布して蛍光を発することにより、特定のタンパク質、細胞、または組織の観察を容易にすることができる物質を意味する。通常、「蛍光プローブ」といった場合は、その物質自体が蛍光を発する物質をいうが、本発明では、それ自体蛍光を発しないが、分解などにより蛍光を発するようになる前駆物質もまた、「蛍光プローブ」の概念に含まれるものとする。The compounds of the present invention represented by general formula (1) can be used as fluorescent probes for measuring glutathione-S-transferase (GST) P1. The compounds of the invention are substantially non-fluorescent in the neutral region (eg pH range 5-9). On the other hand, in the presence of reduced glutathione (GSH) and glutathione-S-transferase (GST) P1, the nitro group ( -NO2 group ) is eliminated and this position is glutathionized, resulting in a strongly fluorescent compound. For example, the compound represented by the general formula (1) or a salt thereof hardly emits fluorescence when irradiated with excitation light of about 490 nm in a neutral region, but the compound glutathionized as described above It has the property of emitting extremely strong fluorescence (for example, fluorescence wavelength of 510 nm) under the same conditions. This reaction occurs selectively only for GSTP1, and does not proceed even if other GST molecular species are present. Therefore, by using the compounds of the present invention as fluorescent probes for measuring GSTP1, it becomes possible to selectively measure the presence of GSTP1 based on changes in fluorescence intensity. In general, a “fluorescent probe” is a substance that facilitates observation of a specific protein, cell, or tissue by specifically binding to or distributing it in a specific protein, cell, or tissue, and emitting fluorescence. means a substance that can Usually, the term "fluorescent probe" refers to a substance that itself emits fluorescence. shall be included in the concept of "probe".
ここで、ＧＳＴＰ１は、前立腺がんを除くほぼ全てのがん細胞で過剰発現していることが知られている。このため、本発明に係るＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブを用いてＧＳＴＰ１の過剰発現を捉えることにより、がん細胞を検出することが可能である。例えば、ＧＳＴＰ１の活性を検出可能な本発明に係る蛍光プローブを生検組織に塗布することでＧＳＴＰ１活性を指標としたがんの有無の評価が可能である。すなわち、本発明に係るＧＳＴＰ１測定用蛍光プローブは、がん細胞検出用のプローブとして利用可能であり、がん細胞またはがん組織の検出用組成物のほか、がん診断用組成物やがん診断用キットにおいて、さらにはがんの検出、判定、または診断方法においても使用することができる。なお、がんの検出、判定、または診断方法はｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる方法であってもよいし、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行われる方法であってもよい。 Here, GSTP1 is known to be overexpressed in almost all cancer cells except prostate cancer. Therefore, cancer cells can be detected by detecting overexpression of GSTP1 using the fluorescent probe for measuring GSTP1 according to the present invention. For example, the presence or absence of cancer can be evaluated using GSTP1 activity as an indicator by applying a fluorescent probe according to the present invention capable of detecting GSTP1 activity to a biopsy tissue. That is, the fluorescent probe for measuring GSTP1 according to the present invention can be used as a probe for detecting cancer cells, and can be used not only in a composition for detecting cancer cells or cancer tissues, but also in a composition for diagnosing cancer or cancer cells. It can be used in diagnostic kits and also in cancer detection, determination, or diagnostic methods. A method for detecting, determining, or diagnosing cancer may be a method performed in vitro, or may be a method performed ex vivo or in vivo.
本発明に係る化合物、蛍光プローブ、または検出もしくは診断用組成物は、プレパラート、ガラスボトムディッシュやスライドガラス、マルチウェルプレートなど、生体イメージングの手法において一般的に用いられる観察容器に保持した生体試料に対して作用させることができるが、国際公開第２０１１／１４９０３２号パンフレットなどに記載の生体試料固定装置に保持した生体試料に対して作用させることもできる。すなわち、本発明の他の形態によれば、本発明に係る化合物、蛍光プローブまたは検出もしくは診断用組成物、並びに生体試料固定装置を含むがん診断用キットが提供される。保持された生体試料に対して、本発明に係る化合物、蛍光プローブ、あるいは検出もしくは診断用組成物、またはその溶液を加えることにより接触させ、所定の時間インキュベートした後に、蛍光顕微鏡やマイクロプレートリーダーを用いて励起光を生体試料に照射し、生じた蛍光を検出することができ、これを通じて蛍光を発する細胞をがん細胞と判定することができる。本発明では、試料の取得の容易性の観点から、生体試料の好ましい一例は血液であり、この場合において好ましくは、血液から得られた細胞群である。がんを患う患者から採取された血液の細胞群には、大量の血球細胞および少数のがん細胞が含まれているが、本発明に係る化合物、蛍光プローブ、または検出もしくは診断用組成物を用いることにより、大量の細胞の中からがん細胞を精度よく検出することが可能になる。これにより、被験者の血液細胞中にがん細胞が存在した場合には、当該被験者ががんを患っていると判定または診断することができる。別法では、インキュベート後に、フローサイトメトリーや蛍光顕微鏡による画像取得とそれに続くマイクロピペットによる細胞分取技法を用いて、がん細胞数の計測およびがん細胞の取得を行うこともできる。被験者の血液細胞中のがん細胞数を計測することにより、ＣＴなどの画像診断では発見不可能な微小な固形がんの存在を診断することが可能となり、これによりがんの早期診断も可能になる。さらに、被験者の所定体積の血液中の血液細胞におけるがん細胞数を一定期間ごとに計測することにより、被験者に対する外科手術、放射線治療などによる局所治療、または化学療法などによる全身治療、または分子標的薬の投与などによる治療の効果を判定することが可能となる。また、被験者の血液細胞中のがん細胞を検出後、取得することにより、がん細胞に対して別途解析手法を適用することが可能となり、遺伝子解析、発現解析、局在解析などの性状解析が可能となる。なお、生体試料の由来は血液に特に制限されず、血液以外の生体由来の試料であってもよいし、非生体由来の試料であってもよい。血液以外の生体由来の試料の種類は特に制限されないが、例えば、リンパ液、髄液その他の体液；細胞抽出物（ホモジネート）などが挙げられる。 Compounds, fluorescent probes, or detection or diagnostic compositions according to the present invention can be applied to biological samples held in observation containers commonly used in bioimaging techniques, such as preparations, glass bottom dishes, slide glasses, and multiwell plates. However, it is also possible to act on the biological sample held in the biological sample fixing device described in WO 2011/149032 pamphlet. That is, according to another aspect of the present invention, there is provided a cancer diagnostic kit comprising a compound, a fluorescent probe or a detection or diagnostic composition according to the present invention, and a biological sample fixing device. The retained biological sample is contacted by adding a compound, fluorescent probe, detection or diagnostic composition, or a solution thereof according to the present invention, incubated for a predetermined time, and then subjected to a fluorescence microscope or microplate reader. A biological sample can be irradiated with excitation light using this method, and the resulting fluorescence can be detected. Through this, cells emitting fluorescence can be determined to be cancer cells. In the present invention, a preferred example of the biological sample is blood from the viewpoint of ease of sample acquisition, and in this case, preferably a cell group obtained from blood. Blood cells collected from patients suffering from cancer contain a large number of blood cells and a small number of cancer cells. By using it, it becomes possible to detect cancer cells from a large number of cells with high accuracy. Accordingly, when cancer cells are present in blood cells of a subject, it is possible to determine or diagnose that the subject has cancer. Alternatively, after incubation, cancer cell counts and cancer cell acquisition can be performed using flow cytometry or fluorescence microscopy imaging followed by micropipette cell sorting techniques. By measuring the number of cancer cells in a subject's blood cells, it is possible to diagnose the presence of microscopic solid tumors that cannot be detected by imaging diagnostics such as CT, thereby enabling early diagnosis of cancer. become. Furthermore, by measuring the number of cancer cells in blood cells in a predetermined volume of blood of a subject at regular intervals, local treatment such as surgery or radiotherapy, or systemic treatment such as chemotherapy, or molecular targeted therapy can be performed on the subject. It becomes possible to determine the effect of treatment such as administration of a drug. In addition, by detecting and acquiring cancer cells in the blood cells of a subject, it is possible to apply separate analysis methods to cancer cells, and to perform property analysis such as gene analysis, expression analysis, and localization analysis. becomes possible. The origin of the biological sample is not particularly limited to blood, and it may be a sample derived from a living body other than blood or a sample derived from a non-living body. There are no particular limitations on the types of samples derived from living organisms other than blood, but examples include lymph fluid, cerebrospinal fluid and other bodily fluids; cell extracts (homogenates) and the like.
本発明に係るがん細胞またはがん組織の検出用組成物、並びにがん診断用組成物は、生体イメージングの他に、手術または検査において、手術もしくは検査前または手術もしくは検査中に本発明に係るがん細胞またはがん組織の検出用組成物を非経口投与することにより適用するか、または肉眼下または鏡視下における手術野の一部または全体に本発明に係る組成物を噴霧、塗布または注入などの方法により適用し、数十秒から数分後に励起光を適用部位に照射することにより、がん細胞またはがん組織を検出するために用いられてもよい。本発明に係る検出用または診断用組成物が適用された部位にがん組織が含まれる場合には、その組織が蛍光を発することから、その蛍光を発している部位ががん組織であると特定することができ、そこを含めた周囲組織と共に切除をすることが可能になる。ここで、「手術」とは、例えば開創を伴う開頭手術、開胸手術、もしくは開腹手術、または皮膚手術などのほか、胃内視鏡、大腸内視鏡、腹腔鏡、または胸腔鏡などの鏡視下手術などを含めて、がんの治療のために適用される任意の手術を包含する。これにより、がんを切除する外科治療において、がんの形態や触覚に頼って決定されていたがん組織の範囲を、より明確に精度良く決定することができ、切除範囲の確定が容易になる。また、「検査」の用語は、胃内視鏡や大腸内視鏡などの内視鏡を用いた検査、および検査に伴う切除や採取などの処置のほか、生体から分離・採取された組織に対して行う検査などを包含する。内視鏡を用いた検査に用いた場合、がん組織が蛍光を発することにより、がん組織の特定が極めて容易になる。内視鏡検査においてがん組織が確認できた場合には、その組織について検査切除や治療的な切除を行うこともできる。手術や検査といった用語は最も広義に解釈しなければならず、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。 The composition for detecting cancer cells or cancer tissues and the composition for diagnosing cancer according to the present invention can be used not only in bioimaging but also in surgery or examination, before surgery or examination, or during surgery or examination. The composition for detecting cancer cells or cancer tissue is applied by parenteral administration, or the composition of the present invention is sprayed or applied to a part or the whole of the surgical field under macroscopic or microscopic observation. Alternatively, it may be used to detect cancer cells or cancer tissue by applying it by a method such as injection and irradiating the application site with excitation light several tens of seconds to several minutes later. When the site to which the detection or diagnostic composition according to the present invention is applied contains cancer tissue, the tissue emits fluorescence. It can be identified and resected along with the surrounding tissue including it. Here, the term "surgery" refers to, for example, craniotomy, thoracotomy, or laparotomy with open wounds, or skin surgery, as well as endoscopes such as gastroscopes, colonoscopies, laparoscopes, or thoracoscopes. It includes any surgery indicated for the treatment of cancer, including visual surgery and the like. This makes it possible to more clearly and accurately determine the extent of cancerous tissue, which used to depend on the morphology and tactile sense of the cancer, in surgical treatment to remove cancer, making it easier to determine the extent of resection. Become. In addition, the term “examination” includes examinations using endoscopes such as gastroscopy and colonoscopy, procedures such as excision and collection associated with examinations, as well as tissue isolated and collected from living organisms. This includes inspections performed on When used for examination using an endoscope, the cancer tissue emits fluorescence, making it extremely easy to identify the cancer tissue. If cancer tissue can be confirmed by endoscopy, the tissue can be resected for examination or therapeutic resection. Terms such as surgery and examination should be interpreted in the broadest sense and should not be interpreted restrictively in any way.
本発明に係るがん細胞またはがん組織の検出用組成物、並びにがん診断用組成物の適用濃度は、特に限定されないが、がん組織の存在が疑われる組織に対して、例えば、１～１０００μＭ程度の濃度の溶液を適用することができる。組成物のｐＨについては、例えばｐＨ７．０～７．５の範囲で使用することが好ましい。本発明の検出用組成物及び診断用組成物としては、上述した本発明に係る化合物（またはその塩）をそのまま用いてもよいが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合してもよい。例えば生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、一般的には粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒、錠剤、液剤など任意の形態の組成物として提供されるが、使用時に注射用滅菌水や、適宜の緩衝液に溶解して適用すればよい。 The application concentration of the composition for detecting cancer cells or cancer tissues and the composition for diagnosing cancer according to the present invention is not particularly limited. Solutions with concentrations on the order of ˜1000 μM can be applied. Regarding the pH of the composition, it is preferable to use it in the range of pH 7.0 to 7.5, for example. As the composition for detection and the composition for diagnosis of the present invention, the compound (or salt thereof) of the present invention described above may be used as it is. May be blended. For example, as additives for using the reagent in a physiological environment, additives such as dissolution aids, pH adjusters, buffers, and tonicity agents can be used, and the amount of these additives can be appropriately selected by those skilled in the art. is. These compositions are generally provided as a composition in any form such as powdered mixtures, lyophilized products, granules, tablets, and liquids. It can be dissolved and applied.
本発明の他の形態によれば、本発明に係る化合物、蛍光プローブ、または検出用もしくは診断用組成物を用いたがん細胞またはがん組織の検出方法が提供される。当該検出方法では、本発明に係る化合物、蛍光プローブ、または検出もしくは診断用組成物を、細胞または組織に適用し、適用後の細胞または組織に対して所定の励起光を照射することにより、細胞または組織における蛍光を検出することを含む。好ましくはかかる方法は、血液中におけるがん細胞を検出する方法であり、その場合、血液中の細胞は、プレパラートなどの観察容器に固定されていてもよいし、上で説明した生体試料固定装置により固定された診断チップであってもよい。一方で、このような検出方法を、生体の組織に適用して、手術時におけるがん組織の確定診断に用いることもできる。その場合の適用方法としては、細胞または組織に対して噴霧または塗布することにより適用してもよいし、注射や輸液により適用されてもよい。 According to another aspect of the present invention, there is provided a method of detecting cancer cells or cancer tissue using the compounds, fluorescent probes, or detection or diagnostic compositions of the present invention. In the detection method, the compound, fluorescent probe, or detection or diagnostic composition according to the present invention is applied to a cell or tissue, and the cell or tissue after application is irradiated with a predetermined excitation light, whereby the cell or detecting fluorescence in tissue. Preferably, such a method is a method for detecting cancer cells in blood. In this case, the cells in blood may be fixed in an observation container such as a slide, or the biological sample fixing device described above may be used. It may also be a diagnostic chip fixed by On the other hand, such a detection method can also be applied to living tissue and used for definitive diagnosis of cancer tissue at the time of surgery. In that case, the application method may be spraying or coating on cells or tissues, or may be applied by injection or infusion.
本発明のさらに他の形態によれば、本発明に係るがん細胞またはがん組織の検出方法を用いて、がんの切除領域を決定し、当該領域を切除する工程を含む、手術・治療方法に関してもよい。 According to still another aspect of the present invention, the method for detecting cancer cells or cancer tissues according to the present invention is used to determine a cancer resection region, and a surgical or therapeutic method comprising the step of resecting the region. It can also be about the method.
本発明に係るがん細胞の検出方法は、がんの判定または診断方法に用いることができる。すなわち、本発明に係るがん細胞の検出方法により、指標となる蛍光よりも高い蛍光が検出された場合に、がんが存在すると判定または診断することができる。ここで、判定方法とは、指標との比較をすることにより、医師をはじめとした医療従事者による判断を含まずに特定する方法をいう。例えば指標となる蛍光として、蛍光を有する細胞を選択することができ、この場合、蛍光を有する細胞が検出された場合に、対象ががんを有すると決定することができる。別の形態では、蛍光強度や蛍光を有する細胞の数を指標とすることにより、がんの重篤度を判定することもできる。 The method for detecting cancer cells according to the present invention can be used for determining or diagnosing cancer. That is, the cancer cell detection method according to the present invention can determine or diagnose the presence of cancer when fluorescence higher than the fluorescence used as an index is detected. Here, the determination method refers to a method of specifying by comparison with an index without including judgment by medical professionals such as doctors. For example, cells with fluorescence can be selected as the indicator fluorescence, in which case it can be determined that the subject has cancer if cells with fluorescence are detected. In another form, the severity of cancer can be determined by using fluorescence intensity or the number of cells having fluorescence as an index.
本明細書において、「がん組織」の用語はがん細胞を含む任意の組織を意味している。「組織」の用語は、臓器の一部または全体を含めて最も広義に解釈することができ、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。本発明に係るがん診断薬は、がん組織において特異的に強発現しているＧＳＴＰ１の活性を検出する作用を有していることから、がん組織の中でも、ＧＳＴＰ１を高発現している組織が好ましく、このようながん組織は、前立腺がんの組織を除くほとんどのがん組織である。がんの例としては、例えば、大腸がん、乳がん、肺がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆道がん、脾臓がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん、卵巣がん、精巣がん、甲状腺がん、膵臓がん、脳腫瘍、造血器腫瘍などが挙げられるが、これらのがん種に限定されることを意図するものではない。また、後述する実施例の欄において実証されているように、本発明に係る蛍光プローブを用いることで、ＧＳＴＰ１遺伝子のプロモーター領域の脱メチル化に基づくＧＳＴＰ１タンパク質発現の有無を検出することが可能である。ここで、正常上皮細胞においてはＧＳＴＰ１が発現しているが、がん化によってＧＳＴＰ１遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧ部分がメチル化されることでＧＳＴＰ１の発現が見られなくなることが知られている。したがって、本発明に係る蛍光プローブをそのような系へ適用することができれば、蛍光の有無を指標として、前立腺がん細胞（ＧＳＴＰ１が過剰発現していない）の検出を行うことも可能である。 As used herein, the term "cancer tissue" means any tissue containing cancer cells. The term "tissue" can be interpreted in the broadest sense, including a part or the whole of an organ, and should not be interpreted restrictively in any way. Since the cancer diagnostic agent according to the present invention has the effect of detecting the activity of GSTP1 that is specifically and strongly expressed in cancer tissues, GSTP1 is highly expressed even in cancer tissues. Tissues are preferred, and such cancer tissues are most cancer tissues, with the exception of those of prostate cancer. Examples of cancer include colon cancer, breast cancer, lung cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, and ovarian cancer. , testicular cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, brain tumor, hematopoietic tumor, etc., but it is not intended to be limited to these cancer types. In addition, as demonstrated in the Examples section below, the use of the fluorescent probe according to the present invention makes it possible to detect the presence or absence of GSTP1 protein expression based on demethylation of the promoter region of the GSTP1 gene. be. Here, GSTP1 is expressed in normal epithelial cells, but it is known that the expression of GSTP1 is lost due to methylation of the CpG portion of the promoter region of the GSTP1 gene due to carcinogenesis. Therefore, if the fluorescent probe according to the present invention can be applied to such a system, it is possible to detect prostate cancer cells (without overexpression of GSTP1) using the presence or absence of fluorescence as an index.
以下、実施例を用いて本発明の好ましい実施形態についてより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲が下記の実施例によって限定されるわけではない。 Preferred embodiments of the present invention will be described in more detail below using examples, but the technical scope of the present invention is not limited by the following examples.
［ＧＳＴＰ１選択的な基質の探索］
本実験では、ＧＳＴＰ１選択的な蛍光プローブを構築するにあたり、いくつかのニトロベンゼン誘導体を対象として、ＧＳＴＰ１選択的な基質を探索した。[Search for GSTP1-selective substrates]
In this experiment, in constructing a GSTP1-selective fluorescent probe, we searched for GSTP1-selective substrates using several nitrobenzene derivatives as targets.
ここで、上述したようにヒトの細胞質型ＧＳＴにはＡｌｐｈａ、Ｍｕ、Ｐｉなど７種類のクラスが存在するが、本実験ではこれらのうち生体内の発現量が多く論文としても多くの報告があるＧＳＴＡ１、ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＰ１の３種類の細胞質型ＧＳＴを用いてアッセイを行うことにより、各種ニトロベンゼン誘導体のＧＳＴの基質としての反応性および選択性を評価した。非特許文献１では、ニトロベンゼン誘導体においてニトロ基（高い電子求引性を有する）がグルタチオン（弱い電子供与性を有する）へと置換されると吸収スペクトルが大きく変化することを利用して、アッセイを行っている。ここではまず、非特許文献１と同様の手法を用いて、非特許文献１で提案されているＧＳＴ活性検出蛍光プローブ（ＤＮＡＴ－Ｍｅ）のＧＳＴ基質部位である以下の化合物（Ａ）（３，４－ジニトロベンズアニリド（３，４－ＮＮＢＡ））を基準物質として合成した。また、合成原料を変更することにより、化合物（Ａ）と同様の手法により以下の化合物（Ｂ）～（Ｇ）を合成した。
Here, as described above, human cytoplasmic GST has seven classes such as Alpha, Mu, and Pi. The reactivity and selectivity of various nitrobenzene derivatives as GST substrates were evaluated by performing assays using three types of cytosolic GST, GSTA1, GSTM1, and GSTP1. In
なお、ここでは、安息香酸誘導体を出発物質とした、化合物（Ｆ）の合成スキーム（下記の反応スキーム１）、化合物（Ｇ）の合成スキーム（下記の反応スキーム２）、および化合物（Ｄ）の合成スキーム（下記の反応スキーム３）について説明する。その後、化合物（Ｂ）および化合物（Ｃ）の合成方法についても、説明する。
Here, a synthesis scheme of compound (F) (
［反応スキーム１］ [Reaction Scheme 1]
（化合物（ａ）の合成；５－メチルチオ－２－ニトロ安息香酸）
５－フルオロ－２－ニトロ安息香酸（３０５ｍｇ，１．７ｍｍｏｌ），ナトリウムメタンチオラート（６２０ｍｇ，８．８ｍｍｏｌ）をイソプロパノール（１０ｍＬ）に懸濁し、室温で３０分間撹拌した。反応溶液に１Ｎ ＨＣｌを加えて反応を止め、酢酸エチルで分液し、１Ｎ ＨＣｌで２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。酢酸エチル－ヘキサンで再結晶させて、目的化合物を得た（２４６ｍｇ，収率７０％）。(Synthesis of compound (a); 5-methylthio-2-nitrobenzoic acid)
5-fluoro-2-nitrobenzoic acid (305 mg, 1.7 mmol) and sodium methanethiolate (620 mg, 8.8 mmol) were suspended in isopropanol (10 mL) and stirred at room temperature for 30 minutes. 1N HCl was added to the reaction solution to stop the reaction, and the mixture was separated with ethyl acetate and washed twice with 1N HCl and once with saturated brine. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. Recrystallization from ethyl acetate-hexane gave the target compound (246 mg, yield 70%).
（化合物（ａ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）δ：７．９６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５，１．６Ｈｚ），７．５８－７．５６（２Ｈ，ｍ），２．６５（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）δ：１６６．５，１４８．５，１４５．１，１３０．０，１２７．９，１２５．９，１２５．４，１４．７。(Equipment data of compound (a))
1 H-NMR (400 MHz, Acetone-d 6 ) δ: 7.96 (1H, dd, J = 7.5, 1.6 Hz), 7.58-7.56 (2H, m), 2.65 ( 3H, s)
13 C-NMR (100 MHz, Acetone-d 6 ) δ: 166.5, 148.5, 145.1, 130.0, 127.9, 125.9, 125.4, 14.7.
（化合物（ｂ）の合成；５－メシル－２－ニトロ安息香酸）
５－メチルチオ－２－ニトロ安息香酸（ａ）（９７ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ），３０％ Ｈ２Ｏ２（４ｍＬ，３９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４ｍＬ）に懸濁し、泡が出るまでリン酸三カリウムを加え、室温で２０分間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加え、１Ｎ ＨＣｌで２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。酢酸エチル－ヘキサンで再結晶させて、目的化合物を得た（７９ｍｇ，収率６８％）。(Synthesis of compound (b); 5-mesyl-2-nitrobenzoic acid)
5-Methylthio-2-nitrobenzoic acid (a) (97 mg, 0.47 mmol), 30% H 2 O 2 (4 mL, 39 mmol) was suspended in acetonitrile (4 mL), and tripotassium phosphate was added until foaming. , and stirred at room temperature for 20 minutes. Ethyl acetate was added to the reaction solution, and the mixture was washed twice with 1N HCl and once with saturated brine. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. Recrystallization from ethyl acetate-hexane gave the target compound (79 mg, yield 68%).
（化合物（ｂ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）δ：８．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），８．３８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．１Ｈｚ），８．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），３．３２（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）δ：１６４．３，１５２．９，１４５．５，１３３．０，１３０．７，１２８．０，１２５．９，４３．９
ＬＲＭＳ（ＥＩ＋）；２４６。(Instrumental data of compound (b))
1 H-NMR (400 MHz, Acetone-d 6 ) δ: 8.47 (1H, d, J = 2.3 Hz), 8.38 (1H, dd, J = 8.5, 2.1 Hz), 8. 20 (1H, d, J=8.2Hz), 3.32 (3H, s)
13 C-NMR (100 MHz, Acetone-d 6 ) δ: 164.3, 152.9, 145.5, 133.0, 130.7, 128.0, 125.9, 43.9
LRMS (EI <+> ); 246.
（化合物（Ｆ）の合成；５－メシル－２－ニトロ安息香酸アニリド）
５－メシル－２－ニトロ安息香酸（ｂ）（２７ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ），ＷＳＣＤ・ＨＣｌ（５０ｍｇ，０．２６ｍｍｏｌ），アニリン（１５．２μＬ，０．１７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５ｍＬ）に懸濁し、室温で１５分間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加え、０．１Ｎ ＨＣｌで２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。酢酸エチル－ヘキサンで再結晶させて、目的化合物を得た（２１ｍｇ，収率５８％）。(Synthesis of compound (F); 5-mesyl-2-nitrobenzoic acid anilide)
5-mesyl-2-nitrobenzoic acid (b) (27 mg, 0.11 mmol), WSCD.HCl (50 mg, 0.26 mmol), aniline (15.2 μL, 0.17 mmol) were suspended in acetonitrile (5 mL), Stir at room temperature for 15 minutes. Ethyl acetate was added to the reaction solution, and the mixture was washed twice with 0.1N HCl and once with saturated brine. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. Recrystallization from ethyl acetate-hexane gave the target compound (21 mg, yield 58%).
（化合物（Ｆ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）δ：８．３６－８．２９（３Ｈ，ｍ），７．７４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．３８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．１６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），３．３２（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）δ：１６３．２，１５１．１，１４６．１，１３９．５，１３４．３，１３０．９，１２９．７，１２９．１，１２６．４，１２５．３，１２０．７，４３．８
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１４Ｈ１２Ｎ２Ｏ５ＳＮａ［Ｍ＋Ｎａ］＋：３２３．０３６７，ｆｏｕｎｄ：３４３．０３６７（＋０．０ｍｍｕ）。(Equipment data of compound (F))
1 H-NMR (400 MHz, Acetone-d 6 ) δ: 8.36-8.29 (3H, m), 7.74 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.38 (2H, t, J = 7.5 Hz), 7.16 (2H, t, J = 7.3 Hz), 3.32 (3H, s)
13 C-NMR (100 MHz, Acetone-d 6 ) δ: 163.2, 151.1, 146.1, 139.5, 134.3, 130.9, 129.7, 129.1, 126.4, 125.3, 120.7, 43.8
HRMS (ESI-TOF) m/z calcd for C14H12N2O5SNa [M + Na] + : 323.0367 , found: 343.0367 (+0.0 mmu).
（化合物（ｃ）の合成；５－メシル－２－メチルチオ安息香酸アニリド）
５－メシル－２－ニトロ安息香酸アニリド（Ｆ）（４６ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ），ナトリウムメタンチオラート（１００ｍｇ，１．４ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（５ｍＬ）に懸濁し、室温で１０分間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加え、１Ｎ ＨＣｌで２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。酢酸エチル－ヘキサンで再結晶させて、目的化合物を得た（３４ｍｇ，収率７３％）。(Synthesis of compound (c); 5-mesyl-2-methylthiobenzoic acid anilide)
5-Mesyl-2-nitrobenzoic acid anilide (F) (46 mg, 0.14 mmol) and sodium methanethiolate (100 mg, 1.4 mmol) were suspended in dimethylsulfoxide (5 mL) and stirred at room temperature for 10 minutes. Ethyl acetate was added to the reaction solution, and the mixture was washed twice with 1N HCl and once with saturated brine. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. Recrystallization from ethyl acetate-hexane gave the target compound (34 mg, yield 73%).
（化合物（ｃ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ７．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），７．９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８Ｈｚ），７．６９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．３６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３），３．２５（３Ｈ，ｓ），２．５２（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１６４．８，１４５．５，１３８．７，１３６．１，１３５．１，１２８．８，１２８．４，１２５．９，１２５．６，１２４．０，１１９．９，４３．６，１４．８
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１５Ｈ１５ＮＯ３Ｓ２Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋：３４４．０３９１，ｆｏｕｎｄ：３４４．０３９３（＋０．２ｍｍｕ）。(Instrumental data of compound (c))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.98 (1H, d, J = 1.8 Hz), 7.95 (1H, dd, J = 8.2, 1.8 Hz), 7.69 ( 2H, d, J = 7.8Hz), 7.62 (1H, d, J = 8.7Hz), 7.36 (2H, t, J = 8.0Hz), 7.12 (1H, t, J = 7.3), 3.25 (3H, s), 2.52 (3H, s)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 164.8, 145.5, 138.7, 136.1, 135.1, 128.8, 128.4, 125.9, 125.6, 124.0, 119.9, 43.6, 14.8
HRMS (ESI-TOF) m/z calcd for C15H15NO3S2Na [M + Na] + : 344.0391 , found: 344.0393 (+0.2mmu).
［反応スキーム２］ [Reaction scheme 2]
（化合物（ｄ）の合成；２－メチルチオ－５－ニトロ安息香酸）
２－フルオロ－５－ニトロ安息香酸（２３５ｍｇ，１．３ｍｍｏｌ）とナトリウムメタンチオラート（４５０ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）をイソプロパノール（６ｍＬ）に懸濁し、室温で１時間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加え、１Ｎ ＨＣｌで２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。酢酸エチル－ヘキサンで再結晶させて、目的化合物を得た（１７３ｍｇ，収率６４％）。(Synthesis of compound (d); 2-methylthio-5-nitrobenzoic acid)
2-Fluoro-5-nitrobenzoic acid (235 mg, 1.3 mmol) and sodium methanethiolate (450 mg, 0.42 mmol) were suspended in isopropanol (6 mL) and stirred at room temperature for 1 hour. Ethyl acetate was added to the reaction solution, and the mixture was washed twice with 1N HCl and once with saturated brine. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. Recrystallization from ethyl acetate-hexane gave the target compound (173 mg, yield 64%).
（化合物（ｄ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）δ：７．９６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５，１．６Ｈｚ），７．５８－７．５６（２Ｈ，ｍ），２．６５（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）δ：１６６．５，１４８．５，１４５．１，１３０．０，１２７．９，１２５．９，１２５．４，１４．７。(Instrumental data of compound (d))
1 H-NMR (400 MHz, Acetone-d 6 ) δ: 7.96 (1H, dd, J = 7.5, 1.6 Hz), 7.58-7.56 (2H, m), 2.65 ( 3H, s)
13 C-NMR (100 MHz, Acetone-d 6 ) δ: 166.5, 148.5, 145.1, 130.0, 127.9, 125.9, 125.4, 14.7.
（化合物（ｅ）の合成；２－メチルスルフィニル－５－ニトロ安息香酸）
２－メチルスルチオ－５－ニトロ安息香酸（ｄ）（９７ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ），３０％Ｈ２Ｏ２（４ｍＬ，３９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１ｍＬ）に懸濁し、泡が出るまでリン酸三カリウムを加え、室温で３０分間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加え、１Ｎ ＨＣｌで２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。酢酸エチル－ヘキサンで再結晶させて、目的化合物を得た（３３ｍｇ，収率２９％）。(Synthesis of compound (e); 2-methylsulfinyl-5-nitrobenzoic acid)
2-Methylsulthio-5-nitrobenzoic acid (d) (97 mg, 0.47 mmol), 30% H 2 O 2 (4 mL, 39 mmol) was suspended in acetonitrile (1 mL), and tripotassium phosphate was added until foaming. , and stirred at room temperature for 30 minutes. Ethyl acetate was added to the reaction solution, and the mixture was washed twice with 1N HCl and once with saturated brine. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. Recrystallization from ethyl acetate-hexane gave the target compound (33 mg, yield 29%).
（化合物（ｅ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：８．６９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．５Ｈｚ），８．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），８．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），２．８２（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１６５．０，１５７．５，１４８．６，１２９．１，１２７．９，１２５．８，１２５．２，４３．７。(Instrumental data of compound (e))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 8.69 (1H, dd, J = 8.5, 2.5 Hz), 8.65 (1H, d, J = 2.7 Hz), 8. 35 (1H, d, J=8.7Hz), 2.82 (3H, s)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 165.0, 157.5, 148.6, 129.1, 127.9, 125.8, 125.2, 43.7.
（化合物（Ｇ）の合成；２－メチルスルフィニル－５－ニトロ安息香酸アニリド）
２－メチルスルフィニル－５－ニトロ安息香酸（ｅ）（１６．９ｍｇ，０．０６９ｍｍｏｌ），ＷＳＣＤ・ＨＣｌ（３９．９ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ），アニリン（９．３９μＬ，０．１０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４ｍＬ）に懸濁し、室温で１０分間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加え、０．１Ｎ ＨＣｌで２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。酢酸エチル－ヘキサンで再結晶させて、目的化合物を得た（１１ｍｇ，収率４９％）。(Synthesis of compound (G); 2-methylsulfinyl-5-nitrobenzoic acid anilide)
2-Methylsulfinyl-5-nitrobenzoic acid (e) (16.9 mg, 0.069 mmol), WSCD.HCl (39.9 mg, 0.21 mmol), aniline (9.39 µL, 0.10 mmol) was dissolved in acetonitrile (4 mL). ) and stirred at room temperature for 10 minutes. Ethyl acetate was added to the reaction solution, and the mixture was washed twice with 0.1N HCl and once with saturated brine. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. Recrystallization from ethyl acetate-hexane gave the target compound (11 mg, yield 49%).
（化合物（Ｇ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１０．８（１Ｈ，ｓ），８．５６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，２．３Ｈｚ），８．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），８．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．７２－７．６３（２Ｈ，ｍ），７．４３－７．３２（２Ｈ，ｍ），７．１８－７．１１（１Ｈ，ｍ），３．４８（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１６３．９，１５０．０，１４３．０，１３８．７，１３８．５，１３１．７，１２８．８，１２５．２，１２４．３，１２３．７，１２０．１，４４．８
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１４Ｈ１２Ｎ２Ｏ４ＳＮａ［Ｍ＋Ｎａ］＋：３２７．０４１５，ｆｏｕｎｄ：３２７．０４２３（＋０．８ｍｍｕ）。(Equipment data of compound (G))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 10.8 (1H, s), 8.56 (1H, dd, J = 8.2, 2.3 Hz), 8.53 (1H, d, J = 1.8 Hz), 8.29 (1H, d, J = 8.2 Hz), 7.72-7.63 (2H, m), 7.43-7.32 (2H, m), 7. 18-7.11 (1H, m), 3.48 (3H, s)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 163.9, 150.0, 143.0, 138.7, 138.5, 131.7, 128.8, 125.2, 124.3, 123.7, 120.1, 44.8
HRMS (ESI - TOF) m/z calcd for C14H12N2O4SNa [M + Na] + : 327.0415 , found: 327.0423 (+0.8 mmu).
［反応スキーム３］ [Reaction scheme 3]
（化合物（ｆ）の合成；３－ブロモ－４－ニトロ安息香酸アニリド）
３－ブロモ－４－ニトロ安息香酸（２．１８ｇ，８．９ｍｍｏｌ）と触媒量のＤＭＦを塩化チオニル（１５ｍＬ）に懸濁し、３時間加熱還流した。トルエンを加え、余剰の塩化チオニルを留去した。残渣のジクロロメタン懸濁液（１０ｍＬ）に対して、アニリン（１．２５ｇ，１４ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（２．８ｇ，２８ｍｍｏｌ）の溶解したジクロロメタン（５ｍＬ）を、氷上で滴下し、室温で１時間撹拌した。反応を１Ｎ ＨＣｌで止め、ジクロロメタンを加えた。有機層を１Ｎ ＨＣｌで３回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ジクロロメタンを留去した。ジクロロメタン－ヘキサンで再結晶させて、目的化合物を得た（１．４７ｇ，収率５１％）。(Synthesis of compound (f); 3-bromo-4-nitrobenzoic acid anilide)
3-bromo-4-nitrobenzoic acid (2.18 g, 8.9 mmol) and a catalytic amount of DMF were suspended in thionyl chloride (15 mL) and heated to reflux for 3 hours. Toluene was added and excess thionyl chloride was distilled off. To a dichloromethane suspension (10 mL) of the residue, aniline (1.25 g, 14 mmol) and triethylamine (2.8 g, 28 mmol) dissolved in dichloromethane (5 mL) was added dropwise on ice, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. . The reaction was quenched with 1N HCl and dichloromethane was added. The organic layer was washed with 1N HCl three times and saturated brine once. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate and dichloromethane was distilled off. Recrystallization from dichloromethane-hexane gave the target compound (1.47 g, yield 51%).
（化合物（ｆ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１０．５（１Ｈ，ｓ），８．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），８．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），８．１２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８Ｈｚ），７．７９－７．７２（２Ｈ，ｍ），７．４３－７．３３（２Ｈ，ｍ），７．１９－７．１０（１Ｈ，ｍ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１６２．５，１５１．１，１３９．３，１３８．５，１３３．６，１２８．７，１２８．６，１２５．５，１２４．３，１２０．５，１１３．０
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１３Ｈ１０ＢｒＮ２Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋：３２０．９８７５，ｆｏｕｎｄ：３２０．９８６５（－１．０ｍｍｕ）。(Instrument data of compound (f))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 10.5 (1H, s), 8.42 (1H, d, J=1.8 Hz), 8.17 (1H, d, J=8. 2 Hz), 8.12 (1H, dd, J=8.2, 1.8 Hz), 7.79-7.72 (2H, m), 7.43-7.33 (2H, m), 7. 19-7.10 (1H, m)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 162.5, 151.1, 139.3, 138.5, 133.6, 128.7, 128.6, 125.5, 124.3, 120.5, 113.0
HRMS (ESI-TOF) m/z calcd for C13H10BrN2O3 [M + H] + : 320.9875 , found: 320.9865 (-1.0 mmu).
（化合物（Ｄ）の合成；３ーシアノ－４－ニトロ安息香酸アニリド）
３－ブロモ－４－ニトロ安息香酸アニリド（８０５ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）とシアン化ナトリウム（２９１ｍｇ，２．９ｍｍｏｌ）をＮ－メチルピロリドンに溶解させて、１５０℃で３．５時間撹拌した。反応溶液を室温まで冷却し、水を加えて沈殿を濾取した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン）で精製し、目的化合物を得た（５１８ｍｇ，収率７７％）。(Synthesis of compound (D); 3-cyano-4-nitrobenzoic acid anilide)
3-Bromo-4-nitrobenzoic acid anilide (805 mg, 2.5 mmol) and sodium cyanide (291 mg, 2.9 mmol) were dissolved in N-methylpyrrolidone and stirred at 150° C. for 3.5 hours. The reaction solution was cooled to room temperature, water was added, and the precipitate was collected by filtration. The residue was purified by silica gel column chromatography (dichloromethane) to obtain the target compound (518 mg, yield 77%).
（化合物（Ｄ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１０．６６（１Ｈ，ｓ），８．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），８．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），８．４２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，１．８Ｈｚ），７．８０－７．７２，（２Ｈ，ｍ），７．４４－７．３５（２Ｈ，ｍ），７．２０－７．１０（１Ｈ，ｍ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）１６２．１，１４９．５，１４０．０，１３８．４，１３４．６，１３３．７，１２８．８，１２６．１，１２４．４，１２０．４，１１５．３，１０７．１
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１４Ｈ１０Ｎ３Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋：２６８．０７２２，ｆｏｕｎｄ：２６８．０７１４（－０．８ｍｍｕ）。(Equipment data of compound (D))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 10.66 (1H, s), 8.66 (1H, d, J=1.8 Hz), 8.52 (1H, d, J=8. 7Hz), 8.42 (1H, dd, J = 8.8, 1.8Hz), 7.80-7.72, (2H, m), 7.44-7.35 (2H, m), 7 .20-7.10 (1H, m)
13 C-NMR (100 MHz, Acetone-d 6 ) 162.1, 149.5, 140.0, 138.4, 134.6, 133.7, 128.8, 126.1, 124.4, 120. 4, 115.3, 107.1
HRMS (ESI - TOF) m/z calcd for C14H10N3O3 [M+H] + : 268.0722 , found: 268.0714 (-0.8 mmu).
（化合物（Ｂ）の合成；２，５－ジニトロ安息香酸アニリド）
２，５－ジニトロ安息香酸（４３ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ），ＷＳＣＤ・ＨＣｌ（８１ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ），アニリン（２２．４μＬ，０．２５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１ｍＬ）に懸濁し、室温で１時間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加え、１Ｎ ＨＣｌで３回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。酢酸エチル－ヘキサンで再沈殿させて、目的化合物を得た（２７ｍｇ，収率４５％）。(Synthesis of compound (B); 2,5-dinitrobenzoic acid anilide)
Suspend 2,5-dinitrobenzoic acid (43 mg, 0.20 mmol), WSCD.HCl (81 mg, 0.42 mmol), and aniline (22.4 μL, 0.25 mmol) in acetonitrile (1 mL) and stir at room temperature for 1 hour. did. Ethyl acetate was added to the reaction solution, and the mixture was washed with 1N HCl three times and saturated brine once. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. Reprecipitation was performed with ethyl acetate-hexane to obtain the target compound (27 mg, yield 45%).
（化合物（Ｂ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１０．８９（１Ｈ，ｓ），８．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），８．５５（１Ｈ，ｍ，Ｊ＝８．７，２．３Ｈｚ），８．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ），７．６６－７．６４（２Ｈ，ｍ），７．４０－７．３６（２Ｈ，ｍ），７．１７－７．１５（１Ｈ，ｍ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１６１．７，１５０．１，１４９．３，１３８．４，１３３．２，１２８．９，１２６．３，１２６．２，１２４．６，１２４．４，１１９．９。(Equipment data of compound (B))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 10.89 (1H, s), 8.62 (1H, d, J=2.3 Hz), 8.55 (1H, m, J=8. 7, 2.3 Hz), 8.36 (1H, d, J = 9.1 Hz), 7.66-7.64 (2H, m), 7.40-7.36 (2H, m), 7. 17-7.15 (1H, m)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 161.7, 150.1, 149.3, 138.4, 133.2, 128.9, 126.3, 126.2, 124.6, 124.4, 119.9.
（化合物（Ｃ）の合成；３－トリフルオロメチル－４-ニトロ安息香酸アニリド
３－トリフルオロメチル－４-ニトロ安息香酸（７８５ｍｇ，３．３ｍｍｏｌ）と触媒量のＤＭＦを塩化チオニル（３ｍＬ）に懸濁し、２時間加熱還流した。反応溶液を室温まで冷却し、トルエンを加えて余剰の塩化チオニルを共沸により留去した。残渣のジクロロメタン懸濁液（２ｍＬ）に対して、アニリン（３０５μＬ，３．３ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（９４０μＬ，６．６ｍｍｏｌ）の溶解したジクロロメタン（５ｍＬ）を、氷上で滴下し、室温で３０分間撹拌した。反応を１Ｎ ＨＣｌで止め、ジクロロメタンを加えた。有機層を１Ｎ ＨＣｌで３回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ジクロロメタンを留去した。ジクロロメタン－ヘキサンで再結晶させて、目的化合物を得た（６１３ｍｇ，収率５９％）。(Synthesis of compound (C); 3-trifluoromethyl-4-nitrobenzoic acid anilide 3-trifluoromethyl-4-nitrobenzoic acid (785 mg, 3.3 mmol) and a catalytic amount of DMF were dissolved in thionyl chloride (3 mL). The reaction solution was cooled to room temperature, and excess thionyl chloride was distilled off by azeotropic distillation after adding toluene.Aniline (305 μL, 3.3 mmol) and triethylamine (940 μL, 6.6 mmol) dissolved in dichloromethane (5 mL) were added dropwise on ice and stirred at room temperature for 30 min.The reaction was quenched with 1N HCl and dichloromethane was added.The organic layer was 1N. After washing with HCl three times and saturated brine once, the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, dichloromethane was distilled off, and the target compound was obtained by recrystallization with dichloromethane-hexane (613 mg, yield 59 %).
（化合物（Ｃ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１０．６７（１Ｈ，ｓ），８．５０（１Ｈ，ｍ，８．５０－８．４９），８．４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８Ｈｚ），８．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．７９－７．７１（２Ｈ，ｍ），７．４４－７．３４（２Ｈ，ｍ），７．２０－７．１１（１Ｈ，ｍ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１６３．０，１４９．２，１３９．５，１３９．０，１３４．４，１２９．３，１２７．９，１２６．３，１２４．９，１２３．８，１２２．０，１２１．７，１２１．１
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１４Ｈ１０Ｆ３Ｎ２Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋：３１１．０６４４，ｆｏｕｎｄ：３１１．０６３６（－０．８ｍｍｕ）。(Equipment data of compound (C))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 10.67 (1H, s), 8.50 (1H, m, 8.50-8.49), 8.46 (1H, dd, J = 8.2, 1.8Hz), 8.33 (1H, d, J = 8.2Hz), 7.79-7.71 (2H, m), 7.44-7.34 (2H, m), 7.20-7.11 (1H, m)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 163.0, 149.2, 139.5, 139.0, 134.4, 129.3, 127.9, 126.3, 124.9, 123.8, 122.0, 121.7, 121.1
HRMS (ESI - TOF) m/z calcd for C14H10F3N2O3 [M + H] + : 311.0644 , found: 311.0636 (-0.8 mmu).
（ＧＳＴ存在下における吸収スペクトルの変化の測定）
次いで、上記で合成した７種類のニトロベンゼン誘導体（化合物（Ａ）～（Ｇ））をそれぞれ、５．０μｇ／ｍＬの各ＧＳＴ分子種および１ｍＭ ＧＳＨの存在下、２５℃にて３０分間インキュベーションし、吸収スペクトルの変化を指標としたアッセイを行った。なお、本アッセイにおける各化合物の添加濃度は５０μＭとし、アッセイの溶媒としては１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ０．１％を共溶媒として含む）を用いた。また、吸収スペクトルの測定には、紫外・可視分光光度計（Ｖ－５５０、日本分光株式会社製）を用いた。(Measurement of change in absorption spectrum in the presence of GST)
Then, each of the seven nitrobenzene derivatives synthesized above (compounds (A) to (G)) was incubated at 25° C. for 30 minutes in the presence of 5.0 μg/mL of each GST molecular species and 1 mM GSH, An assay was performed using the change in absorption spectrum as an indicator. The concentration of each compound added in this assay was 50 μM, and 100 mM phosphate buffer (pH 7.4; containing 0.1% DMSO as a co-solvent) was used as the assay solvent. An ultraviolet/visible spectrophotometer (V-550, manufactured by JASCO Corporation) was used to measure the absorption spectrum.
結果を図１Ａ～図１Ｇに示す。なお、これらの図において、（Ａ）は各化合物の構造を示し、（Ｂ）は３０分間のインキュベーション終了時点における吸収スペクトルを示し、（Ｃ）は各化合物の吸収波長（各図に記載）における吸光度の時間変化を示すグラフである。また、各図の（Ｂ）において、「Ｂｅｆｏｒｅ」はＧＳＨおよびＧＳＴ添加前の吸収スペクトルであり、各図の（Ｂ）および（Ｃ）における「ＧＳＨ」並びに「ＧＳＴＡ１」「ＧＳＴＭ１」および「ＧＳＴＰ１」は、ＧＳＨのみを添加した系並びにＧＳＴＡ１、ＧＳＴＭ１およびＧＳＴＰ１のいずれかを添加した系の結果をそれぞれ示す。 The results are shown in FIGS. 1A-1G. In these figures, (A) shows the structure of each compound, (B) shows the absorption spectrum at the end of the 30-minute incubation, and (C) shows the absorption wavelength of each compound (described in each figure). It is a graph which shows the time change of an absorbance. In addition, in (B) of each figure, "Before" is the absorption spectrum before addition of GSH and GST, and "GSH" and "GSTA1", "GSTM1" and "GSTP1" in (B) and (C) of each figure. shows the results of the system to which only GSH was added and the system to which any of GSTA1, GSTM1 and GSTP1 was added.
図１Ａに示すように、化合物（Ａ）はＧＳＴの存在下において速やかに吸収スペクトルが変化したが、ＧＳＨのみが存在している酵素非存在下においても吸収スペクトルが変化した。また、ＧＳＴＰ１に対する選択性は示さなかった。 As shown in FIG. 1A, the absorption spectrum of compound (A) rapidly changed in the presence of GST, but the absorption spectrum also changed in the absence of the enzyme in the presence of only GSH. Also, it did not show selectivity for GSTP1.
図１Ｂに示すように、化合物（Ａ）の位置異性体である化合物（Ｂ）は、ＧＳＨのみが存在している酵素非存在下における吸収スペクトル変化が遅いなど、化合物（Ａ）に比べて反応性の低下が見られたが、ＧＳＴ分子種の選択性の傾向に変化は見られなかった。 As shown in FIG. 1B, compound (B), which is a positional isomer of compound (A), reacts more slowly than compound (A), such as slow absorption spectrum change in the absence of enzyme in the presence of only GSH. However, no change was observed in the selectivity trend of the GST molecular species.
図１Ｃに示すように、化合物（Ｃ）はＧＳＴの有無により吸収スペクトルの変化を示さなかった（図１Ｃの（Ｂ））。ここで、ＧＳＴが触媒する芳香族求核置換反応では反応中間体であるマイゼンハイマー錯体の形成が律速段階であると考えられている。また、トリフルオロメチル（ＣＦ３）基のハメット定数は０．５４であり、化合物（Ｄ）で用いられるシアノ基（０．６６）や化合物（Ｆ）で用いられるメシル基（０．７２）よりも小さい。このため、トリフルオロメチル基による反応中間体（マイゼンハイマー錯体）の安定化への寄与はシアノ基やメシル基よりも小さいため、グルタチオン化反応が進行しなかったものと考えられる。As shown in FIG. 1C, compound (C) showed no change in absorption spectrum depending on the presence or absence of GST ((B) in FIG. 1C). Here, in the aromatic nucleophilic substitution reaction catalyzed by GST, the formation of the Meisenheimer complex, which is a reaction intermediate, is considered to be the rate-determining step. Further, the Hammett constant of the trifluoromethyl (CF 3 ) group is 0.54, which is lower than the cyano group (0.66) used in compound (D) and the mesyl group (0.72) used in compound (F). is also small. Therefore, it is considered that the trifluoromethyl group contributed less to the stabilization of the reaction intermediate (Meisenheimer complex) than the cyano group or the mesyl group, and therefore the glutathionylation reaction did not proceed.
図１Ｄに示すように、化合物（Ｄ）はＧＳＴＰ１存在下で２９０ｎｍの吸光度の急速な上昇を示した。これに対し、ＧＳＴＰ１存在下以外の条件では、吸光度は時間とともに低下した。この違いはそれぞれの条件において異なる生成物が生成していることを示唆している。 As shown in FIG. 1D, compound (D) exhibited a rapid increase in absorbance at 290 nm in the presence of GSTP1. In contrast, the absorbance decreased with time under conditions other than the presence of GSTP1. This difference suggests that different products are produced under each condition.
図１Ｅに示すように、化合物（Ｅ）はＧＳＴＰ１存在下で速やかに吸収スペクトルが変化した。一方、ＧＳＨとの反応による吸収の変化はほとんど見られなかった。 As shown in FIG. 1E, compound (E) rapidly changed its absorption spectrum in the presence of GSTP1. On the other hand, almost no change in absorption due to reaction with GSH was observed.
図１Ｆに示すように、化合物（Ｅ）の位置異性体である化合物（Ｆ）は、ＧＳＴＰ１存在下で速やかに吸収スペクトルが変化し、かつ、ＧＳＴＡ１またはＧＳＴＭ１の存在下では吸収スペクトルの変化を示さなかった。また、酵素非依存的なＧＳＨとの反応もまったく見られなかった。このように、化合物（Ｆ）はＧＳＴＰ１選択的な基質としてきわめて有望である。 As shown in FIG. 1F, compound (F), which is a positional isomer of compound (E), rapidly changes its absorption spectrum in the presence of GSTP1, and shows a change in absorption spectrum in the presence of GSTA1 or GSTM1. I didn't. Moreover, no enzyme-independent reaction with GSH was observed at all. Thus, compound (F) is extremely promising as a GSTP1-selective substrate.
図１Ｇに示すように、ベンゼン環の２位にメチルスルフィニル基（－ＳＯＣＨ３基）を有する化合物（Ｇ）は、いずれの条件においても吸収スペクトルの変化を示さなかった。ここで、メチルスルフィニル基のハメット定数は０．４９であり、化合物（Ｄ）で用いられたシアノ基（０．６６）や化合物（Ｆ）で用いられたメシル基（０．７２）よりも小さい。このため、スルフィニル基による反応中間体（マイゼンハイマー錯体）の安定化への寄与はシアノ基やメシル基よりも小さいため、グルタチオン化反応が進行しなかったものと考えられる。なお、化合物（Ａ）～（Ｇ）のそれぞれについて、各ＧＳＴ分子種の存在下での３０分間のインキュベーション終了時点の極大吸収波長における吸光度（Ａｂｓ）の値を、インキュベーション前の同じ波長における吸光度（Ａｂｓ０）の値で除して得られた値（Ａｂｓ／Ａｂｓ０）を比較した結果を図１Ｈのグラフに示す。図１Ｈに示すように、化合物（Ｄ）～（Ｆ）ではＧＳＴＰ１存在下におけるＡｂｓ／Ａｂｓ０の値だけが大きい値を示した。As shown in FIG. 1G, the compound (G) having a methylsulfinyl group (--SOCH 3 group) at the 2-position of the benzene ring showed no change in absorption spectrum under any condition. Here, the Hammett constant of the methylsulfinyl group is 0.49, which is smaller than the cyano group (0.66) used in compound (D) and the mesyl group (0.72) used in compound (F). . Therefore, it is considered that the sulfinyl group contributed less to the stabilization of the reaction intermediate (Meisenheimer complex) than the cyano group or mesyl group, and therefore the glutathionylation reaction did not proceed. For each of compounds (A) to (G), the absorbance (Abs) at the maximum absorption wavelength at the end of incubation for 30 minutes in the presence of each GST molecular species was compared to the absorbance at the same wavelength before incubation ( Abs 0 ) and the resulting values (Abs/Abs 0 ) are compared in the graph of FIG. 1H. As shown in FIG. 1H, compounds (D) to (F) showed large values of Abs/Abs 0 only in the presence of GSTP1.
以上のことから、本実験において評価した化合物（Ａ）～（Ｇ）のなかでは化合物（Ｄ）～（Ｆ）がＧＳＴＰ１選択的な基質の候補となりうるものと結論付けた。これを一般化すれば、上記一般式（４）に示す構造において、以下の条件を満たすものであればＧＳＴＰ１選択的な基質となりうるものと考えられる。
・ＥＷＧ基が０．６６以上０．７８未満のハメット定数を有し、かつ共鳴効果を示す電子求引性基である；
・ベンゼン環に結合したニトロ（ＮＯ２）基はベンゼン環に結合したアミド結合に対してオルト位またはパラ位に位置する；および
・ＥＷＧ基は、ニトロ（ＮＯ２）基に対してオルト位またはパラ位に位置する。Based on the above, it was concluded that among compounds (A) to (G) evaluated in this experiment, compounds (D) to (F) could be candidates for GSTP1-selective substrates. Generalizing this, it can be considered that the structure represented by the above general formula (4) can serve as a GSTP1-selective substrate if it satisfies the following conditions.
- The EWG group is an electron-withdrawing group that has a Hammett constant of 0.66 or more and less than 0.78 and exhibits a resonance effect;
- the nitro ( NO2) group attached to the benzene ring is positioned ortho or para to the amide bond attached to the benzene ring; and - the EWG group is positioned ortho or para to the nitro ( NO2) group. It is located in Para position.
以下では、最も理想に近いＧＳＴＰ１選択性の可能性を示した化合物（Ｆ）（２－ニトロ－５－メシル安息香酸アニリド）を用いて、さらなる実験を行った。 In the following, further experiments were performed with compound (F) (2-nitro-5-mesylbenzoic acid anilide), which showed the possibility of the most ideal GSTP1 selectivity.
まず、化合物（Ｆ）がＧＳＴＰ１存在下において実際にグルタチオン化されることを、ＨＰＬＣおよびＬＣ－ＭＳによって解析した。具体的に、ＨＰＬＣによる検討では、化合物（Ｆ）を１００ｍＭリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．４）中、５．０μｇ／ｍＬ ＧＳＴＰ１および１ｍＭ ＧＳＨの存在下、２５℃にて３０分間インキュベーションした反応液を、反応前のものと比較した。また、ＬＣ－ＭＳによる検討では、反応後の反応液を解析した。ここで、ＨＰＬＣ解析の結果を図２（Ａ）に示し、ＬＣ－ＭＳ解析の結果を図２（Ｂ）に示す。図２（Ａ）に示すように、反応前（上段）には見られた化合物（Ｆ）のピークが反応後（下段）には消失し、保持時間がより短い新たな化合物が生成することが確認された。また、新たに生成した化合物の吸収スペクトルは図１Ｆに示したものと同じであったことから、本ピークが反応生成物であると考えられる。さらに、図２（Ｂ）に示すように、ＬＣ－ＭＳ解析によれば、反応生成物のピークはニトロ基がグルタチオン（ＧＳＨ）に置換している化合物の分子量に相当することが確認された。 First, it was analyzed by HPLC and LC-MS that compound (F) was actually glutathionylated in the presence of GSTP1. Specifically, in the HPLC study, compound (F) was incubated in a 100 mM sodium phosphate aqueous solution (pH 7.4) in the presence of 5.0 μg/mL GSTP1 and 1 mM GSH at 25° C. for 30 minutes. , compared with those before the reaction. Further, in the investigation by LC-MS, the reaction solution after the reaction was analyzed. Here, the results of HPLC analysis are shown in FIG. 2(A), and the results of LC-MS analysis are shown in FIG. 2(B). As shown in FIG. 2(A), the compound (F) peak seen before the reaction (upper) disappeared after the reaction (lower), and a new compound with a shorter retention time was generated. confirmed. Moreover, since the absorption spectrum of the newly produced compound was the same as that shown in FIG. 1F, this peak is considered to be a reaction product. Furthermore, as shown in FIG. 2(B), LC-MS analysis confirmed that the peak of the reaction product corresponds to the molecular weight of the compound in which the nitro group is substituted with glutathione (GSH).
続いて、ＧＳＨとの反応に伴って化合物（Ｆ）からニトロ（ＮＯ２）基が脱離していることを、Ｇｒｉｅｓｓ法を用いて確認した。ここで、Ｇｒｉｅｓｓ法とは、亜硝酸イオンの検出・定量方法として知られており、酸性条件下でＮＯ２ －、スルファニルアミド、１－ナフチルエチレンジアミンのジアゾカップリングを利用し、生成したアゾ化合物の吸光度を測定することで間接的にＮＯ２ －を検出・定量する方法である。本実験では、化合物（Ｆ）を１００ｍＭリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．４）中、５．０μｇ／ｍＬ ＧＳＴＰ１および１ｍＭ ＧＳＨの存在下、２５℃にて３０分間インキュベーションした反応液に対して、亜硝酸イオンの定量を行った（反応機構を図３（Ａ）に示す）。この際、絶対濃度については、別途調製した濃度既知のＮＯ２ －を定量することで絶対濃度による検量線を作成し、反応によって生成した亜硝酸イオンを検量線法により定量した。その結果、図３（Ｂ）に示すように、用いた基質濃度とほぼ等濃度の亜硝酸イオンが反応液中に存在することが確認された。Subsequently, it was confirmed using the Griess method that the nitro (NO 2 ) group had been eliminated from compound (F) accompanying the reaction with GSH. Here, the Griess method is known as a method for detecting and quantifying nitrite ions, and utilizes diazo coupling of NO 2 − , sulfanilamide, and 1-naphthylethylenediamine under acidic conditions, and This is a method for indirectly detecting and quantifying NO 2 − by measuring absorbance. In this experiment, compound (F) was incubated in a 100 mM sodium phosphate aqueous solution (pH 7.4) in the presence of 5.0 μg/mL GSTP1 and 1 mM GSH at 25° C. for 30 minutes. Ions were quantified (the reaction mechanism is shown in FIG. 3(A)). At this time, as for the absolute concentration, NO 2 − prepared separately and having a known concentration was quantified to prepare a calibration curve based on the absolute concentration, and the nitrite ions generated by the reaction were quantified by the calibration curve method. As a result, as shown in FIG. 3(B), it was confirmed that nitrite ions were present in the reaction solution at a concentration substantially equal to that of the substrate used.
以上の結果から、ニトロベンゼン誘導体である化合物（Ｆ）はＧＳＴＰ１選択的な基質であることが示された。また、このことから、一般式（４）で表される化合物もまた、ＧＳＴＰ１選択的な基質として用いられうることが推認される。 These results indicated that compound (F), a nitrobenzene derivative, is a selective substrate for GSTP1. In addition, it is presumed from this that the compound represented by the general formula (4) can also be used as a GSTP1-selective substrate.
［蛍光プローブの合成（１）］
ここでは、上述したスクリーニングによって得られたＧＳＴＰ１選択的な基質である５－メシル－２－ニトロ安息香酸アニリドを反応部位として有する蛍光プローブを合成した。なお、本実験では、キサンテン環を蛍光団として有するＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ（ＴＧ；Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ２００５， １２７， ４８８８－４８９４．）を母核として有する蛍光プローブを合成した（下記の反応スキーム４）。[Synthesis of fluorescent probe (1)]
Here, a fluorescent probe was synthesized having, as a reactive site, 5-mesyl-2-nitrobenzoic acid anilide, which is a GSTP1-selective substrate obtained by the screening described above. In this experiment, a fluorescent probe was synthesized having TokyoGreen (TG; J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 4888-4894.), which has a xanthene ring as a fluorophore, as a mother nucleus (the following reaction scheme 4).
具体的には、まず出発原料である２－メチル－４－ニトロ安息香酸（１）をボラン錯体によりアルコールに還元し、生成物をヘキサン／酢酸エチル（１０：１）混合溶媒より再結晶を行うことで２－メチル－４－ニトロベンジルアルコール（２）を収率８１％で得た。次に、２－メチル－４－ニトロベンジルアルコールをシリカゲルと混合し、クロロクロム酸ピリジニウム（ＰＣＣ）でアルデヒドに酸化した。不純物を取り除くために減圧下、シリカゲルにてろ過することにより、２－メチル－４－ニトロベンズアルデヒド（３）を単離した（収率９１％）。３ステップ目として、２－メチル－４－ニトロベンズアルデヒド（３）とレゾルシノールをメタンスルホン酸中で加熱し、Ｆｒｉｅｄｅｌ－Ｃｒａｆｔｓ型の縮合反応、脱水縮合および酸化反応を経て、２－メチル－４－ニトロＴＧ（４）を合成した。硫化ナトリウムおよび硫化水素ナトリウムの水和物で２－メチル－４－ニトロＴＧ（４）のニトロ基をアミノ基に還元し、４－アミノ－２－メチルＴＧ（６）を得た（２工程で収率４％）。最後に、得られた４－アミノ－２－メチルＴＧのアミノ基に５－メシル－２－ニトロ安息香酸を導入すべく、縮合剤（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ））とともにアセトニトリル中で反応させ、ヒドロキシ基にも導入された５－メシル－２－ニトロ安息香酸を水酸化ナトリウムで加水分解することにより最終生成物（８）（Ｐｓ－ＴＧ）を得た（収率５０％）。
Specifically, the starting material, 2-methyl-4-nitrobenzoic acid (1), is first reduced to an alcohol with a borane complex, and the product is recrystallized from a mixed solvent of hexane/ethyl acetate (10:1). Thus, 2-methyl-4-nitrobenzyl alcohol (2) was obtained with a yield of 81%. 2-Methyl-4-nitrobenzyl alcohol was then mixed with silica gel and oxidized to the aldehyde with pyridinium chlorochromate (PCC). 2-Methyl-4-nitrobenzaldehyde (3) was isolated by filtering through silica gel under reduced pressure to remove impurities (yield 91%). As a third step, 2-methyl-4-nitrobenzaldehyde (3) and resorcinol are heated in methanesulfonic acid, and subjected to Friedel-Crafts-type condensation, dehydration condensation, and oxidation to form 2-methyl-4-nitro TG(4) was synthesized. Reduction of the nitro group of 2-methyl-4-nitro TG (4) to an amino group with sodium sulfide and sodium hydrogen sulfide hydrate gave 4-amino-2-methyl TG (6) (in two steps).
なお、反応スキーム４に記載の化合物（１）～（４）および（６）は、非特許文献１において既知の化合物であることから、非特許文献１において報告された合成法に従って合成した。また、その他の化合物（７）～（９）および化合物（７）の合成中間体としての化合物（５）は、以下の手法により合成した。
The compounds (1) to (4) and (6) described in
（化合物（８）の合成；Ｎ－（４－（６－ヒドロキシ－３－オキソ－３Ｈ－キサンテン－９－イル）－３－メチルフェニル）－５－（メチルスルホニル）－２－ニトロベンズアミド（Ｐｓ－ＴＧ）） (Synthesis of compound (8); N-(4-(6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)-3-methylphenyl)-5-(methylsulfonyl)-2-nitrobenzamide (Ps -TG))
２－メチル－４－アミノＴＧ（６）（１０．２ｍｇ，０．０３２ｍｍｏｌ）、５－メシル－２－ニトロ安息香酸（１５．６ｍｇ，０．０６４ｍｍｏｌ）および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ；１２．５ｍｇ，０．０６５ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミドに懸濁し、室温にて１時間撹拌した。反応液に対して酢酸エチルを加え、１Ｎ塩酸で３回、飽和食塩水で１回洗浄した。これを無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、ろ液を留去した。混合物をアセトニトリルに懸濁し、４℃において撹拌しながら室温で１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加え、１０分間反応させた。反応液をｐＨ７．４、２００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液によって中和し、ＨＰＬＣの初期溶媒（下記）によって希釈し、分取ＨＰＬＣによって精製した。分取ＨＰＬＣでは移動相Ａとして１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）、移動相Ｂとしてアセトニトリルを用い、２０分間で組成比がＡ：Ｂ＝９０：１０から１０：９０となるように組成比の勾配をかけ、流速９ｍＬ／ｍｉｎで溶出させた。溶出液中に含まれるアセトニトリルを減圧下で留去した後、残渣を酢酸エチルに懸濁し、０．１Ｎ塩酸で３回洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。酢酸エチルを留去して、目的化合物８．５ｍｇを得た（収率５０％）
（化合物（８）の機器データ）
１Ｈ-ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ７．５６（２Ｈ，ｍ），７．４８（１Ｈ， ｄｄ，Ｊ＝１．６，８．８），６．９５（１Ｈ，ｓ），６．８６（１Ｈ，ｍ），６．４７ （１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４），６．０８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２），５．７７（４Ｈ，ｂｒ），２．５９（３Ｈ，ｓ），１．２０（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ-ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１６３．３，１５９．１，１５０．１， １４５．２，１４０．８，１３７．２，１３３．２，１３０．６，１２８．８，１２７．６，１２６．３，１２１．８，１２１．３，１１７．８，１１６．８，１０３．１，６０．３，２１．６，２１．３，１４．６
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ Ｆｏｕｎｄ ５４５．１０１９ ［Ｍ＋Ｈ］＋，ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ５４５．１０１９ ｆｏｒ Ｃ２８Ｈ２１Ｎ２Ｏ８Ｓ （＋ ０．０ ｍｍｕ）。2-methyl-4-amino TG (6) (10.2 mg, 0.032 mmol), 5-mesyl-2-nitrobenzoic acid (15.6 mg, 0.064 mmol) and 1-ethyl-3-(3-dimethyl Aminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC.HCl; 12.5 mg, 0.065 mmol) was suspended in dimethylformamide and stirred at room temperature for 1 hour. Ethyl acetate was added to the reaction mixture, and the mixture was washed with 1N hydrochloric acid three times and saturated brine once. After drying this with anhydrous magnesium sulfate, the filtrate was evaporated. The mixture was suspended in acetonitrile, and 1N sodium hydroxide aqueous solution was added at room temperature with stirring at 4° C. and allowed to react for 10 minutes. Reactions were neutralized with 200 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4, diluted with HPLC initial solvent (below), and purified by preparative HPLC. In preparative HPLC, 10 mM ammonium acetate buffer (pH 7.0) was used as mobile phase A, and acetonitrile was used as mobile phase B. was applied and eluted at a flow rate of 9 mL/min. After acetonitrile contained in the eluate was distilled off under reduced pressure, the residue was suspended in ethyl acetate, washed with 0.1N hydrochloric acid three times, and dried over anhydrous magnesium sulfate. Ethyl acetate was distilled off to obtain 8.5 mg of the desired compound (yield 50%).
(Instrumental data of compound (8))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.56 (2H, m), 7.48 (1H, dd, J = 1.6, 8.8), 6.95 (1H, s), 6 .86 (1H, m), 6.47 (1H, d, J = 8.4), 6.08 (2H, d, J = 9.2), 5.77 (4H, br), 2.59 (3H, s), 1.20 (3H, s)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ 163.3, 159.1, 150.1, 145.2, 140.8, 137.2, 133.2, 130.6, 128.8, 127. 6, 126.3, 121.8, 121.3, 117.8, 116.8, 103.1, 60.3, 21.6, 21.3, 14.6
HRMS (ESI-TOF) m/z Found 545.1019 [M+H] + , calculated 545.1019 for C 28 H 21 N 2 O 8 S (+0.0 mmu).
（化合物（７）の合成；９－（４－アミノ－２－メチルフェニル）－２，７－ジクロロ－６－ヒドロキシ－３Ｈ－キサンテン－３－オン（２－メチル－４－アミノ－２’，７’－ジクロロ－ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ） (Synthesis of compound (7); 9-(4-amino-2-methylphenyl)-2,7-dichloro-6-hydroxy-3H-xanthen-3-one (2-methyl-4-amino-2′, 7′-dichloro-Tokyo Green)
２－メチル－４－ニトロベンズアルデヒド（５５９ｍｇ，３．４ｍｍｏｌ）およびクロロレゾルシノール（９８３ｍｇ，６．８ｍｍｏｌ）をメタンスルホン酸３ｍＬに懸濁し、１時間加熱還流した。室温に戻した後、水３０ｍＬを加えて生じた沈殿を濾取した後、水、酢酸エチルで洗浄した。固体を酢酸エチルに懸濁し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル６０Ｎ、酢酸エチル／２０％エタノール）にて精製して、化合物（５）（２－メチル－４－ニトロジクロロＴＧ）の赤褐色の粗生成物を得た。これを水１５ｍＬに懸濁し、硫化ナトリウム九水和物（２１６ｍｇ，０．８６ｍｍｏｌ）および硫化ナトリウムｎ水和物（３４７ｍｇ）を加えて２時間加熱還流した。反応液を４℃に冷却し、濃塩酸を滴下し反応液を酸性にすることで生じた暗赤色の沈殿を濾取し、水で洗浄した。これを酢酸エチルに懸濁し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製（移動相：酢酸エチル）して、目的化合物（４－アミノ－２－メチルジクロロＴＧ）１０４ｍｇを得た（収率８％）。 2-Methyl-4-nitrobenzaldehyde (559 mg, 3.4 mmol) and chlororesorcinol (983 mg, 6.8 mmol) were suspended in 3 mL of methanesulfonic acid and heated to reflux for 1 hour. After returning to room temperature, 30 mL of water was added, and the resulting precipitate was collected by filtration and washed with water and ethyl acetate. The solid was suspended in ethyl acetate and purified by silica gel column chromatography (silica gel 60N, ethyl acetate/20% ethanol) to give a reddish brown crude product of compound (5) (2-methyl-4-nitrodichloro TG). got This was suspended in 15 mL of water, sodium sulfide nonahydrate (216 mg, 0.86 mmol) and sodium sulfide n-hydrate (347 mg) were added, and the mixture was heated under reflux for 2 hours. The reaction solution was cooled to 4° C., concentrated hydrochloric acid was added dropwise to acidify the reaction solution, and a dark red precipitate was collected by filtration and washed with water. This was suspended in ethyl acetate and purified by silica gel column chromatography (mobile phase: ethyl acetate) to obtain 104 mg of the target compound (4-amino-2-methyldichloro TG) (yield 8%).
（化合物（７）の機器データ）
１Ｈ-ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ７．１０（２Ｈ，ｓ），６．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），６．７５（２Ｈ，ｓ），６．６１（２Ｈ，ｍ），１．８７（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ-ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１５１．４，１５０．２，１３６．４，１３０．２，１２８．４，１１７．７，１１５．５，１１５．３，１１１．５，１０３．９，７９．２，１９．５
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ Ｆｏｕｎｄ ３８６．０３５１ ［Ｍ＋Ｈ］＋， ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ３８６．０３５１ ｆｏｒ Ｃ２０Ｈ１４ＮＯ３Ｃｌ２ （－０．１ ｍｍｕ）。(Instrumental data of compound (7))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.10 (2H, s), 6.91 (1H, d, J = 8.2), 6.75 (2H, s), 6.61 (2H , m), 1.87 (3H, s)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ 151.4, 150.2, 136.4, 130.2, 128.4, 117.7, 115.5, 115.3, 111.5, 103. 9, 79.2, 19.5
HRMS (ESI-TOF) m/z Found 386.0351 [M+H] + , calculated 386.0351 for C20H14NO3Cl2 ( -0.1 mmu).
（化合物（９）の合成；Ｎ－（４－（２，７－ジクロロ－６－ヒドロキシ－３－オキソ－３Ｈ－キサンテン－９－イル）－３－メチルフェニル）－５－（メチルスルホニル）－２－ニトロベンズアミド（Ｐｓ－ＤＣＴＧ）） (Synthesis of compound (9); N-(4-(2,7-dichloro-6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)-3-methylphenyl)-5-(methylsulfonyl)- 2-nitrobenzamide (Ps-DCTG))
２－メチル－４－ニトロ－ジクロロＴＧ（５）（８．７ｍｇ，０．０２３ｍｍｏｌ）、５－メシル－２－ニトロ安息香酸（１２．２ｍｇ，０．０５０ｍｍｏｌ）、および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ；１４．６ｍｇ，０．０７６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル１ｍＬ中にて２０分間、室温にて撹拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈した後、有機層を０．１Ｎ塩酸で３回、飽和食塩水で１回洗浄し、無水硫酸マグネシウムによって乾燥させ、減圧下で留去した。これをアセトニトリル２ｍＬに懸濁し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を氷上で加え、室温にて１０分間反応させた。反応液を中和し、セミ分取ＨＰＬＣによって精製した。分取ＨＰＬＣでは移動相ＡおよびＢとしてそれぞれ１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）、アセトニトリルを用い、２０分間で組成比がＡ：Ｂ＝９０：１０から１０：９０となるように組成比の勾配をかけ、流速９ｍＬ／ｍｉｎで溶出させた。溶出液中に含まれるアセトニトリルを減圧下で留去した後、残渣を酢酸エチルに懸濁し、０．１Ｎ塩酸で３回洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させて、目的化合物（Ｐｓ－ＤＣＴＧ）１１．１ｍｇを得た（収率７９％）。 2-methyl-4-nitro-dichloro TG (5) (8.7 mg, 0.023 mmol), 5-mesyl-2-nitrobenzoic acid (12.2 mg, 0.050 mmol), and 1-ethyl-3-( 3-Dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC.HCl; 14.6 mg, 0.076 mmol) was stirred in 1 mL of acetonitrile for 20 minutes at room temperature. After diluting the reaction solution with ethyl acetate, the organic layer was washed with 0.1N hydrochloric acid three times and saturated brine once, dried over anhydrous magnesium sulfate, and evaporated under reduced pressure. This was suspended in 2 mL of acetonitrile, 1N aqueous sodium hydroxide solution was added on ice, and the mixture was allowed to react at room temperature for 10 minutes. The reaction was neutralized and purified by semi-preparative HPLC. In preparative HPLC, 10 mM ammonium acetate buffer (pH 7.0) and acetonitrile were used as mobile phases A and B, respectively, and the composition ratio was adjusted so that the composition ratio was A:B = 90:10 to 10:90 in 20 minutes. A gradient was applied and eluted at a flow rate of 9 mL/min. After acetonitrile contained in the eluate was distilled off under reduced pressure, the residue was suspended in ethyl acetate, washed with 0.1N hydrochloric acid three times, dried over anhydrous magnesium sulfate, and the target compound (Ps-DCTG) was obtained. 11.1 mg was obtained (yield 79%).
（化合物（９）の機器データ）
１Ｈ-ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ８．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８），８．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），８．３１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８），７．８２（１Ｈ，ｓ），７．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７），７．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），７．０１（２Ｈ，ｓ），６．７７（２Ｈ，ｓ），３．４２（３Ｈ，ｓ），２．０５（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ-ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１６２．７，１４９．５，１４９．３，１４４．８，１３９．９，１３６．８，１３２．８，１３１．７，１３０．０，１２９．１，１２８．３，１２７．９，１２６．９，１２５．７，１２５．１，１２１．３，１１７．４，１０４．１，５９．７，４２．９，２０．８，１９．８，１４．１
ＨＲＭＳ （ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ Ｆｏｕｎｄ ６１３．０２４５ ［Ｍ＋Ｈ］＋，ｃａｌｕｃｕｌａｔｅｄ ６１３．０２３９ ｆｏｒ Ｃ２８Ｈ１９Ｎ２Ｏ８ＳＣｌ２ （＋０．６ ｍｍｕ）。(Instrumental data of compound (9))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.43 (1H, d, J = 1.8), 8.40 (1H, d, J = 8.2), 8.31 (1H, dd, J = 8.2, 1.8), 7.82 (1H, s), 7.75 (1H, d, J = 8.7), 7.33 (1H, d, J = 8.2), 7.01 (2H, s), 6.77 (2H, s), 3.42 (3H, s), 2.05 (3H, s)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ 162.7, 149.5, 149.3, 144.8, 139.9, 136.8, 132.8, 131.7, 130.0, 129. 1, 128.3, 127.9, 126.9, 125.7, 125.1, 121.3, 117.4, 104.1, 59.7, 42.9, 20.8, 19.8, 14.1
HRMS (ESI-TOF) m/z Found 613.0245 [M + H] <+ >, calculated 613.0239 for C28H19N2O8SCl2 ( +0.6 mmu).
［蛍光プローブの分光学的特性およびクラス選択性の評価（１）］
上記で合成した蛍光プローブＰｓ－ＴＧ（化合物（８））およびＰｓ－ＤＣＴＧ（化合物（９））の分光学的特性を評価した。また、これらの蛍光プローブについて、反応前後でのＨＰＬＣ解析およびＬＣ－ＭＳ解析により、ＧＳＴ存在下におけるＧＳＨとの反応生成物の同定を行った。そして、ＧＳＨおよび各種ＧＳＴ存在下での蛍光強度上昇を指標として、ＧＳＴクラス選択的な反応性を評価した。[Evaluation of Spectroscopic Properties and Class Selectivity of Fluorescent Probes (1)]
The spectroscopic properties of the fluorescent probes Ps-TG (compound (8)) and Ps-DCTG (compound (9)) synthesized above were evaluated. In addition, for these fluorescent probes, reaction products with GSH in the presence of GST were identified by HPLC analysis and LC-MS analysis before and after the reaction. Then, GST class-selective reactivity was evaluated using the increase in fluorescence intensity in the presence of GSH and various GSTs as an index.
（Ｐｓ－ＴＧの評価）
まず、２．５μＭのＰｓ－ＴＧ（化合物（８））を１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ０．１％を共溶媒として含む）に溶解し、反応前の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定した。なお、吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルの測定には、それぞれ紫外・可視分光光度計（Ｖ－５５０、日本分光株式会社製）および蛍光分光光度計（ＲＦ－５３００ＰＣ；株式会社島津製作所製）を用いた。また、２．５μＭのＰｓ－ＴＧを１ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）および５μｇ／ｍＬのグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴＰ１－１）を含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ１％を共溶媒として含む）中、室温（２５℃）にて撹拌しながら１日間反応させた。その後、上記と同様にして反応後の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定した。(Evaluation of Ps-TG)
First, 2.5 μM Ps-TG (compound (8)) was dissolved in 100 mM phosphate buffer (pH 7.4; containing 0.1% DMSO as a co-solvent), and the absorption spectrum and fluorescence spectrum before the reaction were measured. . An ultraviolet/visible spectrophotometer (V-550, manufactured by JASCO Corporation) and a fluorescence spectrophotometer (RF-5300PC; manufactured by Shimadzu Corporation) were used to measure the absorption spectrum and the fluorescence spectrum, respectively. In addition, 100 mM phosphate buffer containing 2.5 μM Ps-TG, 1 mM reduced glutathione (GSH) and 5 μg/mL glutathione-S-transferase (GSTP1-1) (pH 7.4;
Ｐｓ－ＴＧ（化合物（８））についての吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルの測定結果を図４の（Ａ）および（Ｂ）にそれぞれ示す。図４の（Ｂ）に示す結果からわかるように、Ｐｓ－ＴＧは反応の前後で約６０倍の蛍光強度上昇を示した（反応前後の蛍光量子収率はそれぞれ０．０１６および０．９１３であった）。また、図４（Ａ）に示すように反応の前後において吸収スペクトルは変化せず、蛍光スペクトルのみが大きく変化した。これは、電子が基底状態から励起状態へと励起される過程には反応の前後で違いはないが、励起された電子の遷移過程に違いがあるためである。 Measurement results of absorption spectrum and fluorescence spectrum of Ps-TG (compound (8)) are shown in FIGS. 4A and 4B, respectively. As can be seen from the results shown in FIG. 4B, Ps-TG showed an approximately 60-fold increase in fluorescence intensity before and after the reaction (fluorescence quantum yields before and after the reaction were 0.016 and 0.913, respectively). there were). Moreover, as shown in FIG. 4A, the absorption spectrum did not change before and after the reaction, and only the fluorescence spectrum changed significantly. This is because there is no difference in the process by which electrons are excited from the ground state to the excited state before and after the reaction, but there is a difference in the transition process of the excited electrons.
続いて、Ｐｓ－ＴＧがグルタチオン化反応を受けることで強蛍光性を示すようになっていることを確認するために、ＨＰＬＣおよびＬＣ－ＭＳによる解析を行った。具体的には、上記で吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定したサンプルを反応液としてＨＰＬＣ測定を行った。ＨＰＬＣによる分析には、ポンプとしてＬＣ－１０ＡＴ、吸収および蛍光検出器として、ＳＰＤ－Ｍ２０ＡおよびＲＦ－１０ＡｘＬ（株式会社島津製作所製）、分離用カラムとしてＩｎｔｅｒｓｕｓｔａｉｎ Ｃ１８カラム（ＧＬサイエンス社）から構成されたＨＰＬＣシステムを利用した。移動相としては、Ａ液およびＢ液に１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液、アセトニトリルをそれぞれ用い、２０分間でＡ：Ｂ＝９０：１０から５：９５の混合比を変化させ、流速は０．２ｍＬ／分の条件で分析を行った。 Subsequently, HPLC and LC-MS analyzes were performed in order to confirm that Ps-TG exhibits strong fluorescence due to the glutathionylation reaction. Specifically, HPLC measurement was performed using the sample whose absorption spectrum and fluorescence spectrum were measured above as a reaction liquid. HPLC analysis consisted of LC-10AT as a pump, SPD-M20A and RF-10AxL (manufactured by Shimadzu Corporation) as absorption and fluorescence detectors, and an Intersustain C18 column (GL Sciences) as a separation column. A HPLC system was utilized. As the mobile phase, 10 mM ammonium acetate aqueous solution and acetonitrile were used for A and B solutions, respectively, and the mixing ratio was changed from A: B = 90: 10 to 5: 95 in 20 minutes, and the flow rate was 0.2 mL / min. conditions were analyzed.
ＨＰＬＣによる解析結果を図４の（Ｃ）に示す。図４（Ｃ）に示す吸収クロマトグラムから、Ｐｓ－ＴＧの保持時間は反応に伴って短くなっていた。また、対応する蛍光測定モードでは、Ｐｓ－ＴＧに相当するピークはほぼ無蛍光であるのに対し、反応後は強蛍光性であった。 The analysis result by HPLC is shown in FIG. 4(C). From the absorption chromatogram shown in FIG. 4(C), the retention time of Ps-TG became shorter with the reaction. Moreover, in the corresponding fluorescence measurement mode, the peak corresponding to Ps-TG was almost non-fluorescent, whereas it was strongly fluorescent after the reaction.
また、ＨＰＬＣ解析で確認できた強蛍光性ピークが実際にグルタチオン化された分子であることを確かめるため、反応生成物についてＬＣ－ＭＳ解析を行った。具体的には、ＨＰＬＣ測定と同じ反応液をＬＣ－ＭＳ解析に用いた。ＬＣ－ＭＳ解析には、ポンプとしてＬＣ－１０ＡＴ、吸収検出器としてＳＰＤ－Ｍ２０Ａ、ＭＳとして四重極型質量分析計ＬＣＭＳ－２０２０（株式会社島津製作所製）、分離用カラムとしてＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３カラム（ＧＬサイエンス社）から構成されたシステムを利用した。移動相としては、Ａ液には１０ｍＭ酢酸アンモニウム、Ｂ液にはアセトニトリルを用い、２０分間でＡ：Ｂ＝９０：１０から５：９５の混合比を変化させ、流速は０．２ｍＬ／分の条件で分析を行った。 In addition, LC-MS analysis was performed on the reaction product in order to confirm that the strongly fluorescent peak confirmed by HPLC analysis was actually a glutathionylated molecule. Specifically, the same reaction solution used for HPLC measurement was used for LC-MS analysis. For LC-MS analysis, LC-10AT as a pump, SPD-M20A as an absorption detector, LCMS-2020 quadrupole mass spectrometer (manufactured by Shimadzu Corporation) as MS, and an Inertsil ODS-3 column as a separation column. (GL Sciences) was used. As the mobile phase, 10 mM ammonium acetate was used for A solution, and acetonitrile was used for B solution. conditions were analyzed.
ＬＣ－ＭＳによる解析結果を図４（Ｄ）に示す。なお、図４（Ｄ）の上段は吸収クロマトグラムであり、下段は抽出イオンクロマトグラムである。図４（Ｄ）に示すように、ＬＣ－ＭＳ解析ではグルタチオン化生成物由来のＭＳピークが検出された（ｍ／ｚ＝８０２．７±０．５）。以上のことから、Ｐｓ－ＴＧのニトロ基がＧＳＨに置換されることで、強蛍光性を持つ反応生成物が生じることが示された。そして、Ｐｓ－ＴＧは、グルタチオン化に伴ってニトロ基が脱離することでＤ－ＰｅＴ機構による消光が解除されるという分子設計通りに機能することが確認された。 The analysis result by LC-MS is shown in FIG. 4(D). The upper part of FIG. 4(D) is an absorption chromatogram, and the lower part is an extracted ion chromatogram. As shown in FIG. 4(D), the LC-MS analysis detected an MS peak derived from the glutathionylation product (m/z=802.7±0.5). From the above, it was shown that the substitution of the nitro group of Ps-TG with GSH produces a reaction product with strong fluorescence. It was also confirmed that Ps-TG functions according to its molecular design, in which quenching by the D-PeT mechanism is canceled by elimination of the nitro group accompanying glutathionization.
次いで、Ｐｓ－ＴＧ（化合物（８））のＧＳＴＰ１選択性を評価した。具体的に、上記で合成したＰｓ－ＴＧについて、３種類のＧＳＴ（ＧＳＴＡ１－１、ＧＳＴＭ１－１、ＧＳＴＰ１－１）について異なる濃度のＧＳＴを用いてＧＳＴ活性を測定した場合の蛍光強度の経時的な変化を測定することで、特異活性を算出した。 The GSTP1 selectivity of Ps-TG (compound (8)) was then evaluated. Specifically, for the Ps-TG synthesized above, three types of GST (GSTA1-1, GSTM1-1, GSTP1-1) were measured for GST activity using different concentrations of GST. The specific activity was calculated by measuring the change in
具体的には、１μＭのＰｓ－ＴＧを１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ ０．１％を共溶媒として含む）に溶解し、異なる濃度の各種ＧＳＴ（ＧＳＴＡ１－１；０．１～１０．１μｇ／ｍＬ、ＧＳＴＭ１－１；０．４～１０．１μｇ／ｍＬ、ＧＳＴＰ１－１；０．３～９．８μｇ／ｍＬ）の存在下、１ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）と室温（２５℃）にて撹拌しながら反応させ、蛍光強度を３０秒ごとに３０分間記録した。なお、本実験における励起／蛍光波長は４９０／５１０ｎｍとし、ネガティブコントロールとしてＧＳＨのみを添加した系についても同様の実験を行った。また、本実験はマルチウェルプレートリーダー（ＳＨ－９０００、コロナ電気株式会社）を用いて行った。 Specifically, 1 μM Ps-TG was dissolved in 100 mM phosphate buffer (pH 7.4; containing 0.1% DMSO as a co-solvent), and different concentrations of various GSTs (GSTA1-1; 0.1-10 .1 μg/mL, GSTM1-1; 0.4-10.1 μg/mL, GSTP1-1; 0.3-9.8 μg/mL), 1 mM reduced glutathione (GSH) and room temperature (25 ° C. ), and the fluorescence intensity was recorded every 30 seconds for 30 minutes. The excitation/fluorescence wavelengths in this experiment were set to 490/510 nm, and a similar experiment was also conducted for a system to which only GSH was added as a negative control. In addition, this experiment was performed using a multiwell plate reader (SH-9000, Corona Denki Co., Ltd.).
結果を図５に示す。図５（Ａ）は、各種ＧＳＴの濃度を０．５μｇ／ｍＬとしたときのＰｓ－ＴＧの蛍光強度の経時的な変化を示すグラフである。また、図５（Ｂ）は、Ｐｓ－ＴＧの各種ＧＳＴとの反応初速度を、単位時間当たりの蛍光強度変化（ΔＦ．Ｉ．／ｓｅｃ）として示すグラフである。図５の（Ａ）および（Ｂ）に示すように、ＧＳＴの非存在下およびＧＳＴＡ１の存在下では、１ｍＭ ＧＳＨによって蛍光強度の上昇は見られなかった。一方、ＧＳＴＭ１またはＧＳＴＰ１の存在下では蛍光強度の上昇が見られ、単位時間当たりの蛍光強度変化（ΔＦ．Ｉ．／ｓｅｃ）はそれぞれ０．９および７．１であった。その差は約８倍程度であり、高いＧＳＴＰ１選択性を確認することができた。 The results are shown in FIG. FIG. 5(A) is a graph showing changes over time in Ps-TG fluorescence intensity when the concentration of various GSTs was 0.5 μg/mL. FIG. 5(B) is a graph showing the initial reaction rate of Ps-TG with various GSTs as a change in fluorescence intensity per unit time (ΔF.I./sec). As shown in FIGS. 5A and 5B, 1 mM GSH did not increase the fluorescence intensity in the absence of GST and in the presence of GSTA1. On the other hand, an increase in fluorescence intensity was observed in the presence of GSTM1 or GSTP1, and the change in fluorescence intensity per unit time (ΔF.I./sec) was 0.9 and 7.1, respectively. The difference was about 8-fold, confirming high GSTP1 selectivity.
（Ｐｓ－ＤＣＴＧ）
続いて、Ｐｓ－ＤＣＴＧ（化合物（９））についても、上記と同様に評価を行ったところ、Ｐｓ－ＴＧ（化合物（８））と同様の結果が得られた（図６の（Ａ）～（Ｄ）並びに図７の（Ａ）および（Ｂ））。ここで、図６（Ｂ）に示す蛍光スペクトルから算出される反応の前後での蛍光量子収率はそれぞれ０．０２２および０．８５１であり、Ｐｓ－ＤＣＴＧは反応前後で約４０倍の蛍光強度の上昇を示した。図６（Ｄ）に示すＬＣ－ＭＳ解析結果におけるｍ／ｚは８７０．７±０．５であった。さらに、図７（Ａ）に示すように、１ｍＭ ＧＳＨのみの存在下またはＧＳＨとＧＳＴＡ１との共存下においてＰｓ－ＤＣＴＧの蛍光強度に変化は見られなかった。一方、ＧＳＨとＧＳＴＭ１との共存下、およびＧＳＨとＧＳＴＰ１との共存下による反応初速度はそれぞれ３．７および１２．１であった。その差は約３倍程度であり、Ｐｓ－ＴＧと比較すると弱いもののＰｓ－ＤＣＴＧもまたＧＳＴＰ１選択性を示すことが明らかとなった。なお、図７に示す測定における励起／蛍光波長は５０５／５２５ｎｍとした。(Ps-DCTG)
Subsequently, Ps-DCTG (compound (9)) was also evaluated in the same manner as above, and the same results as Ps-TG (compound (8)) were obtained (FIG. 6 (A) to (D) and FIGS. 7A and 7B). Here, the fluorescence quantum yields before and after the reaction calculated from the fluorescence spectrum shown in FIG. 6(B) are 0.022 and 0.851, respectively. showed an increase in The m/z in the LC-MS analysis results shown in FIG. 6(D) was 870.7±0.5. Furthermore, as shown in FIG. 7(A), no change in fluorescence intensity of Ps-DCTG was observed in the presence of 1 mM GSH alone or in the coexistence of GSH and GSTA1. On the other hand, the initial reaction rates in the coexistence of GSH and GSTM1 and in the coexistence of GSH and GSTP1 were 3.7 and 12.1, respectively. The difference was about 3-fold, and it was revealed that Ps-DCTG also exhibited GSTP1 selectivity, although it was weaker than Ps-TG. The excitation/fluorescence wavelengths in the measurement shown in FIG. 7 were set to 505/525 nm.
ここで、Ｐｓ－ＴＧおよびＰｓ－ＤＣＴＧのそれぞれに対する各種ＧＳＴの比活性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を測定した結果を下記の表１に示す。 Table 1 below shows the results of measuring the specific activity of various GSTs with respect to Ps-TG and Ps-DCTG.
［蛍光プローブのＧＳＨおよび各種還元活性種に対する反応性の評価（１）］
（Ｐｓ－ＴＧのＧＳＨに対する反応性）
従来のプローブ（ＤＮＡＦ－１，２、ＤＮＡＴ－Ｍｅおよび３，４－ＤＮＡＤＣＦ）は、その反応性の高さゆえ、ＧＳＴＰ１の非存在下においてもＧＳＨと非酵素的に反応し、蛍光強度の上昇を起こす。そこで、本実験では、このような特性がＰｓ－ＴＧにおいて改善しているかどうかを確かめるために、Ｐｓ－ＴＧとＧＳＨとの反応性を評価した。[Evaluation of reactivity of fluorescent probes to GSH and various reducing active species (1)]
(Reactivity of Ps-TG to GSH)
Conventional probes (DNAF-1,2, DNAT-Me and 3,4-DNADCF), due to their high reactivity, react non-enzymatically with GSH even in the absence of GSTP1, resulting in an increase in fluorescence intensity. cause Therefore, in this experiment, the reactivity between Ps-TG and GSH was evaluated in order to confirm whether such characteristics were improved in Ps-TG.
具体的には、２μＭのＰｓ－ＴＧを１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ ０．１％を共溶媒として含む）に溶解し、異なる濃度のＧＳＨ（０．６２５～２０ｍＭ）の存在下、室温（２５℃）にて３０分間反応させた。そして、反応後の蛍光強度をマイクロプレートリーダーで測定した。本実験における励起／蛍光波長は４９０／５１０ｎｍとし、ポジティブコントロール（ＧＳＨ／ＧＳＴＰ１）として、２．０μｇ／ｍＬ ＧＳＴＰ１－１と反応させた。また、ネガティブコントロール（Ｎｏｎｅ）としては、ＧＳＴＰ１もＧＳＨも添加せずに同様の実験を行った。なお、本実験はマルチウェルプレートリーダー（ＳＨ－９０００、コロナ電気株式会社）を用いて行った。 Specifically, 2 μM Ps-TG was dissolved in 100 mM phosphate buffer (pH 7.4; containing DMSO 0.1% as a co-solvent), and in the presence of different concentrations of GSH (0.625-20 mM), The reaction was allowed to proceed for 30 minutes at room temperature (25°C). Then, the fluorescence intensity after the reaction was measured with a microplate reader. The excitation/fluorescence wavelengths in this experiment were 490/510 nm, and the positive control (GSH/GSTP1) was reacted with 2.0 μg/mL GSTP1-1. As a negative control (None), the same experiment was performed without adding GSTP1 or GSH. This experiment was performed using a multiwell plate reader (SH-9000, Corona Denki Co., Ltd.).
結果を図８に示す。図８に示すように、Ｐｓ－ＴＧは、細胞内の生理的濃度（０．５～１０ｍＭ）を超える濃度のＧＳＨともほとんど反応しないことがわかる。これは、Ｐｓ－ＴＧの蛍光強度の上昇には、ＧＳＨ存在下でのＧＳＴＰ１の活性が必要であることを意味する。 The results are shown in FIG. As shown in FIG. 8, Ps-TG hardly reacts with GSH at a concentration exceeding the intracellular physiological concentration (0.5-10 mM). This means that the increase in fluorescence intensity of Ps-TG requires GSTP1 activity in the presence of GSH.
（Ｐｓ－ＴＧの各種還元活性種に対する反応性）
細胞内には、ニトロ基との反応性があることが予想される酸化還元活性種が多数存在している。そこで、本実験では、これらの酸化還元活性種およびその関連物質について、Ｐｓ－ＴＧとの反応性を評価した。(Reactivity of Ps-TG to various reducing active species)
A large number of redox-active species that are expected to be reactive with nitro groups are present in cells. Therefore, in this experiment, these redox active species and their related substances were evaluated for their reactivity with Ps-TG.
具体的には、２μＭのＰｓ－ＴＧを１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ ０．１％を共溶媒として含む）に溶解し、１ｍＭの様々な酸化還元活性種の存在下、室温（２５℃）にて３０分間反応させた。その後、反応後の蛍光強度をマイクロプレートリーダーで測定した。ここで、酸化還元活性種としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、システイン、２－メルカプトエタノール（βＭＥ）、トリスルフィドナトリウム（Ｎａ２Ｓ３）、還元型および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨおよびＮＡＤ＋）、還元型および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰ＋）、アスコルビン酸（ＡＡ）を用いた。本実験における励起／蛍光波長は４９０／５１０ｎｍとし、ポジティブコントロール（ＧＳＨ／ＧＳＴＰ１）として、２．０μｇ／ｍｌＧＳＴＰ１－１と反応させた。また、ネガティブコントロール（Ｎｏｎｅ）としては、ＧＳＴＰ１もＧＳＨも添加せずに同様の実験を行った。なお、本実験はマルチウェルプレートリーダー（ＳＨ－９０００、コロナ電気株式会社）を用いて行った。Specifically, 2 μM of Ps-TG was dissolved in 100 mM phosphate buffer (pH 7.4; containing 0.1% DMSO as a co-solvent), and in the presence of 1 mM of various redox-active species, room temperature (25 ° C.) for 30 minutes. After that, the fluorescence intensity after the reaction was measured with a microplate reader. Here, the redox active species include dithiothreitol (DTT), cysteine, 2-mercaptoethanol (βME), sodium trisulfide (Na 2 S 3 ), reduced and oxidized nicotinamide adenine dinucleotides (NADH and NAD + ), reduced and oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH and NADP + ), ascorbic acid (AA) were used. The excitation/fluorescence wavelengths in this experiment were 490/510 nm, and the positive control (GSH/GSTP1) was reacted with 2.0 μg/ml GSTP1-1. As a negative control (None), the same experiment was performed without adding GSTP1 or GSH. This experiment was performed using a multiwell plate reader (SH-9000, Corona Denki Co., Ltd.).
結果を図９に示す。図９に示すように、Ｐｓ－ＴＧは、上記で示した酸化還元活性種とはほとんど反応しないことがわかる。このことから、Ｐｓ－ＴＧは酸化還元活性種との反応による非特異的な蛍光強度の上昇を起こす恐れが少ない蛍光プローブであるといえる。 The results are shown in FIG. As shown in FIG. 9, Ps-TG hardly reacts with the redox active species shown above. From this, it can be said that Ps-TG is a fluorescent probe that is less likely to cause a nonspecific increase in fluorescence intensity due to reaction with redox active species.
［細胞イメージング（１）］
上記で作製した２種類の蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＧ、Ｐｓ－ＤＣＴＧ）を培養細胞へ適用し、細胞内においてＧＳＴＰ１活性を検出することが可能か否かを調べた。なお、蛍光プローブの評価には内在的なＧＳＴＰ１の発現がほとんど見られないヒト乳がん由来細胞であるＭＣＦ－７細胞を用いた。また、ＭＣＦ－７細胞および後述するＨＴ－１０８０細胞については、いずれも１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃にて５％ＣＯ２条件下で培養し、３～４日に１回継代しつつ培養した。[Cell imaging (1)]
The two types of fluorescent probes (Ps-TG and Ps-DCTG) prepared above were applied to cultured cells to examine whether GSTP1 activity could be detected in the cells. For the evaluation of the fluorescent probe, MCF-7 cells, which are human breast cancer-derived cells in which endogenous GSTP1 expression is hardly observed, were used. In addition, both MCF-7 cells and HT-1080 cells described later were incubated at 37° C. for 5 minutes in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin-streptomycin-glutamine. The cells were cultured under % CO 2 conditions and subcultured once every 3-4 days.
本実験ではまず、ＭＣＦ－７細胞を３５ｍｍガラスボトムディッシュ（松波硝子工業株式会社）または８－ウェルチャンバー（ＩＷＡＫＩ）に３．０×１０５細胞／ディッシュまたは３．３×１０４細胞／ウェルとなるようにそれぞれ播種した。そして細胞が接着した後に、Ｎ末端が３ｘＦＬＡＧタグ化されたＧＳＴＰ１をコードするｃＤＮＡ（３ｘＦＬＡＧ－ＧＳＴＰ１）が挿入された発現ベクターｐＩＲＥＳ２－ＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ２／３ｘＦＬＡＧ－ＧＳＴＰ１をトランスフェクション試薬Ｆｕｇｅｎｅ６（プロメガ株式会社）により細胞内へ導入し、２４時間後以降に実験に使用した。なお、ｐＩＲＥＳ２－ＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ２／３ｘＦＬＡＧ－ＧＳＴＰ１ベクターでは、ＣＭＶプロモーターの下流において転写される１本のｍＲＮＡが３ｘＦＬＡＧ－ＧＳＴＰ１およびＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ２の両者のｍＲＮＡ配列をもつ。そして、両配列の間にはＩｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ） が存在し、３ｘＦＬＡＧ－ＧＳＴＰ１およびＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ２のそれぞれのタンパク質が発現する。すなわち、当該ベクターを用いることにより、赤色蛍光タンパク質であるＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ２が発する蛍光によって３ｘＦＬＡＧ－ＧＳＴＰ１の発現を確認することができるのである。In this experiment, MCF-7 cells were first placed in a 35 mm glass bottom dish (Matsunami Glass Industry Co., Ltd.) or an 8-well chamber (IWAKI) at 3.0×10 5 cells/dish or 3.3×10 4 cells/well. Each seed was sown so that Then, after the cells adhered, the expression vector pIRES2-DsRed Express2/3xFLAG-GSTP1 inserted with cDNA encoding GSTP1 tagged with 3xFLAG at the N-terminus (3xFLAG-GSTP1) was transfected with a transfection reagent Fugene6 (Promega Corporation). It was introduced into cells and used for experiments after 24 hours. In the pIRES2-DsRed Express2/3xFLAG-GSTP1 vector, one mRNA transcribed downstream of the CMV promoter has both 3xFLAG-GSTP1 and DsRed Express2 mRNA sequences. An internal ribosomal entry site (IRES) is present between both sequences, and 3xFLAG-GSTP1 and DsRed Express2 proteins are expressed. That is, by using the vector, the expression of 3xFLAG-GSTP1 can be confirmed by the fluorescence emitted by the red fluorescent protein DsRed Express2.
次いで、上記発現ベクターが導入されたＭＣＦ－７細胞にプローブを負荷することによりイメージング実験を行った。具体的には、上記ベクターが導入されたＭＣＦ－７細胞に対し、２．５μＭのＰｓ－ＴＧまたはＰｓ－ＤＣＴＧを３７℃、５％ＣＯ２条件下で５分間インキュベーションして、その後に共焦点レーザー走査型顕微鏡下で観察を行った。なお、本実験において、共焦点レーザー走査型顕微鏡としてはＦＬＵＯＶＩＥＷ ＦＶ１０ｉ－ＤＯＣ（オリンパス株式会社製）を用い、蛍光プローブの蛍光は波長４７３ｎｍのＬＤレーザーにより励起させ、ＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ２の蛍光は波長５８４ｎｍのＬＤレーザーにより励起させて、対応する蛍光スペクトルにおける蛍光画像を取得した。Imaging experiments were then carried out by loading probes into MCF-7 cells transfected with the above expression vector. Specifically, 2.5 μM of Ps-TG or Ps-DCTG was incubated at 37° C. for 5 minutes under 5% CO 2 conditions for MCF-7 cells introduced with the above vector, and then confocal Observations were made under a laser scanning microscope. In this experiment, FLUOVIEW FV10i-DOC (manufactured by Olympus Corporation) was used as a confocal laser scanning microscope. A fluorescence image was acquired in the corresponding fluorescence spectrum upon excitation by a laser.
結果を図１０に示す。ここで、図１０の（Ａ）および（Ｃ）はそれぞれ、Ｐｓ－ＴＧおよびＰｓ－ＤＣＴＧの化学構造式である。また、図１０の（Ｂ）および（Ｄ）はそれぞれ、各蛍光プローブを投与したＭＣＦ－７細胞のイメージング画像であり、左から蛍光プローブの蛍光；ＤｓＲｅｄの蛍光；並びに、蛍光プローブの蛍光、ＤｓＲｅｄの蛍光および白色像の重ね合わせ（Ｍｅｒｇｅ）を示すものである（スケールバーはいずれも２０μｍである）。図１０に示すように、いずれの蛍光プローブを用いた場合であっても、ＤｓＲｅｄの赤色蛍光を示す細胞では蛍光プローブ由来の緑色蛍光が観察された。これに対し、赤色蛍光を示さない細胞における緑色蛍光の強度は弱いものであった。このことから、ＧＳＴＰ１が発現した細胞において選択的に蛍光プローブの蛍光強度の上昇が起こっていることが示された。 The results are shown in FIG. Here, (A) and (C) of FIG. 10 are the chemical structural formulas of Ps-TG and Ps-DCTG, respectively. In addition, (B) and (D) of FIG. 10 are respectively imaging images of MCF-7 cells administered with each fluorescent probe. From the left, the fluorescence of the fluorescent probe; the fluorescence of DsRed; (Both scale bars are 20 μm). As shown in FIG. 10, green fluorescence derived from the fluorescent probe was observed in cells exhibiting red fluorescence of DsRed, regardless of which fluorescent probe was used. In contrast, the intensity of green fluorescence was weak in cells that did not exhibit red fluorescence. This indicated that the fluorescence intensity of the fluorescent probe selectively increased in cells expressing GSTP1.
ここで、図１０に示す結果では、細胞内における蛍光強度が比較的小さく、細胞膜に強い蛍光が観察された。すなわち、いずれの蛍光プローブについても、細胞膜透過性がそれほど高くないことが示唆された。これは、生体内環境（ｐＨ７．４）においてこれらの蛍光プローブはアニオン性を示して十分な脂溶性を有しない結果、細胞膜を透過しにくいものと考えられた。 Here, in the results shown in FIG. 10, the intensity of fluorescence in the cells was relatively low, and strong fluorescence was observed in the cell membrane. That is, it was suggested that the cell membrane permeability was not so high for any of the fluorescent probes. It is thought that these fluorescent probes exhibit anionic properties in the in vivo environment (pH 7.4) and do not have sufficient lipid solubility, and as a result, they are difficult to permeate cell membranes.
［蛍光プローブの合成（２）］
続いて、上記で作製した蛍光プローブの細胞膜透過性を向上させることを目的として、さらなる誘導体化を試みた。ここでは具体的に、上記で作製した蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＧ、Ｐｓ－ＤＣＴＧ）をより脂溶性の高い化学構造へと改変すべく、蛍光団を構成するキサンテン環のフェノール性ヒドロキシ基をアセチル化した化合物を合成した（下記の反応スキーム２）。なお、Ｐｓ－ＴＧ（化合物（８））およびＰｓ－ＤＣＴＧ（化合物（９））のそれぞれに対応するアセチル化化合物を、以下では「Ｐｓ－ＴＡｃ」（化合物（１０））および「Ｐｓ－ＤＣＴＡｃ」（化合物（１１））とも称する。[Synthesis of fluorescent probe (2)]
Subsequently, further derivatization was attempted for the purpose of improving the cell membrane permeability of the fluorescent probe prepared above. Here, specifically, in order to modify the fluorescent probes (Ps-TG, Ps-DCTG) prepared above to have a more lipid-soluble chemical structure, the phenolic hydroxy group of the xanthene ring that constitutes the fluorophore is acetylated. was synthesized (
（化合物（１０）の合成；９－（２－メチル－４－（５－（メチルスルホニル）－２－ニトロベンズアミド）フェニル）－３－オキソ－３Ｈ－キサンテン－６－イルアセテート（Ｐｓ－ＴＡｃ）） (Synthesis of compound (10); 9-(2-methyl-4-(5-(methylsulfonyl)-2-nitrobenzamido)phenyl)-3-oxo-3H-xanthen-6-yl acetate (Ps-TAc) )
Ｐｓ－ＴＧ（８）（２．１ｍｇ，０．００３９ｍｍｏｌ）および塩化アセチル（０．６μＬ，０．００８ｍｍｏｌ）を懸濁させたテトラヒドロフラン２ｍＬに対して、４℃条件下でＮ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＰＡ）（１．４μＬ，０．００８ｍｍｏｌ）を滴下し、氷上において２時間撹拌した。反応液に酢酸エチルを加えた後、有機層を１Ｎ塩酸で３回洗浄し、無水硫酸マグネシウムによって乾燥させた。減圧下、有機層を留去し、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１：２）によって精製して、目的化合物０．５ｍｇを得た（収率２２％）。 N,N'-diisopropylethylamine was added to 2 mL of tetrahydrofuran in which Ps-TG (8) (2.1 mg, 0.0039 mmol) and acetyl chloride (0.6 µL, 0.008 mmol) were suspended at 4°C. (DIEPA) (1.4 μL, 0.008 mmol) was added dropwise and stirred on ice for 2 hours. After adding ethyl acetate to the reaction solution, the organic layer was washed with 1N hydrochloric acid three times and dried over anhydrous magnesium sulfate. The organic layer was distilled off under reduced pressure and purified by silica gel chromatography (hexane/ethyl acetate=1:2) to obtain 0.5 mg of the desired compound (yield 22%).
（化合物（１０）の機器データ）
１Ｈ-ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ８．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７），８．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８，），８．３１（１Ｈ，ｄｄ），７．８０（１Ｈ，ｓ，Ｊ＝８．２），７．７１（２Ｈ，ｍ），７．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８），７．３３（１Ｈ， ｄ，Ｊ＝８．２），７．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．１），６．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６），６．４９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．６，１．８），６．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３），３．４２（３Ｈ，ｓ），２．３２（３Ｈ，ｓ），２．０６（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ-ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１８４．４，１６８．７，１６２．７，１５８．１，１５４．２，１５２．４，１４９．５，１４７．５，１４４．８，１３９．６，１３６．８，１３２．９，１３０．８，１３０．５，１３０．８，１３０．１，１３．０，１２９．１，１２８．２，１２７．６，１２５．８，１２１．２，１１９．９，１１９．２，１１８．１，１１７．５，１１０．５，１０５．２，２９．０，２０．９，１９．５
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ Ｆｏｕｎｄ ５８７．１１２８ ［Ｍ＋Ｈ］＋，ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ５８７．１１２４ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ２３Ｎ２Ｏ９Ｓ（＋０．４ ｍｍｕ）。(Instrumental data of compound (10))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.40 (1H, d, J = 8.7), 8.39 (1H, d, J = 1.8,), 8.31 (1H, dd ), 7.80 (1H, s, J = 8.2), 7.71 (2H, m), 7.50 (1H, d, J = 18), 7.33 (1H, d, J = 8 .2), 7.12 (1H, d, J = 4.1), 6.98 (1H, d, J = 9.6), 6.49 (1H, dd, J = 9.6, 1 . 8), 6.27 (1H, d, J = 2.3), 3.42 (3H, s), 2.32 (3H, s), 2.06 (3H, s)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ 184.4, 168.7, 162.7, 158.1, 154.2, 152.4, 149.5, 147.5, 144.8, 139. 6, 136.8, 132.9, 130.8, 130.5, 130.8, 130.1, 13.0, 129.1, 128.2, 127.6, 125.8, 121.2, 119.9, 119.2, 118.1, 117.5, 110.5, 105.2, 29.0, 20.9, 19.5
HRMS (ESI-TOF) m/z Found 587.1128 [M+H] + , calculated 587.1124 for C 30 H 23 N 2 O 9 S (+0.4 mmu).
（化合物（１１）の合成；２，７－ジクロロ－９－（２－メチル－４－（５－（メチルスルホニル）－２－ニトロベンズアミド）フェニル）－３－オキソ－３Ｈ－キサンテン－６－イルアセテート（Ｐｓ－ＤＣＴＡｃ）） (Synthesis of compound (11); 2,7-dichloro-9-(2-methyl-4-(5-(methylsulfonyl)-2-nitrobenzamido)phenyl)-3-oxo-3H-xanthen-6-yl Acetate (Ps-DCTAc))
Ｐｓ－ＤＣＴＧ（５．１ｍｇ，０．００８３ｍｍｏｌ）および塩化アセチル（１．２μｌ，０．０１７ｍｍｏｌ）を含むテトラヒドロフラン２ｍＬに対して、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（３．０μＬ，０．０１７ｍｍｏｌ）を氷上で加え、４℃にて２時間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加えた後、有機層を１Ｎ塩酸で３回、飽和食塩水で１回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１：２）により精製して、目的化合物（Ｐｓ－ＤＣＴＡｃ）１．２ｍｇを得た（２２％）。 N,N'-diisopropylethylamine (3.0 µL, 0.017 mmol) was added to 2 mL of tetrahydrofuran containing Ps-DCTG (5.1 mg, 0.0083 mmol) and acetyl chloride (1.2 µl, 0.017 mmol) on ice. and stirred at 4° C. for 2 hours. After adding ethyl acetate to the reaction solution, the organic layer was washed with 1N hydrochloric acid three times and saturated brine once, and dried over anhydrous magnesium sulfate. Purification by silica gel chromatography (hexane/ethyl acetate=1:2) gave 1.2 mg of the target compound (Ps-DCTAc) (22%).
（化合物（１１）の機器データ）
１Ｈ-ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ８．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６），８．４０（１Ｈ，ｓ），８．３３（１Ｈ，ｍ），７．８４（２Ｈ，ｓ），７．７７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０），７．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４），７．１４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８），６．５３（１Ｈ，ｓ），３．４２（３Ｈ，ｓ），２．３９（３Ｈ，ｓ），２．０９（３Ｈ，ｓ）
１３Ｃ-ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１７２．５，１６８．４，１６３．３，１５８．１，１５１．６，１５０．０，１４８．２，１４５．３，１３０．７，１３０．５，１２８．８，１２８．３，１２８．２，１２６．３，１２３．３，１２１．８，１２０．９，１１８．０，１１３．９，１０５．６，６０．３，４３．４，２１．６，２１．３，２０．１
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ Ｆｏｕｎｄ ６５５．０３４９ ［Ｍ＋Ｈ］＋，ｃａｌｕｃｕｌａｔｅｄ ６５５．０３４５ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ２１Ｎ２Ｏ９ＳＣｌ２ （＋０．４ ｍｍｕ）。(Instrumental data of compound (11))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.42 (1H, d, J = 1.6), 8.40 (1H, s), 8.33 (1H, m), 7.84 (2H , s), 7.77 (1H, d, J = 8.0), 7.36 (1H, d, J = 8.4), 7.14 (2H, d, J = 8.8), 6 .53 (1H, s), 3.42 (3H, s), 2.39 (3H, s), 2.09 (3H, s)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ 172.5, 168.4, 163.3, 158.1, 151.6, 150.0, 148.2, 145.3, 130.7, 130. 5, 128.8, 128.3, 128.2, 126.3, 123.3, 121.8, 120.9, 118.0, 113.9, 105.6, 60.3, 43.4, 21.6, 21.3, 20.1
HRMS (ESI-TOF) m/z Found 655.0349 [M+H] + , calculated 655.0345 for C 30 H 21 N 2 O 9 SCl 2 (+0.4 mmu).
［蛍光プローブの分光学的特性およびクラス選択性の評価（２）］
上記で合成したアセチル化蛍光プローブＰｓ－ＴＡｃ（化合物（１０））およびＰｓ－ＤＣＴＡｃ（化合物（１１））の分光学的特性を評価した。[Evaluation of Spectroscopic Properties and Class Selectivity of Fluorescent Probes (2)]
The spectroscopic properties of the acetylated fluorescent probes Ps-TAc (compound (10)) and Ps-DCTAc (compound (11)) synthesized above were evaluated.
具体的には、まず、Ｐｓ－ＴＡｃ（化合物（１０））について、上記と同様の手法により吸収スペクトルを測定した。その結果、図１１（Ａ）に記載の「反応前」の吸収スペクトルで示すように、Ｐｓ－ＴＡｃは波長４５０ｎｍおよび４９０ｎｍにピークをもつ吸収スペクトルを示した。これは、蛍光団を構成するキサンテン環のフェノール性ヒドロキシ基がアセチル基によって保護されているためであると考えられる。 Specifically, first, the absorption spectrum of Ps-TAc (compound (10)) was measured by the same method as above. As a result, Ps-TAc exhibited an absorption spectrum having peaks at wavelengths of 450 nm and 490 nm, as shown in the absorption spectrum "before reaction" shown in FIG. 11(A). This is probably because the phenolic hydroxy group of the xanthene ring that constitutes the fluorophore is protected by an acetyl group.
続いて、Ｐｓ－ＴＡｃを１０μＭの濃度で含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ０．１％を共溶媒として含む）溶液に、１０μｇ／ｍＬのブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）または１ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を添加し、室温（２５℃）にて撹拌しながら６０分間反応させた。ここで、ＰＬＥを添加した系について反応後に測定した吸収スペクトルが図１１（Ａ）の「反応後」のスペクトルである。また、ＧＳＨ添加系およびＰＬＥ添加系の双方について、反応の間、波長４９０ｎｍでの吸光度を経時的に記録した。これにより得られた結果を図１１（Ｂ）に示す。図１１（Ｂ）に示すように、ブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）の添加によってＰｓ－ＴＡｃの吸収スペクトルは速やかに変化し、６０分経過後には上述した図４（Ａ）と同様の吸収スペクトルを示した。このことから、蛍光団を構成するキサンテン環のフェノール性ヒドロキシ基とアセチル基とからなるエステル結合がＰＬＥの作用によって加水分解され、フェノール性ヒドロキシ基が露出した（すなわち、Ｐｓ－ＴＡｃはＰｓ－ＴＣへと変換された）ものと考えられる。また、図１１（Ｂ）に示すように、この変化は細胞内に比較的高濃度で（通常は１～１０ｍＭ程度の量で）存在する還元型ＧＳＨの作用（エステル結合の開裂作用）によっても進行することが確認された。このため、本発明に係る一般式（２）で表される蛍光プローブのうち、フェノール性ヒドロキシ基がアシル化されたもの（置換基Ｒ２がアシル基であるもの；Ｐｓ－ＴＡｃやＰｓ－ＤＣＴＡｃなど）は、細胞内エステラーゼ活性が低い細胞においても、還元型ＧＳＨの作用によって酵素活性非依存的に、対応するフェノール性ヒドロキシ基含有蛍光プローブ（置換基Ｒ２が水素原子であるもの）へと変換されることが期待される。なお、Ｐｓ－ＤＣＴＡｃについても同様の実験を行った結果、図１１の（Ａ）および（Ｂ）に示すのと同様の結果が得られた。Subsequently, 10 μg/mL porcine liver esterase (PLE) or 1 mM reduced glutathione was added to a 100 mM phosphate buffer (pH 7.4; DMSO 0.1% co-solvent) solution containing Ps-TAc at a concentration of 10 μM. (GSH) was added and reacted for 60 minutes with stirring at room temperature (25°C). Here, the absorption spectrum measured after the reaction for the system to which PLE was added is the "after reaction" spectrum in FIG. 11(A). Also, the absorbance at a wavelength of 490 nm was recorded over time during the reaction for both the GSH-added system and the PLE-added system. The result obtained by this is shown in FIG. 11(B). As shown in FIG. 11(B), the addition of porcine liver esterase (PLE) rapidly changed the absorption spectrum of Ps-TAc, and after 60 minutes, the absorption spectrum was similar to that shown in FIG. 4(A). rice field. From this, the ester bond consisting of the phenolic hydroxy group and the acetyl group of the xanthene ring that constitutes the fluorophore was hydrolyzed by the action of PLE, and the phenolic hydroxy group was exposed (that is, Ps-TAc is Ps-TC converted to). In addition, as shown in FIG. 11(B), this change is also caused by the action of reduced GSH present in cells at a relatively high concentration (usually in an amount of about 1 to 10 mM) (cleavage action of ester bonds). confirmed to proceed. Therefore, among the fluorescent probes represented by the general formula (2) according to the present invention, those in which the phenolic hydroxy group is acylated (the substituent R 2 is an acyl group; Ps-TAc and Ps-DCTAc etc.), even in cells with low intracellular esterase activity, by the action of reduced GSH, the corresponding phenolic hydroxyl group-containing fluorescent probe (where the substituent R2 is a hydrogen atom) in an enzyme-independent manner. expected to be converted. Similar experiments were conducted with Ps-DCTAc, and results similar to those shown in FIGS. 11(A) and 11(B) were obtained.
以上の結果から、Ｐｓ－ＴＡｃおよびＰｓ－ＤＣＴＡｃは、生細胞に添加されると、図１２に示すような機構によってまず細胞膜を透過して細胞内へ取り込まれ、その後に細胞内に存在するエステラーゼの加水分解作用を受けて脱アセチル化されて、対応するアルコール（Ｐｓ－ＴＧやＰｓ－ＤＣＴＧ）へと変換される。そして、Ｐｓ－ＴＧやＰｓ－ＤＣＴＧはＧＳＴＰ１選択的な蛍光プローブであることから、取り込まれた細胞内にＧＳＴＰ１が存在すれば、その作用によりグルタチオン化を受けて強い蛍光を発するものと推定される。 From the above results, when Ps-TAc and Ps-DCTAc are added to living cells, they first permeate the cell membrane and are taken into the cells by the mechanism shown in FIG. is deacetylated by the hydrolysis action of , and converted to the corresponding alcohol (Ps-TG or Ps-DCTG). Since Ps-TG and Ps-DCTG are GSTP1-selective fluorescent probes, it is presumed that if GSTP1 is present in the incorporated cells, it will undergo glutathionization due to its action and emit strong fluorescence. .
［細胞イメージング（２）］
上記で作製した２種類のアセチル化蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＡｃ、Ｐｓ－ＤＣＴＡｃ）について、上述した「細胞イメージング（１）」と同様の発現ベクターｐＩＲＥＳ２－ＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ２を用いた手法により３種類のＧＳＴ分子種（ＧＳＴＰ１、ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＡ１）のそれぞれを発現させたＭＣＦ－７細胞へ適用した際の細胞イメージングを行った。[Cell imaging (2)]
For the two types of acetylated fluorescent probes (Ps-TAc, Ps-DCTAc) prepared above, three types of GST molecules were obtained using the same expression vector pIRES2-DsRed Express2 as in "Cell Imaging (1)" described above. Cell imaging was performed when applied to MCF-7 cells expressing each of the species (GSTP1, GSTM1, GSTA1).
具体的には、上述した発現ベクターｐＩＲＥＳ２－ＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ２を用いて３種類のＧＳＴ分子種（ＧＳＴＰ１、ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＡ１）のそれぞれをＮ末端が３ｘＦＬＡＧタグ化されたｃＤＮＡとして発現させたＭＣＦ－７細胞に対し、２．５μＭのＰｓ－ＴＡｃまたはＰｓ－ＤＣＴＡｃを３７℃、５％ＣＯ２条件下で５分間インキュベーションした後に、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて観察を行った。その結果得られた画像から、ＧＳＴの発現を示すＤｓＲｅｄ発現細胞（赤色蛍光あり）を＋、非発現細胞を－として、それぞれの細胞における蛍光プローブ由来の緑色蛍光の蛍光強度を算出した。Specifically, using the expression vector pIRES2-DsRed Express2 described above, each of the three GST molecular species (GSTP1, GSTM1, GSTA1) was expressed as a cDNA tagged with 3xFLAG at the N-terminus in MCF-7 cells. On the other hand, 2.5 μM Ps-TAc or Ps-DCTAc was incubated at 37° C., 5% CO 2 for 5 minutes, and then observed using a confocal laser scanning microscope. From the resulting image, the fluorescence intensity of green fluorescence derived from the fluorescent probe in each cell was calculated, with DsRed-expressing cells (with red fluorescence) indicating GST expression being + and non-expressing cells being −.
結果を図１３に示す。ここで、図１３の（Ａ）はＰｓ－ＴＡｃの化学構造式であり、（Ｂ）はイメージング画像（スケールバーはいずれも４０μｍである）であり、（Ｃ）は各種ＧＳＴが発現しているＤｓＲｅｄの発現細胞（＋）および非発現細胞（－）における緑色蛍光の蛍光強度を比較したグラフである。同様に、図１３の（Ｄ）はＰｓ－ＤＣＴＡｃの化学構造式であり、（Ｅ）はイメージング画像（スケールバーはいずれも４０μｍである）であり、（Ｆ）は各種ＧＳＴが発現しているＤｓＲｅｄの発現細胞（＋）および非発現細胞（－）における緑色蛍光の蛍光強度を比較したグラフである。 The results are shown in FIG. Here, (A) in FIG. 13 is the chemical structural formula of Ps-TAc, (B) is an imaging image (both scale bars are 40 μm), and (C) is the expression of various GSTs. Fig. 3 is a graph comparing the fluorescence intensity of green fluorescence in DsRed-expressing cells (+) and non-expressing cells (-). Similarly, (D) in FIG. 13 is the chemical structural formula of Ps-DCTAc, (E) is an imaging image (both scale bars are 40 μm), and (F) is the expression of various GSTs. Fig. 3 is a graph comparing the fluorescence intensity of green fluorescence in DsRed-expressing cells (+) and non-expressing cells (-).
図１３に示すように、ＧＳＴＰ１発現細胞において強い緑色蛍光が検出されたことから、Ｐｓ－ＴＡｃおよびＰｓ－ＤＣＴＡｃは細胞内におけるＧＳＴＰ１活性を選択的に検出していることが示された。なお、Ｐｓ－ＴＡｃとＰｓ－ＤＣＴＡｃとのシグナル／バックグラウンド比を比較すると、Ｐｓ－ＴＡｃの方が高い結果となった。したがって、以下の検討では、Ｐｓ－ＴＡｃを用いて実験を行った。 As shown in FIG. 13, strong green fluorescence was detected in GSTP1-expressing cells, indicating that Ps-TAc and Ps-DCTAc selectively detect intracellular GSTP1 activity. A comparison of the signal/background ratios of Ps-TAc and Ps-DCTAc showed that Ps-TAc was higher. Therefore, in the following studies, experiments were performed using Ps-TAc.
続いて、細胞質型ＧＳＴおよびミトコンドリア型ＧＳＴの各種分子種をＭＣＦ－７細胞に発現させ、蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＡｃ）のＧＳＴＰ１選択性を評価した。具体的には、上記と同様の手法により、異なる８クラス１８種類のＧＳＴのそれぞれを組み込んだｐＩＲＥＳ２－ＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ２／３ｘＦＬＡＧ－ＧＳＴをＭＣＦ－７細胞へトランスフェクションした。 Subsequently, various molecular species of cytosolic and mitochondrial GST were expressed in MCF-7 cells, and the GSTP1 selectivity of the fluorescent probe (Ps-TAc) was evaluated. Specifically, pIRES2-DsRed Express2/3xFLAG-GST incorporating each of 8 different classes of 18 types of GST was transfected into MCF-7 cells by the same method as described above.
次いで、各ＧＳＴ分子種の発現をウエスタンブロッティングにより確認した。具体的には、等量のタンパク質（ＧＳＴ発現ＭＣＦ－７細胞由来）をＳＤＳ－ポリアクリルアミド（ＰＡＧＥ）ゲル電気泳動（１２．５％ポリアクリルアミド）によって分離した後、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレンに転写した。そして、０．１％ポンソーＳ染色液（株式会社ビークル製）にてＰＶＤＦメンブレン上へのタンパク転写を確認した後、３％スキムミルクを含むＴＢＳ－Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むトリス緩衝液）中、室温にて１時間振盪した。ＴＢＳ－Ｔで３回（各５分間）洗浄した後、一次抗体として抗ＦＬＡＧ－Ｍ２マウスＩｇＧ抗体（希釈倍率１：５０００、シグマアルドリッチジャパン合同会社）または抗β－アクチンウサギＩｇＧ抗体（希釈倍率１：４０００、生物医学研究所）を含むＴＢＳ－Ｔ（５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む）中、４℃にて一晩振盪した。ＴＢＳ－Ｔで３回（各５分間）洗浄して余分な抗体を取り除いた後、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウスＩｇＧ抗体または西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ウサギＩｇＧ抗体（両者ともに希釈倍率１：２５００、プロメガ株式会社）を含むＴＢＳ－Ｔ（５％ＢＳＡ含む）中にて室温で１時間振盪した。目的タンパク質の検出は、ルミノールおよび過酸化水素を含む発光試薬を用いた化学発光法により、冷却ＣＣＤカメラシステムＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ４０００（富士フイルム株式会社製）を用いて行った。 Expression of each GST molecular species was then confirmed by Western blotting. Specifically, equal amounts of protein (from GST-expressing MCF-7 cells) were separated by SDS-polyacrylamide (PAGE) gel electrophoresis (12.5% polyacrylamide) and then transferred to polyvinylidene fluoride (PVDF) membranes. transcribed. Then, after confirming protein transfer onto the PVDF membrane with 0.1% Ponceau S staining solution (manufactured by Vehicle Co., Ltd.), TBS-T containing 3% skim milk (Tris buffer containing 0.1% Tween-20 solution) and shaken at room temperature for 1 hour. After washing with TBS-T three times (5 minutes each), anti-FLAG-M2 mouse IgG antibody (dilution ratio 1:5000, Sigma-Aldrich Japan LLC) or anti-β-actin rabbit IgG antibody (dilution ratio 1) was used as the primary antibody. : 4000, Biomedical Research Institute) in TBS-T (containing 5% bovine serum albumin (BSA)) at 4° C. overnight. After washing with TBS-T three times (5 minutes each) to remove excess antibody, horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG antibody or horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-rabbit IgG antibody ( Both were shaken at room temperature for 1 hour in TBS-T (containing 5% BSA) containing a dilution ratio of 1:2500 (Promega Corporation). The target protein was detected by a chemiluminescence method using a luminescent reagent containing luminol and hydrogen peroxide, using a cooled CCD camera system ImageQuant LAS4000 (manufactured by FUJIFILM Corporation).
上記のようにして行ったウエスタンブロッティングの結果を図１４に示す。図１４に示すように、いずれのＧＳＴ分子種を発現させたＭＣＦ－７細胞においても、目的のＧＳＴタンパク質が発現していることが確認された。 The results of Western blotting performed as described above are shown in FIG. As shown in FIG. 14, it was confirmed that the target GST protein was expressed in MCF-7 cells expressing any of the GST molecular species.
続いて、ＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ２の赤色蛍光を示す細胞において確かにＧＳＴタンパク質が発現していることを確かめるため、蛍光免疫染色を行った。具体的には、各ＧＳＴ分子種を発現させたＭＣＦ－７細胞を４％パラホルムアルデヒドＰＢＳ溶液中、室温にて１５分間固定した。その後、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含むＰＢＳ溶液で３０分間処理することにより、細胞膜透過処理を施した。そして、抗体バッファー（１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００および０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）中、室温にて１時間インキュベーションした後、抗ＦＬＡＧ－Ｍ２マウスＩｇＧ抗体（希釈倍率１：５００、シグマアルドリッチジャパン合同会社）を加え、４℃にて一晩インキュベーションした。細胞をＰＢＳで５分間インキュベートして洗浄して、余分な一次抗体を除去した（合計５回）。次いで、細胞をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７ラベルされた抗マウスＩｇＧヤギ抗体（希釈倍率１：１０００、アブカム株式会社）を含む抗体バッファー中、室温にて１時間インキュベーションした後、ＰＢＳで５分間インキュベートして洗浄して、余分な二次抗体を除去した（合計５回）。そして、細胞を褪色防止用封入剤であるＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ（登録商標）Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）含有）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に封入した。そして、共焦点レーザー走査型顕微鏡下で観察を行った。なお、本実験において、共焦点レーザー走査型顕微鏡としてはＦＬＵＯＶＩＥＷ ＦＶ１０００（オリンパス株式会社製）を用いた。また、本実験において、ＤＡＰＩ、ＤｓＲｅｄおよびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の各蛍光色素について、それぞれ４０５ｎｍ、５８３ｎｍ、および６３５ｎｍの波長のレーザー光を用いて励起し、対応したフィルタセットを用いて検出を行った。 Subsequently, fluorescent immunostaining was performed in order to confirm that the GST protein was indeed expressed in the cells exhibiting red fluorescence of DsRed Express2. Specifically, MCF-7 cells expressing each GST molecular species were fixed in a 4% paraformaldehyde PBS solution at room temperature for 15 minutes. Then, the cells were subjected to cell membrane permeabilization by treatment with a PBS solution containing 0.1% Triton X-100 for 30 minutes. and anti-FLAG-M2 mouse IgG after incubation for 1 hour at room temperature in antibody buffer (PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Triton X-100 and 0.1% sodium azide). An antibody (1:500 dilution ratio, Sigma-Aldrich Japan LLC) was added and incubated overnight at 4°C. Cells were incubated with PBS for 5 minutes and washed to remove excess primary antibody (5 times total). Cells were then incubated in antibody buffer containing AlexaFluor® 647-labeled anti-mouse IgG goat antibody (dilution 1:1000, Abcam) for 1 hour at room temperature, followed by incubation with PBS for 5 minutes. to remove excess secondary antibody (5 times total). Then, the cells were mounted in ProLong Gold (registered trademark) Antifade Reagent containing 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Thermo Fisher Scientific), which is an antifading mounting medium. Observation was then performed under a confocal laser scanning microscope. In this experiment, FLUOVIEW FV1000 (manufactured by Olympus Corporation) was used as a confocal laser scanning microscope. In this experiment, DAPI, DsRed, and AlexaFluor647 fluorochromes were excited using laser light with wavelengths of 405 nm, 583 nm, and 635 nm, respectively, and detected using corresponding filter sets.
結果を図１５に示す。ここで、図１５において、「ＤＡＰＩ」、「ＤｓＲｅｄ」、「Ａｌｅｘａ６４７」はそれぞれの蛍光色素による発光を撮影した画像であり、「Ｍｅｒｇｅ」はこれらの重ね合わせ画像である。図１５に示すように、赤色蛍光を示したすべての細胞において３ｘＦＬＡＧ－ＧＳＴが発現していることが確認された。 The results are shown in FIG. Here, in FIG. 15, "DAPI", "DsRed", and "Alexa647" are images obtained by photographing light emission by respective fluorescent dyes, and "Merge" is a superimposed image thereof. As shown in FIG. 15, it was confirmed that 3xFLAG-GST was expressed in all cells exhibiting red fluorescence.
続いて、上記で各種ＧＳＴ分子種のいずれかを発現させたＭＣＦ－７細胞に対してＰｓ－ＴＡｃをインキュベーション後、落射蛍光顕微鏡を用いて蛍光イメージングを行った。具体的には、各種ＧＳＴ分子種のそれぞれを３ｘＦＬＡＧタグ化されたｃＤＮＡとして発現させたＭＣＦ－７細胞に対し、２．５μＭのＰｓ－ＴＡｃを３７℃、５％ＣＯ２条件下で５分間インキュベーションした後に、落射型蛍光顕微鏡ＩＸ８０（オリンパス株式会社）を用いた観察によって行った。なお、プローブ由来の蛍光およびＤｓＲｅｄ由来の蛍光は、それぞれＵ－ＭＮＩＢＡフィルタセット（励起波長：４７０～４９５ｎｍ、蛍光波長：５１０～５５０ｎｍ）およびＵ－ＭＷＩＧフィルタセット（励起波長：５３０～５５０ｎｍ、蛍光波長：５７５ｎｍ以上）を用いて観察した。Subsequently, after incubating Ps-TAc with MCF-7 cells expressing any of the various GST molecular species described above, fluorescence imaging was performed using an epifluorescence microscope. Specifically, MCF-7 cells expressing each of the various GST molecular species as 3x FLAG-tagged cDNA were incubated with 2.5 μM Ps-TAc for 5 minutes at 37° C. under 5% CO 2 conditions. After that, observation was performed using an epi-illumination fluorescence microscope IX80 (Olympus Corporation). The fluorescence derived from the probe and the fluorescence derived from DsRed were obtained with a U-MNIBA filter set (excitation wavelength: 470-495 nm, fluorescence wavelength: 510-550 nm) and a U-MWIG filter set (excitation wavelength: 530-550 nm, fluorescence wavelength), respectively. : 575 nm or more).
結果を図１６に示す。ここで、図１６の「ＦＩＴＣ」は蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＡｃ）由来の緑色蛍光の画像であり、「ＤｓＲｅｄ」はＤｓＲｅｄ由来の赤色蛍光の画像であり、「Ｍｅｒｇｅ」はこれらの重ね合わせ画像である（スケールバーはいずれも２０μｍである）。また、ＧＳＴＰ１発現細胞の観察画像を拡大したものを図１７（Ａ）に示し、各画像における緑色蛍光の強度を各ＧＳＴ発現細胞間で定量化したグラフを図１７（Ｂ）に示す（測定に用いた細胞数は２０個である）。図１６および図１７に示すように、ＧＳＴＰ１発現細胞のみにおいて蛍光プローブ由来の緑色蛍光が観察され、その他のＧＳＴ分子種を発現している細胞では緑色蛍光は観察されなかった。このことから、本発明に係る蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＡｃ）は高いＧＴＳＰ１選択性を示すことが確認された。 The results are shown in FIG. Here, "FITC" in FIG. 16 is an image of green fluorescence derived from the fluorescent probe (Ps-TAc), "DsRed" is an image of red fluorescence derived from DsRed, and "Merge" is a superimposed image of these. (both scale bars are 20 μm). FIG. 17(A) shows an enlarged observation image of GSTP1-expressing cells, and FIG. The number of cells used is 20). As shown in FIGS. 16 and 17, green fluorescence derived from the fluorescent probe was observed only in GSTP1-expressing cells, and green fluorescence was not observed in cells expressing other GST molecular species. From this, it was confirmed that the fluorescent probe (Ps-TAc) according to the present invention exhibits high GTSP1 selectivity.
ところで、ＭＣＦ－７細胞においてはＧＳＴＰ１遺伝子のプロモーター領域がメチル化されており、これによってＧＳＴＰ１の発現が低いことが知られている。そこで、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤として利用されている５－アザシチジンを用いてＭＣＦ－７細胞を処理することによりＧＳＴＰ１を発現させ、このようにして発現したＧＳＴＰ１の活性をＰＳ－ＴＡｃを用いて捕えることが可能であるかどうかを検証した。 By the way, it is known that the promoter region of the GSTP1 gene is methylated in MCF-7 cells, resulting in low GSTP1 expression. Therefore, GSTP1 is expressed by treating MCF-7 cells with 5-azacytidine, which is used as a DNA methyltransferase inhibitor, and the activity of GSTP1 thus expressed is captured using PS-TAc. verified whether it is possible.
具体的には、ＭＣＦ－７細胞を播種した翌日に、培地をベヒクルまたは５μＭの５－アザシチジンを含む培地へと交換した。そして、この培地交換から３日後に０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡによって細胞を剥がし、１．０×１０５細胞／ディッシュとなるように３５ｍｍガラスボトムディッシュに細胞を播種して、５－アザシチジン処理からの時間が９６時間を超えるまで静置した。その後、細胞培養用培地を除去し、ＰＢＳ（日水製薬株式会社）で細胞を２回洗浄し、２．５μＭの蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＡｃ）および１０μｇ／ｍＬの蛍光色素Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（ＤＮＡに結合するため生細胞の核を染色可能である）を含むＨａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ，ハンクス平衡塩溶液）（和光純薬工業株式会社）を加え、３７℃にて２０分間インキュベーションした。プローブ溶液を除去し、ＰＢＳで細胞を１回洗浄した後、再びＨＢＳＳを加えて共焦点レーザー走査型顕微鏡により観察を行った。なお、共焦点レーザー走査型顕微鏡としてはＦＬＵＯＶＩＥＷ ＦＶ１０ｉ－ＤＯＣ（オリンパス株式会社製）を用い、蛍光プローブの蛍光は波長４７３ｎｍのＬＤレーザーにより励起させ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８の蛍光は波長４０５ｎｍのＬＤレーザーにより励起させて、対応する蛍光スペクトルにおける蛍光画像を取得した。Specifically, the day after MCF-7 cells were seeded, the medium was changed to vehicle or medium containing 5 μM 5-azacytidine. Three days after this medium exchange, the cells were detached with 0.25% trypsin-EDTA, and the cells were seeded on a 35 mm glass bottom dish at 1.0×10 5 cells/dish. was allowed to stand until the time exceeded 96 hours. Thereafter, the cell culture medium was removed, the cells were washed twice with PBS (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), 2.5 μM of the fluorescent probe (Ps-TAc) and 10 μg/mL of the fluorescent dye Hoechst33258 (which binds to DNA). Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS, Hanks' Balanced Salt Solution) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing nuclei of living cells can be stained because of the nuclei of living cells) was added and incubated at 37°C for 20 minutes. After removing the probe solution and washing the cells once with PBS, HBSS was added again and observed with a confocal laser scanning microscope. As a confocal laser scanning microscope, FLUOVIEW FV10i-DOC (manufactured by Olympus Corporation) was used, the fluorescence of the fluorescent probe was excited by an LD laser with a wavelength of 473 nm, and the fluorescence of Hoechst33258 was excited by an LD laser with a wavelength of 405 nm. , acquired fluorescence images in the corresponding fluorescence spectra.
結果を図１８に示す。ここで、図１８（Ａ）は上記の処理を施したＭＣＦ－７細胞のイメージング画像であり、図１８（Ｂ）はコントロール群および５－アザシチジン投与群のそれぞれからランダムに抽出した６０個ずつの細胞における蛍光強度の分布を示す図である。図１８に示すように、コントロール群では蛍光プローブに由来する強蛍光性の細胞が観察されなかったのに対し、５－アザシチジン投与群では非常に高い蛍光強度を示す細胞が観察された。この結果は、５－アザシチジンの投与によってＤＮＡメチルトランスフェラーゼが阻害され、ＭＣＦ－７細胞におけるＧＳＴＰ１遺伝子のプロモーター領域のメチル化が解除される結果、ＧＳＴＰ１遺伝子の発現が誘導されたことによるものと推定された。 The results are shown in FIG. Here, FIG. 18(A) is an imaging image of MCF-7 cells subjected to the above treatment, and FIG. FIG. 4 is a diagram showing the distribution of fluorescence intensity in cells; As shown in FIG. 18, no strongly fluorescent cells derived from the fluorescent probe were observed in the control group, whereas cells exhibiting extremely high fluorescence intensity were observed in the 5-azacytidine-administered group. This result is presumed to be due to the fact that the administration of 5-azacytidine inhibited DNA methyltransferase and demethylated the promoter region of the GSTP1 gene in MCF-7 cells, resulting in the induction of GSTP1 gene expression. rice field.
そこで、この仮説を検証することを目的として、５μＭの５－アザシチジンを培地中へ加えて処理したＭＣＦ－７細胞に対して、さらにｓｉＲＮＡを投与することでＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）を行い、ＧＳＴＰ１の発現を抑制することを試みた。具体的には、上記で強蛍光性の細胞が観察された５－アザシチジン投与群のＭＣＦ－７細胞に対し、３０ｐｍｏｌのコントロールｓｉＲＮＡまたはＧＳＴＰ１ ｓｉＲＮＡ（インビトロジェン社製）のそれぞれを４μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて細胞へ導入した。ｓｉＲＮＡの導入から２４時間後以降、細胞を０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡによって剥がし、全細胞を６～１０ｍＬのＤＭＥＭに懸濁し、３５ｍｍガラスボトムディッシュに再播種して、再播種からさらに２４時間後以降に上記と同様の手法により共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて観察を行った。Therefore, for the purpose of verifying this hypothesis, RNAi (RNA interference) was performed by further administering siRNA to MCF-7 cells treated by adding 5 μM 5-azacytidine to the medium, and GSTP1. An attempt was made to suppress the expression. Specifically, 4 μL of each of 30 pmol of control siRNA or GSTP1 siRNA (manufactured by Invitrogen) and 4 μL of Lipofectamine ™ RNAiMAX Transfection were applied to MCF-7 cells of the 5-azacytidine administration group in which cells with strong fluorescence were observed above. It was introduced into cells using Reagent (Thermo Fisher Scientific). After 24 hours post-siRNA introduction, cells were detached with 0.25% trypsin-EDTA, whole cells were suspended in 6-10 mL DMEM and replated in 35 mm glass bottom dishes for another 24 hrs after replating. Observation was then carried out using a confocal laser scanning microscope in the same manner as above.
結果を図１９に示す。ここで、図１９（Ａ）は上記の処理を施したＭＣＦ－７細胞のイメージング画像であり、このうち「Ｍｅｒｇｅ（×１０）」は「Ｍｅｒｇｅ」画像の１０倍拡大画像である。また、図１９（Ｂ）はコントロールｓｉＲＮＡ投与群およびＧＳＴＰ１ ｓｉＲＮＡ投与群のそれぞれからランダムに抽出した６０個ずつの細胞における蛍光強度の分布を示す図である。図１９に示すように、ＧＳＴＰ１ ｓｉＲＮＡ投与群においては、蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＡｃ）由来の蛍光強度の顕著な減少が観察された。このことから、本発明に係る蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＡｃ）を用いることで、ＧＳＴＰ１遺伝子のプロモーター領域の脱メチル化に基づくＧＳＴＰ１タンパク質発現の有無を検出することが可能であることが示された。なお、正常上皮細胞においてはＧＳＴＰ１が発現しているが、がん化によってＧＳＴＰ１遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧ部分がメチル化されることでＧＳＴＰ１の発現が見られなくなることが知られている。したがって、本発明に係る蛍光プローブをそのような系へ適用することができれば、蛍光の有無を指標として、前立腺がん細胞（ＧＳＴＰ１が過剰発現していない）の検出を行うことも可能であると考えられる。 The results are shown in FIG. Here, FIG. 19(A) is an imaging image of MCF-7 cells subjected to the above processing, of which "Merge (×10)" is a 10-fold enlarged image of the "Merge" image. FIG. 19(B) is a diagram showing the distribution of fluorescence intensity in 60 cells randomly extracted from each of the control siRNA-administered group and the GSTP1 siRNA-administered group. As shown in FIG. 19, a marked decrease in fluorescence intensity derived from the fluorescent probe (Ps-TAc) was observed in the GSTP1 siRNA-administered group. From this, it was shown that the presence or absence of GSTP1 protein expression based on demethylation of the promoter region of the GSTP1 gene can be detected by using the fluorescent probe (Ps-TAc) according to the present invention. Although GSTP1 is expressed in normal epithelial cells, it is known that the expression of GSTP1 is lost due to methylation of the CpG portion of the promoter region of the GSTP1 gene due to carcinogenesis. Therefore, if the fluorescent probe according to the present invention can be applied to such a system, it will be possible to detect prostate cancer cells (not overexpressing GSTP1) using the presence or absence of fluorescence as an index. Conceivable.
さらに、がん細胞に発現する内在性のＧＳＴＰ１の発現を可視化することが可能かどうか評価することを目的として、ＧＳＴＰ１を発現している繊維芽肉腫由来細胞であるＨＴ１０８０細胞に対して本発明に係る蛍光プローブ（ＰＳ－ＴＡｃ）を適用した。この際、ＧＳＴＰ１特異性を調べることを目的として、上記と同様にｓｉＲＮＡをトランスフェクションして、ＨＴ１０８０細胞においてもＧＳＴＰ１がノックダウンされるかどうかの確認も併せて行った。 Furthermore, for the purpose of evaluating whether it is possible to visualize the expression of endogenous GSTP1 expressed in cancer cells, the present invention was applied to HT1080 cells, fibrosarcoma-derived cells expressing GSTP1. A corresponding fluorescent probe (PS-TAc) was applied. At this time, for the purpose of examining GSTP1 specificity, siRNA was transfected in the same manner as described above to confirm whether GSTP1 was also knocked down in HT1080 cells.
具体的には、６ウェルプレートに２．０×１０５細胞／ウェルとなるようにＨＴ１０８０細胞を播種した翌日、３０ｐｍｏｌのコントロールｓｉＲＮＡまたはＧＳＴＰ１ ｓｉＲＮＡ（インビトロジェン社製）のそれぞれを４μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて細胞へ導入した。ｓｉＲＮＡの導入から２４時間後以降、細胞を０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡによって剥がし、全細胞を６～１０ｍＬのＤＭＥＭに懸濁し、３５ｍｍガラスボトムディッシュに再播種して、再播種からさらに２４時間後以降に上記と同様の手法により共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて観察を行った。また、やはり上記と同様の手法により、ウエスタンブロッティングによってＧＳＴＰ１のノックダウンを確認した。Specifically, the day after HT1080 cells were seeded in a 6-well plate at 2.0×10 5 cells/well, 30 pmol of control siRNA or GSTP1 siRNA (manufactured by Invitrogen) was added to 4 μL of Lipofectamine ™ RNAiMAX Transfection. It was introduced into cells using Reagent (Thermo Fisher Scientific). After 24 hours post-siRNA introduction, cells were detached with 0.25% trypsin-EDTA, whole cells were suspended in 6-10 mL DMEM and replated in 35 mm glass bottom dishes for another 24 hrs after replating. Observation was then carried out using a confocal laser scanning microscope in the same manner as above. In addition, GSTP1 knockdown was confirmed by Western blotting using the same method as above.
結果を図２０に示す。ここで、図２０（Ａ）はウエスタンブロッティングの結果を示す電気泳動写真である。また、図２０（Ｂ）は上記の処理を施したＨＴ１０８０細胞のイメージング画像であり、このうち「Ｍｅｒｇｅ（ｗｉｄｅ ｆｉｅｌｄ）」は「Ｍｅｒｇｅ」画像の６倍拡大画像である。さらに、図２０（Ｃ）はコントロールｓｉＲＮＡ投与群およびＧＳＴＰ１ ｓｉＲＮＡ投与群のそれぞれからランダムに抽出した６０個ずつの細胞における蛍光強度の分布を示す図である。そして、図２０（Ｄ）はコントロールｓｉＲＮＡおよびＧＳＴＰ１ ｓｉＲＮＡをそれぞれ投与した細胞群におけるＰｓ－ＴＡｃの投与前並びに投与後６分、１０分および１５分経過後のイメージング画像（ｍｅｒｇｅ（ｗｉｄｅ ｆｉｅｌｄ）に対応）である。図２０（Ａ）に示す結果から、ＨＴ１０８０細胞において発現している内因性ＧＳＴＰ１の活性もまた、ＧＳＴＰ１ ｓｉＲＮＡの投与によってノックダウンを受けることが確認された。また、図２０の（Ｂ）および（Ｃ）に示すように、ＨＴ１０８０細胞においても、コントロールｓｉＲＮＡ投与群では蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＡｃ）由来の蛍光が観察され、この蛍光はＧＳＴＰ１ ｓｉＲＮＡの投与によって大きく減弱した。さらに、図２０（Ｄ）に示すように、本発明の蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＡｃ）の投与によって蛍光強度は時間依存的な上昇を示したが、その一方でＧＳＴＰ１ ｓｉＲＮＡの投与により、この蛍光強度の上昇は抑制された。 The results are shown in FIG. Here, FIG. 20(A) is an electrophoresis photograph showing the results of Western blotting. FIG. 20(B) is an imaging image of HT1080 cells subjected to the above processing, of which "Merge (wide field)" is a 6-fold enlarged image of the "Merge" image. Furthermore, FIG. 20(C) shows the fluorescence intensity distribution in 60 cells randomly extracted from each of the control siRNA-administered group and the GSTP1 siRNA-administered group. And FIG. 20(D) corresponds to imaging images (merge (wide field)) before administration of Ps-TAc and after 6, 10 and 15 minutes after administration in the cell groups to which control siRNA and GSTP1 siRNA were administered, respectively. ). The results shown in FIG. 20(A) confirmed that the activity of endogenous GSTP1 expressed in HT1080 cells was also knocked down by administration of GSTP1 siRNA. In addition, as shown in (B) and (C) of FIG. 20, fluorescence derived from the fluorescent probe (Ps-TAc) was also observed in the control siRNA-administered group in HT1080 cells, and this fluorescence was increased by the administration of GSTP1 siRNA. diminished. Furthermore, as shown in FIG. 20(D), administration of the fluorescent probe (Ps-TAc) of the present invention showed a time-dependent increase in fluorescence intensity, while administration of GSTP1 siRNA reduced this fluorescence intensity. rise was restrained.
以上の結果から、本発明に係る蛍光プローブ（Ｐｓ－ＴＡｃなど）は、内在的にＧＳＴＰ１を発現するがん細胞においても、その活性を検出することが可能な蛍光プローブであることが確認された。 From the above results, it was confirmed that the fluorescent probe (Ps-TAc, etc.) according to the present invention is a fluorescent probe capable of detecting the activity even in cancer cells endogenously expressing GSTP1. .
続いて、Ｐｓ－ＴＡｃが様々ながん細胞のＧＳＴＰ１活性を捉えることができるか、また、ＧＳＴＰ１の発現の有無を評価できるか明らかとするために、Ｐｓ－ＴＡｃを各種がん細胞へ投与し、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。 Subsequently, Ps-TAc was administered to various cancer cells in order to clarify whether Ps-TAc can capture the GSTP1 activity of various cancer cells and whether the presence or absence of GSTP1 expression can be evaluated. , observed with a confocal laser microscope.
具体的には、まず、細胞を１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８を含むハンクス緩衝液中、３７℃にて、２０分間培養した。その後、培地を取り除き、リン酸ナトリウム緩衝液にて、細胞を洗浄した。続いて、２μＭのＰｓ－ＴＡｃを含むハンクス緩衝液を加え、さらに１５分間室温で培養した後、共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス）において、蛍光イメージングを行った。共焦点レーザー走査型顕微鏡としてはＦＬＵＯＶＩＥＷ ＦＶ１０ｉ－ＤＯＣ（オリンパス株式会社製）を用い、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８の蛍光は波長４０５ｎｍのＬＤレーザー、蛍光プローブの蛍光は波長４７３ｎｍのＬＤレーザーにより励起させ、それぞれ対応する蛍光スペクトルにおける蛍光画像を取得した。本実験では、ＧＳＴＰ１陽性細胞として、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９（大腸がん細胞）、ＨｕＣＣＴ１（胆管がん細胞）、ＤＵ１４５（前立腺がん細胞）、ＨＴ１０８０（線維肉腫細胞）を用い、また、ＧＳＴＰ１陰性細胞として、ＭＣＦ７（乳がん細胞）およびＬＮＣａＰ（前立腺がん細胞）を用いた。 Specifically, the cells were first incubated in Hank's buffer containing 10 μg/mL Hoechst 33258 at 37° C. for 20 minutes. After that, the medium was removed, and the cells were washed with a sodium phosphate buffer. Subsequently, Hank's buffer solution containing 2 μM Ps-TAc was added, and the cells were further incubated at room temperature for 15 minutes, followed by fluorescence imaging with a confocal laser microscope (Olympus). As a confocal laser scanning microscope, FLUOVIEW FV10i-DOC (manufactured by Olympus Corporation) was used. Fluorescence images in the spectrum were acquired. In this experiment, HCT116, HT29 (colorectal cancer cells), HuCCT1 (cholangiocarcinoma cells), DU145 (prostate cancer cells), and HT1080 (fibrosarcoma cells) were used as GSTP1-positive cells. , MCF7 (breast cancer cells) and LNCaP (prostate cancer cells) were used.
結果を図２１に示す。なお、図２１に示す写真のうち、各細胞に対応する上段の写真は蛍光画像であり、下段の写真は白色光（ＢＦ）画像であり、ともに共焦点レーザー顕微鏡を用いて撮像したものである。図２１に示すように、細胞種によって蛍光強度、蛍光性生成物の細胞内分布などが異なるものの、本実験において用いた全てのＧＳＴＰ１発現細胞で、細胞内において蛍光を確認することができた。一方、ＧＳＴＰ１非発現細胞では、蛍光強度上昇が見られなかった。 The results are shown in FIG. Among the photographs shown in FIG. 21, the upper photograph corresponding to each cell is a fluorescence image, and the lower photograph is a white light (BF) image, both taken using a confocal laser microscope. . As shown in FIG. 21, intracellular fluorescence could be confirmed in all GSTP1-expressing cells used in this experiment, although fluorescence intensity, intracellular distribution of fluorescent products, etc. differed depending on the cell type. On the other hand, no increase in fluorescence intensity was observed in GSTP1 non-expressing cells.
［蛍光プローブの合成（３）］
上記とは異なる蛍光団を有する蛍光プローブの作製を試みた（下記の反応スキーム６）。[Synthesis of fluorescent probe (3)]
An attempt was made to prepare a fluorescent probe with a different fluorophore (
（化合物（ｇ）の合成；２－（４－アミノフェニル）－６－ブロモ－１Ｈ－ベンゾ［デ］イソキノリン－１，３（２Ｈ）－ジオン）
４－ブロモ－１，８－ナフタル酸無水物（５０５．３ｍｇ，１．８ｍｍｏｌ）と１，４－ジアミノベンゼン（２４７．２ｍｇ，２．３ｍｍｏｌ）をエタノール（６．０ｍＬ）に懸濁させ、１０時間加熱還流を行なった。反応液を室温まで冷却し、沈殿を濾取し、目的化合物を収率９１％（６０９．８ｍｇ，１．６ｍｍｏｌ）で得た。(Synthesis of compound (g); 2-(4-aminophenyl)-6-bromo-1H-benzo[de]isoquinoline-1,3(2H)-dione)
4-Bromo-1,8-naphthalic anhydride (505.3 mg, 1.8 mmol) and 1,4-diaminobenzene (247.2 mg, 2.3 mmol) were suspended in ethanol (6.0 mL). Heated to reflux for 1 hour. The reaction solution was cooled to room temperature, and the precipitate was collected by filtration to obtain the target compound with a yield of 91% (609.8 mg, 1.6 mmol).
（化合物（ｇ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ８．５３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），８．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８），８．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８），７．９８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０），６．９４（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．６，２．１），６．６４（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．６，２．１），５．２６（２Ｈ，ｓ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１６３．４，１６３．７，１４８．６，１３２．５，１３１．５，１３１．３，１３０．９，１２９．８，１２９．１，１２８．９，１２８．８，１２８．６，１２３．４，１２２．７，１１３．７
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ） ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１８Ｈ１２Ｎ２Ｏ２Ｂｒ［Ｍ＋Ｈ］＋：３６７．００８２，ｆｏｕｎｄ；３６７．００７８（－０．４ｍｍｕ）。(Instrumental data of compound (g))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.53 (2H, d, J = 8.2), 8.29 (1H, d, J = 7.8), 8.20 (1H, d, J = 7.8), 7.98 (1H, t, J = 8.0), 6.94 (2H, dd, J = 6.6, 2.1), 6.64 (2H, dd, J = 6.6, 2.1), 5.26 (2H, s)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ 163.4, 163.7, 148.6, 132.5, 131.5, 131.3, 130.9, 129.8, 129.1, 128. 9, 128.8, 128.6, 123.4, 122.7, 113.7
HRMS (ESI-TOF) m /z calcd for C18H12N2O2Br [M + H] + : 367.0082 , found; 367.0078 (-0.4 mmu).
（化合物（ｈ）の合成；２－（４－アミノフェニル）－６－（アゼチジン－１－イル）－１Ｈ－ベンゾ［デ］イソキノリン－１，３（２Ｈ）－ジオン）
化合物（ｇ）（２００．０ｍｇ，０．５４ｍｍｏｌ）とアゼチジン塩酸塩（１５３．１ｍｇ，１．６ｍｍｏｌ）と炭酸セシウム（５６２．４ｍｇ，１．７ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（３．０ｍＬ）に懸濁させ、８０℃で８時間撹拌した。反応液を室温まで冷却し、水（１００ｍＬ）に注ぎ、沈殿を濾取し、目的化合物を収率９２％で得た。(Synthesis of compound (h); 2-(4-aminophenyl)-6-(azetidin-1-yl)-1H-benzo[de]isoquinoline-1,3(2H)-dione)
Compound (g) (200.0 mg, 0.54 mmol), azetidine hydrochloride (153.1 mg, 1.6 mmol) and cesium carbonate (562.4 mg, 1.7 mmol) were suspended in dimethylsulfoxide (3.0 mL). , and stirred at 80° C. for 8 hours. The reaction solution was cooled to room temperature, poured into water (100 mL), and the precipitate was collected by filtration to obtain the target compound with a yield of 92%.
（化合物（ｈ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ８．４１（２Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝７．９，１．１），８．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７），７．６２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，７．３），６．８６（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．６，２．１），６．６１（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．６，２．１），６．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７），５．２０（２Ｈ，ｓ），４．５０（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３），２．５３（２Ｈ，ｓ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１６４．２，１６３．４，１５２．３，１４８．２，１３２．８，１３０．８，１３０．３，１２９．２，１２４．３，１２４．０，１２２．３，１２０．３，１１３．７，１０８．９，１０６．１，５５．２，４０．１，１６．５
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ） ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２１Ｈ１８Ｎ３Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋：３４４．１３９９，ｆｏｕｎｄ；３４４．１３９４（－０．５ｍｍｕ）。(Instrumental data of compound (h))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.41 (2H, td, J = 7.9, 1.1), 8.20 (1H, d, J = 8.7), 7.62 ( 1H, dd, J = 8.2, 7.3), 6.86 (2H, dd, J = 6.6, 2.1), 6.61 (2H, dd, J = 6.6, 2. 1), 6.50 (1H, d, J = 8.7), 5.20 (2H, s), 4.50 (4H, t, J = 7.3), 2.53 (2H, s)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ 164.2, 163.4, 152.3, 148.2, 132.8, 130.8, 130.3, 129.2, 124.3, 124. 0, 122.3, 120.3, 113.7, 108.9, 106.1, 55.2, 40.1, 16.5
HRMS (ESI - TOF) m/z calcd for C21H18N3O2 [M + H] + : 344.1399 , found; 344.1394 (-0.5 mmu).
（Ｐｓ－Ｎａｐｈの合成；Ｎ－（４－（６－アゼチジン－１－イル）－１，３－ジオキソ－１Ｈ－ベンゾ［デ］イソキノリン－２（３Ｈ）－イル）フェニル）－５－（メチルスルホニル）－２－ニトロベンズアミド）
化合物（ｈ）（９．６ｍｇ，０．０２８ｍｍｏｌ）と５－メシル－２－ニトロ安息香酸（４．９ｍｇ，０．０２３ｍｍｏｌ）、ＷＳＣＤ・ＨＣｌ（７．４ｍｇ，０．０３９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２ｍＬ）とクロロホルム（２ｍＬ）の混合溶媒に懸濁し、室温にて２時間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加え、０．１Ｎ ＨＣｌで２回、飽和炭酸水素ナトリウムで１回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。残渣をアセトニトリル（３ｍＬ）に溶解させて、水（１０ｍＬ）に滴下し、沈殿を濾取した。得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／酢酸エチル＝４：１）で精製し、目的化合物（Ｐｓ－Ｎａｐｈ）を収率２０％で得た（２．６ｍｇ，０．００４６ｍｍｏｌ）。(Synthesis of Ps-Naph; N-(4-(6-azetidin-1-yl)-1,3-dioxo-1H-benzo[de]isoquinolin-2(3H)-yl)phenyl)-5-(methyl sulfonyl)-2-nitrobenzamide)
Compound (h) (9.6 mg, 0.028 mmol), 5-mesyl-2-nitrobenzoic acid (4.9 mg, 0.023 mmol), WSCD·HCl (7.4 mg, 0.039 mmol) in acetonitrile (2 mL) and chloroform (2 mL), and stirred at room temperature for 2 hours. Ethyl acetate was added to the reaction solution, and the mixture was washed twice with 0.1N HCl, once with saturated sodium hydrogen carbonate, and once with saturated brine. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. The residue was dissolved in acetonitrile (3 mL), added dropwise to water (10 mL) and the precipitate collected by filtration. The resulting solid was purified by silica gel column chromatography (chloroform/ethyl acetate=4:1) to obtain the target compound (Ps-Naph) with a yield of 20% (2.6 mg, 0.0046 mmol).
（Ｐｓ－Ｎａｐｈの機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ９．１７（１Ｈ，ｓ），８．５１－８．４４（２Ｈ，ｍ），８．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝０．９），８．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７），８．２６－８．２２（２Ｈ，ｍ），７．７８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９），７．３１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），６．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），４．５５（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５），２．５４（２Ｈ，ｑｕｉｎ）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ） ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２９Ｈ２３Ｎ４Ｏ７Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋：５７１．１２８７，ｆｏｕｎｄ；５７１．１２８８（＋０．１ｍｍｕ）。(Equipment data of Ps-Naph)
1 H-NMR (400 MHz, CD 3 CN) δ 9.17 (1H, s), 8.51-8.44 (2H, m), 8.35 (1H, d, J=0.9), 8. 31 (1H, d, J = 8.7), 8.26-8.22 (2H, m), 7.78 (2H, d, J = 6.9), 7.31 (2H, d, J = 8.2), 6.50 (1H, d, J = 8.2), 4.55 (4H, t, J = 7.5), 2.54 (2H, quin)
HRMS (ESI - TOF) m/z calcd for C29H23N4O7S [M+H] + : 571.1287 , found; 571.1288 (+0.1 mmu).
［蛍光プローブの分光学的特性の評価（３）］
まず、２．５μＭのＰｓ－Ｎａｐｈ（図２２の（Ａ））を１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ ０．１％を共溶媒として含む）に溶解し、反応前の蛍光スペクトルを測定した。なお、蛍光スペクトルの測定には、蛍光分光光度計（ＲＦ－５３００ＰＣ；株式会社島津製作所製）を用いた。また、２．５μＭのＰｓ－Ｎａｐｈを１ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）および３μｇ／ｍＬのグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴＰ１－１）を含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ １％を共溶媒として含む）中、室温（２５℃）にて撹拌しながら２時間反応させた。その後、上記と同様にして反応後の蛍光スペクトルを測定した。[Evaluation of spectroscopic properties of fluorescent probe (3)]
First, 2.5 μM Ps-Naph ((A) in FIG. 22) was dissolved in 100 mM phosphate buffer (pH 7.4; containing 0.1% DMSO as a co-solvent), and the fluorescence spectrum before the reaction was measured. . A fluorescence spectrophotometer (RF-5300PC; manufactured by Shimadzu Corporation) was used to measure the fluorescence spectrum. In addition, 2.5 μM Ps-Naph, 1 mM reduced glutathione (GSH) and 3 μg/mL glutathione-S-transferase (GSTP1-1) in 100 mM phosphate buffer (pH 7.4;
Ｐｓ－Ｎａｐｈについての蛍光スペクトルの測定結果を図２２の（Ｂ）に示す。図２２の（Ｂ）に示す結果からわかるように、Ｐｓ－Ｎａｐｈは反応の前後で５５５ｎｍにおいて約２５倍の蛍光強度上昇を示した。 FIG. 22B shows the fluorescence spectrum measurement results for Ps-Naph. As can be seen from the results shown in FIG. 22(B), Ps-Naph exhibited an approximately 25-fold increase in fluorescence intensity at 555 nm before and after the reaction.
［蛍光プローブの合成（４）］
上記とはさらに異なる蛍光団を有する蛍光プローブの作製を試みた（下記の反応スキーム７）。[Synthesis of fluorescent probe (4)]
An attempt was made to prepare a fluorescent probe having a fluorophore different from that described above (Reaction Scheme 7 below).
（化合物（ｉ）の合成；５（６）－アミノフルオレセイン）
４－ニトロフタル酸無水物（１．０２ｇ，５．３ｍｍｏｌ）とレゾルシノール（１．３２ｇ，１２．０ｍｍｏｌ）をメタンスルホン酸（１０ｍＬ）に懸濁し、８０℃にて一晩撹拌した。反応液を室温まで冷却し、氷水に注いだ。氷上にて、１０Ｎ ＮａＯＨを用いて、その懸濁液のｐＨを１４にして沈殿を溶解させた後、濃塩酸を用いて、その溶液のｐＨを３にし、生成した沈殿を回収した。硫化ナトリウム９水和物（２．４２ｇ）を溶解した精製水（４０ｍＬ）に沈殿を溶解させて、６０℃にて２時間撹拌した。反応溶液を室温まで冷却し、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液に注いだ。酢酸エチルで分液し、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液で２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝１：２から１：１）で精製し、目的化合物（５，６－異性体混合物）を収率７８％（１．４３ｇ，４．１２ｍｍｏｌ）で得た。(Synthesis of compound (i); 5(6)-aminofluorescein)
4-Nitrophthalic anhydride (1.02 g, 5.3 mmol) and resorcinol (1.32 g, 12.0 mmol) were suspended in methanesulfonic acid (10 mL) and stirred at 80° C. overnight. The reaction solution was cooled to room temperature and poured into ice water. On ice, the pH of the suspension was adjusted to 14 using 10N NaOH to dissolve the precipitate, then the pH of the solution was adjusted to 3 using concentrated hydrochloric acid, and the precipitate formed was collected. The precipitate was dissolved in purified water (40 mL) containing sodium sulfide nonahydrate (2.42 g) and stirred at 60° C. for 2 hours. The reaction solution was cooled to room temperature and poured into a saturated sodium dihydrogen phosphate aqueous solution. The mixture was separated with ethyl acetate, washed twice with a saturated aqueous sodium dihydrogen phosphate solution, and washed once with a saturated saline solution. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. The residue was purified by silica gel column chromatography (chloroform/methanol=1:2 to 1:1) to obtain the target compound (5,6-isomer mixture) with a yield of 78% (1.43 g, 4.12 mmol). rice field.
（化合物（ｉ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ７．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），６．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８），６．９４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．１），６．８５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），６．７３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８），６．６５－６．６２（６Ｈ，ｍ），６．５９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７），６．５７－６．５０（４Ｈ，ｍ），６．２４（２Ｈ，ｓ），６．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８），５．７３（２Ｈ，ｓ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１６９．４，１６９．０，１５９．２，１５９．１，１５６．３，１５５．５，１５１．９，１５１．５，１５０．５，１３９．７，１２９．０，１２９．０，１２７．５，１２５．９，１２４．１，１２１．７，１１５．４，１１２．５，１１２．４，１１２．１，１１０．７，１１０．６，１０６．１，１０５．５，１０２．１，１０２．０，８２．７，８０．６
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ） ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２０Ｈ１４ＮＯ５［Ｍ＋Ｈ］＋：３４８．０８７２，ｆｏｕｎｄ；３４８．０８６８（－０．４ｍｍｕ）。(Instrument data of compound (i))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.55 (1H, d, J = 8.2), 6.97 (1H, d, J = 1.8), 6.94 (1H, dd, J = 8.5, 2.1), 6.85 (1H, d, J = 8.2), 6.73 (1H, dd, J = 8.2, 1.8), 6.65-6 .62 (6H, m), 6.59 (2H, d, J = 8.7), 6.57-6.50 (4H, m), 6.24 (2H, s), 6.08 (1H , d, J=1.8), 5.73 (2H, s)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ 169.4, 169.0, 159.2, 159.1, 156.3, 155.5, 151.9, 151.5, 150.5, 139. 7, 129.0, 129.0, 127.5, 125.9, 124.1, 121.7, 115.4, 112.5, 112.4, 112.1, 110.7, 110.6, 106.1, 105.5, 102.1, 102.0, 82.7, 80.6
HRMS (ESI-TOF) m/z calcd for C20H14NO5 [M+H] + : 348.0872 , found; 348.0868 (-0.4 mmu).
（化合物（ｊ）の合成；５（６）－アミノフルオレセインジアセテート）
化合物（ｉ）（５，６－異性体混合物）（２２２．２ｍｇ，０．６４ｍｍｏｌ）、無水酢酸（１２１μＬ，１．２８ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（２２３μＬ，１．２８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２．０ｍＬ）に溶解させ、４℃にて２時間攪拌した。反応溶液を酢酸エチルと飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液で分液し、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液で２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１：２）で精製し、目的化合物（５，６－異性体混合物）を収率７３％（２０２．８ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ）で得た。(Synthesis of compound (j); 5(6)-aminofluorescein diacetate)
Dissolve compound (i) (5,6-isomer mixture) (222.2 mg, 0.64 mmol), acetic anhydride (121 μL, 1.28 mmol), DIEA (223 μL, 1.28 mmol) in DMF (2.0 mL) and stirred at 4° C. for 2 hours. The reaction solution was partitioned between ethyl acetate and a saturated sodium dihydrogen phosphate aqueous solution, and washed twice with a saturated sodium dihydrogen phosphate aqueous solution and once with a saturated saline solution. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. The residue was purified by silica gel column chromatography (hexane/ethyl acetate=1:2) to obtain the target compound (5,6-isomer mixture) with a yield of 73% (202.8 mg, 0.47 mmol).
（化合物（ｊ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），７．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．４），７．１８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８），７．０６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３），７．０４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３），６．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），６．９５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７），６．８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７），６．８２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３），６．８０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３），６．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３），６．７６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８），６．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３），２．３１（６Ｈ，ｓ），２．３０（６Ｈ，ｓ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６９．４，１６９．０，１６８．９，１６８．９，１５６．３，１５３．０，１５１．９，１５１．８，１５１．６，１５１．３，１２９．１，１２７．８，１２６．８，１２５．０，１２４．４，１１７．６，１１７．０，１１６．７，１１６．５，１１５．０，１１０．３，１１０．１，１０７．５，８１．８，８０．２，７７．３，７７．０，７６．７，２１．１
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ） ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２４Ｈ１８ＮＯ７［Ｍ＋Ｈ］＋：４３２．１０８３，ｆｏｕｎｄ；４３２．１０８３（＋０．０ｍｍｕ）。(Instrumental data of compound (j))
1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 7.74 (1H, d, J = 8.2), 7.46 (1H, d, J = 1.4), 7.18 (1H, dd, J = 8.2, 1.8), 7.06 (2H, d, J = 2.3), 7.04 (2H, d, J = 2.3), 6.99 (1H, d, J = 8 .2), 6.95 (2H, d, J = 8.7), 6.86 (2H, d, J = 8.7), 6.82 (2H, d, J = 2.3), 6 .80 (2H,d,J=2.3), 6.78 (1H,d,J=2.3), 6.76 (1H,dd,J=8.2,1.8),6. 23 (1H, d, J = 2.3), 2.31 (6H, s), 2.30 (6H, s)
13 C-NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ 169.4, 169.0, 168.9, 168.9, 156.3, 153.0, 151.9, 151.8, 151.6, 151.3, 129.1, 127.8, 126.8, 125.0, 124.4, 117.6, 117.0, 116.7, 116.5, 115.0, 110.3, 110.1, 107. 5, 81.8, 80.2, 77.3, 77.0, 76.7, 21.1
HRMS (ESI-TOF) m/z calcd for C24H18NO7 [M+H] + : 432.1083 , found; 432.1083 (+0.0mmu).
（化合物（ｋ）の合成；５－（５－（メチルスルホニル）－２－ニトロベンズアミド）－３－オキソ－３Ｈ－スピロ［イソベンゾフラン－１，９’－キサンテン］－３’，６’－ジイルジアセテート）
化合物（ｊ）（５，６－異性体混合物）（１００．６ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）、５－メシル－２－ニトロ安息香酸（４４．９ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）、ＷＳＣＤ・ＨＣｌ（５２．１ｍｇ，０．２７ｍｍｏｌ）をアセトニトリルに懸濁させ、室温で１時間攪拌した。反応溶液を酢酸エチルと飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液で分液し、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液で２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１：２）で精製し、目的化合物を収率４２％（６４．４ｍｇ，０．０９８ｍｍｏｌ）で得た。(Synthesis of compound (k); 5-(5-(methylsulfonyl)-2-nitrobenzamido)-3-oxo-3H-spiro[isobenzofuran-1,9′-xanthene]-3′,6′-diyl diacetate)
Compound (j) (5,6-isomer mixture) (100.6 mg, 0.23 mmol), 5-mesyl-2-nitrobenzoic acid (44.9 mg, 0.21 mmol), WSCD·HCl (52.1 mg, 0.27 mmol) was suspended in acetonitrile and stirred at room temperature for 1 hour. The reaction solution was partitioned between ethyl acetate and a saturated sodium dihydrogen phosphate aqueous solution, and washed twice with a saturated sodium dihydrogen phosphate aqueous solution and once with a saturated saline solution. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. The residue was purified by silica gel column chromatography (hexane/ethyl acetate=1:2) to obtain the target compound with a yield of 42% (64.4 mg, 0.098 mmol).
（化合物（ｋ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１１．４１（１Ｈ，ｓ），８．４６－８．３９（３Ｈ，ｍ），８．３３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．１），７．９２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８），７．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），７．２９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．４），６．９４－６．７０（４Ｈ，ｍ），３．４２（３Ｈ，ｓ），２．２９（６Ｈ，ｓ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１６９．４，１６９．０，１６８．９，１６８．９，１５６．３，１５３．０，１５１．９，１５１．８，１５１．６，１５１．３，１２９．１，１２７．８，１２６．８，１２５．０，１２４．４，１１７．６，１１７．０，１１６．７，１１６．５，１１５．０，１１０．３，１１０．１，１０７．５，８１．８，８０．２，７７．３，７７．０，７６．７，２１．１
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ） ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３２Ｈ２３Ｎ２Ｏ１２Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋：６５９．０９７２，ｆｏｕｎｄ；６５９．０９７４（＋０．２ｍｍｕ）。(Instrumental data of compound (k))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 11.41 (1H, s), 8.46-8.39 (3H, m), 8.33 (1H, dd, J = 8.5, 2. 1), 7.92 (1H, dd, J = 8.2, 1.8), 7.45 (1H, d, J = 8.2), 7.29 (2H, d, J = 1.4 ), 6.94-6.70 (4H, m), 3.42 (3H, s), 2.29 (6H, s)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ 169.4, 169.0, 168.9, 168.9, 156.3, 153.0, 151.9, 151.8, 151.6, 151. 3, 129.1, 127.8, 126.8, 125.0, 124.4, 117.6, 117.0, 116.7, 116.5, 115.0, 110.3, 110.1, 107.5, 81.8, 80.2, 77.3, 77.0, 76.7, 21.1
HRMS (ESI-TOF) m/z calcd for C32H23N2O12S [M + H] + : 659.0972 , found; 659.0974 (+0.2 mmu).
（Ｐｓ－ＦＬの合成；Ｎ－（３’，６’－ジヒドロキシ－３－オキソ－３Ｈ－スピロ［イソベンゾフラン－１，９’－キサンテン］－５－イル）－５－（メチルスルホニル）－２－ニトロベンズアミド）
化合物（ｋ）（１４ｍｇ，０．０２１ｍｍｏｌ）を１Ｎ ＮａＯＨ（０．５ｍＬ）とジメチルスルホキシド（１．０ｍＬ）に溶解させて室温にて５分間攪拌した。反応液をｐＨ７．４、２００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液によって中和し、分取ＨＰＬＣによって精製した。分取ＨＰＬＣでは移動相Ａとして１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、移動相Ｂとしてアセトニトリルを用いて、２０分間で組成比がＡ：Ｂ＝９０：１０から１０：９０となるよう組成比のグラジエントをかけ、流速９ｍＬ／ｍｉｎで溶出させた。溶出液中に含まれるアセトニトリルを減圧下、留去した後、残渣を酢酸エチルに懸濁し、０．１Ｎ塩酸で３回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。酢酸エチルを減圧下留去し、目的化合物（Ｐｓ－ＦＬ）を収率６３％で得た（７．５ｍｇ，０．０１３ｍｍｏｌ）
（Ｐｓ－ＦＬの機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，１０％ＭｅＯＤ ｉｎ ＣＤＣｌ３）δ８．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８），８．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８），８．２３－８．１２（４Ｈ，ｍ），７．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７），８．２３－８．１２（４Ｈ，ｍ），６．７２（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．７，２．３）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ） ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２８Ｈ１９Ｎ２Ｏ１０Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋：５７５．０７６０，ｆｏｕｎｄ；５７５．０７５７（－０．３ｍｍｕ）
［蛍光プローブの分光学的特性の評価（４）］
まず、２μＭのＰｓ－ＦＬ（図２３の（Ａ））を１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ０．１％を共溶媒として含む）に溶解し、反応前の蛍光スペクトルを測定した。なお、蛍光スペクトルの測定には、蛍光分光光度計（ＲＦ－５３００ＰＣ；株式会社島津製作所製）を用いた。また、２μＭのＰｓ－ＦＬを１ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）および３μｇ／ｍＬのグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴＰ１－１）を含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ １％を共溶媒として含む）中、室温（２５℃）にて撹拌しながら２時間反応させた。その後、上記と同様にして反応後の蛍光スペクトルを測定した。(Synthesis of Ps-FL; N-(3′,6′-dihydroxy-3-oxo-3H-spiro[isobenzofuran-1,9′-xanthen]-5-yl)-5-(methylsulfonyl)-2 - nitrobenzamide)
Compound (k) (14 mg, 0.021 mmol) was dissolved in 1N NaOH (0.5 mL) and dimethylsulfoxide (1.0 mL) and stirred at room temperature for 5 minutes. The reaction was neutralized with pH 7.4, 200 mM sodium phosphate buffer and purified by preparative HPLC. In preparative HPLC, 10 mM ammonium acetate buffer (pH 7.0) was used as mobile phase A, acetonitrile was used as mobile phase B, and the composition ratio was A:B = 90: 10 to 10: 90 in 20 minutes. A composition ratio gradient was applied and elution was performed at a flow rate of 9 mL/min. After acetonitrile contained in the eluate was distilled off under reduced pressure, the residue was suspended in ethyl acetate, washed with 0.1N hydrochloric acid three times, and dried over anhydrous sodium sulfate. Ethyl acetate was distilled off under reduced pressure to obtain the target compound (Ps-FL) with a yield of 63% (7.5 mg, 0.013 mmol).
(Equipment data of Ps-FL)
1 H-NMR (400 MHz, 10% MeOD in CDCl 3 ) δ 8.33 (1H, d, J=1.8), 8.26 (1H, d, J=1.8), 8.23-8. 12 (4H, m), 7.16 (1H, d, J = 8.7), 8.23-8.12 (4H, m), 6.72 (2H, dd, J = 8.7, 2 .3)
HRMS (ESI-TOF) m/z calcd for C28H19N2O10S [M + H] + : 575.0760 , found; 575.0757 (-0.3mmu)
[Evaluation of spectroscopic properties of fluorescent probe (4)]
First, 2 μM Ps-FL ((A) in FIG. 23) was dissolved in 100 mM phosphate buffer (pH 7.4; containing 0.1% DMSO as a co-solvent), and the fluorescence spectrum was measured before the reaction. A fluorescence spectrophotometer (RF-5300PC; manufactured by Shimadzu Corporation) was used to measure the fluorescence spectrum. In addition, 100 mM phosphate buffer containing 2 μM Ps-FL, 1 mM reduced glutathione (GSH) and 3 μg/mL glutathione-S-transferase (GSTP1-1) (pH 7.4; containing 1% DMSO as a co-solvent) ) at room temperature (25° C.) with stirring for 2 hours. After that, the fluorescence spectrum after the reaction was measured in the same manner as described above.
Ｐｓ－ＦＬについての蛍光スペクトルの測定結果を図２３の（Ｂ）に示す。図２３の（Ｂ）に示す結果からわかるように、Ｐｓ－ＦＬは反応の前後で５１５ｎｍにおいて約１５０倍の蛍光強度上昇を示した。 FIG. 23B shows the fluorescence spectrum measurement results for Ps-FL. As can be seen from the results shown in FIG. 23(B), Ps-FL exhibited an approximately 150-fold increase in fluorescence intensity at 515 nm before and after the reaction.
［蛍光プローブの合成（５）］
上記とはさらに異なる蛍光団を有する蛍光プローブの作製を試みた（下記の反応スキーム８）。[Synthesis of fluorescent probe (5)]
An attempt was made to prepare a fluorescent probe having a fluorophore different from that described above (
（化合物（ｌ）の合成；２－（８－ヒドロキシ－２，３，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ，５Ｈ－ピリド［３，２，１－ｉｊ］キノリン－９－カルボニル）－５（６）－ニトロ安息香酸）
４－ニトロフタル酸無水物（２５７．１ｍｇ，１．３ｍｍｏｌ）と８－ヒドロキシジュロリジン（２５２．３ｍｇ，１．３ｍｍｏｌ）をトルエン（２０ｍＬ）に懸濁し、１００℃で３時間撹拌した後、加熱還流を行い、一晩撹拌した。反応液を室温まで冷却し、溶液に酢酸エチルを加え、飽和食塩水で３回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１：２，０．５％酢酸）で精製し、目的化合物（５，６－異性体混合物）を収率６７．６％（３４３．６ｍｇ，０．８９９ｍｍｏｌ）で得た。(Synthesis of compound (l); 2-(8-hydroxy-2,3,6,7-tetrahydro-1H,5H-pyrido[3,2,1-ij]quinoline-9-carbonyl)-5(6) - nitrobenzoic acid)
4-Nitrophthalic anhydride (257.1 mg, 1.3 mmol) and 8-hydroxyjulolidine (252.3 mg, 1.3 mmol) were suspended in toluene (20 mL), stirred at 100°C for 3 hours, and heated to reflux. and stirred overnight. The reaction solution was cooled to room temperature, ethyl acetate was added to the solution, and the solution was washed with saturated brine three times. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. The residue was purified by silica gel column chromatography (hexane/ethyl acetate=1:2, 0.5% acetic acid) to give the target compound (5,6-isomer mixture) with a yield of 67.6% (343.6 mg, 0.5% acetic acid). .899 mmol).
（化合物（ｌ）の機器データ）
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ８．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３），８．３６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．７，２．３），８．２７（１Ｈ，ｄｄ，８．７，２．３），８．１７（１Ｈ，ｄ，８．７），８．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３），７．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２），６．３３（１Ｈ，ｓ），６．２７（１Ｈ，ｓ），３．２８－３．１５（８Ｈ，ｍ），２．６４（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．２），２．４０（４Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．７），１．９４－１．８４（４Ｈ，ｍ），１．８４－１．７４（４Ｈ，ｍ）
１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１９５．５，１９４．９，１７４．０，１６６．０，１６５．４，１６０．２，１６０．１，１４９．６，１４９．５，１４９．１，１４７．６，１４６．５，１４２．３，１３４．９，１３１．９，１３０．８，１２９．８，１２９．７，１２９．２，１２６．４，１２５．８，１２３．５，１２２．９，１１３．３，１１３．３，１０８．３，１０８．３，１０５．４，１０５．４，６０．５，５０．１，４９．７，４９．４，４９．２，４９．０，４８．８，４８．６，４８．３，２７．０，２１．３，２０．８，２０．６，２０．３，１９．６，１３．９
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ） ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２０Ｈ１９Ｎ２Ｏ６［Ｍ＋Ｈ］＋：３８３．１２４３，ｆｏｕｎｄ；３８３．１２４１（－０．２ｍｍｕ）。(Instrumental data of compound (l))
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.86 (1H, d, J = 2.3), 8.36 (1H, dd, J = 8.7, 2.3), 8.27 ( 1H, dd, 8.7, 2.3), 8.17 (1H, d, 8.7), 8.11 (1H, d, J = 2.3), 7.45 (1H, d, J = 8.2), 6.33 (1H, s), 6.27 (1H, s), 3.28-3.15 (8H, m), 2.64 (4H, t, J = 6.2 ), 2.40 (4H, q, J = 6.7), 1.94-1.84 (4H, m), 1.84-1.74 (4H, m)
13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ 195.5, 194.9, 174.0, 166.0, 165.4, 160.2, 160.1, 149.6, 149.5, 149. 1, 147.6, 146.5, 142.3, 134.9, 131.9, 130.8, 129.8, 129.7, 129.2, 126.4, 125.8, 123.5, 122.9, 113.3, 113.3, 108.3, 108.3, 105.4, 105.4, 60.5, 50.1, 49.7, 49.4, 49.2, 49. 0, 48.8, 48.6, 48.3, 27.0, 21.3, 20.8, 20.6, 20.3, 19.6, 13.9
HRMS (ESI - TOF) m/z calcd for C20H19N2O6 [M + H] + : 383.1243 , found; 383.1241 (-0.2 mmu).
（Ｐｓ－ｊＲｈｏｄの合成；Ｎ－（１２－ヒドロキシ－３’－オキソ－２，３，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ，３’Ｈ，５Ｈ－スピロ［クロメノ［２，３－ｆ］ピリド［３，２，１－ｉｊ］キノリン－９，１’－イソベンゾフラン］－５’－イル）－５－（メチルスルホニル）－２－ニトロベンズアミド）
化合物（ｌ）（５，６－異性体混合物）（２０３．８ｍｇ，０．５３ｍｍｏｌ）とレゾルシノール（６６．７ｍｇ，０．６０６ｍｍｏｌ）をメタンスルホン酸（０．５ｍＬ）とトリフルオロ酢酸（０．５ｍＬ）に溶解させて、８０℃で一晩撹拌した。反応溶液を室温まで冷却し、１０Ｎ ＮａＯＨを用いて、ｐＨ２～３にした。クロロホルムで分液し、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液で３回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝５：１）で粗精製した。得られた固体（１１５．２ｍｇ）、硫化ナトリウム９水和物（２７２．０ｍｇ，３．４８ｍｍｏｌ）を水（１０ｍＬ）に溶解させ、６０℃で１時間撹拌した。反応溶液を室温まで冷却し、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液を用いてｐＨ４にした。酢酸エチルで分液し、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液で３回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、酢酸エチルを減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝４：１から１：１）で粗精製し、化合物（ｍ）を得た。(Synthesis of Ps-jRhod; N-(12-hydroxy-3′-oxo-2,3,6,7-tetrahydro-1H,3′H,5H-spiro[chromeno[2,3-f]pyrido[3 ,2,1-ij]quinoline-9,1′-isobenzofuran]-5′-yl)-5-(methylsulfonyl)-2-nitrobenzamide)
Compound (l) (5,6-isomer mixture) (203.8 mg, 0.53 mmol) and resorcinol (66.7 mg, 0.606 mmol) were mixed with methanesulfonic acid (0.5 mL) and trifluoroacetic acid (0.5 mL). ) and stirred overnight at 80°C. The reaction solution was cooled to room temperature and brought to pH 2-3 using 10N NaOH. The mixture was separated with chloroform, washed three times with a saturated aqueous sodium dihydrogen phosphate solution, and washed once with a saturated saline solution. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and ethyl acetate was distilled off under reduced pressure. The residue was crudely purified by silica gel column chromatography (chloroform/methanol=5:1). The obtained solid (115.2 mg) and sodium sulfide nonahydrate (272.0 mg, 3.48 mmol) were dissolved in water (10 mL) and stirred at 60° C. for 1 hour. The reaction solution was cooled to room temperature and adjusted to
得られた化合物（ｍ）（１１ｍｇ）、５－メシル－２－ニトロ安息香酸（１４ｍｇ，０．０５７ｍｍｏｌ），ＷＳＣＤ・ＨＣｌ（１４ｍｇ，０．０７２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３ｍＬ）に懸濁し、室温で４５分間攪拌した。反応溶液に１Ｎ ＮａＯＨ（３ｍＬ）を加えて室温で５分間攪拌した。１Ｎ ＨＣｌでｐＨを３にして酢酸エチルを加えて分液し、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液で３回、飽和食塩水で１回洗浄した。酢酸エチルを減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝３：１から１：１）で精製した。残渣をジメチルスルホキシド（２００μＬ）とアセトニトリル（２００μＬ）の混合溶媒に溶解させて、酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０，４．０ｍＬ）を加えて、分取ＨＰＬＣによって精製した。分取ＨＰＬＣでは移動相Ａとして１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、移動相Ｂとしてアセトニトリルを用いて、２０分間で組成比がＡ：Ｂ＝９０：１０から１０：９０となるよう組成比のグラジエントをかけ、流速９ｍＬ／ｍｉｎで溶出させた。溶出液中に含まれるアセトニトリルを減圧下、留去した後、残渣を酢酸エチルに懸濁し、飽和リン酸二水素ナトリウム水溶液加えた。酢酸エチルで２回分液し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。酢酸エチルを減圧下留去し、目的化合物（Ｐｓ－ｊＲｈｏｄ）を得た（１．６ｍｇ，０．００２５ｍｍｏｌ）。 The resulting compound (m) (11 mg), 5-mesyl-2-nitrobenzoic acid (14 mg, 0.057 mmol) and WSCD.HCl (14 mg, 0.072 mmol) were suspended in acetonitrile (3 mL) and stirred at room temperature for 45 minutes. Stir for a minute. 1N NaOH (3 mL) was added to the reaction solution and the mixture was stirred at room temperature for 5 minutes. The pH was adjusted to 3 with 1N HCl, and ethyl acetate was added to separate the layers. Ethyl acetate was distilled off under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (chloroform/methanol=3:1 to 1:1). The residue was dissolved in a mixed solvent of dimethylsulfoxide (200 μL) and acetonitrile (200 μL), added with ammonium acetate buffer (pH 7.0, 4.0 mL), and purified by preparative HPLC. In preparative HPLC, 10 mM ammonium acetate buffer (pH 7.0) was used as mobile phase A, acetonitrile was used as mobile phase B, and the composition ratio was A:B = 90:10 to 10:90 in 20 minutes. A composition ratio gradient was applied and elution was performed at a flow rate of 9 mL/min. After acetonitrile contained in the eluate was distilled off under reduced pressure, the residue was suspended in ethyl acetate and saturated aqueous sodium dihydrogen phosphate solution was added. The mixture was separated twice with ethyl acetate, and the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate. Ethyl acetate was distilled off under reduced pressure to obtain the target compound (Ps-jRhod) (1.6 mg, 0.0025 mmol).
（Ｐｓ－ｊＲｈｏｄの機器データ）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ） ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３４Ｈ２８Ｎ３Ｏ９Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋：６５４．１５４６，ｆｏｕｎｄ；６５４．１５４８（＋０．２ｍｍｕ）。(Equipment data of Ps-jRhod)
HRMS (ESI - TOF) m/z calcd for C34H28N3O9S [M+H] + : 654.1546 , found; 654.1548 (+0.2 mmu).
［蛍光プローブの分光学的特性の評価（５）］
まず、２μＭのＰｓ－ｊＲｈｏｄ（図２４の（Ａ））を１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ ０．１％を共溶媒として含む）に溶解し、反応前の蛍光スペクトルを測定した。なお、蛍光スペクトルの測定には、蛍光分光光度計（ＲＦ－５３００ＰＣ；株式会社島津製作所製）を用いた。また、２μＭのＰｓ－ｊＲｈｏｄを１ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）および３μｇ／ｍＬのグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴＰ１－１）を含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＤＭＳＯ１％を共溶媒として含む）中、室温（２５℃）にて撹拌しながら２時間反応させた。その後、上記と同様にして反応後の蛍光スペクトルを測定した。[Evaluation of spectroscopic properties of fluorescent probe (5)]
First, 2 μM Ps-jRhod ((A) in FIG. 24) was dissolved in 100 mM phosphate buffer (pH 7.4; containing 0.1% DMSO as a co-solvent), and the fluorescence spectrum was measured before the reaction. A fluorescence spectrophotometer (RF-5300PC; manufactured by Shimadzu Corporation) was used to measure the fluorescence spectrum. In addition, 2 μM Ps-jRhod, 1 mM reduced glutathione (GSH) and 3 μg/mL glutathione-S-transferase (GSTP1-1) in 100 mM phosphate buffer (pH 7.4; containing 1% DMSO as a co-solvent) The mixture was reacted for 2 hours while stirring at room temperature (25°C). After that, the fluorescence spectrum after the reaction was measured in the same manner as described above.
Ｐｓ－ｊＲｈｏｄについての蛍光スペクトルの測定結果を図２４の（Ｂ）に示す。図２４の（Ｂ）に示す結果からわかるように、Ｐｓ－ｊＲｈｏｄは反応の前後で５６５ｎｍにおいて約７５倍の蛍光強度上昇を示した。 FIG. 24B shows the fluorescence spectrum measurement results for Ps-jRhod. As can be seen from the results shown in FIG. 24(B), Ps-jRhod exhibited an approximately 75-fold increase in fluorescence intensity at 565 nm before and after the reaction.
Claims (14)
式中、Ｌは蛍光団を表し、ＥＷＧ基は０．６６以上０．７８未満のハメット定数を有する電子求引性基を表し、ベンゼン環に結合したニトロ（ＮＯ２）基はベンゼン環に結合したアミド結合に対してオルト位またはパラ位に位置し、前記ＥＷＧ基は、前記ニトロ（ＮＯ２）基に対してオルト位またはパラ位に位置している、
で表されるニトロベンゼン誘導体またはその塩。 The following general formula (1):
In the formula, L represents a fluorophore, the EWG group represents an electron-withdrawing group having a Hammett constant of 0.66 or more and less than 0.78, and the nitro (NO 2 ) group attached to the benzene ring is attached to the benzene ring. is positioned ortho or para to the amide bond, and the EWG group is positioned ortho or para to the nitro (NO 2 ) group;
A nitrobenzene derivative represented by or a salt thereof.
式中、Ｒ１は、置換もしくは非置換の炭素数１～２０のアルキル基、置換もしくは非置換の炭素数１～２０のアルコキシ基、またはアミド基（－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２基）を表し、ｎは０～４の整数を表し、Ｒ２は水素原子または置換もしくは非置換の炭素数２～２０のアシル基を表し、Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、水素原子またはハロゲン原子を表す、
で表される、請求項１～３のいずれか１項に記載のニトロベンゼン誘導体またはその塩。 The L is represented by the following general formula (2):
In the formula, R 1 is a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, a substituted or unsubstituted alkoxy group having 1 to 20 carbon atoms, or an amide group (-C(=O)NH 2 group). , n represents an integer of 0 to 4, R 2 represents a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted acyl group having 2 to 20 carbon atoms, and X 1 and X 2 each independently represent a hydrogen atom or a halogen represents an atom,
The nitrobenzene derivative or a salt thereof according to any one of claims 1 to 3, represented by
式中、Ｒ１は、置換もしくは非置換の炭素数１～２０のアルキル基、置換もしくは非置換の炭素数１～２０のアルコキシ基、またはアミド基（－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２基）を表し、ｎは０～４の整数を表し、Ｒ２は水素原子または置換もしくは非置換の炭素数２～２０のアシル基を表し、Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、水素原子またはハロゲン原子を表す、
で表される、請求項４に記載のニトロベンゼン誘導体またはその塩。 The following general formula (3):
In the formula, R 1 is a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, a substituted or unsubstituted alkoxy group having 1 to 20 carbon atoms, or an amide group (-C(=O)NH 2 group). , n represents an integer of 0 to 4, R 2 represents a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted acyl group having 2 to 20 carbon atoms, and X 1 and X 2 each independently represent a hydrogen atom or a halogen represents an atom,
The nitrobenzene derivative or a salt thereof according to claim 4, represented by
適用後の前記組織に対して励起光を照射する工程と、
前記組織からの蛍光を検出する工程と、
を含む、がん細胞またはがん組織の検出方法。 applying the fluorescent probe for measuring glutathione-S-transferase P1 according to claim 7 or the detection composition according to claim 8 to a tissue;
A step of irradiating the tissue after application with excitation light;
detecting fluorescence from the tissue;
A method for detecting cancer cells or tissue , comprising:
前記細胞に対して励起光を照射する工程と、
前記細胞からの蛍光を検出する工程と、
を含む、血液中におけるがん細胞の検出方法。 a step of contacting the fluorescent probe for measuring glutathione-S-transferase P1 according to claim 7 or the detection composition according to claim 8 with cells in blood collected from a living body;
A step of irradiating the cells with excitation light;
detecting fluorescence from the cells;
A method for detecting cancer cells in blood, comprising:
生体試料固定装置と、
を含む、がん診断用キット。 the fluorescent probe for measuring glutathione-S-transferase P1 according to claim 7 or the detection composition according to claim 8;
a biological sample fixing device;
A kit for cancer diagnosis, comprising:
式中、ＥＷＧ基は０．６６以上０．７８未満のハメット定数を有する電子求引性基を表し、ベンゼン環に結合したニトロ（ＮＯ２）基はベンゼン環に結合したアミド結合に対してオルト位またはパラ位に位置し、前記ＥＷＧ基は、前記ニトロ（ＮＯ２）基に対してオルト位またはパラ位に位置し、Ｒ１は、置換もしくは非置換の炭素数１～２０のアルキル基、置換もしくは非置換の炭素数１～２０のアルコキシ基、またはアミド基（－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２基）を表し、ｍは０～５の整数を表す、
で表されるニトロベンゼン誘導体またはその塩（ただし、以下のＲＮ １１００４８２－３１－２化合物およびＲＮ １１００４８８－１４－９化合物並びにそれらの塩を除く）。
In the formula, the EWG group represents an electron-withdrawing group having a Hammett constant of 0.66 or more and less than 0.78, and the nitro (NO 2 ) group attached to the benzene ring is ortho to the amide bond attached to the benzene ring. position or para position, the EWG group is positioned ortho or para to the nitro (NO 2 ) group, R 1 is a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, represents a substituted or unsubstituted alkoxy group having 1 to 20 carbon atoms, or an amide group (-C(=O) NH2 group), m represents an integer of 0 to 5,
Nitrobenzene derivatives represented by or salts thereof (excluding the following RN 1100482-31-2 compounds and RN 1100488-14-9 compounds and their salts) .
式中、Ｒ１は、置換もしくは非置換の炭素数１～２０のアルキル基、置換もしくは非置換の炭素数１～２０のアルコキシ基、またはアミド基（－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２基）を表し、ｍは０～５の整数を表す、
からなる群から選択されるニトロベンゼン誘導体またはその塩（ただし、以下のＲＮ １１００４８２－３１－２化合物およびＲＮ １１００４８８－１４－９化合物並びにそれらの塩を除く）。
In the formula, R 1 is a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, a substituted or unsubstituted alkoxy group having 1 to 20 carbon atoms, or an amide group (-C(=O)NH 2 group). and m represents an integer from 0 to 5,
A nitrobenzene derivative or a salt thereof selected from the group consisting of (excluding the following RN 1100482-31-2 compounds and RN 1100488-14-9 compounds and salts thereof) .
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