JPWO2017085844A1 - Β-secretase inhibitor containing turmerone as an active ingredient, and pharmaceutical preparations and foods and drinks containing the inhibitor - Google Patents
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Abstract
（要約）（課題）安全性が高く、β‐セクレターゼ活性に対するさらに優れた阻害作用を有するβ‐セクレターゼ阻害剤を含む医薬製剤及び飲食品を提供すること。（解決手段）ＡＲ−ターメロン、α−ターメロン及びβ−ターメロンからなる群から選択される１以上の化合物を有効成分として含有するβ‐セクレターゼ阻害剤とする。(Summary) (Problem) To provide a pharmaceutical preparation and a food and drink containing a β-secretase inhibitor which is highly safe and has a further excellent inhibitory action on β-secretase activity. (Solution) A β-secretase inhibitor containing, as an active ingredient, one or more compounds selected from the group consisting of AR-turmerone, α-turmerone and β-turmerone.
Description
本発明は、ターメリック（Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）の根茎由来の化合物を有効成分として含有するβ‐セクレターゼ阻害剤、並びに該阻害剤を含む医薬製剤及び飲食品に関する。 The present invention relates to a β-secretase inhibitor containing a compound derived from a turmeric (Curcuma longa) rhizome as an active ingredient, and a pharmaceutical preparation and a food and drink containing the inhibitor.
近年の急速な高齢化社会の到来に伴い、老人性痴呆症は、医学的、社会的にも重大な問題となっており、それにより有効な抗認知症治療薬の開発だけではなく、老人性痴呆症を効果的に予防できる薬の開発が強く望まれている。老人性痴呆症の代表的な疾患であるアルツハイマー型痴呆症（アルツハイマー病）は、脳の萎縮、老人班の沈着及び神経原繊維の形成を特徴とする変性疾患で、神経細胞の脱落によって痴呆症状が引き起こされると考えられている（非特許文献１）。 With the recent arrival of a rapidly aging society, senile dementia has become a serious medical and social problem, and not only the development of effective anti-dementia treatment drugs, but also senile Development of a drug that can effectively prevent dementia is strongly desired. Alzheimer-type dementia (Alzheimer's disease), a typical disease of senile dementia, is a degenerative disease characterized by brain atrophy, geriatric deposition, and neurofibrillary tangles. Is considered to be caused (Non-Patent Document 1).
アルツハイマー型痴呆症の原因について未だ定説はないが、病理組織学的研究により、老人班が沈着しそれにより神経細胞が脱落し脳の萎縮が生じると考えられている。老人班の主成分であるβ‐アミロイドは細胞毒性作用を有しており、アルツハイマー型痴呆症における神経細胞死を引き起こしていると考えられている（非特許文献２〜５）。β‐アミロイドは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）からβ‐セクレターゼという酵素の作用によって生成される。従って、このβ‐セクレターゼに対し阻害作用を有する化合物は、アルツハイマー型痴呆症の予防に有用であると考えられる。β‐セクレターゼに対し阻害作用を有する化合物に関する研究が、近年活発に行われている（特許文献１）。 Although there is no established theory about the cause of Alzheimer's dementia, histopathological studies suggest that the elderly population is deposited, which causes neuronal loss and brain atrophy. Β-amyloid, which is the main component of the elderly group, has a cytotoxic effect, and is considered to cause neuronal cell death in Alzheimer's dementia (Non-patent Documents 2 to 5). β-amyloid is produced from the amyloid precursor protein (APP) by the action of an enzyme called β-secretase. Therefore, it is considered that a compound having an inhibitory action on β-secretase is useful for preventing Alzheimer-type dementia. In recent years, research on compounds having an inhibitory effect on β-secretase has been actively carried out (Patent Document 1).
このようなβ‐セクレターゼに対して阻害活性を持つ化合物は、β‐アミロイドの生成のみならず、他の生体内での反応をも阻害する可能性がある。他の生体内での反応を阻害するような物質は、β‐アミロイドの生成を阻害したとしても、患者に深刻な副作用をもたらす虞があるため、アルツハイマー型痴呆症等の治療に利用することは困難である。よって、アルツハイマー型痴呆症の治療に使用することができる、安全性の高いβ‐セクレターゼ阻害剤が求められている。 Such compounds having inhibitory activity against β-secretase may inhibit not only the production of β-amyloid but also other in vivo reactions. Other substances that inhibit the reaction in vivo may cause serious side effects to patients even if they inhibit the production of β-amyloid, so it can be used for treatment of Alzheimer's dementia etc. Have difficulty. Therefore, a highly safe β-secretase inhibitor that can be used for the treatment of Alzheimer-type dementia is desired.
安全性の高いβ−セクレターゼ阻害剤を探索した例として、本発明者らによる特許文献２記載の発明が挙げられる。
特許文献２では、安全性の高いβ−セクレターゼ阻害剤を得るために、例えばコショウ、ゴマ、ターメリック等のスパイスとして一般的に用いられる天然物からβ−セクレターゼ阻害剤が抽出されている。特許文献２ではさらに抽出物に含まれる化合物の内β−セクレターゼ阻害活性を示す化合物が特定されている。
しかし、より阻害活性が高く且つより安価で得られるβ−セクレターゼ阻害剤が求められている。As an example of searching for a highly safe β-secretase inhibitor, there is an invention described in Patent Document 2 by the present inventors.
In Patent Document 2, in order to obtain a highly safe β-secretase inhibitor, a β-secretase inhibitor is extracted from natural products generally used as spices such as pepper, sesame and turmeric, for example. Patent Document 2 further specifies a compound that exhibits β-secretase inhibitory activity among the compounds contained in the extract.
However, there is a need for β-secretase inhibitors that have higher inhibitory activity and can be obtained at lower costs.
特許文献３は、スパイスからの抽出物を利用してアルツハイマー型痴呆症を罹患している患者を処置する方法について記載している。具体的には、クルクミノイド、ターメロン、多糖類及び／又はターメリンを含むウコン抽出物を使用することが記載されている。
しかし、特許文献３はウコン抽出物がアミロイド凝集を阻害することが記載されているものの、具体的な作用機序が明らかにされていないという問題点を有する。Patent Document 3 describes a method for treating a patient suffering from Alzheimer-type dementia using an extract from spices. Specifically, the use of a turmeric extract containing curcuminoids, turmeric, polysaccharides and / or turmerins is described.
However, although Patent Document 3 describes that a turmeric extract inhibits amyloid aggregation, it has a problem that a specific mechanism of action has not been clarified.
特許文献４には、アルツハイマー型痴呆症の治療に用いるＡＲターメロン誘導体を含むアセチルコリンエステラーゼ阻害剤が記載されている。
しかし、アセチルコリンエステラーゼ阻害活性を有する物質はβ−アミロイドの蓄積を緩和する対症療法に役立つが、アルツハイマー型痴呆症の予防に効果的であるとはいえないという問題点を有する。Patent Document 4 describes an acetylcholinesterase inhibitor containing an AR turmerone derivative used for the treatment of Alzheimer-type dementia.
However, a substance having acetylcholinesterase inhibitory activity is useful for symptomatic treatment to alleviate the accumulation of β-amyloid, but has a problem that it cannot be said to be effective in preventing Alzheimer's dementia.
安全性の高いβ−セクレターゼ阻害剤を探索したもう一つの例として、本発明者らは特願２０１５−１４６２０８において、それぞれゴマ、ガランガル及びヒハツから抽出されたセサモリン、エチル４−メトキシシンナメート及びピパタリンを有効成分として含むβ−セクレターゼ阻害剤を有する医薬製剤及び飲食品を提案している。
特願２０１５−１４６２０８記載の発明は、β−セクレターゼ阻害活性を有する化合物として上記３つの化合物を特定しており、それぞれの化合物のＩＣ５０値を算出することで具体的な阻害活性を示している。
しかし、より阻害活性が高く且つより安価で得られるβ−セクレターゼ阻害剤が求められている。As another example of searching for a highly safe β-secretase inhibitor, the present inventors, in Japanese Patent Application No. 2015-146208, obtained sesamolin, ethyl 4-methoxycinnamate, and pipetalin extracted from sesame, galangal, and baboon, respectively. Have proposed a pharmaceutical preparation and a food and drink having a β-secretase inhibitor containing as an active ingredient.
The invention described in Japanese Patent Application No. 2015-146208 identifies the above three compounds as compounds having β-secretase inhibitory activity, and shows specific inhibitory activity by calculating the IC50 value of each compound.
However, there is a need for β-secretase inhibitors that have higher inhibitory activity and can be obtained at lower costs.
本発明は、アルツハイマー型痴呆症の予防に役立ち、安全性が高く、β‐セクレターゼ活性に対するさらに高い阻害活性を有するβ‐セクレターゼ阻害剤、並びに該阻害剤を含む医薬製剤及び飲食品を提供するものである。 The present invention provides a β-secretase inhibitor that is useful for the prevention of Alzheimer-type dementia, has high safety, and has a higher inhibitory activity on β-secretase activity, and pharmaceutical preparations and foods and drinks containing the inhibitor It is.
請求項１に係る発明は、ＡＲ−ターメロン、α−ターメロン及びβ−ターメロンからなる群から選択される１以上の化合物を有効成分として含有するβ‐セクレターゼ阻害剤に関する。 The invention according to claim 1 relates to a β-secretase inhibitor comprising as an active ingredient one or more compounds selected from the group consisting of AR-turmerone, α-turmerone and β-turmerone.
請求項２に係る発明は、ＡＲ−ターメロン、α−ターメロン及びβ−ターメロンが、ターメリックの根茎より抽出されてなることを特徴とする請求項１記載のβ‐セクレターゼ阻害剤に関する。 The invention according to claim 2 relates to the β-secretase inhibitor according to claim 1, wherein AR-turmerone, α-turmerone and β-turmerone are extracted from turmeric rhizomes.
請求項３に係る発明は、請求項１又は２に記載のβ‐セクレターゼ阻害剤を含む医薬製剤に関する。 The invention according to claim 3 relates to a pharmaceutical preparation comprising the β-secretase inhibitor according to claim 1 or 2.
請求項４に係る発明は、請求項１又は２に記載のβ−セクレターゼ阻害剤を含む飲食品に関する。 The invention which concerns on Claim 4 is related with the food-drinks containing the beta-secretase inhibitor of Claim 1 or 2.
請求項１に係る発明によれば、β‐セクレターゼ活性に対するさらに高い阻害活性を有するので、アルツハイマー型痴呆症等の老人性痴呆症を予防又は進行を停止することができる。 According to the invention according to claim 1, since it has a higher inhibitory activity on β-secretase activity, it is possible to prevent or stop senile dementia such as Alzheimer's dementia.
請求項２に係る発明によれば、ターメリック（Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）の根茎の抽出物から得られた化合物を有効成分とするため、人体に対する安全性が高く、アルツハイマー型痴呆症等の老人性痴呆症を予防又は進行を停止することができるβ‐セクレターゼ阻害剤を提供することができる。
さらに、ターメリックから化合物を抽出する方法が簡便であるため、低いコストで製造することができる。According to the invention according to claim 2, since the compound obtained from the extract of turmeric (Curcuma longa) rhizome is used as an active ingredient, it is highly safe for the human body, and can prevent senile dementia such as Alzheimer-type dementia. A β-secretase inhibitor that can prevent or stop progression can be provided.
Furthermore, since the method of extracting a compound from turmeric is simple, it can be produced at low cost.
請求項３に係る発明によれば、β‐セクレターゼ活性に対する優れた阻害作用を有するβ‐セクレターゼ阻害剤を含む医薬製剤であるため、使用者の症状や状態に合わせてβ‐セクレターゼ阻害剤を摂取することができ、アルツハイマー型痴呆症等の老人性痴呆症を予防又は進行を停止することができる。 According to the invention of claim 3, since it is a pharmaceutical preparation containing a β-secretase inhibitor having an excellent inhibitory action on β-secretase activity, the β-secretase inhibitor is ingested according to the symptoms and conditions of the user. It is possible to prevent or stop the progression of senile dementia such as Alzheimer-type dementia.
請求項４に係る発明によれば、β‐セクレターゼ活性に対する優れた阻害作用を有するβ‐セクレターゼ阻害剤を含む飲食品であるため、β‐セクレターゼ阻害剤を日常的に容易に摂取することができ、アルツハイマー型痴呆症等の老人性痴呆症を予防又は進行を停止することができる。 According to the invention of claim 4, since it is a food or drink containing a β-secretase inhibitor having an excellent inhibitory action on β-secretase activity, the β-secretase inhibitor can be easily taken on a daily basis. It is possible to prevent or stop the progression of senile dementia such as Alzheimer's dementia.
以下、本発明に係るβ−セクレターゼ阻害剤、並びに該阻害剤を含む医薬製剤及び飲食品について説明する。 Hereinafter, the β-secretase inhibitor according to the present invention, and pharmaceutical preparations and foods and drinks containing the inhibitor will be described.
本発明のβ‐セクレターゼ阻害剤は、ＡＲ−ターメロン、α−ターメロン及びβ−ターメロンからなる群から選択される１以上の化合物を有効成分として含有する。 The β-secretase inhibitor of the present invention contains one or more compounds selected from the group consisting of AR-turmerone, α-turmerone and β-turmerone as an active ingredient.
ＡＲ−ターメロンは、ＣＡＳ番号５３２−６５−０であって、下式（化１）に示す構造を有している。 AR-turmerone has CAS number 532-65-0 and has a structure represented by the following formula (Formula 1).
α−ターメロンは、ＣＡＳ番号８２５０８−１５−４であって、下式（化２）に示す構造を有している。 α-turmerone has CAS number 82508-15-4 and has a structure represented by the following formula (Chemical Formula 2).
β−ターメロンは、ＣＡＳ番号８２５０８‐１４‐３であって、下式（化３）に示す構造を有している。 β-turmerone has CAS number 82508-14-3 and has a structure represented by the following formula (Formula 3).
本発明において、ＡＲ−ターメロン、α−ターメロン及びβターメロンは標準品を用いることができる。また、カレースパイス等の抽出物から得たものを用いることができ、特にターメリックの抽出物から得たものを用いることができる。 In the present invention, AR-turmerone, α-turmerone and β-turmerone can be standard products. Moreover, what was obtained from extracts, such as curry spice, can be used, and what was especially obtained from the extract of turmeric can be used.
ターメリック（英名：Ｔｕｒｍｅｒｉｃ、学名：Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）は、ショウガ科ウコン属の単子葉植物である。インド原産で、発達した根茎を有する多年草であり、根茎はカレー粉の原料や染料として用いられる。 Turmeric (English name: Turmeric, scientific name: Curcuma longa) is a monocotyledonous plant belonging to the genus Turmeric. Native to India, it is a perennial plant with a developed rhizome, which is used as a raw material and dye for curry powder.
本発明のβ‐セクレターゼ阻害剤には、ＡＲターメロン、α−ターメロン及びβ−ターメロンを有効成分とするものを用いることができる。
ＡＲ−ターメロン、α−ターメロン及びβ−ターメロンはターメリックの根茎からヘキサンによって好適に抽出される。その理由は、ターメリックの根茎をヘキサンで抽出することにより、ＡＲ−ターメロン、α−ターメロン及びβターメロンを多く溶出させることができるからである。As the β-secretase inhibitor of the present invention, those containing AR turmerone, α-turmerone and β-turmerone as active ingredients can be used.
AR-turmerone, α-turmerone and β-turmerone are preferably extracted from turmeric rhizomes with hexane. The reason is that a large amount of AR-turmerone, α-turmerone and β-turmerone can be eluted by extracting turmeric rhizomes with hexane.
上記化合物は、１種単独で又は２種以上を混合して使用してもよい。下記実施例で詳述するように、上記化合物は強いβ‐セクレターゼ阻害活性を有しているので、これらを有効成分として含有する本発明のβ‐セクレターゼ阻害剤は、各種用途に使用することができる。 The said compound may be used individually by 1 type or in mixture of 2 or more types. As described in detail in the following examples, the above-mentioned compounds have strong β-secretase inhibitory activity. Therefore, the β-secretase inhibitor of the present invention containing these as active ingredients can be used for various applications. it can.
例えば、本発明のβ‐セクレターゼ阻害剤を医薬製剤として用いる場合、哺乳動物（特にヒト）における老人性痴呆症の予防薬、特にアルツハイマー型痴呆症の予防薬として用いられる。 For example, when the β-secretase inhibitor of the present invention is used as a pharmaceutical preparation, it is used as a prophylactic agent for senile dementia in mammals (particularly humans), particularly as a prophylactic agent for Alzheimer's dementia.
本発明のβ‐セクレターゼ阻害剤は、慣用されている方法により錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、バップ剤、ローション剤等の医薬製剤に製剤化することができる。 The β-secretase inhibitor of the present invention is a tablet, powder, fine granule, granule, coated tablet, capsule, syrup, troche, inhalant, suppository, injection, ointment by a conventional method. , Ophthalmic ointments, eye drops, nasal drops, ear drops, bapts, lotions and the like.
製剤化に通常使用される賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、および必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤などを使用することができ、一般に医薬製剤の原料として使用される成分及び配合量を適宜選択して定法により製剤化される。 Excipients, binders, lubricants, coloring agents, flavoring agents, and stabilizers, emulsifiers, absorption promoters, surfactants, pH adjusters, antiseptics, anti-staining agents An oxidizing agent or the like can be used, and it is generally formulated by a conventional method by appropriately selecting components and blending amounts used as raw materials for pharmaceutical preparations.
本発明の医薬製剤を投与する場合、その形態は特に限定されず、通常使用される方法であればよく、経口投与でも非経口投与でもよい。本発明に係る医薬製剤の投与量は、症状の程度、年齢、性別、体重、投与形態、疾患の具体的な種類等に応じて、製剤学的な有効量を適宜選択することができる。投与量の一例を挙げると、経口投与の場合、通常、成人において、有効成分量として０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ程度が適当であり、これを１日１回〜数回に分けて投与すればよい。 When administering the pharmaceutical formulation of this invention, the form is not specifically limited, What is necessary is just the method used normally, and oral administration or parenteral administration may be sufficient. The dosage of the pharmaceutical preparation according to the present invention can be appropriately selected from pharmacologically effective amounts according to the degree of symptoms, age, sex, body weight, dosage form, specific type of disease, and the like. As an example of the dosage, in the case of oral administration, the amount of active ingredient is usually about 0.001 to 1000 mg / kg for an adult, and if this is administered once to several times a day, Good.
本発明のβ‐セクレターゼ阻害剤は、食品添加剤として、例えば清涼飲料水、乳製品（加工乳、ヨーグルト）、菓子類（ゼリー、チョコレート、ビスケット、ガム、錠菓）又はサプリメント等の各種飲食品に配合することもできる。 The β-secretase inhibitor of the present invention is a food additive such as soft drinks, dairy products (processed milk, yogurt), confectionery (jelly, chocolate, biscuit, gum, tablet confectionery) or various foods and beverages such as supplements. It can also be blended.
食品添加剤として使用する場合、その添加量については、特に限定されず、食品の種類に応じて適宜決定すればよい。一例としては、上記した抽出物の乾燥重量として、含有量が０．０００５〜５０重量％程度の範囲となるように添加すればよい。 When used as a food additive, the amount added is not particularly limited, and may be appropriately determined according to the type of food. As an example, what is necessary is just to add so that content may become the range of about 0.0005 to 50 weight% as dry weight of an above-described extract.
上記飲食品は、本発明のβ‐セクレターゼ阻害剤の他に、賦形剤、呈味剤、着色剤、保存剤、増粘剤、安定剤、ゲル化剤、酸化防止剤等を含有してもよい。
このうち、賦形剤としては、これらに限定されないが例えば、微粒子二酸化ケイ素のような粉末類、ショ糖脂肪酸エステル、結晶セルロース・カルボキシメチルセルロースナトリウム、リン酸水素カルシウム、小麦デンプン，米デンプン，トウモロコシデンプン，バレイショデンプン，デキストリン，シクロデキストリン等のでんぷん類、結晶セルロース類、乳糖，ブドウ糖，砂糖，還元麦芽糖，水飴，フラクトオリゴ糖，ガラクトオリゴ糖，大豆オリゴ糖，イソマルトオリゴ糖，キシロオリゴ糖，マルトオリゴ糖，乳果オリゴ糖などの糖類、ソルビトール，エリストール，キシリトール，ラクチトール，マンニトール等の糖アルコール類が挙げられる。これらの賦形剤は、単独で又は二種以上組み合わせて使用することができる。In addition to the β-secretase inhibitor of the present invention, the food or drink contains excipients, flavoring agents, colorants, preservatives, thickeners, stabilizers, gelling agents, antioxidants, and the like. Also good.
Among these, excipients include, but are not limited to, powders such as fine particle silicon dioxide, sucrose fatty acid ester, crystalline cellulose / sodium carboxymethylcellulose, calcium hydrogen phosphate, wheat starch, rice starch, corn starch , Starches such as potato starch, dextrin, cyclodextrin, crystalline cellulose, lactose, glucose, sugar, reduced maltose, starch syrup, fructooligosaccharide, galactooligosaccharide, soybean oligosaccharide, isomaltoligosaccharide, xylooligosaccharide, maltooligosaccharide, milk fruit Examples thereof include sugars such as oligosaccharides, and sugar alcohols such as sorbitol, erythritol, xylitol, lactitol, and mannitol. These excipients can be used alone or in combination of two or more.
呈味剤としては、これらに限定されないが例えば、果汁エキスであるボンタンエキス、ライチエキス、リンゴ果汁、オレンジ果汁、ゆずエキス、ピーチフレーバー、ウメフレーバー、甘味剤であるアセスルファムＫ、エリストール、オリゴ糖類、マンノース、キシリトール、異性化糖類、茶成分である緑茶、ウーロン茶、バナバ茶、杜仲茶、鉄観音茶、ハトムギ茶、アマチャヅル茶、マコモ茶、昆布茶、及びヨーグルトフレーバー等が挙げられる。 Examples of the flavoring agent include, but are not limited to, for example, bontang extract, which is a fruit juice extract, lychee extract, apple juice, orange juice, citron extract, peach flavor, ume flavor, sweetener acesulfame K, erystol, oligosaccharide , Mannose, xylitol, isomerized sugar, green tea, oolong tea, banaba tea, Tochu tea, iron kannon tea, pearl barley tea, amacha tea, macomo tea, kelp tea, and yogurt flavor.
以下、本発明の実施例を説明することにより、本発明の効果をより明確なものとする。但し、本発明は以下の実施例には限定されない。 Hereinafter, the effects of the present invention will be made clearer by describing examples of the present invention. However, the present invention is not limited to the following examples.
（ヘキサン抽出物の調製）
ターメリックの根茎１ｋｇを粉砕し、４０℃のヘキサン５０００ｍｌで１時間の攪拌抽出を行い、上澄み液４２００ｍｌをろ紙でろ過した。
次いで、その残渣に４０℃のヘキサン２５００ｍｌで０．５時間の攪拌抽出を行い、ろ紙でろ過した。得られた抽出液に含まれる溶媒をエバポレーター（４０℃）で留去し、ターメリックのヘキサン抽出物を得た。(Preparation of hexane extract)
1 kg of turmeric rhizome was pulverized and extracted with 5000 ml of hexane at 40 ° C. for 1 hour, and 4200 ml of the supernatant was filtered through filter paper.
Subsequently, the residue was subjected to stirring extraction with 2500 ml of hexane at 40 ° C. for 0.5 hour, and filtered through filter paper. The solvent contained in the obtained extract was distilled off with an evaporator (40 ° C.) to obtain a turmeric hexane extract.
（酢酸エチル抽出物の調製）
ターメリックのヘキサン抽出後の残渣を乾燥させ、４０℃の酢酸エチル５０００ｍｌで１時間撹拌抽出し、上澄み液４８００ｍｌをろ紙でろ過した。得られた抽出液に含まれる溶媒をエバポレーター（４０℃）で留去し、ターメリックの酢酸エチル抽出物を得た。
ヘキサン抽出物及び酢酸エチル抽出物の収率を以下の表１に示す。(Preparation of ethyl acetate extract)
The residue after turmeric hexane extraction was dried and extracted by stirring with 5000 ml of ethyl acetate at 40 ° C. for 1 hour, and 4800 ml of the supernatant was filtered through filter paper. The solvent contained in the obtained extract was distilled off with an evaporator (40 ° C.) to obtain a turmeric ethyl acetate extract.
The yields of hexane extract and ethyl acetate extract are shown in Table 1 below.
（β‐セクレターゼ阻害率の測定）
上記のように抽出したヘキサン抽出物及び酢酸エチル抽出物の酵素阻害活性を、以下の方法により検討した。また、Lys-Thr-Glu-Glu-Ile-Ser-Glu-Val-Asn-Sta-Val-Ala-Glu-Phe(Sta: (3S,4S)-4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチル-ヘプタン酸;ペプチド研究所製)を陽性対照として用いた。
具体的には、まず各抽出物及び陽性対照について、それぞれを含むＤＭＳＯ溶液２μｌを、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）７８μｌとともに０．６ｍｌサンプルチューブに入れた。コントロールとして２μｌのＤＭＳＯを上記の７８μｌの０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液とともに０．６ｍｌサンプルチューブに入れた。
その後、酵素溶液（β−セクレターゼ、17.4 μg protein/ml）10 μlを入れて混合し、37℃で10分間前培養した。
基質としてMOCAc-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-Lys(Dnp)-Arg-Arg-NH2 （ペプチド研究所製）0.1 mmol/l溶液を10 μl加えて混合し、37℃で1時間培養した。反応後，2.5 M 酢酸ナトリウム溶液50 μlを加え、反応を停止させた。(Measurement of β-secretase inhibition rate)
The enzyme inhibition activity of the hexane extract and ethyl acetate extract extracted as described above was examined by the following method. Lys-Thr-Glu-Glu-Ile-Ser-Glu-Val-Asn-Sta-Val-Ala-Glu-Phe (Sta: (3S, 4S) -4-amino-3-hydroxy-6-methyl- Heptanoic acid (Peptide Institute) was used as a positive control.
Specifically, for each extract and positive control, a DMSO solution containing 2 μl was first added to a 0.6 ml sample tube together with 78 μl of 0.02 M sodium acetate buffer (pH 4.5, 0.1% Triton X-100). Put it in. As a control, 2 μl of DMSO was placed in a 0.6 ml sample tube along with the above 78 μl of 0.02 M sodium acetate buffer.
Thereafter, 10 μl of enzyme solution (β-secretase, 17.4 μg protein / ml) was added and mixed, and pre-cultured at 37 ° C. for 10 minutes.
Add 10 μl of 0.1 mmol / l solution of MOCAc-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-Lys (Dnp) -Arg-Arg-NH 2 (Peptide Institute) And mixed and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After the reaction, 50 μl of 2.5 M sodium acetate solution was added to stop the reaction.
反応液100 μlを、水900 μlが入ったバイアル瓶に添加し、以下の条件の蛍光HPLC分析に供した。
・カラム；L-column ODS （4.6 id × 250 mm）
・移動相；water / 0.1% formic acid : acetonitrile（9：1 v/v）→17.50 min（11：9，v/v）→17.51 min（1：19，v/v）→22.50 min（1：19，v/v）→22.51 min（9：1，v/v）→27.50 min（STOP）
・カラム温度；40℃
・検出；Ex. 325 nm / Em. 395 nm
・注入量；20 μl
生成した蛍光ペプチド断片のピーク面積値から，下記の式より阻害率（%）を算出した。
β−セクレターゼ阻害率（%）= 100−〔（各抽出物由来のピークの面積値／コントロール由来のピーク面積値）×100〕100 μl of the reaction solution was added to a vial containing 900 μl of water and subjected to fluorescence HPLC analysis under the following conditions.
・ Column: L-column ODS (4.6 id x 250 mm)
・ Mobile phase: water / 0.1% formic acid: acetonitrile (9: 1 v / v) → 17.50 min (11: 9, v / v) → 17.51 min (1:19, v / v) → 22.50 min (1: 19, v / v) → 22.51 min (9: 1, v / v) → 27.50 min (STOP)
・ Column temperature: 40 ℃
・ Detection: Ex. 325 nm / Em. 395 nm
・ Injection volume: 20 μl
The inhibition rate (%) was calculated from the following formula from the peak area value of the generated fluorescent peptide fragment.
β-secretase inhibition rate (%) = 100 − [(peak area value derived from each extract / peak area value derived from control) × 100]
上記計算より各ヘキサン抽出物及び酢酸エチル抽出物のβ−セクレターゼ阻害率を算出した結果、以下の通りであった。 As a result of calculating the β-secretase inhibition rate of each hexane extract and ethyl acetate extract from the above calculation, it was as follows.
上記阻害率により、ターメリックの抽出物が、非常に高いβ‐セクレターゼ阻害活性を有することがわかった。 According to the inhibition rate, it was found that the turmeric extract has a very high β-secretase inhibitory activity.
ヘキサン抽出物を以下の条件でのＧＣＭＳを用いて分析した。
・カラム；Intertcap Pure Wax (0.25 i.d. × 0.25 μm × 60 m)
・注入量；1.0 μl
・昇温；50℃で2分保持、2.5℃昇温／分→240℃まで
・気化室温；250℃
・キャリーガス流量；ヘリウム 1.2 ml/分
・スプリット比；1/80
ＧＣＭＳ分析の結果から付属のライブラリー検索（wiley7nおよびNIST08）で化合物をＡＲ−ターメロン、α−ターメロン及びβターメロンと推定した。
ヘキサン抽出物はＡＲ−ターメロンを９．９％、α−ターメロンを３０．４％、及びβ−ターメロンを１１．５％含有していた。The hexane extract was analyzed using GCMS under the following conditions.
・ Column: Intertcap Pure Wax (0.25 id × 0.25 μm × 60 m)
・ Injection volume: 1.0 μl
・ Temperature increase: Hold at 50 ° C for 2 minutes, 2.5 ° C temperature increase / minute → up to 240 ° C
Carry gas flow rate: Helium 1.2 ml / min Split ratio: 1/80
From the results of GCMS analysis, the compounds were estimated to be AR-turmerone, α-turmerone and β-turmerone by the attached library search (wiley7n and NIST08).
The hexane extract contained 9.9% AR-turmerone, 30.4% α-turmerone, and 11.5% β-turmerone.
ヘキサン抽出物を以下のHPLC条件で分画した。
・カラム；L-column ODS （20 id × 250 mm）
・移動相；water:acetonitrile（20：80, v/v）
・流速：18.9 ml/min
・カラム温度；室温
・検出；UV 243 nm
・注入量；10 μl
ヘキサン抽出物の有効成分としてRT７．５、１０．５及び１１．０の画分よりそれぞれ無色のオイル状物質を得た。従来、α−ターメロン及びβ−ターメロンは分離することが難しい物質として知られていたが、上記のような簡便な方法で抽出できたのは特筆すべきことである。The hexane extract was fractionated under the following HPLC conditions.
・ Column: L-column ODS (20 id × 250 mm)
・ Mobile phase: water: acetonitrile (20:80, v / v)
・ Flow rate: 18.9 ml / min
・ Column temperature; Room temperature ・ Detection; UV 243 nm
・ Injection volume: 10 μl
As an active ingredient of the hexane extract, colorless oily substances were obtained from the fractions of RT7.5, 10.5 and 11.0, respectively. Conventionally, α-turmerone and β-turmerone have been known as substances that are difficult to separate, but it should be noted that they can be extracted by the simple method as described above.
上記無色のオイル状物質について、上記段落［００５０］記載のＧＣＭＳ条件で分析し、その結果から付属のライブラリー検索（wiley7nおよびNIST08）およびＮＭＲ解析を用いて化合物がそれぞれＡＲ−ターメロン、α−ターメロン及びβ−ターメロンであることを確認した（Hideji Itokawa,Fusayoshi Hirayama,Kazuko Funakoshi and Koichi Takeya Chem.Pharm.Bull.33(8)3488-3492(1985)及びShin-ichi Uehara,Ichiro Yasuda,Koichi Takeya,Hideji Itokawa Yakugaku zasshi 112(11),817-823の文献値との比較により確認した）。 The colorless oily substance was analyzed under the GCMS conditions described in the above paragraph [0050], and the compounds were identified as AR-turmerone and α-turmerone using the attached library search (wiley7n and NIST08) and NMR analysis, respectively. And β-turmerone (Hideji Itokawa, Fusayoshi Hirayama, Kazuko Funakoshi and Koichi Takeya Chem. Pharm. Bull. 33 (8) 3488-3492 (1985) and Shin-ichi Uehara, Ichiro Yasuda, Koichi Takeya, It was confirmed by comparison with literature values of Hideji Itokawa Yakugaku zasshi 112 (11), 817-823).
上記で同定した化合物（ＡＲ−ターメロン、α−ターメロン及びβ−ターメロン）の標準品の酵素阻害活性を、上記の（β‐セクレターゼ阻害率の測定）と同様の方法で検討し、各標準品についてＩＣ５０値を算出した結果、以下の通りであった。
ＡＲ−ターメロン：９２μＭ
α−ターメロン：３９μＭ
β−ターメロン：６２μＭ
上記ＩＣ５０値により、ＡＲ−ターメロン、α−ターメロン及びβ−ターメロンが、β−セクレターゼ阻害活性を有することがわかった。
このＩＣ５０値は、本発明者らが以前に見出し、特願２０１５−１４６２０８において記載したセサモリン、ピパタリン及びエチル４−メトキシシンナメートのＩＣ５０値（セサモリン：０．１４ｍＭ、エチル４−メトキシシンナメート：０．６７６ｍＭ、ピパタリン：０．３０４ｍＭ）と比較しても顕著に低いものであり、ＡＲ−ターメロン、α−ターメロン及びβ−ターメロンは非常に高いβ‐セクレターゼ阻害活性を有することが明らかになった。
また、本発明の抽出方法は特願２０１５−１４０２０８記載の抽出方法と比較して簡便なものであるため、生産コストを１／１０以下に抑えることができる。The enzyme inhibition activity of the standard products of the above-identified compounds (AR-turmerone, α-turmerone and β-turmerone) was examined by the same method as the above (measurement of β-secretase inhibition rate). As a result of calculating IC50 value, it was as follows.
AR-turmeron: 92 μM
α-turmerone: 39 μM
β-turmerone: 62 μM
From the above IC50 values, it was found that AR-turmerone, α-turmerone and β-turmerone have β-secretase inhibitory activity.
This IC50 value is the IC50 value (sesamolin: 0.14 mM, ethyl 4-methoxycinnamate: 0 of sesamolin, pipetaline and ethyl 4-methoxycinnamate previously found by the present inventors and described in Japanese Patent Application No. 2015-146208. .676 mM, pipetalin: 0.304 mM), and AR-turmerone, α-turmerone and β-turmerone were found to have very high β-secretase inhibitory activity.
Moreover, since the extraction method of the present invention is simpler than the extraction method described in Japanese Patent Application No. 2015-140208, the production cost can be suppressed to 1/10 or less.
本発明は、アルツハイマー型痴呆症を予防するための医薬製剤に好適に使用することができ、清涼飲料水、乳製品、菓子類又はサプリメント等の各種飲食品の添加剤に好適に使用することができる。 The present invention can be suitably used as a pharmaceutical preparation for preventing Alzheimer-type dementia, and can be suitably used as an additive for various foods and beverages such as soft drinks, dairy products, confectionery, and supplements. it can.
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