JPWO2016140327A1 - Micro chamber array plate - Google Patents

Abstract

被験試料中に存在する膨大な数の細胞中に混在する少数の標的細胞（特定の細胞）を高感度、且つ高い網羅性で検出することを可能にする。【解決手段】各種細胞を収容し得る凹部であるマイクロチャンバーを同一形状で複数その主面上に規則的に配置形成したマイクロチャンバーアレイプレートである。主面及びマイクロチャンバーは親水性表面を有し、マイクロチャンバーは、凹部の開口形状の重心点を主面上の仮想格子点と一致するように配置形成される。また、隣接する仮想格子点を結ぶ線分のうちの３０％以下で残存させる開口形状を有する。A small number of target cells (specific cells) mixed in a huge number of cells existing in a test sample can be detected with high sensitivity and high coverage. A microchamber array plate in which a plurality of microchambers, which are concave portions capable of accommodating various cells, are regularly arranged and formed on the main surface thereof in the same shape. The main surface and the microchamber have a hydrophilic surface, and the microchamber is arranged and formed so that the center of gravity of the opening shape of the recess coincides with the virtual lattice point on the main surface. Moreover, it has an opening shape that remains in 30% or less of the line segments connecting adjacent virtual lattice points.

Description

本発明は、マイクロチャンバーアレイプレートに関し、特に、混在する少数の標的細胞を高感度且つ高い網羅性をもって検出できるマイクロチャンバーアレイプレートに関する。   The present invention relates to a microchamber array plate, and more particularly to a microchamber array plate that can detect a small number of mixed target cells with high sensitivity and high coverage.

幅広い研究分野において、様々な種類の複数の細胞を含む試料から特定の細胞又はこれを含有する細胞の小群を同定することが求められる。特に、医学、薬学に関連するバイオテクノロジーの研究開発及び臨床現場では、多数の細胞の中から特定の細胞（例えば、特定の物質を有する又は産出する細胞、あるいは病原菌に感染した細胞や癌細胞等）の有無を検出することが実験の進行や病気の診断にとって重要となる。しかしながら、特定の細胞の存在割合が低い場合、この特定の細胞又は該細胞を含有する細胞の小群を同定することは困難である。   In a wide range of research fields, it is required to identify specific cells or small groups of cells containing them from samples containing multiple cells of various types. In particular, in the research and development of biotechnology related to medicine and pharmacy, and in the clinical field, a specific cell (for example, a cell having or producing a specific substance, a cell infected with a pathogen, a cancer cell, etc.) ) Is important for the progress of experiments and diagnosis of diseases. However, it is difficult to identify this specific cell or a small group of cells containing the cell when the proportion of the specific cell is low.

例えば、マラリア原虫が赤血球に感染して生じる感染症の１つとしてのマラリア原虫感染症では、以下のようにしてこれを検出・診断している。   For example, a malaria parasite infection as one of infections caused by infection of red blood cells with plasmodium is detected and diagnosed as follows.

顕微鏡下でマラリア原虫による感染の有無及びその程度を観察する方法では、血液細胞をスライドガラスに塗抹し乾燥させ、ギムザ染色した後に染色操作を行って顕微鏡観察するだけで可能であり、簡便である。しかしながら、検出・診断には時間と高度な観察テクニックが必要であり、検出感度は非常に低い。例えば、４０分程度の所要時間で、全血液細胞のうちの少なくとも０．０１％程度の細胞が感染している場合にかろうじて検出できる程度の検出感度（検出限界）である。   In the method of observing the presence and extent of infection with malaria parasites under a microscope, blood cells can be smeared on a slide glass, dried, stained with Giemsa, then stained, and observed with a microscope. . However, detection and diagnosis require time and advanced observation techniques, and the detection sensitivity is very low. For example, the detection sensitivity (detection limit) is such that it can barely be detected when at least about 0.01% of all blood cells are infected in a required time of about 40 minutes.

また、イムノクロマトグラフィー法を利用する方法では、検査を簡便に実施できるように検査キットも販売されており、簡単な操作で感染の有無・程度を観察できる。例えば、２０分程度の所要時間で、上記した顕微鏡下での観察と同程度の検出感度となる。一方、擬陽性も出やすいことから他の方法との併用が推奨されている。   In addition, in the method using the immunochromatography method, a test kit is also sold so that the test can be easily performed, and the presence / absence and degree of infection can be observed with a simple operation. For example, in the required time of about 20 minutes, the detection sensitivity is comparable to that observed under the microscope described above. On the other hand, combined use with other methods is recommended because false positives are likely to occur.

更に、ＰＣＲ法を利用する方法では、上記した顕微鏡下での観察等とは異なり、比較的高い検出感度を得られる。一方で、結果を得るまでに５時間程度を要し、操作が煩雑で高度な観察テクニックを要する。また、試料の状態やプライマーによっては反応条件設定が難しく検出できない場合もある。従って、ＰＣＲ法単独では感染診断に不向きである。   Furthermore, in the method using the PCR method, a relatively high detection sensitivity can be obtained unlike the observation under the microscope described above. On the other hand, it takes about 5 hours to obtain the result, and the operation is complicated and an advanced observation technique is required. In addition, depending on the state of the sample and the primers, it may be difficult to set reaction conditions and cannot be detected. Therefore, the PCR method alone is not suitable for infection diagnosis.

上記したような欠点を補うべく、迅速、簡便、かつ検出感度の高い、新たな感染症の検出方法が求められており、マイクロアレイチップを用いた方法などが提案されている。   In order to compensate for the above-described drawbacks, a new method for detecting an infectious disease that is quick, simple, and high in detection sensitivity is required, and a method using a microarray chip has been proposed.

特許文献１には、マイクロチャンバーを集積化し、ヒーター等と連結して、ハイスループットに生体試料の生化学反応等を行うことの可能なシステムが開示されている。しかしながら、細胞レベルで検出できるほど感度が高くはなく、膨大な数の細胞中に混在する少数の標的細胞を高感度に検出することは困難である。   Patent Document 1 discloses a system that can integrate a micro chamber and connect it to a heater or the like to perform a biochemical reaction of a biological sample with high throughput. However, the sensitivity is not so high as to be detected at the cell level, and it is difficult to detect a small number of target cells mixed in a huge number of cells with high sensitivity.

特許文献２には、ポリマーを基板上にパターニングして、これに所定の物質を固定させ、固定された該物質に細胞を作用させることにより、該物質の細胞に対する作用を観察する技術が開示されている。しかしながら、各パターンに一定数の細胞を固定化することは困難であり、また膨大な数の細胞中に混在する少数の標的細胞を高感度に検出することは困難である。   Patent Document 2 discloses a technique for observing the action of a substance on cells by patterning a polymer on a substrate, fixing a predetermined substance on the substrate, and causing cells to act on the fixed substance. ing. However, it is difficult to fix a fixed number of cells in each pattern, and it is difficult to detect a small number of target cells mixed in a huge number of cells with high sensitivity.

特許文献３には、１つのリンパ球が格納されるように設計されたマイクロウェルを多数集積化したアレイチップが開示されている。しかしながら、マイクロウェルには一細胞しか導入できないため、アレイチップ上に集積化されたマイクロウェルの数以上の細胞をスクリーニングすることは困難である。従って、膨大な数（１００〜１０００万個）の細胞中に混在する少数の標的細胞を高感度に検出することは困難である。また、導入された細胞をさらに培養やPCRすることは極めて困難である。   Patent Document 3 discloses an array chip in which a large number of microwells designed to store one lymphocyte are integrated. However, since only one cell can be introduced into the microwell, it is difficult to screen more than the number of microwells integrated on the array chip. Therefore, it is difficult to detect a small number of target cells mixed in a huge number (1 to 10 million) of cells with high sensitivity. Further, it is extremely difficult to further culture and PCR the introduced cells.

更に、ベッドサイド等でも容易に使用できる新しい検出手段も求められている。   Furthermore, a new detection means that can be easily used at the bedside or the like is also demanded.

特許文献４には、マイクロチャンバーの大きさ（特に、縦横の比率）やチップ表面の水接触角が特定の範囲の値を有するマイクロチップは開示されている。これによれば、膨大な数の細胞中に混在する少数の標的細胞（特定の細胞）を高感度に検出することができる。   Patent Document 4 discloses a microchip in which the size of the microchamber (particularly the aspect ratio) and the water contact angle on the chip surface have values in a specific range. According to this, a small number of target cells (specific cells) mixed in a huge number of cells can be detected with high sensitivity.

具体的には、チップ上へ多数の細胞を含む試料を展開して細胞を各マイクロチャンバーに格納する。過剰な細胞はマイクロアレイチップから除去（洗浄）し、各マイクロチャンバー内にほぼ均一に単層として細胞を格納する。特定の大きさのマイクロチャンバーや特定の水接触角を有することで、測定試料を与えて各マイクロチャンバー内に単層として細胞を格納されなかった場合にも、洗浄することで各マイクロチャンバー内にほぼ均一に単層として細胞を格納できる。この利点としては、（ｉ）マイクロチャンバー内で重なった細胞によって検出標的である特定の細胞が他の細胞の下に位置してしまって、検出を困難にさせることを防止できる、（ｉｉ）顕微鏡で観察する際に焦点を容易に合わせ得て、共焦点レーザー顕微鏡による観察でもバックグラウンドを抑制でき、高感度で観察できる、（ｉｉｉ）単層に格納された細胞上に別の種類の細胞をのせて、それぞれの細胞の相互作用を簡便かつ効率よく検討できる、などといった点を挙げられる。また、特許文献４に記載のチップでは、セルスクレイパー等の器具を使用して、マイクロチャンバー以外の部分に吸着した余分な細胞を除去（洗浄）できることも開示されている。 Specifically, a sample containing a large number of cells is developed on the chip, and the cells are stored in each microchamber. Excess cells are removed (washed) from the microarray chip, and the cells are stored almost uniformly as a monolayer in each microchamber. By having a specific size micro-chamber and a specific water contact angle, even if a measurement sample is given and cells are not stored as a single layer in each micro-chamber, it can be washed into each micro-chamber. Cells can be stored almost uniformly as a single layer. Advantages include (i) that a specific cell that is a detection target is located under another cell by cells that overlap in the microchamber, thereby preventing detection from being difficult. (Ii) a microscope (Iii) It is possible to easily adjust the focus when observing with a confocal laser microscope, and the background can be suppressed with high sensitivity. (Iii) Another type of cell on a cell stored in a monolayer In addition, it is possible to easily and efficiently study the interaction of each cell. The chip disclosed in Patent Document 4 also discloses that an extra cell adsorbed on a portion other than the microchamber can be removed (washed) using an instrument such as a cell scraper.

特表２００４−５０２９２９号公報JP-T-2004-502929 特開２００４−１２５７８１号公報JP 2004-125781 A 特開２００４−１８７６７６号公報JP 2004-187676 A 国際公開第２０１０／０２７００３号International Publication No. 2010/027003

特許文献４に記載のチップは、マイクロチャンバー内に単層に格納された細胞以外の細胞を容易に洗浄（除去）でき、その結果、マイクロチャンバー内に細胞を単層に格納できる。一方で、細胞を洗浄（除去）することは、被験試料中の細胞を検査に供さないことでもある。目的とする細胞が被験試料中に比較的高い確率で存在する場合、これは大きな問題とならないが、特に、目的の細胞が被験試料中にごく低い確率でしか存在しない場合、目的の細胞が検出されないこと、すなわち、検出の網羅性を低くするリスク要因となりえる。   The chip described in Patent Document 4 can easily wash (remove) cells other than cells stored in a single layer in the microchamber, and as a result, can store cells in the single layer in the microchamber. On the other hand, washing (removing) cells also means not subjecting the cells in the test sample to a test. This is not a major problem when the target cell is present in the test sample with a relatively high probability, but it is detected especially when the target cell is present in the test sample with a very low probability. That is, it can be a risk factor that lowers the comprehensiveness of detection.

本発明は、以上のような状況に鑑みてなされたものであって、その目的とするところは、被験試料中に存在する膨大な数の細胞中に混在する少数の標的細胞（特定の細胞）について高感度、且つ高い網羅性で検出できるようにするマイクロチャンバーアレイプレートを提供することにある。   The present invention has been made in view of the situation as described above, and the object of the present invention is to provide a small number of target cells (specific cells) mixed in a huge number of cells present in a test sample. It is an object of the present invention to provide a microchamber array plate that enables detection with high sensitivity and high coverage.

本発明は、各種細胞を収容し得る凹部であるマイクロチャンバーを同一形状で且つ複数その主面上の規則的に分散配列した仮想格子点上に配置形成したマイクロチャンバーアレイプレートであって、前記主面及び前記マイクロチャンバーの内面は親水性表面を有し、前記マイクロチャンバーは、前記凹部の開口形状の重心点を前記主面上の前記仮想格子点と一致するように配置形成され、且つ、隣接する前記マイクロチャンバーの前記重心間を結ぶ線分のうちの３０％以下で前記主面を残存させる前記開口形状を有する、ことを特徴とする。 The present invention is a microchamber array plate in which microchambers, which are recesses capable of accommodating various cells, are arranged and formed on virtual lattice points having the same shape and regularly dispersed on the principal surface thereof, The surface and the inner surface of the microchamber have a hydrophilic surface, and the microchamber is arranged and formed so that the center of gravity of the opening shape of the recess coincides with the virtual lattice point on the main surface, and adjacent It has the opening shape which leaves the main surface in 30% or less of the line segment which connects between the centroids of the micro chamber.

かかる発明によれば、細胞を含む被検試薬をマイクロチャンバーアレイプレートに適用後、これを洗浄しなくても、マイクロチャンバーアレイプレートの上面への細胞の残存を抑制できる。またマイクロチャンバー内に効率的に細胞を単層として格納できる。故に、膨大な数の細胞中に混在する少数の標的細胞（特定の細胞）のマイクロチャンバー内に確実に捕捉し、これを高感度に検出できて、結果として、高い網羅性での検出を実現できるのである。 According to this invention, after the test reagent containing cells is applied to the microchamber array plate, the remaining of the cells on the upper surface of the microchamber array plate can be suppressed without washing it. In addition, cells can be efficiently stored as a single layer in the microchamber. Therefore, a small number of target cells (specific cells) mixed in a vast number of cells can be reliably captured in the microchamber and detected with high sensitivity, resulting in detection with high coverage. It can be done.

上記した発明において、前記開口形状の前記重心点を直線でつないだ閉線で画される領域のうち、前記開口形状の占める合計面積の比率を５０％以上とすることを特徴としてもよい。更に、前記親水性表面は、水接触角を４０°以下とすることを特徴としてもよい。かかる発明によれば、マイクロチャンバーアレイプレートの上面への細胞の残存をより抑制できて、少数の標的細胞をマイクロチャンバー内に確実に捕捉し、これを高感度に検出できて、結果として、高い網羅性での検出を実現できるのである。   In the above-described invention, the ratio of the total area occupied by the opening shape may be 50% or more in a region defined by a closed line connecting the center of gravity of the opening shape with a straight line. Furthermore, the hydrophilic surface may have a water contact angle of 40 ° or less. According to this invention, the remaining of the cells on the upper surface of the microchamber array plate can be further suppressed, a small number of target cells can be reliably captured in the microchamber, and this can be detected with high sensitivity. Detection with completeness can be realized.

上記した発明において、前記仮想格子点は、１つの前記仮想格子点を中心とした同心円上に順次前記仮想格子点を配置してなることを特徴としてもよい。更に、前記仮想格子点はそのうちの隣接する３点を等距離で最隣接させる繰り返し規則配置を有することを特徴としてもよい。かかる発明によれば、特定の細胞又は当該特定の細胞を含有する細胞の小群をより簡便にマイクロチャンバー内に定量又は半定量できるのである。   In the above-described invention, the virtual lattice points may be formed by sequentially arranging the virtual lattice points on concentric circles centered on one virtual lattice point. Furthermore, the virtual lattice points may have a repeating regular arrangement in which three adjacent points are closest to each other at an equal distance. According to this invention, a specific cell or a small group of cells containing the specific cell can be quantified or semi-quantified in a microchamber more easily.

上記した発明において、前記開口形状は円又は前記円に内接する正多角形であることを特徴としてもよい。また、前記開口形状は正六角形であり、隣接する前記マイクロチャンバー同士においてそのエッジ線を互いに平行に配置されていることを特徴としてもよい。かかる発明によれば、特定の細胞又は当該特定の細胞を含有する細胞の小群をより簡便に且つより正確にマイクロチャンバー内に定量又は半定量できるのである。   In the above-described invention, the opening shape may be a circle or a regular polygon inscribed in the circle. The opening shape may be a regular hexagon, and the edge lines may be arranged in parallel with each other between the adjacent micro chambers. According to this invention, a specific cell or a small group of cells containing the specific cell can be quantified or semi-quantified in the microchamber more easily and more accurately.

上記した発明において、前記正六角形の外接円の径は２０〜５００μｍの範囲内であることを特徴としてもよい。また、前記マイクロチャンバーは底部に向かって断面積を小さくするテーパー側面を有することを特徴としてもよい。更に、前記マイクロチャンバーは２０μｍ以上の深さを有することを特徴としてもよい。また、前記マイクロチャンバーは、前記外接円の径に対する前記深さの比を０．３５〜１の範囲内とすることを特徴としてもよい。かかる発明によれば、特定の細胞又は当該特定の細胞を含有する細胞の小群をより簡便に且つより正確にマイクロチャンバー内に定量又は半定量できるのである。   In the above-mentioned invention, the diameter of the circumscribed circle of the regular hexagon may be in the range of 20 to 500 μm. The microchamber may have a tapered side surface that decreases in cross-sectional area toward the bottom. Further, the microchamber may have a depth of 20 μm or more. The microchamber may have a ratio of the depth to the diameter of the circumscribed circle in a range of 0.35 to 1. According to this invention, a specific cell or a small group of cells containing the specific cell can be quantified or semi-quantified in the microchamber more easily and more accurately.

マイクロチャンバーアレイプレートの正面図である。It is a front view of a micro chamber array plate. Ａ：図１の領域７の拡大図、Ｂ：マイクロチャンバー（逆正六角錘台形）の部分拡大斜視図、Ｃ：マイクロチャンバー（逆錘台形）の断面図である。1A is an enlarged view of a region 7 in FIG. 1, B is a partially enlarged perspective view of a micro chamber (inverted regular hexagonal trapezoid), and C is a cross-sectional view of the micro chamber (inverted truncated pyramid). 図１の領域７の部分拡大図である。It is the elements on larger scale of the area | region 7 of FIG. Ａ：マイクロチャンバーの配列、Ｂ：マイクロチャンバーあたり１つの感染した血液細胞を検出したところを示す図である。A: arrangement of microchambers, B: detection of one infected blood cell per microchamber. 細胞の同定方法を示すフロー図である。It is a flowchart which shows the identification method of a cell. マイクロチャンバーアレイプレートの顕微鏡写真である。It is a microscope picture of a micro chamber array plate. マイクロチャンバーに細胞（赤血球）を保持させた図６のマイクロチャンバーアレイプレートの顕微鏡写真である。FIG. 7 is a photomicrograph of the microchamber array plate of FIG. 6 in which cells (red blood cells) are held in the microchamber. 水接触角をＡ：８０度、Ｂ：２５度、Ｃ：１０度としたマイクロチャンバーアレイプレートの顕微鏡写真である。It is a microscope picture of the microchamber array plate which made water contact angle A: 80 degree | times, B: 25 degree | times, and C: 10 degree | times. 開口の長径及び深さの異なるマイクロチャンバーに赤血球を格納させたマイクロチャンバーアレイプレートの顕微鏡写真である。It is a microscope picture of the microchamber array plate which stored the erythrocyte in the microchamber from which the major axis and depth of an opening differ. マイクロチャンバーに細胞（白血球）を保持させたマイクロチャンバーアレイプレートの顕微鏡写真である。It is a microscope picture of the micro chamber array plate which hold | maintained the cell (white blood cell) in the micro chamber. マイクロチャンバーに赤血球を格納したマイクロチャンバーアレイプレートの顕微鏡写真である。It is a microscope picture of the microchamber array plate which stored erythrocytes in the microchamber. マイクロチャンバーにヒト白血病細胞（ＣＥＭ）を格納したマイクロチャンバーアレイプレートの顕微鏡写真である。It is a microscope picture of the microchamber array plate which stored the human leukemia cell (CEM) in the microchamber. マイクロチャンバーに、Ａ：赤血球、Ｂ：ヒト白血病細胞（ＣＥＭ）を格納したマイクロチャンバーアレイプレートの顕微鏡写真である。It is a microscope picture of the microchamber array plate which stored A: red blood cells and B: human leukemia cells (CEM) in the microchamber. マイクロチャンバーの間隔と格納された細胞数である。Microchamber spacing and the number of stored cells. マイクロチャンバーにヒト白血病細胞（ＣＥＭ）を格納したマイクロチャンバーアレイプレートの顕微鏡写真である。It is a microscope picture of the microchamber array plate which stored the human leukemia cell (CEM) in the microchamber. マイクロチャンバーの間隔と上面に残存した細胞数である。These are the distance between the microchambers and the number of cells remaining on the upper surface.

本発明者らが鋭意検討を行ったところ、上記した特許文献４に開示のマイクロチップの特性を備えつつ、さらに、複数のマイクロチャンバーを特定の配置にすることで、細胞の適用後にマイクロチャンバーアレイプレートを洗浄しなくても、マイクロチャンバーアレイプレートの上面への細胞の残存を抑制でき、及びマイクロチャンバー内に効率的に細胞を単層として格納でき、これにより、マイクロチャンバー内に膨大な数の細胞中に混在する少数の標的細胞（特定の細胞）の高感度、且つ高い網羅性での検出を実現できることを見出した。   As a result of intensive studies by the present inventors, a microchamber array is provided after application of cells by providing a plurality of microchambers in a specific arrangement while providing the characteristics of the microchip disclosed in Patent Document 4 described above. Without washing the plate, it is possible to suppress the remaining of cells on the top surface of the microchamber array plate, and the cells can be efficiently stored as a single layer in the microchamber. It has been found that detection of a small number of target cells (specific cells) mixed in cells with high sensitivity and high completeness can be realized.

具体的には、ここでのマイクロチャンバーアレイプレートは、各種細胞を収容し得る凹部であるマイクロチャンバーを同一形状で複数その主面上に規則的に分散配置形成したものである。プレートの主面及びマイクロチャンバーは親水性表面を有する。そして、複数のマイクロチャンバーの最外部に存在するマイクロチャンバーの開口の重心を直線でつないだ閉線４で画される領域Ａ（図１参照）内において、この上面のいずれの点においても、当該点を中心とした特定の直径を有する円の範囲内にいずれかのマイクロチャンバーの開口周縁の少なくとも一部が重なるように、複数のマイクロチャンバーが配列されるのである。及び／又は複数のマイクロチャンバーの最外部に存在するマイクロチャンバーの開口の重心を直線でつないだ閉線４で画される領域Ａの面積を１００％とし、領域Ａにおける複数のマイクロチャンバーの開口が占める合計面積の比率を空隙率としたときに、当該空隙率が１００％より小さく５０％以上にすることである。 Specifically, the microchamber array plate here has a plurality of microchambers that are concave portions capable of accommodating various cells in the same shape and regularly distributed and formed on the main surface. The main surface of the plate and the microchamber have a hydrophilic surface. And in the region A (see FIG. 1) defined by the closed line 4 connecting the centroids of the openings of the microchambers existing at the outermost part of the plurality of microchambers at any point on this upper surface, The plurality of microchambers are arranged so that at least a part of the peripheral edge of the opening of any one of the microchambers overlaps within a circle having a specific diameter centered on the point. And / or the area of the region A defined by the closed line 4 connecting the centroids of the microchamber openings existing at the outermost part of the plurality of microchambers with a straight line is 100%, and the openings of the plurality of microchambers in the region A are When the ratio of the total area occupied is the porosity, the porosity is less than 100% and 50% or more.

つまり、上面から凹むマイクロチャンバーを複数備え、前記複数のマイクロチャンバーに多数の細胞を格納可能なマイクロチャンバーアレイプレートであって、
（Ｉ）前記マイクロチャンバーが下記（ｉ）及び（ｉｉ）の条件を備え：
（ｉ）前記複数のマイクロチャンバーの全てが、それぞれ、（１：０．３５〜１）の範囲内の（マイクロチャンバーの開口の長径：深さ）の比［ここで、マイクロチャンバーの開口の長径はマイクロチャンバーの開口の重心を通り、かつマイクロチャンバーの開口の周縁で画される線分のうちの最長の線分の長さとして定義され、及びマイクロチャンバーの深さは前記上面からマイクロチャンバーの最深部までの長さとして定義される］を有する；
（ｉｉ）前記複数のマイクロチャンバーの全ての内面及び前記マイクロチャンバーアレイプレートの上面の水接触角が４０°以下である、
（ＩＩ）当該複数のマイクロチャンバーの全ての底部の長径［ここで、マイクロチャンバーの底部の長径はマイクロチャンバーの底部の重心を通り、かつマイクロチャンバーの底部の周縁で画される線分のうちの最長の線分の長さとして定義される］が、２０〜５００μｍの範囲内であり、かつ
（ＩＩＩ）前記マイクロチャンバーが下記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）からなる群より選択される少なくとも１つの条件を備える：
（ｉｉｉ）前記複数のマイクロチャンバーの最外部に存在するマイクロチャンバーの開口の重心を直線でつないだ閉線４で画される領域Ａ内においては、前記上面のいずれの点においても、当該点を中心とした直径ｘの円の範囲内にいずれかの前記マイクロチャンバーの開口周縁の少なくとも一部が重なるように、前記複数のマイクロチャンバーが配列され、かつ
前記直径ｘが３５μｍである；
（ｉｖ）前記複数のマイクロチャンバーの最外部に存在するマイクロチャンバーの開口の重心を直線でつないだ閉線４で画される領域Ａの面積を１００％とし、領域Ａにおける複数のマイクロチャンバーの開口が占める合計面積の比率を空隙率としたときに、当該空隙率が１００％より小さく５０％以上である
［ここで、最外部に存在するマイクロチャンバーとは、前記複数のマイクロチャンバーの全てを内包できる最短の周長を有し、可能な限り多くのマイクロチャンバーの周縁に接する閉線５で画される領域ａ内において前記閉線５に接するマイクロチャンバーである］、マイクロチャンバーアレイプレートを１つの態様とし得る。また、前記マイクロチャンバーの開口の全てが、２０〜５００μｍの範囲内の長径、及び２０μｍ以上の深さを有する。That is, a microchamber array plate comprising a plurality of microchambers recessed from the upper surface and capable of storing a large number of cells in the plurality of microchambers,
(I) The microchamber has the following conditions (i) and (ii):
(I) A ratio of (long diameter of microchamber opening: depth) within a range of (1: 0.35 to 1) in each of the plurality of microchambers [where the long diameter of the microchamber opening is Is defined as the length of the longest line segment that passes through the center of gravity of the opening of the microchamber and is defined by the periphery of the opening of the microchamber, and the depth of the microchamber is from the top surface to the microchamber. Defined as the length to the deepest part;
(Ii) The water contact angle of all inner surfaces of the plurality of microchambers and the upper surface of the microchamber array plate is 40 ° or less.
(II) The major axis of all the bottoms of the plurality of microchambers [where the major axis of the microchamber bottom is a line segment that passes through the center of gravity of the microchamber bottom and is defined by the periphery of the microchamber bottom. Defined as the length of the longest line segment] within the range of 20 to 500 μm, and (III) at least one condition in which the microchamber is selected from the group consisting of (iii) and (iv) below With:
(Iii) In the region A defined by the closed line 4 in which the centroids of the microchamber openings existing on the outermost sides of the plurality of microchambers are connected by a straight line, the point is determined at any point on the upper surface. The plurality of microchambers are arranged so that at least a part of the opening periphery of any one of the microchambers overlaps within a circle having a diameter x as a center; and the diameter x is 35 μm;
(Iv) The area of the region A defined by the closed line 4 connecting the centroids of the microchamber openings existing outside the plurality of microchambers by a straight line is defined as 100%, and the openings of the plurality of microchambers in the region A The void ratio is less than 100% and 50% or more when the ratio of the total area occupied by [the outermost microchamber includes all of the plurality of microchambers] A microchamber that is in contact with the closed line 5 in a region a defined by the closed line 5 that has the shortest possible perimeter and is in contact with the periphery of as many microchambers as possible. It can be an embodiment. In addition, all the openings of the microchamber have a major axis in the range of 20 to 500 μm and a depth of 20 μm or more.

多数の細胞を含む被験試料から、前記被験試料に含まれる特定の細胞又は当該特定の細胞を含有する細胞の小群を同定するための方法であって、
（ａ）上記したマイクロチャンバーアレイプレートに、前記被験試料中の細胞を展開して、被験試料中の細胞をマイクロチャンバーに格納する工程；及び
（ｂ）各マイクロチャンバーに、特定の細胞が存在するか否かを判定する工程、
（ｃ）特定の細胞が存在すると判定されたマイクロチャンバーに入っている細胞を、特定の細胞又は当該特定の細胞を含有する細胞の小群であると同定する工程、
を含む、同定方法を１つの態様とする。A method for identifying a specific cell contained in a test sample or a small group of cells containing the specific cell from a test sample containing a large number of cells,
(A) expanding the cells in the test sample on the micro-chamber array plate, and storing the cells in the test sample in the micro-chamber; and (b) a specific cell is present in each micro-chamber. Determining whether or not,
(C) identifying a cell in a microchamber determined to contain a specific cell as a specific cell or a small group of cells containing the specific cell;
One aspect of the identification method includes:

。
ここで、前記特定の細胞がほ乳類由来細胞、鳥類由来細胞又は酵母であり得る。.
Here, the specific cell may be a mammal-derived cell, an avian-derived cell, or a yeast.

更に、前記多数の細胞を含む被験試料の細胞濃度が１×１０^６〜１×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌの範囲内であり得る。また、前記多数の細胞を含む被験試料中の細胞数が１×１０^５〜１×１０^８個の範囲内であり得る。Furthermore, the cell concentration of the test sample containing a large number of cells may be in the range of 1 × 10 ⁶ to 1 × 10 ⁸ cells / ml. Moreover, the number of cells in the test sample containing the large number of cells may be in the range of 1 × 10 ⁵ to 1 × 10 ⁸ .

そして、前記工程（ａ）及び（ｂ）の間に、マイクロチャンバーアレイプレートの上面に残存している細胞を除去する工程を含まないこともできる。 And between the said process (a) and (b), the process of removing the cell which remain | survives on the upper surface of a micro chamber array plate can also be not included.

このようなマイクロチャンバーアレイプレートによれば、被験試料に含まれる細胞を無駄にすることなくマイクロチャンバー内に格納することができる。また、上記した同定方法によれば、従来の同定方法と比較して、膨大な数の細胞中に混在する少数の標的細胞（特定の細胞）の高感度、且つ高い網羅性での検出を実現できるのである。   According to such a microchamber array plate, the cells contained in the test sample can be stored in the microchamber without being wasted. In addition, according to the above-described identification method, compared to the conventional identification method, detection of a small number of target cells (specific cells) mixed in a huge number of cells with high sensitivity and high completeness is realized. It can be done.

以下に、更に詳細を説明する。   Details will be described below.

１．マイクロチャンバーアレイプレート
本発明の１つの実施例としてのマイクロチャンバーアレイプレート（以下、「ＭＣＡＰ」）について、図１〜３を参照しながら説明する。 1. Microchamber Array Plate A microchamber array plate (hereinafter referred to as “MCAP”) as one embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS.

図１に示されるように、ＭＣＡＰ１は、上面から凹ませた凹部としてのマイクロチャンバー（以下、「ＭＣ」）２を複数備え、この複数のＭＣ２に多数の細胞を格納可能である。   As shown in FIG. 1, the MCAP 1 includes a plurality of micro chambers (hereinafter referred to as “MC”) 2 as recesses recessed from the upper surface, and a large number of cells can be stored in the plurality of MCs 2.

図３に示すように、複数のＭＣ２の全ては、ＭＣ２の開口２ｃの長径（外接円径）：深さ２ｂにおいて、１：０．３５〜１の範囲内の比を有する。また、複数のＭＣ２の全ての内面、及びＭＣＡＰ１の上面の水接触角が４０°以下である。 As shown in FIG. 3, all of the plurality of MCs 2 have a ratio in the range of 1: 0.35 to 1 at the major axis (circumferential circle diameter): depth 2 b of the opening 2 c of the MC 2. Moreover, the water contact angles of all the inner surfaces of the plurality of MC2 and the upper surface of the MCAP1 are 40 ° or less.

ここで、ＭＣＡＰ１の形状は、厚みのある長方形を基調とする板状のものであることが好ましく、ＭＣＡＰ１を平面視した時（すなわち、ＭＣＡＰ１をその上面の真上から見た時）の形状が長方形の他、長方形の角の少なくとも１つ以上が丸みを帯びている、又は少なくとも１つ以上に面取りが施されている形状である。このとき、長辺（一方の短辺からもう一方の短辺までの間隔で最も広い部分）の長さが７０〜１５０ｍｍ程度、短辺（一方の長辺からもう一方の長辺までの間隔で最も広い部分）の長さが２５〜９０ｍｍ程度が好ましい。より好ましくは、（長辺）×（短辺）＝（７３〜７７ｍｍ）×（２４〜２７ｍｍ）程度が好ましい。ＭＣＡＰ１の厚みは、０．５〜２２ｍｍ程度、好ましくは０．８〜１．９ｍｍ程度であり、厚みは、均一であってもよいが、上部外縁３の一部又は全部が凹んでいてもよい。   Here, the shape of the MCAP 1 is preferably a plate-like shape based on a thick rectangle, and the shape when the MCAP 1 is viewed in plan (that is, when the MCAP 1 is viewed from directly above the upper surface). In addition to the rectangle, at least one or more corners of the rectangle are rounded or at least one is chamfered. At this time, the length of the long side (the widest part in the interval from one short side to the other short side) is about 70 to 150 mm, the short side (in the interval from one long side to the other long side) The length of the widest portion is preferably about 25 to 90 mm. More preferably, (long side) × (short side) = (73 to 77 mm) × (24 to 27 mm) is preferable. The thickness of the MCAP 1 is about 0.5 to 22 mm, preferably about 0.8 to 1.9 mm. The thickness may be uniform, but a part or all of the upper outer edge 3 may be recessed. .

さらに、図４を併せて参照すると、ＭＣＡＰ１は、その上部外縁３の短辺から内側に向かって１０〜１５ｍｍ程度の範囲に、手でＭＣＡＰ１を保持し、また、被験試料等の情報を記入するためのフロスト部分を備えていてもよい。ＭＣ２の列には番号が付されていてもよい。   Furthermore, referring also to FIG. 4, MCAP1 holds MCAP1 by hand in the range of about 10 to 15 mm inward from the short side of upper outer edge 3, and also fills in information such as the test sample. A frost portion may be provided. The MC2 column may be numbered.

再び図１を参照すると、ＭＣＡＰ１の上部の面であって、複数のＭＣ２の全てを内包できる最短の周長を有し、可能な限り多くのＭＣ２の周縁に接する閉線５から、３５μｍ、好ましくは３０μｍ、より好ましくは２０μｍ外側を囲む閉線８で画された領域を「ＭＣＡＰ１の上面」とする。閉線８は、ＭＣＡＰ１の上部外縁３の少なくとも一部と重なってもよいが、ＭＣＡＰ１がフロスト部分を有する場合には、ＭＣＡＰ１の上面は、フロスト部分とは重ならない。閉線８の０．００１〜２．５ｍｍ、好ましくは０．０５〜２．０ｍｍ、より好ましくは１．０〜１．５ｍｍ外側を囲む閉線６で画される領域が、ＭＣＡＰ１の上部外縁３の少なくとも１辺と接するように、好ましくはＭＣＡＰ１の上部外縁３の直交する２辺（当該上部外縁３が長方形を基調とする形状である場合には長辺と短辺の延長線が直交する）、又はＭＣＡＰ１の上部外縁３の２つの長辺と閉線８で画された領域が接するように、より好ましくはＭＣＡＰ１の上部外縁３の２つの長辺とこれらに直交する短辺（当該上部外縁３が長方形を基調とする形状である場合には長辺と短辺の延長線が直交する）と閉線６で画される領域が接するようにＭＣＡＰ１の上面を配置してもよい。この場合も閉線６で画される領域は、フロスト部分と重ならない。   Referring to FIG. 1 again, it is the upper surface of the MCAP 1 and has the shortest circumference that can contain all of the plurality of MCs 2, and is 35 μm, preferably 35 μm from the closed line 5 that touches the periphery of as many MCs as possible. The area defined by the closed line 8 surrounding the outside of 30 μm, more preferably 20 μm is defined as “the upper surface of MCAP1”. The closed line 8 may overlap at least part of the upper outer edge 3 of the MCAP 1, but when the MCAP 1 has a frost portion, the upper surface of the MCAP 1 does not overlap the frost portion. The area defined by the closed line 6 that surrounds the outside of the closed line 8 by 0.001 to 2.5 mm, preferably 0.05 to 2.0 mm, more preferably 1.0 to 1.5 mm is the upper outer edge 3 of the MCAP 1. Preferably, two orthogonal sides of the upper outer edge 3 of the MCAP 1 are in contact with each other (if the upper outer edge 3 has a shape based on a rectangle, the extended lines of the long side and the short side are orthogonal) More preferably, the two long sides of the upper outer edge 3 of the MCAP 1 and the region defined by the closed line 8 are in contact with each other, more preferably the two long sides of the upper outer edge 3 of the MCAP 1 and the short side perpendicular thereto (the upper outer edge). When the shape 3 is based on a rectangle, the upper side of the MCAP 1 may be arranged so that the region defined by the closed line 6 is in contact with the extended line of the long side and the short side. Also in this case, the region defined by the closed line 6 does not overlap with the frost portion.

ＭＣＡＰ１の上面の大きさは、ヒトが操作できる範囲であり、成人のヒトが片手で操作できる範囲が好ましく、長方形を基調とする場合、長辺（一方の短辺からもう一方の短辺までの間隔で最も広い部分）の長さが７０〜１５０ｍｍ程度、短辺（一方の長辺からもう一方の長辺までの間隔で最も広い部分）の長さが２５〜９０ｍｍ程度が好ましい。より好ましくは、スライドグラスサイズであり、フロスト部分がない場合には（長辺）×（短辺）＝（７３〜７７ｍｍ）×（１８〜２７ｍｍ）程度、又はフロスト部分がある場合には（長辺）×（短辺）＝（５８〜６２ｍｍ）×（１８〜２７ｍｍ）が好ましい。ＭＣＡＰの上面が正方形を基調とするものである場合、一辺（一方の辺から対面するもう一方の辺までの最も広い部分）の長さは、１８〜１５０ｍｍ程度、好ましくは２０〜７５ｍｍである。   The size of the upper surface of the MCAP1 is a range that can be operated by a human, and a range that can be operated by an adult human with one hand is preferable. When the rectangle is based on a long side (from one short side to the other short side) The length of the widest portion is preferably about 70 to 150 mm, and the length of the short side (the widest portion of the distance from one long side to the other long side) is preferably about 25 to 90 mm. More preferably, it is a slide glass size, and when there is no frost part (long side) × (short side) = (73 to 77 mm) × (18 to 27 mm), or when there is a frost part (long) Side) × (short side) = (58 to 62 mm) × (18 to 27 mm) is preferable. When the upper surface of the MCAP is based on a square, the length of one side (the widest part from one side to the other side facing each other) is about 18 to 150 mm, preferably 20 to 75 mm.

また、ＭＣＡＰ１の上面に対応するＭＣＡＰ１の厚みは、均一であることが好ましい。   Moreover, it is preferable that the thickness of MCAP1 corresponding to the upper surface of MCAP1 is uniform.

ＭＣ２内の空間の上部をＭＣＡＰ１の上面からの延長面とした場合のＭＣ２内の空間の形状は、円柱、正多角柱、逆円錐台、逆正多角錘台等が挙げられる。好ましくは円柱、正八角柱、正六角柱、正五角柱、正四角柱、逆円錘台、逆正八角錘台、逆正六角錘台、逆正五角錘台、逆正四角錘台等であり、より好ましくは円柱、正六角柱、正四角柱、逆円錘台、逆正六角錘台、逆正四角錘台等である。   Examples of the shape of the space in the MC2 when the upper portion of the space in the MC2 is an extended surface from the upper surface of the MCAP1 include a cylinder, a regular polygonal column, an inverted truncated cone, and an inverted regular polygonal frustum. Preferably, a cylinder, a regular octagonal column, a regular hexagonal column, a regular pentagonal column, a regular quadrangular column, a reverse frustum base, a reverse regular octagonal pyramid, a reverse regular hexagonal pyramid, a reverse regular pentagonal pyramid, a reverse regular square pyramid, A cylinder, a regular hexagonal column, a regular quadrangular column, a reverse frustum base, a reverse regular hexagonal frustum, a reverse regular square frustum, and the like are preferable.

図２に示すように、ＭＣ２内の空間の形状を逆錘台形とする場合には、ＭＣ２の断面（図２Ｃ参照）において開口２ｃの周縁を通りＭＣＡＰ１の上面と直行する垂線ｎを引いた際、垂線ｎとＭＣ２の内側面との間に形成される角（テーパーともいう）の角度Ｐは、０°より大きく３０°以下、好ましくは５°より大きく２０°以下である。ＭＣ２の底部２ａ及び開口２ｃの形状は、ＭＣ２内の空間の形状に依存する。   As shown in FIG. 2, when the shape of the space in MC2 is an inverted frustum trapezoid, when a perpendicular line n passing through the periphery of the opening 2c and perpendicular to the upper surface of MCAP1 is drawn in the cross section of MC2 (see FIG. 2C) The angle P (also referred to as a taper) formed between the perpendicular n and the inner surface of MC2 is greater than 0 ° and not greater than 30 °, preferably greater than 5 ° and not greater than 20 °. The shapes of the bottom 2a and the opening 2c of MC2 depend on the shape of the space in MC2.

ＭＣ２の底部２ａは平面、曲面（例、凸面、凹面）とすることもできるが、細胞を単層にＭＣ２の底部２ａに並べるためには、可能な限り平面であることが好ましい。また、ＭＣ２内の空間の形状は、１枚のＭＣＡＰ１において、同一形状であることが好ましい。   The bottom 2a of MC2 can be a flat surface or a curved surface (eg, convex surface, concave surface). However, in order to arrange cells in a single layer on the bottom 2a of MC2, it is preferably as flat as possible. Moreover, it is preferable that the shape of the space in MC2 is the same shape in one MCAP1.

さらに、ＭＣ２の配列は、ＭＣＡＰ１の上面を平面視したときに、ＭＣ２の開口２ｃの重心がＭＣＡＰ１の主面上の規則上に並ぶ格子又は斜め格子（仮想格子点）上に分散配列していることが好ましい。ここで格子状とは、隣接する２つのＭＣ２の開口２ｃの重心を通る線分がＭＣＡＰ１の長辺又は短辺と並行であることをいう。また、斜め格子とは、ＭＣ２の偶数列の位置がＭＣ２の奇数列の位置と、ＭＣ２半個分ずれて配列されているもの、又はＭＣ２の奇数列の位置がＭＣ２の偶数列の位置と、ＭＣ２半個分ずれて配列されているものをいう。また、ＭＣ２は、ＭＣ２の開口２ｃの重心が等間隔となるように配列すること、すなわち、１つの仮想格子点を中心とした同心円上に順次仮想格子点を配置して、この仮想格子点に重心を一致させたＭＣ２が配列していることが好ましい。   Further, the arrangement of MC2 is distributed on a lattice or diagonal lattice (virtual lattice points) in which the centers of gravity of the openings 2c of MC2 are regularly arranged on the main surface of MCAP1 when the upper surface of MCAP1 is viewed in plan view. It is preferable. Here, the lattice shape means that a line segment passing through the center of gravity of the openings 2c of two adjacent MC2s is parallel to the long side or the short side of MCAP1. Further, the diagonal lattice means that the position of the even-numbered column of MC2 is shifted from the position of the odd-numbered column of MC2 by half the position of MC2, or the position of the odd-numbered column of MC2 is the position of the even-numbered column of MC2. MC2 is arranged with a half shift. MC2 is arranged so that the centers of gravity of the openings 2c of MC2 are equally spaced, that is, virtual lattice points are sequentially arranged on a concentric circle centered on one virtual lattice point, and the virtual lattice points are arranged at the virtual lattice points. It is preferable that MC2s having the same center of gravity are arranged.

ここでは、図２Ａに示すように、一定間隔ｄで仮想格子点を有する線分ｌ１と、ｄ／２だけ線分ｌ１を長手方向に沿って移動させた線分ｌ２と、を交互に配置させた仮想格子点の配置を有する。線分ｌ１と線分ｌ２との間隔は、隣接する３つの仮想格子点を正三角形１０となるように結ぶことのできるようなものであり、仮想格子点は、隣接する３点を等距離で最隣接させる繰り返し規則配置となる。そして、ＭＣ２は開口２ｃの形状の重心点を主面上の格子と一致するように配置形成され、且つ、隣接する仮想格子点を結ぶ線分（正三角形１０の一辺）のうちの半分以下を残存させる開口間隔を狭くした開口形状を有する。例えば、大きくても５０μｍ程度までの培養細胞であれば、この開口間隔を５０μｍ、好ましくは４０μｍ、さらに好ましくは、３０μｍ以下とすることが好ましい。 Here, as shown in FIG. 2A, line segments l1 having virtual lattice points at a constant interval d and line segments l2 obtained by moving the line segment l1 along the longitudinal direction by d / 2 are alternately arranged. With an arrangement of virtual grid points. The interval between the line segment l1 and the line segment l2 is such that three adjacent virtual lattice points can be connected so as to form the equilateral triangle 10, and the virtual lattice point is an equal distance between the three adjacent points. It becomes the repeating rule arrangement which makes it adjoin most. MC2 is arranged and formed so that the center of gravity of the shape of the opening 2c coincides with the grid on the main surface, and less than half of the line segment (one side of the equilateral triangle 10) connecting the adjacent virtual grid points. It has an opening shape in which the interval between the remaining openings is narrowed. For example, in the case of cultured cells up to about 50 μm at most, the opening interval is preferably 50 μm, preferably 40 μm, more preferably 30 μm or less.

また、図２Ａに示すようにＭＣ２の開口２ｃの長径はＭＣ２の開口２ｃの重心を通り、かつＭＣ２の開口２ｃの周縁で画される線分のうちの最長の線分の長さとして定義される。つまり、開口２ｃの形状の外接円Ｐの直径と一致する。また図２Ｂに示すようにＭＣ２の深さは上面からＭＣ２の最深部までの長さとして定義される。   Further, as shown in FIG. 2A, the major axis of the opening 2c of the MC2 is defined as the length of the longest line segment among the line segments passing through the center of gravity of the opening 2c of the MC2 and defined by the periphery of the opening 2c of the MC2. The That is, it matches the diameter of the circumscribed circle P in the shape of the opening 2c. 2B, the depth of MC2 is defined as the length from the upper surface to the deepest part of MC2.

ＭＣＡＰ１のＭＣ２における開口２ｃの長径：深さ２ｂの比の上限値は１であるが、好ましくは０．８５であり、さらに好ましくは０．８である。また、この比の下限値は、０．３５であるが、好ましくは０．４、さらに好ましくは０．４５である。   The upper limit value of the ratio of the major axis of the opening 2c to the depth 2b in MC2 of MCAP1 is 1, but is preferably 0.85, and more preferably 0.8. The lower limit of this ratio is 0.35, preferably 0.4, and more preferably 0.45.

ＭＣ２の開口２ｃの長径の下限値は２０μｍであるが、好ましくは３０μｍ、より好ましくは５０μｍである。あるいは、後述する深さと上記（ＭＣ２の開口２ｃの長径：深さ）の比から、ＭＣ２の開口２ｃの長径の下限値を２０、２３．５、２５、４４、５０、及び５７．１μｍのいずれかから選択することができる。またＭＣ２の開口２ｃの長径の上限値が５００μｍであるが、ＭＣ２の開口２ｃの長径に応じて４２５、４００、２２５、２００、及び１７５μｍのいずれかから適宜設定できる。ＭＣ２の開口２ｃの長径の範囲は、これらの上限値と下限値を適宜組み合わせて設定することができる。   The lower limit value of the major axis of the opening 2c of MC2 is 20 μm, preferably 30 μm, more preferably 50 μm. Alternatively, based on the ratio of the depth described later and the above (long diameter of the opening 2c of MC2: depth), the lower limit value of the long diameter of the opening 2c of MC2 is any of 20, 23.5, 25, 44, 50, and 57.1 μm. You can choose from. Moreover, although the upper limit of the major axis of the opening 2c of MC2 is 500 μm, it can be set appropriately from any one of 425, 400, 225, 200, and 175 μm according to the major axis of the opening 2c of MC2. The range of the major axis of the opening 2c of MC2 can be set by appropriately combining these upper limit value and lower limit value.

ＭＣ２の開口２ｃの短径はＭＣ２の開口２ｃの重心を通り、かつＭＣ２の開口２ｃの周縁で画される線分のうちの最短の線分の長さとして定義される。ＭＣ２の開口２ｃの短径は、ＭＣ２に細胞を格納できる限り特に制限されない。また、開口２ｃの形状とＭＣ２の開口２ｃの長径から設定してもよい。しかしながら、細胞をＭＣ２内に格納するためには、少なくとも当該短径の下限値は２０μｍ以上、好ましくは、５０μｍ以上、より好ましくは８０μｍ以上であることが好ましい。当該短径の上限値は、ＭＣ２の開口２ｃの長径に応じて設定することができる。なお、開口２ｃの形状が円形の場合には、長径と短径は等しくなる。   The short diameter of the opening 2c of the MC2 is defined as the length of the shortest line segment among the line segments that pass through the center of gravity of the opening 2c of the MC2 and are defined at the periphery of the opening 2c of the MC2. The short diameter of the opening 2c of MC2 is not particularly limited as long as cells can be stored in MC2. Moreover, you may set from the shape of the opening 2c, and the long diameter of the opening 2c of MC2. However, in order to store cells in MC2, at least the lower limit of the minor axis is preferably 20 μm or more, preferably 50 μm or more, more preferably 80 μm or more. The upper limit value of the minor axis can be set according to the major axis of the opening 2c of MC2. In addition, when the shape of the opening 2c is circular, the major axis and the minor axis are equal.

ＭＣ２の深さは、上述の（ＭＣ２の開口２ｃの長径：深さ）の比により、ＭＣ２の開口２ｃの長径の値が決まれば好ましい値を決定することができる。ただし、ＭＣ２は細胞を格納するため、２０μｍ以上の深さを有することが好ましい。すなわち、ＭＣ２は、ＭＣ２の開口２ｃの長径及び深さが上述の比の関係を有し、長径が上述の値を有し、かつ深さが２０μｍ以上、であるものが特に好ましい。   The depth of MC2 can be determined to be a preferable value if the value of the long diameter of the opening 2c of MC2 is determined by the ratio of (the long diameter of the opening 2c of MC2: depth) described above. However, since MC2 stores cells, it is preferable to have a depth of 20 μm or more. That is, it is particularly preferable that the long diameter and the depth of the opening 2c of the MC 2 have the above-described ratio, the long diameter has the above value, and the depth is 20 μm or more.

ＭＣ２の全ての内面及び前記ＭＣＡＰ１の上面の水接触角は４０°以下であるが、好ましくは１０°以下、より好ましくは８°以下、さらに好ましくは５°以下である。   The water contact angle of all inner surfaces of MC2 and the upper surface of MCAP1 is 40 ° or less, preferably 10 ° or less, more preferably 8 ° or less, and further preferably 5 ° or less.

また、水接触角は次のように測定される。水接触角は公知の方法であるθ/２法を用いて測定される。θ/２法とは液滴の左右端点と頂点を結ぶ直線の、固体表面に対する角度から接触角を求める方法である。例えば、ＭＣＡＰ１の表面において水接触角を求める場合、蒸留水を該表面の異なる複数の場所に滴下し、それぞれ滴下した液滴の接触角を求める。これにより得られる値を水接触角ということができる。例えば、上記方法に従い、接触角計（協和界面科学株式会社製）を用いて、蒸留水１〜２μlをＭＣＡＰ１の異なる複数の地点（５点以上）に滴下して水接触角を測定することができる。   The water contact angle is measured as follows. The water contact angle is measured using a known method θ / 2. The θ / 2 method is a method for obtaining the contact angle from the angle of the straight line connecting the left and right end points and the vertex of the droplet with respect to the solid surface. For example, when obtaining the water contact angle on the surface of MCAP1, distilled water is dropped on a plurality of different locations on the surface, and the contact angles of the dropped liquid droplets are obtained. The value obtained by this can be called a water contact angle. For example, according to the above method, using a contact angle meter (manufactured by Kyowa Interface Science Co., Ltd.), 1 to 2 μl of distilled water is dropped at a plurality of different points (more than 5 points) of MCAP1 to measure the water contact angle. it can.

更に、複数のＭＣ２の全ての底部２ａの長径は、２０〜５００μｍの範囲内である。ここで、ＭＣ２の底部２ａの長径は、ＭＣ２の底部２ａの重心を通り、かつＭＣ２の底部２ａの周縁で画される線分のうちの最長の線分の長さとして定義される。 Furthermore, the major axis of all the bottom portions 2a of the plurality of MC2 is in the range of 20 to 500 μm. Here, the major axis of the bottom 2a of the MC2 is defined as the length of the longest line segment among the line segments that pass through the center of gravity of the bottom 2a of the MC2 and are defined by the periphery of the bottom 2a of the MC2.

底部２ａの長径は、ＭＣ２の開口２ｃの長径、ＭＣ２の深さ２ｂ及びテーパーの角度Ｐによって適宜設定できる。   The major axis of the bottom 2a can be appropriately set according to the major axis of the opening 2c of the MC2, the depth 2b of the MC2, and the taper angle P.

具体的には図２Ｃに示すように、垂線ｎと、さらにＭＣ２の底部外縁に接するように水平に引いた水平線ｍとの交点から、ＭＣ２内側側面までの距離は、Δｗで表される。   Specifically, as shown in FIG. 2C, the distance from the intersection of the perpendicular line n and the horizontal line m drawn horizontally so as to contact the outer edge of the bottom of MC2 to the inner side surface of MC2 is represented by Δw.

Δｗの長さは、ＭＣ２の深さ２ｂにｔａｎＰを乗じた値となる。例えば、ＭＣ２の深さが２０μｍであり、テーパーの角度Ｐが２０°であれば、Δｗの長さは約７．３μｍとなる。逆錘台形の空間を有するＭＣ２の底部２ａの長径は、ＭＣ２の長径からΔｗに２を乗じて得られた値を減じた値である。   The length of Δw is a value obtained by multiplying the depth 2b of MC2 by tanP. For example, if the depth of MC2 is 20 μm and the taper angle P is 20 °, the length of Δw is about 7.3 μm. The major axis of the bottom 2a of MC2 having the inverted frustum-shaped space is a value obtained by subtracting the value obtained by multiplying Δw by 2 from the major axis of MC2.

ＭＣ２の底部２ａの短径はＭＣ２の底部２ａの重心を通り、かつＭＣ２の底部２ａの周縁で画される線分のうちの最短の線分の長さとして定義される。ＭＣ２の底部２ａの短径は、ＭＣ２に細胞を格納できる限り特に制限されない。また、底部２ａの形状とＭＣ２の底部２ａの長径から設定してもよい。しかしながら、細胞をＭＣ２内に格納するためには、少なくとも当該短径の下限値は５μｍ以上、好ましくは、１０μｍ以上、より好ましくは２０μｍ以上であることが好ましい。当該短径の上限値は、ＭＣ２の底部２ａの長径に応じて設定することができる。なお、底部２ａの形状が円形の場合には、長径と短径は等しくなる。   The minor axis of the bottom 2a of the MC2 is defined as the length of the shortest line segment among the line segments that pass through the center of gravity of the bottom 2a of the MC2 and are defined at the periphery of the bottom 2a of the MC2. The short diameter of the bottom 2a of MC2 is not particularly limited as long as cells can be stored in MC2. Moreover, you may set from the shape of the bottom part 2a, and the long diameter of the bottom part 2a of MC2. However, in order to store cells in MC2, at least the lower limit of the minor axis is preferably 5 μm or more, preferably 10 μm or more, more preferably 20 μm or more. The upper limit value of the minor axis can be set according to the major axis of the bottom 2a of MC2. In addition, when the shape of the bottom part 2a is circular, a major axis and a minor axis become equal.

ここで、図１に示すように、複数のＭＣ２の最外部に存在するＭＣ２の開口２ｃの重心を直線でつないだ閉線４で画される領域Ａ内においては、上面のいずれの点においても、当該点を中心とした直径ｘの円９（図３参照）の範囲内にいずれかのＭＣ２の開口２ｃ周縁の少なくとも一部が重なるように、複数のＭＣ２が配列され、かつ、直径ｘが３５μｍである。 Here, as shown in FIG. 1, in a region A defined by a closed line 4 in which the centers of gravity of the openings 2c of MC2 existing outside the plurality of MC2 are connected by a straight line, at any point on the upper surface. A plurality of MC2s are arranged so that at least a part of the periphery of the opening 2c of any MC2 overlaps within a circle 9 (see FIG. 3) having a diameter x centered on the point, and the diameter x is 35 μm.

また、図１に示すように、複数のＭＣ２の最外部に存在するＭＣ２の開口２ｃの重心を直線でつないだ閉線４で画される領域Ａの面積を１００％とし、領域Ａにおける複数のＭＣ２の開口２ｃが占める合計面積の比率を空隙率としたときに、当該空隙率が１００％より小さく５０％以上である。   Further, as shown in FIG. 1, the area of the region A defined by the closed line 4 that connects the centroids of the openings 2c of the MC2 existing outside the plurality of MC2 by a straight line is defined as 100%, When the ratio of the total area occupied by the openings 2c of MC2 is defined as the porosity, the porosity is less than 100% and 50% or more.

ここで最外部に存在するＭＣ２とは、複数のＭＣ２の全てを内包できる最短の周長を有し、可能な限り多くのＭＣ２の周縁に接する閉線５で画される領域ａ内において閉線５に接するＭＣ２として定義される。   Here, the outermost MC2 has the shortest circumference that can include all of the plurality of MC2 and is closed within a region a defined by the closed line 5 that touches the periphery of as many MC2 as possible. 5 is defined as MC2 in contact with 5.

直径ｘの下限値は、０μｍより大きければ特に制限されないが、好ましくは５μｍ、より好ましくは１０μｍ、さらに好ましくは２０μｍ、よりさらに好ましくは３０μｍである。直径ｘが４０μｍ以上となると被験試料を展開した際に細胞がＭＣ２とＭＣ２の間に残存する割合が高くなるので好ましくなく、直径ｘの上限値は３５μｍ以下であることが好ましい。   The lower limit of the diameter x is not particularly limited as long as it is larger than 0 μm, but is preferably 5 μm, more preferably 10 μm, still more preferably 20 μm, and still more preferably 30 μm. When the diameter x is 40 μm or more, the ratio of cells remaining between MC2 and MC2 increases when the test sample is developed, which is not preferable, and the upper limit of the diameter x is preferably 35 μm or less.

空隙率の上限値は１００％より小さければ特に制限されないが、好ましくは９０％、より好ましくは、８０％、さらに好ましくは７０％である。空隙率が５０％以下となるとを展開した際に細胞がＭＣ２とＭＣ２の間に残存する割合が高くなるので好ましくなく、空隙率の下限値は５０％以上であることが好ましい。   The upper limit of the porosity is not particularly limited as long as it is smaller than 100%, but is preferably 90%, more preferably 80%, and further preferably 70%. When the porosity is 50% or less, the ratio of remaining cells between MC2 and MC2 becomes high when developed, and the lower limit of the porosity is preferably 50% or more.

ＭＣＡＰ１は、上記したＭＣ２の形状によって細胞を内部に均一に単層に格納でき、ＭＣ２の配列によって細胞を含む被験試料を適量ＭＣＡＰ１に展開した際に細胞を効率的にＭＣ２内に格納することができる。つまり、ＭＣ２とＭＣ２の間隔を狭くすることで細胞が該間隔上に残る割合を低くでき、膨大な数の細胞中に混在する少数の標的細胞（特定の細胞）を高感度、且つ高い網羅性で検出することが可能となる。   MCAP1 can store cells uniformly in a single layer due to the shape of MC2 described above, and can efficiently store cells in MC2 when a test sample containing cells is expanded on MCAP1 by the arrangement of MC2. it can. In other words, by narrowing the interval between MC2 and MC2, the proportion of cells remaining on the interval can be lowered, and a small number of target cells (specific cells) mixed in a huge number of cells are highly sensitive and have high coverage. Can be detected.

また、複数のＭＣ２の最外部に存在するＭＣ２の開口２ｃの重心を直線でつないだ閉線４で画される領域Ａ内においては、上面のいずれの点においても、当該点を中心とした特定の直径を有する円の範囲内にいずれかのＭＣ２の開口２ｃ周縁の少なくとも一部が重なるように、複数のＭＣ２が配列され、及び／又は複数のＭＣ２の最外部に存在するＭＣ２の開口２ｃの重心を直線でつないだ閉線４で画される領域Ａの面積を１００％とし、領域Ａにおける複数のＭＣ２の開口２ｃが占める合計面積の比率を空隙率としたときに、当該空隙率が１００％より小さく５０％以上であるようにすることで、細胞の適用後にＭＣＡＰ１を洗浄しなくても、ＭＣＡＰ１の上面への細胞の残存を抑制でき、及びＭＣ２内に効率的に細胞を単層として格納できる。これにより１つのＭＣＡＰ１において解析される細胞数を迅速に見積もることも可能となった被験試料に含まれる特定の細胞又は当該特定の細胞を含有する細胞の小群を定量又は半定量することが可能となる。ここで半定量とは被験試料中に含まれる特定の細胞の含有量又は含有率の概算を求めることをいう。   Further, in the area A defined by the closed line 4 in which the centroids of the openings 2c of the MC2 existing on the outermost part of the plurality of MC2 are connected by a straight line, any point on the upper surface is specified with the point as the center. A plurality of MC2s are arranged so that at least a part of the periphery of the opening 2c of any MC2 overlaps within a circle having a diameter of and / or the opening 2c of the MC2 existing at the outermost part of the plurality of MC2 When the area of the region A defined by the closed line 4 in which the centers of gravity are connected by a straight line is 100% and the ratio of the total area occupied by the openings 2c of the plurality of MC2 in the region A is the porosity, the porosity is 100. By making it less than 50% and more than 50%, it is possible to suppress the remaining of cells on the upper surface of MCAP1 without washing MCAP1 after application of the cells, and to efficiently make the cells into a monolayer in MC2. In storage That. This makes it possible to quantify or semi-quantify specific cells or a small group of cells containing the specific cells contained in a test sample that can quickly estimate the number of cells analyzed in one MCAP1. It becomes. Here, semi-quantitative means obtaining an approximate content or content of specific cells contained in the test sample.

ここでは、１枚のＭＣＡＰ１にできるだけ多数の細胞を保持できることが好ましい。ＭＣＡＰ１に細胞が保持されるとは、ＭＣＡＰ１に備えられたＭＣ２に細胞が格納されることであり、領域Ａの面積が広いほど、また空隙率が高いほど、ＭＣＡＰ１はより多くの細胞を保持できる。   Here, it is preferable that one MCAP1 can hold as many cells as possible. The cells are retained in MCAP1 means that cells are stored in MC2 provided in MCAP1, and MCAP1 can retain more cells as the area of area A is larger and the porosity is higher. .

１枚のＭＣＡＰ１に格納される多数の細胞とは、具体的には、１枚のＭＣＡＰ１に存在する全てのチャンバーに格納されている細胞数を合計したときに、少なくとも１万個以上、好ましくは１０万個以上、より好ましくは１００万個以上、さらに好ましくは１０００万個以上の細胞をいう。   More specifically, the number of cells stored in one MCAP1 is specifically at least 10,000 or more when the number of cells stored in all the chambers existing in one MCAP1 is added, preferably More than 100,000 cells, more preferably more than 1 million cells, still more preferably more than 10 million cells.

例えば、１００万個に１個の割合で存在し得る標的細胞を同定する場合、１枚のＭＣＡＰ１に１００万個以上の細胞を保持できるようにすることが好ましい。より好ましくは２００万〜１０００万個、さらに好ましくは３００万〜１０００万個の細胞を担持できるようにする。この場合、１枚のＭＣＡＰ１に１万個以上のチャンバーを設けることが特に好ましい。   For example, when identifying target cells that can be present at a ratio of 1 to 1 million cells, it is preferable that one MCAP1 can hold 1 million or more cells. More preferably, it can carry 2 million to 10 million cells, more preferably 3 million to 10 million cells. In this case, it is particularly preferable to provide 10,000 or more chambers in one MCAP1.

また、１つのＭＣ２に、少なくとも１０個以上の細胞を格納できるようにすることが好ましく、より好ましくは５０〜５００個、さらに好ましくは５０〜３００個の細胞を格納できるようにする。   In addition, it is preferable that at least 10 cells can be stored in one MC2, more preferably 50 to 500 cells, and even more preferably 50 to 300 cells can be stored.

例えば、１枚のＭＣＡＰ１に１０万個のＭＣ２を設け、各ＭＣ２に約１０個ずつ細胞を格納させた場合には、ＭＣＡＰ１枚あたり約１００万個の細胞が保持されていることとなる。   For example, when 100,000 MC2s are provided in one MCAP1, and about 10 cells are stored in each MC2, about 1 million cells are held per MCAP.

ＭＣＡＰ１の材料は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）等のポリマー、シリコン等の金属、ガラス、石英ガラス、またポリマーとガラスや金属等を張り合わせたような複数の素材を組み合わせたもの（例えばＰＤＭＳとガラス繊維）等が例示される。好ましくは、ポリスチレン、ＰＭＭＡ、ガラス、シリコン等である。   Materials for MCAP1 are polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyamide, polycarbonate, polydimethylsiloxane (PDMS), polymethyl methacrylate (PMMA), cyclic olefin copolymer (COC) and other polymers, silicon and other metals, glass, quartz glass, Examples include a combination of a plurality of materials such as a polymer and glass or metal laminated together (for example, PDMS and glass fiber). Preferred are polystyrene, PMMA, glass, silicon and the like.

またＭＣＡＰ１は、透光性を有していなくても有していてもよいが、好ましくは透光性を有しており、ＭＣＡＰ１を倒立型顕微鏡で観察する場合には、少なくともＭＣ２の底部が透光性を有することが好ましい。   MCAP1 may or may not have translucency, but preferably has translucency, and when MCAP1 is observed with an inverted microscope, at least the bottom of MC2 is It preferably has translucency.

２．マイクロチャンバーアレイプレートの作製方法
ＭＣＡＰ１の作製方法は、特に制限されず、公知の方法に従って作製することができる。 2. Method for Producing Microchamber Array Plate The method for producing MCAP1 is not particularly limited, and can be produced according to a known method.

ＭＣＡＰ１は、板状の所定材料の基板にＭＣ２を直接加工する方法、マイクロ貫通孔もしくはＭＣ２が形成されたフィルムをこれらの基板に貼り付ける方法、またはプラスチック成型等によっても作製できる。好ましくは、プラスチック成型である。具体的には、ＭＣ２は半導体研究分野における微細加工技術であるリソグラフィー法（光リソグラフィー、電子線リソグラフィー等）によって作製する方法、マイクロドリル等を用いて穴をあける掘削加工技術、レーザー加工等あらゆる微***を作製する技術によって作製することができる。   MCAP1 can also be produced by a method of directly processing MC2 on a plate-like substrate of a predetermined material, a method of attaching a film having micro through holes or MC2 formed on these substrates, or plastic molding. Preferably, plastic molding is used. Specifically, MC2 is a microfabrication technique in the field of semiconductor research, such as a lithography method (optical lithography, electron beam lithography, etc.), a drilling technique for drilling holes using a microdrill, laser processing, etc. It can be produced by a technique for producing a hole.

また、プラスチック成型によるＭＣＡＰ１の作製方法は特に制限されないが、ＭＣＡＰ１の型をあらかじめ作製しておき、射出成型等により成型する方法が好ましい。型の作製方法も特に制限されないが、リソグラフィーとエッチングによりプラスチック製のマスターを作製し、続いて当該マスターへの電鋳によってＭＣＡＰ１の金型を作製する方法が例示される。より具体的には、電子線リソグラフィー法の１つであるＸ線リソグラフィー及びエッチングによるプラスチック製マスターの作製、当該マスターへのニッケル等の電鋳（メッキ）、及び当該金型を使用した射出成型法を組み合わせてプラスチック構造体を作製するＬＩＧＡ（Lithographie Galvanoformung Abformung）プロセスに従い、上記ポリマー（プラスチック）製のＭＣＡＰ１を作製することができる。   The method for producing MCAP1 by plastic molding is not particularly limited, but a method in which a mold for MCAP1 is produced in advance and molded by injection molding or the like is preferable. The method for producing the mold is not particularly limited, but a method of producing a plastic master by lithography and etching and then producing a mold for MCAP1 by electroforming to the master is exemplified. More specifically, production of a plastic master by X-ray lithography and etching, which is one of electron beam lithography methods, electroforming (plating) of nickel or the like on the master, and injection molding method using the mold According to the LIGA (Lithographie Galvanoformung Abformung) process for producing a plastic structure by combining the above, MCAP1 made of the above polymer (plastic) can be produced.

ＭＣ２の底部をより平らにするためには、ＬＩＧＡプロセス等により金型を作成した後、射出成型によって、ＭＣＡＰ１を成型する方法が好ましい。   In order to make the bottom of MC2 flatter, a method of molding MCAP1 by injection molding after forming a mold by a LIGA process or the like is preferable.

ＭＣＡＰ１におけるＭＣ２の全ての内面及び前記ＭＣＡＰ１の上面の水接触角を４０°以下とすることが好ましい。換言するとＭＣ２の全ての内面及びＭＣＡＰ１の上面を親水化することが好ましい。疎水性の高いポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ＰＤＭＳ、ＰＭＭＡ、ＣＯＣ等をＭＣＡＰ１の基板として使用する場合には、当該親水性表面を達成するため、必要に応じて親水化処理を施すことができる。親水化処理方法は、プラズマ処理、コロナ放電処理等が例示される。好ましくは、プラズマ処理であり、酸素プラズマ処理等が例示される。例えば、ＭＣＡＰ１の基板が疎水性の材料（ポリスチレン、ＰＭＭＡ等のポリマー）である場合には、酸素プラズマ処理等の親水化処理を行うことが好ましい。また、ＭＣＡＰ１の基板が比較的親水性の高い材料（シリコンやガラス等）であって水接触角が４０°以下である場合には、このような処理をしなくともよいが、より親水性を高めるために、研磨等の公知技術の親水化処理を適用してもよい。   It is preferable that the water contact angles of all inner surfaces of MC2 in MCAP1 and the upper surface of MCAP1 are 40 ° or less. In other words, it is preferable to make all the inner surfaces of MC2 and the upper surface of MCAP1 hydrophilic. When highly hydrophobic polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyamide, polycarbonate, PDMS, PMMA, COC, etc. are used as the MCAP1 substrate, a hydrophilic treatment is performed as necessary to achieve the hydrophilic surface. Can do. Examples of the hydrophilic treatment method include plasma treatment and corona discharge treatment. Preferable is plasma treatment, and oxygen plasma treatment is exemplified. For example, when the substrate of MCAP1 is a hydrophobic material (polymer such as polystyrene or PMMA), it is preferable to perform hydrophilic treatment such as oxygen plasma treatment. In addition, when the MCAP1 substrate is made of a material having relatively high hydrophilicity (such as silicon or glass) and the water contact angle is 40 ° or less, such treatment is not necessary. In order to enhance, a hydrophilization treatment of a known technique such as polishing may be applied.

３．特定の細胞又は当該特定の細胞を含有する細胞の小群の同定方法
特定の細胞又は当該特定の細胞を含有する細胞の小群の同定方法は、多数の細胞を含む被験試料から、前記被験試料に含まれる特定の細胞又は当該特定の細胞を含有する細胞の小群を同定するための方法である。 3. Method for identifying a specific cell or a small group of cells containing the specific cell The method for identifying a specific cell or a small group of cells containing the specific cell comprises: Is a method for identifying a specific cell or a small group of cells containing the specific cell.

ここで、被験試料としては、個体から採取された検体、当該検体の希釈液、当該検体から採取された細胞の浮遊液、又は培養細胞若しくは培養菌体の浮遊液等が挙げられる。ＭＣＡＰ１上面への被験試料の展開のしやすさから、被験試料は、個体から採取された検体は希釈するか、細胞を検体から回収してから細胞浮遊液として調製することが好ましい。個体から採取された検体としては、末梢血、骨髄、リンパ液、髄液、関節液、羊水、腹水、胸水等の浸出液又は漏出液、生検材料、外科的な摘出組織等が挙げられる。生検材料及び外科的な摘出組織は、必要に応じて公知の方法に従ってトリプシン、コラゲナーゼ等の酵素を使用して細胞外マトリックスを消化し、その後フィルター濾過等を行って細胞浮遊液を得ることができる。被験試料中に含まれる細胞（以下、「細胞群」ともいう）は、細菌、リケッチア、酵母、原虫等の単細胞生物の他、動物由来細胞又は植物由来細胞であってよく、より具体的には例えば哺乳類由来細胞、鳥類由来細胞、昆虫由来細胞、植物培養細胞等を挙げることができる。また、細胞群は同一の細胞からなっても、複数種の細胞からなってもよい。   Here, examples of the test sample include a specimen collected from an individual, a diluted solution of the specimen, a suspension of cells collected from the specimen, or a suspension of cultured cells or cultured cells. For ease of development of the test sample on the upper surface of MCAP1, the test sample is preferably prepared as a cell suspension after diluting the specimen collected from the individual or collecting the cells from the specimen. Examples of specimens collected from individuals include peripheral blood, bone marrow, lymph, cerebrospinal fluid, joint fluid, amniotic fluid, ascites, effusion fluid such as ascites, pleural effusion, biopsy material, surgically removed tissue, and the like. Biopsy material and surgically removed tissue can be obtained by digesting the extracellular matrix using an enzyme such as trypsin or collagenase according to a known method, if necessary, and then performing filter filtration to obtain a cell suspension. it can. Cells contained in the test sample (hereinafter also referred to as “cell group”) may be unicellular organisms such as bacteria, rickettsia, yeast, and protozoa, as well as animal-derived cells or plant-derived cells. For example, mammal-derived cells, avian-derived cells, insect-derived cells, plant cultured cells and the like can be mentioned. The cell group may be composed of the same cell or a plurality of types of cells.

標的となる特定の細胞は、例えば、特定の遺伝子を発現している細胞や、核酸、タンパク質、脂質、糖等の生体物質が通常より過剰である、又は不足している細胞を、特定の細胞として種々の細胞群から検出することができる。このような特定の細胞は自然界に存在する細胞であってもよいし、人為的処理が施された細胞であってもよい。また、特定の細胞としては、例えば病原細胞、病変細胞、病原菌又は病原生物に感染された細胞、突然変異した細胞、特定の性質を有する未知の細胞等が挙げられる。   The target specific cell is, for example, a cell expressing a specific gene or a cell in which biological substances such as nucleic acids, proteins, lipids, and sugars are excessive or insufficient than usual. Can be detected from various cell groups. Such specific cells may be cells that exist in nature or may be cells that have been subjected to artificial treatment. Specific cells include, for example, pathogenic cells, lesion cells, cells infected with pathogenic bacteria or pathogenic organisms, mutated cells, unknown cells having specific properties, and the like.

ここで、当該人為的処理は、例えば物理的処理（例：電磁波照射）、化学的処理（例：薬剤処理）、遺伝子工学的処理（例：遺伝子組み換え処理）等を挙げることができる。このような人為的処理のうち、細胞に与える影響が既知である処理を細胞群に施し、当該影響が表れない細胞又は当該影響がより強く表れる細胞を特定の細胞として同定することもできる。例えば、薬剤処理へ耐性又は高感受性を示す細胞を特定の細胞として検出することができる。   Here, examples of the artificial treatment include physical treatment (eg, electromagnetic wave irradiation), chemical treatment (eg: drug treatment), genetic engineering treatment (eg: gene recombination treatment), and the like. Among such artificial treatments, a treatment that has a known effect on cells can be applied to the cell group, and a cell that does not show the effect or a cell that shows the effect more strongly can be identified as a specific cell. For example, cells exhibiting resistance or high sensitivity to drug treatment can be detected as specific cells.

ここで、特定の細胞を含有する細胞の小群とは、特定の細胞を含む細胞群であって、ＭＣ１つあたりに格納されている細胞群をいう。   Here, the small group of cells containing specific cells refers to a group of cells containing specific cells and stored per MC.

さらに、本同定方法によれば、多数の細胞を含む被験試料から、前記被験試料に含まれる特定の細胞又は当該特定の細胞を含有する細胞の小群を同定することができる。   Furthermore, according to this identification method, a specific cell contained in the test sample or a small group of cells containing the specific cell can be identified from a test sample containing a large number of cells.

本同定方法において、多数の細胞を含む被験試料とは、例えば１枚のＭＣＡＰ１上のＭＣ２に格納される細胞数の合計が０．５×１０^４〜０．５×１０^１０個の範囲内、好ましくは０．５×１０^６〜０．５×１０^８個の範囲内、より好ましくは０．５×１０^７〜２．５×１０^７個である被験試料である。本同定方法において、当該被験試料中の細胞濃度は、細胞種によって異なり得るが、例えば１×１０^４〜１×１０^１０ ｃｅｌｌｓ／ｍｌが例示できる。好ましくは１×１０^６〜１×１０^８ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、より好ましくは５×１０^６〜５×１０^７ ｃｅｌｌｓ／ｍｌである。In the present identification method, the test sample containing a large number of cells means, for example, that the total number of cells stored in MC2 on one MCAP1 is within a range of 0.5 × 10 ^{4 to} 0.5 × 10 ¹⁰ , The test sample is preferably in the range of 0.5 × 10 ^{6 to} 0.5 × 10 ⁸ , more preferably 0.5 × 10 ^{7 to} 2.5 × 10 ⁷ . In this identification method, the cell concentration in the test sample may vary depending on the cell type, and examples thereof include 1 × 10 ⁴ to 1 × 10 ¹⁰ cells / ml. Preferably it is 1 * 10 < ⁶ > -1 * 10 < ⁸ > cells / ml, More preferably, it is 5 * 10 < ⁶ > -5 * 10 < ⁷ > cells / ml.

検体を希釈する場合、又は培養細胞若しくは培養菌体の浮遊液を調製する場合には、生理食塩水、ＰＢＳ、α−ＭＥＭ培地、ダルベッコＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＬＢブロス、ＹＰＡＤ培地、ＳＣ培地等の被験試料に含まれる細胞に応じて適宜選択することができる。ほ乳類細胞培養培地にはウシ胎児血清等を１〜２０％含んでいてもよい。また、細胞同士が接着する性質を有する場合には、必要に応じてＥＤＴＡを添加することもできる。培養細胞、培養菌体の浮遊液の調製は、公知の方法に従って行うことができる。   When diluting a specimen or preparing a suspension of cultured cells or cultured cells, physiological saline, PBS, α-MEM medium, Dulbecco MEM medium, RPMI 1640 medium, LB broth, YPAD medium, SC medium, etc. It can select suitably according to the cell contained in this test sample. The mammalian cell culture medium may contain 1 to 20% fetal calf serum or the like. Moreover, when it has the property to which cells adhere | attach, EDTA can also be added as needed. The suspension of cultured cells and cultured cells can be prepared according to a known method.

同定方法は、図５に示すような、以下のＳ１からＳ３の工程を含む。   The identification method includes the following steps S1 to S3 as shown in FIG.

工程Ｓ１は、上記した「１．マイクロチャンバーアレイプレート」の項で述べたＭＣＡＰ１に被験試料中の細胞を展開して、被験試料中の細胞をＭＣ２に格納する工程を含む。当該被験試料は、必要に応じて前記細胞濃度に調製されたあと、ＭＣＡＰ１の上面に展開される。ＭＣＡＰ１の上面に展開される被験試料の量は、１枚のＭＣＡＰ１上の領域Ａが覆われる量である限り特に制限されないが、細胞の損失を防ぐため領域Ａの面積１ｍｍ^２あたり０．３〜０．５μｌ程度となるように展開することが好ましい。被験試料を展開する方法は、被験試料が領域Ａ上に展開されるよう、ＭＣＡＰ１の上からその上面にマイクロピペット等を用いて滴下することが好ましい。Step S1 includes a step of expanding the cells in the test sample to MCAP1 described in the section “1. Microchamber array plate” and storing the cells in the test sample in MC2. The test sample is adjusted to the cell concentration as necessary, and then developed on the upper surface of MCAP1. The amount of the test sample developed on the upper surface of the MCAP1 is not particularly limited as long as the region A on the single MCAP1 is covered. However, in order to prevent cell loss, the amount of the test sample is 0.3 to ³ per 1 mm ² of the area A. It is preferable to develop so as to be about 0.5 μl. As a method for developing the test sample, it is preferable that the test sample is dropped from above the MCAP 1 onto the upper surface using a micropipette or the like so that the test sample is developed on the region A.

また、ＭＣＡＰ１を、その製造から長時間（例、１日）経過以降に、使用する場合には、被験試料を滴下する前に、ＭＣＡＰ１の親水性回復処理（例、超音波洗浄）等を行うことが好ましい。超音波洗浄を行う場合には、生理食塩水、ＰＢＳ、α−ＭＥＭ培地、ダルベッコＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＬＢブロス、ＹＰＡＤ培地、ＳＣ培地等の被験試料に含まれる細胞に応じて適宜選択することができる。より好ましくは、被験試料を調製した液体と同じものを使用することが好ましい。   In addition, when MCAP1 is used after a long time (eg, one day) since its manufacture, a hydrophilic recovery treatment (eg, ultrasonic cleaning) of MCAP1 is performed before the test sample is dropped. It is preferable. When performing ultrasonic cleaning, select appropriately according to the cells contained in the test sample such as physiological saline, PBS, α-MEM medium, Dulbecco MEM medium, RPMI 1640 medium, LB broth, YPAD medium, SC medium, etc. Can do. More preferably, the same liquid as that used to prepare the test sample is used.

被験試料をＭＣＡＰ１の上面に展開した後、一定時間、好ましくは５〜３０分、好ましくは１０〜１５分間ＭＣＡＰを静置することにより、細胞がＭＣ２内の底部に格納され、さらに細胞を均一に単層に並べることができる。   After the test sample is spread on the upper surface of MCAP1, the MCAP is allowed to stand for a certain period of time, preferably 5 to 30 minutes, preferably 10 to 15 minutes. Can be arranged in a single layer.

ここでは、洗浄を行わなくてもＭＣＡＰ１の上面への細胞の残存を抑制でき、及び効率的にＭＣ２内に単層に細胞を格納できるので、その必要性は小さい。所望により、工程Ｓ１の後に、過剰な細胞をＭＣＡＰ１からの除去（洗浄）する工程Ｓ１’を行ってもよい。   Here, it is possible to suppress the remaining of cells on the upper surface of the MCAP1 without washing, and the cells can be efficiently stored in a single layer in the MC2, so that the necessity is small. If desired, step S1 'may be performed after step S1 to remove (wash) excess cells from MCAP1.

ＭＣＡＰ１から、過剰の細胞を除去する方法としては、ＭＣ２内の細胞が撹拌されない程度の洗浄方法であれば特に制限されない。例えば、マイクロピペット等で上述のＰＢＳ、又は細胞培養培地等を静かに流し入れ、ＭＣＡＰ１の上面を洗い流す方法が挙げられる。   The method for removing excess cells from MCAP1 is not particularly limited as long as it is a washing method that does not agitate the cells in MC2. For example, a method of gently pouring the above-described PBS, cell culture medium, or the like with a micropipette or the like and washing the upper surface of MCAP1 can be mentioned.

工程Ｓ２は、各ＭＣ２に、特定の細胞が存在するか否かを判定する工程を含む。標的である特定の細胞の判定方法は、例えば、標的である特定の細胞が形態変化を起こす細胞である場合は、顕微鏡観察により細胞の形態を観察することにより、形態変化を起こした細胞が特定の細胞であると決定することができ、当該特定の細胞が存在するＭＣを、特定の細胞が存在するＭＣであると判定することができる。また、当該特定の細胞に特異的に結合する物質が存在する場合、被験試料中の細胞群に当該物質を作用させた後その結合を検出することにより、当該物質が結合した細胞が特定の細胞であると決定することができ、当該特定の細胞が存在するＭＣを、特定の細胞が存在するＭＣであると判定することができる。このような物質としては、例えば細胞イメージング試薬、染色試薬、抗体及びアプタマー等を挙げることができる。あるいは、当該特定の細胞に含まれる酵素等と特異的に反応する基質が存在する場合、当該基質に対する反応を検出し、反応が認められた細胞を特定の細胞であると決定することができ、当該特定の細胞が存在するＭＣを、特定の細胞が存在するＭＣであると判定することもできる。   Step S2 includes a step of determining whether or not a specific cell exists in each MC2. For example, when the target specific cell is a cell that undergoes a morphological change, the cell that caused the morphological change can be identified by observing the morphology of the cell under a microscope. The MC in which the specific cell is present can be determined to be the MC in which the specific cell is present. In addition, when there is a substance that specifically binds to the specific cell, the cell bound to the substance is detected by detecting the binding of the substance after acting on the cell group in the test sample. The MC in which the specific cell exists can be determined as the MC in which the specific cell exists. Examples of such substances include cell imaging reagents, staining reagents, antibodies and aptamers. Alternatively, when there is a substrate that specifically reacts with an enzyme or the like contained in the specific cell, the reaction to the substrate can be detected, and the cell in which the reaction is recognized can be determined to be a specific cell, The MC in which the specific cell exists can also be determined as the MC in which the specific cell exists.

細胞イメージング試薬、染色試薬、抗体若しくはアプタマー等の結合、又は特定の基質との反応の有無を検出する方法は、蛍光色素を用いるのが好適である。例えば、蛍光を発する細胞イメージング試薬、染色試薬で細胞群を染色したり；特定の酵素と反応することにより蛍光を発する特定の基質を細胞群に接触させたり、特定の細胞内の抗原に特異的に結合する抗体やアプタマーに蛍光標識を施してから当該抗体又はアプタマーを細胞群と接触させることにより、被験試料中の特定の細胞のみを蛍光色素で標識することができる。標識された蛍光色素は顕微鏡又は蛍光スキャナー等で観察することができる。そして、蛍光色素が標識された細胞を特定の細胞であると決定することができ、当該特定の細胞が存在するＭＣを、特定の細胞が存在するＭＣであると判定できる。   As a method for detecting the presence of a cell imaging reagent, staining reagent, antibody or aptamer binding, or reaction with a specific substrate, it is preferable to use a fluorescent dye. For example, staining a cell group with a fluorescent cell imaging reagent or staining reagent; contacting a specific substrate that emits fluorescence by reacting with a specific enzyme, or specific to an antigen in a specific cell By applying a fluorescent label to an antibody or aptamer that binds to the antibody, and then bringing the antibody or aptamer into contact with a cell group, only specific cells in the test sample can be labeled with a fluorescent dye. The labeled fluorescent dye can be observed with a microscope or a fluorescent scanner. Then, a cell labeled with a fluorescent dye can be determined to be a specific cell, and an MC in which the specific cell is present can be determined to be an MC in which the specific cell is present.

蛍光色素で特定の細胞を標識する工程は、ＭＣＡＰ１に被験試料を展開する前に行っても、細胞がＭＣ２内に格納された後行ってもよい。   The step of labeling specific cells with a fluorescent dye may be performed before the test sample is developed on MCAP1, or may be performed after the cells are stored in MC2.

例えば、血液細胞中から病原性微生物が感染した血液細胞を検出する場合、ＭＣＡＰ１に血液細胞を展開させる前に、感染した血液細胞中の病原性微生物の核を蛍光染色し、蛍光顕微鏡やアレイスキャナー等の装置を用いて、当該蛍光が検出された細胞を特定の細胞であると決定でき、当該特定の細胞が存在するＭＣを、特定の細胞が存在するＭＣであると判定できる。あるいは、ＭＣ２に血液細胞を展開した後に、血液細胞中の病原性微生物の核を蛍光染色し、同様に当該蛍光が検出された細胞を特定の細胞であると決定でき、当該特定の細胞が存在するＭＣを、特定の細胞が存在するＭＣであると判定してもよい。例えばベッドサイド等において感染した血液細胞を検出しようとする場合には、マイクロアレイチップに血液細胞を展開させる前に感染した血液細胞中の病原性微生物の核等を蛍光染色したほうが、展開後の処理が簡便になるため、一層簡単に感染した血液細胞を検出することができる。また、例えば、血液細胞中の病原性微生物の核に限定されず、例えば蛍光標識された抗体を用いることによって特定タンパク質（特定アミノ酸配列）を蛍光標識し、また、蛍光標識されたプローブを用いて特定の遺伝子配列を蛍光標識してもよい。   For example, when blood cells infected with pathogenic microorganisms are detected from blood cells, the nuclei of pathogenic microorganisms in infected blood cells are fluorescently stained before deploying the blood cells to MCAP1, and fluorescence microscopes or array scanners are used. Or the like, the cell in which the fluorescence is detected can be determined to be a specific cell, and the MC in which the specific cell is present can be determined to be the MC in which the specific cell is present. Alternatively, after developing blood cells on MC2, the nucleus of pathogenic microorganisms in the blood cells can be fluorescently stained, and the cells in which the fluorescence is detected can be determined to be specific cells, and the specific cells are present. The MC to be determined may be an MC in which a specific cell exists. For example, when trying to detect infected blood cells on the bedside etc., it is better to fluorescently stain the nuclei of pathogenic microorganisms in the infected blood cells before spreading the blood cells on the microarray chip. Since it becomes simple, infected blood cells can be detected more easily. In addition, for example, it is not limited to the nucleus of pathogenic microorganisms in blood cells. For example, a specific protein (specific amino acid sequence) is fluorescently labeled by using a fluorescently labeled antibody, and a fluorescently labeled probe is used. Specific gene sequences may be fluorescently labeled.

また、工程Ｓ２を行うにあたり、蛍光検出等に時間を要する場合には、ＭＣ２内が乾燥することを防ぐため、ＭＣＡＰ１の上面をカバーグラス等で覆ってもよい。   In addition, when it takes time to detect fluorescence when performing step S2, the upper surface of MCAP1 may be covered with a cover glass or the like in order to prevent the inside of MC2 from drying.

工程Ｓ３は、特定の細胞が存在すると判定されたＭＣ２に入っている細胞を、特定の細胞又は当該特定の細胞を含有する細胞の小群であると同定する工程を含む。   Step S3 includes a step of identifying a cell in MC2 that is determined to have a specific cell as a specific cell or a small group of cells containing the specific cell.

本同定方法は、蛍光強度あるいは蛍光標識された細胞の数等を測定する工程を含んでいてもよい。この測定を行うことにより、１つの特定細胞内で内での蛍光強度が強い場合、あるいは蛍光標識された細胞が多い場合に、特定の細胞におけるタンパク質、脂質若しくは核酸の発現量が多い、又は細胞の変性や病原体の感染の程度が高いと検定することができる。例えば図４に示すように、ＭＣＡＰ上に縦５０個、横２００個になるようにＭＣを配置させ、各ＭＣ２に１００個ずつ血液細胞を格納させることもできる。そして、１つのＭＣあたり１つの感染した血液細胞が検出された場合には、その感染率は１％と決定することができる。   This identification method may include a step of measuring the fluorescence intensity or the number of fluorescently labeled cells. By performing this measurement, when the fluorescence intensity within one specific cell is strong, or when there are many fluorescently labeled cells, the expression level of the protein, lipid or nucleic acid in the specific cell is large, or the cell It can be tested that the degree of denaturation or pathogen infection is high. For example, as shown in FIG. 4, it is possible to arrange 50 MCs on the MCAP so as to be 50 vertically and 200 horizontally, and store 100 blood cells in each MC2. When one infected blood cell is detected per one MC, the infection rate can be determined as 1%.

また、本方法では、例えばマイクロアレイチップに合計１００万個の血液細胞を保持させ、そのうち１つの血液細胞が感染した場合であっても、この感染した血液細胞を検出することができる。この場合、本同定方法によれば感染した血液細胞が被験試料中に０．０００１％しか存在していなくとも、検出することが可能であるといえる。   Further, in this method, for example, even if a microarray chip holds a total of 1 million blood cells and one of the blood cells is infected, this infected blood cell can be detected. In this case, according to the present identification method, it can be said that detection is possible even if the infected blood cells are present only in 0.0001% in the test sample.

さらに、本同定方法は、蛍光色素で標識された特定の細胞をさらに蛍光顕微鏡等で観察する工程を含んでいてもよい。当該観察を行うことで、病原菌や細胞の種類等についても決定することができる。   Furthermore, this identification method may further include a step of observing specific cells labeled with a fluorescent dye with a fluorescence microscope or the like. By performing the observation, it is possible to determine the pathogenic bacteria, the type of cells, and the like.

さらに、例えば、ＭＣＡＰ１を使用することにより、人為的処理された細胞の群のなかから、当該処理により特定の性質を有するようになった細胞を選択することができる。   Furthermore, for example, by using MCAP1, cells that have a specific property by the treatment can be selected from a group of cells that have been artificially treated.

また、ＭＣＡＰ１を使用することにより、特に強く当該特定の性質を有する細胞を選択することもできる。より具体的には、例えば、遺伝子組み換え処理により特定の物質を生産するよう形質転換させた複数の細胞の中から、特に効率よく当該物質を生産する細胞を検出することもできる。あるいは、例えば、電磁波照射処理若しくは薬剤処理により特定の機能を失った細胞を検出することができる。また、これらの処理に対し耐性又は高感受性を有する細胞を検出することができる。   In addition, by using MCAP1, cells having the specific property can be selected particularly strongly. More specifically, for example, cells that produce the substance can be detected particularly efficiently from a plurality of cells transformed to produce a particular substance by genetic recombination treatment. Alternatively, for example, cells that have lost a specific function due to electromagnetic wave irradiation treatment or drug treatment can be detected. In addition, cells having resistance or high sensitivity to these treatments can be detected.

また、本検出方法は、研究室のみならず、例えば臨床現場等においても好適に用いることができる。   Moreover, this detection method can be suitably used not only in a laboratory but also in a clinical site, for example.

また、本同定方法によれば、ＭＣＡＰ１に備えられたチャンバー内に細胞が格納される。このため、本願の検出方法においては、検出時、標的とする特定の細胞がＭＣＡＰ１のどの部分に存在しているのかが分かり易い。このことから、検出後、当該特定の細胞の回収やＰＣＲ法による更なる分析等を容易に行うことができる。   Moreover, according to this identification method, a cell is stored in the chamber provided in MCAP1. For this reason, in the detection method of the present application, at the time of detection, it is easy to understand in which part of the MCAP1 the target specific cell exists. From this, after the detection, the specific cells can be easily collected and further analyzed by the PCR method.

また、本検出方法においては、ＭＣＡＰ１に備えられた各ＭＣ２内に細胞を均一かつ効率よく格納させることが可能である。すなわち、本願の検出方法においては、ＭＣＡＰ１に備えられた各ＭＣが同じ形状である場合には、ほぼ同数の細胞を格納させることができる。   Further, in this detection method, it is possible to store cells uniformly and efficiently in each MC2 provided in MCAP1. That is, in the detection method of the present application, when the MCs included in the MCAP 1 have the same shape, approximately the same number of cells can be stored.

本同定方法により、特に感染症における感染血液細胞を好ましく検出することができる。感染症としては、マラリア原虫類に代表される原虫感染症、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に代表されるウイルス感染症、結核菌に代表される細菌感染症等が例示される。   By this identification method, it is possible to preferably detect infected blood cells particularly in infectious diseases. Examples of infectious diseases include protozoan infections represented by malaria parasites, viral infections represented by human immunodeficiency virus (HIV), bacterial infections represented by Mycobacterium tuberculosis, and the like.

これらの感染症のうち、例えばマラリア原虫類による感染症では、マラリア原虫類が赤血球に感染する。この場合、本検出方法における検出対象である特定の細胞はマラリア原虫類に感染した血液細胞、すなわちマラリア原虫類に感染した赤血球である。マラリア原虫類は、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫及び卵形マラリア原虫の４種類が例示される。   Among these infectious diseases, for example, in infections caused by malaria parasites, malaria parasites infect red blood cells. In this case, the specific cells to be detected in this detection method are blood cells infected with malaria parasites, that is, red blood cells infected with malaria parasites. The malaria parasites are exemplified by four types of Plasmodium falciparum, Plasmodium falciparum, Plasmodium falciparum and oval malaria parasites.

また、例えばＨＩＶ感染症では、ＨＩＶがある種のリンパ球（Ｔ細胞）に感染する。この場合、本検出方法における検出対象である特定の細胞は、ＨＩＶに感染した血液細胞、すなわちＨＩＶに感染したある種のリンパ球（Ｔ細胞）である。ＨＩＶには、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２の2種類が例示される。   For example, in HIV infection, HIV infects certain lymphocytes (T cells). In this case, the specific cells to be detected in this detection method are blood cells infected with HIV, that is, certain lymphocytes (T cells) infected with HIV. Examples of HIV include two types, HIV-1 and HIV-2.

また、例えば結核では、結核菌がある種の白血球細胞（単球）に感染する。この場合、本検出方法における検出対象である特定の細胞は、結核菌に感染した血液細胞、すなわち結核菌に感染したある種の白血球細胞（単球）である。   For example, in tuberculosis, certain types of white blood cells (monocytes) are infected with M. tuberculosis. In this case, the specific cells to be detected in this detection method are blood cells infected with M. tuberculosis, that is, certain white blood cells (monocytes) infected with M. tuberculosis.

本同定方法は、このほかの感染症における感染血液細胞も検出の対象とすることができる。   This identification method can also detect infected blood cells in other infectious diseases.

また、血液細胞としては血液に含まれる細胞であって、血液細胞として赤血球、血小板、白血球（リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球）が例示される。例えば、これら血液細胞を複数含む被験試料を、本検出方法へ供する、複数の細胞を含む被験試料として用いることができる。例えば、複数の血液細胞を含む血液や体液を当該被験試料として用いることができる。   Examples of blood cells are cells contained in blood, and examples of blood cells include red blood cells, platelets, and white blood cells (lymphocytes, monocytes, neutrophils, eosinophils, basophils). For example, a test sample containing a plurality of these blood cells can be used as a test sample containing a plurality of cells for use in the present detection method. For example, blood or body fluid containing a plurality of blood cells can be used as the test sample.

本同定方法により、培養細胞中の特定の細胞を検出することもできる。培養細胞は、哺乳類又は昆虫由来の細胞株（例えばＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｓｆ９細胞等）や酵母が好ましく例示できる。   This identification method can also detect specific cells in cultured cells. The cultured cells are preferably exemplified by cell lines derived from mammals or insects (for example, HEK293 cells, Hela cells, 3T3 cells, COS-7 cells, CHO cells, Jurkat cells, Sf9 cells, etc.) and yeast.

本同定方法は標的とする特定の細胞が被験試料中に極微量しか存在していなくとも（例えば被験試料の細胞中の存在割合が０．００１〜０．００００１％であっても）、該特定の細胞を十分に検出することが可能であるため、検出標的となる特定の細胞の存在割合が非常に小さい被験試料を用いるときに特に有利である。このような例としては、例えば、血液中に循環している癌細胞は血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を挙げることができる。また例えば、妊娠女性の血中に存在する胎児由来の有核赤血球を挙げることができる。また例えば癌細胞群中に存在する癌幹細胞を挙げることができる。癌幹細胞は、自己複製能と増殖能を有し、悪性腫瘍（癌）にごくわずか存在しており、幹細胞と同様のマーカー（例えばＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ１１７、Ｓｃａ−１等）を発現していると言われており、本同定方法によれば、好ましく検出することができると考えられる。   In this identification method, even if the target specific cell is present in a very small amount in the test sample (for example, even if the test sample is present in the cell in a proportion of 0.001 to 0.00001%), the identification It is particularly advantageous when using a test sample in which the presence ratio of specific cells serving as detection targets is extremely small. As such an example, for example, cancer cells circulating in the blood include circulating tumor cells (CTC). Moreover, for example, fetal nucleated red blood cells present in the blood of pregnant women can be mentioned. Moreover, for example, cancer stem cells present in a cancer cell group can be mentioned. Cancer stem cells have the ability to self-replicate and proliferate, are present in very few malignant tumors (cancers), and express the same markers (eg, CD34, CD133, CD117, Sca-1 etc.) as stem cells According to this identification method, it can be preferably detected.

また、特定の遺伝子やタンパク質を発現している細胞も、本同定方法の適用対象になりえる。   A cell expressing a specific gene or protein can also be an application target of this identification method.

４．同定用キット
同定用キットは、複数の細胞を含む被験試料から特定の細胞を検出するためのキットであって、ＭＣＡＰ１を含み、以下が例示される。 4). Identification kit The identification kit is a kit for detecting specific cells from a test sample containing a plurality of cells, includes MCAP1, and the following are exemplified.

同定用キットは、好ましくは、ＭＣＡＰ１に細胞を接触させる際に使用され得る緩衝液、培養液等、さらに、ＭＣＡＰ１に細胞を展開させる際に使用され得る緩衝液、培養液、界面活性剤等、さらに、ＭＣＡＰ１から過剰な細胞を除去（洗浄）する際に使用され得る緩衝液、培養液、界面活性剤、酵素等の洗浄液等が含まれ得る。また、ＭＣＡＰ１に細胞を接触、展開、さらにＭＣＡＰから細胞を除去等させる際に使用され得るマイクロピペット等が含まれ得る。   The identification kit is preferably a buffer solution, a culture solution, and the like that can be used when contacting cells with MCAP1, and further a buffer solution, a culture solution, a surfactant, and the like that can be used when expanding cells into MCAP1. Further, a buffer solution, a culture solution, a surfactant, a washing solution for enzymes, etc. that can be used when removing (washing) excess cells from MCAP1 can be included. In addition, a micropipette or the like that can be used when contacting and expanding cells with MCAP1 and further removing cells from MCAP and the like can be included.

ＭＣＡＰ１の上面への細胞の残存を抑制できるので、その必要性は小さいが、所望により、同定用キットにはさらに、ＭＣ２以外の部分に吸着した余分な細胞を除去、洗浄する際に使用され得るセルスクレイパー等の器具が含まれていてもよい。また、検出標的である特定の細胞を検出するための装置が含まれ得て、装置としては、蛍光顕微鏡、マイクロアレイスキャナー等が例示される。また、例えば検出標的である特定の細胞が最終的に蛍光染色されることにより検出される場合、該特定の細胞を染色するための蛍光染色剤（例えば蛍光色素、蛍光標識済み抗体等）が含まれていてもよい。   Although the necessity is small because the remaining of cells on the upper surface of MCAP1 can be suppressed, if necessary, the identification kit can be further used to remove and wash excess cells adsorbed on portions other than MC2. Instruments such as a cell scraper may be included. In addition, a device for detecting a specific cell as a detection target can be included, and examples of the device include a fluorescence microscope and a microarray scanner. In addition, for example, when a specific cell as a detection target is finally detected by fluorescent staining, a fluorescent staining agent (for example, a fluorescent dye, a fluorescently labeled antibody, etc.) for staining the specific cell is included. It may be.

さらに、該同定用キットの使用マニュアルが含まれていてもよい。   Further, a manual for using the identification kit may be included.

かかる同定用キットを使用することで、検出標的である特定の細胞が被験試料中に存在する割合が低くても（例えば０．０００１％しか存在していなくとも）、迅速かつ簡便に当該特定の細胞を検出することが可能である。   By using such an identification kit, even if the proportion of specific cells that are detection targets is low in the test sample (for example, only 0.0001% is present), the specific cells can be quickly and easily It is possible to detect cells.

５．薬剤候補物質のスクリーニング方法
上記したＭＣＡＰ１は、薬剤候補物質のスクリーニングにも好ましく用い得る。各ＭＣ２にほぼ同数の細胞が格納されるため各ＭＣ２内の細胞の状態が均一となり、異なる薬剤候補物質を各ＭＣ２へと添加した際、それぞれの薬剤候補物質がどのような影響を細胞へ与えるのかを比較評価し易い。 5. Drug candidate substance screening method The above-mentioned MCAP1 can be preferably used for drug candidate substance screening. Since almost the same number of cells are stored in each MC2, the state of the cells in each MC2 becomes uniform, and when different drug candidate substances are added to each MC2, what influence each drug candidate substance has on the cells It is easy to compare and evaluate.

かかる薬剤候補物質のスクリーニング方法では、種々の薬剤候補物質が細胞に与える影響を簡便かつ迅速に測定し、所望の活性を示す物質を効率よく選択できる。   In such drug candidate substance screening methods, the influence of various drug candidate substances on cells can be measured simply and rapidly, and substances exhibiting desired activity can be efficiently selected.

まず、細胞が保持されたＭＣ２に薬剤候補物質を添加する。ＭＣＡＰ１が備える全てのＭＣ２に同一の薬剤候補物質を添加してもよいし、ＭＣ２によって添加する薬剤候補物質を変えてもよい。また、いくらかのＭＣ２には薬剤候補物質を加えず、これらのＭＣ２に保持された細胞をコントロールとして用いるのが好ましい。   First, a drug candidate substance is added to MC2 holding cells. The same drug candidate substance may be added to all MCs 2 provided in MCAP1, or the drug candidate substance to be added may be changed by MC2. Further, it is preferable that some MC2 is not added with a drug candidate substance, and cells retained in these MC2 are used as a control.

薬剤候補物質を添加した後、該薬剤候補物質がＭＣ２内に保持される細胞に与える影響を測定する。当該影響の測定の方法は、用いる薬剤候補物質、用いる細胞、及び所望の活性に応じて適宜設定すればよい。   After the drug candidate substance is added, the influence of the drug candidate substance on the cells retained in MC2 is measured. The method for measuring the influence may be appropriately set according to the drug candidate substance to be used, the cell to be used, and the desired activity.

例えば、抗ガン剤として作用する物質をスクリーニングしたい場合は、ＭＣ２内に癌細胞を保持し、薬剤候補物質を添加して、当該癌細胞がどの程度の割合及び時間で死滅するかを測定すればよい。当該測定結果に基づいて、実験に供した薬剤候補物質の中から所望の活性を示す物質を選択すればよい。例えば、上記の抗ガン剤として作用する物質をスクリーニングする例であれば、癌細胞が高効率で死滅する作用を示した物質を選択すればよい。多数の薬剤候補物質を簡便かつ迅速にスクリーニングできる。   For example, if you want to screen for a substance that acts as an anticancer agent, keep cancer cells in MC2, add a drug candidate substance, and measure the rate and time at which the cancer cells die. Good. Based on the measurement result, a substance exhibiting a desired activity may be selected from drug candidate substances subjected to the experiment. For example, in the example of screening a substance that acts as the above-described anticancer agent, a substance that has an effect of killing cancer cells with high efficiency may be selected. A large number of drug candidate substances can be screened easily and rapidly.

また、薬剤候補物質のスクリーニング方法に用いられるＭＣＡＰ１は、上記したＭＣＡＰ１であることが好ましい。このＭＣＡＰ１であれば、細胞をより均一かつ効率よく、単層として、ＭＣ２に格納させることができる。   Moreover, it is preferable that MCAP1 used for the screening method of a drug candidate substance is MCAP1 mentioned above. With this MCAP1, cells can be stored in MC2 as a single layer more uniformly and efficiently.

また、このＭＣＡＰ１によれば、細胞をチャンバー内で少なくとも数日以上培養することができる。このため、ＭＣＡＰ１を用いて薬剤候補物質のスクリーニング方法を実施すれば、薬剤候補物質を添加した後細胞を数日以上培養して維持した後、当該物質が細胞に与える影響を測定することができる。   Further, according to this MCAP1, cells can be cultured in a chamber for at least several days. For this reason, if a drug candidate substance screening method is performed using MCAP1, after the drug candidate substance is added, the cells are cultured and maintained for several days or more, and then the influence of the substance on the cells can be measured. .

またさらに、ＭＣＡＰ１では、各ＭＣ２にほぼ同数の細胞が保持されるため、各ＭＣ２内の細胞の状態を均一とすることができる。よって、ＭＣＡＰ１を用いた薬剤候補物質のスクリーニング方法を実施すれば、異なる薬剤候補物質を各ＭＣ２へと添加した際、それぞれの薬剤候補物質がどのような影響を細胞へ与えるのかを比較評価しやすい。   Furthermore, in MCAP1, since almost the same number of cells are held in each MC2, the state of the cells in each MC2 can be made uniform. Therefore, if a drug candidate substance screening method using MCAP1 is carried out, it is easy to compare and evaluate what influence each drug candidate substance has on cells when different drug candidate substances are added to each MC2. .

以上、本発明による実施例及びこれに基づく変形例を説明したが、本発明は必ずしもこれに限定されるものではなく、当業者であれば、本発明の主旨又は添付した特許請求の範囲を逸脱することなく、様々な代替実施例及び改変例を見出すことができるであろう。 As mentioned above, although the Example by this invention and the modification based on this were demonstrated, this invention is not necessarily limited to this, A person skilled in the art will deviate from the main point of this invention, or the attached claim. Various alternative embodiments and modifications could be found without doing so.

＜ＭＣ２内への細胞（赤血球）の格納＞
図６及び以下に示すような、ＭＣＡＰ１を使用して、ＭＣ２内への細胞（赤血球）の格納の様子を観察した。<Storage of cells (red blood cells) in MC2>
Using MCAP1 as shown in FIG. 6 and the following, the state of storage of cells (red blood cells) in MC2 was observed.

基板：ポリスチレン
表面処理：酸素プラズマ処理
水接触角：１０°
ＭＣ２の形成：ＬＩＧＡプロセス及び射出成型
ＭＣ２の空間の形状：逆正六角錘台形（テーパーの角度 ２０°）
開口２ｃの長径＝１００μｍ
深さ＝５０μｍ
開口２ｃの長径：深さの比＝１：約０．５８
底部２ａの長径＝約６３．６μｍ
ｘ＝１１３．４μｍ
ＭＣ２同士の距離：開口２ｃ（正六角形）の中心間距離２００μｍ
（等間隔で配置されている）Substrate: Polystyrene surface treatment: Oxygen plasma treatment Water contact angle: 10 °
MC2 formation: LIGA process and injection molding MC2 space shape: inverted regular hexagonal frustum (taper angle 20 °)
Major diameter of opening 2c = 100 μm
Depth = 50μm
Ratio of major axis of the opening 2c: depth = 1: about 0.58
The major axis of the bottom 2a = about 63.6 μm
x = 113.4 μm
Distance between MC2: Distance between centers of opening 2c (regular hexagon) 200 μm
(Equally spaced)

ここで、ＭＣＡＰ１は、ＬＩＧＡプロセスと射出成型によって作製した。まず、Ｘ線リソグラフィー法によって、ＰＭＭＡにパターニングし、エッチングによって不要なＰＭＭＡを除去しＰＭＭＡ製のマスターを作製した。その後当該マスターにニッケルを電鋳（メッキ）し、金型を作製した。作製された金型を使用して、射出成型によりポリスチレン製のＭＣＡＰを作製した。この表面を、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ：Reactive Ion Etching）装置（サムコ株式会社製）によって２００Ｗの出力、２０秒程度の処理時間で酸素プラズマ処理を行うことにより、チップ基板表面を親水化した。また、細胞懸濁液が展開しやすく、ＭＣ２内に空気が入らないようにするため、親水化したＭＣＡＰ１に対して前もって超音波処理を行った。培地（ＲＰＭＩ１６４０）を入れたビーカーに浸し、市販の超音波洗浄装置を用いて約５分間超音波処理した。   Here, MCAP1 was produced by the LIGA process and injection molding. First, PMMA was patterned by X-ray lithography, and unnecessary PMMA was removed by etching to produce a PMMA master. Thereafter, nickel was electroformed (plated) on the master to produce a mold. A polystyrene MCAP was produced by injection molding using the produced mold. The surface of the chip substrate was hydrophilized by subjecting this surface to an oxygen plasma treatment with a reactive ion etching (RIE) apparatus (manufactured by Samco Corporation) with an output of 200 W and a treatment time of about 20 seconds. In addition, in order to prevent the cell suspension from spreading and prevent air from entering the MC2, the hydrated MCAP1 was sonicated in advance. The sample was immersed in a beaker containing a medium (RPMI1640) and sonicated for about 5 minutes using a commercially available ultrasonic cleaning apparatus.

なお、親水化した表面の水接触角はθ/２法により測定した。すなわち、異なる複数の表面位置（５点以上）に蒸留水１〜２μlを滴下して、接触角計（協和界面科学株式会社製）を用いて、室温にて水接触角を測定しその平均値から水接触角を決定した。   The water contact angle of the hydrophilic surface was measured by the θ / 2 method. That is, 1 to 2 μl of distilled water is dropped onto a plurality of different surface positions (5 points or more), and the water contact angle is measured at room temperature using a contact angle meter (manufactured by Kyowa Interface Science Co., Ltd.), and the average value is obtained. From this, the water contact angle was determined.

赤血球（細胞の大きさ：長いところで８〜１０μｍ程度）の観察は以下のように行った。   Observation of red blood cells (cell size: about 8 to 10 μm at a long place) was performed as follows.

まず、ヒトから採血、遠心分離（４℃、１５００ｇ、３０ｍｉｎ）して得た赤血球を培地（ＲＰＭＩ１６４０）で懸濁し、ヒト由来の赤血球懸濁液（懸濁液中の赤血球濃度１×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を作成した。この赤血球懸濁液２００μｌを、マイクロピペットを用いてＭＣＡＰ１上に与え、赤血球を接触及び展開させ、１５分静置した。さらにマイクロピペットを使って培養液（ＲＰＭＩ１６４０）１ｍｌでＭＣＡＰ１の上面を洗浄した後、倒立顕微鏡でＭＣ２に格納されている赤血球を観察した。First, erythrocytes obtained by collecting blood from a human and centrifuging (4 ° C., 1500 g, 30 min) are suspended in a medium (RPMI1640), and a erythrocyte suspension derived from human (red blood cell concentration in suspension: 1 × 10 ⁸ cells). / Ml). 200 μl of this erythrocyte suspension was applied onto MCAP1 using a micropipette, the erythrocytes were contacted and developed, and allowed to stand for 15 minutes. Further, the upper surface of MCAP1 was washed with 1 ml of a culture solution (RPMI1640) using a micropipette, and then the erythrocytes stored in MC2 were observed with an inverted microscope.

その一例を図７に示す。ＭＣ２の底部２ａには細胞（赤血球）が同一径で円形に観察できることから、この底部２ａには細胞が均一に一層（単層）だけ並んで格納されている。なお、この観察は、ＭＣ２の底部に顕微鏡の焦点を合わせてあるため、ＭＣ開口２ｃには顕微鏡の焦点が合っていない。このため図７（図６も同様）において、ＭＣ２の開口２ｃ周縁は、黒い影として示されている。以下の観察においても同様である。 An example is shown in FIG. Since cells (red blood cells) can be observed in a circle with the same diameter at the bottom 2a of MC2, cells are uniformly stored in this bottom 2a side by side (single layer). In this observation, since the microscope is focused on the bottom of MC2, the microscope aperture is not focused on MC opening 2c. For this reason, in FIG. 7 (FIG. 6 is also the same), the periphery of the opening 2c of MC2 is shown as a black shadow. The same applies to the following observations.

＜水接触角と細胞の展開効率＞
酸素プラズマ処理条件を変更することにより、水接触角の異なる３種のＭＣＡＰ（水接触角８０°、２５°、１０°）を作製して赤血球を観察し、水接触角と細胞の展開効率について比較した。<Water contact angle and cell deployment efficiency>
By changing the oxygen plasma treatment conditions, three types of MCAP (water contact angles 80 °, 25 °, 10 °) with different water contact angles were prepared and red blood cells were observed. Compared.

上記した赤血球の観察に用いたＭＣＡＰ１とは、以下のように変更を加えて製造している。
ＭＣ２の空間の形状：逆円錐台形（テーパーの角度 ２０°）
開口２ｃの長径＝１００μｍ
深さ＝１００μｍ
開口２ｃの長径：深さの比＝１：１
底部の長径＝約２７．２μｍ
酸素プラズマ処理：ＲＩＥ装置（サムコ株式会社製）
水接触角８０°：出力２００Ｗ、３秒
水接触角２５°：出力２００Ｗ、５秒
水接触角１０°：出力２００Ｗ、２０秒MCAP1 used for the observation of red blood cells described above is manufactured with the following modifications.
MC2 space shape: inverted frustoconical shape (taper angle 20 °)
Major diameter of opening 2c = 100 μm
Depth = 100μm
Ratio of major axis of the opening 2c: depth = 1: 1
Bottom major axis = about 27.2 μm
Oxygen plasma treatment: RIE equipment (manufactured by Samco Corporation)
Water contact angle 80 °: Output 200W, 3 seconds Water contact angle 25 °: Output 200W, 5 seconds Water contact angle 10 °: Output 200W, 20 seconds

その一例を図８に示した。ここで細胞の展開効率とは、ＭＣＡＰ１のＭＣ２の全個数に対する細胞の格納されたＭＣ２の個数の割合である。   An example is shown in FIG. Here, the cell deployment efficiency is the ratio of the number of MC2 in which cells are stored to the total number of MC2 in MCAP1.

図８Ａに示すように、水接触角８０°の場合、ＭＣ２にはほとんど細胞が入らなかった。図８Ｂに示すように、水接触角２５°の場合、４０％程度の細胞を格納できた。また、同８Ｃに示すように、水接触角１０°の場合、９０％以上の細胞を格納できた。なお、水接触角４０°で多くの細胞を格納できるようになり、また、水接触角５°の場合にも、良好（９０％以上）に細胞を格納できた。   As shown in FIG. 8A, when the water contact angle was 80 °, almost no cells entered MC2. As shown in FIG. 8B, about 40% of cells could be stored when the water contact angle was 25 °. Further, as shown in FIG. 8C, when the water contact angle was 10 °, 90% or more of cells could be stored. In addition, it became possible to store many cells at a water contact angle of 40 °, and cells could be stored well (90% or more) when the water contact angle was 5 °.

以上のことから、水接触角は４０°以下であるが、好ましくは１０°以下、より好ましくは８°以下、さらに好ましくは５°以下である。   From the above, the water contact angle is 40 ° or less, preferably 10 ° or less, more preferably 8 ° or less, and further preferably 5 ° or less.

＜ＭＣ２の開口２ｃの長径及び深さと赤血球の保持能力＞
次に、ＭＣＡＰ１のＭＣ２の開口２ｃの長径及び深さを変えたとき、ＭＣ２内への細胞の格納の相違について検討した。<The major axis and depth of the opening 2c of MC2 and the retention ability of red blood cells>
Next, when the major axis and depth of the opening 2c of the MC2 of the MCAP1 were changed, the difference in the storage of the cells in the MC2 was examined.

開口２ｃの長径及び深さを下記表１のようにした逆円錐台形（テーパーの角度 ２０°）のＭＣ２を備えるＭＣＡＰ１を３種類のプレートＡ〜Ｃを製造した。各プレートＡ〜Ｃは、長径及び深さ、各ＭＣ２間の距離以外の条件は、上記したＭＣＡＰ１と同じである。   Three types of plates A to C were manufactured using MCAP1 having an inverted frustoconical MC2 (taper angle of 20 °) with the major axis and depth of the opening 2c as shown in Table 1 below. Each of the plates A to C is the same as the above-described MCAP1 except for the major axis and depth and the distance between each MC2.

プレートＡ〜Ｃには、上記同様、赤血球懸濁液２００μｌを添加し、赤血球を接触及び展開後、１５分間静置した。その後洗浄して、倒立顕微鏡を用いて赤血球を格納するＭＣ２を検出した。   As described above, 200 μl of the red blood cell suspension was added to the plates A to C, and the red blood cells were left to stand for 15 minutes after contact and development. Thereafter, washing was performed, and MC2 storing red blood cells was detected using an inverted microscope.

図９Ａ及びＣに示すように、プレートＡ及びＣでは、ＭＣ２の底部２ａ内に細胞を同一径の円形に観察されたことから、重なることなくＭＣ２に細胞を格納できたことがわかる。また、細胞数を数えると、各ＭＣ２にはほぼ同数の細胞が格納されていた。各ＭＣ２の底部２ａには均一に、赤血球を単層に保持しているのである。一方、図９Ｂに示すように、長径の大きいプレートＢでは、底面２ａに赤血球が接着していないＭＣ２を確認できた。これは、洗浄工程においてＭＣ２の底部２ａに接着していた赤血球が洗い流されてしまったためであると考えられる。すなわち、長径が５００μｍ程度に大きいＭＣ２では、深さが１５０μｍ以下の場合、細胞を均一に単層にチャンバー内に保持することは困難であると考えられた。また、プレートＡ及びＣでは、各ＭＣ２の底に均一に、赤血球を単層に保持していることから、ＭＣ２の開口２ｃ長径：深さ比は１：０．３５〜１程度が好ましいと言える。   As shown in FIGS. 9A and 9C, in the plates A and C, since the cells were observed in a circular shape with the same diameter in the bottom 2a of the MC2, it can be seen that the cells could be stored in the MC2 without overlapping. When the number of cells was counted, almost the same number of cells were stored in each MC2. The erythrocytes are uniformly held in a monolayer on the bottom 2a of each MC2. On the other hand, as shown in FIG. 9B, MC2 in which red blood cells were not adhered to the bottom surface 2a could be confirmed in the plate B having a large major axis. This is considered to be because the red blood cells adhering to the bottom 2a of MC2 were washed away in the washing step. That is, with MC2 having a major axis as large as about 500 μm, it was considered difficult to keep the cells uniformly in a single layer in the chamber when the depth was 150 μm or less. Further, in the plates A and C, since the red blood cells are uniformly held in a single layer on the bottom of each MC2, it can be said that the opening 2c major axis: depth ratio of the MC2 is preferably about 1: 0.35 to 1. .

＜白血病細胞の観察＞
次に、上記したと同様のＭＣＡＰ１を用いて、白血病細胞を含む被験試料の観察を行った。<Observation of leukemia cells>
Next, the test sample containing leukemia cells was observed using the same MCAP1 as described above.

ヒト培養系白血病細胞（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ）をＲＰＭＩ１６４０培地で１．０ｘ１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ程度に調整し、ＭＣＡＰ１上にマイクロピペット等を用いて展開した。１５分程度静置した後、ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、更に、マイクロピペットでチップ上を洗浄し、倒立型顕微鏡でＭＣ２内の細胞を観察した。Human cultured leukemia cells (CCRF-CEM) were adjusted to about 1.0 × 10 ⁷ cells / ml with RPMI 1640 medium and developed on MCAP1 using a micropipette or the like. After standing for about 15 minutes, the chip was further washed with a micropipette using RPMI 1640 medium, and the cells in MC2 were observed with an inverted microscope.

図１０に示すように、ＭＣ２の底部２ａには細胞（白血病細胞）が同一径で円形に観察され、均一に一層（単層）の状態に並んでいることが確認できた。つまり、有核細胞白血病細胞でも赤血球と同等の観察が可能である。全血中の白血球画分に含まれる癌細胞の検出も可能となることから、特に血中循環癌細胞（ＣＴＣ）の検出も可能となる。 As shown in FIG. 10, cells (leukemia cells) were observed in a circular shape with the same diameter at the bottom 2a of MC2, and it was confirmed that the cells were uniformly arranged in a single layer (single layer). That is, nucleated cell leukemia cells can be observed in the same manner as erythrocytes. Since cancer cells contained in the leukocyte fraction in whole blood can also be detected, in particular, circulating cancer cells (CTC) in the blood can also be detected.

＜空隙率の影響＞
次に、ＭＣＡＰ１の主面にＭＣ２の開口２ｃの占める割合、すなわち空隙率の影響について観察した。<Influence of porosity>
Next, the ratio of the opening 2c of MC2 to the main surface of MCAP1, that is, the influence of the porosity was observed.

下記表２のようにした逆円錐台形（テーパーの角度 ２０°）のＭＣ２を備えるＭＣＡＰ１を３種類（プレートＤ、プレートＥ、プレートＦ）製造した。 Three types of MCAP1 (plate D, plate E, and plate F) having an inverted frustoconical MC2 (taper angle 20 °) as shown in Table 2 below were manufactured.

ここで、ｘの値（図３参照）を４０、３０、２０μｍとしたプレートＤ、Ｅ、Ｆにおいて、いずれもＭＣ２の開口２ｃの重心は等間隔であり、この重心を斜め格子点の上に配列するように配置している。また、ＭＣＡＰ１の大きさは、長辺×短辺が約７６ｍｍ×約２５ｍｍ、厚さ約１．０ｍｍである。フロスト部分の幅は、約１０ｍｍである。領域Ａの長辺は約５３ｍｍであり短辺は約２０ｍｍである。   Here, in the plates D, E, and F where the value of x (see FIG. 3) is 40, 30, and 20 μm, the centroids of the openings 2c of the MC2 are equally spaced, and these centroids are placed on the diagonal lattice points. It arranges so that it may arrange. The size of MCAP1 is about 76 mm × about 25 mm in long side × short side and about 1.0 mm in thickness. The width of the frost portion is about 10 mm. The long side of region A is about 53 mm and the short side is about 20 mm.

赤血球懸濁液は、上記同様に調製し、細胞数は５×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌである。一方、ヒト培養系白血病細胞（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ）浮遊液は、細胞を培養した後、ＰＢＳ（ＲＰＭＩ１６４０）で１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した。The red blood cell suspension is prepared in the same manner as described above, and the number of cells is 5 × 10 ⁷ cells / ml. On the other hand, the human cultured leukemia cell (CCRF-CEM) suspension was adjusted to 1 × 10 ⁷ cells / ml with PBS (RPMI1640) after culturing the cells.

プレートＤ〜Ｆの上面に赤血球浮遊液又はヒト培養（ＣＥＭ）細胞浮遊液を４００〜５００μｌ（領域Ａの１ｍｍ^２あたり０．３６〜０．４μｌ）を展開した。なお、洗浄操作は行わず、細胞をチャンバー内に格納するために展開後１５分間静置し、倒立顕微鏡を用いてチャンバー内の細胞の状態を観察した。400 to 500 μl (0.36 to 0.4 μl per 1 mm ^{2 of} region A) of erythrocyte suspension or human culture (CEM) cell suspension was developed on the upper surface of plates D to F. In addition, washing | cleaning operation was not performed, but in order to store a cell in a chamber, it left still for 15 minutes after expansion | deployment, and observed the state of the cell in a chamber using the inverted microscope.

図１１Ａに示すように、赤血球浮遊液を用いた場合、プレートＥ（Ｘ＝３０μｍ）では、ＭＣ２の底部２ａには細胞が同一径の円形に観察され、すき間なく格納されている。これに対し、図１１Ｂに示すように、プレートＤ（Ｘ＝４０μｍ）では、格納された細胞と細胞の間にすき間が生じていた（矢印部参照）。このことからＭＣ２の開口２ｃの同士の間隔を３０μｍとすると、より均一にＭＣ２内の底部２ａに細胞を単層として格納できる。   As shown in FIG. 11A, when the erythrocyte suspension is used, in the plate E (X = 30 μm), cells are observed in a circular shape with the same diameter on the bottom 2a of MC2 and stored without gaps. On the other hand, as shown in FIG. 11B, in the plate D (X = 40 μm), there was a gap between the stored cells (see the arrow). Therefore, when the interval between the openings 2c of the MC2 is set to 30 μm, the cells can be more uniformly stored as a single layer in the bottom 2a in the MC2.

図１２に示すように、白血病細胞（ＣＥＭ）浮遊液を用いた場合でも、同様であった。つまり、プレートＥ（Ｘ＝３０μｍ）では、ＭＣ２の底部２ａには細胞が同一径の円形に観察され、すき間なく格納されている。これに対し、プレートＤ（Ｘ＝４０μｍ）では、格納された細胞と細胞の間にすき間が生じているのである。 As shown in FIG. 12, the same was true when leukemia cell (CEM) suspension was used. That is, in the plate E (X = 30 μm), cells are observed in a circular shape with the same diameter on the bottom 2a of the MC 2 and stored without gaps. On the other hand, in the plate D (X = 40 μm), there is a gap between the stored cells.

また、図１３に示すように、プレートＦ（Ｘ＝２０μｍ）では、赤血球浮遊液及び白血病細胞（ＣＥＭ）浮遊液ともにＭＣ２の底部２ａには細胞が同一径の円形に観察され、すき間なく格納されていた。つまり、細胞が均一に単層として格納できていた。 Further, as shown in FIG. 13, in the plate F (X = 20 μm), both the erythrocyte suspension and the leukemia cell (CEM) suspension are observed in the bottom 2a of the MC2 in a circular shape with the same diameter and stored without gaps. It was. In other words, the cells were uniformly stored as a single layer.

図１４に示すように、赤血球浮遊液及び白血病細胞（ＣＥＭ）浮遊液ともに、プレートＥ及びＦでは、Ｘの値に関わらずほぼ同数の細胞を格納していたが、プレートＤでは、急激にその数を減少させていた。ここで開口２ｃの正六角形の外接円の半径をｒ、開口２ｃ間の距離をＬとすると、Ｘの値との間には幾何学的な関係が成立し、Ｘが３０μｍよりも小さいことは、Ｌのうちの３０％以下でＭＣＡＰ１の上面を残存させる開口２ｃを有すると換言できる。 As shown in FIG. 14, both the erythrocyte suspension and leukemia cell (CEM) suspension stored almost the same number of cells regardless of the value of X in plates E and F. The number was decreasing. Here, assuming that the radius of the circumscribed circle of the regular hexagon of the opening 2c is r and the distance between the openings 2c is L, a geometrical relationship is established with the value of X, and X is smaller than 30 μm. In other words, 30% or less of L has an opening 2c that leaves the upper surface of MCAP1.

さらに、図１５に示すように、顕微鏡のピントをＭＣＡＰ１の上面に合わせて観察すると、かかる上面に細胞が残存していることがわかる（矢印部参照）。   Furthermore, as shown in FIG. 15, when the focus of the microscope is aligned with the upper surface of MCAP1, it can be seen that cells remain on the upper surface (see the arrows).

図１６に示すように、プレートＤでは残存している細胞数が２３個／１０，０００μｍ^２であり、プレートＥ及びＦでは、それぞれ２０個及び１３個／１０，０００μｍ^２である。洗浄を行わない場合には、ＭＣ２間の間隔が３０μｍ程度以下である方が、ＭＣＡＰ１の上面に残存する細胞は少なく、より均一に単層として多くの細胞をＭＣ２内に効率的に格納できる。As shown in FIG. 16, the number of remaining cells is 23 / 10,000 μm ² in plate D, and 20 and 13 / 10,000 μm ² in plates E and F, respectively. When washing is not performed, the number of cells remaining on the upper surface of MCAP1 is smaller when the interval between MC2 is about 30 μm or less, and more cells can be efficiently stored in MC2 as a single layer.

以上のように、膨大な数の細胞中に混在する少数の標的細胞（特定の細胞）の高感度、且つ高い網羅性での検出を実現できると考えられた。   As described above, it was considered that detection of a small number of target cells (specific cells) mixed in an enormous number of cells with high sensitivity and high completeness could be realized.

１ マイクロチャンバーアレイプレート（ＭＣＡＰ）
２ マイクロチャンバー（ＭＣ）
２ａ 底部
２ｃ 開口

1 Microchamber array plate (MCAP)
2 Microchamber (MC)
2a Bottom 2c Opening

Claims (11)

各種細胞を収容し得る凹部であるマイクロチャンバーを同一形状で且つ複数その主面上に規則的に分散配列した仮想格子点上に形成したマイクロチャンバーアレイプレートであって、
前記主面及び前記マイクロチャンバーの内面は親水性表面を有し、
前記マイクロチャンバーは、前記凹部の開口形状の重心点を前記主面上の前記仮想格子点と一致するように配置形成され、且つ、隣接する前記マイクロチャンバーの前記重心間を結ぶ線分のうちの３０％以下で前記主面を残存させる前記開口形状を有する、ことを特徴とするマイクロチャンバーアレイプレート。A microchamber array plate formed on virtual lattice points in which microchambers, which are concave portions capable of accommodating various cells, have the same shape and are regularly dispersed on the principal surface,
The main surface and the inner surface of the microchamber have a hydrophilic surface,
The microchamber is arranged and formed so that the center of gravity of the opening shape of the recess coincides with the virtual lattice point on the main surface, and among the line segments connecting the centers of gravity of the adjacent microchambers A microchamber array plate having the opening shape that leaves the main surface at 30% or less. 前記開口形状の前記重心点を直線でつないだ閉線で画される領域のうち、前記開口形状の占める合計面積の比率を５０％以上とすることを特徴とする請求項１記載のマイクロチャンバーアレイプレート。   2. The microchamber array according to claim 1, wherein a ratio of a total area occupied by the opening shape in a region defined by a closed line obtained by connecting the center of gravity of the opening shape with a straight line is 50% or more. plate. 前記親水性表面は、水接触角を４０°以下とすることを特徴とする請求項２記載のマイクロチャンバーアレイプレート。 The microchamber array plate according to claim 2, wherein the hydrophilic surface has a water contact angle of 40 ° or less. 前記仮想格子点は、１つの前記仮想格子点を中心とした同心円上に順次前記仮想格子点を配置してなることを特徴とする請求項１記載のマイクロチャンバーアレイプレート。   The micro-chamber array plate according to claim 1, wherein the virtual lattice points are formed by sequentially arranging the virtual lattice points on a concentric circle centered on one virtual lattice point. 前記仮想格子点はそのうちの隣接する３点を等距離で最隣接させる繰り返し規則配置を有することを特徴とする請求項４記載のマイクロチャンバーアレイプレート。   5. The microchamber array plate according to claim 4, wherein the virtual lattice points have a repeating regular arrangement in which three adjacent points are closest to each other at an equal distance. 前記開口形状は円又は前記円に内接する正多角形であることを特徴とする請求項５記載のマイクロチャンバーアレイプレート。 6. The microchamber array plate according to claim 5, wherein the opening shape is a circle or a regular polygon inscribed in the circle. 前記開口形状は正六角形であり、隣接する前記マイクロチャンバー同士においてそのエッジ線を互いに平行に配置されていることを特徴とする請求項６記載のマイクロチャンバーアレイプレート。   The microchamber array plate according to claim 6, wherein the opening shape is a regular hexagon, and the edge lines of the adjacent microchambers are arranged in parallel to each other. 前記正六角形の外接円の径は２０〜５００μｍの範囲内であることを特徴とする請求項７記載のマイクロチャンバーアレイプレート。   The micro chamber array plate according to claim 7, wherein the diameter of the circumscribed circle of the regular hexagon is in the range of 20 to 500 µm. 前記マイクロチャンバーは底部に向かって断面積を小さくするテーパー側面を有することを特徴とする請求項８記載のマイクロチャンバーアレイプレート。   9. The micro chamber array plate according to claim 8, wherein the micro chamber has a tapered side surface with a cross-sectional area decreasing toward the bottom. 前記マイクロチャンバーは２０μｍ以上の深さを有することを特徴とする請求項９記載のマイクロチャンバーアレイプレート。   The micro chamber array plate according to claim 9, wherein the micro chamber has a depth of 20 μm or more. 前記マイクロチャンバーは、前記外接円の径に対する前記深さの比を０．３５〜１の範囲内とすることを特徴とする請求項１０記載のマイクロチャンバーアレイプレート



The micro chamber array plate according to claim 10, wherein the micro chamber has a ratio of the depth to the diameter of the circumscribed circle within a range of 0.35 to 1.

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