JP6395712B2 - Microarray chip and cell analysis method using the chip - Google Patents

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Description

本発明は、複数の細胞を含む試料から、該試料に含まれる特定の細胞を検出するための検出方法に関する。また、本発明は、複数の細胞を含む試料から、該試料に含まれる特定の細胞を検出するための検出用キットに関する。また、本発明は、複数のマイクロチャンバーを備えており、該マイクロチャンバー１つあたりに複数個の細胞を格納可能であるマイクロアレイチップに関する。さらにまた、本発明は、複数のマイクロチャンバーを備えたマイクロアレイチップを用いて薬剤候補物質をスクリーニングする方法に関する。   The present invention relates to a detection method for detecting specific cells contained in a sample from a sample containing a plurality of cells. The present invention also relates to a detection kit for detecting specific cells contained in a sample from a sample containing a plurality of cells. The present invention also relates to a microarray chip that includes a plurality of microchambers and that can store a plurality of cells per microchamber. Furthermore, the present invention relates to a method for screening drug candidate substances using a microarray chip having a plurality of microchambers.

様々な種類の複数の細胞が含まれる試料から特定の細胞のみを検出することは、非常に幅広い分野にわたって必要とされている。特に医学、薬学に関連するバイオテクノロジーの研究開発及び臨床現場においては、多数の細胞中において、特定の細胞（例えば、特定の物質を有する又は産出する細胞、あるいは病原菌に感染した細胞や癌細胞等）の有無を検出することは、実験の進行や病気の診断のために非常に重要である。   The detection of only specific cells from a sample containing a plurality of cells of various types is required over a very wide range of fields. In particular, in the research and development of biotechnology related to medicine and pharmacy, and in clinical practice, among many cells, a specific cell (for example, a cell having or producing a specific substance, a cell infected with a pathogen, a cancer cell, etc. ) Is very important for the progress of experiments and diagnosis of diseases.

しかしながら、特に特定の細胞の存在割合が低い場合、多くの細胞が存在する試料中から当該特定の細胞を検出することは困難である。   However, it is difficult to detect a specific cell from a sample in which many cells are present, particularly when the specific cell is present in a low proportion.

例えば、感染症の一つとして、マラリア原虫が赤血球細胞に感染することにより生じるマラリア原虫感染症があるが、該感染症の検出・診断方法としては次のものが例示される。   For example, as one of the infectious diseases, there is a malaria parasite infection that occurs when a malaria parasite infects red blood cells. Examples of the method for detecting and diagnosing the infectious disease include the following.

例えば、血液細胞をスライドガラスに塗抹、乾燥し、ギムザ染色した後に顕微鏡下でマラリア原虫による感染の有無・程度を観察する方法がある。該方法は染色操作を行うだけで顕微鏡による観察が可能であり、簡便という利点を有する。しかしながら、該方法による検出・診断には時間と高度な観察技術を必要とし、さらに検出感度は非常に低い。例えば、該方法の所要時間は４０分と長く、全血液細胞のうち少なくとも０．０１％程度の細胞が感染している場合にかろうじて検出できる程度であり、検出感度（検出限界）は高くない。   For example, there is a method in which blood cells are smeared on a glass slide, dried, and stained with Giemsa, and then the presence / absence and extent of infection by a malaria parasite is observed under a microscope. The method can be observed with a microscope only by performing a staining operation, and has the advantage of simplicity. However, detection and diagnosis by this method requires time and advanced observation techniques, and the detection sensitivity is very low. For example, the time required for the method is as long as 40 minutes, and it is barely detectable when at least about 0.01% of all blood cells are infected, and the detection sensitivity (detection limit) is not high.

別の例としては、イムノクロマトグラフィー法を利用してマラリア原虫による感染の有無・程度を検査・診断する方法がある。該方法も広く知られており、検査が簡便に実施できるように検査キットも販売されている。このため、このような検査キットを使用した場合には、さらに簡単な操作で感染の有無・程度を観察できる。イムノクロマトグラフィー法の所要時間は２０分程度と短時間ではあるが、その検出感度は顕微鏡下での観察と同程度であり高くない。また、イムノクロマトグラフィー法は擬陽性も出やすいことから前述の顕微鏡下での観察との併用が常である。   As another example, there is a method of examining and diagnosing the presence / absence or degree of infection with malaria parasite using an immunochromatography method. This method is also widely known, and a test kit is also sold so that the test can be easily performed. Therefore, when such a test kit is used, the presence / absence and degree of infection can be observed with a simpler operation. Although the time required for the immunochromatography method is as short as about 20 minutes, its detection sensitivity is similar to that observed under a microscope and is not high. In addition, since immunochromatography tends to produce false positives, it is usually used in combination with the above-mentioned observation under a microscope.

別の方法としては、ＰＣＲ法を利用してマラリア原虫による感染の有無・程度を検査・診断する方法がある。該方法は、前述の顕微鏡下での観察等とは異なり比較的高い検出感度を有する。しかしながら、ＰＣＲ法では結果を得るまでに５時間程度を要し、また操作が煩雑で高度な技術を要する。また、試料の状態やプライマーによっては反応条件設定が難しく検出できない場合もある。従ってＰＣＲ法単独では感染診断には向いていない。   As another method, there is a method of examining and diagnosing the presence / absence or degree of infection by a malaria parasite using a PCR method. The method has a relatively high detection sensitivity, unlike the observation under the microscope described above. However, the PCR method requires about 5 hours until results are obtained, and the operation is complicated and requires advanced techniques. In addition, depending on the state of the sample and the primers, it may be difficult to set reaction conditions and cannot be detected. Therefore, the PCR method alone is not suitable for infection diagnosis.

このように、例えばマラリア原虫感染症において、従来の検出・診断方法には検出までに長時間を要する、高度な技術を要する、検出感度が低い等の欠点がある。このため、迅速、簡便かつ検出感度が高い新しい感染症の検出方法が求められている。   Thus, for example, in the case of malaria parasite infection, the conventional detection / diagnostic methods have drawbacks such as that it takes a long time to detect, advanced techniques, and low detection sensitivity. Therefore, there is a need for a new method for detecting infectious diseases that is quick, simple, and has high detection sensitivity.

一方、これまでに種々のマイクロアレイチップが報告されており、細胞の検出等に応用されている。例えば、特許文献１には、マイクロチャンバーを集積化し、ヒーター等と連結し、ハイスループットに生体試料の生化学反応等を行うシステムが報告されている。しかしながら、該システムは細胞レベルで検出できるほど感度が高いとはいえず、膨大な数の細胞中に混在する少数の標的細胞を高感度に検出することは困難である。   On the other hand, various microarray chips have been reported so far and applied to cell detection and the like. For example, Patent Document 1 reports a system in which micro chambers are integrated and connected to a heater or the like to perform a biochemical reaction of a biological sample with high throughput. However, the system is not sensitive enough to be detected at the cellular level, and it is difficult to detect a small number of target cells mixed in a huge number of cells with high sensitivity.

また、特許文献２には、ポリマーを基板上にパターニングして、これに何らかの物質を固定させ、固定された該物質に細胞を作用させることにより、該物質の細胞に対する作用を観察する技術が報告されている。しかしながら、該技術においては各パターンに一定数の細胞を固定化することは困難であり、また膨大な数の細胞中に混在する少数の標的細胞を高感度に検出することは困難である。   Patent Document 2 reports a technique for observing the action of a substance on cells by patterning a polymer on a substrate, immobilizing a substance on the substrate, and causing cells to act on the immobilized substance. Has been. However, in this technique, it is difficult to fix a fixed number of cells in each pattern, and it is difficult to detect a small number of target cells mixed in a vast number of cells with high sensitivity.

また、特許文献３には、１つのリンパ球が格納されるように設計されたマイクロウェルを多数集積化したアレイチップが報告されている。しかしながら、該マイクロウェルには一細胞しか導入できないため、アレイチップ上に集積化されたマイクロウェル数以上の細胞をスクリーニングすることは困難である。従って、当該アレイチップにおいても、膨大な数（１００〜１０００万個）の細胞中に混在する少数の標的細胞を高感度に検出することは困難である。またさらに、当該アレイチップのマイクロウェルでは、導入された細胞をさらに培養やPCRすることは極めて困難であると考えられる。   Further, Patent Document 3 reports an array chip in which a large number of microwells designed to store one lymphocyte are integrated. However, since only one cell can be introduced into the microwell, it is difficult to screen more than the number of microwells integrated on the array chip. Therefore, even in the array chip, it is difficult to detect a small number of target cells mixed in a huge number (1 to 10 million) of cells with high sensitivity. Furthermore, it is considered extremely difficult to further culture or PCR the introduced cells in the microwells of the array chip.

このように、従来のマイクロアレイチップを用いる方法であっても、膨大な数の細胞中に混在する少数の標的細胞（特定の細胞）を高感度に検出することは困難である。
このことから、例えば前述のマラリア原虫感染症をはじめとする種々の感染症に感染した細胞、また、これ以外の種々の標的細胞（特定の細胞）を迅速、簡便かつ高感度に検出可能な新しい検出手段が求められている。また、ベッドサイド等でも容易に使用可能な新しい検出手段が求められている。Thus, even with the conventional method using a microarray chip, it is difficult to detect a small number of target cells (specific cells) mixed in an enormous number of cells with high sensitivity.
From this, for example, cells that have been infected with various infectious diseases including the aforementioned malaria parasite infection, and various other target cells (specific cells) can be detected quickly, conveniently and with high sensitivity. There is a need for detection means. There is also a need for new detection means that can be used easily at the bedside or the like.

このような検出手段の好適な例として、本発明者らは既に、マイクロチャンバーの大きさ（特に縦横の比率）やチップ表面の水接触角が特定の範囲の値を有するマイクロチップを報告している（特許文献４）。当該チップによれば、膨大な数の細胞中に混在する少数の標的細胞（特定の細胞）を高感度に検出することができる。具体的には、当該チップ上へ多数の細胞を含むサンプルを展開して細胞を各マイクロチャンバーに格納し、過剰な細胞をマイクロアレイチップから除去（洗浄）することにより、各マイクロチャンバー内にほぼ均一に単層として細胞を格納することができる。特定の大きさのマイクロチャンバーや特定の水接触角を有することにより、測定サンプルを適用した際に各マイクロチャンバー内に単層として細胞を格納されなかった場合にも、洗浄することによって各マイクロチャンバー内にほぼ均一に単層として細胞を格納することができるのである。このために種々の利点を得ることができる。例えば、（ｉ）マイクロチャンバー内で細胞が重なり、検出標的である特定の細胞が他の細胞の下に位置することになって、検出が困難になるなどの問題が起きにくい、（ｉｉ）顕微鏡で観察する際に焦点を容易に合わせることができるし、共焦点レーザー顕微鏡による観察においても、バックグラウンドを抑制でき、高感度での観察が可能となる、（ｉｉｉ）単層に格納された細胞上に別の種類の細胞をのせて、それぞれの細胞の相互作用を簡便かつ効率よく検討することができる、などといった利点を得ることができる。   As a suitable example of such a detection means, the present inventors have already reported a microchip having a value in a specific range for the size of the microchamber (particularly the aspect ratio) and the water contact angle on the chip surface. (Patent Document 4). According to the chip, a small number of target cells (specific cells) mixed in a huge number of cells can be detected with high sensitivity. Specifically, a sample containing a large number of cells is spread on the chip, the cells are stored in each microchamber, and excess cells are removed (washed) from the microarray chip, so that they are almost uniform in each microchamber. Cells can be stored as a single layer. Each microchamber can be washed by having a specific size microchamber and a specific water contact angle, even when cells are not stored as a single layer in each microchamber when a measurement sample is applied. The cells can be stored almost uniformly as a single layer. For this reason, various advantages can be obtained. For example, (i) a cell overlaps in a microchamber and a specific cell that is a detection target is positioned under another cell, and thus problems such as difficulty in detection are unlikely to occur. (Ii) a microscope (Iii) Cells stored in a single layer that can be focused easily when observing with (3), and that the background can be suppressed and observation with high sensitivity is possible even with observation with a confocal laser microscope It is possible to obtain advantages such as being able to easily and efficiently study the interaction of each cell by placing another type of cell on top.

しかし、裏を返せば、当該チップを用いる場合には、検出のために用いるサンプル（例えば血液）をチップに適用した後に、細胞をマイクロアレイチップから除去（洗浄）する必要があるケースが多く存在するということであり、このためにサンプルに含まれる多くの細胞を無駄にしてしまうという問題があった。   However, on the other hand, when the chip is used, there are many cases in which cells need to be removed (washed) from the microarray chip after a sample (for example, blood) used for detection is applied to the chip. For this reason, there is a problem that many cells contained in the sample are wasted.

特表２００４−５０２９２９号公報JP-T-2004-502929 特開２００４−１２５７８１号公報JP 2004-125781 A 特開２００４−１８７６７６号公報JP 2004-187676 A 国際公開第２０１０／０２７００３号International Publication No. 2010/027003

本発明は、できる限りサンプル中に存在する細胞を無駄にすることなく、膨大な数の細胞中に混在する少数の標的細胞（特定の細胞）を高感度に検出できる方法を提供することを目的とする。   An object of the present invention is to provide a method capable of detecting a small number of target cells (specific cells) mixed in a huge number of cells with high sensitivity without wasting cells present in a sample as much as possible. And

本発明者らが上記課題に鑑み鋭意検討を行ったところ、上記特許文献４において報告したマイクロチップの特性を備えつつ、さらに、マイクロアレイチップの最外部に存在するマイクロチャンバー開口部の中心を直線でつないで囲った領域の面積を１００％とし、その領域におけるマイクロチャンバー開口部以外の部分が占める面積比率を間隙率としたとき、前記マイクロアレイチップの間隙率が０％より大きく４５％以下であるマイクロチップを用いることにより、標的とする特定の細胞を迅速、簡便かつ高感度に検出することができ、さらにサンプルに含まれる細胞のロスも抑えられることを見出した。さらには、当該マイクロチップでは、各マイクロチャンバーの形状を統一することにより、各マイクロチャンバーに概ね同数の細胞を格納することができ、これにより一つのチップにおいて解析される細胞数を迅速に見積もることも可能となった。   The present inventors have conducted intensive studies in view of the above-mentioned problems. As a result, the center of the microchamber opening existing at the outermost part of the microarray chip is linearly provided while having the characteristics of the microchip reported in Patent Document 4. When the area of the connected region is 100%, and the area ratio occupied by the portion other than the microchamber opening in the region is the porosity, the microarray chip has a porosity of more than 0% and not more than 45%. It has been found that by using a chip, specific cells to be targeted can be detected quickly, conveniently and with high sensitivity, and the loss of cells contained in the sample can be suppressed. Furthermore, in the microchip, by unifying the shape of each microchamber, approximately the same number of cells can be stored in each microchamber, thereby quickly estimating the number of cells analyzed in one chip. Became possible.

本発明は上記知見に基づきさらに検討を重ねた結果完成されたものであり、例えば以下の項に記載の発明を包含する。
項１．
複数のマイクロチャンバーを備えており、該マイクロチャンバー１つあたりに複数の細胞を単層に格納可能であり、表面の水接触角が１０°以下であり、該マイクロチャンバーの（内径：深さ）の比が（１：０．３５〜１）であり、以下の（ｉ）（ｉｉ）の条件のいずれか一方又は両方を満たす、マイクロアレイチップ。
（ｉ）最外部に存在するマイクロチャンバーの開口部の中心を直線でつないで囲った領域の面積を１００％とし、その領域におけるマイクロチャンバー開口部以外の部分が占める面積比率を間隙率としたとき、間隙率が０％より大きく４５％以下である。
（ｉｉ）マイクロチャンバーとマイクロチャンバーとの間隔が、３５μｍ以下である。
項２．
前記マイクロチャンバーが、内径が２０〜５００μｍ、深さが２０μｍ以上である、項１に記載のマイクロアレイチップ。
項３．
複数の細胞を含む試料から、該試料に含まれる特定の細胞を検出するための検出方法であって、
（１）複数のマイクロチャンバーを備えたマイクロアレイチップであって、該マイクロチャンバー１つあたりに複数の細胞を格納可能であるマイクロアレイチップに、該試料中の細胞を保持させる工程、及び
（２）該マイクロアレイチップに保持された細胞において、特定の細胞の有無を検出する工程
を含み、
前記マイクロアレイチップの表面の水接触角が１０°以下であり、
前記マイクロチャンバーの（内径：深さ）の比が（１：０．３５〜１）であり、
さらに前記マイクロアレイチップが、以下の（ｉ）（ｉｉ）の条件のいずれか一方又は両方を満たす、
検出方法。
（ｉ）前記マイクロアレイチップの最外部に存在するマイクロチャンバーの開口部の中心を直線でつないで囲った領域の面積を１００％とし、その領域におけるマイクロチャンバー開口部以外の部分が占める面積比率を間隙率としたとき、前記マイクロアレイチップの間隙率が０％より大きく４５％以下である。
（ｉｉ）前記マイクロアレイチップの、マイクロチャンバーとマイクロチャンバーとの間隔が、３５μｍ以下である。
項４．
前記マイクロチャンバーが、内径が２０〜５００μｍ、深さが２０μｍ以上である、項３に記載の検出方法。
項５．
前記特定の細胞が動物由来細胞である、項３又は４に記載の検出方法。
項６．
前記複数の細胞を含む試料の細胞濃度が１×１０６〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌである、項３〜５のいずれかに記載の検出方法。The present invention has been completed as a result of further studies based on the above findings, and includes, for example, the inventions described in the following sections.
Item 1.
A plurality of microchambers are provided, a plurality of cells can be stored in a single layer per microchamber, the water contact angle on the surface is 10 ° or less, and (inner diameter: depth) of the microchamber The microarray chip has a ratio of (1: 0.35 to 1) and satisfies one or both of the following conditions (i) and (ii).
(I) When the area of a region surrounded by a straight line connecting the centers of the microchamber openings existing at the outermost portion is 100%, and the area ratio occupied by the portion other than the microchamber openings in the region is the porosity The porosity is greater than 0% and 45% or less.
(Ii) The distance between the microchamber and the microchamber is 35 μm or less.
Item 2.
Item 2. The microarray chip according to Item 1, wherein the microchamber has an inner diameter of 20 to 500 µm and a depth of 20 µm or more.
Item 3.
A detection method for detecting specific cells contained in a sample from a sample containing a plurality of cells,
(1) a step of holding a cell in the sample in a microarray chip having a plurality of microchambers, the microarray chip capable of storing a plurality of cells per one microchamber, and (2) A step of detecting the presence or absence of specific cells in the cells held in the microarray chip,
The water contact angle of the surface of the microarray chip is 10 ° or less,
The ratio of (inner diameter: depth) of the microchamber is (1: 0.35-1),
Furthermore, the microarray chip satisfies one or both of the following conditions (i) and (ii):
Detection method.
(I) The area of a region surrounded by a straight line connecting the centers of the microchamber openings existing on the outermost part of the microarray chip is defined as 100%, and the area ratio occupied by the portion other than the microchamber openings in the region is defined as a gap. The porosity of the microarray chip is greater than 0% and not greater than 45%.
(Ii) The distance between the micro chamber and the micro chamber of the microarray chip is 35 μm or less.
Item 4.
Item 4. The detection method according to Item 3, wherein the microchamber has an inner diameter of 20 to 500 µm and a depth of 20 µm or more.
Item 5.
Item 5. The detection method according to Item 3 or 4, wherein the specific cell is an animal-derived cell.
Item 6.
Item 6. The detection method according to any one of Items 3 to 5, wherein a cell concentration of the sample containing the plurality of cells is 1 × 10 6 to 1 × 10 8 cells / ml.

検出方法
本発明の検出方法によれば、従来の検出方法と比較して、複数の細胞を含む試料から、細胞を無駄に消費することを抑えつつ、該試料に含まれる特定の細胞を迅速、簡便かつ高感度に検出することができる。
検出用キット
本発明の検出用キットによれば、複数の細胞を含む試料から、細胞を無駄に消費することを抑えつつ、標的とする特定の細胞を迅速、高感度かつより簡便に検出することができる。Detection method According to the detection method of the present invention, compared to the conventional detection method, while suppressing wasteful consumption of cells from a sample containing a plurality of cells, specific cells contained in the sample can be rapidly extracted. Simple and highly sensitive detection is possible.
Detection Kit According to the detection kit of the present invention, specific target cells can be detected quickly, highly sensitively and more easily while suppressing wasteful consumption of cells from a sample containing a plurality of cells. Can do.

マイクロアレイチップ
本発明のマイクロアレイチップによれば、複数の細胞を含む試料から、細胞を無駄にすることを抑えつつ、標的とする特定の細胞を迅速、高感度かつより簡便に検出することができる。Microarray Chip According to the microarray chip of the present invention, specific cells targeted can be detected quickly, highly sensitively and more easily from a sample containing a plurality of cells while suppressing waste of cells.

薬剤候補物質のスクリーニング方法
本発明の薬剤候補物質のスクリーニング方法により、種々の薬剤候補物質が細胞に与える影響を簡便かつ迅速に測定し、所望の活性を示す物質を効率よく選択することができる。Method for Screening Drug Candidate Substances According to the method for screening drug candidate substances of the present invention, the influence of various drug candidate substances on cells can be measured easily and rapidly, and substances exhibiting desired activity can be selected efficiently.

マイクロチャンバーの開口部（１０個）の存在位置関係の一例を示す。An example of the positional relationship of the openings (10) of the microchamber is shown. 図１ａに記載の１０個の開口部を、（１）：直線でつながれる中心の数が最小になるように、かつ（２）：直線でつないで囲った領域内に、全ての開口部の中心が含まれるように、開口部の中心を直線でつないだ図である。The 10 openings described in FIG. 1a are (1): the number of centers connected by a straight line is minimized, and (2): all of the openings are within the area connected by a straight line. It is the figure which connected the center of the opening part with the straight line so that the center might be included. 開口部の中心を直線でつないだ図（一例）である。It is the figure which connected the center of the opening part with the straight line (an example). 開口部の中心を直線でつないだ図（一例）である。It is the figure which connected the center of the opening part with the straight line (an example). 開口部が円であって格子状に整列している場合において、（１）：直線でつながれる中心の数が最小になるように、かつ（２）：直線でつないで囲った領域内に、全ての開口部の中心が含まれるように、開口部の中心を直線でつないだ図である。In the case where the openings are circular and aligned in a lattice pattern, (1): the number of centers connected by a straight line is minimized, and (2): in a region surrounded by a straight line, It is the figure which connected the center of the opening part with the straight line so that the center of all the opening parts may be included. 開口部が正六角形であって格子状に整列している場合において、（１）：直線でつながれる中心の数が最小になるように、かつ（２）：直線でつないで囲った領域内に、全ての開口部の中心が含まれるように、開口部の中心を直線でつないだ図である。In the case where the openings are regular hexagons and are arranged in a lattice pattern, (1): the number of centers connected by a straight line is minimized, and (2): within a region surrounded by a straight line. FIG. 5 is a diagram in which the centers of the openings are connected by a straight line so that the centers of all the openings are included. マイクロチャンバー（円筒型）の模式図を示す。The schematic diagram of a microchamber (cylindrical type) is shown. 縦５０個、横２００個になるようにマイクロチャンバーを配置させ、各マイクロチャンバーに１００個ずつ血液細胞を格納させたマイクロアレイチップにおいて、１つのマイクロチャンバーあたり１つの感染した血液細胞が検出されたマイクロアレイチップの例を示す。In a microarray chip in which microchambers are arranged so as to be 50 vertically and 200 horizontally, and 100 blood cells are stored in each microchamber, a microarray in which one infected blood cell is detected per microchamber. An example of a chip is shown. 開口部が正六角形のマイクロアレイチップを示す。A microarray chip whose opening is a regular hexagon is shown. 開口部が正六角形のマイクロアレイチップに細胞（赤血球細胞）が均一に一層（単層）に保持されている図を示す。The figure which the cell (red blood cell) is hold | maintained uniformly in the single layer (single layer) on the microarray chip | tip whose opening part is a regular hexagon is shown. 図７は、水接触角による細胞展開率の差異を示す。左に示すマイクロアレイチップの表面の水接触角は８０度であり、チャンバーに細胞がほとんど入らない（細胞展開率１０％以下）。中央に示すマイクロアレイチップの表面の水接触角は２５度であり、細胞が入らないチャンバーがいくつか存在する（細胞展開率４０％程度）。右に示すマイクロアレイチップの表面の水接触角は１０度であり、ほとんどのチャンバーに一定量の細胞が存在する（細胞展開率９０％以上）。FIG. 7 shows the difference in cell expansion rate depending on the water contact angle. The water contact angle on the surface of the microarray chip shown on the left is 80 degrees, and cells hardly enter the chamber (cell expansion rate is 10% or less). The water contact angle on the surface of the microarray chip shown in the center is 25 degrees, and there are some chambers that do not contain cells (cell expansion rate of about 40%). The water contact angle on the surface of the microarray chip shown on the right is 10 degrees, and a certain amount of cells are present in most chambers (cell expansion rate of 90% or more). 図８は、内径及び深さの異なるマイクロチャンバーを備えた３種のマイクロアレイチップにおいて、マイクロチャンバーに赤血球細胞が格納された様子を示す。FIG. 8 shows a state in which red blood cells are stored in a microchamber in three types of microarray chips having microchambers having different inner diameters and depths. 開口部が正六角形のマイクロアレイチップに細胞（白血球）が均一に一層（単層）に保持されている図を示す。The figure which the cell (white blood cell) is uniformly hold | maintained by the single layer (monolayer) on the microarray chip | tip whose opening part is a regular hexagon is shown. マイクロチャンバー間の間隔が３０μｍのマイクロアレイチップと、当該間隔が４０μｍのマイクロアレイチップとを用い、それぞれのチップを用いて洗浄工程を行うことなく赤血球を検出した場合の検出結果を示す。The detection results when red blood cells are detected using a microarray chip with an interval between microchambers of 30 μm and a microarray chip with an interval of 40 μm without performing a washing step are shown. マイクロチャンバー間の間隔が３０μｍのマイクロアレイチップと、当該間隔が４０μｍのマイクロアレイチップとを用い、それぞれのチップを用いて洗浄工程を行うことなく白血球を検出した場合の検出結果を示す。A detection result when white blood cells are detected using a microarray chip having a space between micro chambers of 30 μm and a microarray chip having a space of 40 μm without performing a washing step is shown.

以下、本発明の検出方法について説明する。   Hereinafter, the detection method of the present invention will be described.

本発明の検出方法では、１つのマイクロアレイチップに、多数の細胞を保持させ、この中から検出標的となる特定の細胞を検出する。例えば１００万個程度という多数の細胞であっても１つのマイクロアレイチップに保持させることができ、そしてこのうち標的とする特定の細胞が一つしか存在しない場合であっても、この特定の細胞を検出することができる。この場合、本発明の検出方法によれば細胞が試料中に０．０００１％しか存在していなくとも、特定の細胞を検出することが可能であるといえる。   In the detection method of the present invention, a large number of cells are held on one microarray chip, and specific cells that are detection targets are detected from these cells. For example, even a large number of cells of about 1 million can be held on one microarray chip, and even if only one specific cell to be targeted exists, Can be detected. In this case, according to the detection method of the present invention, it can be said that a specific cell can be detected even if the cell is present only in 0.0001% in the sample.

本発明の検出方法において、検出標的となる特定の細胞、及びこれを含む多数の細胞（すなわち、細胞群）は、本発明の効果が奏されるものであれば特に限定されない。   In the detection method of the present invention, specific cells to be detected and a large number of cells (that is, a cell group) including the target cells are not particularly limited as long as the effects of the present invention are exhibited.

例えば、特定の遺伝子を発現している細胞や、核酸、タンパク質、脂質、糖等の生体物質が通常より過剰である、又は不足している細胞を、特定の細胞として種々の細胞群から検出することができる。このような特定の細胞は自然界に存在する細胞であってもよいし、人為的処理が施された細胞であってもよい。当該自然界に存在する細胞としては、特に限定されないが、例えば病原細胞、病変細胞、病原菌又は病原生物に感染された細胞、突然変異した細胞、特定の性質を有する未知の細胞等が挙げられる。また、当該人為的処理は特に限定されないが、例えば物理的処理（例：電磁波照射）、化学的処理（例：薬剤処理）、遺伝子工学的処理（例：遺伝子組み換え処理）等を挙げることができる。   For example, a cell expressing a specific gene or a cell in which biological substances such as nucleic acids, proteins, lipids, and sugars are excessive or deficient than usual is detected as a specific cell from various cell groups. be able to. Such specific cells may be cells that exist in nature or may be cells that have been subjected to artificial treatment. The cells existing in the natural world are not particularly limited, and examples thereof include pathogenic cells, diseased cells, cells infected with pathogenic bacteria or pathogenic organisms, mutated cells, unknown cells having specific properties, and the like. The artificial treatment is not particularly limited, and examples thereof include physical treatment (eg, electromagnetic wave irradiation), chemical treatment (eg: drug treatment), genetic engineering treatment (eg: gene recombination treatment), and the like. .

また、このような人為的処理のうち、細胞に与える影響が既知である処理を細胞群に施し、当該影響が表れない細胞又は当該影響がより強く表れる細胞を特定の細胞として検出することもできる。例えば、薬剤処理へ耐性又は高感受性を示す細胞を特定の細胞として検出することができる。   Further, among such artificial treatments, a treatment that has a known effect on cells can be applied to the cell group, and a cell that does not show the effect or a cell that shows the effect more strongly can be detected as a specific cell. . For example, cells exhibiting resistance or high sensitivity to drug treatment can be detected as specific cells.

また、当該細胞群も本発明の効果が奏される限り特に限定はされない。単細胞生物の群はもちろん、多細胞生物由来の細胞の群であってもよい。多細胞生物由来の細胞としては、例えば生物の正常組織又は病態組織から得られた細胞、及びこれらの細胞に由来する培養細胞等が挙げられる。また、これらの細胞を得る生物も本発明の効果が奏される限り特に限定されない。例えば動物由来細胞又は植物由来細胞であってよく、より具体的には例えば脊椎動物（特に哺乳類及び鳥類）由来細胞、昆虫由来細胞、植物培養細胞等を挙げることができるが、これらに限定されない。また、同一の細胞の群であっても、複数種の細胞が混在する群であってもよい。   The cell group is not particularly limited as long as the effect of the present invention is exhibited. It may be a group of cells derived from a multicellular organism as well as a group of unicellular organisms. Examples of cells derived from multicellular organisms include cells obtained from normal tissues or pathological tissues of organisms, and cultured cells derived from these cells. In addition, the organism from which these cells are obtained is not particularly limited as long as the effects of the present invention are exhibited. For example, it may be an animal-derived cell or a plant-derived cell, and more specific examples include, but are not limited to, vertebrate (particularly mammals and birds) -derived cells, insect-derived cells, plant cultured cells, and the like. Moreover, even if it is the group of the same cell, the group in which multiple types of cells are mixed may be sufficient.

本発明の検出方法を用いて特定の細胞を検出する、より具体的な例としては、例えば、マラリア原虫感染症患者の血液細胞中から、マラリア原虫感染赤血球を検出する例が挙げられる。マラリア原虫感染症であれば、１００万個程度という多数の血液細胞中感染した血液細胞が一つしか存在しない場合であっても、この感染した血液細胞を検出することができる。   More specific examples of detecting specific cells using the detection method of the present invention include, for example, detecting malaria parasite-infected erythrocytes from blood cells of a Plasmodium infection patient. In the case of a Plasmodium infection, even if there is only one infected blood cell in a large number of blood cells of about 1 million, this infected blood cell can be detected.

また、例えば、血中に存在する癌細胞を探索、検出するにあたっても好ましく用いることができる。特に、癌が転移する際に、癌細胞が血液やリンパ液の流れに乗って循環し、離れた臓器にまで転移することが知られている。このように血液中に循環している癌細胞は血中循環腫瘍細胞（Circulating Tumor Cell：CTC）と呼ばれ、転移性の癌症例において治療効果の判定や予後予測因子として有用性が認められており、ＣＴＣを検出できることは極めて有用である。   For example, it can be preferably used for searching and detecting cancer cells present in blood. In particular, when cancer metastasizes, it is known that cancer cells circulate in the flow of blood or lymph and metastasize to distant organs. Cancer cells circulating in the blood in this way are called circulating tumor cells (Circulating Tumor Cells: CTCs), and their usefulness has been recognized as therapeutic factors and predictors of prognosis in metastatic cancer cases. Therefore, it is extremely useful to be able to detect CTC.

また、例えば、妊娠女性の血中に存在する胎児由来の有核赤血球の検出に好ましく用いることができる。胎児由来の有核赤血球は、出生前診断に有用であり、特に母体にほとんど負担をかけることなく出生前診断を可能とする点で有用である。
あるいはまた、例えば、癌細胞群中に存在する癌幹細胞を探索するにあたっても、好ましく用いることができる。例えば、体液（血液やリンパ液等が例示される）中に存在する癌細胞中に存在する癌幹細胞や、腫瘍を各細胞へと解離させた後にそれらの細胞中に存在する癌幹細胞を探索するために用いることができる。For example, it can be preferably used for detection of fetal nucleated red blood cells present in the blood of pregnant women. Fetal nucleated red blood cells are useful for prenatal diagnosis, and are particularly useful in that prenatal diagnosis is possible with little burden on the mother.
Alternatively, for example, it can be preferably used in searching for cancer stem cells present in a cancer cell group. For example, to search for cancer stem cells present in cancer cells present in body fluids (such as blood and lymph), and cancer stem cells present in those cells after dissociating the tumor into cells. Can be used.

さらに、例えば、人為的処理された細胞の群のなかから、当該処理により特定の性質を有するようになった細胞を選択することができる。   Furthermore, for example, from the group of artificially treated cells, cells that have a specific property by the treatment can be selected.

また、特に強く当該特定の性質を有する細胞を選択することもできる。より具体的には、例えば、遺伝子組み換え処理により特定の物質を生産するよう形質転換させた複数の細胞の中から、特に効率よく当該物質を生産する細胞を検出することもできる。あるいは、例えば、電磁波照射処理若しくは薬剤処理により特定の機能を失った細胞を検出することができる。また、これらの処理に対し耐性又は高感受性を有する細胞を検出することができる。   It is also possible to select cells that are particularly strong and have the specific properties. More specifically, for example, cells that produce the substance can be detected particularly efficiently from a plurality of cells transformed to produce a particular substance by genetic recombination treatment. Alternatively, for example, cells that have lost a specific function due to electromagnetic wave irradiation treatment or drug treatment can be detected. In addition, cells having resistance or high sensitivity to these treatments can be detected.

また、本発明の検出方法は、研究室のみならず、例えば臨床現場等においても好適に用いることができる。   Moreover, the detection method of the present invention can be suitably used not only in a laboratory but also in a clinical site, for example.

また、本発明の検出方法では、複数の細胞（細胞群）をマイクロアレイチップが備える各マイクロチャンバーに格納（保持）させた後、この格納された細胞中、検出標的である特定の細胞を特異的に検出し得る標識を施すことができる。また、複数の細胞（細胞群）を含む試料において、検出標的とする特定の細胞をあらかじめ標識しておくことも可能である。特定の細胞を予め標識しておく方が、標識効率が均一になりやすいため、好ましい。このような標識の方法としては特に限定されず、検出標的である特定の細胞の性質に応じて適宜選択することができる。検出の簡便性及び毒性等を考慮すると、特に蛍光標識が好適である。そして、該標識の有無（例えば蛍光標識の有無）に基づき当該特定の細胞を検出することができ、さらに、検出される標識の数（例えば蛍光標識の数）に基づけば、試料中の細胞のうち特定の細胞がどの程度存在しているのかについて定量的な分析を行うこともできる。またさらに、該標識の強度（例えば蛍光標識の蛍光強度）に基づき、検出した特定の細胞が有する性質の強度を分析することもできる。具体的には例えば、標的とする特定の細胞が感染症病原体に感染された血液細胞である場合は、当該定量的データや個々の細胞の標識の強さ（例えば蛍光標識の場合は蛍光強度）に着目することにより、感染症の重傷度やステージを分析することもできる。   In the detection method of the present invention, after storing (holding) a plurality of cells (cell groups) in each microchamber provided in the microarray chip, specific cells that are detection targets are specifically selected from the stored cells. A detectable label can be applied. Further, in a sample containing a plurality of cells (cell group), it is possible to label specific cells as detection targets in advance. It is preferable to label specific cells in advance because the labeling efficiency tends to be uniform. The labeling method is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the properties of the specific cell that is the detection target. Considering simplicity of detection and toxicity, a fluorescent label is particularly suitable. The specific cells can be detected based on the presence or absence of the label (for example, the presence or absence of a fluorescent label). Further, based on the number of labels to be detected (for example, the number of fluorescent labels), the cells in the sample can be detected. It is also possible to perform a quantitative analysis as to how many specific cells are present. Furthermore, based on the intensity of the label (for example, the fluorescence intensity of the fluorescent label), the intensity of the property of the detected specific cell can be analyzed. Specifically, for example, when the target specific cell is a blood cell infected with an infectious disease pathogen, the quantitative data and the intensity of labeling of each cell (for example, fluorescence intensity in the case of a fluorescent label) By paying attention to, it is possible to analyze the severity and stage of infection.

また、本発明の検出方法によれば、マイクロアレイチップに備えられたマイクロチャンバー内に細胞が格納される。このため、本願の検出方法においては、検出時、標的とする特定の細胞がマイクロアレイチップのどの部分に存在しているのかが分かり易い。このことから、検出後、当該特定の細胞の回収やＰＣＲ法による更なる分析等を容易に行うことができる。   Further, according to the detection method of the present invention, cells are stored in the microchamber provided in the microarray chip. For this reason, in the detection method of the present application, at the time of detection, it is easy to know in which part of the microarray chip the target specific cell exists. From this, after the detection, the specific cells can be easily collected and further analyzed by the PCR method.

また、本発明の検出方法においては、マイクロアレイチップに備えられた各マイクロチャンバー内に細胞を均一かつ効率よく格納させることが可能である。すなわち、本願の検出方法においては、マイクロアレイチップに備えられた各マイクロチャンバーが同じ形状である場合には、ほぼ同数の細胞を格納させることができる。   In the detection method of the present invention, cells can be stored uniformly and efficiently in each microchamber provided in the microarray chip. That is, in the detection method of the present application, when each microchamber provided in the microarray chip has the same shape, approximately the same number of cells can be stored.

本発明の検出方法を適用できる、複数の細胞を含む試料は、本発明の効果を奏することができるものであれば特に限定されず、検出標的となる特定の細胞が存在する細胞群を含む可能性のある試料であればよい。このような細胞群及び検出標的となる特定の細胞としては、例えば以下に挙げるものが好ましい。   The sample containing a plurality of cells to which the detection method of the present invention can be applied is not particularly limited as long as the effect of the present invention can be achieved, and may include a cell group in which specific cells serving as detection targets are present. Any suitable sample may be used. As such a cell group and a specific cell as a detection target, for example, those listed below are preferable.

本発明の検出方法により、特に感染症における感染血液細胞を好ましく検出することができる。感染症としては、マラリア原虫類に代表される原虫感染症、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に代表されるウイルス感染症、結核菌に代表される細菌感染症等が例示される。   By the detection method of the present invention, it is possible to preferably detect infected blood cells particularly in infectious diseases. Examples of infectious diseases include protozoan infections represented by malaria parasites, viral infections represented by human immunodeficiency virus (HIV), bacterial infections represented by Mycobacterium tuberculosis, and the like.

これらの感染症のうち、例えばマラリア原虫類による感染症では、マラリア原虫類が赤血球に感染する。この場合、本発明の検出方法における検出対象である特定の細胞はマラリア原虫類に感染した血液細胞、すなわちマラリア原虫類に感染した赤血球である。マラリア原虫類は、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫及び卵形マラリア原虫の４種類が例示される。   Among these infectious diseases, for example, in infections caused by malaria parasites, malaria parasites infect red blood cells. In this case, the specific cells to be detected in the detection method of the present invention are blood cells infected with malaria parasites, that is, erythrocytes infected with malaria parasites. The malaria parasites are exemplified by four types of Plasmodium falciparum, Plasmodium falciparum, Plasmodium falciparum and oval malaria parasites.

また、例えばＨＩＶ感染症では、ＨＩＶがある種のリンパ球（Ｔ細胞）に感染する。この場合、本発明の検出方法における検出対象である特定の細胞は、ＨＩＶに感染した血液細胞、すなわちＨＩＶに感染したある種のリンパ球（Ｔ細胞）である。ＨＩＶには、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２の2種類が例示される。   For example, in HIV infection, HIV infects certain lymphocytes (T cells). In this case, the specific cells to be detected in the detection method of the present invention are blood cells infected with HIV, that is, certain lymphocytes (T cells) infected with HIV. Examples of HIV include two types, HIV-1 and HIV-2.

また、例えば結核では、結核菌がある種の白血球細胞（単球）に感染する。この場合、本発明の検出方法における検出対象である特定の細胞は、結核菌に感染した血液細胞、すなわち結核菌に感染したある種の白血球細胞（単球）である。   For example, in tuberculosis, certain types of white blood cells (monocytes) are infected with M. tuberculosis. In this case, the specific cells to be detected in the detection method of the present invention are blood cells infected with M. tuberculosis, that is, certain white blood cells (monocytes) infected with M. tuberculosis.

本発明の検出方法は、このほかの感染症における感染血液細胞も検出の対象とすることができる。   The detection method of the present invention can also detect infected blood cells in other infectious diseases.

また、血液細胞としては血液に含まれる細胞であれば限定されない。血液細胞として赤血球、血小板、白血球（リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球）が例示される。例えば、これら血液細胞を複数含む試料を、本発明の検出方法へ供する、複数の細胞を含む試料として用いることができる。例えば、複数の血液細胞を含む血液や体液を当該試料として用いることができる。   The blood cells are not limited as long as they are cells contained in blood. Examples of blood cells include red blood cells, platelets, and white blood cells (lymphocytes, monocytes, neutrophils, eosinophils, basophils). For example, a sample containing a plurality of these blood cells can be used as a sample containing a plurality of cells for use in the detection method of the present invention. For example, blood or body fluid containing a plurality of blood cells can be used as the sample.

本発明の検出方法により、培養細胞中の特定の細胞を検出することもできる。培養細胞は本発明の効果が奏される限り特に限定されないが、哺乳類又は昆虫由来の細胞株（例えばＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｓｆ９細胞等）や酵母が好ましく例示できる。   Specific cells in cultured cells can also be detected by the detection method of the present invention. The cultured cells are not particularly limited as long as the effects of the present invention are exhibited, but cell lines derived from mammals or insects (for example, HEK293 cells, Hela cells, 3T3 cells, COS-7 cells, CHO cells, Jurkat cells, Sf9 cells, etc.) Preferred examples include yeast and yeast.

本発明の検出方法は標的とする特定の細胞が試料中に極微量しか存在していなくとも（例えば試料の細胞中の存在割合が０．００１〜０．００００１％であっても）、該特定の細胞を十分に検出することが可能であるため、検出標的となる特定の細胞の存在割合が非常に小さい試料を用いるときに特に有利である。このような例としては、例えば、血液中に循環している癌細胞は血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を挙げることができる。また例えば、妊娠女性の血中に存在する胎児由来の有核赤血球を挙げることができる。また例えば癌細胞群中に存在する癌幹細胞を挙げることができる。癌幹細胞は、自己複製能と増殖能を有し、悪性腫瘍（癌）にごくわずか存在しており、幹細胞と同様のマーカー（例えばCD34、CD133、CD117、Sca-1等）を発現していると言われており、本発明の検出方法によれば、好ましく検出することができると考えられる。   The detection method of the present invention allows the specific cells to be targeted even if only a very small amount is present in the sample (for example, even if the presence ratio of the sample in the cells is 0.001 to 0.00001%). It is particularly advantageous when using a sample with a very small proportion of specific cells serving as detection targets. As such an example, for example, cancer cells circulating in the blood include circulating tumor cells (CTC). Moreover, for example, fetal nucleated red blood cells present in the blood of pregnant women can be mentioned. Moreover, for example, cancer stem cells present in a cancer cell group can be mentioned. Cancer stem cells are self-replicating and proliferating, are present in very few malignant tumors (cancer), and express the same markers as stem cells (eg CD34, CD133, CD117, Sca-1 etc.) According to the detection method of the present invention, it can be preferably detected.

またあるいは、特定の遺伝子やタンパク質を発現している細胞も、本発明の検出方法の検出対象になりえる。   Alternatively, a cell expressing a specific gene or protein can also be a detection target of the detection method of the present invention.

本発明の検出方法においては、特定のマイクロアレイチップが用いられる。本発明は、当該特定のマイクロアレイチップも包含する。   In the detection method of the present invention, a specific microarray chip is used. The present invention also includes the specific microarray chip.

当該チップは、複数のマイクロチャンバーを備えており、該マイクロチャンバー１つあたりに複数の細胞を単層に格納可能であり、表面の水接触角が１０°以下であり、該マイクロチャンバーの（内径：深さ）の比が（１：０．３５〜１）であり、以下の（ｉ）（ｉｉ）の条件のいずれか一方又は両方を満たす、マイクロアレイチップである。
（ｉ）最外部に存在するマイクロチャンバーの開口部の中心を直線でつないで囲った領域の面積を１００％とし、その領域におけるマイクロチャンバー開口部以外の部分が占める面積比率を間隙率としたとき、間隙率が０％より大きく４５％以下である。
（ｉｉ）マイクロチャンバーとマイクロチャンバーとの間隔が、３５μｍ以下である。
以下、さらに詳細に説明する。The chip includes a plurality of microchambers, and a plurality of cells can be stored in a single layer per microchamber, and the water contact angle on the surface is 10 ° or less. : Depth) is a microarray chip having a ratio of (1: 0.35 to 1) and satisfying one or both of the following conditions (i) and (ii).
(I) When the area of a region surrounded by a straight line connecting the centers of the microchamber openings existing at the outermost portion is 100%, and the area ratio occupied by the portion other than the microchamber openings in the region is the porosity The porosity is greater than 0% and 45% or less.
(Ii) The distance between the microchamber and the microchamber is 35 μm or less.
This will be described in more detail below.

マイクロアレイチップの基板は限定されず、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）等のポリマー、シリコン等の金属、ガラス、石英ガラス、またポリマーとガラスや金属等を張り合わせたような複数の素材を組み合わせたもの（例えばＰＤＭＳとガラス）等が例示される。好ましくは、ポリスチレン、ＰＭＭＡ、ガラス、シリコン等である。   The substrate of the microarray chip is not limited, and polymers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyamide, polycarbonate, polydimethylsiloxane (PDMS), polymethyl methacrylate (PMMA), and cyclic olefin copolymer (COC), metals such as silicon, glass, Examples thereof include quartz glass, and a combination of a plurality of materials such as a polymer and glass or metal laminated together (for example, PDMS and glass). Preferred are polystyrene, PMMA, glass, silicon and the like.

マイクロアレイチップの大きさは限定されず、検出標的である特定の細胞を検出・測定する装置に応じて適宜選択される。   The size of the microarray chip is not limited, and is appropriately selected according to an apparatus for detecting and measuring a specific cell as a detection target.

該マイクロアレイチップにはマイクロチャンバーが形成されている。マイクロチャンバーは基板に直接加工を施すことにより作製してもよく、マイクロ貫通孔もしくはマイクロチャンバーが形成されたフィルムをこれらの基板に貼り付けることにより作製してもよい。好ましくは、マイクロチャンバーはこれらの基板に直接加工を施すことにより作製される。この場合、マイクロチャンバーは半導体研究分野における微細加工技術であるリソグラフィー法（光リソグラフィー、電子線リソグラフィー等）によって作製することはもちろんのこと、マイクロドリル等を用いて穴をあける掘削加工技術、レーザー加工等あらゆる微***をあける技術によって作製することができる。例えば、ＬＩＧＡ（Lithographie Galvanoformung Abformung）プロセス等が例示される。   A microchamber is formed in the microarray chip. The microchamber may be produced by directly processing the substrate, or may be produced by attaching a film in which microthrough holes or microchambers are formed to these substrates. Preferably, the microchamber is produced by directly processing these substrates. In this case, the microchamber is not only manufactured by a lithography method (optical lithography, electron beam lithography, etc.), which is a microfabrication technology in the field of semiconductor research, but also excavation processing technology for drilling holes using a microdrill, laser processing It can be produced by a technique for making any minute hole. For example, a LIGA (Lithographie Galvanoformung Abformung) process is exemplified.

該マイクロアレイチップの表面は親水性であり、具体的には表面の水接触角が１０°以下である。当該親水性を達成するため、必要に応じて表面処理を施すことができる。表面処理方法は限定されず、プラズマ処理、コロナ放電処理等が例示される。好ましくは、プラズマ処理であり、酸素プラズマ処理等が例示される。例えば、マイクロアレイチップの基板が疎水性の材料（ポリスチレン、ＰＭＭＡ等のポリマー）である場合には、酸素プラズマ処理等の親水化処理を行うことが好ましい。また、マイクロアレイチップの基板が親水性の材料（シリコンやガラス等）であって水接触各が１０°以下である場合には、このような処理をしなくともよい。   The surface of the microarray chip is hydrophilic. Specifically, the water contact angle of the surface is 10 ° or less. In order to achieve the said hydrophilicity, it can surface-treat as needed. The surface treatment method is not limited, and examples thereof include plasma treatment and corona discharge treatment. Preferable is plasma treatment, and oxygen plasma treatment is exemplified. For example, when the substrate of the microarray chip is a hydrophobic material (polymer such as polystyrene or PMMA), it is preferable to perform a hydrophilic treatment such as an oxygen plasma treatment. In addition, when the substrate of the microarray chip is a hydrophilic material (silicon, glass, etc.) and each water contact is 10 ° or less, such a treatment is not necessary.

マイクロアレイチップの表面の水接触角は、より好ましくは８°以下、さらに好ましくは５°以下である。なお、“マイクロアレイチップの表面”とはマイクロチャンバーの内部の表面も含む意味である。   The water contact angle on the surface of the microarray chip is more preferably 8 ° or less, and further preferably 5 ° or less. The “surface of the microarray chip” is meant to include the surface inside the microchamber.

このため、前述のマイクロアレイチップの基板表面の水接触角が前述する範囲にあるものであれば更に処理を施さなくてもよく、前述する好適な範囲にないものは、当該好適な範囲になるよう、その表面が処理されればよい。当業者であれば、細胞の接着の程度等を検討しつつ、最適な水接触角となるようマイクロアレイチップに表面処理を施すことができる。例えばマイクロアレイチップの基板としてポリマー素材のものを使用する場合には、その表面に酸素プラズマ処理等を行うことにより水接触角を調整すればよい。   For this reason, as long as the water contact angle on the substrate surface of the microarray chip is in the above-described range, no further treatment is required, and those not in the above-mentioned preferable range are in the preferable range. The surface may be treated. A person skilled in the art can perform a surface treatment on the microarray chip so as to obtain an optimum water contact angle while examining the degree of cell adhesion and the like. For example, when a polymer material is used as the substrate of the microarray chip, the water contact angle may be adjusted by performing oxygen plasma treatment or the like on the surface.

なお、水接触角は次のように測定される。水接触角は公知の方法であるθ/２法を用いて測定される。θ/２法とは液滴の左右端点と頂点を結ぶ直線の、固体表面に対する角度から接触角を求める方法である。例えば、マイクロアレイチップの表面において水接触角を求める場合、蒸留水を該表面の異なる複数の場所に滴下し、それぞれ滴下した液滴の接触角を求める。これにより得られる値を水接触角ということができる。例えば、上記方法に従い、接触角計（協和界面科学株式会社製）を用いて、蒸留水１〜２μlをマイクロアレイチップ基板の異なる複数の地点（５点以上）に滴下して水接触角を測定することができる。   The water contact angle is measured as follows. The water contact angle is measured using a known method θ / 2. The θ / 2 method is a method for obtaining the contact angle from the angle of the straight line connecting the left and right end points and the apex of the droplet to the solid surface. For example, when determining the water contact angle on the surface of the microarray chip, distilled water is dropped at a plurality of different locations on the surface, and the contact angle of each dropped liquid droplet is determined. The value obtained by this can be called a water contact angle. For example, according to the above method, using a contact angle meter (manufactured by Kyowa Interface Science Co., Ltd.), 1 to 2 μl of distilled water is dropped at a plurality of different points (more than 5 points) on the microarray chip substrate to measure the water contact angle. be able to.

マイクロチャンバーの形状は特に限定されない。マイクロチャンバーの形状としては円筒形、逆半球形、逆円錐形、逆角錐形（逆三角錐形、逆四角錐形、逆五角錐形、逆六角錐形、七角以上の逆多角錐形）、直方体等、さらにこれらの形状の二つ以上を組み合わせた形状が例示される。前記円筒形や直方体の場合はマイクロチャンバーの底部は通常平坦であるが、曲面、凸面、凹面とすることもできる。また、前記逆円錐形や逆角錐形の場合は底面がマイクロチャンバーの開口となるが、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状（マイクロチャンバーの底部は平坦な形状）も例示できる。さらに、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状の場合は、前述と同様に、マイクロチャンバーの底部を曲面等とすることもできる。マイクロチャンバーの形状は好ましくは円筒形、逆半球形、逆円錐形、逆角錐形であり、より好ましくは円筒形、逆半球形であり、最も好ましくは円筒形である。また、マイクロチャンバーは、一枚のマイクロアレイチップにおいて、好ましくは一種類の形状からなる。   The shape of the microchamber is not particularly limited. The shape of the microchamber is cylindrical, inverted hemispherical, inverted conical, inverted pyramid (inverted triangular pyramid, inverted quadrangular pyramid, inverted pentagonal pyramid, inverted hexagonal pyramid, inverted polygonal pyramid with a heptagon or more) A shape such as a rectangular parallelepiped or a combination of two or more of these shapes is exemplified. In the case of the cylindrical shape or the rectangular parallelepiped, the bottom of the microchamber is usually flat, but may be curved, convex, or concave. In the case of the inverted cone or inverted pyramid, the bottom surface is the opening of the microchamber, but the shape of the inverted cone or inverted pyramid cut out from the top (the bottom of the microchamber is flat) is also available. It can be illustrated. Furthermore, in the case of a shape obtained by cutting a part from the top of an inverted cone or inverted pyramid, the bottom of the microchamber can be a curved surface or the like as described above. The shape of the microchamber is preferably cylindrical, inverted hemispherical, inverted conical, or inverted pyramid, more preferably cylindrical, inverted hemispherical, and most preferably cylindrical. Further, the microchamber preferably has one type of shape in one microarray chip.

本発明のチップの一形態においては、マイクロチャンバーの開口部の面積と開口部以外の面積の比率が重要となる。具体的には、マイクロアレイチップの最外部に存在するマイクロチャンバーの開口部の中心を直線でつないで囲った領域の面積を１００％とし、その領域におけるマイクロチャンバー開口部以外の部分が占める面積比率を間隙率としたとき、前記マイクロアレイチップの間隙率は０％より大きく４５％以下である。   In one embodiment of the chip of the present invention, the ratio between the area of the opening of the microchamber and the area other than the opening is important. Specifically, the area of a region that is surrounded by connecting the centers of the microchamber openings existing on the outermost part of the microarray chip with a straight line is defined as 100%, and the area ratio occupied by the portion other than the microchamber openings in the region is defined as the area ratio. When the porosity is defined, the porosity of the microarray chip is greater than 0% and 45% or less.

開口部の中心とは、本発明では開口部の図形の重心である。例えば、開口部が円や正多角形である場合には、重心は中心と重なる。開口部は、円又は正多角形（正三角形、正四角形、正六角形など）が好ましく、特に正六角形が好ましい。   The center of the opening is the center of gravity of the figure of the opening in the present invention. For example, when the opening is a circle or a regular polygon, the center of gravity overlaps the center. The opening is preferably a circle or a regular polygon (regular triangle, regular square, regular hexagon, etc.), and is preferably a regular hexagon.

マイクロアレイチップの最外部に存在するマイクロチャンバーの開口部の中心を直線でつなぐ、とは、次の条件（１）（２）を満たすように多数の開口部の中心を直線でつなぐことをいう。
（１）：直線でつながれる中心の数が最小になるようにする。
（２）：直線でつないで囲った領域内に、全ての開口部の中心が含まれるようにする。
例えば、図１ａに記載の１０個の開口部があった場合には、図１ｂのように各開口部を直線でつなぐ。図１ｃのようにつないだ場合には、全ての中心が囲まれた領域に存在するものの、条件（１）を満たしておらず、また、図１ｄのようにつないだ場合には、条件（１）も（２）も満たしていない。“Connecting the centers of the openings of the microchambers existing on the outermost part of the microarray chip with a straight line” means connecting the centers of many openings with a straight line so as to satisfy the following conditions (1) and (2).
(1): Minimize the number of centers connected by a straight line.
(2): The center of all the openings is included in an area surrounded by a straight line.
For example, when there are ten openings shown in FIG. 1a, the openings are connected by straight lines as shown in FIG. 1b. When connected as shown in FIG. 1c, all the centers exist in the enclosed region, but the condition (1) is not satisfied, and when connected as shown in FIG. 1d, the condition (1 ) And (2) are not satisfied.

また例えば、開口部が格子状に整列している場合には、囲まれた領域は長方形になる場合がある。例えば、図２ａに、開口部が円であって格子状に整列している場合の例を示す。また、図２ｂに、開口部が正六角形であって格子状に整列している場合の例を示す。これらの例においては、いずれも、赤枠（長方形）で囲まれた部分の面積を１００％とした場合の、塗りつぶされた部分の面積比率（％）が間隙率である。なお、制限されるわけではないが、開口部は、格子状に整列していることが好ましい。   For example, when the openings are aligned in a lattice pattern, the enclosed region may be a rectangle. For example, FIG. 2a shows an example in which the openings are circular and are arranged in a lattice pattern. FIG. 2b shows an example in which the openings are regular hexagons and are arranged in a lattice pattern. In any of these examples, the area ratio (%) of the filled portion is 100% when the area of the portion surrounded by the red frame (rectangle) is 100%. Although not limited, it is preferable that the openings are aligned in a lattice pattern.

本発明のマイクロアレイチップにおいて、間隙率は、前述の通り０％より大きく４５％以下であり、約１〜４２．５％が好ましく、約２〜４０％がより好ましく、約３〜３５％がさらに好ましく、約５〜３０％がよりさらに好ましい。なお、下限については、チップ製造の簡便さの観点から考えれば、約１０％以上が好ましく、約１５％以上がより好ましく、約２０％以上がさらに好ましい。   In the microarray chip of the present invention, the porosity is greater than 0% and 45% or less as described above, preferably about 1 to 42.5%, more preferably about 2 to 40%, and further about 3 to 35%. Preferably, about 5-30% is even more preferred. The lower limit is preferably about 10% or more, more preferably about 15% or more, and further preferably about 20% or more from the viewpoint of simplicity of chip manufacturing.

一枚のマイクロアレイチップにできるだけ多数の細胞を保持できることが好ましい。マイクロアレイチップに細胞が保持されるとは、マイクロアレイチップに備えられたマイクロチャンバーに細胞が格納されることであり、従ってマイクロチャンバーの数が多いほど、マイクロアレイチップは多くの細胞を保持できる。   It is preferable that as many cells as possible can be held in one microarray chip. The phrase “cells are held in the microarray chip” means that the cells are stored in the microchambers provided in the microarray chip. Therefore, as the number of microchambers increases, the microarray chip can hold more cells.

特に限定されるわけではないが、一枚のマイクロアレイチップに１万個以上の細胞を保持できるようにすることが好ましい。また、１０万個以上がより好ましく、１００万個以上がさらに好ましく、１０００万個以上がよりさらに好ましい。   Although not particularly limited, it is preferable that one microarray chip can hold 10,000 or more cells. Moreover, 100,000 or more are more preferable, 1 million or more are further more preferable, and 10 million or more are more preferable.

例えば、１００万個に１個の割合で存在し得る標的細胞を検出する場合、一枚のマイクロアレイチップに１００万個以上の細胞を保持できるようにすることが好ましい。より好ましくは２００万〜１０００万個、さらに好ましくは３００万〜１０００万個の細胞を担持できるようにする。この場合、一枚のマイクロアレイチップに１万個以上のマイクロチャンバーを設けることが特に好ましい。   For example, when detecting target cells that may be present at a ratio of 1 to 1 million, it is preferable that one microarray chip can hold 1 million or more cells. More preferably, it can carry 2 million to 10 million cells, more preferably 3 million to 10 million cells. In this case, it is particularly preferable to provide 10,000 or more microchambers on one microarray chip.

また、各マイクロチャンバーに１０個以上の細胞を格納できるようにすることが好ましく、より好ましくは５０〜５００個、さらに好ましくは５０〜３００個の細胞を格納できるようにする。   Further, it is preferable that 10 or more cells can be stored in each microchamber, more preferably 50 to 500 cells, still more preferably 50 to 300 cells can be stored.

例えば、一枚のマイクロアレイチップに１０万個のマイクロチャンバーを設け、各マイクロチャンバーに約１０個ずつ細胞を格納させた場合には、マイクロアレイチップ一枚あたり約１００万個の細胞が保持されていることとなる。   For example, when 100,000 microchambers are provided in one microarray chip, and about 10 cells are stored in each microchamber, about 1 million cells are held per microarray chip. It will be.

マイクロチャンバーの寸法は、各マイクロチャンバーに同数程度の細胞を格納されるように決定される。各マイクロチャンバーの寸法は同一であることがさらに好ましい。なお、マイクロチャンバーの開口部が円形である場合には、「内径」とはマイクロアレイチップ表面におけるマイクロチャンバーの開口部の直径を意味する。マイクロチャンバーの開口部が正多角形である場合には、「内径」とは当該正多角形の一つの角と中心とを通る当該正多角形内の線分の長さを意味する。マイクロチャンバーの開口部がこれら以外である場合には、「内径」とはマイクロチャンバーの開口部の内部において設置できる最長の線分の長さを意味する。また、「深さ」とは、マイクロチャンバーの開口部と、マイクロチャンバーの最も深い場所の距離を意味する（図３）。   The size of the microchamber is determined so that the same number of cells can be stored in each microchamber. More preferably, the dimensions of each microchamber are the same. When the opening of the microchamber is circular, the “inner diameter” means the diameter of the opening of the microchamber on the surface of the microarray chip. When the opening of the microchamber is a regular polygon, the “inner diameter” means the length of a line segment in the regular polygon passing through one corner and the center of the regular polygon. When the opening of the microchamber is other than these, the “inner diameter” means the length of the longest line segment that can be installed inside the opening of the microchamber. “Depth” means the distance between the opening of the microchamber and the deepest location of the microchamber (FIG. 3).

本発明のマイクロアレイチップが備えるマイクロチャンバーの（内径：深さ）の比は（１：０．３５〜１）である。特に、（内径：深さ）の比が（１：０．３５〜１）であることが好ましく、（１：０．３５〜０．８５）であることがより好ましく、（１：０．４〜０．８５）であることがさらに好ましく、（１：０．４５〜０．８）であることがよりさらに好ましい。   The ratio of (inner diameter: depth) of the microchamber provided in the microarray chip of the present invention is (1: 0.35 to 1). In particular, the ratio of (inner diameter: depth) is preferably (1: 0.35-1), more preferably (1: 0.35-0.85), (1: 0.4 ~ 0.85) is more preferable, and (1: 0.45-0.8) is still more preferable.

また、マイクロチャンバーの内径は好ましくは２０〜５００μｍ、より好ましくは２０〜４００μｍ、さらに好ましくは２０〜３００μｍ、よりさらに好ましくは３０〜２５０μｍ、特に好ましくは３０〜２００μｍである。また、その深さは、内径の値にもよるが、好ましくは２０〜２００μｍ、より好ましくは２０〜１００μｍ、さらに好ましくは２０〜８０μｍ、よりさらに好ましくは２０〜７０μｍ、特に好ましくは３０〜７０μｍである。   The inner diameter of the microchamber is preferably 20 to 500 μm, more preferably 20 to 400 μm, still more preferably 20 to 300 μm, still more preferably 30 to 250 μm, and particularly preferably 30 to 200 μm. Moreover, although the depth is based also on the value of an internal diameter, Preferably it is 20-200 micrometers, More preferably, it is 20-100 micrometers, More preferably, it is 20-80 micrometers, More preferably, it is 20-70 micrometers, Especially preferably, it is 30-70 micrometers. is there.

なお、上述の（内径：深さ）の比により、内径の値が決まれば、マイクロチャンバーの深さの好ましい値を決めることができる。ただし、マイクロチャンバーは細胞を格納するため、２０μｍ以上の深さを有することが好ましい。すなわち、マイクロチャンバーは、内径及び深さが上述の比の関係を有し、内径が上述の値を有し、かつ深さが２０μｍ以上であるものが特に好ましい。   Note that if the value of the inner diameter is determined by the ratio of (inner diameter: depth) described above, a preferable value of the depth of the microchamber can be determined. However, the microchamber preferably has a depth of 20 μm or more in order to store cells. That is, it is particularly preferable that the microchamber has an inner diameter and a depth having the above-described ratio, the inner diameter has the above-described value, and the depth is 20 μm or more.

上記の水接触角及びマイクロチャンバーの（内径：深さ）の比を具備することにより、本発明のマイクロアレイチップは、そのマイクロチャンバーの底に細胞を均一に一層（単層）として保持させることができる。すなわち、各マイクロチャンバーの底辺に、ほとんど重複することなく細胞を保持することができる。このため、マイクロチャンバー内で細胞が重なり、検出標的である特定の細胞が他の細胞の下に位置することになって、検出が困難になるなどの問題が起きにくい。また、単層であることにより、顕微鏡で観察する際に焦点を容易に合わせることができる。共焦点レーザー顕微鏡による観察においても、バックグラウンドを抑制でき、高感度での観察が可能となる。   By providing the ratio of the water contact angle and the (inner diameter: depth) of the microchamber, the microarray chip of the present invention can hold cells uniformly as a single layer (single layer) at the bottom of the microchamber. it can. That is, the cells can be held at the bottom of each microchamber with little overlap. For this reason, cells overlap in the microchamber, and specific cells that are detection targets are located under other cells, so that problems such as difficulty in detection hardly occur. In addition, the single layer enables easy focusing when observing with a microscope. Even in the observation with a confocal laser microscope, the background can be suppressed and observation with high sensitivity becomes possible.

このようなマイクロチャンバーであれば、細胞をより均一かつ効率よく、単層として、マイクロチャンバー内に格納させることができる。   With such a microchamber, cells can be stored in the microchamber as a single layer more uniformly and efficiently.

マイクロチャンバーの数も特に限定されない。前述のように、マイクロアレイチップに保持される細胞数が多ければ多いほど、感染した血液細胞を高感度に検出することができる。特に制限されないが、マイクロチャンバーの数は、一枚のマイクロアレイチップあたり１０００個以上、より好ましくは２，０００〜５０，０００個、さらに好ましくは２，０００〜２０，０００個である。上述のように、例えば１０万個設けることもできる。さらには、〜１００万個、〜１０００万個、あるいは〜１億個程度設けてもよい。   The number of micro chambers is not particularly limited. As described above, as the number of cells held in the microarray chip increases, infected blood cells can be detected with high sensitivity. Although not particularly limited, the number of microchambers is 1000 or more per microarray chip, more preferably 2,000 to 50,000, still more preferably 2,000 to 20,000. As described above, for example, 100,000 can be provided. Furthermore, about 1 million, ˜10 million, or ˜100 million may be provided.

マイクロアレイチップは、当該分野で従来公知の方法により適宜作製される。例えば、マイクロアレイチップの作製は、リソグラフィーとエッチングという手法を用いてチップの鋳型を作製し、その鋳型からチップを成型する方法が例示される。本発明においては、当該方法により前述のマイクロアレイチップを作製した。具体的には、マイクロアレイチップの基板としてポリマー（プラスチック）素材のチップを使用し、電子線リソグラフィー法の中でも、Ｘ線リソグラフィーと、電鋳（メッキ）、形成の技術を用いて作製するＬＩＧＡプロセスに従い、前述のマイクロアレイチップを作製することができる。   The microarray chip is appropriately produced by a conventionally known method in this field. For example, the fabrication of a microarray chip is exemplified by a method of fabricating a chip mold using lithography and etching, and molding the chip from the mold. In the present invention, the above-described microarray chip was produced by this method. Specifically, a polymer (plastic) material chip is used as the substrate of the microarray chip, and in accordance with the LIGA process, which is produced using X-ray lithography, electroforming (plating), and forming techniques, among electron beam lithography methods. The above-described microarray chip can be manufactured.

本発明の検出方法は、複数の細胞を含む試料から、該試料に含まれる特定の細胞を検出するための検出方法であって、前記マイクロアレイチップに、試料中の細胞を保持させる工程、及び、該マイクロアレイチップに保持された細胞において特定の細胞の有無を検出する工程、を少なくとも含有する。   The detection method of the present invention is a detection method for detecting specific cells contained in a sample from a sample containing a plurality of cells, wherein the microarray chip holds cells in the sample, and A step of detecting the presence or absence of specific cells in the cells held on the microarray chip.

マイクロアレイチップへの細胞の保持は、細胞をマイクロアレイチップに接触させ、細胞をマイクロアレイチップ上に展開し、細胞を各マイクロチャンバーに格納したのち、必要に応じて過剰な細胞をマイクロアレイチップから除去（洗浄）する手順を経ることにより可能となる。   The cells are retained on the microarray chip by contacting the cells with the microarray chip, spreading the cells on the microarray chip, storing the cells in each microchamber, and then removing (washing) the excess cells from the microarray chip as necessary. ) Is possible through a procedure.

ここで、細胞のマイクロアレイチップへの接触は、細胞をマイクロアレイチップに接触させられる限り、その方法は限定されない。例えば、培養細胞や生体から採取した細胞そのものをマイクロアレイチップに接触させることにより行ってもよく、これらを緩衝液や培養液等の溶液と混合させ、得られた混合液をマイクロアレイチップに接触させることによりおこなってもよい。   Here, the method of contacting the cells with the microarray chip is not limited as long as the cells can be brought into contact with the microarray chip. For example, it may be performed by bringing cultured cells or cells themselves collected from a living body into contact with a microarray chip, mixing these with a solution such as a buffer solution or a culture solution, and bringing the obtained mixed solution into contact with the microarray chip. May be performed.

例えば、血液細胞のマイクロアレイチップへの接触は、採取した血液そのものをマイクロアレイチップに接触（添加、滴下等）させることにより行ってもよく、採取した血液を緩衝液や培養液等の溶液と混合させ、得られた混合液をマイクロアレイチップに接触させることにより行ってもよい。また、血液細胞のマイクロアレイチップへの接触は、採取した血液から血液細胞を分取し、これを緩衝液や培養液等の溶液と混合させた後に、該混合液をマイクロアレイチップに接触させることにより行ってもよい。   For example, the contact of blood cells with the microarray chip may be performed by bringing the collected blood itself into contact with the microarray chip (addition, dropping, etc.), and the collected blood is mixed with a solution such as a buffer solution or a culture solution. Alternatively, the obtained mixed solution may be brought into contact with a microarray chip. The contact of blood cells with the microarray chip is performed by separating the blood cells from the collected blood, mixing it with a solution such as a buffer solution or a culture solution, and then bringing the mixture into contact with the microarray chip. You may go.

また、培養細胞（例えば哺乳類細胞）のマイクロアレイチップへの接触は、培養した細胞を培地ごとマイクロアレイチップに接触（添加、滴下等）させることにより行ってもよく、培養細胞をふくむ培地を緩衝液や培養液等の溶液と混合させ、得られた混合液をマイクロアレイチップに接触させることにより行ってもよい。また、培養細胞を培地から回収し、これを緩衝液や培養液等の溶液と混合させた後に、該混合液をマイクロアレイチップに接触させることにより行ってもよい。   In addition, the cultured cells (for example, mammalian cells) may be contacted with the microarray chip by bringing the cultured cells into contact with the microarray chip together with the medium (addition, dropping, etc.). You may perform by making it mix with solutions, such as a culture solution, and making the obtained liquid mixture contact a microarray chip | tip. Alternatively, the cultured cells may be collected from the medium, mixed with a solution such as a buffer solution or a culture solution, and then contacted with the mixed solution to the microarray chip.

また、細胞のマイクロアレイチップ上への展開も、細胞をマイクロアレイチップ上に展開できる限り、その方法は限定されない。複数の細胞（細胞群）そのものをマイクロアレイチップに接触させることにより細胞をマイクロアレイチップ上に展開させてもよく、接触させた後さらに展開液を用いて展開させてもよい。展開液としては、緩衝液、培養液、界面活性剤等が例示される。   In addition, the method for expanding the cells on the microarray chip is not limited as long as the cells can be expanded on the microarray chip. The cells may be developed on the microarray chip by bringing a plurality of cells (cell group) into contact with the microarray chip, or may be further developed using a developing solution after contacting. Examples of the developing solution include a buffer solution, a culture solution, and a surfactant.

例えば、マイクロアレイチップ上への展開させる細胞が血液細胞の場合、前述のように血液細胞をマイクロアレイチップに接触させることにより血液細胞をマイクロアレイチップ上に展開させてもよく、また接触させた血液細胞を、さらに展開液を用いて展開させてもよい。また例えば、展開させる細胞が培養細胞の場合であっても、血液細胞と同様にしてマイクロアレイチップ上に展開させることができる。少なくともこのような手順を経ることにより、細胞（例えば血液細胞や培養細胞）を各マイクロチャンバーに格納することができる。   For example, when the cells to be spread on the microarray chip are blood cells, the blood cells may be spread on the microarray chip by bringing the blood cells into contact with the microarray chip as described above. Further, it may be developed using a developing solution. For example, even if the cells to be developed are cultured cells, they can be developed on the microarray chip in the same manner as the blood cells. At least through such a procedure, cells (for example, blood cells and cultured cells) can be stored in each microchamber.

マイクロアレイチップ上に細胞を展開する際の細胞の濃度は、細胞種にもよるが、例えば１×１０１０〜１×１０４（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）が例示できる。下述するように、細胞を展開後、過剰な細胞の除去を行うことで、各マイクロチャンバー内にほぼ均一に単層として細胞を格納することができる。また、用いる細胞種やマイクロアレイチップに応じて適宜展開させる細胞濃度を調整してもよい。The concentration of the cells when the cells are spread on the microarray chip can be exemplified by, for example, 1 × 10 10 to 1 × 10 4 (cells / ml) depending on the cell type. As described below, by removing excess cells after expanding the cells, it is possible to store the cells as a single layer almost uniformly in each microchamber. Further, the cell concentration to be appropriately developed may be adjusted according to the cell type and microarray chip to be used.

過剰な細胞のマイクロアレイチップからの除去（洗浄）も、マイクロアレイチップから（すなわちマイクロチャンバー内及びマイクロチャンバー外から）過剰な細胞を除去できる限り、その方法は限定されない。   The method of removing (washing) excess cells from the microarray chip is not limited as long as excess cells can be removed from the microarray chip (that is, from inside and outside the microchamber).

例えば、ピペットマン等を用いて、マイクロアレイチップを軽く傾けて緩衝液、培養液、界面活性剤、酵素等の洗浄液を流すことにより過剰な細胞を除去してよい。また、マイクロチャンバー以外の部分に吸着した余分な細胞を除去、洗浄する際には、セルスクレイパー等の器具を使用しても良い。   For example, excess cells may be removed by gently tilting the microarray chip using a pipetman or the like and flowing a washing solution such as a buffer solution, a culture solution, a surfactant, or an enzyme. In addition, when removing and washing excess cells adsorbed on portions other than the microchamber, a device such as a cell scraper may be used.

ただし、洗浄を行うことにより余分な細胞が除去されるということは、サンプル中の細胞が無駄になっているということである。従って、細胞を無駄にしないという観点からは、洗浄はできる限り行わないようにすることが好ましい。洗浄回数を減らす又は行わないようにするためには、サンプル中の細胞濃度を調整することが好ましい。例えば、１×１０６〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ程度が好ましく、１×１０７〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ程度がより好ましい。細胞が赤血球や培養細胞（例えば哺乳類由来細胞）である場合、特に好ましく当該細胞濃度を適用することができる。However, the fact that extra cells are removed by washing means that the cells in the sample are wasted. Therefore, from the viewpoint of not wasting cells, it is preferable not to perform washing as much as possible. In order to reduce or not perform washing, it is preferable to adjust the cell concentration in the sample. For example, about 1 × 10 6 to 1 × 10 8 cells / ml is preferable, and about 1 × 10 7 to 1 × 10 8 cells / ml is more preferable. When the cells are erythrocytes or cultured cells (for example, mammalian cells), the cell concentration can be particularly preferably applied.

またさらに、本発明のチップのさらに好ましい一形態においては、マイクロチャンバーとマイクロチャンバーとの間隔が、次のような条件であることが好ましい。
すなわち、マイクロチャンバーとマイクロチャンバーとの間隔は、出来るだけ等間隔であることが好ましい。また、用いる細胞種や、マイクロチャンバーの内径及び深さ等にもよるが、当該間隔は３５μｍ以下であることが好ましく、３０μｍ以下であることがより好ましい。Furthermore, in a further preferred embodiment of the chip of the present invention, it is preferable that the distance between the microchamber and the microchamber is under the following conditions.
That is, the distance between the microchamber and the microchamber is preferably as equal as possible. The interval is preferably 35 μm or less, and more preferably 30 μm or less, depending on the cell type used, the inner diameter and depth of the microchamber, and the like.

なお、マイクロチャンバーとマイクロチャンバーとの間隔とは、各マイクロチャンバーの開口部の中心と中心を結ぶ直線の長さ（中心間距離）から、当該直線とマイクロチャンバーの開口部とが重複する部分を除いた長さをいう。例えば、チャンバー開口部が正六角形であり、内径が１００μｍ、中心間距離が２００μｍであると、そのマイクロチャンバー間の間隔は、２００−（５０／２×３１／２）≒１５６．７μｍ程度になる。また例えば、チャンバー開口部が円形であり、内径が１００μｍ、中心間距離が２００μｍであると、そのマイクロチャンバー間の間隔は、２００−（５０＋５０）＝１００μｍになる。Note that the interval between the microchambers is the length of the straight line connecting the centers of the openings of each microchamber (distance between the centers), and the portion where the straight line and the opening of the microchamber overlap. It means the length excluding it. For example, if the chamber opening is a regular hexagon, the inner diameter is 100 μm, and the center-to-center distance is 200 μm, the interval between the microchambers is about 200− (50/2 × 3 1/2 ) ≈156.7 μm. Become. For example, if the chamber opening is circular, the inner diameter is 100 μm, and the center-to-center distance is 200 μm, the interval between the microchambers is 200− (50 + 50) = 100 μm.

上述した、マイクロアレイチップの表面の水接触角条件（１０°以下）、及びマイクロチャンバーの（内径：深さ）の比の条件（１：０．３５〜１）、と当該マイクロチャンバーとマイクロチャンバーとの間隔の条件を組み合わせることにより、洗浄を行う必要性をより小さくすることができる。   The above-mentioned water contact angle condition (less than 10 °) on the surface of the microarray chip, and the condition (1: 0.35-1) of the (inner diameter: depth) ratio of the microchamber, the microchamber and the microchamber The need for cleaning can be further reduced by combining the interval conditions.

すなわち、本発明は、複数のマイクロチャンバーを備えており、該マイクロチャンバー１つあたりに複数の細胞を単層に格納可能であり、表面の水接触角が１０°以下であり、該マイクロチャンバーの（内径：深さ）の比が（１：０．３５〜１）であり、マイクロチャンバーとマイクロチャンバーとの間隔が等間隔（好ましくは３５μｍ以下、より好ましくは３０μｍ以下）である、マイクロアレイチップをも包含する。   That is, the present invention comprises a plurality of microchambers, a plurality of cells can be stored in a single layer per microchamber, the water contact angle on the surface is 10 ° or less, A microarray chip in which the ratio of (inner diameter: depth) is (1: 0.35-1), and the distance between the microchamber and the microchamber is equal (preferably 35 μm or less, more preferably 30 μm or less). Is also included.

より好ましくは、さらに上記特定の間隙率及び／又は好適なサンプル中の細胞濃度をも組み合わせることにより、洗浄を行う必要性がより小さくなり、特に好ましくは洗浄を行わなくともよくなる（すなわち、各マイクロチャンバー内にほぼ均一に単層として細胞を格納することができる）ため、細胞を効率よく利用することができる。また、その他上述したマイクロアレイチップの条件をさらに組み合わせて好ましいマイクロアレイチップとすることもできる。   More preferably, the combination of the specific porosity and / or the appropriate cell concentration in the sample further reduces the need for washing, and particularly preferably eliminates the need for washing (ie, each microscopic The cells can be stored almost uniformly in the chamber as a single layer), so that the cells can be used efficiently. In addition, a preferable microarray chip can be obtained by further combining the above-mentioned conditions of the microarray chip.

なお、マイクロチャンバーの形状にもよるが、通常、マイクロチャンバーとマイクロチャンバーとの間隔が等間隔であって３５μｍ以下である場合には、上記特定の間隙率も満たすと考えられる。   Although depending on the shape of the microchamber, it is considered that the specific porosity is usually satisfied when the distance between the microchamber and the microchamber is equal and 35 μm or less.

検出標的である特定の細胞の有無を検出するにあたっては、当該特定の細胞を検出できる限り、その方法は限定されない。   In detecting the presence or absence of a specific cell as a detection target, the method is not limited as long as the specific cell can be detected.

例えば、検出標的である特定の細胞が形態変化を起こす細胞である場合は、顕微鏡観察により細胞の形態を観察することにより、検出することができる。また、当該特定の細胞に特異的に結合する物質が存在する場合、当該物質を用いて結合の有無を検出することで検出することができる。このような物質としては、例えば抗体やアプタマー等を挙げることができるが、これらに限定されない。またあるいは、当該特定の細胞に特異的に反応する物質が存在する場合、当該物質を用いて反応の有無を検出することで検出することもできる。   For example, when a specific cell that is a detection target is a cell that undergoes a morphological change, it can be detected by observing the morphology of the cell by microscopic observation. Moreover, when the substance which couple | bonds specifically with the said specific cell exists, it can detect by detecting the presence or absence of a coupling | bonding using the said substance. Examples of such substances include, but are not limited to, antibodies and aptamers. Alternatively, when there is a substance that specifically reacts with the specific cells, the substance can be used to detect the presence or absence of the reaction.

このような結合や反応の有無を検出する方法も特に限定されないが、蛍光を用いるのが好適である。例えば、特定の細胞に特異的に結合する物質に蛍光標識を施してから用いれば、試料中の特定の細胞のみを標識することができる。よって、蛍光の有無により該特定の細胞の有無を容易に検出できる。   A method for detecting the presence or absence of such binding or reaction is not particularly limited, but it is preferable to use fluorescence. For example, if a substance that specifically binds to specific cells is used after being fluorescently labeled, only specific cells in the sample can be labeled. Therefore, the presence or absence of the specific cell can be easily detected based on the presence or absence of fluorescence.

特に、マイクロアレイチップに試料を接触させる前に、該試料中の特定の細胞のみが標識されるよう蛍光標識を施し、細胞がマイクロチャンバー内に保持された後に当該蛍光標識を検出して特定の細胞の有無を検出することができる。また、細胞がマイクロチャンバー内に保持された後、特定の細胞のみを蛍光標識してもよい。   In particular, before contacting the sample with the microarray chip, a fluorescent label is applied so that only specific cells in the sample are labeled, and after the cells are held in the microchamber, the fluorescent label is detected to detect the specific cells. The presence or absence of can be detected. Alternatively, only specific cells may be fluorescently labeled after the cells are retained in the microchamber.

例えば、血液細胞中から病原性微生物が感染した血液細胞を検出する場合、マイクロアレイチップに血液細胞を接触させる前に、感染した血液細胞中の病原性微生物の核を蛍光染色し、蛍光顕微鏡やアレイスキャナー等の装置を用いて、該蛍光に基づき感染した血液細胞を検出できる。あるいは、マイクロアレイチップに形成されたマイクロチャンバーに血液細胞を格納した後に、血液細胞中の病原性微生物の核を蛍光染色し、同様に感染した血液細胞を検出してもよい。例えばベッドサイド等において感染した血液細胞を検出しようとする場合には、マイクロアレイチップに血液細胞を接触、展開させる前に感染した血液細胞中の病原性微生物の核等を蛍光染色させたほうが、接触、展開後の処理が簡便になるため、一層簡単に感染した血液細胞を検出することができる。また、例えば、血液細胞中の病原性微生物の核に限定されず、例えば蛍光標識された抗体を用いることによって特定タンパク質（特定アミノ酸配列）を標的としたり、蛍光標識されたプローブを用いることによって特定の遺伝子配列を標的としてもよい。   For example, when blood cells infected with pathogenic microorganisms are detected from blood cells, the nuclei of pathogenic microorganisms in the infected blood cells are fluorescently stained before contacting the blood cells with the microarray chip. Infected blood cells can be detected based on the fluorescence using an apparatus such as a scanner. Alternatively, after storing blood cells in a microchamber formed on the microarray chip, the nuclei of pathogenic microorganisms in the blood cells may be fluorescently stained to similarly detect the infected blood cells. For example, when trying to detect infected blood cells on the bedside etc., it is better to fluorescently stain the nuclei of pathogenic microorganisms in the infected blood cells before contacting and deploying the blood cells to the microarray chip. Since the processing after the deployment becomes simple, infected blood cells can be detected more easily. For example, it is not limited to the nuclei of pathogenic microorganisms in blood cells. For example, a specific protein (specific amino acid sequence) is targeted by using a fluorescently labeled antibody, or specified by using a fluorescently labeled probe. These gene sequences may be targeted.

また、例えば、培養細胞中特定のマーカーを発現した細胞を検出したい場合は、当該マーカーに特異的であって蛍光標識された抗体を予め培養細胞に作用させておき、マイクロチャンバー内に保持された後、蛍光顕微鏡やアレイスキャナー等の装置を用いて該蛍光に基づき当該特定の細胞を検出できる。あるいは、マイクロアレイチップに形成されたマイクロチャンバーに培養細胞を格納した後に、培養細胞中の特定のマーカーを発現した細胞を蛍光標識された抗体を用いて標識し、該蛍光に基づき当該細胞を検出してもよい。   In addition, for example, when it is desired to detect a cell expressing a specific marker in cultured cells, an antibody specific for the marker and fluorescently labeled is allowed to act on the cultured cells in advance and held in the microchamber. Thereafter, the specific cells can be detected based on the fluorescence using an apparatus such as a fluorescence microscope or an array scanner. Alternatively, after storing cultured cells in a microchamber formed on the microarray chip, cells expressing a specific marker in the cultured cells are labeled with a fluorescently labeled antibody, and the cells are detected based on the fluorescence. May be.

具体的に一例を説明すると、まず、感染赤血球細胞を含む赤血球細胞懸濁液において、原虫等の感染微生物の核が染まるように蛍光染色して感染赤血球細胞を標識し、場合によっては赤血球細胞も蛍光物質等で標識を行う。この標識された感染赤血球細胞を含む赤血球細胞懸濁液をマイクロアレイチップ上に展開し、必要に応じて過剰な血液細胞を除去・洗浄した後、蛍光顕微鏡やマイクロアレイスキャナー等によって、蛍光検出を行う。これにより、蛍光強度や標識された細胞の数等を調べることによって、感染症の有無はもちろん、程度及び種類等についても解析することができる。   A specific example will be described. First, in an erythrocyte cell suspension containing infected erythrocytes, the infected erythrocytes are labeled by fluorescent staining so that the nuclei of infectious microorganisms such as protozoa are stained. Label with a fluorescent substance. The erythrocyte cell suspension containing the labeled infected erythrocytes is spread on a microarray chip, and excess blood cells are removed and washed as necessary, followed by fluorescence detection with a fluorescence microscope, a microarray scanner, or the like. Thus, by examining the fluorescence intensity, the number of labeled cells, etc., it is possible to analyze not only the presence or absence of infectious disease but also the degree and type.

このような本発明の検出方法では、例えば図３のように、マイクロアレイチップ上に縦５０個、横２００個になるようにマイクロチャンバーを配置させ、各マイクロチャンバーに１００個ずつ血液細胞を格納させることもできる。そして、１つのマイクロチャンバーあたり１つの感染した血液細胞が検出された場合には、その感染率は１％と判断することができる。   In such a detection method of the present invention, for example, as shown in FIG. 3, microchambers are arranged on the microarray chip so as to be 50 vertically and 200 horizontally, and 100 blood cells are stored in each microchamber. You can also. When one infected blood cell is detected per one microchamber, the infection rate can be determined to be 1%.

また、本発明の検出方法では、例えばマイクロアレイチップに合計１００万個の血液細胞を保持させ、そのうち１つの血液細胞が感染した場合であっても、この感染した血液細胞を検出することができる。この場合、本発明の検出方法によれば感染した血液細胞が試料中に０．０００１％しか存在していなくとも、検出することが可能であるといえる。   Further, in the detection method of the present invention, for example, even if a microarray chip holds a total of 1 million blood cells and one of the blood cells is infected, the infected blood cell can be detected. In this case, according to the detection method of the present invention, it can be said that detection is possible even when only 0.0001% of infected blood cells are present in the sample.

本発明の検出用キットは、複数の細胞を含む試料から特定の細胞を検出するためのキットであって、上記のマイクロアレイチップを含有することを特徴とする。
本発明の検出用キットに含有されるマイクロアレイチップ以外のものとしては限定されないが、以下のものが例示される。The detection kit of the present invention is a kit for detecting specific cells from a sample containing a plurality of cells, and contains the above-mentioned microarray chip.
Although it does not limit as things other than the microarray chip | tip contained in the kit for a detection of this invention, the following are illustrated.

本発明の検出用キットにはさらに、マイクロアレイチップに細胞を接触させる際に使用され得る緩衝液、培養液等が含有されていてもよい。   The detection kit of the present invention may further contain a buffer solution, a culture solution, and the like that can be used when cells are brought into contact with the microarray chip.

本発明の検出用キットにはさらに、マイクロアレイチップに細胞を展開させる際に使用され得る緩衝液、培養液、界面活性剤等が含有されていてもよい。   The detection kit of the present invention may further contain a buffer solution, a culture solution, a surfactant, and the like that can be used when cells are developed on the microarray chip.

本発明の検出用キットにはさらに、マイクロアレイチップから過剰な細胞を除去（洗浄）する際に使用され得る緩衝液、培養液、界面活性剤、酵素等の洗浄液等が含有されていてもよい。   The detection kit of the present invention may further contain a buffer solution, a culture solution, a surfactant, a washing solution such as an enzyme, etc. that can be used when excess cells are removed (washed) from the microarray chip.

本発明の検出用キットにはさらに、マイクロアレイチップに細胞を接触、展開、さらにマイクロアレイチップから細胞を除去等させる際に使用され得るピペットマン等が含有されていてもよい。   The detection kit of the present invention may further contain a pipetteman or the like that can be used when cells are brought into contact with a microarray chip, developed, and cells are removed from the microarray chip.

本発明の検出用キットにはさらに、マイクロチャンバー以外の部分に吸着した余分な細胞を除去、洗浄する際に使用され得るセルスクレイパー等の器具が含有されていてもよい。   The detection kit of the present invention may further contain a device such as a cell scraper that can be used for removing and washing excess cells adsorbed to portions other than the microchamber.

本発明の検出用キットにはさらに、検出標的である特定の細胞を検出するための装置が含有されていてもよい。装置としては、蛍光顕微鏡、マイクロアレイスキャナー等が例示される。   The detection kit of the present invention may further contain a device for detecting specific cells that are detection targets. Examples of the apparatus include a fluorescence microscope and a microarray scanner.

また、例えば検出標的である特定の細胞が最終的に蛍光染色されることにより検出される場合、本発明の検出用キットには、該特定の細胞を染色するための蛍光染色剤（例えば蛍光色素、蛍光標識済み抗体等）が含有されていてもよい。   Further, for example, when a specific cell as a detection target is finally detected by fluorescent staining, the detection kit of the present invention includes a fluorescent staining agent (for example, a fluorescent dye) for staining the specific cell. , Fluorescently labeled antibodies, etc.) may be contained.

本発明の検出用キットにはさらに、該検出用キットの使用マニュアルが含有されていてもよい。   The detection kit of the present invention may further contain a manual for using the detection kit.

このような本発明の検出用キットを使用することにより、検出標的である特定の細胞が試料中に存在する割合が低くても（例えば０．０００１％しか存在していなくとも）、迅速かつ簡便に当該特定の細胞を検出することが可能である。   By using such a detection kit of the present invention, even if the ratio of specific cells that are detection targets to be present in the sample is low (for example, only 0.0001% is present), it is quick and simple. It is possible to detect the specific cells.

また、本発明のマイクロアレイチップは、下述するように薬剤候補物質のスクリーニングにも好ましく用いることができる。各マイクロチャンバーにほぼ同数の細胞が格納されるため各マイクロチャンバー内の細胞の状態が均一となり、異なる薬剤候補物質を各マイクロチャンバーへと添加した際、それぞれの薬剤候補物質がどのような影響を細胞へ与えるのかを比較評価しやすいからである。   In addition, the microarray chip of the present invention can be preferably used for screening drug candidate substances as described below. Since almost the same number of cells are stored in each microchamber, the state of the cells in each microchamber is uniform, and when different drug candidate substances are added to each microchamber, what effect each drug candidate substance has This is because it is easy to compare and evaluate whether to give to cells.

本発明の薬剤候補物質のスクリーニング方法により、種々の薬剤候補物質が細胞に与える影響を簡便かつ迅速に測定し、所望の活性を示す物質を効率よく選択することができる。   According to the screening method for drug candidate substances of the present invention, the influence of various drug candidate substances on cells can be measured simply and rapidly, and substances exhibiting desired activity can be selected efficiently.

本発明の薬剤候補物質のスクリーニング方法には、複数のマイクロチャンバーを備え、該マイクロチャンバー内には細胞が保持されているマイクロアレイチップを用いる。   In the drug candidate substance screening method of the present invention, a microarray chip having a plurality of microchambers and holding cells in the microchambers is used.

本発明の薬剤候補物質のスクリーニング方法では、まず、前記細胞が保持されたマイクロチャンバーに薬剤候補物質を添加する。マイクロアレイチップが備える全てのマイクロチャンバーに同一の薬剤候補物質を添加してもよいし、マイクロチャンバーによって添加する薬剤候補物質を変えてもよい。また、いくらかのマイクロチャンバーには薬剤候補物質を加えず、これらのマイクロチャンバーに保持された細胞をコントロールとして用いるのが好ましい。   In the drug candidate substance screening method of the present invention, first, a drug candidate substance is added to the microchamber holding the cells. The same drug candidate substance may be added to all the microchambers provided in the microarray chip, or the drug candidate substance to be added may be changed depending on the microchamber. In addition, it is preferable not to add drug candidate substances to some microchambers, and to use the cells retained in these microchambers as controls.

薬剤候補物質を添加した後、該薬剤候補物質がマイクロチャンバー内に保持される細胞に与える影響を測定する。当該影響の測定の方法は、用いる薬剤候補物質、用いる細胞、及び所望の活性に応じて適宜設定すればよい。   After adding the drug candidate substance, the influence of the drug candidate substance on the cells held in the microchamber is measured. The method for measuring the influence may be appropriately set according to the drug candidate substance to be used, the cell to be used, and the desired activity.

例えば、抗ガン剤として作用する物質をスクリーニングしたい場合は、マイクロチャンバー内に癌細胞を保持し、薬剤候補物質を添加して、当該癌細胞がどの程度の割合及び時間で死滅するかを測定すればよい。   For example, if you want to screen for a substance that acts as an anticancer agent, keep cancer cells in the microchamber and add a drug candidate substance to measure the rate and time of death of the cancer cells. That's fine.

そして、当該測定結果に基づいて、実験に供した薬剤候補物質の中から所望の活性を示す物質を選択すればよい。例えば、上記の抗ガン剤として作用する物質をスクリーニングする例であれば、癌細胞が高効率で死滅する作用を示した物質を選択すればよい。   Based on the measurement result, a substance exhibiting a desired activity may be selected from drug candidate substances used in the experiment. For example, in the example of screening a substance that acts as the above-described anticancer agent, a substance that has an effect of killing cancer cells with high efficiency may be selected.

このようにすることで、多数の薬剤候補物質を簡便かつ迅速にスクリーニングすることができる。   By doing in this way, many drug candidate substances can be screened easily and rapidly.

また、本発明の薬剤候補物質のスクリーニング方法に用いられるマイクロアレイチップは、上述の本発明のマイクロアレイチップであることが好ましい。本発明のマイクロアレイチップであれば、細胞をより均一かつ効率よく、単層として、マイクロチャンバーに格納させることができる。   Moreover, it is preferable that the microarray chip used in the method for screening a drug candidate substance of the present invention is the above-described microarray chip of the present invention. With the microarray chip of the present invention, cells can be stored in a microchamber as a single layer more uniformly and efficiently.

また、本発明のマイクロアレイチップによれば、細胞をマイクロチャンバー内で少なくとも数日以上培養することができる。このため、本発明のマイクロアレイチップを用いて本発明の薬剤候補物質のスクリーニング方法を実施すれば、薬剤候補物質を添加した後細胞を数日以上培養して維持した後、当該物質が細胞に与える影響を測定することができる。   Moreover, according to the microarray chip of the present invention, cells can be cultured in a microchamber for at least several days. For this reason, if the drug candidate substance screening method of the present invention is carried out using the microarray chip of the present invention, after adding the drug candidate substance, the cells are cultured and maintained for several days or more, and then the substance gives the cells The impact can be measured.

またさらに、本発明のマイクロアレイチップでは、各マイクロチャンバーにほぼ同数の細胞が保持されるため、各マイクロチャンバー内の細胞の状態を均一とすることができる。よって、本発明のマイクロアレイチップを用いて本発明の薬剤候補物質のスクリーニング方法を実施すれば、異なる薬剤候補物質を各マイクロチャンバーへと添加した際、それぞれの薬剤候補物質がどのような影響を細胞へ与えるのかを比較評価しやすい。   Furthermore, in the microarray chip of the present invention, since almost the same number of cells are held in each microchamber, the state of the cells in each microchamber can be made uniform. Therefore, if the drug candidate substance screening method of the present invention is carried out using the microarray chip of the present invention, when different drug candidate substances are added to each microchamber, what effect each drug candidate substance has on the cell It is easy to compare and evaluate what to give.

以下、実施例を挙げて本発明について説明するが、本発明は該実施例に限定されない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated, this invention is not limited to this Example.

実施例１
＜マイクロアレイチップ＞
次のマイクロアレイチップを使用した。
マイクロアレイチップの基板：ポリスチレン
マイクロアレイチップの表面処理：酸素プラズマ処理
マイクロチャンバーの形成：ＬＩＧＡプロセス
マイクロチャンバーの形状：正六角柱形
マイクロチャンバーの寸法：内径１００μｍ、深さ５０μｍ
マイクロチャンバー同士の距離：チャンバーの開口部（正六角形）の中心間距離２００μｍ（等間隔で配置されている）
マイクロアレイチップの表面の水接触角：１０°
該マイクロアレイチップを図５に示す。 Example 1
<Microarray chip>
The following microarray chip was used.
Microarray chip substrate: Polystyrene microarray chip surface treatment: Oxygen plasma treatment Microchamber formation: LIGA process Microchamber shape: Regular hexagonal column Microchamber dimensions: Inner diameter 100 μm, Depth 50 μm
Distance between microchambers: 200 μm distance between centers of chamber openings (regular hexagons) (disposed at equal intervals)
Water contact angle on the surface of the microarray chip: 10 °
The microarray chip is shown in FIG.

当該マイクロアレイチップは次のようにして製造した。
ＬＩＧＡプロセスによって作製されたスターライト工業株式会社製のマイクロアレイチップを使用した。具体的には、該マイクロアレイチップは、Ｘ線リソグラフィー法によって、ＰＭＭＡ基板にパターニングし、エッチングによってＰＭＭＡの鋳型を作り、そこで電鋳（メッキ）を行い、作製されたニッケルの金型にポリスチレンを流し込んで成型されたものである。The microarray chip was manufactured as follows.
A microarray chip manufactured by Starlight Industry Co., Ltd. produced by the LIGA process was used. Specifically, the microarray chip is patterned on a PMMA substrate by an X-ray lithography method, a PMMA mold is formed by etching, and electroforming (plating) is performed therein, and polystyrene is poured into the produced nickel mold. It was molded with

該マイクロアレイチップの表面を、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ：Reactive Ion Etching）装置（サムコ株式会社製）によって２００Ｗの出力、２０秒程度の処理時間で酸素プラズマ処理を行うことにより、チップ基板表面を親水化した。   The surface of the microarray chip is subjected to oxygen plasma treatment with a reactive ion etching (RIE) apparatus (manufactured by Samco Co., Ltd.) with an output of 200 W and a treatment time of about 20 seconds. Turned into.

このように親水化したマイクロアレイチップ表面の水接触角は次のようにθ/２法により測定した。具体的には、得られたマイクロアレイチップの表面の異なる複数の地点（５点以上）に蒸留水１〜２μlを滴下して、接触角計（協和界面科学株式会社製）を用いて、室温にて水接触角を測定した。得られた値の平均値を求めることにより、水接触角を決定した。   The water contact angle on the surface of the microarray chip thus made hydrophilic was measured by the θ / 2 method as follows. Specifically, 1 to 2 μl of distilled water is dropped onto a plurality of different points (more than 5 points) on the surface of the obtained microarray chip, and a contact angle meter (manufactured by Kyowa Interface Science Co., Ltd.) is used. The water contact angle was measured. The water contact angle was determined by determining the average of the obtained values.

また、マイクロアレイチップ上に細胞懸濁液が展開しやすいように、マイクロチャンバー内に空気が入らないようにするため、親水化したマイクロアレイチップに対して事前に超音波処理を行った。超音波処理は、一般的に用いられる超音波洗浄装置を用いて、培地（ＲＰＭＩ１６４０）を入れたビーカーに表面処理を行ったマイクロアレイチップを浸して、約５分間処理を行った。   In order to prevent the cell suspension from spreading on the microarray chip, ultrasonic treatment was performed in advance on the hydrophilic microarray chip in order to prevent air from entering the microchamber. The ultrasonic treatment was performed for about 5 minutes by immersing the surface-treated microarray chip in a beaker containing a medium (RPMI1640) using a commonly used ultrasonic cleaning apparatus.

＜赤血球の検出手順＞
次のようにして赤血球を検出した。
まず、ヒトから採血、遠心分離（４℃、１５００ｇ、３０ｍｉｎ）することにより得た赤血球を培地（ＲＰＭＩ１６４０）で懸濁することにより、ヒト由来の赤血球細胞懸濁液（懸濁液中の赤血球濃度１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を得た。得られた赤血球細胞懸濁液２００μｌを、マイクロピペットを用いてマイクロアレイチップ上に添加することにより、マイクロアレイチップに赤血球を接触、展開させ、さらにマイクロピペットにより培養液（ＲＰＭＩ１６４０）１ｍｌで洗浄を行った後、顕微鏡下で赤血球が格納されているマイクロチャンバーを測定した。結果を図６に示す。図６から、マイクロチャンバーの底に細胞（赤血球）を均一に一層（単層）として保持させ得ることが確認できた。<Red blood cell detection procedure>
Red blood cells were detected as follows.
First, red blood cells obtained by collecting blood from a human and centrifuging (4 ° C., 1500 g, 30 min) are suspended in a culture medium (RPMI1640), whereby a human-derived red blood cell suspension (red blood cell concentration in the suspension) 1 × 10 8 cells / ml) was obtained. The resulting red blood cell suspension (200 μl) was added onto the microarray chip using a micropipette, so that the red blood cells were brought into contact with the microarray chip and developed. Thereafter, the microchamber in which the red blood cells were stored was measured under a microscope. The results are shown in FIG. From FIG. 6, it was confirmed that the cells (red blood cells) can be uniformly held as a single layer (single layer) at the bottom of the microchamber.

実施例２
＜水接触角の検討＞
水接触角と細胞の展開効率について、以下のようにして比較した。ただし、当該検討で用いたマイクロアレイチップは、前記マイクロアレイチップにおいて、以下のように変更を加えて製造したものを使用した。
マイクロチャンバーの形状：円筒形
マイクロチャンバーの寸法：内径１００μｍ、深さ１００μｍ Example 2
<Examination of water contact angle>
The water contact angle and cell deployment efficiency were compared as follows. However, the microarray chip used in the examination was the same as the microarray chip manufactured with the following modifications.
Microchamber shape: Cylindrical microchamber dimension: Inner diameter 100 μm, Depth 100 μm

また、酸素プラズマ処理条件を変更することより、水接触角の異なる３種のマイクロアレイチップ（水接触角８０°、２５°、１０°）を作製した。具体的には、以下の条件下で酸素プラズマ処理を実施した。
水接触角８０°のマイクロアレイチップ：ＲＩＥ装置（サムコ株式会社製）を用いて、出力２００Ｗ、３秒の処理時間で表面処理を行った。
水接触角２５°のマイクロアレイチップ：ＲＩＥ装置を用いて、出力２００Ｗ、５秒の処理時間で表面処理を行った。
水接触角１０°のマイクロアレイチップ：ＲＩＥ装置を用いて、出力２００Ｗ、２０秒の処理時間で表面処理を行った。Also, three types of microarray chips (water contact angles of 80 °, 25 °, and 10 °) having different water contact angles were produced by changing the oxygen plasma treatment conditions. Specifically, oxygen plasma treatment was performed under the following conditions.
Using a microarray chip having a water contact angle of 80 °: RIE apparatus (manufactured by Samco Co., Ltd.), surface treatment was performed with an output of 200 W and a treatment time of 3 seconds.
A microarray chip having a water contact angle of 25 °: surface treatment was performed using an RIE apparatus with an output of 200 W and a treatment time of 5 seconds.
A microarray chip having a water contact angle of 10 °: surface treatment was performed using an RIE apparatus with an output of 200 W and a treatment time of 20 seconds.

上記と同様にして赤血球を用いて細胞の展開効率を検討した。結果を図７に示す。ここで、細胞の展開効率とは、マイクロアレイチップに備えられた全マイクロチャンバー数に対する、細胞が格納されたマイクロチャンバー数の割合を意味する。   The cell deployment efficiency was examined using red blood cells in the same manner as described above. The results are shown in FIG. Here, the cell deployment efficiency means the ratio of the number of microchambers in which cells are stored to the total number of microchambers provided in the microarray chip.

前述のようにして得られたマイクロアレイチップにおいては、水接触角が８０°の場合は、マイクロチャンバーに殆ど細胞が入らなかった。これに対して、水接触角を２５°にした場合には、４０％程度のマイクロチャンバーに細胞を格納することができた。また、水接触角を１０°にした場合には、９０％以上のマイクロチャンバーに細胞を格納することができた。   In the microarray chip obtained as described above, when the water contact angle was 80 °, almost no cells entered the microchamber. On the other hand, when the water contact angle was 25 °, the cells could be stored in a microchamber of about 40%. In addition, when the water contact angle was 10 °, cells could be stored in 90% or more of microchambers.

なお、水接触角を５°とした場合にも、良好（９０％以上）にマイクロチャンバーに細胞を格納することができた。   Even when the water contact angle was 5 °, cells could be stored in the microchamber well (90% or more).

実施例３
＜各マイクロチャンバーによる赤血球細胞の保持能力の検討＞
マイクロアレイチップが備えるマイクロチャンバーの内径及び深さを変えたとき、マイクロチャンバー内に格納される細胞に違いが見られるかを検討した。
＜マイクロアレイチップの製造＞
下記の内径及び深さの円筒形マイクロチャンバーを備えるマイクロアレイチップを３種（マイクロアレイチップＡ〜Ｃ）製造した。

Figure 0006395712
Example 3
<Examination of red blood cell retention ability in each microchamber>
It was examined whether there was a difference in the cells stored in the microchamber when the inner diameter and depth of the microchamber provided in the microarray chip were changed.
<Manufacture of microarray chip>
Three types of microarray chips (microarray chips A to C) including cylindrical microchambers having the following inner diameter and depth were manufactured.
Figure 0006395712

マイクロアレイチップＡ〜Ｃは、内径及び深さ、各マイクロチャンバー間の距離、並びに格納細胞数以外の条件は、各マイクロチャンバー間の距離を除いて全て実施例１で製造したマイクロアレイチップと同じであり、実施例１に記載の方法と同様にして製造した。なお、各マイクロチャンバー間の距離は、以下の通りである。

Figure 0006395712
The microarray chips A to C were all the same as the microarray chip manufactured in Example 1 except for the inner diameter and depth, the distance between the microchambers, and the number of stored cells, except for the distance between the microchambers. This was prepared in the same manner as described in Example 1. In addition, the distance between each microchamber is as follows.
Figure 0006395712

上記と同様にして、赤血球細胞懸濁液２００μｌをマイクロアレイチップ上に添加することにより、マイクロアレイチップに赤血球を接触、展開させ、洗浄して、顕微鏡下で赤血球が格納されているマイクロチャンバーを検出した。   In the same manner as above, by adding 200 μl of red blood cell suspension onto the microarray chip, the red blood cells were brought into contact with the microarray chip, developed, washed, and the microchamber in which the red blood cells were stored was detected under the microscope. .

結果を図８に示す。図８に示されるように、マイクロアレイチップＡ及びＣでは、顕微鏡下、各マイクロチャンバーに重なり無く格納されることが検出できた。また、顕微鏡下、細胞数を数え、各マイクロチャンバーにほぼ同数の細胞が格納されていることが検出できた。よって、各マイクロチャンバーの底に均一に、赤血球が単層に保持されていることがわかった。一方、マイクロチップＢでは、マイクロチャンバーによっては、底面のうち赤血球が接着していない部分が多く見られた。これは、マイクロアレイチップを洗浄した際に、マイクロチャンバーの底に接着していた赤血球までも洗浄により洗い流されてしまったためと考えられた。このことから、内径が５００μｍ程度の大きさのマイクロチャンバーでは、深さが１５０μｍ以下の場合、細胞を均一に単層にチャンバー内に保持するのが困難であると考えられた。また、マイクロアレイチップＡ及びＣでは各マイクロチャンバーの底に均一に、赤血球が単層に保持されていることから、マイクロチャンバーの（内径：深さ）の比は（１：０．３５〜１）程度が好ましいと考えられた。   The results are shown in FIG. As shown in FIG. 8, in the microarray chips A and C, it was detected that the microarray chips A and C were stored without overlapping in each microchamber under the microscope. Further, the number of cells was counted under a microscope, and it was detected that almost the same number of cells were stored in each microchamber. Therefore, it was found that the red blood cells were uniformly held in the monolayer at the bottom of each microchamber. On the other hand, in the microchip B, depending on the microchamber, many portions of the bottom surface where the red blood cells were not adhered were observed. This was thought to be because, even when the microarray chip was washed, even the erythrocytes adhered to the bottom of the microchamber were washed away by washing. From this, it was considered that in a microchamber having an inner diameter of about 500 μm, it is difficult to hold cells uniformly in a single layer in the chamber when the depth is 150 μm or less. In the microarray chips A and C, since the red blood cells are uniformly held on the bottom of each microchamber, the ratio of (inner diameter: depth) of the microchamber is (1: 0.35-1). The degree was considered preferable.

実施例４
上記実施例１で用いたマイクロアレイチップを用いて、白血球を検出した。 Example 4
White blood cells were detected using the microarray chip used in Example 1 above.

具体的には、次のようにして行った。培養シャーレからトリプシンなどを用いて回収したヒト培養系白血球（CCRF-CEM）をPBSまたは培地で1.0x107celllls/ml以上に調整し、マイクロアレイチップ上にピペット等を用いて展開した。15分程度静置した後、 PBSまたは培地を用いて、ピペットなどでチップ上を洗浄し、顕微鏡等でマイクロチャンバーを観察した。結果を図９に示す。図９から、マイクロチャンバーの底に細胞（白血球）を均一に一層（単層）として保持させ得ることが確認できた。Specifically, it was performed as follows. Human culture leukocytes (CCRF-CEM) collected from a culture dish using trypsin or the like were adjusted to 1.0 × 10 7 celllls / ml or more with PBS or a medium and developed on a microarray chip using a pipette or the like. After standing for about 15 minutes, the chip was washed with a pipette or the like using PBS or a medium, and the microchamber was observed with a microscope or the like. The results are shown in FIG. From FIG. 9, it was confirmed that cells (white blood cells) could be uniformly held as a single layer (single layer) at the bottom of the microchamber.

なお、当該チップには白血球も適用可能であることから、全血中の白血球画分に含まれるガン細胞の検出も可能であると考えられた。また、このことから、特に血中循環癌細胞（CTC）の検出も可能であると考えられた。   Since white blood cells can be applied to the chip, it was considered possible to detect cancer cells contained in the white blood cell fraction in whole blood. In addition, this suggested that blood circulating cancer cells (CTC) can be detected.

実施例５
上記実施例１で製造したマイクロアレイチップと同様の製造方法にて、チャンバーの開口部（正六角形）の中心間距離を２００μｍとするかわりに、マイクロチャンバー間の間隔を３０μｍ又は４０μｍ（いずれも等間隔）としたマイクロアレイチップを製造した。なお、これらのマイクロアレイチップの他の構成は、実施例１で製造したマイクロアレイチップと同じとした。なお、これらのチップの間隙率を算出したところ、マイクロチャンバー間の間隔を３０μｍとしたマイクロアレイチップは約４０％、マイクロチャンバー間の間隔を４０μｍとしたマイクロアレイチップは約５０％であった。 Example 5
In the same manufacturing method as the microarray chip manufactured in Example 1 above, instead of setting the center-to-center distance of the chamber openings (regular hexagons) to 200 μm, the spacing between the microchambers is 30 μm or 40 μm (both are equally spaced). ) Was produced. The other configurations of these microarray chips were the same as those of the microarray chip manufactured in Example 1. When the porosity of these chips was calculated, the microarray chip with an interval between microchambers of 30 μm was about 40%, and the microarray chip with an interval between microchambers of 40 μm was about 50%.

そして、これらのマイクロアレイチップを用い、測定に用いた赤血球細胞懸濁液中の赤血球濃度は５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌとした点、及び洗浄を行わなかった点、以外は、実施例１で行った赤血球検出の手順と同様にして、赤血球を検出した。また、これらのマイクロアレイチップを用い、洗浄を行わなかった点以外は、実施例４で行った白血球検出の手順と同様にして、白血球を検出した。赤血球検出結果を図１０に、白血球検出結果を図１１に、それぞれ示す。Then, using these microarray chips, the red blood cell concentration in the red blood cell suspension used for the measurement was 5 × 10 7 cells / ml, and the washing was not performed. Red blood cells were detected in the same manner as in the procedure for detecting red blood cells. In addition, leukocytes were detected in the same manner as the leukocyte detection procedure performed in Example 4 except that these microarray chips were not used for washing. The red blood cell detection result is shown in FIG. 10, and the white blood cell detection result is shown in FIG.

図１０及び図１１から、洗浄を行わない場合には、マイクロチャンバー間の間隔が３０μｍのマイクロアレイチップの方が、当該間隔が４０μｍのマイクロアレイチップに比べて、より均一に単層として細胞をマイクロチャンバー内に格納することができることがわかった。また、洗浄を行わない場合には、マイクロチャンバー間の間隔が３０μｍ程度以下である方が、より均一に単層として細胞をマイクロチャンバー内に格納することができると考えられた。   From FIG. 10 and FIG. 11, when washing is not performed, a microarray chip with a space between microchambers of 30 μm is more uniform as a single layer than a microarray chip with a space of 40 μm. Found that can be stored within. In addition, when washing was not performed, it was considered that when the distance between the microchambers was about 30 μm or less, the cells could be stored in the microchamber more uniformly as a single layer.

Claims (6)

複数のマイクロチャンバーを備えており、該マイクロチャンバー１つあたりに複数の細胞を単層に格納可能であり、該マイクロアレイチップの表面の水接触角がθ／２法による測定で１０°以下であり、該マイクロチャンバーは内径が２０〜５００μｍ、及び深さが２０μｍ以上であり、該マイクロチャンバーの（内径：深さ）の比が（１：０．３５〜１）であり、以下の条件を満たす、マイクロアレイチップ：
（ｉ）最外部に存在するマイクロチャンバーの開口部の中心を直線でつないで囲った領域の面積を１００％とし、その領域におけるマイクロチャンバー開口部以外の部分が占める面積比率を間隙率としたとき、間隙率が４０％以下であり、
（ｉｉ）マイクロチャンバーとマイクロチャンバーとの間隔が、３０μｍ以下であり、かつ
（ｉｉｉ）マイクロチャンバーの開口部の形状が六角形、
である。 A plurality of microchambers are provided, a plurality of cells can be stored in a single layer per microchamber, and the water contact angle on the surface of the microarray chip is 10 ° or less as measured by the θ / 2 method . The microchamber has an inner diameter of 20 to 500 μm and a depth of 20 μm or more, and the (inner diameter: depth) ratio of the microchamber is (1: 0.35 to 1), and satisfies the following conditions: Microarray chip:
(I) When the area of a region surrounded by a straight line connecting the centers of the microchamber openings existing at the outermost portion is 100%, and the area ratio occupied by the portion other than the microchamber openings in the region is the porosity The porosity is 40% or less,
(Ii) the interval between the microchamber and the microchamber is 30 μm or less, and (iii) the shape of the opening of the microchamber is a hexagon,
It is. 複数の細胞を含む試料から、該試料に含まれる特定の細胞を検出するための検出方法であって、
（１）複数のマイクロチャンバーを備えたマイクロアレイチップであって、該マイクロチャンバー１つあたりに複数の細胞を格納可能であるマイクロアレイチップに、該試料中の細胞を保持させる工程、及び
（２）該マイクロアレイチップに保持された細胞において、特定の細胞の有無を検出する工程
を含み、
前記マイクロアレイチップの表面の水接触角がθ／２法による測定で１０°以下であり、
前記マイクロチャンバーは内径が２０〜５００μｍ、及び深さが２０μｍ以上であり、前記マイクロチャンバーの（内径：深さ）の比が（１：０．３５〜１）であり、さらに前記マイクロアレイチップが、以下の条件を満たす、検出方法（但し、前記複数の細胞はスフェロイドではない）：
（ｉ）前記マイクロアレイチップの最外部に存在するマイクロチャンバーの開口部の中心を直線でつないで囲った領域の面積を１００％とし、その領域におけるマイクロチャンバー開口部以外の部分が占める面積比率を間隙率としたとき、前記マイクロアレイチップの
間隙率が４０％以下であり、
（ｉｉ）前記マイクロアレイチップの、マイクロチャンバーとマイクロチャンバーとの間隔が、３０μｍ以下であり、かつ
（ｉｉｉ）マイクロチャンバーの開口部の形状が六角形、
である。 A detection method for detecting specific cells contained in a sample from a sample containing a plurality of cells,
(1) a step of holding a cell in the sample in a microarray chip having a plurality of microchambers, the microarray chip capable of storing a plurality of cells per one microchamber, and (2) A step of detecting the presence or absence of specific cells in the cells held in the microarray chip,
The water contact angle of the surface of the microarray chip is 10 ° or less as measured by the θ / 2 method ,
The microchamber has an inner diameter of 20 to 500 μm and a depth of 20 μm or more, the (inner diameter: depth) ratio of the microchamber is (1: 0.35 to 1), and the microarray chip further includes: Detection method that satisfies the following conditions (however, the plurality of cells are not spheroids) :
(I) The area of a region surrounded by a straight line connecting the centers of the microchamber openings existing on the outermost part of the microarray chip is defined as 100%, and the area ratio occupied by the portion other than the microchamber openings in the region is defined as a gap. The porosity of the microarray chip is 40% or less,
(Ii) The interval between the microchambers of the microarray chip is 30 μm or less, and (iii) the shape of the opening of the microchamber is a hexagon,
It is. 前記特定の細胞が動物由来細胞である、請求項２に記載の検出方法。 The detection method according to claim 2, wherein the specific cell is an animal-derived cell. 前記複数の細胞を含む試料の細胞濃度が１×１０６〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌである、請求項２または３に記載の検出方法。 The detection method according to claim 2 or 3, wherein a cell concentration of the sample containing the plurality of cells is 1 x 10 6 to 1 x 10 8 cells / ml. 工程（１）において、前記試料中の細胞を保持させる工程が、過剰な細胞を除去することを含まない工程であり、前記マイクロアレイチャンバー内に前記複数の細胞を単層に保持する工程である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の検出方法。In the step (1), the step of holding the cells in the sample is a step not including removing excess cells, and the step of holding the plurality of cells in a single layer in the microarray chamber. The detection method as described in any one of Claims 2-4. 前記マイクロチャンバーが、チップの基板上に形成された形状を有する、請求項１に記載のマイクロアレイチップ。 The microarray chip according to claim 1, wherein the microchamber has a shape formed on a substrate of the chip .
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