JPWO2014125955A1 - 抗体のリフォールディング方法、リフォールディングされた抗体の製造方法、リフォールディングされた抗体、及びこれらの利用 - Google Patents
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Abstract
Description
項1.(1−1)ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる不活性な抗体を変性させる工程、ここで該ペプチドは、該不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有する、及び、
(1−2)前記工程(1−1)において変性した、前記ペプチドが連結されなる不活性な抗体を、液相に分散させる工程、
を含む、液相中での抗体のリフォールディング方法。
項2.抗体が1本鎖抗体、Fab断片、F(ab’)2断片、単ドメイン抗体、多価性1本鎖抗体、定常部融合1本鎖抗体及び完全長抗体からなる群より選択される少なくとも1種である、項1に記載のリフォールディング方法。
項3.前記ペプチドの等電点が8.5以下である、項1または2に記載のリフォールディング方法。
項4.前記ペプチドが、基材に対して親和性を有するペプチドである、項1〜3のいずれかに記載のリフォールディング方法。
項5.前記リンカーが、基材に対して親和性を有するペプチドである、項1〜4のいずれかに記載のリフォールディング方法。
項6.(2−1)ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる不活性な抗体を変性させる工程、ここで該ペプチドは、該不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有する、及び、
(2−2)前記工程(2−1)において変性した、前記ペプチドが連結されてなる不活性な抗体を、液相に分散させる工程、
を含む、リフォールディングされた抗体の製造方法。
項7.抗体が1本鎖抗体、Fab断片、F(ab’)2断片、単ドメイン抗体、多価性1本鎖抗体、定常部融合1本鎖抗体及び完全長抗体からなる群より選択される少なくとも1種である、項6に記載の製造方法。
項8.前記ペプチドの等電点が8.5以下である、項6または7に記載の製造方法。
項9.前記ペプチドが、基材に対して親和性を有するペプチドである、項6〜8のいずれかに記載の製造方法。
項10.前記リンカーが、基材に対して親和性を有するペプチドである、項6〜9のいずれかに記載の製造方法。
項11.項6〜10のいずれかに記載の製造方法によって得られる、リフォールディングされた抗体。
項12.項1、3、4、6、8及び9のいずれかに記載の、前記不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドからなる、液相中での抗体のリフォールディング用助剤。
項13.項1〜5のいずれかに記載の方法によってリフォールディングされた抗体及び/または項6〜10のいずれかに記載の製造方法によって得られたリフォールディングされた抗体を、基材に接触させる工程を含有する、リフォールディングされた抗体の基材への固定化方法。
項14.抗体に連結されたペプチドを介して、抗体が基材に固定される、項13に記載の固定化方法。
項15.前記不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが以下の(a)または(b)に示すペプチドであり、基材がポリカーボネート及びポリメタクリル酸メチルからなる群より選択される少なくとも1種である、項13または14に記載の固定化方法、
(a)配列番号1〜4のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
(b)前記(a)のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリカーボネート及びポリメタクリル酸メチルからなる群より選択される少なくとも1種に親和性を有するペプチド。
項16.項13〜15のいずれかに記載の固定化方法によってリフォールディングされた抗体が固定されてなる、基材。
項17.ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる不活性な抗体を含有する、液相中での抗体のリフォールディング用組成物、ここで該ペプチドは、該不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有する。
項18.更に、前記ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されなる不活性な抗体の等電点よりもpHが0.5以上高い溶液を含有する、項17に記載の組成物。
項19.抗体をコードするポリヌクレオチドと、該抗体の等電点より低い等電点を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドとが直接またはリンカーを介して連結されてなる、液相中での抗体のリフォールディング用ペプチド連結抗体発現ベクター。
項20.項19に記載のベクターを宿主細胞に導入して形質転換させることにより得られる形質転換体。
項21.項20に記載の形質転換体から得られる、ペプチドが連結されてなる抗体。
項22.項1、3、4、6、8及び9のいずれかに記載の、前記不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する、液相中での抗体のリフォールディング用ペプチド発現ベクター。
項23.アスパラギン酸残基からなるペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる抗体、ここで該ペプチドは、該不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有する。
項24.前記抗体が、不活性な抗体またはリフォールディングされた抗体である、項23に記載の抗体。
1.液相中での抗体のリフォールディング方法
本発明の液相中での抗体のリフォールディング方法は、(1−1)ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる不活性な抗体を変性させる工程、及び、(1−2)前記工程(1−1)において変性した、前記ペプチドが連結されなる不活性な抗体を、液相に分散させる工程、を含むことを特徴とする。ここで、前記工程(1−1)において、前記ペプチドは、前記不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有することを特徴とする。
本発明のリフォールディングされた抗体の製造方法は、(2−1)ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる不活性な抗体を変性させる工程、及び、(2−2)前記工程(2−1)において変性した、前記ペプチドが連結されてなる不活性な抗体を、液相に分散させる工程、を含むことを特徴とする。ここで、前記工程(2−1)において、前記ペプチドは、前記不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有することを特徴とする。
本発明のリフォールディングされた抗体の基材への固定化方法は、前述の液相中での抗体のリフォールディング方法によってリフォールディングされた抗体及び/または前述のリフォールディングされた抗体の製造方法によって得られたリフォールディングされた抗体を、基材に接触させる工程を含有することを特徴とする。
本発明の液相中での抗体のリフォールディング用ペプチド連結抗体発現ベクターは、抗体をコードするポリヌクレオチドと、該抗体の等電点より低い等電点を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドとが直接またはリンカーを介して連結されてなることを特徴とする。
1.後述する手順に従い、以下の実施例1−1〜1−3及び比較例1に示す構造を備えた、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが連結されてなる不活性な抗体を調製した。
実施例1−1:anti-CEA scFv-PM-His(等電点4.9)
実施例1−2:anti-CEA scFv-D5-His(等電点4.7)
実施例1−3:anti-CEA scFv-D10-His(等電点4.4)
比較例1:anti-CEA scFv-His(等電点5.3)
まず、配列番号4で示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチド(配列番号56)の3’末端側に6つのヒスチジン残基を連結させたヌクレオチド配列を合成し、これをpET22ベクター(メルク社製)のNot I/Xho Iサイトに導入した。次いで、anti-CEA scFvをPCRで増幅し、前記ベクターのNdeI/NotIサイトに導入した。これにより、T7プロモーター/Lacオペレーター→RBS→スタートコドン(ATG)- anti-CEA scFv→前記ペプチド-Stopコドン→T7ターミネーターの順で連結された、実施例1−1を作製するための発現ベクターを得た。同様に、配列番号4で示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチドに代えて、5つの連続するアスパラギン酸残基からなるポリヌクレオチド、または、10つの連続するアスパラギン酸残基からなるポリヌクレオチドを用いた以外は同様にして、実施例1−2または実施例1−3を作製するためのするための発現ベクターを得た。また、配列番号4で示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いない以外は実施例1−1同様にして、比較例1を作製するための発現ベクターを得た。
実施例1−1(anti-CEA scFv-PM-His)及び比較例1(anti-CEA scFv-His)を用いた結果を図1に示す。図1から明らかなように、比較例1に対して、実施例1−1においてOD値が著しく小さいことが確認された。図1はOD値が小さいほど不溶で不活性な凝集体としての抗体が減少していることを示し、すなわち、OD値が小さいほどリフォールディング効率が高いことを示す。なお、図1において、例えばpH6.0-、0mMで示されるものは、pH6、NDSB無添加、NaCl 0mMの液相に分散させてリフォールディングを行ったことを示し、pH6.0+、50mMで示されるものは、pH6、NDSB 0.5M、NaCl 50mMの液相に分散させてリフォールディングを行ったことを示す。また、図中、例えば「pH6.0-」や「pH6.0+」においてはそれぞれ4本のバーが示されているが、これは左から順に、すなわち図1の比較例1(anti-CEA scFv-His)の結果を示すグラフにおいて「pH6.0-」のバーの上部に示されている1〜4の数字の小さいほうから順にNaCl 0mM、50mM、150mM、300mMの結果を示す。後述する同様の図においても同様に説明される。
1.以下の手順で、以下の実施例2−1〜2−5及び比較例2に示す構造を備えた、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが連結されてなる不活性な抗体を調製した。
実施例2−1:anti-RNase scFv-PM-His(等電点5.96)
実施例2−2:anti-RNase scFv-D5-His(等電点5.75)
実施例2−3:anti-RNase scFv-D10-His(等電点4.93)
実施例2−4:anti-RNase scFv-D15-His(等電点4.55)
実施例2−5:anti-RNase scFv-D20-His(等電点4.32)
比較例2:anti-RNase scFv-His(等電点7.26)
抗体としてRNaseに対する1本鎖抗体を用いた以外は試験例1の実施例1−1〜1−3及び比較例1と同様にして、実施例2−1〜2−3及び比較例2に示す、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが連結されてなる不活性な抗体を調製した。
実施例2−1及び比較例2を用いた場合の効果を図3に示す。図3から明らかなように、比較例2に対して、実施例2−1においてOD値が著しく小さいことが確認された。
1.以下の手順で、次の実施例3−1〜3−5及び比較例3に示す構造を備えた、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが連結されてなる不活性な抗体を調製した。試験例2とは異なる抗体である、C反応性蛋白(CRP、C-reactive protein)に対する1本鎖抗体を用いた以外は試験例2と同様にして試験を行った。
実施例3−1:anti-CRP scFv-PM-His(等電点5.9)
実施例3−2:anti-CRP scFv-D5-His(等電点5.8)
実施例3−3:anti-CRP scFv-D10-His(等電点5)
実施例3−4:anti-CRP scFv-D15-His(等電点4.6)
実施例3−5:anti-CRP scFv-D20-His(等電点4.4)
比較例3:anti-CRP scFv-His(等電点6.6)
実施例3−1及び比較例3を用いた場合の効果を図5に示す。図5から明らかなように、比較例3に対して、実施例3−1においてOD値が著しく小さいことが確認された。
1.前述の実施例1において抗体としてTSH、IgA、IgGまたはTF189を用いる以外は同様にして実施例4〜7に示す構造を備えた、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが連結されてなる不活性な抗体を調製し、同様にして試験を行った。
実施例4:anti-TSH scFv-PM-His(等電点6.41)
実施例5:anti-IgA scFv-PM-His(等電点6.49)
実施例6:anti-IgG scFv-PM-His(等電点6.14)
実施例7:anti-TF189 scFv-PM-His(等電点5.86)
図7に示すように、抗体としてTSH、IgA、IgGまたはTF189の1本鎖抗体を用いた場合も、前記ペプチドを連結させることによってリフォールディング効率を高めることができた。なお、図中、例えば「pH7.5-」や「pH7.5+」においてはそれぞれ4本のバーが示されているが、これは左から順にTSH、IgA、IgG、TF189の結果を示す。また、図はイオン強度(NaCl濃度)0mMの溶液に分散させてリフォールディングを行った結果である。
前記実施例1−1、実施例2−1、実施例3−1、実施例4及び比較例1に示される不活性な抗体を以下のように変性、リフォールディングを行うことによって、これらにおけるリフォールディング効率を算出した。
1.配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるペプチド(PM)は、ポリメタクリル酸メチル(PMMA)製の基材に親和性を有しており、実施例2−1において該ペプチドは1本鎖抗体に連結されている。このことから、前述のようにして得た、配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが連結されたリフォールディングされた抗体を、ポリメタクリル酸メチル製の基材と接触させることによって、該ペプチドを介してリフォールディングされた抗体が該基材上に良好に固定できるかどうかについて検討した。比較例として、前記比較例2をリフォールディングしたものを用いた。なお、リフォールディングでは0.05M TAPSグッドバッファーを用い、pH8.5、NDSB201無添加、NaCl濃度0mMに調整した液相を用いた。
1.前記実施例2−4において連結させたペプチドに加えて、以下の親和性ペプチドを連結させた以外は試験例2と同様にして、抗体のリフォールディング効率を比較した。ここで、下記PSは、配列番号10で表されるアミノ酸配列からなる親和性ペプチドであり、親水性ポリスチレンに対して親和性を有する。下記SiNは、配列番号29で表されるアミノ酸配列からなる親和性ペプチドであり、窒化ケイ素に対して親和性を有する。実施例8−1においてPSとD15との間に酵素により切断可能な切断部位を連結させた。同様に、実施例8−2においてSiNとD15との間に切断部位を連結させた。また、実施例2−4の低等電点ペプチドに代えて、前記親和性ペプチドを連結させたものを、比較例4(PS)及び比較例5(SiN)とした。なお、配列番号10で示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチドは配列番号61で表され、配列番号29で表されるアミノ酸配列ペプチドをコードするポリヌクレオチドは配列番号63で表される。
実施例2−4:anti-RNase scFv-D15-His(等電点4.55)
実施例8−1:anti-RNase scFv-PS-D15-His(等電点5)
実施例8−2:anti-RNase scFv-SiN-D15-His(等電点4.83)
比較例2:anti-RNase scFv-His(等電点7.26)
比較例4:anti-RNase scFv-PS-His(等電点8.97)
比較例5:anti-RNase scFv-SiN-His(等電点8.14)
図9はPSを用いた結果であり、図10はSiNを用いた結果である。図9から明らかなように、親和性ペプチドPSの存在下でも、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが連結された不活性な抗体ではODが低く、その抗体のリフォールディング効率を高めることができた。同様に、図10においても同様に、親和性ペプチドSiNの存在下でも、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが連結された不活性な抗体では、その抗体のリフォールディング効率を高めることができた。
1.前記実施例2−1、実施例2−4、実施例8−1を用いて、リフォールディングされた抗体を、ポリメタクリル酸メチル製の基材と接触させることによって、前記ペプチドを介してリフォールディングされた抗体が前記基材上に良好に固定できるかどうかについて検討した。
図11から明らかなように、ポリメタクリル酸メチルに親和性を有し、且つ、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチド(PM)が導入されている実施例2−1においてリフォールディングされた抗体によれば、該リフォールディングされた抗体に連結されているPMの効果によって、ポリメタクリル酸メチル製の基材にリフォールディングされた抗体が高密度に固定化され、ポリメタクリル酸メチルに親和性を有するペプチドが連結されていない他のリフォールディングされた抗体と比較して、高いシグナルが得られた。
1.実施例1−1(anti-CEA scFv-PM-His)における一本鎖抗体を、CEAに対する重鎖のFab抗体(Fab H)またはCEAに対する軽鎖のFab抗体(Fab L)に代えた以外は、試験例1と同様にして、以下の実施例9−1及び実施例9−2に示される、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが連結されてなる不活性な抗体を作製した。また、実施例2−1(anti-RNase scFv-PM-His)における一本鎖抗体を、RNaseに対する重鎖のFab抗体(Fab H)またはRNaseに対する軽鎖のFab抗体(Fab L)に代えた以外は、試験例2と同様にして、以下の実施例9−3及び実施例9−4に示される、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが連結されてなる不活性な抗体を作製した。また、実施例7(anti-TF189 scFv-PM-His)における一本鎖抗体を、TF189に対する重鎖のFab抗体(Fab H)またはTF189に対する軽鎖のFab抗体(Fab L)に代えた以外は、試験例4と同様にして、以下の実施例9−5及び実施例9−6に示される、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが連結されてなる不活性な抗体を作製した。また、同様に、抗体としてAFPを用いる以外は実施例9−1等と同様にして、以下の実施例9−7及び実施例9−8に示される、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが連結されてなる不活性な抗体を作製した。
実施例9−1:anti-CEA Fab H-PM-His (等電点4.91)
実施例9−2:anti-CEA Fab L-PM-His (等電点5.81)
実施例9−3:anti-RNase Fab H-PM-His (等電点6.32)
実施例9−4:anti-RNase Fab L-PM-His (等電点5.55)
実施例9−5:anti-TF189 Fab H-PM-His (等電点6.54)
実施例9−6:anti-TF189 Fab L-PM-His (等電点5.33)
実施例9−7:anti-AFP Fab H-PM-His (等電点7.29)
実施例9−8:anti-AFP Fab L-PM-His (等電点5.81)
得られた実施例9−1〜9−8のペプチドが連結されてなる不活性な抗体を、前記試験例1と同様にして変性、リフォールディングを行い、そのリフォールディング効率を評価した。なお、本試験例では、変性、リフォールディングは実施例9−1〜9−8がそれぞれ単独で存在する条件下で行うことに加えて、実施例9−1及び9−2が共存する条件下(anti-CEA Fab-PM-His (H+L))、実施例9−3及び9−4が共存する条件下(anti-RNase Fab-PM-His (H+L))、実施例9−5及び9−6が共存する条件下(anti-TF189 Fab-PM-His (H+L))、実施例9−7及び9−8が共存する条件下(anti-AFP Fab-PM-His (H+L))でも行った。
図13〜図16は、それぞれCEA、RNase、TF189、AFPに関する各結果を示す。これらの結果から明らかなように、いずれにおいてもOD値が小さく、効率良くリフォールディングされていることが確認された。
試験例9において実施例9−1及び9−2が共存する条件下(anti-CEA Fab-PM-His (H+L))、実施例9−3及び9−4が共存する条件下(anti-RNase Fab-PM-His (H+L))、実施例9−5及び9−6が共存する条件下(anti-TF189 Fab-PM-His (H+L))を用いて、前記試験例5と同様にして変性、リフォールディングを行うことによって、これらにおけるリフォールディング効率を算出した。
1.以下のペプチドを連結させた不活性な抗体を、前記試験例10と同様にして変性、リフォールディングすることによって得た、リフォールディングされた各抗体を、後述の手順に従いポリメタクリル酸メチル製の基材と接触させ、固定された各抗体の活性を評価した。また、前記試験例10において用いたanti-CEA Fab -PM-His (H+L)、anti-RNase Fab -PM-His (H+L)、anti-TF189 Fab -PM-His (H+L)についてもリフォールディングを行い、同様にしてポリメタクリル酸メチル製の基材と接触させて、固定された各抗体の活性を評価した。リフォールディングは、0.05M TAPSグッドバッファーを用い、pH8.5、NDSB201無添加、NaCl濃度0mMに調整された液相を用いて行った。
−CEAに対する抗体
実施例1−1:anti-CEA scFv-PM-His
実施例9−1:anti-CEA Fab H-PM-His
実施例9−2:anti-CEA Fab L-PM-His
−RNaseに対する抗体
実施例2−1:anti-RNase scFv-PM-His
実施例9−3:anti-RNase Fab H-PM-His
実施例9−4:anti-RNase Fab L-PM-His
−TF189に対する抗体
実施例7:anti-TF189 scFv-PM-His
実施例9−5:anti-TF189 Fab H-PM-His
実施例9−6:anti-TF189 Fab L-PM-His
図17〜19から明らかなように、特にFab LとFab Hを混合させた場合に、一本鎖抗体を用いた場合と同様に、所望の活性が観察された。通常、H鎖とL鎖はこれらが協力して抗原認識を行うと考えられている。本試験例において、Fab HやFab Lが単独で存在する場合と比較して、Fab LとFab Hとが共存させてリフォールディングを行い、この場合に高い活性が認められたことは、本発明によれば抗体に由来する所望の活性が良好に回復されていることを示している。
前述の実施例1において抗体としてラクダ由来VHHを用いる以外は同様にして実施例10に示す構造を備えた、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが連結されてなる不活性な抗体を調製し、同様にして試験を行った。また、比較のため、比較例6に示す構造を備えた抗体を調製し、同様にして試験行った。
実施例10:VHH-PM-His(等電点6.05)
比較例6:VHH-His(等電点8.20)
図20に示すように、抗体としてVHH単ドメイン抗体を用いた場合も、前記ペプチドを連結させることによって凝集が著しく解消され、これによってリフォールディング効率を高めることができることが分かった。液相のpHが7.5など更に低い場合であっても、同様の傾向が認められた。
試験例12に記載される実施例10及び比較例6を用いて、前記試験例5と同様にして変性、リフォールディングを透析によって行い、これらにおけるリフォールディング効率を算出した。具体的には、8M Urea-PBSに溶解させた実施例10(VHH-PM-His)を、0.5mg/mL VHH-PM-His、0.5M Urea、50mM TAPSとなるよう希釈して得た溶液1mLを透析チューブ内に入れ、50mM TAPS 1Lの外液に対して4℃で一晩透析した。次いで、透析チューブ内の溶液を回収し、遠心分離によって凝集体を除去した。遠心分離前後のタンパク質濃度をDC Protein Assay(バイオラッドラボラトリーズ社製)によってそれぞれ定量し、回収率を算出した。比較例6(VHH-His)についても同様にして回収率を算出した。
試験例13とは異なる方法を用いて、実施例10についてリフォールディング効率を算出した。具体的には、ゲルクロマトグラフィーによってリフォールディング効率を算出した。まず、AKTA Purifier UPC10 クロマトグラフィシステム(GEヘルスケア社製)にゲル濾過カラムHi Trap Desalting(GEヘルスケア社製) 5mL を2個連結してセットし、50mM TAPS (pH 8.5)で平衡化した。次に、8M Urea-PBSに溶解させた実施例10(VHH-PM-His)を、0.5mg/mL VHH-PM-His、0.5M Urea、50mM TAPS、0.5M NDSB201となるよう希釈して得た溶液2mLを前記カラムに負荷し、50mM TAPS (pH 8.5)を供給した。次いで 最初に溶出されるタンパク質のピークを含有する溶液を回収した(3mL回収)。 回収したタンパク質溶液の濃度をDC protein assay(バイオラッドラボラトリーズ社製)で定量し、アプライ量と回収量から回収率を算出した。その結果、実施例10では回収率が99%であった。このことから、抗体としてVHHを用いた場合であっても不活性な抗体を効率よくリフォールディングできたことが分かった。
1.前記実施例10を用いてリフォールディングされた抗体を、ポリメタクリル酸メチル製の基材と接触させることによって、前記ペプチドを介してリフォールディングされた抗体が前記基材上に良好に固定できるかどうかについて検討した。また、当該固定化された抗体がその活性を維持しているかどうかについて検討した。比較例6についても同様にして検討した。
図21から明らかなように、ポリメタクリル酸メチルに親和性を有し、且つ、不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチド(PM)が導入されている実施例10においてリフォールディングされた抗体によれば、該リフォールディングされた抗体に連結されているPMの効果によって、ポリメタクリル酸メチル製の基材にリフォールディングされた抗体が高密度に固定化され、ポリメタクリル酸メチルに親和性を有するペプチドが連結されていない抗体と比較して、高いシグナルが得られた。このことから、実施例10においてリフォールディングされた抗体が基材に高密度に固定化され、また、抗体に由来する所望の活性が良好に回復されていることが分かった。
Claims (19)
- (1−1)ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる不活性な抗体を変性させる工程、ここで該ペプチドは、該不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有する、及び、
(1−2)前記工程(1−1)において変性した、前記ペプチドが連結されなる不活性な抗体を、液相に分散させる工程、
を含む、液相中での抗体のリフォールディング方法。 - 抗体が1本鎖抗体、Fab断片、F(ab’)2断片、単ドメイン抗体、多価性1本鎖抗体、定常部融合1本鎖抗体及び完全長抗体からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項1に記載のリフォールディング方法。
- 前記ペプチドの等電点が8.5以下である、請求項1または2に記載のリフォールディング方法。
- (2−1)ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる不活性な抗体を変性させる工程、ここで該ペプチドは、該不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有する、及び、
(2−2)前記工程(2−1)において変性した、前記ペプチドが連結されてなる不活性な抗体を、液相に分散させる工程、
を含む、リフォールディングされた抗体の製造方法。 - 抗体が1本鎖抗体、Fab断片、F(ab’)2断片、単ドメイン抗体、多価性1本鎖抗体、定常部融合1本鎖抗体及び完全長抗体からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項4に記載の製造方法。
- 前記ペプチドの等電点が8.5以下である、請求項4または5に記載の製造方法。
- 前記リンカーが、基材に対して親和性を有するペプチドである、請求項4〜6のいずれかに記載の製造方法。
- 請求項4〜7のいずれかに記載の製造方法によって得られる、リフォールディングされた抗体。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の方法によってリフォールディングされた抗体及び/または請求項4〜7のいずれかに記載の製造方法によって得られたリフォールディングされた抗体を、基材に接触させる工程を含有する、リフォールディングされた抗体の基材への固定化方法。
- 抗体に連結されたペプチドを介して、抗体が基材に固定される、請求項9に記載の固定化方法。
- 前記不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有するペプチドが以下の(a)または(b)に示すペプチドであり、基材がポリカーボネート及びポリメタクリル酸メチルからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項9または10に記載の固定化方法、
(a)配列番号1〜4のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
(b)前記(a)のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリカーボネート及びポリメタクリル酸メチルからなる群より選択される少なくとも1種に親和性を有するペプチド。 - 請求項9〜11のいずれかに記載の固定化方法によってリフォールディングされた抗体が固定されてなる、基材。
- ペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる不活性な抗体を含有する、液相中での抗体のリフォールディング用組成物、ここで該ペプチドは、該不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有する。
- 更に、前記ペプチドが連結されなる不活性な抗体の等電点よりもpHが0.5以上高い溶液を含有する、請求項13に記載の組成物。
- 抗体をコードするポリヌクレオチドと、該抗体の等電点より低い等電点を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドとが直接またはリンカーを介して連結されてなる、液相中での抗体のリフォールディング用ペプチド連結抗体発現ベクター。
- 請求項15に記載のベクターを宿主細胞に導入して形質転換させることにより得られる形質転換体。
- 請求項16に記載の形質転換体から得られる、ペプチドが連結されてなる抗体。
- アスパラギン酸残基からなるペプチドが直接またはリンカーを介して連結されてなる抗体、ここで該ペプチドは、該不活性な抗体の等電点よりも低い等電点を有する。
- 前記抗体が、不活性な抗体またはリフォールディングされた抗体である、請求項18に記載の抗体。
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