JPWO2014123151A1 - 多系統萎縮症リスクの検査方法、検査キット、及び多系統萎縮症の治療又は予防薬 - Google Patents

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Abstract

本発明は、MSAの原因遺伝子の特定を通じて発症のメカニズムを解明し、ひいてはその治療法を見出すことを課題とする。本発明は、被検者の多系統萎縮症リスクの検査方法であって、被検者から採取した試料におけるコエンザイムQ10の生合成を低下させる変異を検出する工程を含む、方法を提供する。コエンザイムQ10の生合成を低下させる変異としては、例えば、コエンザイムQ2の発現又は機能を抑制する変異が挙げられる。

Description

本発明は、多系統萎縮症の発症リスクの検査方法等に関する。
多系統萎縮症（Multiple System Atrophy; MSA）は、難治性の神経変性疾患の一つである。平均発症年齢は57.5±7.2歳で、臨床症候は、小脳性運動失調、パーキンソニズム、自律神経症候、錐体路徴候が様々な組み合わせで出現する。小脳性運動失調が主要症候であるMSA-Cと、パーキンソニズムが主要症候であるMSA-Pの2つの臨床病型が代表的であり、MSA-Cはオリーブ橋小脳萎縮症に対応し、MSA-Pは線条体黒質変性症に対応する。この他に、自律神経障害が主要症候であるShy-Drager症候群がある。日本人ではMSA-PよりMSA-Cの頻度が高く、欧米人ではMSA-Pの頻度がより高い。
病理学的には、glial cytoplasmic inclusion（GCI）が特徴で、α-シヌクレインが主要成分である。
MSAは代表的な孤発性神経変性疾患であると位置づけられているが、これまでに非常に稀ではあるものの複数のMSA多発家系が見出されおり（非特許文献１−３）、遺伝的要因の関与が示唆されている。
現在までのところMSAの発症機構はまったく不明であり、治療としては症状に応じた対症療法が行われている。
Hara K, et al. Arch Neurol 2007;64:545-51. Wullner U, et al. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2009;80:449-50. Hohler AD and Singh VJ. J Clin Neurosci 2012;19:479-80.
本発明は、MSAの原因遺伝子の特定を通じて発症のメカニズムを解明し、ひいてはその治療法を見出すことを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、MSA多発家系にPara-hydroxybenzoate-polyprenyltransferase遺伝子（以下、Para-hydroxybenzoate-polyprenyltransferase（EC 2.5.1.39）を「コエンザイムQ2」又は「CoQ2」と表し、その遺伝子を「COQ2」又は「COQ2遺伝子」と表す場合もある。）の変異の保因者がいることを見出し、家族性多系統萎縮症の一部では、COQ2変異のホモ接合性変異又は複合へテロ接合性変異があれば、それが十分条件で発症することを確認した。また、孤発性MSAにおいても、ヘテロ接合性のCOQ2変異がMSA発症の大きなリスクファクターとなることを明らかにした。さらに、COQ2はCoQ10の生合成に関与していることから、家族性及び孤発性MSA患者の組織におけるCoQ10量を測定したところ、これが低下していることを実証し、CoQ10投与による治療効果が論理的に強く示唆されることを確認して、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、
〔１〕被検者の多系統萎縮症リスクの検査方法であって、被検者から採取した試料におけるコエンザイムQ10の生合成を低下させる変異を検出する工程を含む、方法；
〔２〕前記コエンザイムQ10の生合成を低下させる変異は、Para-hydroxybenzoate-polyprenyltransferase（コエンザイムQ2）の発現又は機能を抑制する変異である、上記〔１〕に記載の方法；
〔３〕前記コエンザイムQ2の発現又は機能を抑制する変異は、配列番号：１におけるP49H、S57T、R69H、M78V、I97T、P107S、S113F、T267A、S297C、R337Q、R337X、及びV343Aからなる群より選択される、上記〔２〕に記載の方法；
〔４〕前記コエンザイムQ2の発現又は機能を抑制する変異は、V343Aである、上記〔２〕に記載の方法；
〔５〕多系統萎縮症リスクの検査キットであって、以下の(i)から(iii)の少なくとも1つを含むキット：
(i) コエンザイムQ2遺伝子における、コエンザイムQ2タンパク質（配列番号：１）の49位、57位、69位、78位、97位、107位、113位、267位、297位、337位、及び343位からなる群より選択される部位のアミノ酸をコードする核酸を含む領域にハイブリダイズする核酸；
(ii) コエンザイムQ2遺伝子における、コエンザイムQ2タンパク質（配列番号：１）の49位、57位、69位、78位、97位、107位、113位、267位、297位、337位、及び343位からなる群より選択される部位のアミノ酸をコードする核酸を含む領域を増幅可能なプライマーセット；及び
(iii) 配列番号：１において、P49H、S57T、R69H、M78V、I97T、P107S、S113F、T267A、S297C、R337Q、R337X、及びV343Aからなる群より選択される少なくとも1つの変異を有するコエンザイムQ2タンパク質と、野生型コエンザイムQ2タンパク質のいずれかのみに交差性なく結合する抗体；
〔６〕コエンザイムQ10を含む多系統萎縮症の予防又は治療剤；
〔７〕コエンザイムQ10を投与する工程を含む、多系統萎縮症の予防又は治療方法；
〔８〕多系統萎縮症の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、
候補化合物と細胞とを接触させてインキュベートする工程と、
細胞内のコエンザイムQ10量を上昇させる候補化合物を選択する工程と、を含む方法；
及び、
〔９〕V343A変異を含むコエンザイムQ2タンパク質をコードする核酸、
に関する。
本発明によれば、被検者におけるCOQ2遺伝子の所定の変異の有無を検出するという簡便な方法により、MSA発症リスクを評価することができる。
MSA発症リスクが高いと判断された場合には、CoQ10の補充により発症が抑制されることが期待され、またCoQ10の補充はMSAの治療にも有効である可能性が強く示唆される。
図１Ａは、6つのMSA多発家系の家系図を示す。FMSA_1の両親は血族婚（first degree cousin）であった。FMSA_1の患者（II-4及びII-8）は二人とも網膜色素変性症にも罹患していたが、他の兄弟MSAでも網膜色素変性症でもなかった。FMSA_1のII-4及びII-8と、FMSA_8のII-6のMSAの確定診断は生検により行った。FMSA_8の他の2人の兄弟はPD患者であった。□は男性、○は女性、黒色はMSA患者、灰色はPD患者、白色はいずれにも罹患していない者を示し、黒点はゲノムDNAが入手できたことを示す。MSA-Cは小脳性運動失調が主要症候であるMSA、MSA-Pはパーキンソニズムが主要症候であるMSA、PDはパーキンソン病を示す。 図１Ｂは、FMSA_1の多点パラメトリック連鎖解析を示す。パイプラインソフトウェアSNPHiTLinkを用い、Hardy-Weinberg検定でp値＞0.05、call rate＞0.95、ジェノタイピングの信頼スコア＜0.1、対照者のマイナーアレル頻度＞0、及び連鎖解析のためのマーカー間距離が80kbから120kbであるSNPを選択した。多点パラメトリック連鎖解析（完全浸透度をもつ常染色体劣性遺伝）及びハプロタイプの再構築をAllegro version 2で行った。LODスコアの最高値は1.93であり、染色体4上の領域（NCBI36/hg18アセンブリの72.795 Mbから89.616 Mb at）、5上の領域（149.50 Mbから168.32 Mb）、6上の領域（85.499 Mbから87.382 Mb）、7上の領域（62.754 Mbから64.907 Mb）、9上の領域（99.781 Mbから115.484 Mb）、及び13上の領域（75.849 Mbから98.253 Mb）を含む約80Mbの領域にわたっていた。 図１Ｃは、候補となる変異の絞り込みの過程を説明した図である。ホールゲノムシーケンスにより合計3,492,929のSNVとindelが見出され、そのうち54,306は候補領域に位置した。このうち342がエクソン又はスプライス領域をコードし、78が非同義又はスプライス領域変異であった。この中でdbSNP130に登録されていない新規なSNVは4つのみであった。 図１Ｄは、FMSA_1の患者（II-4。上のパネル）及び非罹患者（II-7。下のパネル）のダイレクトシーケンスの結果を示す。患者は、M78V-V343Aのホモ接合体を有した。 図２Ａは、COQ2変異体のyeast complementation assayの結果を示す。野生型（wt）ヒトCOQ2遺伝子cDNAを含むpAUR123ベクター、又はmockベクターで形質転換した酵母coq2ヌル変異体の増殖曲線を左のパネルに示す。様々な変異を有するヒトCOQ2 cDNA（L16V、P22L、F29L、N336H、V343A、I97T、T267A、又はS297C）を含むpAUR123ベクターで形質転換した酵母coq2ヌル変異体の増殖曲線を中央のパネルに示す。I97T、T267A、及びS297Cは、野生型COQ2に比較して増殖率がかなり低下したが、coq2ヌル株よりは高い増殖率を示した（中等度に有害な変異）。L16V、P22L、F29L、N336H、及びV343Aは、野生型COQ2と同程度の増殖率を示した。様々な変異を有するヒトCOQ2 cDNA（P49H、S57T、R69H、M78V、M78V-V343A、P107S、S113F、R337X、又はR337Q）を含むpAUR123ベクターで形質転換したcoq2ヌル変異体の増殖曲線を右のパネルに示す。これらは、coq2ヌル株と同様に呼吸依存性増殖率の著しい低下を示した（非常に有害な変異）。それぞれの酵母株は、YPD培地で前培養し、OD600が0.1となるように希釈し、酵素エキス・ペプトン・グリセロール（YPG）培地中で1分間200回振とうしながら23℃で4日間インキュベートした。OD600は10分毎に測定し、インキュベーションタイムにしたがってプロットした。CoQ2活性は、放射性パラヒドロキシベンゾエート（PHB）のデカプレニルPHBへの取り込みを測定して求めた。 図２Ｂは、CoQ2変異体の酵素活性の測定結果を示す。COQ2遺伝子のいずれかの変異（R337Q/V343A、R337X/V343A、V343A/V343A、又はV343A/wt）を有するMSA患者、及び変異を有しない対照者から得たリンパ芽球様細胞におけるCoQ2活性を測定した。各対象の酵素活性（pmol/mg-protein/minute）は、9回の独立した実験の中央値（column）と標準偏差（bar）で示されている。群比較はKruskal-Wallis検定で行い、多重検定にSteel法を用いた。1人の対照者（野生型COQ2ジェノタイプ）に対して* p < 0.05。 図２Ｃは、MSA患者の凍結小脳サンプルにおけるCoQ10濃度を測定した結果を示す。3人のMSA患者（1人のM78V-V343A/M78V-V343Aと2人のV343A/wt）と3人の対照者（wt/wt）の凍結小脳サンプルにおけるCoQ10濃度を測定した。約100mgの脳組織を10倍量（v/wt）の0.32 Mスクロース、1 mM EDTA、及び20% SDSを含む10mM TrisHCl（pH7.4）でホモジナイズした。続いて、ヘキサン／エタノール（5:2 v/v）でCoQ10を抽出し、抽出物中のCoQ10濃度をHPLCで測定し、遊離コレステロール濃度で調整した。 図３は、Andrew J. et al., The American Journal of Human Genetics 84, 558-566, May 15, 2009のFigure 1である。CoQ10の生合成の概要を示す。 図４は、MSA患者を対象としたユビキノールの臨床試験のアウトラインを示す。 図５は、各用量でユビキノールを投与した後の血漿CoQ10濃度（μg/ml）の測定結果を示す。 図６は、各用量でユビキノールを投与した後の単核球中の全CoQ10/遊離コレステロール（nM/μM）の測定結果を示す。 図７は、各用量でユビキノールを投与した後の髄液CoQ10濃度（μg/ml）の測定結果を示す。 図８は、各用量でユビキノールを投与した後の尿中8−OHdG（ng/mg-Cre）の測定結果を示す。 図９は、ユビキノールの臨床評価スケールを示す。 図１０は、ユビキノール投与前後の脳血流量と酸素代謝量の測定結果を示す。
〔MSAリスクの検査方法〕
本発明に係るMSAリスクの検査方法は、被検者から採取した試料における、コエンザイムQ10の生合成を低下させる変異を検出する工程を含む。
本明細書において、MSAリスクの検査方法とは、被検者がMSAを発症する可能性の高さを判定したり、被検者にMSA様の症状が見られる場合に実際にMSAであるか否かを判定したりするために必要な情報を収集するために行う検査の方法をいう。本発明に係る検査方法は、検査会社等で実施されうる。
MSAの臨床病型は特に限定されないが、後述するとおり、本発明に係る方法のうち特定の態様は、MSA-Cの特異的な検出に適している。
本明細書において、CoQ10とは、ユビキノンとも呼ばれるベンゾキノン誘導体を意味する。酸化型がユビキノン、還元型がユビキノールと呼ばれることもあるが、本明細書においてCoQ10は酸化型、還元型のいずれであってもよい。
CoQ10の生合成経路の概略を図３に示す。CoQ2が触媒してパラヒドロキシベンゾエート（PHB）がプレニル化されると、デカプレニルPHBが生じる。このデカプレニルPHBが、さらに多くの補酵素によって様々な修飾を受けてCoQ10が生合成される。
後述する実施例に示されるとおり、本発明者らは、CoQ10の生合成に関連するCOQ2遺伝子の変異がMSAリスクに関与することを解明した。したがって、COQ2の変異に限らず、CoQ10の生合成を低下させる変異は、MSAリスクを増大させる可能性があるものと理解される。CoQ10の生合成を低下させる変異としては、以下で説明するCOQ2の変異に加え、例えばCoQ10の生合成に関与する様々な酵素の変異が挙げられるがこれらに限定されない。当業者は、CoQ10の生合成を低下させる公知の変異や新たに発見された変異を適宜選択して、かかる変異を検出することができる。
本明細書において、被検者から採取した試料は、CoQ10の生合成を低下させる変異を検出できる限りどのような試料であってもよいが、例えば、血液その他の体液、皮膚、組織、細胞等が挙げられる。
CoQ10の生合成を低下させる変異の一例として、CoQ2の発現又は機能を抑制する変異があげられる。
本明細書において、CoQ2は、以下のアミノ酸配列を有する酵素であり、COQ2遺伝子によってコードされる。Para-hydroxybenzoate-polyprenyltransferaseとも呼ばれ、CoQ10の生合成において、デカプレニルピロリン酸からPHBにデカプレニル基を転移する反応を触媒する。

MLGSRAAGFARGLRALALAWLPGWRGRSFALARAAGAPHGGDLQPPACPEPRGRQLSLSAAAVVDSAPRPLQPYLRLMRLDKPIGTWLLYLPCTWSIGLAAEPGCFPDWYMLSLFGTGAILMRGAGCTINDMWDQDYDKKVTRTANRPIAAGDISTFQSFVFLGGQLTLALGVLLCLNYYSIALGAGSLLLVITYPLMKRISYWPQLALGLTFNWGALLGWSAIKGSCDPSVCLPLYFSGVMWTLIYDTIYAHQDKRDDVLIGLKSTALRFGENTKPWLSGFSVAMLGALSLVGVNSGQTAPYYAALGAVGAHLTHQIYTLDIHRPEDCWNKFISNRTLGLIVFLGIVLGNLWKEKKTDKTKKGIENKIEN （配列番号：１）
CoQ10の生合成を低下させるCoQ2の変異としては、例えば、P49H、S57T、R69H、M78V、I97T、P107S、S113F、T267A、S297C、R337Q、R337X、及びV343Aが挙げられる。ここで、49、57等の数字は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の49位、57位等をそれぞれ表し、数字の左に一文字で表記されたアミノ酸は野生型のアミノ酸残基を、数字の右に一文字で表記されたアミノ酸は変異型のアミノ酸残基を示す。R337Xのように、数字の右にアルファベットがない場合、又は数字の右のアルファベットがXである場合は、変異型において当該アミノ酸部分にストップコドンが生じて以降のアミノ酸配列が欠失することを意味する。
これらの変異の中で、V343Aは日本人に特有の変異であった。日本人は、欧米人に比較して、MSA-Cが多いため、V343Aの変異はMSA-Cに関連が高いと考えられる。
なお、ヒトCOQ2遺伝子は、第一エクソンに4つのATGコドンを含む。配列番号：１は、
この4つのATGコドンのうち、4番目を翻訳開始コドンとしたUniProt database（Q96H96, http://www.uniprot.org/uniprot/Q96H96）に従ったものである。
1番目のATGコドンを翻訳開始コドンとするNCBI Reference SequenceのNM_015697.7及びNG_015825.1と、GenBankのBC008804.2のそれぞれを用いて各変異をアノテーションした場合の比較を下表に示す。
これらのアミノ酸の変異は、核酸の変異に基づくものと考えられるので、変異の検出は、ゲノムDNA上の変異を検出することによって行ってもよいし、RNAレベルやタンパク質レベル行ってもよい。被検者の試料に由来するRNAからcDNAを調製して、cDNAにおける変異を検出してもよい。DNAやRNAを単離する方法は特に限定されず、当業者に公知の方法で染色体DNA又はRNAを抽出、単離することが可能である。
核酸の変異を検出する場合、当業者は上述したアミノ酸の変異から、核酸レベルではどのような変異を検出すればよいか容易に特定することができる。
DNAレベルで変異を検出する方法としては、例えば、以下のような方法が用いられる。
(i) PCR-RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）
特定の変異を有する遺伝子は制限酵素による切断によって生じる断片の長さが異なることを利用して、変異を検出する方法であり、例えば以下の手順により行うことができる。被検者から得たゲノムDNAについて、検出しようとする変異を含む領域をPCR法により増幅する。増幅産物に変異部位を認識する制限酵素を作用させ、断片を電気泳動法等により分離、同定する。生じた断片の長さから制限酵素による切断の有無、ひいては変異の有無を確認できる。本方法は、被検者の試料からRNAを抽出し、逆転写酵素によりcDNAを調製して行ってもよい。
(ii) 対立遺伝子特異的PCR
変異を含む領域にハイブリダイズするプライマー（allele-specific oligonuceoide: ASO）を用いてPCRを行い、変異を有する場合、当該プライマーと鋳型DNAとの間にミスマッチが生じるため、アニール温度が高い場合に伸長反応が起こらないことを利用する方法である。増幅産物を電気泳動法等により分離、同定し、増幅の有無を確認することによって、試料DNAの変異の有無を知ることができる。
(iii) 一本鎖DNA高次構造多型（SSCP）法
DNAをPCRで増幅した後、一本鎖に解離させると、一本鎖DNAは塩基対形成をはじめとする種々の分子内相互作用で塩基配列に依存した固有の高次構造をとる。安定な二重らせん構造をとる二本鎖DNAに比べ、一本鎖DNAの高次構造は、一塩基の違いが存在しても変化することがある。そのため一本鎖DNAをポリアクリルアミド中で電気泳動すると、高次構造の違いに応じて移動度も異なり、この移動度の違いを検出することによって変異の有無を判定することができる。
具体的には、例えば、被検者から得られた染色体DNAを、32P等で標識したプライマーを用いてPCRにより増幅する。得られた標識DNA断片を加熱変性して一本鎖DNAとし、これをポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離して、オートラジオグラフィーによりバンドの位置変化を検出する。
(iv) 変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（denaturing gradient gel electrophoresis: DGGE）法
変性剤による変性は二本鎖DNAにミスマッチが存在すると起こりやすくなること、二本鎖DNAが部分的に融解した状態では電気泳動の移動度が著しく低下することを利用して、変異の有無を検出する方法である。
具体的には、尿素、ホルムアミド等の変性剤の濃度に勾配をつけたポリアクリルアミドゲル上で、必要に応じて制限酵素等で処理した被検者のDNAサンプルと、正常DNA断片と、これらに相補的なプローブ核酸との混合物の電気泳動を行ってサンプルを分離する。変異に起因するミスマッチが存在すると、より低い濃度の変性剤で一本鎖に解離するため、変性剤濃度が低いゲル領域で泳動速度が遅くなる。従って、正常DNAサンプルのバンドと比較することによって、ミスマッチの存在の有無を検出することが可能となり、結果として変異の有無を検出することができる。
変性剤の濃度勾配は、垂直につけてもよいし（垂直勾配法）と平行につけてもよい（平行勾配法）。また、DGGEと類似の原理を利用した温度勾配ゲル電気泳動法（temperature gradient gel electrophoresis: TGGE）も開発されている。
(v) マイクロアレイを用いる方法
マイクロアレイ上に固定されたプローブDNAと、DNA又はRNAサンプルとの特異的なハイブリダイゼーションを検出して、変異の有無を解析する方法である。ハイブリダイゼーションの有無を検出する方法や、プローブDNAの3'末端を変異の予想される部位にあわせてハイブリダイゼーションさせ、標識したジデオキシヌクレオチドとDNAポリメラーゼを添加して、伸長反応の有無を検出する方法等がある。標識は、蛍光色素、放射性物質、電気化学的に検出できる化合物等各種選択することができる。
なお、特異的なハイブリダイゼーションとは、通常のハイブリダイゼーション条件で、好ましくは高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下における特異的なハイブリダイゼーションを意味する。本明細書において高ストリンジェントな条件とは、例えば、少なくとも約6×SSC及び1％SDSの65℃溶液中でハイブリダイゼーションを行い、最初の洗浄を42℃の20%(v/v)ホルムアミド（0.1×SSC中）で10分、次の洗浄を65℃の0.2×SSC及び0.1%SDSで行う条件とすることができるが、これに限定されず、当業者は適宜条件を選択することができる。
(vi) Pyrosequencing法
シーケンス反応を化学発光で検出する方法である。被検者由来のDNAをPCRで増幅した後、一本鎖DNAを精製し、適当なプライマーをハイブリダイズさせてからデオキシヌクレオチドを一塩基ずつ添加する。伸長反応に伴って発生するピロリン酸がカスケード反応を開始させ、生じたATPによりルシフェリンを基質としてルシフェラーゼが発光する。この発光を検出することにより被検DNAの塩基配列を決定することができ、高精度に変異を検出できる（Alderborn, A. et al.: Genome Res. (2000) 28:1249-1258）。
(vii) Sanger法
標的DNAとプライマーを用いてDNAを合成する際、４種のデオキシリボヌクレオチド（dNTP）とともに1種のジデオキシリボヌクレオチド（ddNTP）のいずれかを加えておき、ddNTPが取り込まれたときに合成が止まるようにして、様々な長さのDNAを合成する。この反応を4種のジデオキシリボヌクレオチドのそれぞれについて行った後、様々な長さを、ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動にかけて分離する。ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動では1塩基の違いも道程できるので、どの位置で合成が止まったかを検出することにより、標的DNAの塩基配列がわかる。具体的には、各DNAは種々の方法で標識し、サーマルサイクラーを用いたサイクルシーケンス反応等で塩基配列を決定する。DNAの標識方法としては、プライマーを蛍光標識するDye Primer法、ddNTPを蛍光標識するDye Terminator法、基質dNTPを標識するInternal-label法がある。
本発明においては、被検者から得たゲノムDNAを鋳型として、検出しようとする変異を含む領域をPCR法により増幅して標的DNAとすることができる。
(viii) 次世代シーケンサーによる方法
本発明では、被検者から得たゲノムDNAを鋳型として、検出しようとする変異を含む領域をPCR法により増幅し、次世代シーケンサーを用いて配列を解析する方法も用いることができる。次世代シーケンサーは、Sanger法を用いるシーケンサーを「第1世代シーケンサー」とし、これと対比して用いられる用語である。原理は様々なものがあるが、超並列的な処理によって、低コストかつ短時間で大量の塩基配列を解析することができる（例えば、Holt R.A. and Jones S.J.: Genome Res., Vol.18 (6):839-864, 2008）。
変異を検出するためのその他の方法としては、質量分析計（MALDI TOF-MS等）を用いて、質量の違いにより多型を検出する方法；クエンチャーと蛍光色素によって標識されたアレル特異的オリゴと、Taq DNAポリメラーゼを用いたPCR反応を行ってタイピングするTaqMan PCR法；いわゆるインベーダー法；ローリングサークル法；シーケンサーを使用して試料DNAの配列を解析する方法、denatured HPLC法、Melting Temperature解析、PCR-SSOP(sequence-specific oligonucleotide probe)法、PCR-PHFA(preferential homoduplex formation assay)法、PCR-RSCA(reference strand conformation assay)法等も挙げられるがこれらに限定されない。
RNAレベルで変異を検出する方法としては、例えば、以下のような方法が用いられる。
(i) ノーザンブロット法
被検者に由来する試料から常法に従ってmRNAを取り出し、これをグリオキサール、ホルムアミド、ホルマリン、メチル水銀などを含む溶液中で加熱し、分子内の水素結合をはずして、高次構造を壊して線上にする。その後、ホルマリンを含むアガロースゲルで電気泳動する。ゲルを15〜20×SSCの高塩溶液でナイロンメンブレンやニトロセルロースメンブレンにトランスファーする。ニトロセルロースメンブレンの場合は、80℃で約2時間真空オーブンで処理し、RNAを固定する。ナイロンメンブレンの場合は、たとえば紫外線を照射して架橋によりRNAを固定する。
次に、メンブレン上の特定のmRNAを同定するために、クローン化したcDNAからプローブを作製して標識し、プローブとメンブレンを特定条件下で接触させた後、cDNAプローブが結合したmRNAのみを検出できる。ハイブリダイゼーションの条件は、塩濃度、温度、塩基の長さ、組成等によって、当業者が適宜選択することができる。
標的mRNAが微量の場合は、RT-PCR法を組み合わせることもできる。RNA試料に対して、逆転写酵素とオリゴ(dT)プライマーを用いて逆転写反応を行い、得られたcDNAをPCR法により増幅した後、標識した相補的核酸を使用してcDNAを検出する。
(ii) ドットブロット法
ノーザンブロット法の変法であり、被検者に由来する試料から取り出したmRNAを水酸化メチル水銀法等で変成させた後、様々な濃度でニトロセルロース等のフィルターに点（ドット）としてスポッティングし、放射性標識等で標識したプローブとハイブリダイゼーションさせ、シグナルの強さを検出する。プローブに相同性を有する別のmRNAや、目的mRNAとは長さの異なるものを検出する可能性もあるが、ノーザンブロット法よりも簡便である。
(iii) RNase保護アッセイ
RNaseが標的RNAと完全に一致してハイブリダイズした二本鎖RNAは分解しないが、ミスマッチがあるとそこで切断するという性質を利用する方法である。まず、32P等で標識したmRNAをプローブとして試料RNAとハイブリダイズさせたのち、RNaseによって消化する。反応産物をアガロースゲル又はポリアクリルアミドゲル等で電気泳動し、サイズを測定する。転写産物がプローブRNAと完全に相補的であれば、大きな一つのバンドを示すが、ミスマッチが存在する場合、バンドのサイズが小さくなったり、2本以上のバンドが生じたりするので、目的とするRNAの有無を確認できる。
(iv) in situ ハイブリダイゼーション
被検者から得た試料をタンパク質分解酵素や塩酸などで前処理した後、プローブの非特異的な結合を抑えるためにサケ***DNAやアルブミンなどでブロッキングする。その後、標識物質でラベルしたプローブRNAと組織標本とを約24時間かけてハイブリダイズさせ、その後組織標本を洗浄して、オートラジオグラフィーや免疫組織化学的方法により標的部位を検出する。また、標的mRNAが微量の場合には、in situ RT-PCR法が用いられる。逆転写酵素とオリゴ(dT)プライマーを用いて逆転写反応を行い、得られたcDNAをPCR法により増幅した後、標識した相補的核酸を使用してcDNAを検出する。
(v) リアルタイムPCR法
リアルタイムPCR法は、PCR増幅産物を蛍光で検出する方法である。SYBR Greenに代表される二本鎖核酸に特異的に挿入する蛍光標識を用いるインターカレート法と、TaqManプローブに代表される蛍光標識した変異配列特異的なプローブを用いる方法がある。リアルタイムPCR法を用いる場合も、試料中のRNAから逆転写酵素でcDNAを得て、これを鋳型とすることができる。
(vi) DNAマイクロアレイ
その他、RNAレベルでの検出は、DNAマイクロアレイを用いた方法によっても行うことができる。被検者の試料から全RNAを抽出し、目的とする複数の変異を有するRNAのそれぞれと相補的なDNAを固定したDNAマイクロアレイを用いれば、複数の変異を一度に検出することができる。
タンパク質レベルで変異を検出する方法としては、例えば、変異を有するCoQ2と変異を有しないCoQ2のいずれかのみに交差性なく結合する抗体を用いて、抗体との結合の有無を確認するイムノアッセイが挙げられる。かかる抗体は、当業者が公知の方法によって作製することが可能である。抗体との結合の検出は、公知の方法により抗体や二次抗体を標識しておくことによって行うことができる。標識するための物質としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素；125I、131I、35S、3H等の放射性物質；フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等の蛍光物質；ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等の発光物質；その他、金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子が挙げられる。
タンパク質レベルでの変異の検出方法としては、ウエスタンブロッティングも挙げられる。被検者から得た試料をSDSなどで処理し、タンパク質の高次構造を破壊して変成させた後、SDS-PAGEによりタンパク質を分子量に従って分離する。泳動後、ゲルをメンブレン（ニトロセルロース、ナイロン、PVDF等）と重ねて転写装置にセットし、ゲル内に展開したタンパク質のバンドを電気的にメンブレン上に転写（ブロッティング）する。タンパク質への非特異的吸着を防ぐためのブロッキングを行った後、変異を有する又は有しないCoQ2に特異的に結合する抗体と一次反応させる。続いて、発色酵素等で標識した一次抗体分子を特異的に認識する二次抗体を一次抗体と反応させ、二次抗体の検出を介して、標的タンパク質を検出する。
また、本発明において、CoQ10の生合成を低下させる変異の検出として、CoQ2タンパク質の機能の低下を検出してもよい。
CoQ2の機能の低下は、例えば、パラヒドロキシベンゾエートのプレニル化活性の低下を測定して確認することができる。実施例に記載するとおり、CoQ2活性の測定は、PHBを放射性物質で標識し、デカプレニルPHBを検出して行うことができる。
〔MSAリスクの検査キット〕
本発明に係るMSAリスクの検査キットは、以下の(i)から(iii)の少なくとも1つを含む。(i) コエンザイムQ2遺伝子における、コエンザイムQ2タンパク質の49位、57位、69位、78位、97位、107位、113位、267位、297位、337位、及び343位からなる群より選択される部位のアミノ酸をコードする核酸を含む領域にハイブリダイズする核酸；
(ii) コエンザイムQ2遺伝子における、コエンザイムQ2タンパク質の49位、57位、69位、78位、97位、107位、113位、267位、297位、337位、及び343位からなる群より選択される部位のアミノ酸をコードする核酸を含む領域を増幅可能なプライマーセット；及び
(iii) P49H、S57T、R69H、M78V、I97T、P107S、S113F、T267A、S297C、R337Q、及びR337X、V343Aからなる群より選択される少なくとも1つの変異を有するコエンザイムQ2タンパク質と、野生型コエンザイムQ2タンパク質のいずれかのみに交差性なく結合する抗体。
これらの核酸や抗体は、本発明に係るMSAリスクの検査方法に用いることができる。
上記(i)の核酸は、核酸における変異部位に特異的に結合させて、変異の有無を検出することができる。核酸は、例えば5〜100塩基長、10〜50塩基長、15〜30塩基長等とすることができる。核酸の配列は、検出配列に応じて、当業者が適宜設計可能である。
これらの核酸は、固相担体に固定されていてもよい。本明細書において固相担体とは、DNAを固定できる担体であれば特に限定されず、ガラス製、金属製、樹脂製等のマイクロタイタープレート、基板、ビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、PVDFメンブレン等が挙げられる。DNAは、これらの固相担体に公知の方法で固定することが可能である。
上記(ii)の核酸は、PCR法により変異を有する核酸を特異的に増幅することにより、変異の検出を可能にする。各プライマーは、例えば5〜100塩基長、10〜50塩基長、15〜30塩基長等とすることができる。プライマーの配列は、検出配列に応じて、当業者が適宜設計可能である。
上記(iii)の抗体は、変異を有するタンパク質と野生型タンパク質のいずれかに交差性なく結合することにより、CoQ2タンパク質の変異を検出可能にする。抗体は、当業者が公知の方法にしたがって作製できる。抗体は標識してあってもよいし、固相担体に固定されていてもよい。本発明に係るキットは、必要に応じて二次抗体を含んでいてもよい。
なお、当該抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、抗原で免疫した動物から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞等と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマに産生させることができる。ポリクローナル抗体は、抗原で免疫した動物の血清等から得ることができる。本発明に係る検査キットに含まれる抗体は、蛍光物質、放射性物質等で標識しておくこともできる。
このようなキットは、例えば、検出用プローブ、逆転写酵素、各種反応・検出試薬、緩衝液、取扱説明書、二次抗体等をさらに備えていてもよい。
〔MSAの診断方法〕
本発明は、被検者から採取した試料におけるCoQ10の生合成を低下させる変異を検出するMSAの診断方法も包含する。CoQ10の生合成を低下させる変異の検出は、本発明に係る検査方法と同様に行うことができるので、ここでは説明を省略する。
〔MSAの予防又は治療剤、並びに予防又は治療方法〕
本発明に係るMSAの治療剤は、有効成分としてCoQ10を含む。また、本発明に係るMSAの予防又は治療方法は、CoQ10を投与する工程を含む。上述のとおり、MSAの一部では、CoQ10の生合成に関与する酵素の変異によりCoQ10量が減少することが発症に関与する。
MSAの投与形態は特に限定されず、経口的投与でも非経口的投与でもよい。非経口投与としては、例えば、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射等の注射投与、経皮投与、経粘膜投与（経鼻、経口腔、経眼、経肺、経膣、経直腸）投与等が上げられる。
CoQ10は、そのまま投与してもよいし、薬学的に許容できる担体、賦形剤、添加剤等を加えて製剤化してもよい。剤形としては、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤等が挙げられる。
製剤化は、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤、溶解補助剤、着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調整剤、防腐剤、抗酸化剤などを適宜使用し、常法により行うことができる。
製剤化に用いられる成分の例としては、精製水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等薬学的に許容される有機溶剤、動植物油、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ソルビトール、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、コーンスターチ、無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、トラガント、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、高級アルコール、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、等が挙げられるがこれらに限定されない。
丸剤又は錠剤は、糖衣、胃溶性、腸溶性物質で被覆することもできる。
注射剤は、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、アルコール類等を含むことができる。さらに、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解剤、溶解補助剤、防腐剤等を加えることができる。
CoQ10は、MSAに有用な他の医薬や治療法と併用投与してもよい。例えば、現在対症療法に用いられている医薬と組み合わせることができる。
CoQ10は、MSAの予防にも有用である。本発明に係る検査方法でMSAリスクが高いと判断された場合、発症していなくてもCoQ10を補充することによって、発症を防止したり、発症を遅らせたりすることが可能である。CoQ10は、いわゆる健康食品にも用いられており、安全性が高く副作用も少ないので、継続的に服用することが可能である。
CoQ10をヒトに投与する場合、投与量は、患者の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与間隔、有効成分の種類、製剤の種類によって異なり、特に限定されないが、例えば、30MG〜2000MG、40MG〜1500MG、100MG〜1200MGを1回又は数回に分けて投与することができる。
〔MSAの予防又は治療薬のスクリーニング方法〕
本発明に係るMSAの予防又は治療薬のスクリーニング方法は、多系統萎縮症の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、候補化合物と細胞とを接触させる工程と、細胞内のコエンザイムQ10量を上昇させる候補化合物を選択する工程と、を含む。
スクリーニング方法に用いられる細胞は、CoQ10が生合成される細胞であれば特に限定されないが、例えば、リンパ芽球様細胞などが挙げられる。
候補化合物も特に限定されず、低分子化合物、高分子化合物、核酸、タンパク質等でありうる。これらの候補化合物と細胞とを接触させてインキュベートする際の温度や時間を含む実験条件は、当業者が適宜決定することができる。例えば、CoQ10の生合成に関与する物質の機能を亢進させる候補化合物や、CoQ10の生合成に関与する物質の機能を低下させる物質の機能を阻害する候補化合物などが考えられる。
細胞内のCoQ10量が上昇するか否かも、当業者が公知の方法にしたがって行うことができる。CoQ10活性を測定して、量を評価してもよい。
〔CoQ2タンパク質をコードする核酸〕
V343A変異は日本人に特有のものであり、これを研究することにより、さらに発症のメカニズムを解明し、MSAの治療又は予防方法の研究開発に資すると考えられる。V343A変異を含む核酸は、かかる研究開発に有用である。本発明は、さらに、かかる核酸を含む組換えベクター、当該ベクターを含む形質転換体等も包含する。
本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。
１．対象と方法
１−１．ヒトを対象とする研究の承認
被検者は、東京大学及び他の研究参加機関の審査委員会に承認された研究計画に登録された。全ての被検者から書面によるインフォームドコンセントを得た。
１−２．MSA多発家系
MSAの診断は、現在コンセンサスの得られているMSAの診断基準に基づいて行った（Gilman S, et al. Neurology 2008;71:670-6.）。
本発明者らは、これまでに4つの日本のMSA多発家系（FMSA_1からFMSA_4）について報告した（文献12）。MSAを罹患する2組の兄弟がいる2つの新たな日本のMSA家系（FMSA_8及びFMSA_12）を含めて6つのMSA多発家系が本研究に登録された（図１Ａ）。FMSA_1には血族婚があり（両親がfirst degree cousins）、常染色体劣性遺伝の可能性が示唆された。6つのMSA多発家系の臨床所見を表２に示す。FMSA_1のII-4及びII-8とFMSA_8のII-6に生検を実施し、MSAの確定診断とした。
１−３．孤発性MSA患者と対照者
MSAの診断は、現在コンセンサスが得られている基準に従って行った（Gilman S, et al. Neurology 2008;71:670-6.）。日本人コホートは、Japan Multiple System Atrophy Research Consortium (JAMSAC)から試料提供された195人のMSA患者と113人の健常者を含んだ。さらに、東京大学、高齢者ブレインバンク、東京都健康長寿医療センター、新潟大学脳研究所、北海道大学大学院医学研究科、及び鹿児島大学大学院医歯学総合研究科における168人のMSA患者と407人の対照者を、対象とした。
独立したMSAのコホートとして、ヨーロッパと北米のコホートを用いた。ヨーロッパ人のゲノムDNAのサンプルには、ピティエ・サルペトリエール病院（フランス）の138人のMSA患者と281人の対照者、フェデリコ2世大学（イタリア）の34人のMSA患者と34人の対照者、ボン大学（ドイツ）の46人のMSA患者のものが含まれていた。ヨーロッパ人コホートには、シドニー大学の5人のMSA患者のサンプルも含まれた。北米人のゲノムDNAのサンプルには、北米多系統萎縮症研究グループ（North American Multiple System Atrophy Study Group; NAMSA-SG)から試料提供された172人のMSA患者と294人の対照者のものが含まれていた。参加者の統計を表３に示す。
１−４．対照者の独立コホートと他の神経変性疾患コホート
レプリケーションスタディのための対照者の独立コホート（n=2,383）は、Japanese Genetic Study Consortium for Alzheimer Disease（JGSCAD）及びJapanese Consortium for Amyotrophic Lateral Sclerosis research (JaCALS)から提供された。CoQ2変異体とMSAの関連の特異性を調べるために、他の神経変性疾患（アルツハイマー病（AD）、パーキンソン病（PD）、及び筋萎縮性側索硬化症（ALS）患者；JGSCADから2,728人のAD患者、東京大学及びJapanese Parkinson Disease Susceptibility Gene Consortiumから659人のPD患者、東京大学及びJaCALSから634人のALS患者）も調査対象とした。
１−５．関連解析とホールゲノムシーケンス
関連解析は、Affymetrix SNP 6.0 arraysを用いて、FMSA_1に対して行った。FMSA_1のII-4のゲノムDNAサンプルを、Illumina Genome Analyzer IIx (100-bp-long paired ends)で4回分析した。ヒトゲノム参照配列（NCBI36/hg18 assembly）に対するアライメント及び変異の検出には、Burrows Wheeler Aligner (BWA)及びSmatoolsを用いた。
１−６．COQ2遺伝子の変異解析
COQ2遺伝子の各エクソンを増幅するプライマーペア表４を用いてPCRを行い、続いてヌクレオチド配列解析を行った。
Exon 1 Forward primer sequence 配列番号：２
Exon 1 Reverse primer sequence 配列番号：３
Exon 2 Forward primer sequence 配列番号：４
Exon 2 Reverse primer sequence 配列番号：５
Exon 3 Forward primer sequence 配列番号：６
Exon 3 Reverse primer sequence 配列番号：７
Exon 4 Forward primer sequence 配列番号：８
Exon 4 Reverse primer sequence 配列番号：９
Exon 5 Forward primer sequence 配列番号：１０
Exon 5 Reverse primer sequence 配列番号：１１
Exon 6 Forward primer sequence 配列番号：１２
Exon 6 Reverse primer sequence 配列番号：１３
Exon 7 Forward primer sequence 配列番号：１４
Exon 7 Reverse primer sequence 配列番号：１５
１−７．Yeast Complementation SystemによるCOQ2遺伝子の機能解析
野生型ヒトCOQ2遺伝子に対し、表５のプライマー（上から順に、配列番号：１６〜４７）を用いてPCRによる部位特異的変異導入を行った。続いて野生型と変異型のヒトCOQ2遺伝子cDNAを酵母発現型pAUR123ベクター（Takara社）に挿入した。酵母coq2遺伝子ヌル変異体であるBY4741Δcoq2株を、野生型又は変異型ヒトCOQ2遺伝子cDNAを含むpAUR123ベクターで、Yeastmaker Yeast Transformation System 2（Clontech社）を使って形質転換した。非発酵性炭素源を含む培地（酵母エキス・ペプトン・グリセロール培地）中での増殖を、OD monitor（Titech社）で培地の600nmの吸光度（OD600）をモニターすることにより測定した。
１−８．CoQ2活性の測定
CoQ2（EC 2.5.1.39）の活性は、放射性パラヒドロキシベンゾエート（PHB）のデカプレニルPHBへの取り込みを測定することによりアッセイした。具体的には、QProteome Mitochondria Isolation kit（Qiagen社）を用いてリンパ芽球様細胞から調製したミトコンドリア画分を酵素源とした。Lopez-Martinらの方法（Lopez-Martin JM, et al. Hum Mol Genet 2007;16:1091-7.）に従い、500μgのミトコンドリアリッチ画分、1000μM [14C]PHB （1.85 MBq/μmol）、及び5μMデカプレニルピロリン酸を含む100μLのアッセイ用バッファー（0.05% 3-[(3-クロルアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート(CHAPS)を含む）からなる反応液を調製した。反応は37℃で60分行い、1000μLのヘキサンで抽出した。ヘキサン相の放射性物質を液体シンチレーションカウンターTri-Carb 2000CA（PerkinElmer社）で測定した。結果は、9つの独立した実験の平均値で示した。
１−９．組織中のCoQ10レベルの測定
152人のMSA患者と76人の対照者から樹立したEBウイルス不死化リンパ芽球様細胞（JAMSACより提供を受けた）を、10％ウシ胎児血清を含むRPMI-1640培地で培養した。遊離コレステロールとCoQ10を、約107から108個のリンパ芽球様細胞から4倍量の2プロパノールで抽出するか、3人のMSA患者及び3人の対照者の生検によって調製した小脳の凍結サンプルから9倍量の2プロパノールで抽出した。
抽出物中の遊離コレステロールと総CoQ10濃度（ユビキノン10及びユビキノール10）は、高速液体クロマトグラフィーで測定した。
１−１０．統計解析
すべての結果は、平均±標準偏差で示した。キャリアと非キャリアの発症年齢の平均値の有意差は、student t検定で；アレル頻度と分割表の有意差はYates補正カイ2乗検定又はFisherの直接確率検定で、オッズ比と対応する95％信頼区間（CI）はFisherの直接確率検定でそれぞれ評価した。群比較は、Kruskal-Wallis検定とSteel法を用いた。すべての統計は両側検定とし、有意水準はp=0.05とした。
２．結果
２−１．家族性MSAの原因遺伝子の同定
常染色体劣性遺伝様式の遺伝モデルを使ったFMSA_1のパラメトリックな多点連鎖解析によれば、染色体4、5、6、7、9及び13を含む約80Mbにわたる領域におけるLODスコアの最高値は1.93であった（図１Ｂ）。
FMSA_1における患者（II-4）について、ホールゲノムシーケンスを行ったところ、合計で187.5Gbのshort readが得られた。参照ゲノムの平均カバレッジは58倍であった。候補領域に位置する47,830の一塩基変異（SNVs）又は挿入／欠失（indels）から始めて、この家族の変異候補を4つの新規な非同義SNVに絞り込んだ（図１Ｃ）。
4つのSNVは、SHROOM3遺伝子（NM_020859, Q8TF72）のc.2120A>G、p.K707R in、COQ2遺伝子（NM_015697, Q96H96）のc.1178T>C, p.V343A、COQ2遺伝子のc.382A>G, p.M78V、及びSCEL遺伝子（NM_144777, O95171）のc.691A>G, p.R231Gであった。
180人の日本人対照者をスクリーニングしたところ、COQ2遺伝子のM78Vのみが対照者には見られず、SHROOM3遺伝子のK706R、COQ2遺伝子のV343A及びSCEL遺伝子のR231Gのアレル頻度は、それぞれ3/360、5/360、及び98/360であった。家族性MSAが非常に珍しいことから、CoQ10の生合成に関与するパラヒドロキシベンゾエート・ポリプレニルトランスフェラーゼをコードするCOQ2遺伝子の変異であるM78Vが、家族性MSAの常染色体劣性遺伝の原因である可能性が高いと考えた。FMSA_1の同時分離解析により、2人の患者（II-4及びII-8）はCOQ2遺伝子におけるM78VとV343Aのホモ接合体を有し、罹患していない兄弟（II-7）は野生型配列を有することがわかった（図１Ｄ）。
これらの知見に基づき、他の複数のMSA家系においてCOQ2遺伝子のコード領域とそれに接するスプライス領域のヌクレオチド配列の直接解析を行った。さらに、FMSA_12における患者の兄弟（II-3及びII-4）において、COQ2遺伝子のナンセンス変異（c.1159C>T, p.R337X）及びミスセンス変異（c.1178T>C, p.V343A）のヘテロ接合体を発見した。FMSA_12の同時分離解析により、彼らの母親（I-2）がV343Aのヘテロ接合体を有すること、罹患していない兄弟（II-1）が野生型配列を有していたこと、別の罹患していない兄弟（II-2）がR337Xのヘテロ接合体を有していたことを発見し、2人の患者である兄弟（II-3及びII-4）が、R337XとV343Aの複合ヘテロ接合体を有していることを確認した。R337Xは、180人の日本人の対照者には見られなかった。他の4つのMSA家系（FMSA_2、FMSA_3、FMSA_4、及びFMSA_8）では、COQ2遺伝子の変異は見出されなかった。
以上の結果から、FMSA_1及びFMSA_12の2家系の家族性MSAでは、M78VとV343Aのホモ接合体、又はR337XとV343Aの複合ヘテロ接合体を有すると、これが十分条件となってMSAが発症することがわかった。
２−２．CoQ2変異体と孤発性MSAとの関連
孤発性MSAに対するCOQ2遺伝子変異の関与を調べるため、より大きな日本人コホート（363人のMSA患者と520人の対照者）について、COQ2遺伝子のリシーケンスを行った。dbSNP130に登録された非同義COQ2遺伝子変異体は一つだけであった（L16V、rs6818847）が、本発明者らは、L16Vのアレル頻度が日本人のMSA患者においては0.90、日本人の対照者においては0.88であることを確認したため、この変異体をその後の解析に含めなかった。
COQ2遺伝子のリシーケンスにより、4人のMSA患者が2つの変異を同時に有していたが（1人はI97T/V343A、1人はR337Q/V343A、2人はV343A/V343A）、対照者には2つの変異をCOQ2遺伝子に有する者は存在しないことが明らかとなった（表６）。
サブクローニングされた変異アレルのヌクレオチド配列解析により、R337Q/V343Aは複合ヘテロ接合体であることがわかった。I97TとV343Aは距離が大きすぎてPCRで増幅できず、両親からのゲノムDNAサンプルも入手できなかったため、I97T/V343Aの相を決定することはできなかった。29人のMSA患者がV343Aのヘテロ接合体を有し、2人のMSA患者が別のヘテロ接合変異（P107S及びS113F）を有していることを確認したが、17人の対照者もV343Aのヘテロ接合体を含み、2人の対照者が別のヘテロ接合体変異（P22L及びN336H）を有することも確認した。
COQ2遺伝子変異体のうちV343Aは、日本人では比較的よく見られる変異であった。表７に示されるとおり、V343Aのアレル頻度は、日本人のMSA患者においては35/726（4.8％）であり、日本人の対照者においては17/1,040（1.6%）であること、また、対照者と比較したMSA患者のオッズ比は3.05（95％C.I.、1.65〜5.85）で有意（p=1.5×10-4）であることを確認した。さらに、日本人の対照者の第二コホート（n=2,383）においてさらにV343Aのジェノタイピングを行ったところ、対照者におけるV343Aのアレル頻度は106/4,766（2.2%）であり、対照者の第二コホートと比較したMSA患者のオッズ比は、2.23（95% C.I.、1.46〜3.32、p=6.0×10-5）となった。

AD、PD及びALSを含む他の神経変性疾患のジェノタイピングにより、V343Aのアレル頻度はAD患者において109/5,456 (2.0%)（うち2人はV343Aのホモ接合体を有した）、PD患者において33/1,318 (2.5%)、ALS患者において31/1268 (2.4 %)であった。これらのアレル頻度は、対照者の第一及び第二コホートにおいては有意差が見られず、COQ2遺伝子のV343A変異のMSAに対する特異性が確認できた。
次に、我々は、欧米人のMSAコホートを解析した。ヨーロッパ人コホートにおいては、各MSA患者で4つのシングルトン変異（F29L、S57T、T267A、及びS297C）を見出したが、CoQ2の変異を有する対照者はいなかった（表６）。北米コホートにおいては、1人のMSA患者に1つのシングルトン変異（P49H）を見出し、1人の対照者においても1つのシングルトン変異（R69H）を見出した（表６）。興味深いことに、日本人群では比較的よく見られる変異であるV343Aは、欧米人ではMSA患者群にも対照者群にも見られなかった。いずれのコホートでもV343A以外の変異体は稀であったことから（表６）、次に、コホートを組み合わせて、COQ2遺伝子変異と機能障害との関連に着目してこれらの変異体とMSAとの関係を調べた。
２−３．yeast complementary assayによるCOQ2遺伝子変異体の機能解析
CoQ10の生合成と好気的エネルギー産生に対する、各変異の機能への影響を調べるために、酵母coq2遺伝子ヌル変異体を、野生型又は変異型ヒトCOQ2遺伝子cDNAで形質転換して、機能相補性解析を行った（図２Ａ）。BY4741Δcoq2酵母株の変異COQ2遺伝子（P49H、S57T、R69H、M78V、M78V-V343A、P107S、S113F、R337Q及びR337Xを含む）による形質転換体においては、coq2ヌル株に見られるのと同様に、呼吸依存性増殖が著しく低下した（非常に有害な変異）。さらに、変異型COQ2 cDNA（I97T、T267A及びS297Cを含む）による形質転換体は、野生型CoQ2を発現する形質転換体に比べてかなり低いが、coq2ヌル株よりは高い増殖率を示した（中等度に有害な変異）。変異型COQ2 cDNA（L16V、P22L、F29L、N336H及びV343Aを含む）による形質転換体は、野生型CoQ2を発現する形質転換体と同等の増殖率を示した。
患者−対照者コホートで同定された稀な変異体に着目すると、yeast complementation assayにおいて、9つ変異体（P49H、S57T、R69H、I97T、P107S、S113F、T267A、S297C及びR337Q）が中等度から重度に有害なものと認められた。これらの機能的に有害な稀な変異体について、3つのコホートを併せて解析したところ、8つの変異（P49H、S57T、I97T、P107S、S113F、T267A、S297C及びR337Q）がMSAコホート（n=758）において同定され、対照者コホート（n=927）では1つだけ変異が同定された（R69H）。MSA患者における、対照者と比較した、有害な変異体のアレル頻度のオッズ比は9.83（95% C.I., 1.31〜436.4）で、有意であった（p=0.014）（表７）。
２−４．リンパ芽球様細胞におけるCoQ2活性
次に、COQ2変異を有するリンパ芽球様細胞が入手できるものについて、V343A変異体との関連でCoQ2活性を測定した。V343Aは、MSAによく関連する変異であり、この変異体がyeast complementation assayにおいて通常の増殖を示したので選択した。CoQ2変異（R337Q/V343A、R337X/V343A、V343A/V343A、またはV343A/wt）のいずれかを有するMSA患者から得たリンパ芽球様細胞と、変異を有しない対照者から得たリンパ芽球様細胞におけるCoQ2活性を測定した。これらの患者におけるCoQ2活性は、変異を有しない対照者と比較して著しく低かった（図２Ｂ）。V343A変異体におけるCoQ2活性は、yeast complementation analysisにおいて、V343A変異COQ2 cDNAで形質転換した酵母coq2ヌル株が通常の増殖速度を示したにもかかわらず、著しく減少していた。
２−５．ジェノタイプとフェノタイプの関連
COQ2遺伝子変異（yeast complementation assay及びCoQ2活性測定において確認された機能損失したCoQ2）のキャリアである孤発性MSA患者と、非キャリアの孤発性MSA患者の臨床的特徴を表８に示す。

キャリア群のMSA発症年齢の平均は非キャリア群より高く、その差は有意であった。（p=0.0021）。臨床病型は、34人のキャリアがMSA-C、5人のキャリアがMSA-P、1人のキャリアがいずれにも分類されない型であり、468人の非キャリアがMSA-C、209人の非キャリアがMSA-P、42人の非キャリアがいずれにも分類されない型であった。MSA-Pに対するMSA-Cの比は、2×2分割表を用いたFisherの直接確率検定で求めたところ、CoQ2変異のキャリアにおいて非キャリアより有意に高かった（p=0.018）（表８）。
２−６．リンパ芽球様細胞における細胞内CoQ10濃度
V343AキャリアのMSA患者から得たリンパ芽球様細胞、変異を有しないMSA患者から得たリンパ芽球様細胞、及び変異を有しない対照者から得たリンパ芽球様細胞における細胞内CoQ10濃度を測定した。対象者は（1）2つの変異アレル（R337Q/V343A、R337X/V343A、及びV343A/V343A）のキャリアであるMSA患者、（2）V343Aのヘテロ接合体のキャリアである16人のMSA患者、（3）変異を有しない133人のMSA患者、及び（4）変異を有しない76人の対照者に分けた（表９）。
2つの変異アレルのキャリアであるMSA患者から得たリンパ芽球様細胞内CoQ10濃度は、変異を有しない対照者よりかなり低かった。V343Aのヘテロ接合体を有するMSA患者では、変異を有しない対照者に比較して、細胞内CoQ10濃度が低下している傾向が見られたが、有意な差ではなかった。COQ2変異を有しないMSA患者のリンパ芽球様細胞内CoQ10濃度は、COQ2変異を有しない対照者と同等であった。
２−７．脳組織における細胞内CoQ10濃度
COQ2変異を有するMSA患者から得られる脳組織の数は限られているが、COQ2変異を有する3人の患者（1人はM78V-V343A/M78V-V343A、2人はV343A/wt）の凍結脳組織と、変異を有しない対照者の凍結脳組織におけるCoQ10濃度を測定した（図２Ｃ）。M78V-V343Aのホモ接合体を有するMSA患者におけるCoQ10濃度は、変異を有しない対照者と比較して有意に低かった。
３．MSA患者を対象としたユビキノールの臨床試験
３−１．試験薬と投与方法
家族性MSAの発症者で，COQ2遺伝子のR337X/V343A複合ヘテロ接合性変異を有する患者1例（図1に示すFMSA_12のII-4）を対象として、ユビキノールの臨床試験を行った。
カネカから提供を受けたユビキノール（2-[(2E,6E,10E,14E,18E,22E,26E,30E,34E)-3,7,11,15,19,23,27,31,35,39-decamethyltetraconta-2,6,10,14,18,22,26,30,34,38-decaenyl]-5,6-dimethoxy-3-methylcyclohexa-2,5-diene-1,4-diol）として、120mg含有する安定粉末を、規定の用量（600mg、840mg、1200mg）に従い、胃瘻チューブから朝一回投与した。
３−２．試験のデザイン・目的
対象1例で対照を設定しない非盲検の探索的臨床試験であり、以下の事項の検討を目的として行った。
１．高用量投与の安全性を確認する
２．薬物動態を調べる
３．薬物動態から長期投与の用量を判断する
４．臨床指標を検討する
３−３．試験の評価項目
試験の評価項目は以下のとおりである。
(1) 主要評価項目（Primary endpoint）
・血漿および白血球中，髄液中コエンザイムQ10濃度
・有害事象の有無
(2) 副次的評価項目（Secondary endpoint）
・UMSARS Part II（運動機能の評価）
・尿中8-OHdG
・15O-PETによる酸素代謝能の評価
(3) 安全性評価項目
・肝機能検査（AST，ALT，γ-GTP，ALP，T.Bil）
ラットにコエンザイムQ10を300mg/kg投与したところ，AST，ALTが軽度上昇したという報告があるため。
・自覚症状，身体診察・神経学的診察による他覚所見
・施行される各種検査値の異常
３−４．試験のアウトライン
試験のアウトラインを図４に示す。
３−５．短期投与試験の結果
・有害事象について
試験期間中，自覚症状・他覚症状の有無，臨床検査（血算，生化学的検査：AST，ALT，γ-GTP，ALP，T.Bil, BUN, Cre, Na, K, Cl, Glu, CK）について経時的な観察をした。
試験薬に関連すると判断される有害事象は生じなかった．
３−６．血漿CoQ10濃度
血漿CoQ10濃度の測定結果を図５に示す。
ベースの血漿CoQ10濃度は低いレベルであった。1200mg投与で、既報告におけるプラトーに達した。ユビキノンの高用量投与の既報告では、ユビキノンとして2400mg以上の投与によって、7.5〜8.0μg/mlでプラトーに達している。本試験では、ユビキノール1200mgで7.9μg/mlに達しており、既報告のデータに照らしてプラトーと判断された。
３−７．単核球中の遊離コレステロールに対する全CoQ10量
単核球中の全CoQ10/遊離コレステロール（nM/μM）の測定結果を図６に示す。ユビキノール投与により、用量依存的に、単核球中の全CoQ10/遊離コレステロールが上昇していることが確認された。
３−８．髄液CoQ10濃度
髄液CoQ10濃度（μg/ml）を測定した結果を図７に示す。ユビキノン・ユビキノール投与時の髄液CoQ10濃度の変化は報告がない。ベースの髄液CoQ10濃度は低いレベルであったが、840mg，1200mg投与群でプラトーに達しているように見えた。
３−９．尿中8−OHdG
尿中8−OHdG（ng/mg-Cre）の測定結果を図８に示す。ベースの尿中8−OHdGは高いレベル（平均8.4, n=500）であったが、ユビキノール投与により低下した。用量依存性は明確には見られなかった。
３−１０．臨床評価スケール
臨床評価スケールを図９に示す。軽微な変動はあったが、統計的に有意と判断できる変化は認められなかった。担当医、家族（妻）からの呼びかけに対する反応の改善、上肢の拳上の改善、四肢の震えの軽減との感想が得られた。但し、主観的なバイアス、入院中のリハビリ効果など複合的な要素があり、判断は困難であった。
３−１１．脳血流量・酵素代謝量
脳血流量と酵素代謝量の測定結果を図１０に示す。いずれも投与後に上昇する傾向が見られた。
３−１２．まとめ
今回の試験で以下の点が初めて明らかになった。
１．高用量投与においても、ユビキノールはユビキノンに比べ、bioavailabilityが高い。
２．ユビキノール1200mgで、血漿CoQ10はプラトーに達すること。先行研究で観察されている血漿CoQ10のプラトーに一致する結果が観察された。このことは、投与されたCoQ10が血漿へ移行することを示す。
３．ユビキノール投与により、末梢血単核球のCoQ10含量が上昇することが確認できた。このことは、投与されたCoQ10が細胞内に移行することを示す。
４．ユビキノール投与により、髄液CoQ10濃度、正常コントロールの髄液CoQ10濃度を超える値まで上昇することが確認された。このことは、投与されたCoQ10が髄液へ移行することを示す。
５．２〜４．より、投与されたCoQ10が、CoQ10の低下を補うことができることが示された。
５．ユビキノール1200mgの2週間投与で、有害事象は観察されなかった。
６．[15O]O2 PETの評価によって、脳酸素消費量が投与前に比べて明らかに改善した。CoQ10補充により、中枢神経系の機能改善を評価するサロゲートマーカーになる可能性が示唆された。

Claims (9)

  1. 被検者の多系統萎縮症リスクの検査方法であって、被検者から採取した試料におけるコエンザイムQ10の生合成を低下させる変異を検出する工程を含む、方法。
  2. 前記コエンザイムQ10の生合成を低下させる変異は、Para-hydroxybenzoate-polyprenyltransferase（コエンザイムQ2）の発現又は機能を抑制する変異である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記コエンザイムQ2の発現又は機能を抑制する変異は、配列番号：１におけるP49H、S57T、R69H、M78V、I97T、P107S、S113F、T267A、S297C、R337Q、R337X、及びV343Aからなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
  4. 前記コエンザイムQ2の発現又は機能を抑制する変異は、V343Aである、請求項２に記載の方法。
  5. 多系統萎縮症リスクの検査キットであって、以下の(i)から(iii)の少なくとも1つを含むキット：
    (i) コエンザイムQ2遺伝子における、コエンザイムQ2タンパク質（配列番号：１）の49位、57位、69位、78位、97位、107位、113位、267位、297位、337位、及び343位からなる群より選択される部位のアミノ酸をコードする核酸を含む領域にハイブリダイズする核酸；
    (ii) コエンザイムQ2遺伝子における、コエンザイムQ2タンパク質（配列番号：１）の49位、57位、69位、78位、97位、107位、113位、267位、297位、337位、及び343位からなる群より選択される部位のアミノ酸をコードする核酸を含む領域を増幅可能なプライマーセット；及び
    (iii) 配列番号：１において、P49H、S57T、R69H、M78V、I97T、P107S、S113F、T267A、S297C、R337Q、R337X、及びV343Aからなる群より選択される少なくとも1つの変異を有するコエンザイムQ2タンパク質と、野生型コエンザイムQ2タンパク質のいずれかのみに交差性なく結合する抗体。
  6. コエンザイムQ10を含む多系統萎縮症の予防又は治療剤。
  7. コエンザイムQ10を投与する工程を含む、多系統萎縮症の予防又は治療方法；
  8. 多系統萎縮症の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、
    候補化合物と細胞とを接触させてインキュベートする工程と、
    細胞内のコエンザイムQ10量を上昇させる候補化合物を選択する工程と、を含む方法。
  9. V343A変異を含むコエンザイムQ2タンパク質をコードする核酸。
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