JPWO2014042226A1 - 抗原特異的ヘルパーt細胞レセプター遺伝子 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)配列番号:1、3、5、8、10、11、13、14、16、18、20、22、23、25、27、28、30、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、56、58からなる群より選択される塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、配列番号:123に示されるアミノ酸配列またはその変異配列を有するWT1ヘルパーペプチド(WT1332ペプチド)に特異的なCD4+ヘルパーT細胞のTCRのα鎖のCDR3をコードするポリヌクレオチド(αCDR3ポリヌクレオチドという)。
(2)配列番号:2、4,6、7、9、12、15、17、19、21,24、26、29、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、57、59からなる群より選択される塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、WT1332ペプチドに特異的なCD4+ヘルパーT細胞のTCRのβ鎖のCDR3をコードするポリヌクレオチド(βCDR3ポリヌクレオチドという)。
(3)αCDR3ポリヌクレオチドおよびβCDR3ポリヌクレオチドの組であって、各ポリヌクレオチドが下記の塩基配列を有するものであるポリヌクレオチドの組:
αCDR3ポリヌクレオチド βCDR3ポリヌクレオチド
配列番号:1 配列番号:2
配列番号:3 配列番号:4
配列番号:5 配列番号:6
配列番号:3 配列番号:7
配列番号:8 配列番号:9
配列番号:10 配列番号:12
配列番号:11 配列番号:12
配列番号:13 配列番号:15
配列番号:14 配列番号:15
配列番号:16 配列番号:17
配列番号:18 配列番号:19
配列番号:20 配列番号:21
配列番号:22 配列番号:24
配列番号:23 配列番号:24
配列番号:25 配列番号:26
配列番号:27 配列番号:4
配列番号:28 配列番号:29
配列番号:30 配列番号:32
配列番号:31 配列番号:32
配列番号:33 配列番号:34
配列番号:35 配列番号:36
配列番号:37 配列番号:38
配列番号:39 配列番号:40
配列番号:41 配列番号:42
配列番号:43 配列番号:44
配列番号:45 配列番号:46
配列番号:47 配列番号:48
配列番号:49 配列番号:50
配列番号:51 配列番号:52
配列番号:53 配列番号:54
配列番号:55 配列番号:57
配列番号:56 配列番号:57
配列番号:58 配列番号:59
ただし、上記配列はその相補配列または縮重配列であってもよい。
(4)(3)に記載したいずれかの組のαCDR3ポリヌクレオチドおよびβCDR3ポリヌクレオチドを含むTCR遺伝子。
(5)WT1332ペプチドに特異的なCD4+T細胞から得られる(4)に記載したTCR遺伝子。
(6)(4)に記載したTCR遺伝子をCD4+T細胞に導入することを特徴とする、WT1332ペプチドに特異的なCD4+ヘルパー細胞の製造方法。
(7)(5)に記載した方法により得られるCD4+ヘルパーT細胞。
(8)(3)に記載したいずれかのポリヌクレオチドの組のαCDR3ポリヌクレオチドおよびβCDR3ポリヌクレオチド含むTCR遺伝子を含むベクター。
(9)該導入が(8)に記載のベクターを用いて行われる(6)記載の方法。
(10)(7)に記載したCD4+ヘルパーT細胞と末梢血単核細胞を共培養することを特徴とする、WT1特異的CTLの誘導増強方法。
(11)(10)に記載した方法により得られるWT1特異的CTL。
(12)(7)に記載したCD4+ヘルパーT細胞を対象に導入することを特徴とする、対象における癌の治療または予防方法。
(13)(7)に記載したCD4+ヘルパーT細胞を含有する、癌の治療または予防のための医薬組成物。
(14)癌の治療または予防のための医薬の製造のための、(7)に記載したCD4+ヘルパーT細胞の使用。
(15)(1)に記載したαCDR3ポリヌクレオチド、(2)に記載したβCDR3ポリヌクレオチド、あるいは(1)に記載したαCDR3ポリヌクレオチドおよび(2)に記載したβCDR3ポリヌクレオチドの両方を含むDNAチップ。
(16)(15)に記載のDNAチップを用いることを特徴とする、検体中のWT1332ペプチドに特異的なCD4+ヘルパーT細胞の頻度測定方法。
(17)(1)に記載されたいずれかのαCDR3ポリヌクレオチドによりコードされるαCDR3ペプチド。
(18)(2)に記載されたいずれかのβCDR3ポリヌクレオチドによりコードされるβCDR3ペプチド。
(19)(3)に記載されたポリヌクレオチドのいずれかの組によりコードされるペプチドの組。
(20)(17)もしくは(18)に記載のペプチドまたは(19)に記載のペプチドの組を含むチップ。
(21)(17)〜(19)のいずれかに記載のペプチドに対する抗体。
(22)(21)に記載の抗体を用いることを特徴とする、検体中のWT1332ペプチドに特異的なCD4+ヘルパーT細胞の頻度測定方法。
配列番号:1−59は、CD4+ヘルパーT細胞クローンのTCRに含まれるCDR3をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号:60−118は、CD4+ヘルパーT細胞クローンのTCRに含まれるCDR3のアミノ酸配列である。
配列番号:119は、TCRα鎖増幅用のリバースプライマーである。
配列番号:120は、TCRβ鎖増幅用のリバースプライマーである。
配列番号:121は、TCRβ鎖増幅用のリバースプライマーである。
配列番号:122は、CDR3ヌクレオチド配列決定用のプライマーである。
配列番号:123は、WT1332ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号:124は、HIVペプチドのアミノ鎖配列である。
配列番号:125は、天然WT1ペプチドの変異体のアミノ酸配列である。
実験手順は以下のとおりであった。
(i)健常人由来末梢血単核球(PBMC)を採取し、24穴プレートに3×106 cells/wellで播く。メディウムは10% AB serum、40IU/ml IL−2添加X−VIVO 15メディウムを用いる。
(ii)上記iにWT1332ペプチドを終濃度20μg/mlで添加し7日間培養する。
(iii)7日後、細胞を回収し10% AB serum添加X−VIVO 15メディウムで1×107 cells/mlとなるように調製し、それを100μlずつ丸底96穴プレートに播く。
(iv)10% AB serum添加X−VIVO 15メディウムにWT1332ペプチド、BD GolgiStopTM (BD Bioscience)およびCD28/CD49d Costimulatory Reagent (BD Bioscience)をそれぞれ終濃度40μg/ml、終濃度4μg/mlおよび終濃度4μg/mlになるように添加する。
(v)上記ivを100μlずつ上記iiiに加える。
(vi)上記vに抗−ヒトCD154−APC標識抗体(BD Bioscience)を10μlずつ加えて、37℃、5% CO2インキュベーターで6時間インキュベーションする。
(vii)インキュベーション後、細胞を回収し、抗−ヒトCD4−APC−H7標識抗体(BD Bioscience)、抗−ヒトCD3−Pacific Blue標識抗体(BD Bioscience)および死細胞を除くために7−AAD(eBioscience)で染色する。
(viii)3人の健常人からPBMCを採取・混合し、30Gyのγ線を照射し終濃度10% AB serum、終濃度100IU/ml IL−2、終濃度3μg/ml PHA添加X−VIVO 15メディウムで1×106 cells/mlとなるように調製する。これを100μlずつ丸底96穴プレートに播く。
(ix)FACSAria cell sorterを用いて7−AAD−CD3+CD4+CD154+細胞分画、つまりWT1332特異的CD4+T細胞が含まれる細胞分画を上記viiiの各ウェルにシングルセルソーティングする。
(x)10〜14日間の培養後、増殖してきた各ウェルの細胞を独立したCD4+T細胞クローンとする。
(i)上記(1)−xの各CD4+T細胞クローンを3×105 cells/mlとなるように1% AB serum添加X−VIVO 15メディウム中に調製する。
(ii)WT1332をパルスした、もしくはペプチドを何もパルスしていない自己(autologous)PBMCに30Gyのγ線を照射し、1×106 cells/mlとなるように1% AB serum添加X−VIVO 15メディウム中に調製する。
(iii)上記(2)−iおよびiiを100μlずつ丸底96穴プレートに播く。
(iv)2日間の培養後、各ウェルに3H−チミジンを1μCi/wellになるように添加する。
(v)18時間後に各CD4+T細胞クローンに取り込まれた3H−チミジンを測定し、WT1332特異的な増殖反応を示すCD4+T細胞クローンを選び出す。これをWT1332特異的CD4+T細胞クローンとする。
(vi)WT1332特異的CD4+T細胞クローンの培養は1〜2週間に一度くらいの頻度でWT1332をパルスした自己(autologous)PBMCに30Gyのγ線を照射したものと共培養することで、WT1332特異的CD4+T細胞クローンを刺激し行う。
(i)WT1332特異的CD4+T細胞クローンを最後の刺激から10日間以上培養する。これは刺激に用いる自己(autologous)PBMCに含まれるT細胞の混入を防ぐためである。
(ii)WT1332特異的CD4+T細胞クローンをペレットにし、そこにTRIzol試薬(Invitrogen)を加えて、そのマニュアルに従ってRNAを抽出する。
(iii)上記(3)−iiで抽出したRNAをクロンテック社SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kitを用いてcDNAを合成する。
(iv)上記(3)−iiiで合成したcDNAを鋳型にしてTCR α鎖およびβ鎖遺伝子を増幅する。用いるプライマーはSMARTerTM RACE cDNA Amplification Kitに付属のUPMプライマーをフォワードプライマーとし、以下のTCR特異的プライマーをリバースプライマーとした:
Cα3’UTR-primer: 5’-CAC AGG CTG TCT TAC AAT CTT GCA GAT C-3’ (配列番号:119)
Cβ1-3’UTR-primer: 5’-CTC CAC TTC CAG GGC TGC CTT CA-3’ (配列番号:120)
Cβ2-3’UTR-primer: 5’-TGA CCT GGG ATG GTT TTG GAG CTA-3’ (配列番号:121)。
(v)TCR遺伝子の増幅にはToYoBo社のKOD FXを用いて、94℃、3min→(98℃、10sec→68℃、1min)×35サイクル、の条件で行った。
(vi)PCR産物の大きさをアガロースゲル電気泳動を用いて確認し1kbp付近のバンドをゲルから切り出して精製する。
(vii)上記(3)−viの精製済みPCR産物にアデニンをTaq polymeraseを用いて付加した後、pCR2.1ベクター(Invitrogen)にライゲーションする。
(viii)上記(3)−viiをコンピテントセルHST02に形質転換し、シングルコロニーからプラスミドを精製したのち、シークエンスを行う。
(ix)シークエンスの解析はThe International Immunogenetics Information System(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest?livret=0&Option=humanTcR)を用いて行い各TCR遺伝子を同定する。
T細胞クローンからのRNA抽出はTRIzol Reagent(Invitrogen社)を用いて行った。用いるT細胞クローンはフィーダー細胞の混入を防ぐ目的で、3週間以上IL−2存在下で抗原刺激を加えないで培養したものを準備した。抽出されたRNAはRNase−free waterに溶かし、−80℃で保存した。
TCR α/βのクローニングにはSMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech社)を用いた。まず最初に、そのマニュアルに従い5’−RACE反応を行い1stストランドcDNAを合成した。その後、完全長TCR α鎖およびβ鎖cDNAを得るために、それぞれの3’UTR (Untranslated Region)に特異的なリバースプライマーとキットに付属のユニバーサルプライマー(UPM)を用い、合成された1stストランドcDNAを鋳型としてPCR反応を行った。使用したリバースプライマーは以下の通りである。
Cα 3’UTR-RACE-primer: CACAGGCTGTCTTACAATCTTGCAGATC (配列番号:119)
Cβ1 3’UTR-RACE-primer: CTCCACTTCCAGGGCTGCCTTCA (配列番号:120)
Cβ2 3’UTR-RACE-primer: TGACCTGGGATGGTTTTGGAGCTA (配列番号:121)
また、PCR反応はKOD FX(TOYOBO社)を用いて以下の反応液組成で行った。
2ページ前のプライマー、つまり、Cα3’UTR-primer、Cβ1-3’UTR-primerおよびCβ2-3’UTR-primerと同じものなので、名前をどちらかに統一したほうがいいかと思いますが、いかがでしょう。
形質転換されたHST02コンピテント細胞は、アンピシリン/LBプレートに播種され、37℃でインキュベーションされた。その後、シングルコロニーをアンピシリン/LB液体培地に取り、37℃,200rpmで撹拌しつつインキュベーションした。その後、大腸菌液からプラスミドをAUTOMATIC DNA ISOLATION SYSTEM PI−50(KURABO社)を用いて精製した。
精製したプラスミドのシークエンスにはBigDye(登録商標) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems社)を用いた。またプライマーにはM13リバースプライマー:
caggaaacagctatgac (配列番号:122)
を使用した。TCRおよびCDR3の解析には、IMGT/V−QUEST(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/)を利用した。
WT1332特異的CD4+T細胞由来T細胞受容体(TCR)遺伝子を導入されたヒトCD4+T細胞はWT1332特異的かつHLAクラスII拘束性に増殖反応およびサイトカイン産生を示すことを確認した。
WT1332−TCR−transduced CD4+T細胞のサイトカイン発現に及ぼすWT1332ペプチド濃度の影響を調べた。WT1332−TCR−transduced CD4+T細胞を各種濃度のWT1332ペプチドにて4時間刺激し、細胞内サイトカイン染色アッセイを行って、CD4+T細胞に対するTNF−α産生CD4+T細胞の割合を調べた。結果を図2Cに示す。サイトカイン産生はWT1332ペプチド濃度依存的であり、ED50は4.85μMであった。
WT1332−TCR−transduced CD4+T細胞の増殖能を調べると、WT1332特異的に強い増殖能が認められ、その増殖反応はanti−HLA−DP抗体で顕著に抑制された(図2D)。
次に、WT1332ペプチドをパルスした自己のPBMC、全長のWT1蛋白をパルスした自己のPBMC、短縮されたWT1蛋白(WT1332配列を含まない)をパルスした自己のPBMC、PHA−blastの溶解物をパルスしたPBMC、WT1を発現する白血病細胞株TF−1の溶解物をパルスしたPBMC、WT1を発現する白血病細胞株K562の溶解物をパルスしたPBMCに対するWT1332−TCR−transduced CD4+T細胞の増殖応答およびIFN−γ産生を調べた。細胞増殖は[3H]−チミジン取り込みにより測定し、IFN−γはELISAにより測定した。結果を図2Eおよび図2Fにそれぞれ示す。WT1332−TCR−transduced CD4+T細胞の増殖およびIFN−γ産生は、WT1を発現する白血病細胞株(TF−1およびK562)の溶解物をパルスしたPBMCにより顕著に刺激され、WT1332ペプチドをパルスした自己のPBMCおよび全長のWT1蛋白をパルスした自己のPBMCによっても刺激されることがわかった。
さらに、3人の健常人(HLA−DPB1*05:01陽性)ドナーに由来する、実施例2と同様に調製されたWT1332−TCR−transduced CD4+T細胞株(つまり3種類)のWT1332ペプチドに応答した各種サイトカイン産生についても調べた。3種類の細胞株のサイトカイン産生能の平均値を図2Gに示す。IL−2、IFN−γ、TNF−αおよびGM−CSFといったTh1タイプのサイトカインの産生が多かった。
一般に、CD4+T細胞はヘルパーT細胞として働き、がん細胞を攻撃する主要なエフェクター細胞であるCD8+T細胞(CTL)の誘導やその維持に重要である事が知られている。そこで、WT1332−TCR−transduced CD4+T細胞がWT1特異的CTLの誘導を増強するか検討した。
次に、WT1332−TCR−transduced CD4+T細胞の細胞傷害活性、つまりkilling activityを評価した。
次に、WT1332−TCR−transduced CD4+T細胞が、グランザイムB(granzyme B)およびパーフォリン(perforin)経路により細胞傷害活性を発揮するかどうかについて調べた。WT1332−TCR−transduced CD4+T細胞において、グランザイムBおよびパーフォリンの高発現がみられた(図4D)。
WT1332−TCR−transduced CD4+T細胞および空のベクターで同様に処理されたCD4+T細胞(mock−transduced CD4+T細胞)を、WT1332ペプチドをパルスしたHLA−DPB1*05:01陽性TF−1細胞またはWT1332ペプチドをパルスしていないHLA−DPB1*05:01陽性TF−1細胞とともに、抗−CD107a−APCモノクローナル抗体の存在下で5時間培養した。その後IFN−γ染色を行ってフローサイトメトリーに供した。WT1332−TCR−transduced CD4+T細胞をWT1332ペプチドをパルスしたHLA−DPB1*05:01陽性TF−1細胞とともにインキュベーションした場合にのみ、WT1332−TCR−transduced CD4+T細胞においてIFN−γおよびCD107aの同時発現がみられた(図4E)。このことは、WT1332−TCR−transduced CD4+T細胞において脱顆粒が起こっていることを示す。
WT1332−TCR−transduced CD4+T細胞の細胞傷害活性がグランザイムB/パーフォリン経路に依存するものであるかどうかを確認するために、100μMのグランザイム阻害剤Ac−IETD−Choにて前処理されたHLA−DPB1*05:01陽性TF−1細胞を標的細胞として用いた。HLA−DPB1*05:01陽性TF−1細胞を100μMのAc−IETD−ChoまたはDMSO(コントロール)にて2時間前処理し、その後51Crにて標識し、WT1332−TCR−transduced CD4+T細胞とともにインキュベーションし、51Cr放出アッセイを行った。Ac−IETD−Choにて前処理されたHLA−DPB1*05:01陽性TF−1細胞に対するWT1332−TCR−transduced CD4+T細胞の細胞傷害活性は、DMSOにて前処理されたTF−1細胞に対する細胞傷害活性と比較して著しく低かった(図4F)。
これらの結果を総合すると、本発明で得られたWT1332−TCR−transduced CD4+T細胞は、WT1を発現する、HLA−DPB1*05:01陽性白血病細胞を直接認識し、グランザイムB/パーフォリン経路によりそれらに傷害を与えることが確認された。
WT1発現HLA−DPB1*05:01陽性ヒト白血病細胞C2F8(5×104個)をNOG(登録商標)マウス(7匹)に尾静脈より移入した。翌日、実験系として、HLA−DPB1*05:01拘束性WT1332特異的TCR(配列番号14と15)を導入したヒトCD4+T細胞(5×106 個)および抗原提示細胞としてT細胞を除去した同一人のヒト末梢血単核球(2×106 個)を上記NOG(登録商標)マウス(3匹)の尾静脈より移入した。コントロールとして、コントロールベクターを導入したヒトCD4+T細胞(5×106 個)および抗原提示細胞としてT細胞を除去した同一人のヒト末梢血単核球(2×106 個)を上記NOG(登録商標)マウス(4匹)の尾静脈より移入した。
1週間後および2週間後に、実験系のマウスにはHLA−DPB1*05:01拘束性WT1332特異的TCRを導入したヒトCD4+T細胞(5×106 個)を尾静脈より移入した。コントロールのマウスにはコントロールベクターを導入したヒトCD4+T細胞(5×106 個)を尾静脈より移入した。その後、マウスの生存を調べた。
結果を図5に示す。実験系のマウスの生存率はコントロールのマウスの生存率を上回ったことから、HLA−DPB1*05:01拘束性WT1332特異的TCR導入ヒトCD4+T細胞は、インビボで抗腫瘍効果を有することが示された。
Claims (22)
- 配列番号:1、3、5、8、10、11、13、14、16、18、20、22、23、25、27、28、30、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、56、58からなる群より選択される塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、配列番号:123に示されるアミノ酸配列またはその変異配列を有するWT1ヘルパーペプチド(WT1332ペプチドという)に特異的なCD4+ヘルパーT細胞のTCRのα鎖のCDR3をコードするポリヌクレオチド(αCDR3ポリヌクレオチドという)。
- 配列番号:2、4,6、7、9、12、15、17、19、21,24、26、29、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、57、59からなる群より選択される塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、WT1332ペプチドに特異的なCD4+ヘルパーT細胞のTCRのβ鎖のCDR3をコードするポリヌクレオチド(βCDR3ポリヌクレオチドという)。
- 請求項1に記載のαCDR3ポリヌクレオチドおよび請求項2記載のβCDR3ポリヌクレオチドの組であって、各ポリヌクレオチドが下記の塩基配列を有するものであるポリヌクレオチドの組:
αCDR3ポリヌクレオチド βCDR3ポリヌクレオチド
配列番号:1 配列番号:2
配列番号:3 配列番号:4
配列番号:5 配列番号:6
配列番号:3 配列番号:7
配列番号:8 配列番号:9
配列番号:10 配列番号:12
配列番号:11 配列番号:12
配列番号:13 配列番号:15
配列番号:14 配列番号:15
配列番号:16 配列番号:17
配列番号:18 配列番号:19
配列番号:20 配列番号:21
配列番号:22 配列番号:24
配列番号:23 配列番号:24
配列番号:25 配列番号:26
配列番号:27 配列番号:4
配列番号:28 配列番号:29
配列番号:30 配列番号:32
配列番号:31 配列番号:32
配列番号:33 配列番号:34
配列番号:35 配列番号:36
配列番号:37 配列番号:38
配列番号:39 配列番号:40
配列番号:41 配列番号:42
配列番号:43 配列番号:44
配列番号:45 配列番号:46
配列番号:47 配列番号:48
配列番号:49 配列番号:50
配列番号:51 配列番号:52
配列番号:53 配列番号:54
配列番号:55 配列番号:57
配列番号:56 配列番号:57
配列番号:58 配列番号:59
ただし、上記配列はその相補配列または縮重配列であってもよい。 - 請求項3に記載したいずれかの組のαCDR3ポリヌクレオチドおよびβCDR3ポリヌクレオチドを含むTCR遺伝子。
- WT1332ペプチドに特異的なCD4+T細胞から得られる請求項4に記載したTCR遺伝子。
- 請求項4または5に記載したTCR遺伝子をCD4+T細胞に導入することを特徴とする、WT1332ペプチドに特異的なCD4+ヘルパー細胞の製造方法。
- 請求項6に記載した方法により得られるCD4+ヘルパーT細胞。
- 請求項3に記載したいずれかのポリヌクレオチドの組のαCDR3ポリヌクレオチドおよびβCDR3ポリヌクレオチド含むTCR遺伝子を含むベクター。
- 該導入が請求項8に記載のベクターを用いて行われる請求項6に記載の方法。
- 請求項7に記載したCD4+ヘルパーT細胞と末梢血単核細胞を共培養することを特徴とする、WT1特異的CTLの誘導増強方法。
- 請求項10に記載した方法により得られるWT1特異的CTL。
- 請求項7に記載したCD4+ヘルパーT細胞を対象に導入することを特徴とする、対象における癌の治療または予防方法。
- 請求項7に記載したCD4+ヘルパーT細胞を含有する、癌の治療または予防のための医薬組成物。
- 癌の治療または予防のための医薬の製造のための、請求項7に記載したCD4+ヘルパーT細胞の使用。
- 請求項1に記載したαCDR3ポリヌクレオチド、請求項2に記載したβCDR3ポリヌクレオチド、あるいは請求項1に記載したαCDR3ポリヌクレオチドおよび請求項2に記載したβCDR3ポリヌクレオチドの両方を含むDNAチップ。
- 請求項15に記載のDNAチップを用いることを特徴とする、検体中のWT1332ペプチドに特異的なCD4+ヘルパーT細胞の頻度測定方法。
- 請求項1に記載されたいずれかのαCDR3ポリヌクレオチドによりコードされるαCDR3ペプチド。
- 請求項2に記載されたいずれかのβCDR3ポリヌクレオチドによりコードされるβCDR3ペプチド。
- 請求項3に記載されたポリヌクレオチドのいずれかの組によりコードされるペプチドの組。
- 請求項17もしくは請求項18に記載のペプチドまたは請求項19に記載のペプチドの組を含むチップ。
- 請求項17〜19のいずれかに記載のペプチドに対する抗体。
- 請求項21に記載の抗体を用いることを特徴とする、検体中のWT1332ペプチドに特異的なCD4+ヘルパーT細胞の頻度測定方法。
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