JPWO2014003176A1 - プロテインａのｂドメイン変異体を含むポリペプチドが結合された担体からなる吸着材 - Google Patents

Abstract

本発明の目的は、温度応答性プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィー吸着材において、温度応答性プロテインＡの培養生産性及び菌体破砕液中での安定性を向上させることができる吸着材を提供することである。本発明によれば、Ｎ末端側からタグペプチド、リンカー配列、及びプロテインＡのＢドメイン変異体を含むポリペプチドが結合された担体からなる吸着材であって、上記リンカー配列が、Val-Pro-Arg配列を含まず、かつ７から１２個のアミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であり；前記プロテインＡのＢドメイン変異体が、ｐH５〜９及び６０℃未満の条件下においてイムノグロブリンとの結合性が温度によって変化しうるものである、上記吸着材が提供される。

Description

本発明は、イムノグロブリンとの結合性が温度によって変化しうるプロテインＡのＢドメイン変異体を含むポリペプチドが結合された担体からなる吸着材に関する。本発明の吸着材は、イムノグロブリンの精製のために使用することができる。

イムノグロブリンは、生体内に侵入した異物を認識して免疫反応を引き起こす抗体，並びにこれと構造又は機能的に類似したポリペプチドの総称であり、IgG，IgM，IgA，IgD，IgEなどがある。イムノグロブリンは、ライフサイエンス研究、医薬及び臨床検査等の分野において有用である。高純度のイムノグロブリンの製造方法としてアフィニティークロマトグラフィーが使用されている。イムノグロブリンの精製に用いるアフィニティークロマトグラフィーのリガンドとしては、イムノグロブリンの共通領域に極めて高い特異性と親和性を有するスタフィロコッカス（Staphylococcus）由来のプロテインA（以下、プロテインA）、及びそのイムノグロブリン結合ドメインが知られている。プロテインＡは、抗体医薬品の製造工程に広く用いられている。従来から知られているプロテインＡまたはその一部をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィー吸着材（以下、従来型プロテインＡ吸着材）では、吸着したＩｇＧを酸性域（ｐＨ３〜４）で溶出させる必要があるため、精製したＩｇＧの立体構造変化や会合凝集などが起こり失活することが問題となっている。

この問題を解決する手段の一つとして、温度変化によってＩｇＧとの親和性を制御することにより中性域での溶出を可能としたプロテインＡの温度感受性変異体（以下、温度応答性プロテインＡ）が提案されている（特許文献１）。しかしながら、この温度応答性プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィー吸着材（以下、温度応答性プロテインＡ吸着材）は、従来型プロテインＡ吸着材と比較してＩｇＧ吸着容量等の性能面で十分なものではなく、温度応答性プロテインＡ吸着材の性能向上が強く求められていた。

従来型プロテインＡ吸着材のさらなる問題は高価なことであり、その使用により抗体医薬品は非常に高価なものとなり、保険財政を圧迫する要因となっている。温度応答性プロテインＡ吸着材を従来型プロテインＡ吸着材よりも低コストで提供することは重要な課題である。特許文献１によると、温度応答性プロテインＡは、Ｎ末端にＨｉｓ−Ｔａｇ配列を持つポリペプチドとして、遺伝子組換え大腸菌を培養して生産されているが、培養での生産量が低く、菌体破砕液中での安定性が良くないため、高価なプロテアーゼインヒビターを用いなければならなかった。温度応答性プロテインＡの培養生産性と安定性の向上が強く求められていた。

国際公開ＷＯ２００８／１４３１９９

本発明は、温度応答性プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィー吸着材において、温度応答性プロテインＡの培養生産性及び菌体破砕液中での安定性を向上させることができる吸着材を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、ＩｇＧ吸着容量が向上した温度応答性プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィー吸着材を提供することを解決すべき課題とした。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、Ｎ末端側からタグペプチド、リンカー配列、及びプロテインＡのＢドメイン変異体を含むポリペプチドにおいて、タグペプチドとプロテインＡのＢドメイン変異体とをつなぐリンカー配列を最適化することにより、上記ポリペプチドの培養生産性及び菌体破砕液中での安定性を向上できることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１） Ｎ末端側からタグペプチド、リンカー配列、及びプロテインＡのＢドメイン変異体を含むポリペプチドが結合された担体からなる吸着材であって、
上記リンカー配列が、Val-Pro-Arg配列を含まず、かつ７から１２個のアミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であり；前記プロテインＡのＢドメイン変異体が、ｐH５〜９及び６０℃未満の条件下においてイムノグロブリンとの結合性が温度によって変化しうるものである、上記吸着材。

（２） リンカー配列が、１から４個のグリシン残基と３から７個のセリン残基を含む、（１）に記載の吸着材。
（３） リンカー配列が、メチオニン残基を含む、（１）又は（２）に記載の吸着材。
（４） リンカー配列が、ロイシン残基を含む、（１）から（３）の何れかに記載の吸着材。
（５） リンカー配列が、ヒスチジン残基を含む、（１）から（４）の何れかに記載の吸着材。

（６） リンカー配列が、
グリシン残基、セリン残基及びメチオニン残基から構成されるアミノ酸配列；
グリシン残基、セリン残基、メチオニン残基及びヒスチジン残基から構成されるアミノ酸配列；
グリシン残基、セリン残基、メチオニン残基、ヒスチジン残基及びロイシン残基から構成されるアミノ酸配列；又は
グリシン残基、セリン残基、メチオニン残基、ヒスチジン残基、ロイシン残基及びアルギニン残基から構成されるアミノ酸配列：
の何れかである、（１）から（５）の何れかに記載の吸着材。

（７） リンカー配列が、Ser-Ser-Gly-(Xaa)n-Met（式中、nは３から８の整数を示し、n個のXaaはそれぞれ独立に、グリシン残基、セリン残基、ヒスチジン残基、ロイシン残基又はアルギニン残基を示す）で示されるアミノ酸配列である、（１）から（６）の何れかに記載の吸着材。
（８） リンカー配列が、Ser-Ser-Gly-Leu-(Xbb)m-His-Met（式中、mは１から６の整数を示し、m個のXbbはそれぞれ独立に、グリシン残基、セリン残基又はアルギニン残基を示す）で示されるアミノ酸配列である、（１）から（７）の何れかに記載の吸着材。

（９） タグペプチドが６ｘヒスチジンタグである、（１）から（８）の何れかに記載の吸着材。
（１０） プロテインＡのＢドメイン変異体が、配列番号１のポリペプチドと６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列（但し、配列番号１で表されるアミノ酸配列において少なくとも19位のGly及び／または22位のGlyは、Ala又はLeuに置換されている）であって、かつpH５〜９及び６０℃未満の条件下においてイムノグロブリンとの結合性が温度によって変化しうるアミノ酸配列を、１分子内に少なくとも１以上含むものである、（１）から（９）の何れかに記載の吸着材。
（１１） プロテインＡのＢドメイン変異体が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を１分子内に少なくとも１以上含むものである、（１）から（１０）の何れかに記載の吸着材。

（１２） 担体が、粒子状のクロマト充填剤である、（１）から（１１）の何れかに記載の吸着材。
（１３） 担体の平均粒子径が２０〜２００μｍである、（１）から（１２）の何れかに記載の吸着材。
（１４） 担体が、ポリビニルアルコールの架橋重合体から構成される、（１）から（１３）の何れかに記載の吸着材。

（１５） ポリペプチドがアミド結合によって担体に結合されている、（１）から（１４）の何れかに記載の吸着材。
（１６） 担体に対し、２０ｍｇ／ｍＬ樹脂以上のポリペプチドが結合している、（１）から（１５）の何れかに記載の吸着材。
（１７） イムノグロブリンの最大結合容量が、２０ｍｇ／ｍＬ樹脂以上である、（１）から（１６）の何れかに記載の吸着材。
（１８） 担体が、カルボキシル基を４００〜６００μｍｏｌ／ｍＬ樹脂含むものである、（１）から（１７）の何れかに記載の吸着材。

（１９） 担体が膜である、（１）から（１１）の何れかに記載の吸着材。
（２０） 膜が中空糸状である、（１９）に記載の吸着材。
（２１） 膜が、グラフト高分子鎖を導入した基材膜から製造される、（１９）又は（２０）に記載の吸着材。
（２２） （１）から（２１）の何れかに記載の吸着材に、イムノグロブリンを含有する試料を接触させることを含む、イムノグロブリンの精製方法。

本発明によれば、プロテインＡのＢドメイン変異体を含むポリペプチドについて培養生産性を向上することができ、また菌体破砕液中での安定性を向上することができることから、低コストで温度応答性プロテインＡを提供することができる。さらに、本発明のプロテインＡのＢドメイン変異体を含むポリペプチドが結合された担体からなる吸着材においては、ＩｇＧ吸着容量を向上できた。従って、本発明によれば、より効率的で経済的に優れたＩｇＧ精製プロセスを提供することができる。

以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明の吸着材は、Ｎ末端側からタグペプチド、リンカー配列、及びプロテインＡのＢドメイン変異体を含むポリペプチドが結合された担体からなるものである。

本発明におけるタグペプチドとしては、例えば２〜６個のヒスチジンから構成されるタグ（Hisタグ又は6×His）や、グルタチオン-S-トランスフェラーゼから構成されるタグ（GSTタグ）、マルトース結合ポリペプチド（MBP）タグ，カルモジュリン，Myc-タグ（c-mycタグ），FLAG-タグまたは緑色蛍光タンパク（GFP）等の公知のタグが挙げられるが、中でもHisタグやGSTタグ等が好ましい。Hisタグは、サイズが小さいために免疫原性が低く、精製されたポリペプチドからタグを除去せずに使用できる。また、Hisタグは、遺伝子を予め導入したプラスミドが市販されており、容易に手に入る。

本発明におけるリンカー配列は、Val-Pro-Arg配列を含まず、かつ７から１２個のアミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列である。
本発明におけるリンカー配列の特徴の一つは、トロンビン認識配列であるVal-Pro-Arg配列を含まないことである。Val-Pro-Arg配列を除外したことにより、ポリペプチドの製造時の安定性が向上し、培養生産性を向上することができるとともに、使用時における安定性も向上し、Hisタグなどのタグペプチドの溶出を防止することができる。

本発明におけるリンカー配列のもう一つの特徴は、７から１２個のアミノ酸残基から構成されることである。リンカー配列のアミノ酸残基が６個以下の場合、又は１３個以上の場合には、ポリペプチドの発現量が低下し、十分な培養生産性を達成できなくなることが本発明により明らかになった。

好ましくは、リンカー配列は、１から４個のグリシン残基と３から７個のセリン残基を含むことができる。更に好ましくは、リンカー配列は、メチオニン残基、ロイシン残基及びヒスチジン残基から選択される１から３種のアミノ酸残基を含むことができる。
上記した好ましいリンカー配列のアミノ酸配列の具体例としては、
グリシン残基、セリン残基及びメチオニン残基から構成されるアミノ酸配列；
グリシン残基、セリン残基、メチオニン残基及びヒスチジン残基から構成されるアミノ酸配列；
グリシン残基、セリン残基、メチオニン残基、ヒスチジン残基及びロイシン残基から構成されるアミノ酸配列；又は
グリシン残基、セリン残基、メチオニン残基、ヒスチジン残基、ロイシン残基及びアルギニン残基から構成されるアミノ酸配列：
などを挙げることができる。

更に好ましくは、リンカー配列が、Ser-Ser-Gly-(Xaa)n-Met（式中、nは３から８の整数を示し、n個のXaaはそれぞれ独立に、グリシン残基、セリン残基、ヒスチジン残基、ロイシン残基又はアルギニン残基を示す）で示されるアミノ酸配列、特に好ましくは、Ser-Ser-Gly-Leu-(Xbb)m-His-Met（式中、mは１から６の整数を示し、m個のXbbはそれぞれ独立に、グリシン残基、セリン残基又はアルギニン残基を示す）で示されるアミノ酸配列である。

本発明におけるプロテインＡのＢドメイン変異体は、ｐH５〜９及び６０℃未満の条件下においてイムノグロブリンとの結合性が温度によって変化しうるものである。プロテインＡのＢドメイン変異体としては、特許文献１（国際公開ＷＯ２００８／１４３１９９）に記載のものを挙げることができる。

「pH5〜9，60℃未満の条件下においてイムノグロブリンとの結合性が温度によって変化し得る」とは、イムノグロブリンの立体構造に影響を及ぼさないpH5〜9，60℃未満の条件下で、温度によってイムノグロブリンとの間の「結合力」や結合の「特異性」等が変化し、この性質によってイムノグロブリンを精製することができることを意味し、具体的には、低温領域でポリペプチドのカラム充填・IgGのカラムへの負荷・カラム洗浄を行った際に、イムノグロブリンを結合することができ、その後、高温領域にすることによってポリペプチドの構造等が変化することによって、低温領域で結合したイムノグロブリンを放出し得ることを意味する。具体的には、例えば0〜15℃，好ましくは0〜8℃，より好ましくは5℃付近の低温領域と、例えば、25〜60℃，好ましくは30〜45℃，より好ましくは32〜38℃，特に好ましくは35℃付近の高温領域で、ポリペプチドとイムノグロブリンとの結合性に、差があることを意味する。温度によってイムノグロブリンとの結合性が変化し得る変異体であるか否かは、候補となる変異体を、カラムクロマトグラフィー等のリガンドとして用い、実際にイムノグロブリンを精製してみることで容易に確認することができる。

本発明で用いるプロテインＡのＢドメイン変異体の具体例としては、配列番号１のポリペプチドと６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列（但し、配列番号１で表されるアミノ酸配列において少なくとも19位のGly及び／または22位のGlyは、Ala又はLeuに置換されている）であって、かつpH５〜９及び６０℃未満の条件下においてイムノグロブリンとの結合性が温度によって変化しうるアミノ酸配列を、１分子内に少なくとも１以上含むものである。配列番号１で表されるアミノ酸配列において少なくとも19位のGly及び／または22位のGlyは、Ala又はLeuに置換されているアミノ酸配列としては、19位のGly及び／または22位のGlyは、Ala又はLeuに置換されている変異体に対して、この変異を変更することなく、更に他のアミノ酸の置換，欠失，付加，あるいは挿入が導入された変異体が含まれる。

１９位と２２位の変異以外の変異としては、例えば、タンパク質内部の疎水性アミノ酸を、他の疎水性アミノ酸に変異させるほか、側鎖による水素結合を欠失させる変異等が挙げられる。水素結合を欠失させる変異としては、例えば、Gln（特に、タンパク質表面に露出している、例えば26位のGln）のGlyへの置換等が挙げられる。さらに、親水性のアミノ酸であっても、その側鎖に著しく疎水性を有する部分がある場合、その部分を欠失させる変異であれば、タンパク質立体構造の安定性を低下させることができる。たとえば、中性溶液中で電荷を有する親水性のArgを例えばGly等の疎水性の強いメチレン基を有しない（又は少ない）アミノ酸等に置換すると、そのポリペプチドの天然立体構造が不安定になる傾向にある。但し、これらの変異体は、pH5〜9の範囲でイムノグロブリンとの結合性が温度変化に応じて変化し得るものであることが必要である。

本発明で用いるポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のポリペプチドと６０％以上の相同性を有する。相同性としては、例えば、アミノ酸配列の６０％以上が一致しているものが好ましく、より好ましくは７０％以上，更に好ましくは８０％以上，更に好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上が一致している。

アミノ酸の置換としては、化学的または構造的に類似したアミノ酸の置換が好ましい。化学的または構造的に類似したアミノ酸のグループとしては以下のものが挙げられる。
（グリシン、プロリン、アラニン、バリン）
（ロイシン、イソロイシン）
（グルタミン酸、グルタミン）
（アスパラギン酸、アスパラギン）
（システイン、スレオニン）
（スレオニン、セリン、アラニン）
（リジン、アルギニン）

プロテインＡのＢドメイン変異体としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列を１分子内に少なくとも１以上含むものが特に好ましい。

本発明で用いるポリプチドは、上記した配列番号１のポリペプチドと６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を１分子内に少なくとも１以上含むものであり、上記アミノ酸配列を２つ以上含むこともできる。含まれるアミノ酸配列の数（以下、ｎとする）の上限は特にないが、アフィニティークロマトグラフィー用リガンドとして用いる場合には、アフィニティークロマトグラフィー用支持体等やアフィニティークロマトグラフィー用カラムの大きさや種類等との相性から、nは６以下であることが好ましく、５以下がさらに好ましく、４以下が特に好ましい。

本発明で用いるポリペプチドは、常法に従いポリペプチド合成装置等を用いて合成することもできるが、対応する遺伝子を作製し、これを発現させることによって製造することもできる。即ち、ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするDNAを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、その形質転換体を培養することによって、ポリペプチドを製造することができる。

ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするDNAは、発現ベクターに挿入することが好ましい。発現ベクターは、市販のプラスミドを利用でき、特に限定されない。例えば、pET系ベクター（メルク社製,日本）又は、pRSET系ベクター（インビトロジェン社製,日本）が宿主である大腸菌との組み合わせでポリペプチドを大量に発現できるので好ましい。発現ベクターと宿主細胞は適切に組み合わせて使用することが好ましい。例えば、pET系ベクター及びpRSET系ベクターの場合は、大腸菌BL21(DE3)又はC41(DE3)などを宿主細胞として使用することができる。

発現ベクターによる宿主細胞の形質転換は、ヒートショック法又はエレクトロポレーション法などにより行うことができる。発現ベクターにより形質転換された形質転換体は、適切な培地を用いて常法により培養することができる。例えば、宿主が大腸菌の場合には、LB培地又は2×TY培地などの液体培地を使用し、通常15℃から40℃、特に30℃から37℃で培養することが好ましい。培地を振とう又は攪拌し、必要に応じ通気やpH調整を行うことが好ましい。ポリペプチドの発現誘導にはイソプロピル-1-β-D-ガラクトピラノシド（IPTG）等を培地に添加して行うことができる。

ポリペプチドを発現した宿主細胞は、遠心分離又はフィルター分離等により培地から分離される。宿主細胞を適切な緩衝液に懸濁して細胞破砕を行う。細胞破砕後に遠心分離を行うことで、本発明で用いるポリペプチドを可溶性分画に回収することができる。可溶性分画からポリペプチドを精製するには、公知のポリペプチド精製方法を用いることができ、例えば、塩析法とイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせること等で行える。また、ポリペプチドのN末端に存在するタグペプチドを利用して精製することができる。例えばHisタグの場合には、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー、GSTタグの場合には、グルタチオンを結合した親和性樹脂を利用した精製方法を用いることができる。金属キレートアフィニティークロマトグラフィーには、ニッケルチャージアガロースゲルであるNi-NTAなどを使用できる。

本発明における担体は、アフィニティークロマトグラフィー用の吸着材として使用できるものであれば特に限定されないが、好ましくは、粒子状のクロマト充填剤、又は膜（さらに好ましくは、中空糸状の膜）である。担体が粒子状の場合、担体の平均粒子径は２０〜２００μｍであることが好ましい。

担体の材料は、特に限定されないが、膜状の担体の材料は、多孔性の膜を形成しうる高分子材料を使用することができる。例えば、ポリエチレンやポリプロピレン等のオレフィン樹脂、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンテレナフタレート等のポリエステル樹脂、ナイロン６、ナイロン６６等のポリアミド樹脂、ポリフッ化ビニリデン、ポリクロロトリフルオロエチレン等の含フッ素樹脂、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン及びポリカーボネート等の非結晶性樹脂などが使用できる。粒子状のクロマト充填剤の材料としては、ガラス、シリカ、ポリスチレン樹脂、メタクリル樹脂、架橋アガロース、架橋デキストラン、架橋ポリビニルアルコール、及び架橋セルロースなどが使用できる。架橋ポリビニルアルコール、及び架橋セルロースは親水性が高く、不純物成分の吸着を抑制できるために好ましい。

上記の担体には、カップリング基を導入することができる。カップリング基としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化されたカルボキシル基、カルボキシル基、臭化シアン活性化基、水酸基、エポキシ基、アルデヒド基、及びチオール基などが挙げられる。担体に固定化されるポリペプチドは一級アミノ基を有しているため、上記の中でもこれに結合できるＮＨＳで活性化されたカルボキシル基、カルボキシル基、臭化シアン活性化基、エポキシ基、及びホルミル基が好ましい。特に、ＮＨＳで活性化されたカルボキシル基は、カップリング反応時に他の試薬が不要であり、反応が迅速で強固な結合を形成するので、特に好ましい。

担体としては、カルボキシル基を４００〜６００μｍｏｌ／ｍＬ樹脂含むものを用いることが好ましい。

担体へのカップリング基の導入方法は特に限定されないが、担体とカップリング基との間にスペーサーを導入するのが一般的である。カップリング基の導入方法は常法により行うことができる。

カップリング基を末端及び／又は側鎖に有するグラフト高分子鎖を担体に導入してもよい。カップリング基を有するグラフト高分子鎖を支持体に導入することで、カップリング基の密度を任意に高める等、制御することが可能となる。カップリング基を有する高分子鎖を担体にグラフトするか、カップリング基に変換しうる前駆体官能基を有する高分子鎖を担体にグラフトし、その後にグラフトした前駆体官能基をカップリング基に変換してもよい。

グラフト高分子鎖の導入方法はいかなる方法でもよい。あらかじめ高分子鎖を調製し、担体にカップリングしてもよい。また、「リビングラジカル重合法」や「放射線グラフト重合法」の手法により、担体上で直接グラフト鎖を重合してもよい。「放射線グラフト重合法」は、担体に予め反応開始剤を導入する必要がなく、適応可能な担体が多種であるため、好ましい。

ポリプチドを担体に固定する方法としては、当該技術分野において周知であり文献に記載されている多様な技術が任意に使用できる。例えば、上記したようなN-ヒドロキシスクシンイミド等のカップリング剤、又はカルボキシル基又はチオール基等による固体支持体の活性化による固定化などを使用することができる。例えば、ポリペプチドはアミド結合によって担体に結合することができる。また、ポリペプチドの結合量は、特に限定されないが、担体に対し、２０ｍｇ／ｍＬ樹脂以上のポリペプチドが結合していることが好ましく、より好ましくは４０ｍｇ／ｍＬ樹脂以上のポリペプチドが結合していることが、イムノグロブリンの結合容量の観点から好ましい。

本発明の吸着材において、イムノグロブリンの最大結合容量は好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ樹脂以上、より好ましくは４０ｍｇ／ｍＬ樹脂以上である。

本発明によればさらに、本発明の吸着材に、イムノグロブリンを含有する試料を接触させることによってイムノグロブリンを精製する方法が提供される。
精製の対象となるイムノグロブリンとしては、生体あるいは培養細胞等に由来するものの他、それらの構造を模して人工的に合成されたものでもよく、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。また、イムノグロブリンは、非ヒト動物由来のイムノグロブリンを、ヒト化等のキメラ化，あるいはヒト型化（完全ヒト化）したものでもよい。また、精製対象であるイムノグロブリンとしては、モノクローナル抗体の重鎖可変領域であるVH鎖と軽鎖可変領域であるVL鎖のみからなるファージ抗体でもよい。

本発明においては、pH5〜9、60℃未満の条件下において本発明の吸着材を用いて、温度変化によってイムノグロブリンを溶出させることができる。本発明においては、温度のコントロールが必要であるが、温度をコントロールする方法としては、例えばアフィニティークロマトグラフィー用カラムの周囲に、循環する水等が直接接触するように循環用ジャケットを配置し、循環水等の温度を調節することにより該カラムの内部の温度を制御する方法等が挙げられる。

まず、ジャケットを循環する水等の熱媒体の温度を、0〜15℃、好ましくは0〜10℃、より好ましくは5℃に調節することにより、該カラム内の温度を同様の温度にする。そして中性pHの適切な緩衝液で平衡化された該カラムにイムノグロブリンを含む試料溶液を注入した後、洗浄用の緩衝液（中性pH）を用いて該カラムに結合しない物質を完全に除去する。平衡化緩衝液及び注入する試料溶液及び洗浄用緩衝液の温度も目的とする温度に保っておくことが好ましい。

アフィニティーリガンドに結合しているイムノグロブリンは、前述同様に、該カラム内の温度を30〜45℃、好ましくは32〜38℃、より好ましくは37℃前後に安定させた後、同温度に保たれた溶出用の中性緩衝液を該カラムに注入することで、回収することができる。

以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例によって限定されるものではない。

実施例１：
（部位特異的変異導入のための鋳型プラスミドの調製）
ヒスチジンタグ配列、リンカー配列（配列番号５）および温度応答性プロテインＡの反復配列からなるポリペプチドをコードする挿入遺伝子（配列番号３）の５'末端側にNcoI認識配列（ＣＣＡＴＧＧ）を、３'末端側にBamHＩ認識配列（ＧＧＡＴＣＣ）を付加したdsＤＮＡは化学的に合成した。該ＤＮＡの両末端を制限酵素NcoＩとBamHＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動を行い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製、日本）を用いて精製したものを挿入遺伝子として用いた。発現ベクターは、pET28b(+)プラスミド（メルク社製、日本）のクローニングサイトを制限酵素NcoＩとBamHＩで切断し、前記挿入遺伝子を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでライゲーションして調製した。

（形質転換と鋳型プラスミドの増幅）
上記発現ベクターを用いて、ヒートショック法により、ＸＬ１−ｂｌｕｅコンピテントセル（日本ジーン社製、日本）の形質転換を行った。その反応物を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地プレートで１８時間増殖させた。該プレート上に出現したコロニーを５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、１８時間増殖させて上記発現ベクターで形質転換された大腸菌クローンを得た。

（鋳型プラスミドの精製）
この大腸菌株から、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製、日本）を使用して、部位特異的変異導入のための鋳型プラスミドを精製した。

（リンカー配列の異なる変異体ポリペプチド発現ベクターの調製および発現）
リンカー配列の異なる変異体ポリペプチドは、上記鋳型プラスミドに、ＫＯＤ ｐｌｕｓ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡社製、日本）を用いたＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲ法によって部位特異的に変異導入して作成した。ＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲの後、メチル化されている鋳型プラスミドをＤｐｎＩで消化した。その後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでセルフライゲーションしたものを、リンカー配列の異なる変異体ポリペプチドの発現ベクターとした。作成した変異体ポリペプチドのリンカー配列部分のアミノ酸配列を、配列番号５に示した。得られた変異体ポリペプチドの発現ベクターを用いて、E.coli BL21(DE3)株の形質転換を行い、変異体ポリペプチドを発現する形質転換体１を得た。

（変異体の発現量確認）
変異体ポリペプチドを発現する形質転換体１を、50μg/mLカナマイシンを含むLB培地プレートで、３７℃で、１６時間増殖させた。出現したコロニーを１つ選び、50μg/mLカナマイシンを含むＬＢ液体培地に接種して、３７℃で振とう培養した。培養開始から５時間目に終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加してさらに３時間振とう培養を続けた。形質転換体１の菌体量を、分光光度計を用いて波長６００ｎｍの濁度で測定した値は１４．８であった。

得られた形質転換体１の培養液から、遠心分離によって菌体を回収し、10mM Tris-HCl(pH8.0)に懸濁した。この懸濁液にリゾチームを加えて、１５℃、３０分間処理した後、さらに凍結解凍法によって菌体を破砕し、遠心分離によって、変異体ポリペプチドを上澄みに回収した。
得られた上澄み液に含まれる各変異体ポリペプチドの発現量はＨＰＬＣ法で測定した。発現量は１．１３ｍｇ／ｍＬであった。

実施例２〜９
変異体ポリペプチドのリンカー配列を、配列番号６〜１１又は１５〜１６に示すものに変更し、それぞれに対応する形質転換体２〜７及び１２〜１３を得た以外は、実施例１と同様に、部位特異的変異導入、形質転換体の調製および発現量の確認を行った。結果を表３に示した。

比較例１〜４
変異体ポリペプチドのリンカー配列を、配列番号４又は配列番号１２〜１４に示すものに変更し、それぞれに対応する形質転換体１０〜１３を得た以外は、実施例１と同様に、部位特異的変異導入、形質転換体の調製および発現量の確認を行った。結果を表３に示した。

実施例１０
（形質転換体１の大量培養および安定性確認）
実施例１の形質転換体１を、50μg/mLカナマイシンを含むLB培地プレートで、３７℃で、１６時間増殖させた。出現したコロニーを１つ選び、50μg/mLカナマイシンを含むＬＢ液体培地に接種して、３７℃で７時間振とう培養した。得られた培養液の０．５ｍＬを、５Ｌ容量の加圧通気攪拌培養槽（培地液量３Ｌ、培地組成：２％ グルコース、０．１％ ラクトース１水和物、０．５％ 酵母エキス、１．０％ ペプトン、０．５％ ＮａＣｌ）に接種して、３７℃で１６時間、通気攪拌培養を行った。実施例１と同様に、菌体量を測定し、菌体を破砕して変異体ポリペプチドの発現量を測定した。菌体量は、６００ｎｍ濁度で３５であり、変異体ポリペプチドの発現量は、培養液当たりで２．３ｇ／Ｌであった（表４）。得られた菌体破砕液を１０℃条件下で２４時間放置した後、変異体ポリペプチドの濃度を再度測定したところ、２．３ｇ／Ｌであった（表４）。

実施例１１〜１８
形質転換体１の代わりに、形質転換体２〜９をそれぞれ用いること以外は、実施例１０と同様に、形質転換体２〜９の大量培養および安定性確認を行った。結果を表４に示した。

比較例５
（形質転換体１０の大量培養および安定性確認）
形質転換体１０を用いた以外は、実施例１０と同様に培養を行った。菌体量は、６００ｎｍ濁度で３２であり、変異体ポリペプチドの発現量は、培養液当たりで１．２ｇ／Ｌであった（表４）。実施例１０と同様に菌体破砕液を１０℃条件下で２４時間放置した後、変異体ポリペプチドの濃度を再度測定したところ、０．９ｇ／Ｌであった（表４）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ、変異体ポリペプチドのバンドよりも低分子量のバンドが出現していた。

比較例６〜８
形質転換体１０の代わりに、形質転換体１１〜１３をそれぞれ用いること以外は、比較例５と同様に、形質転換体１１〜１３の大量培養および安定性確認を行った。結果を表４に示した。

実施例１９
（形質転換体１培養液からの変異体ポリペプチドの精製）
実施例１０で得られた変異体ポリペプチドを含む菌体破砕液を遠心分離して、変異体ポリペプチドを含む上澄み液を得た。得られた上澄み液を、Ｎｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケア社製）カラムに吸着させて、２５０ｍＭイミダゾールを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出した。溶出液は、さらに、陰イオン交換カラムに吸着させて、ＮａＣｌ濃度グラジエントで溶出させることにより精製した。陰イオン交換カラムの溶出画分は、限外濾過膜（分画分子量３０００ｋＤａ）で濃縮と脱塩を行って、変異体ポリペプチドの濃縮液２０ｍＬを得た。濃縮液中に含まれる変異体ポリペプチドの量は、１．０ｇであった。

（変異体ポリペプチドの架橋ポリビニルアルコールビーズへの固定化）
得られた変異体ポリペプチドを、以下の方法により、架橋ポリビニルアルコールビーズへ固定化した。
１）カルボキシル基の導入
無水コハク酸３．０ｇ及び４−ジメチルアミノピリジン３．６ｇをトルエン４５０ｍＬに溶解させたものを反応液として用いた。架橋ポリビニルアルコールビーズ（平均粒子径１００μｍ）１ｇを上記反応液と５０℃で接触させ、２時間攪拌した。その後、架橋ポリビニルアルコールビーズを脱水イソプロピルアルコールで洗浄した。カルボキシル基導入量を測定した結果、４４３μｍｏｌ／ｍＬ−ビーズ体積であった。

２）カラムパッキング
上記架橋ポリビニルアルコールビーズを、空カラム（Ｔｒｉｃｏｒｎ５／２０、ＧＥヘルスケア社製）に充填した。

３）ＮＨＳ活性化
上記カラムを４０℃に加温しながら、ＮＨＳ活性化反応液（ＮＨＳ０．０７ｇ、脱水イソプロピルアルコール４５ｍＬ、ジイソプロピルカルボジイミド０．０９ｍＬ）を、０．４ｍＬ／分の流速で３０分間透過し、カルボキシル基をＮＨＳ活性化した。反応後、脱水イソプロピルアルコールを透過させることで洗浄した。

４）変異体ポリペプチドのカップリング
上記ＮＨＳ活性化カラムに氷冷した１ｍＭ塩酸を２ｍＬ透過して、脱水イソプロピルアルコールを置換した。ついで、変異体ポリペプチド３０ｍｇを１ｍＬのカップリング緩衝液（０．２Ｍリン酸緩衝液、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）に溶解後に２℃に冷却し、０．４ｍＬ／分の流速でカラムに供給した後、１６時間保持させた。所定時間経過後、カラムにカップリング緩衝液を透過させることで、ＮＨＳ活性基とカップリング反応しなかった変異体ポリペプチドを洗浄・回収した。

５）ブロッキング
変異体ポリペプチドをカップリングしたカラムにブロッキング反応液（０．５Ｍ エタノールアミン、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を１０ｍＬ透過し、残留ＮＨＳをエタノールアミンでブロッキングした。反応後、このカラムを純水で洗浄し、その後２０％エタノールでカラムに封入した状態で４℃で保存した。

６）免疫グロブリンの最大結合容量および動的吸着容量測定
クロマトグラフィーシステム（ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ、ＧＥヘルスケア社製）を用いて、温度変化による免疫グロブリン（献血ヴェノグロブリン−ＩＨ、ベネシス社製）の吸着・溶出試験を行った。カラムの温度変化操作は、クロマトグラフィーシステムのポンプを一度停止し、カラムを所定温度の恒温水槽に浸漬し、その後１０分以上放置した後にクロマトグラフィーシステムのポンプを再度起動することにより行った。吸着温度を２℃、溶出温度を４０℃とした。温度溶出後、溶出しきれなかった抗体を、低ｐＨの溶出緩衝液（０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ３．０）で溶出させた。各溶出画分のＵＶ吸収（２８０ｎｍ）を測定し、下記式より免疫グロブリン濃度を算出することにより、免疫グロブリンの最大結合容量を算出した。
免疫グロブリン濃度（ｍｇ／ｍＬ）＝２８０ｎｍの吸光度／１４×１０
最大結合容量（ｍｇ／ｍＬ）＝
温度溶出画分の免疫グロブリン濃度×温度溶出画分の液量／ビーズ体積
動的吸着容量は、得られた破過曲線の１０％破過点の溶出容量から算出した。

（結果）
免疫グロブリンの最大結合容量は３４．０ｍｇ／ｍＬ−ビーズ体積、動的吸着容量は１９．９ｍｇ／ｍＬ−ビーズ体積であった（表５）。

実施例２０
架橋ポリビニルアルコールビーズの平均粒子径が６０μｍであること以外は、実施例１９と同じ条件で実施した。免疫グロブリンの最大結合容量は４７．０ｍｇ／ｍＬ−ビーズ体積、動的吸着容量は２６．０ｍｇ／ｍＬ−ビーズ体積であった（表５）。

実施例２１
架橋ポリビニルアルコールビーズの代わりに、架橋セルロースビーズを用いること以外は、実施例１９と同じ条件で実施した。免疫グロブリンの最大結合容量は１８．９ｍｇ／ｍＬ−ビーズ体積、動的吸着容量は２．９ｍｇ／ｍＬ−ビーズ体積であった（表５）。

実施例２２
架橋ポリビニルアルコールビーズの代わりに、架橋アガロースビーズを用いること以外は、実施例１９と同じ条件で実施した。免疫グロブリンの最大結合容量は１８．０ｍｇ／ｍＬ−ビーズ体積、動的吸着容量は６．１ｍｇ／ｍＬ−ビーズ体積であった（表５）。

実施例２３
実施例１９で得られた変異体ポリペプチドの濃縮液を用いて、中空糸への固定化を行った。
１）表面グラフト重合
ＧＭＡ２０ｇをメタノール１８０ｍＬに溶解させ、３０分間、窒素バブリングしたものを反応液として用いた。ポリエチレン製中空糸（内径２．０mm、外径３．０ｍｍ、平均孔径０．２５μｍ）２ｇを窒素雰囲下において、ドライアイスで−６０℃に冷却しながら、コバルト６０を線源としてγ線を２００ｋＧｙ照射した。照射後の中空糸は、１３．４ｐａ以下の減圧下に５分間静置した後、２０ｍＬの上記反応液と該中空糸を４０℃で接触させ、１６時間静置した。その後、中空糸をエタノールで洗浄し、真空乾燥機で真空乾燥させた。

２）エポキシ基のジオール化
表面グラフト重合した中空糸を０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸中に投入し、８０℃で２時間反応を行うことで、グラフト鎖中に残存していたエポキシ基をジオール基に変換した。反応後、この中空糸を純水で洗浄した後、膜をエタノールで洗浄し、真空乾燥機で真空乾燥させた。

３）カルボキシル基の導入
エポキシ基をジオール化した中空糸を、無水コハク酸３．０ｇ及び４−ジメチルアミノピリジン３．６ｇをトルエン９００ｍＬに溶解させた反応液に浸漬し、４０℃で６０分間反応させることで、グラフト鎖にカルボキシル基を導入した。反応後、この中空糸をエタノールで洗浄し、真空乾燥機で真空乾燥させた。

４）ＮＨＳ活性化
モジュール化した中空糸（中空糸１本モジュール、有効糸長４ｃｍ）を４０℃に加温しながら、ＮＨＳ活性化反応後（ＮＨＳ０．０７ｇ、脱水イソプロピルアルコール４５ｍＬ、ジイソプロピルカルボジイミド０．０９ｍＬ）を０．４ｍＬ／分の流速で６０分間透過し、カルボキシル基をＮＨＳ活性化した。反応後、中空糸モジュールを氷冷しながら、中空糸モジュールに脱水イソプロピルアルコールを０．４ｍＬ／分の流速で６０分間透過させることで洗浄した。洗浄後の中空糸モジュールは、脱水イソプロピルアルコールを封入した状態で、４℃で保存した。

５）変異ポリペプチドのカップリング
カルボキシル基をＮＨＳ活性化した中空糸モジュールに氷冷した１ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸を１０ｍＬ透過して、保存液である脱水イソプロピルアルコールを置換した。次いで、実施例１９で得られた変異体ポリペプチド２０ｍｇを７ｍＬのカップリング緩衝液（０．２ｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液、０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）に溶解後に２℃に冷却し、０．４ｍＬ／分の流速で中空糸モジュールを透過させ、透過液を供給液に連続的に加えることで、１６時間循環させた。循環中もモジュールを２℃に保つことで、カップリング時の温度を２℃に保った。所定時間経過後、中空糸モジュールにカップリング緩衝液を透過させることで、ＮＨＳ活性基とカップリングしなかった変異体ポリペプチドを洗浄・回収した。

６）ブロッキング
変異体ポリペプチドをカップリングした中空糸モジュールにブロッキング反応液（０．５ｍｏｌ／Ｌ エタノールアミン、０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を１０ｍＬ透過し、室温で３０分間放置することで、残留ＮＨＳをエタノールアミンでブロッキングした。反応後、この中空糸モジュールを純水で洗浄し、その後２０％エタノールでモジュールに封入した状態で４℃で保存した。

６）免疫グロブリンの最大結合容量および動的吸着容量測定
実施例１９と同様にクロマトグラフィーシステム（ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ、ＧＥヘルスケア社製）を用いて、温度変化による免疫グロブリン（献血ヴェノグロブリン−ＩＨ、ベネシス社製）の吸着・溶出試験を行った。下記式より免疫グロブリン濃度を算出することにより、免疫グロブリンの最大結合容量を算出した。
免疫グロブリン濃度（ｍｇ／ｍＬ）＝２８０ｎｍの吸光度／１４×１０
最大結合容量（ｍｇ／ｍＬ）＝
温度溶出画分の免疫グロブリン濃度×温度溶出画分の液量／膜体積

（結果）
免疫グロブリンの最大結合容量は１５．３ｍｇ／ｍＬ−膜体積であった（表５）。

実施例２４〜３１
形質転換体２〜８を使用し、架橋ポリビニルアルコールビーズの平均粒子径が６０μｍであること以外は実施例１９と同じ条件で、培養液から変異体ポリペプチドを精製し、架橋ポリビニルアルコールビーズに固定化し、免疫グロブリンの最大結合容量、及び動的吸着容量を測定した。結果を表５に示した。

比較例９〜１２
形質転換体１０〜１３を使用し、架橋ポリビニルアルコールビーズの平均粒子径が６０μｍであること以外は実施例１９と同じ条件で、培養液から変異体ポリペプチドを精製し、架橋ポリビニルアルコールビーズに固定化し、免疫グロブリンの最大結合容量、及び動的吸着容量を測定した。結果を表５に示した。

Claims (22)

1. Ｎ末端側からタグペプチド、リンカー配列、及びプロテインＡのＢドメイン変異体を含むポリペプチドが結合された担体からなる吸着材であって、
   上記リンカー配列が、Val-Pro-Arg配列を含まず、かつ７から１２個のアミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であり；前記プロテインＡのＢドメイン変異体が、ｐH５〜９及び６０℃未満の条件下においてイムノグロブリンとの結合性が温度によって変化しうるものである、上記吸着材。
2. リンカー配列が、１から４個のグリシン残基と３から７個のセリン残基を含む、請求項１に記載の吸着材。
3. リンカー配列が、メチオニン残基を含む、請求項１又は２に記載の吸着材。
4. リンカー配列が、ロイシン残基を含む、請求項１から３の何れか１項に記載の吸着材。
5. リンカー配列が、ヒスチジン残基を含む、請求項１から４の何れか１項に記載の吸着材。
6. リンカー配列が、
   グリシン残基、セリン残基及びメチオニン残基から構成されるアミノ酸配列；
   グリシン残基、セリン残基、メチオニン残基及びヒスチジン残基から構成されるアミノ酸配列；
   グリシン残基、セリン残基、メチオニン残基、ヒスチジン残基及びロイシン残基から構成されるアミノ酸配列；又は
   グリシン残基、セリン残基、メチオニン残基、ヒスチジン残基、ロイシン残基及びアルギニン残基から構成されるアミノ酸配列：
   の何れかである、請求項１から５の何れか１項に記載の吸着材。
7. リンカー配列が、Ser-Ser-Gly-(Xaa)n-Met（式中、nは３から８の整数を示し、n個のXaaはそれぞれ独立に、グリシン残基、セリン残基、ヒスチジン残基、ロイシン残基又はアルギニン残基を示す）で示されるアミノ酸配列である、請求項１から６の何れか１項に記載の吸着材。
8. リンカー配列が、Ser-Ser-Gly-Leu-(Xbb)m-His-Met（式中、mは１から６の整数を示し、m個のXbbはそれぞれ独立に、グリシン残基、セリン残基又はアルギニン残基を示す）で示されるアミノ酸配列である、請求項１から７の何れか１項に記載の吸着材。
9. タグペプチドが６ｘヒスチジンタグである、請求項１から８の何れか1項記載の吸着材。
10. プロテインＡのＢドメイン変異体が、配列番号１のポリペプチドと６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列（但し、配列番号１で表されるアミノ酸配列において少なくとも19位のGly及び／または22位のGlyは、Ala又はLeuに置換されている）であって、かつpH５〜９及び６０℃未満の条件下においてイムノグロブリンとの結合性が温度によって変化しうるアミノ酸配列を、１分子内に少なくとも１以上含むものである、請求項１から９の何れか1項に記載の吸着材。
11. プロテインＡのＢドメイン変異体が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を１分子内に少なくとも１以上含むものである、請求項１から１０の何れか1項に記載の吸着材。
12. 担体が、粒子状のクロマト充填剤である、請求項１から１１の何れか１項に記載の吸着材。
13. 担体の平均粒子径が２０〜２００μｍである、請求項１から１２の何れか１項に記載の吸着材。
14. 担体が、ポリビニルアルコールの架橋重合体から構成される、請求項１から１３の何れか１項に記載の吸着材。
15. ポリペプチドがアミド結合によって担体に結合されている、請求項１から１４の何れか１項に記載の吸着材。
16. 担体に対し、２０ｍｇ／ｍＬ樹脂以上のポリペプチドが結合している、請求項１から１５の何れか１項に記載の吸着材。
17. イムノグロブリンの最大結合容量が、２０ｍｇ／ｍＬ樹脂以上である、請求項１から１６の何れか１項に記載の吸着材。
18. 担体が、カルボキシル基を４００〜６００μｍｏｌ／ｍＬ樹脂含むものである、請求項１から１７の何れか１項に記載の吸着材。
19. 担体が膜である、請求項１から１１の何れか１項に記載の吸着材。
20. 膜が中空糸状である、請求項１９に記載の吸着材。
21. 膜が、グラフト高分子鎖を導入した基材膜から製造される、請求項１９又は２０に記載の吸着材。
22. 請求項１から２１の何れかに記載の吸着材に、イムノグロブリンを含有する試料を接触させることを含む、イムノグロブリンの精製方法。