ES2914278T3 - Polipéptidos de unión a inmunoglobulina mutados - Google Patents

Polipéptidos de unión a inmunoglobulina mutados Download PDF

Info

Publication number
ES2914278T3
ES2914278T3 ES17728070T ES17728070T ES2914278T3 ES 2914278 T3 ES2914278 T3 ES 2914278T3 ES 17728070 T ES17728070 T ES 17728070T ES 17728070 T ES17728070 T ES 17728070T ES 2914278 T3 ES2914278 T3 ES 2914278T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
seq
polypeptide
zvar
deleted
lndaqapk
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES17728070T
Other languages
English (en)
Inventor
Gustav Rodrigo
Tomas Bjorkman
Mats Ander
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cytiva Bioprocess R&D AB
Original Assignee
Cytiva Bioprocess R&D AB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB1608229.9A external-priority patent/GB201608229D0/en
Priority claimed from US15/282,367 external-priority patent/US10654887B2/en
Application filed by Cytiva Bioprocess R&D AB filed Critical Cytiva Bioprocess R&D AB
Application granted granted Critical
Publication of ES2914278T3 publication Critical patent/ES2914278T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G, L chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/24—Naturally occurring macromolecular compounds, e.g. humic acids or their derivatives
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/26—Synthetic macromolecular compounds
    • B01J20/265—Synthetic macromolecular compounds modified or post-treated polymers
    • B01J20/267—Cross-linked polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28014—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their form
    • B01J20/28016—Particle form
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28054—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their surface properties or porosity
    • B01J20/28078—Pore diameter
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/282—Porous sorbents
    • B01J20/285—Porous sorbents based on polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
    • B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
    • B01J20/3212—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/3272—Polymers obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B01J20/3274—Proteins, nucleic acids, polysaccharides, antibodies or antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1271—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Micrococcaceae (F), e.g. Staphylococcus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/10—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/52—Sorbents specially adapted for preparative chromatography

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Un polipéptido de unión a Fc que comprende una secuencia como se define en SEQ ID NO:53 KEX1Q X2AFYEILX3LP NLTEEQRX4X5F IX6X7LKDX8PSX9 SX10X11X12LAEAKX13 X14NX15AQAPK (SEQ ID NO:53) en el que, individualmente entre sí: X1 = A o está delecionado X2 = E o K, X3 = H X4 = A o N X5 = A, G, S, Y, Q, T, N, F, L, W, I, M, V, D, E, H, R o K X6 = Q X7 = S X8 = E o D X9 = V o está delecionado X10 = K o está delecionado X11 = A, E o N o está delecionado X12 = I X13 = K X14 = L X15 = D, F, Y, W, K o R, y dicho polipéptido tiene una estabilidad alcalina mejorada en comparación con un polipéptido o un polipéptido parental, como se define en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7, de modo que la estabilidad alcalina mejora, según se mide por la capacidad de unión de IgG remanente después de 24 o 25 h de incubación en NaOH acuoso 0,5 M o 1,0 M a 22 +/- 2 °C.

Description

DESCRIPCIÓN
Polipéptidos de unión a inmunoglobulina mutados
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere al campo de la cromatografía de afinidad y, más específicamente, a los dominios de unión a inmunoglobulina mutados de la proteína A, que son útiles en la cromatografía de afinidad de inmunoglobulinas. La invención también se refiere a multímeros de los dominios mutados y a matrices de separación que contienen los dominios mutados o los multímeros.
Antecedentes de la invención
Las inmunoglobulinas representan los productos biofarmacéuticos más extendidos en fabricación o desarrollo en todo el mundo. La alta demanda comercial y, por lo tanto, el valor de este mercado terapéutico particular ha llevado a que se haga hincapié en que las empresas farmacéuticas maximicen la productividad de sus respectivos procesos de fabricación de mAb mientras controlan los costos asociados.
La cromatografía de afinidad se utiliza, en la mayoría de los casos, como una de las etapas clave en la purificación de estas moléculas de inmunoglobulina, tales como anticuerpos monoclonales o policlonales. Una clase particularmente interesante de reactivos de afinidad son las proteínas capaces de unirse específicamente a partes invariables de una molécula de inmunoglobulina, siendo dicha interacción independiente de la especificidad de unión al antígeno del anticuerpo. Dichos reactivos se pueden usar ampliamente para la recuperación por cromatografía de afinidad de inmunoglobulinas de diferentes muestras tales como, entre otras, preparaciones de suero o plasma o materias primas derivadas de cultivos celulares. Un ejemplo de dicha proteína es la proteína A estafilocócica, que contiene dominios capaces de unirse a las porciones Fc y Fab de las inmunoglobulinas IgG de diferentes especies. Estos dominios se denominan comúnmente dominios E, D, A, B y C.
Debido a su alta afinidad y selectividad, los reactivos basados en la proteína A estafilocócica (“staphylococcal protein A”, SpA) han encontrado un uso generalizado en el campo de la biotecnología, por ejemplo, en cromatografía de afinidad para la captura y la purificación de anticuerpos, así como para la detección o la cuantificación. En la actualidad, el medio de afinidad basado en SpA es probablemente el medio de afinidad más utilizado para el aislamiento de anticuerpos monoclonales y sus fragmentos a partir de diferentes muestras, incluidos los sobrenadantes de cultivos celulares industriales. En consecuencia, varias matrices que comprenden ligandos de proteína A están disponibles en el mercado, por ejemplo, en forma de proteína A nativa (por ejemplo, Protein A SEPHAROSE™, GE Healthcare, Uppsala, Suecia) y también que comprende proteína A recombinante (por ejemplo, rProtein A-SEPHAROSE™, GE Healthcare). Más concretamente, la manipulación genética realizada en el producto comercial de proteína A recombinante tiene como objetivo facilitar su unión a un soporte y aumentar la productividad del ligando.
Estas aplicaciones, al igual que otras aplicaciones de cromatografía de afinidad, requieren una atención integral para la eliminación definitiva de contaminantes. Dichos contaminantes pueden ser, por ejemplo, moléculas no eluidas adsorbidas sobre la fase estacionaria o matriz en un procedimiento cromatográfico, tales como biomoléculas o microorganismos no deseados, incluidos, por ejemplo, proteínas, carbohidratos, lípidos, bacterias y virus. La eliminación de dichos contaminantes de la matriz se suele realizar tras una primera elución del producto deseado con el fin de regenerar la matriz antes de su uso posterior. Tal eliminación generalmente implica un procedimiento conocido como limpieza en el lugar (“cleaning-in-place”, CIP), en el que se usan agentes capaces de eluir los contaminantes de la fase estacionaria. Una clase de agentes de este tipo que se usa con frecuencia son las disoluciones alcalinas que pasan sobre dicha fase estacionaria. En la actualidad, el agente de limpieza y desinfección más utilizado es el NaOH, y la concentración del mismo puede oscilar entre 0,1 y, por ejemplo, 1 M, dependiendo del grado y naturaleza de la contaminación. Esta estrategia está asociada con la exposición de la matriz a disoluciones con valores de pH superiores a 13. Para muchas matrices de cromatografía de afinidad que contienen ligandos de afinidad proteicos, dicho entorno alcalino es una condición muy dura y, en consecuencia, da como resultado capacidades reducidas debido a la inestabilidad del ligando al pH alto implicado.
Por lo tanto, una extensa investigación se ha centrado en el desarrollo de ligandos de proteínas modificados genéticamente que muestren una capacidad mejorada para soportar valores de pH alcalinos. Por ejemplo, Gülich et al. (Susanne Gülich, Martin Linhult, Per-Áke Nygren, Mathias Uhlén, Sophia Hober, Journal of Biotechnology, 80 (2000), 169-178) sugirieron la modificación de proteínas para mejorar las propiedades de estabilidad de un dominio de unión a albúmina estreptocócica (“albumin-binding domain”, a BD) en ambientes alcalinos. Gülich et al. crearon un mutante de ABD, en el que los cuatro restos asparagina han sido reemplazados por leucina (un resto), aspartato (dos restos) y lisina (un restos). Además, Gülich et al. informan que su mutante exhibe un comportamiento de unión a la proteína diana similar al de la proteína nativa, y que las columnas de afinidad que contienen el ligando diseñado muestran mayores capacidades de unión después de la exposición repetida a condiciones alcalinas que las columnas preparadas con el ligando parental no diseñado. Por lo tanto, en el artículo se concluye que los cuatro restos asparagina pueden reemplazarse sin ningún efecto significativo sobre la estructura y la función.
T rabajos recientes muestran que también se pueden realizar cambios en la proteína A (SpA) para lograr propiedades similares. La publicación de solicitud de patente de EE. UU. US 2005/0143566 revela que cuando al menos un resto asparagina se muta a un aminoácido que no sea glutamina o ácido aspártico, la mutación confiere una mayor estabilidad química a valores de pH de hasta aproximadamente 13-14 en comparación con la SpA original, tal como el dominio B de SpA, o proteína Z, una construcción sintética derivada del dominio B de SpA (documento US 5.143.844). Los autores demuestran que cuando estas proteínas mutadas se usan como ligandos de afinidad, los medios de separación, como se esperaba, pueden soportar mejor los procedimientos de limpieza que usan agentes alcalinos. También se han publicado otras mutaciones de dominios de proteína A con el objetivo de aumentar la estabilidad alcalina en los documentos US 8.329.860, JP 2006304633A, US 8.674.073, US 2010/0221844, US 2012/0208234, US 9.051.375, US 2014/0031522, US 2013/0274451, WO 2014/146350 y JP2010081866. Sin embargo, los mutantes disponibles actualmente siguen siendo sensibles al pH alcalino y la concentración de NaOH durante la limpieza suele limitarse a 0,1 M, lo que significa que es difícil lograr una limpieza completa. Concentraciones más altas de NaOH, que mejorarían la limpieza, conducen a pérdidas de capacidad inaceptables.
Por lo tanto, todavía existe la necesidad en este campo de obtener una matriz de separación que contenga ligandos de proteínas que tengan una estabilidad mejorada adicional frente a los procedimientos de limpieza alcalina.
Sumario de la invención
Un aspecto de la invención es proporcionar un polipéptido con estabilidad alcalina mejorada. Esto se logra con un polipéptido como se define en la reivindicación 1.
Una ventaja es que se mejora la estabilidad alcalina con respecto a los polipéptidos parentales, manteniendo una unión altamente selectiva hacia las inmunoglobulinas y otras proteínas que contienen Fc.
Un segundo aspecto de la invención es proporcionar un multímero con estabilidad alcalina mejorada, que comprende una pluralidad de polipéptidos. Esto se logra con un multímero como se define en las reivindicaciones.
Un tercer aspecto de la invención es proporcionar un ácido nucleico o un vector que codifica un polipéptido o multímero con estabilidad alcalina mejorada. Esto se logra con un ácido nucleico o vector como se define en las reivindicaciones. Un cuarto aspecto de la invención es proporcionar una matriz de separación capaz de unirse selectivamente a inmunoglobulinas y otras proteínas que contienen Fc y mostrar una estabilidad alcalina mejorada. Esto se logra con una matriz de separación como se define en las reivindicaciones.
Un quinto aspecto de la invención es proporcionar un método eficaz y barato para aislar una inmunoglobulina u otra proteína que contenga Fc. Esto se logra con un método como se define en las reivindicaciones.
Otras realizaciones adecuadas de la invención se describen en las reivindicaciones dependientes.
Definiciones
Los términos “anticuerpo” e “inmunoglobulina” se usan aquí de manera intercambiable, y se entiende que incluyen también fragmentos de anticuerpos, proteínas de fusión que comprenden anticuerpos o fragmentos de anticuerpos y conjugados que comprenden anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.
Las expresiones “polipéptido de unión a Fc” y “proteína de unión a Fc” significan un polipéptido o proteína respectivamente, capaz de unirse a la parte cristalizable (Fc) de un anticuerpo e incluyen, por ejemplo, proteína A y proteína G, o cualquier fragmento o proteína de fusión de las mismas que haya mantenido dicha propiedad de unión. El término “conector” en el presente documento significa un elemento que une dos unidades polipeptídicas, monómeros o dominios entre sí en un multímero.
El término “espaciador” en el presente documento significa un elemento que conecta un polipéptido o un multímero de polipéptido a un soporte.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra un alineamiento de los dominios de unión a Fc definidos por SEQ ID NO:1-7 y 51-52.
La figura 2 muestra los resultados del ejemplo 2 para la estabilidad alcalina de las variantes polipeptídicas Zvar tetrámeras parentales y mutadas (SEQ ID NO:7) acopladas a un chip biosensor SPR.
La figura 3 muestra los resultados del ejemplo 4 para la estabilidad alcalina (NaOH 0,5 M) de las variantes polipeptídicas Zvar tetrámeras parentales y mutadas (SEQ ID NO:7) acopladas a esferas de agarosa.
La figura 4 muestra los resultados del ejemplo 4 para la estabilidad alcalina (NaOH 1,0 M) de las variantes polipeptídicas Zvar tetrámeras parentales y mutadas (SEQ ID NO:7) acopladas a esferas de agarosa.
Descripción detallada de las realizaciones
La descripción describe un polipéptido de unión a Fc, que comprende, o consiste esencialmente en un mutante de un dominio de unión a Fc parental de la proteína A (SpA) de Staphylococcus, como se define (o que tiene al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % de identidad con esta) en SEQ ID NO:1 (dominio E), SEQ ID NO:2 (dominio D), SEQ ID NO:3 (dominio A), SEQ ID NO:22 (variante A-dominio ), SEQ ID NO:4 (dominio B), SEQ ID NO:5 (dominio C), SEQ ID NO:6 (proteína z ), SEQ ID NO:7 (Zvar), SEQ ID NO:51 (Zvar sin los aminoácidos 1 -6 de la región del conector) o SEQ ID NO:52 (dominio C sin los aminoácidos 1-6 de la región del conector) como se ilustra en la figura 1, en el que, en el mutante, al menos el resto asparagina (o serina, en el caso de SEQ ID NO:2) en la posición* correspondiente a la posición 11 en SEQ ID NO:4-7 se ha mutado a un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido glutámico, lisina, tirosina, treonina, fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano, metionina, valina, alanina, histidina y arginina Dichos polipéptidos de unión a Fc no forman parte de la invención reivindicada. La proteína Z (SEQ ID NO:6) es un dominio B mutado como se describe en el documento US5143844, mientras que SEQ ID NO:7 indica otra variante mutada de proteína Z, denominada en el presente documento Zvar, con las mutaciones N3A,N6D,N23T. SEQ ID NO:22 es una variante natural del dominio A en la proteína A de Staphylococcus aureus cepa N315, que tiene una mutación A46S, usando la terminología de posición de la figura 1. La mutación de N11 en estos dominios confiere una estabilidad alcalina mejorada en comparación con el dominio/polipéptido parental, sin afectar las propiedades de unión a inmunoglobulina. Por lo tanto, el polipéptido también se puede describir como un polipéptido de unión a Fc o a inmunoglobulina o, como alternativa, como una unidad polipeptídica de unión a Fc o a inmunoglobulina.
*A lo largo de esta descripción, se usa la convención de numeración de posiciones de restos aminoácidos de la figura 1, y los números de posición se indican como correspondientes a los de SEQ ID NO:4-7. Esto se aplica también a los multímeros, en los que los números de posición indican las posiciones en las unidades polipeptídicas o monómeros según la convención de la figura 1.
La invención proporciona un polipéptido de unión a Fc que comprende una secuencia definida por SEQ ID NO:53. SEQ ID NO:53
KEXiQ X2AFYEILX3LP NLTEEQRX4X5F IX6X7LKDX8PSX9 SX10X11X12LAEAKX13 X14NX15AQAPK
en la que, individualmente entre sí:
XI = A o está delecionado
X2 = E o K
X3 = H
X4 = A o N
X5 = A, G, S, Y, Q, T, N, F, L, W, I, M, V, D, E, H, R o K
X6 = Q
X7 = S
X8 = E o D
X9 = V o está delecionado
X10 = K o está delecionado
XI I = A, E o N o está delecionado
X12 = I
X13 = K
X14 = L
X15 = D, F,Y,W,K o R,
y dicho polipéptido tiene una estabilidad alcalina mejorada en comparación con un polipéptido o un polipéptido parental, como se define en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7, de modo que la estabilidad alcalina mejora, según se mide por la capacidad de unión a IgG remanente después de 24 o 25 h de incubación en NaOH acuoso 0,5 M o 1,0 M a 22 /- 2 °C.
Específicamente, los restos aminoácidos en SEQ ID NO:53 pueden ser, individualmente entre sí:
X2 = E
X4 = N.
En algunas realizaciones X1 = A, X2 = E, X3 = H, X4 = N, X5 = S, Y, Q, T, N, F, L, W, I, M, V, D, E, H, R o K, X6 = Q, X7 = S, X8 = D, X9 = V, X10 = K, X11 = A, X12 = I, X13 = K, X14 = L, X15= D.
En ciertas realizaciones X1 está delecionado, X2 = E, X3 = H, X4 = N, X5 = A, X6 = Q, X7 = S, X8 = D, X9 = V, X10 = K, X11 = A, X12 = I, X13 = K, X14 = L, X15= D.
En algunas realizaciones X1 = A, X2 = E, X3 = H, X4 = N, X5 = A, X6 = Q, X7 = S, X8 = D, X9 está delecionado, X10 = K, X11 = A, X12 = I, X13 = K, X14 = L, X15= D.
En ciertas realizaciones X1 = A, X2 = E, X3 = H, X4 = N, X5 = A, X6 = Q, X7 = S, X8 = D, X9 = V, X10 está delecionado, X11 = A, X12 = I, X13 = K, X14 = L, X15= D.
En algunas realizaciones X1 = A, X2 = E, X3 = H, X4 = N, X5 = A, X6 = Q, X7 = S, X8 = D, X9 = V, X10 = K, X11 está delecionado, X12 = I, X13 = K, X14 = L, X15= D.
En ciertas realizaciones X1 = A, X2 = E, X3 = H, X4 = N, X5 = A, X6 = Q, X7 = S, X8 = D, X9 = V, X10 = K, X11 = A, X12 = I, X13 = K, X14 = L, X15= F, Y, W, K o R.
En las realizaciones analizadas anteriormente, el polipéptido puede, en algunos casos, no comprender ninguna secuencia definida por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-16, 17-34 y 36-52.
El polipéptido también puede comprender mutaciones adicionales, tales como sustituciones en al menos una de las posiciones correspondientes a las posiciones 10, 15, 23, 36, 47, 55 y 57 en SEQ ID NO:4-7. En una o más de estas posiciones, el resto aminoácido original puede, por ejemplo, sustituirse por un aminoácido que no sea asparagina, prolina o cisteína. El resto aminoácido original puede, por ejemplo sustituirse por una alanina, una valina, una treonina, una serina, una lisina, un ácido glutámico o un ácido aspártico. Además, se pueden delecionar uno o más restos aminoácidos, por ejemplo, desde las posiciones 56-58.
El resto aminoácido en la posición correspondiente a la posición 9 en SEQ ID NO:4-7 (X1) es una alanina o está delecionado. La combinación de las mutaciones en las posiciones 9 y 11 proporciona una estabilidad alcalina particularmente buena, como se muestra en los ejemplos. En realizaciones específicas, el resto aminoácido que corresponde a la posición 9 en SEQ ID NO:7 es una alanina y el resto aminoácido que corresponde a la posición 11 es una lisina o un ácido glutámico, tal como una lisina. Las mutaciones en la posición 9 correspondiente también se analizan en la solicitud en tramitación PCT/SE2014/050872.
El resto aminoácido en la posición correspondiente a la posición 50 en SEQ ID NO:4-7 (X13) es una lisina.
En algunas realizaciones, el resto aminoácido en la posición correspondiente a la posición 43 en SEQ ID NO:4-7 (X11) es una alanina o un ácido glutámico, tal como una alanina o se puede delecionar. En realizaciones específicas, los restos aminoácidos correspondientes a las posiciones 9 y 11 en SEQ ID NO:7 son alanina y lisina/ácido glutámico respectivamente, mientras que el resto aminoácido en la posición 43 es alanina o ácido glutámico.
En ciertas realizaciones, el resto aminoácido en la posición correspondiente a la posición 28 en SEQ ID NO:4-7 (X5) es una alanina o una asparagina, tal como una alanina.
El resto aminoácido en la posición correspondiente a la posición 40 en SEQ ID NO:4-7 (X9) es valina o está delecionado. En realizaciones específicas, los restos aminoácidos en las posiciones 9 y 11 en SEQ ID NO:7 son alanina y ácido glutámico respectivamente, mientras que el resto aminoácido en la posición 40 es valina. Opcionalmente, el resto aminoácido en la posición 43 puede ser alanina o ácido glutámico.
El resto aminoácido en la posición correspondiente a la posición 42 en SEQ ID NO:4-7 (X10) es una lisina o está delecionado.
El resto aminoácido en la posición correspondiente a la posición 18 en SEQ ID NO: ID NO:4-7 (X3) es una histidina.
El resto aminoácido en la posición correspondiente a la posición 33 en SEQ ID NO:4-7 (X7) es una serina.
El resto aminoácido en la posición correspondiente a la posición 37 en SEQ ID NO:4-7 (X8) es un ácido glutámico o un ácido aspártico, tal como un ácido glutámico.
El resto aminoácido en la posición correspondiente a la posición 51 en SEQ ID NO:4-7 (X14) es una leucina.
El resto aminoácido en la posición correspondiente a la posición 44 en SEQ ID NO:4-7 (X12) es una isoleucina. En realizaciones específicas, los restos aminoácidos en las posiciones 9 y 11 en SEQ ID NO:7 son alanina y lisina/ácido glutámico, respectivamente, mientras que el resto aminoácido en la posición 44 es isoleucina. Opcionalmente, el resto aminoácido en la posición 43 puede ser alanina o ácido glutámico.
Se han delecionado las posiciones correspondientes a las posiciones 1,2, 3, 4, 5 y 6 en SEQ ID NO:4-7. En variantes específicas, el polipéptido original es el dominio C de la proteína A (SEQ ID NO:5). Los efectos de estas deleciones en el dominio C nativo se describen en los documentos US9018305 y US8329860.
La presente descripción divulga una amplia gama de mutaciones, de las cuales algunas quedan fuera del alcance reivindicado como se describió anteriormente, en las que la mutación en SEQ ID NO:4-7, tal como en SEQ ID NO:7, se selecciona del grupo que consiste en: N11K ; N11E; N11Y; N11T; N11F; N11L; N11W; N11I; N11M; N11V; N11A; N11H; N11R; N11E,Q32A; N11E,Q32E,Q40E; N11E,Q32E,K50R; Q9A,N11E,N43A; Q9A,N11E,N28A,N43A; Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43E,L44I; Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43A,L44I; N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R,L51Y; Q9A,N11 E,N28A,Q40V,A42K,N43A,L44I; Q9A,N11 K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y; N11K,H18K,D37E,A42R,N43A,L44I; Q9A,N11K,H18K,D37E,A42R,N43A,L44I; Q9A,N11 K,H18K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R; Q9A,N11 K,H18K,D37E,A42R; Q9A,NIIE,D37E,Q40V,A42K,N43A,L44I y Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42R,N43A,L44I. Estas mutaciones proporcionan estabilidades alcalinas particularmente altas. La mutación en SEQ ID NO:4-7, tal como en SEQ ID NO:7, también se puede seleccionar del grupo que consiste en N11K; N11Y; N11F; N11L; N11W; N11I; N11M; N11V; N11A; N11H; N11R; Q9A,N11E,N43A; Q9A,N11E,N28A,N43A; Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43E,L44I; Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43A,L44I; Q9A,N11 E,N28A,Q40V,A42K,N43A,L44I; N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y; Q9A,N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y; N11K,H18K,D37E,A42R,N43A,L44I; Q9A,N11K,H18K,D37E,A42R,N43A,L44I y Q9A,N11 K,H18K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R.
En ciertas realizaciones, el polipéptido consiste esencialmente en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:54-70, consiste esencialmente en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:71 -75, o puede consistir esencialmente en una secuencia seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:76-79. Además, puede consistir esencialmente en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:89-95. En las realizaciones analizadas anteriormente, el polipéptido puede, en algunos casos, no comprender ninguna secuencia definida por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1 -16, 17-34 y 36-52.
El polipéptido puede definirse, por ejemplo, mediante una secuencia seleccionada de los grupos anteriores o de subconjuntos de estos grupos, pero también puede comprender restos aminoácidos adicionales en el extremo N- y/o C-terminal, por ejemplo, una secuencia conductora en el extremo N-terminal y/o una secuencia de cola en el extremo C-terminal.
SEQ ID NO:8 Zvar(Q9A,N11 E,N43A) (no dentro del alcance reivindicado)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO:9 Zvar(Q9A,N11 E,N28A,N43A) (no dentro del alcance reivindicado)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO:10 Zvar(Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43E,L44I) (no dentro del alcance reivindicado)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO:11 Zvar(Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43A,L44I) (no dentro del alcance reivindicado)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK " LNDAQAPK
SEQ ID NO:12 Zvar(N11 E,Q32A) (no dentro del alcance reivindicado)
VDAKFDKEQQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IASLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO:13 Zvar(N11E) (no dentro del alcance reivindicado)
VDAKFDKEQQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO:14 Zvar(N11 E,Q32E,Q40E) (no dentro del alcance reivindicado)
VDAKFDKEQQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IESLKDDPSE SANLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO:15 Zvar(N11 E,Q32E,K50R) (no dentro del alcance reivindicado)
VDAKFDKEQQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IESLKDDPSQ SANLLAEAKR LNDAQAPK
SEQ ID NO:16 Zvar(N11K) (no dentro del alcance reivindicado)
VDAKFDKEQQ KAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO:23 Zvar(N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y) (no dentro del alcance reivindicado)
VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK
SEQ ID NO:24 Zvar(Q9A,N11 E,N28A,Q40V,A42K,N43A,L44I) (no dentro del alcance reivindicado)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO:25 Zvar(Q9A,N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y) (no dentro del alcance reivindicado)
VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRAAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK
SEQ ID NO:26 Zvar(N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I) (no dentro del alcance declarado)
VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRATLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO:27 Zvar(Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I) (no dentro del alcance reivindicado)
VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO:28 Zvar(Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R) (no dentro del alcance declarado)
VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRAILAEAKR LNDAQAPK
SEQ ID NO:29 Zvar(Q9A,N11 K,H18K,D37E,A42R) (no dentro del alcance reivindicado)
VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO:36 B(Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43A,L44I) (no dentro del alcance reivindicado) ADNKFNKEAQ EAFYEILHLP NLNEEQRNGF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:37 C(Q9A,N11 E,E43A) (no dentro del alcance reivindicado)
ADNKFNKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNGF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:38 Zvar(N11Y) (no dentro del alcance reivindicado)
VDAKFDKEQQ y a f y e il h l p n l t e e q r n a f iq s l k d d p s q s a n l l a e a k k LNDAQAPK SEQ ID NO:39 Zvar(N11T) (no dentro del alcance reivindicado)
VDAKFDKEQQ TAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:40 Zvar(N11F) (no dentro del alcance reivindicado)
VDAKFDKEQQ FAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:41 Zvar(N11L) (no dentro del alcance reivindicado)
VDAKFDKEQQ LAFYETLHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:42 Zvar(N11W) (no dentro del alcance reivindicado)
VDAKFDKEQQ WAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:43 Zvar(N111) (no dentro del alcance reivindicado)
VDAKFDKEQQ IAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:44 Zvar(N11M) (no dentro del alcance reivindicado)
VDAKFDKEQQ MAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:45 Zvar(N11V) (no dentro del alcance reivindicado)
VDAKFDKEQQ VAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:46 Zvar(N11A) (no dentro del alcance reivindicado)
VDAKFDKEQQ AAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:47 Zvar(N11H) (no dentro del alcance reivindicado)
VDAKFDKEQQ HAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:48 Zvar(N11R) (no dentro del alcance reivindicado)
VDAKFDKEQQ RAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:49 Zvar(Q9A,N11 E,D37E,Q40V,A42K,N43A,L44I) (no dentro del alcance reivindicado) VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:50 Zvar(Q9A,N11 E,D37E,Q40V,A42R,N43A,L44I) (no dentro del alcance reivindicado) VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:54 Zvar(Q9A,N11 E,A29G,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNGF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:55 Zvar(Q9A,N11 E,A29S,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNSF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:56 Zvar(Q9A,N11 E,A29Y,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNYF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:57 Zvar(Q9A,N11 E,A29Q,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNQF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:58 Zvar(Q9A,N11 E,A29T,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNTF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:59 Zvar(Q9A,N11 E,A29N,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNNF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:60 Zvar(Q9A,N11 E,A29F,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNFF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:61 Zvar(Q9A,N11E,A29L,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNLF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:62 Zvar(Q9A,N11 E,A29W,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNWF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:63 Zvar(Q9A,N11 E,A29I,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNIF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:64 Zvar(Q9A,N11 E,A29M,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNMF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:65 Zvar(Q9A,N11 E,A29V,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNVF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:66 Zvar(Q9A,N11 E,A29D,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNDF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:67 Zvar(Q9A,N11 E,A29E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNEF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:68 Zvar(Q9A,N11 E,A29H,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNHF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:69 Zvar(Q9A,N11 E,A29R,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNRF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:70 Zvar(Q9A,N11 E,A29K,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNKF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK SE ID NO 71 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I,D53F)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNFAQAPK SEQ ID NO:72 Zvar(Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43A,L44I,D53Y)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNYAQAPK SEQ ID NO:73 Zvar(Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43A,L44I,D53W)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNWAQAPK SEQ ID NO:74 Zvar(Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43A,L44I,D53K)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNKAQAPK SEQ ID NO:75 Zvar(Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43A,L44I,D53R)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNRAQAPK SEQ ID NO:76 Zvar(Q9del,N11 E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKE Q EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:77 Zvar(Q9A,N11 E,Q40del,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPS_ SKAILAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO:78 Zvar(Q9A,N11 E,Q40V,A42del,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV S AILAEAKK
LNDAQAPK SEQ ID NO:79 Zvar(Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43del,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKJLAEAKK
LNDAQAPK SEQ ID NO:89 Zvar(D2del,A3del,K4del,Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
V__FDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK
LNDAQAPK SEQ ID NO:90 Zvar(V1del,D2del,Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43A,L44I,K58del)
_AKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK
LNDAQAP SEQ ID NO:91 Zvar(K4del,F5del,D6del,K7del,E8del,Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDA____AQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK
LNDAQAPK SEQ ID NO:92 Zvar(Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43A,L44I,A56del,P57del,K58del)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK
LNDAQ__
SEQ ID NO:93 Zvar(V1del,D2del,A3del,Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
__KFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK
LNDAQAPK SEQ ID NO:94 Zvar(V1del,D2del,A3del,K4del,F5del,D6del,K7del,E8del,Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43A,L44I) ______ AQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK
LNDAQAPK SEQ ID NO:95 Zvar(Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43A,L44I,K58_insYEDG)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK
LNDAQAPKYE DG
En un segundo aspecto, la presente invención describe un multímero que comprende, o que consiste esencialmente en una pluralidad de unidades polipeptídicas como se define en cualquier realización descrita anteriormente. El uso de multímeros puede aumentar la capacidad de unión de inmunoglobulinas y los multímeros también pueden tener una mayor estabilidad alcalina que los monómeros. El multímero puede ser, por ejemplo, un dímero, un trímero, un tetrámero, un pentámero, un hexámero, un heptámero, un octámero o un nonámero. Puede ser un homomultímero, en el que todas las unidades del multímero son idénticas, o puede ser un heteromultímero, en el que al menos una unidad difiere de las demás. Ventajosamente, todas las unidades en el multímero son estables a los álcalis, por ejemplo, al comprender las mutaciones descritas anteriormente. Los polipéptidos pueden unirse entre sí directamente mediante enlaces peptídicos entre los extremos C-terminal y N-terminal de los polipéptidos. Como alternativa, dos o más unidades en el multímero se pueden unir mediante conectores que comprenden especies oligoméricas o poliméricas, tales como elementos que comprenden hasta 15 o 30 aminoácidos, tales como 1-5, 1-10 o 5-10 aminoácidos. Este es el caso en particular para las mutaciones de SEQ ID NO:51 y 52 y para el polipéptido SEQ ID NO:53, en la que ejemplos específicos de conectores pueden ser, por ejemplo, VDAKFD o ADNKFN, tal como VDAKFD. La naturaleza de dicho conector preferiblemente no debería desestabilizar la conformación espacial de las unidades de proteína. Esto puede lograrse, por ejemplo, evitando la presencia de prolina en los conectores. Además, dicho conector también debería ser preferiblemente lo suficientemente estable en ambientes alcalinos para no perjudicar las propiedades de las unidades de proteína mutadas. Para ello es ventajoso que los conectores no contengan asparagina. Además, puede ser ventajoso que los conectores no contengan glutamina. El multímero puede comprender además en el extremo N-terminal una pluralidad de restos aminoácidos, por ejemplo, procedentes del proceso de clonación o que constituyen un resto de una secuencia de señalización escindida. El número de restos aminoácidos adicionales puede ser, por ejemplo, 15 o menos, tal como 10 o menos o 5 o menos. Como ejemplo específico, el multímero puede comprender una secuencia AQ en el extremo N-terminal.
En ciertas realizaciones, el multímero puede comprender, o consistir esencialmente en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SeQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34 y SEQ ID NO:35. Estas secuencias se enumeran a continuación y se denominan Parental(Mutaciones)n, siendo n el número de unidades monoméricas en un multímero.
SEQ ID NO:17 Zvar(Q9A,N11E,N43A)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK
LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO: ID NO:18 Zvar(Q9A,N11 E,N28A,N43A)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK
LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO:19 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43E,L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK
LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO:20 Zvar(Q9A,N11 E,040V,A42K,N43A,L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK
LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO: ID NO:30 Zvar(N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y)4
AQGT VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR
YNDAQAPK VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ
SRAILAEAKR YNDAQAPK VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF
IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPKC
SEQ D NO:31 Zvar(Q9A,N1K,H18K,D37E,A42R)4
AQGT VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK
LNDAQAPK VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ
SRNLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF
IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO:32 Zvar(Q9A,N11 E,N28A,Q40V,A42K,N43A,L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK
LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV
SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF
IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO: ID NO:33 Zvar(Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43A,L44I)6
AQGT VDAKFDKEAQ e a f y e il h l p n l t e e q r n a f iq s l k d d p s v s k a i l a e a k k LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC SEQ ID NO:34 Zvar(Q9A,N11 E,D37E,Q40V,A42K,N43A,L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC SEQ ID NO:35 Zvar(Q9A,N11 E,D37E,Q40V,A42R,N43A,L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPKC SEQ ID NO:80 Zvar(Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43A,L44I)2 con D2, A3 y K4 en el conector delecionados VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC SEQ ID NO:81 Zvar(Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43A,L44I)2 con K58, V1 y D2 en el conector delecionados VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAP AKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC SEQ ID NO:82 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)2 con P57, K58, VI, D2 y A3 en el conector delecionados
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAP AKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC SEQ ID NO:83 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)2 con K4, F5, D6, K7 y E8 en el conector delecionados
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC SEQ ID NO:84 Zvar(Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43A,L44I)2 con A56, P57 y K58 en el conector delecionados VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQ VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC SEQ ID NO:85 Zvar(Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43A,L44I)2 con VI, D2 y A3 en el conector delecionados VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK KFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO:86 Zvar(Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43A,L44I)2 con VI, D2, A3, K4, F5, D6, K7 y E8 en el conector delecionados
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK
LNDAQAPK AQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK
LNDAQAPKC
SEQ ID NO:87 Zvar(Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43A,L44I)2 con YEDG insertado en el conector entre K58 y VI
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK
LNDAQAPK YEDG VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV
SKAILAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO:88 Zvar2
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK
LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV
SKAILAEAKK LNDAQAPKC
En algunas realizaciones, el polipéptido y/o multímero, como se describió anteriormente, comprende además en el extremo C-terminal o N-terminal uno o más elementos de acoplamiento, seleccionados del grupo que consiste en uno o más restos cisteína, una pluralidad de restos lisina y una pluralidad de restos histidina. Los elementos de acoplamiento también pueden estar ubicados dentro de 1-5 restos aminoácidos, tal como dentro de 1-3 o 1-2 restos aminoácidos desde el extremo C-terminal o N-terminal. El elemento de acoplamiento puede ser, por ejemplo, una sola cisteína en el extremo C-terminal. Los elementos de acoplamiento pueden estar directamente unidos al extremo C- o N-terminal, o pueden estar unidos a través de un tramo que comprende hasta 15 aminoácidos, tal como 1-5, 1-10 o 5­ 10 aminoácidos. Preferiblemente, este tramo también debería ser suficientemente estable en ambientes alcalinos para no perjudicar las propiedades de la proteína mutada. Para ello, es ventajoso que el tramo no contenga asparagina. También puede ser ventajoso que el tramo no contenga glutamina. Una ventaja de tener una cisteína C-terminal es que el acoplamiento de punto final de la proteína puede lograrse mediante la reacción del tiol de cisteína con un grupo electrofílico sobre un soporte. Esto proporciona una excelente movilidad de la proteína acoplada que es importante para la capacidad de unión.
La estabilidad alcalina del polipéptido o multímero se puede evaluar acoplándolo a un chip SPR, por ejemplo, a los chips sensores Biacore CM5 como se describe en los ejemplos, usando, por ejemplo, NHS- o químicas de acoplamiento de maleimida, y midiendo la capacidad de unión a inmunoglobulinas del chip, normalmente utilizando IgG humana policlonal, antes y después de la incubación en disoluciones alcalinas a una temperatura específica, por ejemplo, 22 /- 2 °C. La incubación puede realizarse, por ejemplo, en NaOH 0,5 M durante un número de ciclos de 10 min, tal como 100, 200 o 300 ciclos. La capacidad de IgG de la matriz después de 100 ciclos de incubación de 10 min en NaOH 0,5 M a 22 /- 2 °C puede ser de al menos 55, tal como al menos 60, al menos 80 o al menos el 90 % de la capacidad de IgG antes de la incubación. Como alternativa, la capacidad de IgG remanente después de 100 ciclos para un mutante particular medido como se indicó anteriormente se puede comparar con la capacidad de IgG remanente para el polipéptido/multímero original. En este caso, la capacidad de IgG remanente para el mutante puede ser de al menos el 105 %, tal como al menos el 110 %, al menos el 125 %, al menos el 150 % o al menos el 200 % del polipéptido/multímero original.
En un tercer aspecto, la presente invención describe un ácido nucleico que codifica un polipéptido o multímero según cualquier realización descrita anteriormente. Por lo tanto, la invención incluye todas las formas de la presente secuencia de ácido nucleico, tales como el ARN y el ADN que codifica el polipéptido o multímero. La invención incluye un vector, tal como un plásmido, que además de la secuencia codificante comprende las secuencias señal requeridas para la expresión del polipéptido o multímero según la invención. En una realización, el vector comprende un ácido nucleico que codifica un multímero según la invención, en el que los ácidos nucleicos separados que codifican cada unidad pueden tener secuencias de ADN homólogas o heterólogas.
Además, en el presente documento se describe un sistema de expresión que comprende un ácido nucleico o un vector como se describe anteriormente. El sistema de expresión puede ser, por ejemplo, un sistema de células huésped procarióticas gram-positivas o gram-negativas, por ejemplo, E. coli o Bacillus sp. que se ha modificado para expresar el presente polipéptido o multímero. En una realización alternativa, el sistema de expresión es un sistema de células huésped eucarióticas, tales como una levadura, por ejemplo, Pichia pastoris o Saccharomyces cerevisiae, o células de mamífero, por ejemplo, células CHO.
En un cuarto aspecto, la presente invención describe una matriz de separación, en la que una pluralidad de polipéptidos o multímeros según cualquier realización descrita anteriormente se han acoplado a un soporte sólido. Tal matriz es útil para la separación de inmunoglobulinas u otras proteínas que contienen Fc y, debido a la estabilidad alcalina mejorada de los polipéptidos/multímeros, la matriz soportará condiciones altamente alcalinas durante la limpieza, lo cual es esencial para el uso repetido a largo plazo en un entorno de separación en bioprocesos. La estabilidad alcalina de la matriz se evalúa midiendo la capacidad de unión a inmunoglobulinas, normalmente utilizando IgG humana policlonal, antes y después de la incubación en disoluciones alcalinas a una temperatura específica, por ejemplo, 22 /- 2 °C. La incubación puede realizarse, por ejemplo, en NaOH 0,5 M o 1,0 M durante una serie de ciclos de 15 min, tales como 100, 200 o 300 ciclos, correspondientes a un tiempo total de incubación de 25, 50 o 75 h. La capacidad de IgG de la matriz después de 96-100 ciclos de incubación de 15 min o un tiempo total de incubación de 24 o 25 h en NaOH 0,5 M a 22 /- 2 °C puede ser de al menos 80, tal como al menos 85, al menos 90 o al menos 95 % de la capacidad de IgG antes de la incubación. La capacidad de la matriz después de un tiempo total de incubación de 24 h en NaOH 1,0 M a 22 /- 2 °C puede ser de al menos 70, tal como al menos 80 o al menos 90 % de la capacidad de IgG antes de la incubación.
Como comprenderán los expertos en la materia, el polipéptido o multímero expresado debe purificarse en la medida adecuada antes de inmovilizarse sobre un soporte. Dichos métodos de purificación son bien conocidos en la técnica, y la inmovilización de ligandos basados en proteínas sobre soportes se lleva a cabo fácilmente utilizando métodos convencionales. Los métodos y soportes adecuados se analizarán a continuación con más detalle.
El soporte sólido de la matriz según la invención puede ser de cualquier tipo bien conocido adecuado. Una matriz de separación por afinidad convencional suele ser de naturaleza orgánica y se basa en polímeros que exponen una superficie hidrófila al medio acuoso utilizado, es decir, exponen grupos hidroxi (-OH), carboxi (-COOH), carboxamido (-CONH2, posiblemente en formas N-sustituidas), amino (-NH2, posiblemente en forma sustituida), oligo- o polietilenoxi sobre sus superficies externas y, si están presentes, también sobre las internas. El soporte sólido puede ser convenientemente poroso. La porosidad se puede expresar como un valor de Kav o Kd (la fracción del volumen de poro disponible para una molécula de sonda de un tamaño particular) medido por cromatografía de exclusión de tamaño inverso, por ejemplo, según los métodos descritos en Gel Filtration Principles and Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, 1991, pp. 6-13. Por definición, los valores de Kd y Kav siempre se encuentran dentro del intervalo de 0-1. El valor de Kav puede estar ventajosamente entre 0,6-0,95, por ejemplo, 0,7-0,90 o 0,6-0,8, medido con dextrano de Pm 110 kDa como molécula de sonda. Una ventaja de esto es que el soporte tiene una gran fracción de poros capaces de alojar tanto los polipéptidos/multímeros de la invención como las inmunoglobulinas que se unen a los polipéptidos/multímeros y proporcionar un transporte masivo de las inmunoglobulinas hacia los sitios de unión y desde estos.
Los polipéptidos o multímeros pueden unirse al soporte a través de técnicas de acoplamiento convencionales utilizando, por ejemplo, grupos tiol, amino y/o carboxi presentes en el ligando. Los bisepóxidos, la epiclorhidrina, el CNBr, la N-hidroxisuccinimida (NHS), etc., son reactivos de acoplamiento bien conocidos. Entre el soporte y el polipéptido/multímero se puede introducir una molécula conocida como espaciador, que mejora la disponibilidad del polipéptido/multímero y facilita el acoplamiento químico del polipéptido/multímero al soporte. Dependiendo de la naturaleza del polipéptido/multímero y de las condiciones de acoplamiento, el acoplamiento puede ser un acoplamiento multipunto (por ejemplo, a través de una pluralidad de lisinas) o un acoplamiento de un solo punto (por ejemplo, a través de una sola cisteína). Como alternativa, el polipéptido/multímero se puede unir al soporte mediante un enlace no covalente, tal como adsorción física o adsorción bioespecífica.
En algunas realizaciones, la matriz comprende de 5 a 25, tal como de 5 a 20 mg/ml, de 5 a 15 mg/ml, de 5 a 11 mg/ml o de 6 a 11 mg/ml del polipéptido o multímero acoplado al soporte. La cantidad de polipéptido/multímero acoplado puede controlarse mediante la concentración de polipéptido/multímero utilizada en el proceso de acoplamiento, mediante las condiciones de activación y acoplamiento utilizadas y/o mediante la estructura de poros del soporte utilizado. Como regla general, la capacidad de unión absoluta de la matriz aumenta con la cantidad de polipéptido/multímero acoplado, al menos hasta un punto en el que los poros se estrechan significativamente por el polipéptido/multímero acoplado. La capacidad de unión relativa por mg de polipéptido acoplado/multímero disminuirá a altos niveles de acoplamiento, dando como resultado un coste-beneficio óptimo dentro de los intervalos especificados anteriormente.
En determinadas realizaciones, los polipéptidos o multímeros se acoplan al soporte a través de enlaces tioéter. Los métodos para realizar tal acoplamiento son bien conocidos en este campo y los expertos en la materia los realizan con facilidad utilizando técnicas y equipos convencionales. Los enlaces tioéter son flexibles y estables y generalmente adecuados para su uso en la cromatografía de afinidad. En particular, cuando el enlace tioéter es a través de un resto cisteína terminal o casi terminal en el polipéptido o multímero, se mejora la movilidad del polipéptido/multímero acoplado, lo que proporciona una capacidad de unión y una cinética de unión mejoradas. En algunas realizaciones, el polipéptido/multímero se acopla a través de una cisteína C-terminal proporcionada en la proteína como se describe anteriormente. Esto permite un acoplamiento eficaz del tiol de la cisteína a grupos electrofílicos, por ejemplo, grupos epóxido, grupos halohidrina, etc., sobre un soporte, dando como resultado un acoplamiento de puente de tioéter.
En determinadas realizaciones, el soporte comprende un polímero polihidroxílico, tal como un polisacárido. Los ejemplos de polisacáridos incluyen, por ejemplo, dextrano, almidón, celulosa, pululano, agar, agarosa, etc. Los polisacáridos son inherentemente hidrófilos con bajos grados de interacciones no específicas, proporcionan un alto contenido de grupos hidroxilo reactivos (activables) y generalmente son estables frente a las disoluciones de limpieza alcalinas utilizadas en el bioprocesamiento.
En algunas realizaciones, el soporte comprende agar o agarosa. Los soportes utilizados en la presente invención se pueden preparar fácilmente según métodos convencionales, tales como la gelificación en suspensión inversa (S. Hjertén, Biochim. Biophys. Acta, 79(2), 393-398 (1964). Como alternativa, las matrices base son productos disponibles en el mercado, tales como esferas de agarosa reticulada comercializadas con el nombre de SEPHAROSE™ FF (GE Healthcare). En una realización, especialmente ventajosa para separaciones a gran escala, se ha adaptado el soporte para aumentar su rigidez utilizando los métodos descritos en los documentos US6602990 o US7396467 y por lo tanto esto hace que la matriz sea más adecuada para caudales elevados.
En ciertas realizaciones, el soporte, tal como un polisacárido o un soporte de agarosa, está reticulado, por ejemplo, con reticulaciones de éter hidroxialquílico. Los reactivos de reticulación que producen dichas reticulaciones pueden ser, por ejemplo, epihalohidrinas, tales como epiclorhidrina, diepóxidos, tales como butanodiol diglicidil éter, reactivos de alilación, tales como haluros de alilo o alil glicidil éter. La reticulación es beneficiosa para la rigidez del soporte y mejora la estabilidad química. Los enlaces cruzados de hidroxialquil éter son estables a los álcalis y no provocan una adsorción inespecífica significativa.
Como alternativa, el soporte sólido se basa en polímeros sintéticos, como poli(alcohol vinílico), poli(acrilatos de hidroxialquilo), poli(metacrilatos de hidroxialquilo), poliacrilamidas, polimetacrilamidas, etc. En el caso de polímeros hidrofóbicos, tales como matrices basadas en bencenos sustituidos con monovinilo y divinilo, la superficie de la matriz a menudo se hidrofiliza para exponer los grupos hidrofílicos como se define anteriormente a un líquido acuoso circundante. Dichos polímeros se producen fácilmente según métodos convencionales, véase, por ejemplo, “Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization” (R. Arshady, Chimica e L’Industria, 70(9), 70-75 (1988)). Como alternativa, se utiliza un producto disponible en el mercado, tal como SOURCE™ (GE Healthcare). En otra alternativa, el soporte sólido según la invención comprende un soporte de naturaleza inorgánica, por ejemplo, sílice, óxido de circonio, etc.
En otra realización más, el soporte sólido tiene otra forma, tal como una superficie, un chip, capilares o un filtro (por ejemplo, una membrana o una matriz de filtro de profundidad).
En cuanto a la forma de la matriz según la invención, en una realización la matriz tiene forma de monolito poroso. En una realización alternativa, la matriz está en forma de esferas o partículas que pueden ser porosas o no porosas. Las matrices en forma de esferas o de partículas se pueden usar como un lecho cargado o en forma suspendida. Las formas suspendidas incluyen las conocidas como lechos expandidos y suspensiones puras, en las que las partículas o esferas pueden moverse libremente. En el caso de monolitos, lechos cargados y lechos expandidos, el procedimiento de separación suele ser la cromatografía convencional con un gradiente de concentración. En el caso de una suspensión pura, se utilizará el modo discontinuo.
En un quinto aspecto, la presente invención describe un método para aislar una inmunoglobulina, en el que se usa una matriz de separación como se describe anteriormente.
En ciertas realizaciones, el método comprende las etapas de:
a) poner en contacto una muestra líquida que comprende una inmunoglobulina con una matriz de separación como se describe anteriormente,
b) lavar dicha matriz de separación con un líquido de lavado,
c) eluir la inmunoglobulina de la matriz de separación con un líquido de elución, y
d) limpiar la matriz de separación con un líquido de limpieza, que, como alternativa, puede denominarse líquido de limpieza in situ (CIP), por ejemplo, con un tiempo de contacto (incubación) de al menos 10 min. El método también puede comprender las etapas, antes de la etapa a), de proporcionar una matriz de separación por afinidad según cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente y proporcionar una disolución que comprende una inmunoglobulina y al menos otra sustancia como muestra líquida y, después de la etapa c) , recuperar el eluato y, opcionalmente, someter el eluato a etapas de separación adicionales, por ejemplo, por cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía multimodal y/o cromatografía de interacción hidrófoba. Las composiciones adecuadas de la muestra líquida, el líquido de lavado y el líquido de elución, así como las condiciones generales para realizar la separación, son bien conocidas en la técnica de la cromatografía de afinidad y, en particular, en la técnica de la cromatografía de proteína A. La muestra líquida que comprende una proteína que contiene Fc y al menos otra sustancia puede comprender proteínas de la célula huésped (HCP), tales como proteínas de células CHO, E. coli o levadura. Los contenidos en proteínas de células CHO y E. coli pueden determinarse convenientemente mediante inmunoensayos dirigidos a estas proteínas, por ejemplo, los kits ELISA para HCP de CHO o para HCP de E. coli de Cygnus Technologies. Las proteínas de la célula huésped o las proteínas de células CHO/E. coli pueden desorberse durante la etapa b).
La elución se puede realizar utilizando cualquier disolución adecuada utilizada para la elución del medio de proteína A. Esta puede ser, por ejemplo, una disolución o tampón con pH 5 o inferior, tal como pH 2,5-5 o 3-5. En algunos casos, también puede ser una disolución o tampón con pH 11 o superior, tal como pH 11-14 o pH 11-13 En algunas realizaciones, el tampón de elución o el gradiente de tampón de elución comprende al menos un ácido carboxílico mono-, di- o trifuncional o una sal de dicho ácido carboxílico. En ciertas realizaciones, el tampón de elución o el gradiente de tampón de elución comprende al menos una especie aniónica seleccionada del grupo que consiste en acetato, citrato, glicina, succinato, fosfato y formiato.
En algunas realizaciones, el líquido de limpieza es alcalino, por ejemplo, con un pH de 13-14. Tales disoluciones brindan una limpieza eficaz de la matriz, en particular en el extremo superior del intervalo.
En determinadas realizaciones, el líquido de limpieza comprende NaOH o KOH 0,1-2,0 M, tal como NaOH o KOH 0,5­ 2,0 o 0,5-1,0 M. Estas son disoluciones de limpieza eficaces, y en particular cuando la concentración de NaOH o KOH es superior a 0,1 M o al menos 0,5 M. La alta estabilidad de los polipéptidos de la invención permite el uso de tales disoluciones fuertemente alcalinas.
El método también puede incluir una etapa de desinfección de la matriz con un líquido de desinfección, que puede comprender, por ejemplo, un peróxido, tal como el peróxido de hidrógeno y/o un perácido, tal como el ácido peracético o el ácido perfórmico.
En algunas realizaciones, las etapas a)-d) se repiten al menos 10 veces, tal como al menos 50 veces, 50-200, 50-300 o 50-500 veces. Esto es importante para la economía del proceso porque la matriz se puede reutilizar muchas veces.
Las etapas a)-c) también se pueden repetir al menos 10 veces, tal como al menos 50 veces, 50-200, 50-300 o 50-500 veces, realizándose la etapa d) después de una pluralidad de realizaciones de la etapa c), de modo que la etapa d) se realiza al menos 10 veces, tal como al menos 50 veces. La etapa d) puede realizarse, por ejemplo, cada segundo hasta la vigésima realización de la etapa c).
Ejemplos
Mutagénesis de proteínas
La mutagénesis dirigida a sitio se realizó mediante una PCR de dos etapas utilizando oligonucleótidos que codifican las mutaciones. Como molde se usó un plásmido que contenía un solo dominio de Z, B o C. Los fragmentos de PCR se acoplaron a un vector de expresión de E. coli. Se utilizó la secuenciación del ADN para verificar la secuencia correcta de los fragmentos insertados.
Para formar multímeros de mutantes se utilizó un sitio Acc I ubicado en los codones de inicio (GTA GAC) del dominio B, C o Z, correspondientes a los aminoácidos VD. El vector para el dominio monomérico se digirió con Acc I y se trató con fosfatasa. Se diseñaron cebadores con extremos pegajosos Acc I, específicos para cada variante, y se generaron dos productos de PCR solapantes a partir de cada molde. Los productos de PCR se purificaron y la concentración se calculó comparando los productos de PCR en un gel de agarosa al 2 %. Se hibridaron cantidades iguales de los productos de PCR apareados (90 °C -> 25 °C en 45 min) en tampón de acoplamiento. El producto resultante consiste aproximadamente en % de fragmentos que probablemente se acoplarán en un sitio Acc I (fragmentos de PCR correctos y/o el vector digerido). Después del acoplamiento y la transformación, las colonias se seleccionaron mediante PCR para identificar construcciones que contenían el mutante deseado. Los clones positivos se verificaron mediante secuenciación de ADN.
Expresión y purificación de las construcciones
Las construcciones se expresaron en el periplasma bacteriano por fermentación de E. coli K12 en medios convencionales. Después de la fermentación, las células se trataron con calor para liberar el contenido de periplasma hacia el medio. Las construcciones liberadas hacia el medio se recuperaron mediante microfiltración con una membrana que tenía un tamaño de poro de 0,2 gm.
Cada construcción, ahora en el permeado de la etapa de filtración, se purificó por afinidad. El permeado se cargó en un medio de cromatografía que contenía IgG inmovilizada (IgG Sepharose 6FF, GE Healthcare). El producto cargado se lavó con disolución salina tamponada con fosfato y se eluyó bajando el pH.
La reunión de elución se ajustó a un pH neutro (pH 8) y se redujo mediante la adición de ditiotreitol. A continuación, la muestra se cargó en un intercambiador de aniones. Después de una etapa de lavado, la construcción se eluyó en un gradiente de NaCl para separarla de cualquier contaminante. La reunión de elución se concentró por ultrafiltración a 40-50 mg/ml. Cabe señalar que si la purificación por afinidad de una construcción en un medio IgG inmovilizado tiene éxito, esto indica que la construcción en cuestión tiene una alta afinidad por la IgG.
Los ligandos purificados se analizaron con RPC LC-MS para determinar la pureza y asegurarse de que el peso molecular correspondía al esperado (basado en la secuencia de aminoácidos).
Ejemplo 1
Los ligandos monoméricos purificados enumerados en la tabla 1, que además comprenden, para SEQ ID NO:8-16, 23-28 y 36-48, una secuencia conductora AQGT en el extremo N y una cisteína en el extremo C, se inmovilizaron sobre chips sensores Biacore CM5. (GE Healthcare, Suecia), utilizando el kit de acoplamiento de amina de GE Healthcare (para el acoplamiento de carbodiimida de aminas sobre los grupos carboximetilo en el chip) en una cantidad suficiente para producir una intensidad de señal de aproximadamente 200-1500 RU en un instrumento de resonancia de plasmón de superficie Biacore (SPR) (GE Healthcare, Suecia). Para seguir la capacidad de unión de IgG de la superficie inmovilizada, se hizo fluir 1 mg/ml de IgG policlonal humana (Gammanorm) sobre el chip y se anotó la intensidad de la señal (proporcional a la cantidad de unión). A continuación, la superficie se limpió in situ (CIP), es decir, se enjuagó con NaOH 500 mM durante 10 minutos a temperatura ambiente (22 /- 2 °C). Esto se repitió durante 96-100 ciclos y se siguió la estabilidad alcalina del ligando inmovilizado como la capacidad de unión de IgG remanente (intensidad de la señal) después de cada ciclo. Los resultados se muestran en la tabla 1 e indican que al menos los ligandos Zvar(N11K)1, Zvar(N11E)1, Zvar(N11Y)1, Zvar(N11T)1, Zvar(N11F)1, Zvar(N11L)1, Zvar(N11W)1, ZN11I)1, Zvar(N11 M)1, Zvar(N11V)1, Zvar(N11A)1, Zvar(N11H1), Zvar(N11 R)1, Zvar(N11 E,Q32A)1, Zvar(N11 E,Q32E,Q40E)1 y Zvar(N11 E,Q32E,K50R)1, Zvar(Q9A,N11E,N43A)1, Zvar(Q9A,N11E,N28A,N43A)1, Zvar(Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43E,L44I)1, Zvar(Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43A,L44I)1, Zvar(Q9A,N11 E,N28A,Q40V,A42K,N43A,L44I)1, Zvar(N11 K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y)1, Zvar(Q9A,N11 K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y)1, Zvar(N11K, H18K,D37E,A42R,N43A,L44I)1, Zvar(Q9A, N11K, H18K,D37E,A42R,N43A,L44I)1 y Zvar(Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R)1, así como las variedades de Zvar(Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43A,L44I)1 con G, S, Y, Q, T, N, F, L, W, I, M, V, D, E, H, R o K en la posición 29, las variedades de Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)1 que tienen F, Y, W, K o R en la posición 53 y las variedades de Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)1, en las que se ha delecionado Q9, Q40, A42 o N43, tienen una estabilidad alcalina mejorada en comparación con la estructura parental Zvar1, utilizada como referencia. Además, los ligandos B(Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43A,L44I)1 y C(Q9A,N11 E,E43A)1 tienen una estabilidad mejorada en comparación con los dominios B y C originales, usados como referencias.
Tabla 1. Ligandos monoméricos, evaluados por Biacore (NaOH 0,5 M).
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000019_0001
Ejemplo 2
Los ligandos diméricos, tetrámeros y hexaméricos purificados enumerados en la tabla 2 se inmovilizaron sobre chips sensores Biacore CM5 (GE Healthcare, Suecia), utilizando el kit de acoplamiento de amina de GE Healthcare (para el acoplamiento de carbodiimida de aminas sobre los grupos carboximetilo del chip) en una cantidad suficiente para producir una intensidad de señal de alrededor de 200-1500 RU en un instrumento Biacore (GE Healthcare, Suecia).
Para seguir la capacidad de unión de IgG de la superficie inmovilizada, se hizo fluir 1 mg/ml de IgG policlonal humana (Gammanorm) sobre el chip y se anotó la intensidad de la señal (proporcional a la cantidad de unión). A continuación, la superficie se limpió in situ (CIP), es decir, se enjuagó con NaOH 500 mM durante 10 minutos a temperatura ambiente (22 /- 2 °C). Esto se repitió durante 300 ciclos y se siguió la estabilidad alcalina del ligando inmovilizado como la capacidad de unión de IgG remanente (intensidad de la señal) después de cada ciclo. Los resultados se muestran en la tabla 2 y en la figura 2 e indican que al menos los ligandos Zvar(Q9A,N11 E,N43A)4, Zvar(Q9A,N11 E,N28A,N43A)4, Zvar(Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43E,L44I)4 y Zvar(Q9A,N11 E,Q40V,A42K,N43A,L44I)4, Zvar(Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42K,N43A,L44I)4 y Zvar(Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42R,N43A,L44I)4 tienen una estabilidad alcalina mejorada en comparación con la estructura parental Zvar4, que se utilizó como referencia. El ligando hexamérico Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)6 también tiene una estabilidad alcalina mejorada en comparación con la estructura parental Zvar6, utilizada como referencia. Además, los dímeros de Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I) con deleciones de a) D2,A3,K4; b) K58,V1,D2; c) P57,K58,V1,D2,A3; d) K4,F5,D6,K7,E8; e) A56,P57,K58; V1,D2,A3 o f) V1,D2,A3,K4,F5,D6,K7,E8 de la región del conector entre las dos unidades monoméricas tienen una estabilidad alcalina mejorada en comparación con la estructura parental Zvar2, utilizada como referencia. Además, los dímeros de Zvar (Q9A,N11E,Q40v ,A42K,N43A,L44I) con una inserción de YEDG entre K58 y VI en la región del conector tienen una estabilidad alcalina mejorada en comparación con Zvar2.
Tabla 2. Ligandos diméricos, tetrámeros y hexaméricos, evaluados por Biacore (NaOH 0,5 M).
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000021_0001
Ejemplo 3
El ejemplo 2 se repitió con 100 ciclos CIP de tres ligandos usando NaOH 1 M en lugar de 500 mM como en el ejemplo 2. Los resultados se muestran en la tabla 3 y muestran que los tres ligandos tienen una estabilidad alcalina mejorada también en NaOH 1 M, en comparación con la estructura parental Zvar4 que se utilizó como referencia.
Tabla 3. Ligandos tetraméricos, evaluados por Biacore (NaOH 1 M).
Figure imgf000021_0002
Ejemplo 4
Los ligandos tetraméricos purificados de la tabla 2 (todos con una cisteína N-terminal adicional) se inmovilizaron sobre esferas de agarosa utilizando los métodos descritos a continuación y se evaluó su capacidad y estabilidad. Los resultados se muestran en la tabla 4 y la figura 3.
Tabla 4. Matrices con ligandos tetraméricos, evaluados en columnas (NaOH 0,5 M).
Figure imgf000021_0003
Activación
La matriz base utilizada fueron esferas rígidas de agarosa reticuladas de 85 micrómetros (volumen ponderado, d50V) de diámetro medio, preparadas según los métodos del documento US6602990 y con un tamaño de poro correspondiente a un valor Kav de cromatografía de filtración inversa en gel de 0,70 para un dextrano de Pm 110 kDa, según los métodos descritos en Gel Filtration Principles and Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, 1991, pp. 6-13. Se mezclaron 25 ml (g) de matriz base drenada, 10,0 ml de agua destilada y 2,02 g de NaOH (s) en un matraz de 100 ml con agitación mecánica durante 10 min a 25 °C. Se añadieron 4,0 ml de epiclorhidrina y la reacción se desarrolló durante 2 horas. El gel activado se lavó con 10 volúmenes de sedimento de gel (GV) de agua.
Acoplamiento
A 20 ml de disolución de ligando (50 mg/ml) en un tubo Falcon de 50 ml, se le añadieron 169 mg de NaHCO3, 21 mg Na2CO3, 175 mg de NaCl y 7 mg de EDTA. El tubo Falcon se colocó sobre una mesa rodante durante 5-10 min y luego se añadieron 77 mg de DTE. La reducción se desarrolló durante >45 min. A continuación, la disolución de ligando se desalinizó en una columna PD10 cargada con Sephadex G-25. El contenido de ligando en la disolución desalinizada se determinó midiendo la absorción UV a 276 nm.
El gel activado se lavó con 3-5 GV (fosfato 0,1 M/EDTA 1 mM, pH 8,6) y luego se acopló el ligando según el método descrito en el documento US6399750. Todos los tampones usados en los experimentos habían sido desgasificados con gas nitrógeno durante al menos 5-10 min. El contenido de ligando de los geles pudo controlarse variando la cantidad y concentración de la disolución de ligando.
Después de la inmovilización, los geles se lavaron 3xGV con agua destilada. Los geles 1 GV (fosfato 0,1 M/EDTA 1 mM/tioglicerol al 10 %. pH 8,6) se mezclaron y los tubos se dejaron en una mesa de agitación a temperatura ambiente durante la noche. A continuación, los geles se lavaron alternativamente con 3xGV (TRIS 0,1 M/NaCl 0,15 M, pH 8,6) y HAc 0,5 M y luego 8-10xGV con agua destilada. Las muestras de gel se enviaron a un laboratorio externo para el análisis de aminoácidos y se calculó el contenido de ligando (mg/ml de gel) a partir del contenido total de aminoácidos. Proteína
Gammanorm 165 mg/ml (Octapharma), diluido a 2 mg/ml en tampón de equilibrio.
Tampón de equilibrio
Tampón de fosfato PBS 10 mM NaCl 0,14 M KCl 0,0027 M, pH 7,4 (Medicago)
Tampón de adsorción
Tampón de fosfato PBS 10 mM NaCl 0,14 M KCl 0,0027 M, pH 7,4 (Medicago)
Tampones de elución
100 acetato mM pH 2,9
Capacidad de unión dinámica
Se cargaron 2 ml de resina en 100 columnas TRICORN™ 5. La capacidad de remoción se determinó con un sistema ÁKTAExplorer 10 con un tiempo de residencia de 6 minutos (caudal de 0,33 ml/min). Se hizo pasar el tampón de equilibrio a través de la columna de derivación hasta que se obtuvo una línea de base estable. Esto se hizo antes de la puesta a cero automática. La muestra se aplicó a la columna hasta que se obtuvo una señal UV del 100 %. Luego, se aplicó nuevamente el tampón de equilibrio hasta que se obtuvo una línea de base estable.
La muestra se cargó en la columna hasta que se alcanzó una señal UV del 85 % de la absorbancia máxima. A continuación, la columna se lavó con 5 volúmenes de columna (CV) de tampón de equilibrio a un caudal de 0,5 ml/min. La proteína se eluyó con 5 CV de tampón de elución a un caudal de 0,5 ml/min. Luego, la columna se limpió con NaOH 0,5 M a un caudal de 0,2 ml/min y se reequilibró con tampón de equilibrio.
Para el cálculo de la capacidad de remoción al 10 %, se utilizó la siguiente ecuación. Esa es la cantidad de IgG que se carga en la columna hasta que la concentración de IgG en el efluente de la columna sea el 10 % de la concentración de IgG en la alimentación.
Figure imgf000022_0001
A100% = 100 % de señal UV;
Asub = contribución a la absorbancia de la subclase de IgG que no se une;

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. - Un polipéptido de unión a Fc que comprende una secuencia como se define en SEQ ID NO:53 KEXiQ X2AFYEILX3LP NLTEEQRX4X5F IX6X7LKDX8PSX9 SX10X11X12LAEAKX13 X14NX15AQAPK (SEQ ID NO:53)
en el que, individualmente entre sí:
X I = A o está delecionado
X2 = E o K,
X3 = H
X4 = A o N
X5 = A, G, S, Y, Q, T, N, F, L, W, I, M, V, D, E, H, R o K
X6 = Q
X7 = S
X8 = E o D
X9 = V o está delecionado
X10 = K o está delecionado
X I I = A, E o N o está delecionado
X12 = I
X13 = K
X14 = L
X15 = D, F, Y, W, K o R,
y dicho polipéptido tiene una estabilidad alcalina mejorada en comparación con un polipéptido o un polipéptido parental, como se define en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7, de modo que la estabilidad alcalina mejora, según se mide por la capacidad de unión de IgG remanente después de 24 o 25 h de incubación en NaOH acuoso 0,5 M o 1,0 M a 22 /- 2 °C.
2. - El polipéptido de la reivindicación 1, en el que:
X2 = E
X4 = N.
3. - El polipéptido de la reivindicación 1, en el que:
i) X1 = A, X2 = E, X3 = H, X4 = N, X5 = S, Y, Q, T, N, F, L, W, I, M, V, D, E, H, R o K, X6 = Q, X7 = S, X8 = D, X9 = V, X10 = K, X11 = A, X12 = I, X13 = K, X14 = L, X15 = D;
ii) X1 está delecionado, X2 = E, X3 = H, X4 = N, X5 = A, X6 = Q, X7 = S, X8 = D, X9 = V, X10 = K, X11 = A, X12 = I, X13 = K, X14 = L, X15 = D;
iii) X1 = A, X2 = E, X3 = H, X4 = N, X5 = A, X6 = Q, X7 = S, X8 = D, X9 está delecionado, X10 = K, X11 = A, X12 = I, X13 = K, X14 = L, X15 = D;
iv) X1 = A, X2 = E, X3 = H, X4 = N, X5 = A, X6 = Q, X7 = S, X8 = D, X9 = V, X10 está delecionado, X11 = A, X12 = I, X13 = K, X14 = L, X15 = D;
Figure imgf000068_0001
,
4. - El polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que consiste esencialmente en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
i) SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69 y SEQ ID NO:70;
ii) SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74 y SEQ ID NO:75;
iii) SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78 y SEQ ID NO:79; o
iv) SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94 y SEQ ID NO:95.
5. - El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho polipéptido no comprende ninguna secuencia definida por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-16, 17­ 34 y 36-52.
6. - Un multímero que comprende o consiste esencialmente en una pluralidad de polipéptidos como se define en cualquier reivindicación anterior, en el que los polipéptidos están opcionalmente unidos por conectores que comprenden hasta 15 aminoácidos.
7. - El multímero según la reivindicación 6, que es un dímero, trímero, tetrámero, pentámero, hexámero, heptámero, octámero o nonámero.
8. - El multímero según una cualquiera de las reivindicaciones 6-7, que comprende o consiste esencialmente en una secuencia seleccionada del grupo de secuencias definidas en SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34 y SEQ ID NO:35.
9. - El polipéptido o multímero según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además en el C-terminal o N-terminal, o dentro de 1-5 restos aminoácidos del C-terminal o N-terminal, uno o más elementos de acoplamiento, seleccionados del grupo que consiste en uno o más restos cisteína, una pluralidad de restos lisina y una pluralidad de restos histidina.
10. - Un ácido nucleico o un vector que codifica un polipéptido o multímero según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
11. - Una matriz de separación, en la que una pluralidad de polipéptidos o multímeros según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 se han acoplado a un soporte sólido, tal como enlaces tioéter.
12. - La matriz de separación según la reivindicación 11, en la que la capacidad de IgG de la matriz después de 24 incubaciones en NaOH 0,5 M a 22 /- 2 °C es al menos 80, tal como de al menos 85, al menos 90 o al menos 95 % de la capacidad de IgG antes de la incubación y/o en la que la capacidad de IgG de la matriz después de 24 incubaciones en NaOH 1,0 M a 22 /- 2 °C es de al menos 70, tal como al menos 80 o al menos 90 % de la capacidad de IgG antes de la incubación.
13. - Un método para aislar una inmunoglobulina, en el que se usa una matriz de separación según una cualquiera de las reivindicaciones 11-12.
14. - El método de la reivindicación 13, que comprende las etapas de:
a) poner en contacto una muestra líquida que comprende una inmunoglobulina con una matriz de separación según una cualquiera de las reivindicaciones 11-12,
b) lavar dicha matriz de separación con un líquido de lavado,
c) eluir la inmunoglobulina de la matriz de separación con un líquido de elución, y
d) limpiar la matriz de separación con un líquido de limpieza.
15. - El método de la reivindicación 14, en el que el líquido de limpieza es alcalino, tal como con un pH de 13-14 y/o en el que el líquido de limpieza comprende NaOH o KOH 0,1 -1,0 M, tal como NaOH o KOH 0,5-1,0 M.
16. - El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14-15, en el que las etapas a)-d) se repiten al menos 10 veces, tal como al menos 50 veces o 50-200 veces.
17. - El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en el que las etapas a)-c) se repiten al menos 10 veces, tal como al menos 50 veces o 50-200 veces, y en el que la etapa d) se realiza después de una pluralidad de realizaciones de la etapa c), tal como al menos 10 o al menos 50 veces.
ES17728070T 2016-05-11 2017-05-10 Polipéptidos de unión a inmunoglobulina mutados Active ES2914278T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1608229.9A GB201608229D0 (en) 2016-05-11 2016-05-11 Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
GB201608232 2016-05-11
US15/282,367 US10654887B2 (en) 2016-05-11 2016-09-30 Separation matrix
PCT/EP2017/061162 WO2017194596A1 (en) 2016-05-11 2017-05-10 Mutated immunoglobulin-binding polypeptides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2914278T3 true ES2914278T3 (es) 2022-06-08

Family

ID=73554207

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES17728070T Active ES2914278T3 (es) 2016-05-11 2017-05-10 Polipéptidos de unión a inmunoglobulina mutados

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP3455244B1 (es)
JP (1) JP7122974B2 (es)
CN (1) CN109071612B (es)
DK (1) DK3455244T3 (es)
ES (1) ES2914278T3 (es)
WO (1) WO2017194596A1 (es)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110799521A (zh) * 2017-02-15 2020-02-14 拜奥普罗塞亚科技有限责任公司 具有温和洗脱pH的亲和色谱配体
WO2018162501A1 (en) * 2017-03-07 2018-09-13 Jmva Biotech Ab Modified adsorptive surfaces
EP3842536A4 (en) 2018-08-24 2023-01-18 JSR Corporation IMMUNOGLOBULIN-BINDING PROTEIN AND AFFINITY CARRIER WITH IT
EP3962923B1 (en) * 2019-04-29 2023-04-19 Cytiva BioProcess R&D AB Method for separation of antibodies or antibody fragments being devoid of an fc region capable of binding to protein a
JP7363134B2 (ja) * 2019-07-04 2023-10-18 東ソー株式会社 免疫グロブリン結合性タンパク質
GB202113626D0 (en) 2021-09-24 2021-11-10 Cytiva Bioprocess R & D Ab FC binding polypeptides
CN114409801B (zh) * 2021-12-22 2023-04-18 苏州赛分科技股份有限公司 基于重组蛋白a的亲和层析介质及其制备方法和应用
CN113999294B (zh) * 2021-12-30 2022-03-29 苏州纳微科技股份有限公司 免疫球蛋白结合蛋白及其应用
GB202203478D0 (en) 2022-03-14 2022-04-27 Cytiva Bioprocess R & D Ab Vh3 binding polypeptides

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5448825B2 (ja) * 2006-10-19 2014-03-19 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 非凝集抗体Ｆｃドメインの製造方法
JP5229888B2 (ja) * 2008-09-30 2013-07-03 独立行政法人産業技術総合研究所 弱酸性域での易解離性を向上したプロテインａ変異型タンパク質及び抗体捕捉剤
JPWO2010110288A1 (ja) * 2009-03-24 2012-09-27 株式会社カネカ 免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド
EP2542567B1 (de) * 2010-03-05 2020-02-12 Boehringer Ingelheim International Gmbh Selektive anreicherung von antikörpern
JP5298242B2 (ja) * 2010-12-21 2013-09-25 Ｊｓｒ株式会社 アフィニティークロマトグラフィー用担体およびイムノグロブリンを単離する方法
JP5812303B2 (ja) * 2011-06-03 2015-11-11 国立研究開発法人産業技術総合研究所 酸性域での親和性が低下したプロテインａ変異型タンパク質及び抗体捕捉剤
SG10201604554WA (en) * 2011-06-08 2016-07-28 Emd Millipore Corp Chromatography matrices including novel staphylococcus aureus protein a based ligands
EP3019520B1 (en) * 2013-07-10 2019-12-11 GE Healthcare BioProcess R&D AB Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
US11566082B2 (en) * 2014-11-17 2023-01-31 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides

Also Published As

Publication number Publication date
JP7122974B2 (ja) 2022-08-22
CN109071612B (zh) 2022-10-25
JP2019517789A (ja) 2019-06-27
DK3455244T3 (da) 2022-06-07
CN109071612A (zh) 2018-12-21
EP3455244B1 (en) 2022-05-04
EP3455244A1 (en) 2019-03-20
WO2017194596A1 (en) 2017-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210147577A1 (en) Mutated Immunoglobulin-Binding Polypeptides
US11136359B2 (en) Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
ES2914278T3 (es) Polipéptidos de unión a inmunoglobulina mutados
ES2874974T3 (es) Matriz de separación
US20210087227A1 (en) Mutated Immunoglobulin-Binding Polypeptides