JPWO2014003137A1 - 高アフィニティー抗体、及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(A)不純物の混じった試料をカラムに負荷する工程(負荷工程)
(B)負荷したカラムから精製対象とする抗体以外の不純物を取り除く工程(洗浄工程)
(C)精製対象とする抗体をカラムから回収する工程(溶出工程)
解離定数(KD値)[M]=解離速度定数(Kd値)[S-1]
/結合速度定数(Ka値)[M-1S-1]・・・(1)
実施の形態に係る方法で精製された抗体の抗原に対する解離定数(KD値)は、酸溶出型プロテインA担体で精製された抗体のKD値よりも小さい。
[実施例1]
(温度応答性プロテインA担体の調製)
架橋ポリビニルアルコールビーズにカルボキシル基を導入した後、カルボキシル基をNHS活性化した。さらに、NHS活性化された架橋ポリビニルアルコールビーズと、温度応答性プロテインAと、を接触させることで、温度応答性プロテインAを架橋ポリビニルアルコールビーズに固定化した。詳細は以下のとおりである。
無水コハク酸3.0g及び4−ジメチルアミノピリジン3.6gをトルエン450mLに溶解させた反応液を用意した。次に、特開昭59−17354号公報の実施例1に記載の方法で調製した架橋ポリビニルアルコールビーズ(平均粒子径100μm)7.5mLを反応液と50℃で接触させ、2時間攪拌した。これにより、架橋ポリビニルアルコールビーズにカルボキシル基を導入した。その後、架橋ポリビニルアルコールビーズを脱水イソプロピルアルコールで洗浄した。
カルボキシル基を導入したビーズ3mLを、NHS活性化反応液(NHS0.09g、脱水イソプロピルアルコール60mL、ジイソプロピルカルボジイミド0.12mL)に投入し、40℃で30分間反応し、ビーズ表面のカルボキシル基をNHS活性化した。反応後、氷冷した脱水イソプロピルアルコールでビーズを洗浄し、さらに、氷冷した1mM 塩酸で洗浄した。
温度応答性プロテインAは、特許文献(WO2008/143199号パンフレット)の実施例11を参考にして調製した。温度応答性プロテインA150mgを3mLのカップリング緩衝液(0.2mol/L リン酸緩衝液、0.5mol/L NaCl、pH8.3)に溶解した温度応答性プロテインA溶液を用意した。そして、上記、NHS活性化されたビーズを、温度応答性プロテインA溶液に投入し、25℃で、振とうしながら、4時間反応させた。所定時間経過後、ビーズをカップリング緩衝液で洗浄し、担体上のNHS活性基とカップリング反応しなかった温度応答性プロテインAを洗浄し、回収した。
温度応答性プロテインAをカップリングしたビーズを、ブロッキング反応液(0.5mol/L エタノールアミン、0.5mol/LNaCl、pH8.0)10mLに浸漬し、室温で30分間放置することで、残留NHSをエタノールアミンでブロッキングした。反応後、このビーズを純水で洗浄し、その後20%エタノールでカラムに封入した状態で、4℃で保存した。
温度応答性プロテインA担体を、空カラム(GEヘルスケア・ジャパン(株)、Tricorn 5/100 column)に充填した。充填方法は、提供者の取扱説明書を参考に、実施した。そして、カラムをクロマトグラフィシステム(GEヘルスケア・ジャパン(株)、AKTA FPLC)に装着した。
また、抗原に対するアフィニティーを低下させる処理がなされていないヒトモノクロナール抗体として、AE6F4抗体を0.115mg/L含む培養上澄みを用意した。AE6F4産生細胞は、九州大学大学院農学研究院、片倉喜範准教授よりご提供頂いた。AE6F4抗体産生細胞の培養は、文献(日本生物工学会講演要旨集、1994年、65巻、65ページ)を参考に培養した。AE6F4抗体産生細胞を含む培養液を、ろ過膜(旭化成メディカル社製、商品名 BioOptimal(登録商標) MF−SL)を用いてろ過し、細胞を除去して、抗体を含む溶液(培養上澄)を取得した。ろ過は、提供者の取扱い説明書を参考に実施した。
次に、抗体を含む溶液(培養上澄)を取得してから6時間後に、下記の条件で、温度応答性プロテインA担体を充填したカラムに抗体を含む溶液を注入し、担体に抗体を吸着させた。各ステップの温度は、カラム、及びカラム上流の配管(1m)を、所定温度に設定した恒温水槽に浸漬することで、調整した。さらに、下記の条件で、カラムを洗浄し、その後、カラムから抗体を溶出させた。(サンプルA)
1−1)吸着ステップ
・抗体濃度:0.115mg/mL
・平衡化緩衝液:20mM リン酸緩衝液+150mM NaCl(pH8.0)
・平衡化:10ビーズ体積(吸着緩衝液使用)
・抗体負荷量:100mL
・流速:0.4mL/min
・ビーズ体積:1.96mL
・吸着温度:2℃
1−2)洗浄ステップ
・洗浄緩衝液:吸着緩衝液と同一
・流速:0.4mL/min
・洗浄温度:2℃
1−3)溶出ステップ
・溶出緩衝液:吸着緩衝液と同一
・流速:0.4mL/min
・透過液量:20mL
・溶出温度:40℃
溶出液中に含まれる抗体濃度は、280nmの紫外線吸収(UV吸収)を測定することで、下記(2)式を用いて算出した。
/結合速度定数(Ka値)[M-1S-1]・・・(5)
[比較例1]
(酸溶出型プロテインA担持担体による抗体の精製)
実施例1では温度応答性プロテインA担体を用いたが、比較例1及び2では酸溶出型プロテインA担体カラム(MabSelect、GEヘルスケア・ジャパン株式会社)を用いた。抗体の吸着及び溶出条件としては、以下の条件で行った。
1−1)吸着ステップ
・抗体濃度:0.115mg/mL
・平衡化緩衝液:20mM リン酸緩衝液+150mM NaCl(pH8.0)
・平衡化:10ビーズ体積(吸着緩衝液使用)
・抗体負荷量:100mL
・流速:0.4mL/min
・ビーズ体積:1.96mL
・吸着温度:25℃
1−2)洗浄ステップ
・洗浄緩衝液:吸着緩衝液と同一
・流速:0.4mL/min
・洗浄温度:25℃
1−3)溶出ステップ
・溶出緩衝液:50mM クエン酸緩衝液+0.3M NaCl(pH3.0)
・流速:0.4mL/min
・透過液量:20mL
・溶出温度:40℃
抗体の回収率は、30%であり、低い回収率となった。酸処理をしなかった溶液(サンプルB)の分画に含まれる凝集体を測定した。すると、図1に示すように、抗体の凝集体が、12.1%(サンプルB)であり、多くの凝集体を含んでいた。
[比較例2]
(溶出液の酸処理)
溶出までは比較例1と同様に行い、pH3.5の溶出液を、室温で、1時間保持した。その後、pH3.5の溶出液を、1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.0)を用いてpH5.0に滴定し、サンプルCとした。
酸処理をした溶液(サンプルC)の分画に含まれる凝集体を測定した。すると、図1に示すように、抗体の凝集体が、18.1%(サンプルC)であり、多くの凝集体を含んでいた。
AE6F4抗体を0.115mg/L含む培養上澄みを、酢酸を用いてpH3.5に滴定し、室温で1時間保持した。その後、pH3.5の溶出液を1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.0)を用いてpH5.0に滴定した。次に、実施例1と同様の方法で、AE6F4抗体を精製し、これをサンプルDとした。
上記サンプルDの抗体を、実施例と同様の方法で、アフィニティーを測定した。サンプルDの解離定数(KD値)は、3.09×10-5[M]であり、酸処理をしない培養上澄みを温度溶出型プロテインAで精製した抗体よりも、アフィニティーが低いことが分かった。その他の測定値等も図1に示した。
AE6F4産生細胞を培養し、培養上澄取得、48時間後に、温度応答性プロテインAカラムに抗体を含む溶液を注入し、担体に抗体を吸着させた以外、実施例1と同様の方法で、AE6F4抗体を精製し、これをサンプルEとした。
上記サンプルEの抗体を、実施例と同様の方法で、アフィニティーを測定した。サンプルEの解離定数(KD値)は、1.02×10-6[M]であり、培養上澄取得後、時間をかけずに温度溶出型プロテインAで精製した抗体よりも、アフィニティーが低いことが分かった。その他の測定値等も図1に示した。
[実施例2]
AE6F4産生細胞を培養し、培養上澄取得、24時間後に、温度応答性プロテインAカラムに抗体を含む溶液を注入し、担体に抗体を吸着させた以外、実施例1と同様の方法で、AE6F4抗体を精製し、これをサンプルFとした。
上記サンプルFの抗体を、実施例と同様の方法で、アフィニティーを測定した。サンプルFの解離定数(KD値)は、5.11×10-7[M]であり、比較例よりも小さかった。その他の測定値等も図1に示した。
[実施例3]
AE6F4産生細胞を培養し、培養上澄取得、12時間後に、温度応答性プロテインAカラムに抗体を含む溶液を注入し、担体に抗体を吸着させた以外、実施例1と同様の方法で、AE6F4抗体を精製し、これをサンプルGとした。
上記サンプルGの抗体を、実施例と同様の方法で、アフィニティーを測定した。サンプルGの解離定数(KD値)は、3.09×10-7[M]であり、比較例よりも小さかった。その他の測定値等も図1に示した。
Claims (12)
- (A)モノクローナル抗体を産生する細胞を培養する工程と、
(B)前記細胞を含む溶液から前記細胞を除去する工程と、
(C)前記溶液に含まれる前記モノクローナル抗体を温度応答性プロテインA担体によって精製する工程
を含む抗体の製造方法であって、
前記(C)工程の前に、低pH処理、60℃以上の高温処理、アフィニティークロマトグラフィーによる精製処理のいずれの処理も含まず、
前記(B)工程で得られた前記細胞を除去された溶液を、24時間以内に、前記(C)工程に処することを特徴とする、高アフィニティー抗体の製造方法。 - 得られた抗体の抗原に対する解離定数(KD値)が、前記(C)工程の代わりに、モノクローナル抗体をpH4〜9で吸着し、pH2〜4で溶出する酸溶出型プロテインA担体を用いる精製工程を含む抗体の製造方法によって得られる抗体のKD値よりも小さいことを特徴とする、請求項1に記載の、高アフィニティー抗体の製造方法。
- 前記細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)であることを特徴とする、請求項1または2に記載の、高アフィニティー抗体の製造方法。
- 前記抗体がヒト抗体であることを特徴とする、請求項1乃至3のいずれか1項に記載の、高アフィニティー抗体の製造方法。
- 得られた抗体の抗原に対する解離速度定数(Kd値)が、前記(C)工程の代わりに、前記モノクローナル抗体をpH4〜9で固定し、pH2〜4で溶出する酸溶出型プロテインA担体を用いる精製工程を含む抗体の製造方法によって得られる抗体のKd値よりも小さい、請求項1乃至4のいずれか1項に記載の、高アフィニティー抗体の製造方法。
- 前記(C)工程により、前記温度応答型プロテインA担体により抗体を精製した後、低pH処理、60℃以上の高温処理、アフィニティークロマトグラフィーによる精製処理のいずれの処理も行わないことを特徴とする、請求項1乃至5のいずれか1項に記載の、高アフィニティー抗体の製造方法。
- (A)モノクローナル抗体を産生する細胞を培養する工程と、
(B)前記細胞を含む溶液から前記細胞を除去する工程と、
(C)前記溶液に含まれる前記モノクローナル抗体を温度応答性プロテインA担体によって精製する工程と、
を含む抗体の製造方法で得られた高アフィニティー抗体であって、
前記(C)工程の前に、低pH処理、60℃以上の高温処理、アフィニティークロマトグラフィーによる精製処理のいずれの処理も含まず、
前記(B)工程で得られた前記細胞を除去された溶液を、24時間以内に、前記(C)工程に処することで得られたことを特徴とする、高アフィニティー抗体。 - 抗原に対する解離定数(KD値)が、前記(C)工程の代わりに、モノクローナル抗体をpH4〜9で固定し、pH2〜4で溶出する酸溶出型プロテインA担体を用いる精製工程を含む抗体の製造方法によって得られる抗体のKD値よりも小さいことを特徴とする、請求項7に記載の、高アフィニティー抗体。
- 前記細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)であることを特徴とする、請求項7または8に記載の、高アフィニティー抗体。
- 前記抗体がヒト抗体であることを特徴とする、請求項7乃至9のいずれか1項に記載の、高アフィニティー抗体。
- 抗原に対する解離速度定数(Kd値)が、前記(C)工程の代わりに、前記モノクローナル抗体をpH4〜9で固定し、pH2〜4で溶出する酸溶出型プロテインA担体を用いる精製工程を含む抗体の製造方法によって得られる抗体のKd値よりも小さい、請求項7乃至10のいずれか1項に記載の、高アフィニティー抗体。
- 前記(C)工程により、前記温度応答型プロテインA担体により当該抗体を精製した後、低pH処理、60℃以上の高温処理、アフィニティークロマトグラフィーによる精製処理のいずれの処理も行われていない、請求項1乃至11のいずれか1項に記載の、高アフィニティー抗体。
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