JPWO2013146841A1 - 医用画像処理装置及びプログラム - Google Patents
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Abstract
組織切片における特定のタンパク質の発現量を医師が定量的に把握できるようにする。画像処理装置2Aによれば、制御部21は、組織切片における細胞の形態を表す細胞形態画像(明視野画像又は蛍光画像)から操作部22により解析対象のROIが指定されると、明視野画像又は蛍光画像から細胞核の領域を抽出するとともに、蛍光画像から特定タンパク質の発現を示す蛍光輝点を抽出する。そして、操作部22により指定されたROIに存在する細胞核の領域及び蛍光輝点に基づいて、指定されたROIにおける特定タンパクの発現量を示す特徴量を算出し出力する。
Description
本発明は、医用画像処理装置及びプログラムに関する。
病理診断では、まず採取した組織を固定するために脱水し、パラフィンによるブロック化といった処理を行った後、2〜8μmの厚さの薄片に切り、パラフィンを取り除き、染色して顕微鏡観察を行う。病理医は、この顕微鏡像の中で、細胞の核の大きさや形の変化、組織としてのパターンの変化等の形態学的な情報、染色情報をもとに診断を行っている。病理診断に用いられる組織染色方法としては、従来の色素染色法(例えばヘマトキシリン−エオジン染色;以下、HE染色)、酵素を用いた色素染色法(例えばDAB(ジアミノベンジン)染色)が知られている。
病理診断において、組織切片で過剰発現をしているタンパク質及びその発現量を特定することは、予後の予測やその後の治療計画を決める上で非常に重要な情報となり得る。
例えば、HER2遺伝子のコードするHER2タンパクは、細胞膜を貫通する受容体型糖タンパクであり、細胞外、膜貫通、細胞内の3ドメインから構成され、増殖因子が結合すると、チロシン残基のリン酸化により活性化され、シグナル伝達経路を介して細胞の増殖や悪性化に関与するとされている。乳癌、肺癌、大腸癌、胃癌、膀胱癌等においてHER2タンパクの過剰発現がみられる。
また、HER2タンパクは乳癌の予後因子であるとされており、特にリンパ節転移陽性例では、HER2陽性例の予後が有意に不良であることが知られている。また、HER2タンパクは、分子標的薬(トラスツズマブ)の適応を決める重要な因子として、また、アンスラサイクリン系、タキサン系等の抗癌剤の効果予測因子として注目されている。
一般的に、HER2タンパクの過剰発現は免疫組織化学的方法(IHC法)で検査され、HER2遺伝子の過剰発現はFISH法で検査されている。HER検査のガイドラインによると、まず簡便なIHC法で陽性、陰性、境界領域を選別し、陽性の場合にはトラスツズマブの投与を決定する。IHC法で境界領域のものについては、さらにFISH法で陽性、陰性を選別する。
IHC法とFISH法を比べると、IHC法は簡便だが、精度が低いという問題があった。一方、FISH法は精度が高いが、作業が煩雑でありコストが高い。つまり、IHC法でFISH法と同様の精度を出せる手法の開発が望まれている。また、属人性が低く、自動化可能な手法の開発が望まれている。
IHC法とFISH法を比べると、IHC法は簡便だが、精度が低いという問題があった。一方、FISH法は精度が高いが、作業が煩雑でありコストが高い。つまり、IHC法でFISH法と同様の精度を出せる手法の開発が望まれている。また、属人性が低く、自動化可能な手法の開発が望まれている。
例えば、特許文献1には、DAB法により染色された生体組織の画像から細胞核を抽出し、その細胞核に基づいて生体組織の画像から細胞膜を特定し、細胞膜の染色状態を判別し、この判別結果に基づいてHER2タンパクの発現を評価するシステムが記載されている。
しかしながら、DAB法は酵素による増幅があり定量性に欠けるため、特許文献1に記載の技術では、定量的なHER2タンパクの発現量を知ることはできない。また、浸潤部では細胞膜が一定の形状を保っておらず、細胞膜を特定しての解析は困難である。
本発明の課題は、組織切片における特定のタンパク質の発現量を医師が定量的に把握できるようにすることである。
上記課題を解決するために、本発明の第1の側面によると、医用画像処理装置は、
組織切片における細胞の形態を表す細胞形態画像及び前記組織切片における特定のタンパク質の発現を蛍光輝点で表す蛍光画像を入力する入力手段と、
前記細胞形態画像から解析対象領域を指定するための操作手段と、
前記細胞形態画像から細胞核の領域を抽出する細胞核抽出手段と、
前記蛍光画像から前記特定のタンパク質の発現を示す蛍光輝点を抽出する蛍光輝点抽出手段と、
前記操作手段により指定された解析対象領域に存在する前記抽出された細胞核の領域及び蛍光輝点に基づいて、前記指定された解析対象領域における前記特定のタンパク質の発現量を示す特徴量を算出する特徴量算出手段と、
前記算出された特徴量を出力する出力手段と、
を備える。
組織切片における細胞の形態を表す細胞形態画像及び前記組織切片における特定のタンパク質の発現を蛍光輝点で表す蛍光画像を入力する入力手段と、
前記細胞形態画像から解析対象領域を指定するための操作手段と、
前記細胞形態画像から細胞核の領域を抽出する細胞核抽出手段と、
前記蛍光画像から前記特定のタンパク質の発現を示す蛍光輝点を抽出する蛍光輝点抽出手段と、
前記操作手段により指定された解析対象領域に存在する前記抽出された細胞核の領域及び蛍光輝点に基づいて、前記指定された解析対象領域における前記特定のタンパク質の発現量を示す特徴量を算出する特徴量算出手段と、
前記算出された特徴量を出力する出力手段と、
を備える。
上記の医用画像処理装置において、
前記特徴量算出手段は、前記操作手段により指定された解析対象領域における蛍光輝点の数、及び細胞核の個数の情報を取得し、取得した細胞核及び蛍光輝点の個数に基づいて、前記指定された解析対象領域における前記特定のタンパク質の発現量を示す特徴量を算出することが好ましい。
前記特徴量算出手段は、前記操作手段により指定された解析対象領域における蛍光輝点の数、及び細胞核の個数の情報を取得し、取得した細胞核及び蛍光輝点の個数に基づいて、前記指定された解析対象領域における前記特定のタンパク質の発現量を示す特徴量を算出することが好ましい。
上記の医用画像処理装置において、
前記特徴量算出手段は、前記指定された解析対象領域における細胞核1個あたりの蛍光輝点の数を前記特定のタンパク質の発現量を示す特徴量として算出することが好ましい。
前記特徴量算出手段は、前記指定された解析対象領域における細胞核1個あたりの蛍光輝点の数を前記特定のタンパク質の発現量を示す特徴量として算出することが好ましい。
上記の医用画像処理装置において、
前記細胞形態画像と前記蛍光画像の合成画像を生成する合成画像生成手段を備え、
前記出力手段は、前記操作手段により指定された解析対象領域の位置を示すアノテーションが重畳された前記合成画像を前記特徴量とともに出力することが好ましい。
前記細胞形態画像と前記蛍光画像の合成画像を生成する合成画像生成手段を備え、
前記出力手段は、前記操作手段により指定された解析対象領域の位置を示すアノテーションが重畳された前記合成画像を前記特徴量とともに出力することが好ましい。
上記の医用画像処理装置において、
前記細胞形態画像及び前記蛍光画像は、前記組織切片の細胞の形態を表すとともに前記組織切片における特定のタンパク質の発現を蛍光輝点で表す一枚の画像からなることが好ましい。
前記細胞形態画像及び前記蛍光画像は、前記組織切片の細胞の形態を表すとともに前記組織切片における特定のタンパク質の発現を蛍光輝点で表す一枚の画像からなることが好ましい。
本発明の第2の側面によると、プログラムは、
コンピュータを、
組織切片における細胞の形態を表す細胞形態画像及び前記組織切片における特定のタンパク質の発現を蛍光輝点で表す蛍光画像を入力する入力手段、
前記細胞形態画像から解析対象領域を指定するための操作手段、
前記細胞形態画像から細胞核の領域を抽出する細胞核抽出手段、
前記蛍光画像から前記特定のタンパク質の発現を示す蛍光輝点を抽出する蛍光輝点抽出手段、
前記操作手段により指定された解析対象領域に存在する前記抽出された細胞核の領域及び蛍光輝点に基づいて、前記指定された解析対象領域における前記特定のタンパク質の発現量を示す特徴量を算出する特徴量算出手段、
前記算出された特徴量を出力する出力手段、
として機能させる。
コンピュータを、
組織切片における細胞の形態を表す細胞形態画像及び前記組織切片における特定のタンパク質の発現を蛍光輝点で表す蛍光画像を入力する入力手段、
前記細胞形態画像から解析対象領域を指定するための操作手段、
前記細胞形態画像から細胞核の領域を抽出する細胞核抽出手段、
前記蛍光画像から前記特定のタンパク質の発現を示す蛍光輝点を抽出する蛍光輝点抽出手段、
前記操作手段により指定された解析対象領域に存在する前記抽出された細胞核の領域及び蛍光輝点に基づいて、前記指定された解析対象領域における前記特定のタンパク質の発現量を示す特徴量を算出する特徴量算出手段、
前記算出された特徴量を出力する出力手段、
として機能させる。
本発明によれば、組織切片における特定のタンパク質の発現量を医師が定量的に把握することが可能となるので、予後の予測や治療戦略が容易となる。
以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。
−第1の実施の形態−
<病理診断支援システム100の構成>
図1に、第1の実施の形態における病理診断支援システム100の全体構成例を示す。病理診断支援システム100は、所定の染色試薬で染色された人体の組織切片の顕微鏡画像を取得し、取得された顕微鏡画像を解析することにより、観察対象の組織切片における特定の生体物質の発現を定量的に表す特徴量を出力するシステムである。
<病理診断支援システム100の構成>
図1に、第1の実施の形態における病理診断支援システム100の全体構成例を示す。病理診断支援システム100は、所定の染色試薬で染色された人体の組織切片の顕微鏡画像を取得し、取得された顕微鏡画像を解析することにより、観察対象の組織切片における特定の生体物質の発現を定量的に表す特徴量を出力するシステムである。
図1に示すように、病理診断支援システム100は、顕微鏡画像取得装置1Aと、画像処理装置2Aと、がケーブル3A等のインターフェースを介してデータ送受信可能に接続されて構成されている。なお、顕微鏡画像取得装置1Aと画像処理装置2Aとの接続方式は特に限定されない。例えば、顕微鏡画像取得装置1Aと画像処理装置2AはLAN(Local Area Network)により接続されることとしてもよいし、無線により接続される構成としてもよい。
顕微鏡画像取得装置1Aは、公知のカメラ付き光学顕微鏡であり、スライド固定ステージ上に載置されたスライド上の組織切片の顕微鏡画像を取得し、画像処理装置2Aに送信するものである。
顕微鏡画像取得装置1Aは、照射手段、結像手段、撮像手段、通信I/F等を備えて構成されている。照射手段は、光源、フィルター等により構成され、スライド固定ステージに載置されたスライド上の組織切片に光を照射する。結像手段は、接眼レンズ、対物レンズ等により構成され、照射した光によりスライド上の組織切片から発せられる透過光、反射光、又は蛍光を結像する。撮像手段は、CCD(Charge Coupled Device)センサ等を備え、結像手段により結像面に結像される像を撮像して顕微鏡画像のデジタル画像データ(R、G、Bの画像データ)を生成する顕微鏡設置カメラである。通信I/Fは、生成された顕微鏡画像の画像データを画像処理装置2Aに送信する。本実施の形態において、顕微鏡画像取得装置1Aは、明視野観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた明視野ユニット、蛍光観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた蛍光ユニットが備えられており、ユニットを切り替えることにより明視野/蛍光を切り替えることが可能である。
顕微鏡画像取得装置1Aは、照射手段、結像手段、撮像手段、通信I/F等を備えて構成されている。照射手段は、光源、フィルター等により構成され、スライド固定ステージに載置されたスライド上の組織切片に光を照射する。結像手段は、接眼レンズ、対物レンズ等により構成され、照射した光によりスライド上の組織切片から発せられる透過光、反射光、又は蛍光を結像する。撮像手段は、CCD(Charge Coupled Device)センサ等を備え、結像手段により結像面に結像される像を撮像して顕微鏡画像のデジタル画像データ(R、G、Bの画像データ)を生成する顕微鏡設置カメラである。通信I/Fは、生成された顕微鏡画像の画像データを画像処理装置2Aに送信する。本実施の形態において、顕微鏡画像取得装置1Aは、明視野観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた明視野ユニット、蛍光観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた蛍光ユニットが備えられており、ユニットを切り替えることにより明視野/蛍光を切り替えることが可能である。
なお、顕微鏡画像取得装置1Aとしては、カメラ付き顕微鏡に限定されず、例えば、顕微鏡のスライド固定ステージ上のスライドをスキャンして組織切片全体の顕微鏡画像を取得するバーチャル顕微鏡スライド作成装置(例えば、特表2002−514319号公報参照)等を用いてもよい。バーチャル顕微鏡スライド作成装置によれば、スライド上の組織切片全体像を表示部で一度に閲覧可能な画像データを取得することができる。
画像処理装置2Aは、顕微鏡画像取得装置1Aから送信された顕微鏡画像を解析することにより、観察対象の組織切片における特定の生体物質の発現量を定量的に示す特徴量を算出し、算出された特徴量を出力する医用画像処理装置である。
図2に、画像処理装置2Aの機能構成例を示す。図2に示すように、画像処理装置2Aは、制御部21、操作部22、表示部23、通信I/F24、記憶部25等を備えて構成され、各部はバス26を介して接続されている。
図2に、画像処理装置2Aの機能構成例を示す。図2に示すように、画像処理装置2Aは、制御部21、操作部22、表示部23、通信I/F24、記憶部25等を備えて構成され、各部はバス26を介して接続されている。
制御部21は、CPU(Central Processing Unit)、RAM(Random Access Memory)等を備えて構成され、記憶部25に記憶されている各種プログラムとの協働により各種処理を実行し、画像処理装置2Aの動作を統括的に制御する。例えば、制御部21は、記憶部25に記憶されているプログラムとの協働により画像解析処理A(図10参照)を実行し、細胞核抽出手段、蛍光輝点抽出手段、特徴量算出手段、合成画像生成手段としての機能を実現する。
操作部22は、文字入力キー、数字入力キー、及び各種機能キー等を備えたキーボードと、マウス等のポインティングデバイスを備えて構成され、キーボードで押下操作されたキーの押下信号とマウスによる操作信号とを、入力信号として制御部21に出力する。
表示部23は、例えば、CRT(Cathode Ray Tube)やLCD(Liquid Crystal Display)等のモニタを備えて構成されており、制御部21から入力される表示信号の指示に従って、各種画面を表示する。本実施の形態において、表示部23は、算出された特徴量を出力するための出力手段として機能する。
通信I/F24は、顕微鏡画像取得装置1Aをはじめとする外部機器との間でデータ送受信を行なうためのインターフェースである。本実施の形態において、通信I/F24は、入力手段として機能する。
記憶部25は、例えばHDD(Hard Disk Drive)や半導体の不揮発性メモリ等で構成されている。記憶部25には、前述のように各種プログラムや各種データ等が記憶されている。
その他、画像処理装置2Aは、LANアダプタやルータ等を備え、LAN等の通信ネットワークを介して外部機器と接続される構成としてもよい。
その他、画像処理装置2Aは、LANアダプタやルータ等を備え、LAN等の通信ネットワークを介して外部機器と接続される構成としてもよい。
第1の実施の形態における画像処理装置2Aは、顕微鏡画像取得装置1Aから送信された明視野画像(HE染色画像)及び蛍光画像を用いて解析を行う。
明視野画像は、HE(ヘマトキシリン−エオジン)染色された組織切片を顕微鏡画像取得装置1Aにおいて明視野で拡大結像及び撮影することにより得られる顕微鏡画像である。ヘマトキシリンは青紫色の色素であり、細胞核、骨組織、軟骨組織の一部、漿液成分など(好塩基性の組織等)を染色する。エオジンは赤〜ピンク色の色素であり、細胞質、軟部組織の結合組織、赤血球、線維素、内分泌顆粒など(好酸性の組織等)を染色する。図3に、HE染色を行った組織切片を撮影した明視野画像の一例を示す。図3に示すように、HE染色を行った組織切片を撮影した明視野画像においては、組織切片における細胞の形態が表れている。細胞核は、周囲の細胞質よりも濃い色(青紫色)で周囲と区別して表れており、明視野画像では、細胞核の形態をはっきり捉えることができる。
蛍光画像は、特定の生体物質と特異的に結合及び/又は反応する生体物質認識部位が結合した蛍光物質を内包したナノ粒子(蛍光物質内包ナノ粒子と呼ぶ)を含む染色試薬を用いて染色された組織切片に対し、顕微鏡画像取得装置1Aにおいて所定波長の励起光を照射して蛍光物質内包ナノ粒子を発光(蛍光)させ、この蛍光を拡大結像及び撮影することにより得られる顕微鏡画像である。即ち、蛍光画像に現れる蛍光は、組織切片における、生体物質認識部位に対応する特定の生体物質の発現を示すものである。図4に、蛍光画像の一例を示す。
明視野画像は、HE(ヘマトキシリン−エオジン)染色された組織切片を顕微鏡画像取得装置1Aにおいて明視野で拡大結像及び撮影することにより得られる顕微鏡画像である。ヘマトキシリンは青紫色の色素であり、細胞核、骨組織、軟骨組織の一部、漿液成分など(好塩基性の組織等)を染色する。エオジンは赤〜ピンク色の色素であり、細胞質、軟部組織の結合組織、赤血球、線維素、内分泌顆粒など(好酸性の組織等)を染色する。図3に、HE染色を行った組織切片を撮影した明視野画像の一例を示す。図3に示すように、HE染色を行った組織切片を撮影した明視野画像においては、組織切片における細胞の形態が表れている。細胞核は、周囲の細胞質よりも濃い色(青紫色)で周囲と区別して表れており、明視野画像では、細胞核の形態をはっきり捉えることができる。
蛍光画像は、特定の生体物質と特異的に結合及び/又は反応する生体物質認識部位が結合した蛍光物質を内包したナノ粒子(蛍光物質内包ナノ粒子と呼ぶ)を含む染色試薬を用いて染色された組織切片に対し、顕微鏡画像取得装置1Aにおいて所定波長の励起光を照射して蛍光物質内包ナノ粒子を発光(蛍光)させ、この蛍光を拡大結像及び撮影することにより得られる顕微鏡画像である。即ち、蛍光画像に現れる蛍光は、組織切片における、生体物質認識部位に対応する特定の生体物質の発現を示すものである。図4に、蛍光画像の一例を示す。
<蛍光画像の取得>
ここで、蛍光画像の取得方法について、この蛍光画像の取得に際して用いられる染色試薬(蛍光物質内包ナノ粒子)、染色試薬による組織切片の染色方法等も含めて詳細に説明する。
ここで、蛍光画像の取得方法について、この蛍光画像の取得に際して用いられる染色試薬(蛍光物質内包ナノ粒子)、染色試薬による組織切片の染色方法等も含めて詳細に説明する。
〔蛍光物質〕
蛍光画像の取得のための染色試薬に用いられる蛍光物質としては、蛍光有機色素及び量子ドット(半導体粒子)を挙げることができる。200〜700nmの範囲内の波長の紫外〜近赤外光により励起されたときに、400〜1100nmの範囲内の波長の可視〜近赤外光の発光を示すことが好ましい。
蛍光画像の取得のための染色試薬に用いられる蛍光物質としては、蛍光有機色素及び量子ドット(半導体粒子)を挙げることができる。200〜700nmの範囲内の波長の紫外〜近赤外光により励起されたときに、400〜1100nmの範囲内の波長の可視〜近赤外光の発光を示すことが好ましい。
蛍光有機色素としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Alexa Fluor(インビトロジェン社製)系色素分子、BODIPY(インビトロジェン社製)系色素分子、カスケード系色素分子、クマリン系色素分子、エオジン系色素分子、NBD系色素分子、ピレン系色素分子、Texas Red系色素分子、シアニン系色素分子等を挙げることができる。
具体的には、5−カルボキシ−フルオレセイン、6−カルボキシ−フルオレセイン、5,6−ジカルボキシ−フルオレセイン、6−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン、6−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン、6−カルボキシ−4’,5’−ジクロロ−2’,7’−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、5−カルボキシ−ローダミン、6−カルボキシ−ローダミン、5,6−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン 6G、テトラメチルローダミン、X−ローダミン、及びAlexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 635、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、BODIPY FL、BODIPY TMR、BODIPY 493/503、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665(以上インビトロジェン社製)、メトキシクマリン、エオジン、NBD、ピレン、Cy5、Cy5.5、Cy7等を挙げることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。
量子ドットとしては、II−VI族化合物、III−V族化合物、又はIV族元素を成分として含有する量子ドット(それぞれ、「II−VI族量子ドット」、「III−V族量子ドット」、「IV族量子ドット」ともいう。)のいずれかを用いることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。
具体的には、CdSe、CdS、CdTe、ZnSe、ZnS、ZnTe、InP、InN、InAs、InGaP、GaP、GaAs、Si、Geが挙げられるが、これらに限定されない。
上記量子ドットをコアとし、その上にシェルを設けた量子ドットを用いることもできる。以下、本明細書中シェルを有する量子ドットの表記法として、コアがCdSe、シェルがZnSの場合、CdSe/ZnSと表記する。例えば、CdSe/ZnS、CdS/ZnS、InP/ZnS、InGaP/ZnS、Si/SiO2、Si/ZnS、Ge/GeO2、Ge/ZnS等を用いることができるが、これらに限定されない。
量子ドットは必要に応じて、有機ポリマー等により表面処理が施されているものを用いてもよい。例えば、表面カルボキシ基を有するCdSe/ZnS(インビトロジェン社製)、表面アミノ基を有するCdSe/ZnS(インビトロジェン社製)等が挙げられる。
量子ドットは必要に応じて、有機ポリマー等により表面処理が施されているものを用いてもよい。例えば、表面カルボキシ基を有するCdSe/ZnS(インビトロジェン社製)、表面アミノ基を有するCdSe/ZnS(インビトロジェン社製)等が挙げられる。
〔蛍光物質内包ナノ粒子〕
本実施の形態において蛍光物質内包ナノ粒子とは、蛍光物質がナノ粒子内部に分散されたものをいい、蛍光物質とナノ粒子自体とが化学的に結合していても、結合していなくてもよい。
ナノ粒子を構成する素材は特に限定されるものではなく、ポリスチレン、ポリ乳酸、シリカ等を挙げることができる。
本実施の形態において蛍光物質内包ナノ粒子とは、蛍光物質がナノ粒子内部に分散されたものをいい、蛍光物質とナノ粒子自体とが化学的に結合していても、結合していなくてもよい。
ナノ粒子を構成する素材は特に限定されるものではなく、ポリスチレン、ポリ乳酸、シリカ等を挙げることができる。
本実施の形態で用いられる蛍光物質内包ナノ粒子は、公知の方法により作製することが可能である。例えば、蛍光有機色素を内包したシリカナノ粒子は、ラングミュア 8巻 2921ページ(1992)に記載されているFITC内包シリカ粒子の合成を参考に合成することができる。FITCの代わりに所望の蛍光有機色素を用いることで種々の蛍光有機色素内包シリカナノ粒子を合成することができる。
量子ドットを内包したシリカナノ粒子は、ニュー・ジャーナル・オブ・ケミストリー 33巻 561ページ(2009)に記載されているCdTe内包シリカナノ粒子の合成を参考に合成することができる。
蛍光有機色素を内包したポリスチレンナノ粒子は、米国特許4326008(1982)に記載されている重合性官能基をもつ有機色素を用いた共重合法や、米国特許5326692(1992)に記載されているポリスチレンナノ粒子への蛍光有機色素の含浸法を用いて作製することができる。
量子ドットを内包したポリマーナノ粒子は、ネイチャー・バイオテクノロジー19巻631ページ(2001)に記載されているポリスチレンナノ粒子への量子ドットの含浸法を用いて作製することができる。
本実施の形態で用いられる蛍光物質内包ナノ粒子の平均粒径は特に限定されないが、30〜800nm程度のものを用いることができる。また、粒径のばらつきを示す変動係数(=(標準偏差/平均値)×100%)は特に限定されないが、20%以下のものを用いることが好ましい。平均粒径は、走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、各計測値を円の面積としたときの円の直径を粒径として求めた。本願においては、1000個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とした。変動係数も、1000個の粒子の粒径分布から算出した値とした。
〔生体物質認識部位と蛍光物質内包ナノ粒子との結合〕
本実施の形態に係る生体物質認識部位とは、目的とする生体物質と特異的に結合及び/又は反応する部位である。目的とする生体物質は、それと特異的に結合する物質が存在するものであれば特に限定されるものではないが、代表的にはタンパク質(ペプチド)および核酸(オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド)、抗体等が挙げられる。したがって、そのような目的とする生体物質に結合する物質としては、前記タンパク質を抗原として認識する抗体やそれに特異的に結合する他のタンパク質等、および前記核酸にハイブリタイズする塩基配列を有する核酸等が挙げられる。具体的には、細胞表面に存在するタンパク質であるHER2に特異的に結合する抗HER2抗体、細胞核に存在するエストロゲン受容体(ER)に特異的に結合する抗ER抗体、細胞骨格を形成するアクチンに特異的に結合する抗アクチン抗体等があげられる。中でも抗HER2抗体及び抗ER抗体を蛍光物質内包ナノ粒子に結合させたものは、乳癌の投薬選定に用いることができ、好ましい。
本実施の形態に係る生体物質認識部位とは、目的とする生体物質と特異的に結合及び/又は反応する部位である。目的とする生体物質は、それと特異的に結合する物質が存在するものであれば特に限定されるものではないが、代表的にはタンパク質(ペプチド)および核酸(オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド)、抗体等が挙げられる。したがって、そのような目的とする生体物質に結合する物質としては、前記タンパク質を抗原として認識する抗体やそれに特異的に結合する他のタンパク質等、および前記核酸にハイブリタイズする塩基配列を有する核酸等が挙げられる。具体的には、細胞表面に存在するタンパク質であるHER2に特異的に結合する抗HER2抗体、細胞核に存在するエストロゲン受容体(ER)に特異的に結合する抗ER抗体、細胞骨格を形成するアクチンに特異的に結合する抗アクチン抗体等があげられる。中でも抗HER2抗体及び抗ER抗体を蛍光物質内包ナノ粒子に結合させたものは、乳癌の投薬選定に用いることができ、好ましい。
生体物質認識部位と蛍光物質内包ナノ粒子の結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合等の結合力の強い結合が好ましい。
また、生体物質認識部位と蛍光物質内包ナノ粒子の間を連結する有機分子があってもよい。例えば、生体物質との非特異的吸着を抑制するため、ポリエチレングリコール鎖を用いることができ、Thermo Scientific社製SM(PEG)12を用いることができる。
蛍光物質内包シリカナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が蛍光有機色素の場合でも、量子ドットの場合でも同様の手順を適用することができる。例えば、無機物と有機物を結合させるために広く用いられている化合物であるシランカップリング剤を用いることができる。このシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基を与えるアルコキシシリル基を有し、他端に、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基、アルデヒド基等の官能基を有する化合物であり、上記シラノール基の酸素原子を介して無機物と結合する。具体的には、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、ポリエチレングリコール鎖をもつシランカップリング剤(例えば、Gelest社製PEG−silane no.SIM6492.7)等が挙げられる。シランカップリング剤を用いる場合、二種以上を併用してもよい。
蛍光有機色素内包シリカナノ粒子とシランカップリング剤との反応手順は、公知の手法を用いることができる。例えば、得られた蛍光有機色素内包シリカナノ粒子を純水中に分散させ、アミノプロピルトリエトキシシランを添加し、室温で12時間反応させる。反応終了後、遠心分離又はろ過により表面がアミノプロピル基で修飾された蛍光有機色素内包シリカナノ粒子を得ることができる。続いてアミノ基と抗体中のカルボキシル基とを反応させることで、アミド結合を介し抗体を蛍光有機色素内包シリカナノ粒子と結合させることができる。必要に応じて、EDC(1−Ethyl−3−[3−Dimethylaminopropyl]carbodiimide Hydrochloride:Pierce(登録商標)社製)のような縮合剤を用いることもできる。
必要により、有機分子で修飾された蛍光有機色素内包シリカナノ粒子と直接結合しうる部位と、分子標的物質と結合しうる部位とを有するリンカー化合物を用いることができる。具体例として、アミノ基と選択的に反応する部位とメルカプト基と選択的に反応する部位の両方をもつsulfo−SMCC(Sulfosuccinimidyl 4[N−maleimidomethyl]−cyclohexane−1−carboxylate:Pierce社製)を用いると、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した蛍光有機色素内包シリカナノ粒子のアミノ基と、抗体中のメルカプト基を結合させることで、抗体結合した蛍光有機色素内包シリカナノ粒子ができる。
蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が蛍光有機色素の場合でも、量子ドットの場合でも同様の手順を適用することができる。すなわち、アミノ基等の官能基をもつポリスチレンナノ粒子へ蛍光有機色素、量子ドットを含浸することにより、官能基もつ蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子を得ることができ、以降EDC又はsulfo−SMCCを用いることで、抗体結合した蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子ができる。
特定抗原を認識する抗体としては、M.アクチン,M.S.アクチン,S.M.アクチン,ACTH,Alk-1,α1-アンチキモトリプシン,α1-アンチトリプシン,AFP,bcl-2,bcl-6,β-カテニン,BCA 225,CA19-9,CA125,カルシトニン,カルレチニン,CD1a,CD3,CD4,CD5,CD8,CD10,CD15,CD20,CD21,CD23,CD30,CD31,CD34,CD43,CD45,CD45R,CD56,CD57,CD61,CD68,CD79a,"CD99, MIC2",CD138,クロモグラニン,c-KIT,c-MET,コラーゲン タイプIV,Cox-2,サイクリンD1,ケラチン,サイトケラチン(高分子量),パンケラチン,パンケラチン,サイトケラチン 5/6,サイトケラチン 7,サイトケラチン 8,サイトケラチン8/18,サイトケラチン 14,サイトケラチン 19,サイトケラチン 20,CMV,E-カドヘリン,EGFR,ER,EMA,EBV,第VIII因子関連抗原,ファッシン,FSH,ガレクチン-3,ガストリン,GFAP,グルカゴン,グリコフォリン A,グランザイム B,hCG,hGH,ヘリコバクターピロリ,HBc 抗原,HBs 抗原,ヘパトサイト特異抗原,HER2,HSV -I,HSV -II,HHV-8,IgA,IgG,IgM,IGF-1R,インヒビン,インスリン,カッパ L鎖,Ki67,ラムダ L鎖,LH,リゾチーム,マクロファージ,メランA,MLH-1,MSH-2,ミエロパーオキシダーゼ,ミオゲニン,ミオグロビン,ミオシン,ニューロフィラメント,NSE,p27 (Kip1),p53,p53,P63,PAX 5,PLAP,ニューモシスティス カリニ,ポドプラニン(D2-40),PGR,プロラクチン,PSA,前立腺酸性フォスファターゼ,Renal Cell Carcinoma,S100,ソマトスタチン,スペクトリン,シナプトフィジン,TAG-72,TdT,サイログロブリン,TSH,TTF-1,TRAcP,トリプターゼ,ビリン,ビメンチン,WT1,Zap-70が挙げられる。
〔染色方法〕
以下、組織切片の染色方法について述べる。以下に説明する染色方法は病理切片組織に限定せず、細胞染色にも適用可能である。
また、以下に説明する染色方法が適用できる切片の作製法は特に限定されず、公知の方法により作製されたものを用いることができる。
以下、組織切片の染色方法について述べる。以下に説明する染色方法は病理切片組織に限定せず、細胞染色にも適用可能である。
また、以下に説明する染色方法が適用できる切片の作製法は特に限定されず、公知の方法により作製されたものを用いることができる。
1)脱パラフィン工程
キシレンを入れた容器に病理切片を浸漬させ、パラフィンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
次いで、エタノールを入れた容器に病理切片を浸漬させ、キシレンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
次いで、水を入れた容器に病理切片を浸漬させ、エタノールを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
キシレンを入れた容器に病理切片を浸漬させ、パラフィンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
次いで、エタノールを入れた容器に病理切片を浸漬させ、キシレンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
次いで、水を入れた容器に病理切片を浸漬させ、エタノールを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
2)賦活化処理
公知の方法にならい、目的とする生体物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、0.01Mクエン酸緩衝液(pH6.0)、1mMEDTA溶液(pH8.0)、5%尿素、0.1Mトリス塩酸緩衝液等を用いることができる。加熱機器は、オートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバス等を用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は50−130℃、時間は5−30分で行うことができる。
次いで、PBS(Phosphate Buffered Saline:リン酸緩衝生理食塩水)を入れた容器に、賦活化処理後の切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でPBSを交換してもよい。
公知の方法にならい、目的とする生体物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、0.01Mクエン酸緩衝液(pH6.0)、1mMEDTA溶液(pH8.0)、5%尿素、0.1Mトリス塩酸緩衝液等を用いることができる。加熱機器は、オートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバス等を用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は50−130℃、時間は5−30分で行うことができる。
次いで、PBS(Phosphate Buffered Saline:リン酸緩衝生理食塩水)を入れた容器に、賦活化処理後の切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でPBSを交換してもよい。
3)生体物質認識部位が結合された蛍光物質内包ナノ粒子を用いた染色
生体物質認識部位が結合された蛍光物質内包ナノ粒子のPBS分散液を病理切片に載せ、目的とする生体物質と反応させる。蛍光物質内包ナノ粒子と結合させる生体物質認識部位を変えることにより、さまざまな生体物質に対応した染色が可能となる。数種類の生体物質認識部位が結合された蛍光物質内包ナノ粒子を用いる場合には、それぞれの蛍光物質内包ナノ粒子PBS分散液を予め混合しておいてもよいし、別々に順次病理切片に載せてもよい。
温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、30分以上24時間以下であることが好ましい。
蛍光物質内包ナノ粒子による染色を行う前に、BSA含有PBS等、公知のブロッキング剤を滴下することが好ましい。
次いで、PBSを入れた容器に、染色後の切片を浸漬させ、未反応蛍光物質内包ナノ粒子の除去を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でPBSを交換してもよい。カバーガラスを切片に載せ、封入する。必要に応じて市販の封入剤を使用してもよい。
なお、HE染色を行う場合、カバーガラスによる封入前にHE染色を行う。
生体物質認識部位が結合された蛍光物質内包ナノ粒子のPBS分散液を病理切片に載せ、目的とする生体物質と反応させる。蛍光物質内包ナノ粒子と結合させる生体物質認識部位を変えることにより、さまざまな生体物質に対応した染色が可能となる。数種類の生体物質認識部位が結合された蛍光物質内包ナノ粒子を用いる場合には、それぞれの蛍光物質内包ナノ粒子PBS分散液を予め混合しておいてもよいし、別々に順次病理切片に載せてもよい。
温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、30分以上24時間以下であることが好ましい。
蛍光物質内包ナノ粒子による染色を行う前に、BSA含有PBS等、公知のブロッキング剤を滴下することが好ましい。
次いで、PBSを入れた容器に、染色後の切片を浸漬させ、未反応蛍光物質内包ナノ粒子の除去を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でPBSを交換してもよい。カバーガラスを切片に載せ、封入する。必要に応じて市販の封入剤を使用してもよい。
なお、HE染色を行う場合、カバーガラスによる封入前にHE染色を行う。
〔蛍光画像の取得〕
染色した病理切片に対し顕微鏡画像取得装置1Aを用いて、広視野の顕微鏡画像(蛍光画像)を取得する。顕微鏡画像取得装置1Aおいて、染色試薬に用いた蛍光物質の吸収極大波長及び蛍光波長に対応した励起光源及び蛍光検出用光学フィルターを選択する。
蛍光画像の視野は、3mm2以上であることが好ましく、30mm2以上であることがさらに好ましく、300mm2以上であることがさらに好ましい。
染色した病理切片に対し顕微鏡画像取得装置1Aを用いて、広視野の顕微鏡画像(蛍光画像)を取得する。顕微鏡画像取得装置1Aおいて、染色試薬に用いた蛍光物質の吸収極大波長及び蛍光波長に対応した励起光源及び蛍光検出用光学フィルターを選択する。
蛍光画像の視野は、3mm2以上であることが好ましく、30mm2以上であることがさらに好ましく、300mm2以上であることがさらに好ましい。
<蛍光輝点とFISHスコアとの関係>
ここで、本件出願人は、以下に説明するように、一実施例として、Cy5内包シリカナノ粒子(以下、ナノ粒子1という。)を作製し、ナノ粒子1に対して抗HER2抗体を結合させた標識材料Aを作製した。また、CdSe/ZnS内包シリカナノ粒子(以下、ナノ粒子2という)を作製し、ナノ粒子2に対して抗HER2抗体を結合させた標識材料Bを作製した。そして、作製した標識材料A、B及び比較例としての標識材料C、Dを用いて予めFISHスコアを測定したヒト***組織の隣接切片を用いて免疫染色を行って視野を変えて複数の蛍光画像を取得し、各蛍光画像に現れている蛍光輝点の数を計測してFISHスコアとの関連を調べる実験を行った。
ここで、本件出願人は、以下に説明するように、一実施例として、Cy5内包シリカナノ粒子(以下、ナノ粒子1という。)を作製し、ナノ粒子1に対して抗HER2抗体を結合させた標識材料Aを作製した。また、CdSe/ZnS内包シリカナノ粒子(以下、ナノ粒子2という)を作製し、ナノ粒子2に対して抗HER2抗体を結合させた標識材料Bを作製した。そして、作製した標識材料A、B及び比較例としての標識材料C、Dを用いて予めFISHスコアを測定したヒト***組織の隣接切片を用いて免疫染色を行って視野を変えて複数の蛍光画像を取得し、各蛍光画像に現れている蛍光輝点の数を計測してFISHスコアとの関連を調べる実験を行った。
〔蛍光物質内包ナノ粒子の合成〕
(合成例1:蛍光有機色素内包シリカ:Cy5内包シリカナノ粒子の合成)
下記工程(1)〜(5)の方法により、Cy5内包シリカナノ粒子(ナノ粒子1)を作製した。
工程(1):Cy5のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体(GEヘルスケア社製)1mg(0.00126mmol)とテトラエトキシシラン400μL(1.796mmol)を混合した。
工程(2):エタノール40mLと14%アンモニア水10mLを混合した。
工程(3):工程(2)で作製した混合液を室温下で撹拌しているところに、工程(1)で調製した混合液を添加した。添加開始から12時間撹拌を行った。
工程(4):反応混合物を10000Gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程(5):エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を1回ずつ行った。
得られたナノ粒子1を走査型電子顕微鏡(SEM;日立(登録商標)社製S−800型)で観察したところ、平均粒径は110nm、変動係数は12%であった。
(合成例1:蛍光有機色素内包シリカ:Cy5内包シリカナノ粒子の合成)
下記工程(1)〜(5)の方法により、Cy5内包シリカナノ粒子(ナノ粒子1)を作製した。
工程(1):Cy5のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体(GEヘルスケア社製)1mg(0.00126mmol)とテトラエトキシシラン400μL(1.796mmol)を混合した。
工程(2):エタノール40mLと14%アンモニア水10mLを混合した。
工程(3):工程(2)で作製した混合液を室温下で撹拌しているところに、工程(1)で調製した混合液を添加した。添加開始から12時間撹拌を行った。
工程(4):反応混合物を10000Gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程(5):エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を1回ずつ行った。
得られたナノ粒子1を走査型電子顕微鏡(SEM;日立(登録商標)社製S−800型)で観察したところ、平均粒径は110nm、変動係数は12%であった。
(合成例2:量子ドット内包シリカ:発光波長655nmのCdSe/ZnS内包シリカナノ粒子の合成)
下記工程(1)〜(5)の方法により、CdSe/ZnS内包シリカナノ粒子(以下、ナノ粒子2という。)を作製した。
工程(1):CdSe/ZnSデカン分散液(インビトロジェン社Qdot655)10μLとテトラエトキシシラン40μLを混合した。
工程(2):エタノール4mLと14%アンモニア水1mLを混合した。
工程(3):工程(2)で作製した混合液を室温下で撹拌しているところに、工程(1)で作製した混合液を添加した。添加開始から12時間撹拌を行った。
工程(4):反応混合物を10000Gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程(5):エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を1回ずつ行った。
得られたナノ粒子2を走査型電子顕微鏡で観察したところ、平均粒径は130nm、変動係数は13%であった。
下記工程(1)〜(5)の方法により、CdSe/ZnS内包シリカナノ粒子(以下、ナノ粒子2という。)を作製した。
工程(1):CdSe/ZnSデカン分散液(インビトロジェン社Qdot655)10μLとテトラエトキシシラン40μLを混合した。
工程(2):エタノール4mLと14%アンモニア水1mLを混合した。
工程(3):工程(2)で作製した混合液を室温下で撹拌しているところに、工程(1)で作製した混合液を添加した。添加開始から12時間撹拌を行った。
工程(4):反応混合物を10000Gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程(5):エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を1回ずつ行った。
得られたナノ粒子2を走査型電子顕微鏡で観察したところ、平均粒径は130nm、変動係数は13%であった。
〔蛍光物質内包シリカナノ粒子への抗体の結合〕
下記工程(1)〜(12)の方法により、蛍光物質内包シリカナノ粒子に対して抗体を結合させた。ここでは、ナノ粒子1を用いた例を示すが、ナノ粒子2についても同様である。
工程(1):1mgのナノ粒子1を純水5mLに分散させた。次いで、アミノプロピルトリエトキシシラン水分散液100μLを添加し、室温で12時間撹拌した。
工程(2):反応混合物を10000Gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程(3):エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を1回ずつ行った。
得られたアミノ基修飾したシリカナノ粒子のFT−IR測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基修飾されたことが確認できた。
下記工程(1)〜(12)の方法により、蛍光物質内包シリカナノ粒子に対して抗体を結合させた。ここでは、ナノ粒子1を用いた例を示すが、ナノ粒子2についても同様である。
工程(1):1mgのナノ粒子1を純水5mLに分散させた。次いで、アミノプロピルトリエトキシシラン水分散液100μLを添加し、室温で12時間撹拌した。
工程(2):反応混合物を10000Gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程(3):エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を1回ずつ行った。
得られたアミノ基修飾したシリカナノ粒子のFT−IR測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基修飾されたことが確認できた。
工程(4):工程(3)で得られたアミノ基修飾したシリカナノ粒子を、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)を2mM含有したPBSを用いて3nMに調整した。
工程(5):工程(4)で調整した溶液に、最終濃度10mMとなるようSM(PEG)12(サーモサイエンティフィック社製、succinimidyl−[(N−maleomidopropionamid)−dodecaethyleneglycol]ester)を混合し、1時間反応させた。
工程(6):反応混合液を10000Gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程(7):EDTAを2mM含有したPBSを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を3回行った。最後に500μLのPBSを用いて再分散させた。
工程(5):工程(4)で調整した溶液に、最終濃度10mMとなるようSM(PEG)12(サーモサイエンティフィック社製、succinimidyl−[(N−maleomidopropionamid)−dodecaethyleneglycol]ester)を混合し、1時間反応させた。
工程(6):反応混合液を10000Gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程(7):EDTAを2mM含有したPBSを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を3回行った。最後に500μLのPBSを用いて再分散させた。
工程(8):抗HER2抗体100μgを100μLのPBSに溶解させたところに、1Mジチオスレイトール(DTT)を添加し、30分反応させた。
工程(9):反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のDTTを除去し、還元化抗HER2抗体溶液を得た。
工程(9):反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のDTTを除去し、還元化抗HER2抗体溶液を得た。
工程(10):ナノ粒子1を出発原料として工程(7)で得られた粒子分散液と工程(9)で得られた還元化抗HER2抗体溶液とをPBS中で混合し、1時間反応させた。
工程(11):10mMメルカプトエタノール4μLを添加し、反応を停止させた。
工程(12):反応混合物を10000Gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、EDTAを2mM含有したPBSを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を3回行った。最後に500μLのPBSを用いて再分散させ、抗HER2抗体が結合された蛍光物質内包シリカナノ粒子を得た。
工程(11):10mMメルカプトエタノール4μLを添加し、反応を停止させた。
工程(12):反応混合物を10000Gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、EDTAを2mM含有したPBSを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を3回行った。最後に500μLのPBSを用いて再分散させ、抗HER2抗体が結合された蛍光物質内包シリカナノ粒子を得た。
ナノ粒子1を出発原料として得られた抗HER2抗体が結合された蛍光物質内包シリカナノ粒子を標識材料A、ナノ粒子2を出発原料として得られた抗HER2抗体が結合された蛍光物質内包シリカナノ粒子を標識材料Bとする。
また、比較例として、Cy5に抗HER2抗体を結合させ、還元化抗HER2抗体溶液(標識材料D)を得た。同様に、CdSeに抗HER2抗体を結合させたものを標識材料Cとして作製した。
〔蛍光物質内包ナノ粒子を用いた組織染色〕
下記工程(1)〜(10)の方法により、作製した抗体結合標識材料A〜Dを用い、予めFISHスコアを測定したヒト***組織の隣接切片を用いて免疫染色を行った。染色切片はコスモバイオ社製の組織アレイスライド(CB−A712)を用いた。FISHスコアで1〜9の24切片を用いた。
下記工程(1)〜(10)の方法により、作製した抗体結合標識材料A〜Dを用い、予めFISHスコアを測定したヒト***組織の隣接切片を用いて免疫染色を行った。染色切片はコスモバイオ社製の組織アレイスライド(CB−A712)を用いた。FISHスコアで1〜9の24切片を用いた。
工程(1):キシレンを入れた容器に病理切片を30分浸漬させた。途中3回キシレンを交換した。
工程(2):エタノールを入れた容器に病理切片を30分浸漬させた。途中3回エタノールを交換した。
工程(3):水を入れた容器に病理切片を30分浸漬させた。途中3回水を交換した。
工程(4):10mMクエン酸緩衝液(pH6.0)に病理切片を30分浸漬させた。
工程(5):121度で10分オートクレーブ処理を行った。
工程(6):PBSを入れた容器に、オートクレーブ処理後の切片を30分浸漬させた。
工程(7):1%BSA含有PBSを組織に載せて、1時間放置した。
工程(8):1%BSA含有PBSで0.05nMに希釈した抗HER2抗体が結合された標識材料A〜Dを、各組織切片に載せて3時間放置した。
工程(9):PBSを入れた容器に、染色後の切片をそれぞれ30分浸漬させた。
工程(10):Merck Chemicals社製Aquatexを滴下後、カバーガラスを載せ封入した。
工程(2):エタノールを入れた容器に病理切片を30分浸漬させた。途中3回エタノールを交換した。
工程(3):水を入れた容器に病理切片を30分浸漬させた。途中3回水を交換した。
工程(4):10mMクエン酸緩衝液(pH6.0)に病理切片を30分浸漬させた。
工程(5):121度で10分オートクレーブ処理を行った。
工程(6):PBSを入れた容器に、オートクレーブ処理後の切片を30分浸漬させた。
工程(7):1%BSA含有PBSを組織に載せて、1時間放置した。
工程(8):1%BSA含有PBSで0.05nMに希釈した抗HER2抗体が結合された標識材料A〜Dを、各組織切片に載せて3時間放置した。
工程(9):PBSを入れた容器に、染色後の切片をそれぞれ30分浸漬させた。
工程(10):Merck Chemicals社製Aquatexを滴下後、カバーガラスを載せ封入した。
〔実験結果〕
各標識材料A〜Dを用いて染色した組織切片について、視野(観察面積)を変えて複数の蛍光画像を取得し、画像解析ソフトにより、各蛍光画像から蛍光輝点の数(輝点数)を計測した。
なお、顕微鏡は、カールツアイス社製正立顕微鏡Axio Imager M2を用い、対物レンズを20倍に設定し、630〜670nmの波長を有する励起光を照射して、組織切片から発せられる蛍光を結像し、顕微鏡設置カメラ(モノクロ)により蛍光画像(画像データ)を取得し、画像解析ソフトにより輝点数を計測した。なお、上記カメラは画素サイズ6.4μm×6.4μm、縦画素数1040個、横画素数1388個(撮像領域8.9mm×6.7mm)を有している。
また、各標識材料A〜Dについて、各視野において、計測された輝点数とFISHスコアとの相関係数Rを算出した。FISHスコアは、HER2遺伝子の過剰発現レベルと対応しており、FISHスコアの値が大きいほど、HER2遺伝子の過剰発現レベルが高いことを示している。
各標識材料A〜Dを用いて染色した組織切片について、視野(観察面積)を変えて複数の蛍光画像を取得し、画像解析ソフトにより、各蛍光画像から蛍光輝点の数(輝点数)を計測した。
なお、顕微鏡は、カールツアイス社製正立顕微鏡Axio Imager M2を用い、対物レンズを20倍に設定し、630〜670nmの波長を有する励起光を照射して、組織切片から発せられる蛍光を結像し、顕微鏡設置カメラ(モノクロ)により蛍光画像(画像データ)を取得し、画像解析ソフトにより輝点数を計測した。なお、上記カメラは画素サイズ6.4μm×6.4μm、縦画素数1040個、横画素数1388個(撮像領域8.9mm×6.7mm)を有している。
また、各標識材料A〜Dについて、各視野において、計測された輝点数とFISHスコアとの相関係数Rを算出した。FISHスコアは、HER2遺伝子の過剰発現レベルと対応しており、FISHスコアの値が大きいほど、HER2遺伝子の過剰発現レベルが高いことを示している。
図5は、標識材料A(Cy5内包標識材料)を用いた場合の、複数の異なる視野(0.3mm2、3mm2、32mm2、324mm2)の蛍光画像から計測された輝点数と、FISHスコアとの関係を示す図である。図中に示すR2の値は、輝点数とFISHスコアとの相関係数の2乗値である。
図6は、標識材料B(CdSe内包標識材料)を用いた場合の、複数の異なる視野(0.3mm2、3mm2、32mm2、324mm2)の蛍光画像から計測された輝点数と、FISHスコアとの関係を示す図である。
図7は、標識材料C(CdSe)を用いた場合の、複数の異なる視野(0.3mm2、3mm2、32mm2、324mm2)の蛍光画像から計測された輝点数と、FISHスコアとの関係を示す図である。
図8は、標識材料D(Cy5)を用いた場合の、複数の異なる視野(0.3mm2、3mm2、32mm2、324mm2)の蛍光画像から計測された輝点数と、FISHスコアとの関係を示す図である。
表1及び図9に、各標識材料A〜Dについて、各視野(観察面積)の蛍光画像から計測された輝点数とFISHスコアとの相関係数の2乗値(R2)を示す。
標識材料Aを用いて組織切片を染色し、0.3mm2の視野の蛍光画像から輝点数を計測した場合には、輝点数とFISHスコアとの相関係数の2乗値(R2)は0.1241であり、輝点数とFISHスコアには、相関が見られなかった。0.3mm2の視野では、視野が狭すぎ、ばらつきが大きいためであると考えられる。
標識材料Aを用いて組織切片を染色し、3mm2の視野の蛍光画像から輝点数を計測した場合には、輝点数とFISHスコアとの相関係数の2乗値(R2)は0.5387であった。この値は、相関係数Rに換算すると約0.734となり、輝点数とFISHスコアには、強い相関があるといえる。
標識材料Aを用いて組織切片を染色し、32mm2の視野の蛍光画像から輝点数を計測した場合には、輝点数とFISHスコアとの相関係数の2乗値(R2)は0.9011であった。視野が32mm2の場合には、視野が3mm2の場合と比較して、さらに相関が強いといえる。
標識材料Aを用いて組織切片を染色し、324mm2の視野の蛍光画像から輝点数を計測した場合には、輝点数とFISHスコアとの相関係数の2乗値(R2)は0.9887であった。視野が324mm2の場合には、視野が32mm2の場合と比較して、さらに相関が強いといえる。
標識材料Bを用いた場合も同様に、3mm2以上の視野では、輝点数とFISHスコアには相関があり、視野が広いほど相関係数が大きくなることがわかった。
また、標識材料A,Bを用いた場合の結果から、324mm2の視野では輝点数とFISHスコアとの相関係数の2乗値(R2)が十分1に近いことがわかった。
一方、標識材料C又は標識材料Dを用いて組織切片を染色した場合には、輝点数とFISHスコアには、相関が見られなかった。
また、観察対象となる組織切片の厚さ(通常は数μm)の上方、或いは下方部に顕微鏡のピントを若干ずらした場合であっても、上記の状況に大きな差異は見られなかった。
以上の結果から、標識材料A,Bを用いて広視野で組織切片を観察した場合に、輝点数とFISHスコアとの相関が良好であり、輝点数に基づいてHER2の発現レベルを評価することが可能であることがわかった。すなわち、FISH法のような手間のかかる方法を用いなくても、特定の生体物質を認識する生体物質認識部位が結合した蛍光物質内包ナノ粒子の染色試薬で組織切片を染色し、これを顕微鏡で拡大結像して撮影することにより得られた3mm2以上の視野の画像から輝点数を計測することにより、特定の生体物質の発現レベルを評価することができ、FISH法に代わる方法として有効である。
標識材料A,Bは、蛍光物質を内包した粒子を用いており、蛍光物質単体を用いた標識材料C,Dと比較して高輝度であるため、画像から輝点の1点1点を捉えやすく、輝点数を精度良く計測することができる。
<病理診断支援システム100の動作>
以下、病理診断支援システム100において、上記説明した蛍光画像及び明視野画像を取得して解析を行う動作について説明する。ここでは、特定のタンパク質(例えば、乳癌組織におけるHER2タンパク。以下、特定タンパクと呼ぶ。)を認識する生体物質認識部位が結合した蛍光物質内包ナノ粒子を含む染色試薬を用いて染色された組織切片を観察対象とする場合例にとり説明するが、これに限定されるものではない。
以下、病理診断支援システム100において、上記説明した蛍光画像及び明視野画像を取得して解析を行う動作について説明する。ここでは、特定のタンパク質(例えば、乳癌組織におけるHER2タンパク。以下、特定タンパクと呼ぶ。)を認識する生体物質認識部位が結合した蛍光物質内包ナノ粒子を含む染色試薬を用いて染色された組織切片を観察対象とする場合例にとり説明するが、これに限定されるものではない。
まず、顕微鏡画像取得装置1Aにおいて、(a1)〜(a5)の手順により明視野画像及び蛍光画像が取得される。
(a1)操作者は、特定タンパクを認識する生体物質認識部位が結合した蛍光物質内包ナノ粒子を蛍光標識材料とした染色試薬、及びHE試薬により染色された組織切片を載置したスライドを顕微鏡画像取得装置1Aのスライド固定ステージに載置する。
(a2)明視野ユニットに設定し、撮影倍率、ピントの調整を行い、組織上の観察対象の領域を視野に納める。
(a3)撮像手段で撮影を行って明視野画像の画像データを生成し、画像処理装置2Aに画像データを送信する。
(a4)ユニットを蛍光ユニットに変更する。
(a5)視野及び撮影倍率を変えずに撮像手段で撮影を行って蛍光画像の画像データを生成し、画像処理装置2Aに画像データを送信する。
このように、顕微鏡画像取得装置1Aにおいては、同一の組織切片のスライドから同一の撮影倍率で同一範囲(同一視野)の明視野画像及び蛍光画像を取得するので、明視野画像と蛍光画像の同一座標位置は組織切片の同一位置を示していることになり、両画像の位置合わせは不要である。
(a1)操作者は、特定タンパクを認識する生体物質認識部位が結合した蛍光物質内包ナノ粒子を蛍光標識材料とした染色試薬、及びHE試薬により染色された組織切片を載置したスライドを顕微鏡画像取得装置1Aのスライド固定ステージに載置する。
(a2)明視野ユニットに設定し、撮影倍率、ピントの調整を行い、組織上の観察対象の領域を視野に納める。
(a3)撮像手段で撮影を行って明視野画像の画像データを生成し、画像処理装置2Aに画像データを送信する。
(a4)ユニットを蛍光ユニットに変更する。
(a5)視野及び撮影倍率を変えずに撮像手段で撮影を行って蛍光画像の画像データを生成し、画像処理装置2Aに画像データを送信する。
このように、顕微鏡画像取得装置1Aにおいては、同一の組織切片のスライドから同一の撮影倍率で同一範囲(同一視野)の明視野画像及び蛍光画像を取得するので、明視野画像と蛍光画像の同一座標位置は組織切片の同一位置を示していることになり、両画像の位置合わせは不要である。
なお、本願発明者等の検討によれば、HE染色と蛍光物質内包ナノ粒子による染色を同時に行う場合、組織の自家蛍光とエオジンの発光(バックグラウンド)に対し、10%(1.1倍)以上の発光量差を蛍光物質内包ナノ粒子の蛍光輝点が有していれば、8ビット(0〜255階調)、12ビット(0〜4095階調)の何れの処理系においても、顕微鏡画像から蛍光輝点の自動検出処理が可能であった。蛍光物質内包ナノ粒子による染色のみの場合においては、組織の自家蛍光に対し、10%(1.1倍)以上の発光量差を蛍光物質内包ナノ粒子が有していれば、8ビット(0〜255階調)、12ビット(0〜4095階調)の何れの処理系においても蛍光輝点の自動検出処理が可能であった。そのため、蛍光ユニットにおける励起光波長としては560〜630nmの範囲のものを選択し、前記蛍光物質としては当該励起光により580〜690nmの範囲、より好ましくは600〜630nmの範囲にピークを有する蛍光を発するものを用いることが好ましい。この範囲にピークを有する蛍光物質であれば、上記範囲の励起光を選択したときに、エオジンの発光を含む組織の自家蛍光と蛍光物質内包ナノ粒子からの蛍光の発光差を確保して両者を区別して認識可能とする(両者の光量差10%(1.1倍)以上)を確保できるからである。
なお、HE染色を同時に行わない場合においては、組織の自家蛍光が微弱なため励起光の波長の範囲は、一般的な200nm〜700nmの範囲で特に限定せずとも自家蛍光と蛍光物質内包ナノ粒子からの蛍光の発光差を確保して両者を区別して認識可能とする(両者の光量差10%(1.1倍)以上)を確保することができる。
なお、HE染色を同時に行わない場合においては、組織の自家蛍光が微弱なため励起光の波長の範囲は、一般的な200nm〜700nmの範囲で特に限定せずとも自家蛍光と蛍光物質内包ナノ粒子からの蛍光の発光差を確保して両者を区別して認識可能とする(両者の光量差10%(1.1倍)以上)を確保することができる。
画像処理装置2Aにおいては、明視野画像及び蛍光画像に基づき画像解析処理Aが実行される。
図10に、画像処理装置2Aにおける画像解析処理Aのフローチャートを示す。図10に示す画像解析処理は、制御部21と記憶部25に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
図10に、画像処理装置2Aにおける画像解析処理Aのフローチャートを示す。図10に示す画像解析処理は、制御部21と記憶部25に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
通信I/F24を介して顕微鏡画像取得装置1Aからの明視野画像が入力されると(ステップS1)、明視野画像から解析対象のROIの指定が行われる(ステップS2)。
ステップS2においては、まず、表示部23に組織切片を撮影した明視野画像が表示され、表示された明視野画像から操作部22により領域が指定されると、指定された領域が解析対象としてのROI(関心領域)として設定される。
ステップS2においては、まず、表示部23に組織切片を撮影した明視野画像が表示され、表示された明視野画像から操作部22により領域が指定されると、指定された領域が解析対象としてのROI(関心領域)として設定される。
図11に、ステップS2におけるROIの指定の一例を示す。ここで、明視野画像、特にHE染色画像は医師が従来から病理診断に用いている画像であり、例えば、図11に示すように、明視野画像において細胞核がたくさん集まっている領域、細胞核の大小が不揃いな領域、細胞核が正常と比べて大きい領域等の、癌の疑いのある領域と判断した領域を解析対象のROIに指定することができる。
ROIとしては、画像全体を指定することもできるし、任意の領域を指定することもできる。任意領域としては、癌領域や周囲へ癌が拡大している浸潤部等、ユーザである医師が特定タンパクの発現量を定量的に知りたい領域を指定することができる。任意領域の指定方法としては、矩形や円形等の幾何学領域で指定することとしてもよいし、ユーザがマウス等で自由曲線を描いて指定することとしてもよい。
ROIとしては、画像全体を指定することもできるし、任意の領域を指定することもできる。任意領域としては、癌領域や周囲へ癌が拡大している浸潤部等、ユーザである医師が特定タンパクの発現量を定量的に知りたい領域を指定することができる。任意領域の指定方法としては、矩形や円形等の幾何学領域で指定することとしてもよいし、ユーザがマウス等で自由曲線を描いて指定することとしてもよい。
次いで、明視野画像から細胞核の領域の抽出が行われる(ステップS3)。
図12に、ステップS3における処理の詳細フローを示す。ステップS3の処理は、制御部21と記憶部25に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
図12に、ステップS3における処理の詳細フローを示す。ステップS3の処理は、制御部21と記憶部25に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
ステップS3においては、まず、明視野画像のモノクロ画像への変換が行われる(ステップS301)。
次いで、モノクロ画像に対し予め定められた閾値を用いて閾値処理が施され、各画素が2値化される(ステップS302)。図13に、閾値処理後の二値画像の一例を示す。
次いで、モノクロ画像に対し予め定められた閾値を用いて閾値処理が施され、各画素が2値化される(ステップS302)。図13に、閾値処理後の二値画像の一例を示す。
次いで、ノイズ除去が行われる(ステップS303)。ノイズ除去は、具体的には、二値画像にクロージング処理が施されることにより行うことができる。クロージング処理は、膨張処理を行ってから同じ回数分だけ収縮処理を行う処理である。膨張処理は、注目画素からn×n画素(nは2以上の整数)の範囲内にある画素に1つでも白が含まれている場合に注目画素を白に置き換える処理である。収縮処理は、注目画素からn×n画素の範囲内にある画素に1つでも黒が含まれている場合に注目画素を黒に置き換える処理である。クロージング処理により、ノイズ等の小さい領域を除去することができる。図14に、ノイズ除去後の画像の一例を示す。図14に示すように、ノイズ除去後には、細胞核が抽出された画像(細胞核画像)が得られる。
次いで、ノイズ除去後の画像にラベリング処理が施され、抽出された細胞核のそれぞれにラベルLabel_nucleusが付与される(ステップS304)。ラベリング処理とは、連結している画素に同じラベル(番号)を付与していくことで画像内のオブジェクトを識別する処理である。ラベリング処理により、ノイズ除去後の画像から各細胞核を識別してラベルを付与することができる。
なお、後述する蛍光輝点の抽出におけるラベルの番号と区別するため、コンピュータの保持できる最大値をMAXとし、現在までに行ったラベリング回数をLabel_tempとすると、新たな細胞核にはラベルLabel_nucleusとして、MAX−Label_tempが付与される。例えば、101個目の細胞核にラベルを付与する場合、Label_temp=100であるので、MAX=65536とすると、Label_nucleusとして65436が付与される。ラベリング処理後、処理は図10のステップS6に移行する。
なお、後述する蛍光輝点の抽出におけるラベルの番号と区別するため、コンピュータの保持できる最大値をMAXとし、現在までに行ったラベリング回数をLabel_tempとすると、新たな細胞核にはラベルLabel_nucleusとして、MAX−Label_tempが付与される。例えば、101個目の細胞核にラベルを付与する場合、Label_temp=100であるので、MAX=65536とすると、Label_nucleusとして65436が付与される。ラベリング処理後、処理は図10のステップS6に移行する。
一方、図10のステップS4において、通信I/F24を介して顕微鏡画像取得装置1Aからの蛍光画像が入力されると(ステップS4)、蛍光画像から蛍光輝点の抽出が行われる(ステップS5)。図15に、ステップS5における処理の詳細フローを示す。ステップS5の処理は、制御部21と記憶部25に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
まず、蛍光画像からR成分の抽出が行われる(ステップS401)。
次いで、R成分が抽出された画像にTophat変換が施される(ステップS402)。Tophat変換は、入力画像の各画素の値から、入力画像に最小値フィルター及び最大値フィルターをこの順でかけた画像の、対応する画素の値を減算する処理である。最小値フィルターは、注目画素の近傍の画素(例えば、3×3画素)のうちの最小値で注目画素の値を置き換えるものである。最大値フィルターは、注目画素の近傍の画素(例えば、3×3画素)のうちの最大値で注目画素の値を置き換えるものである。Tophat変換により、濃淡プロファイル上の小突起(近傍の画素に比べて輝度の高い領域)を抽出することができる。これにより、蛍光輝点候補画像を得ることができる。図16に、蛍光輝点候補画像の一例を示す。
次いで、R成分が抽出された画像にTophat変換が施される(ステップS402)。Tophat変換は、入力画像の各画素の値から、入力画像に最小値フィルター及び最大値フィルターをこの順でかけた画像の、対応する画素の値を減算する処理である。最小値フィルターは、注目画素の近傍の画素(例えば、3×3画素)のうちの最小値で注目画素の値を置き換えるものである。最大値フィルターは、注目画素の近傍の画素(例えば、3×3画素)のうちの最大値で注目画素の値を置き換えるものである。Tophat変換により、濃淡プロファイル上の小突起(近傍の画素に比べて輝度の高い領域)を抽出することができる。これにより、蛍光輝点候補画像を得ることができる。図16に、蛍光輝点候補画像の一例を示す。
次いで、蛍光輝点候補画像からノイズ除去が行われることにより、蛍光輝点が抽出された画像(蛍光輝点画像)が得られる(ステップS403)。図17に、図16に示す蛍光輝点候補画像におけるノイズ除去後に得られる蛍光輝点が抽出された蛍光輝点画像を示す。
そして、ノイズ除去後の画像にラベリング処理が施され、抽出された蛍光輝点のそれぞれにラベルLabel_pointが付与される(ステップS404)。Label_pointは、1から順に付与される。ラベリング処理の終了後、処理は図10のステップS6に移行する。
図10のステップS6においては、抽出された細胞核の領域と蛍光輝点に基づいて、ROIにおける特定タンパクの発現量を示す特徴量が算出される(ステップS6)。
図18に、ステップS6における処理の詳細フローを示す。ステップS6の処理は、制御部21と記憶部25に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
まず、細胞核画像の各画素と蛍光輝点画像の対応する画素の値が加算され、合成画像が作成される(ステップS601)。次いで、ステップS2で指定されたROI内に付与されているLabel_pointの数Hがカウントされる(ステップS602)。次いで、ステップS2で指定されたROI内に付与されているLabel_nucleusの数Cがカウントされ(ステップS603)、H/Cが算出される(ステップS604)。H/Cは、ROI内の細胞核1個当たりの蛍光輝点数である。
まず、細胞核画像の各画素と蛍光輝点画像の対応する画素の値が加算され、合成画像が作成される(ステップS601)。次いで、ステップS2で指定されたROI内に付与されているLabel_pointの数Hがカウントされる(ステップS602)。次いで、ステップS2で指定されたROI内に付与されているLabel_nucleusの数Cがカウントされ(ステップS603)、H/Cが算出される(ステップS604)。H/Cは、ROI内の細胞核1個当たりの蛍光輝点数である。
また、ROI内の面積Area_ROIが算出され(ステップS605)、更に、H/Area_ROIが算出されると(ステップS606)、処理は図10のステップS7に移行する。面積Area_ROIは、ROI内の画素数に基づいて算出される。
図10のステップS7においては、算出された特徴量が表示部23に表示出力される(ステップS7)。
図19に、ステップS7において表示部23に表示される解析結果画面231の一例を示す図である。図19に示すように、解析結果画面231には、特徴量の算出に使用された明視野画像231aと、蛍光画像231bと、これらの画像から抽出された細胞核画像と蛍光輝点画像が加算されることにより作成された合成画像231cと、解析により得られた特徴量231dと、印刷ボタン231eと、送信ボタン231fと、が表示される。合成画像231cには、図19に示すように、ステップS2で指定されたROIの領域を示すアノテーション(枠線)Aが重畳表示される。
図19に、ステップS7において表示部23に表示される解析結果画面231の一例を示す図である。図19に示すように、解析結果画面231には、特徴量の算出に使用された明視野画像231aと、蛍光画像231bと、これらの画像から抽出された細胞核画像と蛍光輝点画像が加算されることにより作成された合成画像231cと、解析により得られた特徴量231dと、印刷ボタン231eと、送信ボタン231fと、が表示される。合成画像231cには、図19に示すように、ステップS2で指定されたROIの領域を示すアノテーション(枠線)Aが重畳表示される。
特徴量231dとしては、ROI内の蛍光輝点の数(Label_pointの数H)、ROI内の細胞核の個数(Label_nucleusの数C)、ROI内の細胞核1個当たりの蛍光輝点数(H/C)、ROI内の蛍光輝点密度(H/Area_ROI)が表示される。蛍光輝点は、組織切片の染色試薬に用いた生体物質認識部位に対応する特定タンパクの発現を示すものである。よって、これらの特徴量231dを参照することにより、医師はROI内の特定タンパクの発現量を定量的に把握することが可能となる。
ここで、HER2タンパクは、細胞膜の周囲に存在し、シグナル伝達経路を介して細胞の増殖や悪性化に関与されるといわれる。癌になると、細胞膜の周囲にHER2タンパクの過剰発現がみられる。即ち、癌化した細胞の細胞膜には、HER2タンパクの過剰発現が見られる。よって、ROI内のHER2タンパクの発現を示す蛍光輝点の数、特に、細胞核1個当たりの蛍光輝点の数は、ROI内における細胞1個あたりの細胞膜周囲に発現しているHER2タンパクの量を示すものであり、ROI内の細胞の癌の悪性度を定量的に示す特徴量といえる。また、ROI内の蛍光輝点密度は、ROIとして指定された領域の大きさに依存しないHER2タンパクの発現量を表すものであり、ROI内の癌の悪性度を定量的に示す特徴量といえる。よって、これらの特徴量を表示することで、医師に予後の予測や治療戦略のための定量的な情報を提供することが可能となる。
ここで、HER2タンパクは、細胞膜の周囲に存在し、シグナル伝達経路を介して細胞の増殖や悪性化に関与されるといわれる。癌になると、細胞膜の周囲にHER2タンパクの過剰発現がみられる。即ち、癌化した細胞の細胞膜には、HER2タンパクの過剰発現が見られる。よって、ROI内のHER2タンパクの発現を示す蛍光輝点の数、特に、細胞核1個当たりの蛍光輝点の数は、ROI内における細胞1個あたりの細胞膜周囲に発現しているHER2タンパクの量を示すものであり、ROI内の細胞の癌の悪性度を定量的に示す特徴量といえる。また、ROI内の蛍光輝点密度は、ROIとして指定された領域の大きさに依存しないHER2タンパクの発現量を表すものであり、ROI内の癌の悪性度を定量的に示す特徴量といえる。よって、これらの特徴量を表示することで、医師に予後の予測や治療戦略のための定量的な情報を提供することが可能となる。
また、解析結果画面231には、特徴量231dとともに、ROIと、細胞核画像と蛍光輝点画像が加算された合成画像が表示されるので、医師は、ROI内における細胞核の大きさや分布及び特定タンパクの発現を画像で確認することが可能となる。更に、医師が従来から診断に使用している明視野画像や、特定タンパクの蛍光輝点のみを抽出した蛍光画像を併せて表示することで、ROI内の細胞の状態や特定タンパク質の発現状況の把握を支援することができる。
なお、解析結果画面231に表示する明視野画像231a、蛍光画像231b、合成画像231Cは、観察しやすいように何れか又は全てを拡大縮小して表示することとしてもよい。
なお、解析結果画面231に表示する明視野画像231a、蛍光画像231b、合成画像231Cは、観察しやすいように何れか又は全てを拡大縮小して表示することとしてもよい。
解析結果は、印刷ボタン231eや送信ボタン231fを押下することでプリント出力又は外部機器への出力が可能となる。
操作部22により印刷ボタン231eが押下されると、制御部21により解析結果のデータが通信I/F24やLAN等の通信ネットワークを介して図示しないプリンタに送信され、解析結果が印刷出力される。また、操作部22により送信ボタン231fが押下されると、制御部21により解析結果のデータが通信I/F24やLAN等の通信ネットワークを介して外部機器(例えば、PACS(Picture Archiving and Communication System for medical application))に送信される。
出力する解析結果は、特徴量のみであってもよいし、解析結果画面231の表示のように、明視野画像、蛍光画像、合成画像の何れか又は全てを含むものであってもよい。
操作部22により印刷ボタン231eが押下されると、制御部21により解析結果のデータが通信I/F24やLAN等の通信ネットワークを介して図示しないプリンタに送信され、解析結果が印刷出力される。また、操作部22により送信ボタン231fが押下されると、制御部21により解析結果のデータが通信I/F24やLAN等の通信ネットワークを介して外部機器(例えば、PACS(Picture Archiving and Communication System for medical application))に送信される。
出力する解析結果は、特徴量のみであってもよいし、解析結果画面231の表示のように、明視野画像、蛍光画像、合成画像の何れか又は全てを含むものであってもよい。
−第2の実施の形態−
次に、本発明の第2の実施の形態について説明する。
第1の実施の形態においては、明視野画像と蛍光画像を用いて解析処理を行ったが、第2の実施の形態においては、特定タンパクを認識する生体物質認識部位が結合された蛍光物質内包ナノ粒子を含む染色試薬による染色と、HE染色の双方が施された組織切片の蛍光画像のみを用いて解析処理を行う場合について説明する。
次に、本発明の第2の実施の形態について説明する。
第1の実施の形態においては、明視野画像と蛍光画像を用いて解析処理を行ったが、第2の実施の形態においては、特定タンパクを認識する生体物質認識部位が結合された蛍光物質内包ナノ粒子を含む染色試薬による染色と、HE染色の双方が施された組織切片の蛍光画像のみを用いて解析処理を行う場合について説明する。
第2の実施の形態における病理診断支援システム100の構成は、第1の実施の形態において説明したものと同様であるので説明を援用し、以下、異なる部分について説明する。
顕微鏡画像取得装置1Aにおいては、以下の(b1)〜(b3)の手順で蛍光画像が取得される。
(b1)操作者は、特定タンパクを認識する生体物質認識部位が結合した蛍光物質内包ナノ粒子を蛍光標識材料とした染色試薬、及びHE試薬により染色された組織切片を載置したスライドを顕微鏡画像取得装置1Aのスライド固定ステージに載置する。
(b2)蛍光ユニットに設定し、撮影倍率、ピントの調整を行い、組織上の観察対象の領域を視野に納める。
(a3)撮像手段で撮影を行って蛍光画像の画像データを生成し、画像処理装置2Aに画像データを送信する。
(b1)操作者は、特定タンパクを認識する生体物質認識部位が結合した蛍光物質内包ナノ粒子を蛍光標識材料とした染色試薬、及びHE試薬により染色された組織切片を載置したスライドを顕微鏡画像取得装置1Aのスライド固定ステージに載置する。
(b2)蛍光ユニットに設定し、撮影倍率、ピントの調整を行い、組織上の観察対象の領域を視野に納める。
(a3)撮像手段で撮影を行って蛍光画像の画像データを生成し、画像処理装置2Aに画像データを送信する。
上述のように所定の蛍光標識材料による染色とともに組織切片にHE染色を行った場合は、蛍光ユニットで励起光を照射した際に、特定タンパクが蛍光輝点として現れるほか、組織等が自家蛍光を発するとともに細胞質等を染色したエオジンが発光する。ここで、細胞質はエオジンにより染色されるため発光するが、細胞核はエオジンにより染色されないため発光せず、蛍光画像においては細胞核が周囲の細胞質より黒く表される(図21参照)。よって、蛍光標識材料による染色とともに組織切片にHE染色を行った組織切片を蛍光ユニットで撮影することにより得られた蛍光画像では、蛍光輝点のみならず、組織切片の細胞核を含む細胞の形態も表れている。
そこで、画像処理装置2Aにおいては、上記(b1)〜(b3)により取得された蛍光画像のみを用いて細胞核の領域及び蛍光輝点を抽出し、これらの情報に基づいて特定タンパクの発現量を示す特徴量を算出する画像解析処理Bを実行する。
図20に、画像処理装置2Aにおいて実行される画像解析処理Bのフローチャートを示す。図20に示す画像解析処理Bは、制御部21と記憶部25に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
顕微鏡画像取得装置1Aから蛍光画像が入力されると(ステップS11)、まず、細胞核を抽出するためのステップS12〜ステップS13の処理と、蛍光輝点を抽出するためのステップS14の処理が実行される。
ステップS12においては、蛍光画像から解析対象のROIの指定が行われる(ステップS12)。
ここでは、蛍光画像に最小値フィルター処理が施され、最小値フィルター処理後の蛍光画像が表示部23に表示され、表示された蛍光画像から操作部22により領域が指定されると、指定された領域がROI(関心領域)として設定される。
図21に、最小値フィルター処理前後の蛍光画像の一例を示す。図21に示すように、最小値フィルター処理を施すことにより、蛍光画像から蛍光輝点を除去することができるので、医師が細胞核の形態を観察しやすくなり、ROIの設定が容易となる。
ここでは、蛍光画像に最小値フィルター処理が施され、最小値フィルター処理後の蛍光画像が表示部23に表示され、表示された蛍光画像から操作部22により領域が指定されると、指定された領域がROI(関心領域)として設定される。
図21に、最小値フィルター処理前後の蛍光画像の一例を示す。図21に示すように、最小値フィルター処理を施すことにより、蛍光画像から蛍光輝点を除去することができるので、医師が細胞核の形態を観察しやすくなり、ROIの設定が容易となる。
次いで、蛍光画像から細胞核の領域の抽出が行われる(ステップS13)。
図22に、ステップS13における処理の詳細フローを示す。ステップS13の処理は、制御部21と記憶部25に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
図22に、ステップS13における処理の詳細フローを示す。ステップS13の処理は、制御部21と記憶部25に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
ステップS13においては、まず、蛍光画像のモノクロ画像への変換が行われる(ステップS701)。
次いで、モノクロ画像に対しコントラスト補正が行われる(ステップS702)。
蛍光画像においては、図24Aに示すように、細胞核とその周辺の組織とのコントラストが小さい。そこで、ステップS702においては、特に高濃度の領域でのコントラストを強調するため、ガンマ変換により高濃度領域でのコントラストを上げる処理を行う。
ガンマ変換は、各画素の値を[数1]の式により変換するものである。[数1]中の*は乗算記号である。なお、γは、γカーブの度合いを示すパラメータで、図23に示すようにγ>1とするとγカーブは上に凸、γ<1では下に凸となる。例えば、画素値が小さい方から大きいほうへ移行するにつれて濃度が高くなる場合はγ<1としてガンマ変換を行い、その逆であればγ>1としてγ変換を行う。図24Bにガンマ変換後のモノクロ画像を示す。矢印で示す部分を図24Aと比較すると、コントラストがあがって細胞核の形態が明確となっていることがわかる。
蛍光画像においては、図24Aに示すように、細胞核とその周辺の組織とのコントラストが小さい。そこで、ステップS702においては、特に高濃度の領域でのコントラストを強調するため、ガンマ変換により高濃度領域でのコントラストを上げる処理を行う。
ガンマ変換は、各画素の値を[数1]の式により変換するものである。[数1]中の*は乗算記号である。なお、γは、γカーブの度合いを示すパラメータで、図23に示すようにγ>1とするとγカーブは上に凸、γ<1では下に凸となる。例えば、画素値が小さい方から大きいほうへ移行するにつれて濃度が高くなる場合はγ<1としてガンマ変換を行い、その逆であればγ>1としてγ変換を行う。図24Bにガンマ変換後のモノクロ画像を示す。矢印で示す部分を図24Aと比較すると、コントラストがあがって細胞核の形態が明確となっていることがわかる。
次いで、コントラスト補正後のモノクロ画像に対し、予め定められた閾値を用いて閾値処理が施されて各画素が2値化され(ステップS703)、更に、ノイズ処理(ステップS704)、ラベリング処理が行われ(ステップS705)、図14に示すような細胞核が抽出された画像(細胞核画像)が取得される。ステップS703、S704、S705における処理は、それぞれ図12のステップS302、S303、S304と同様であるので説明を援用する。
ラベリング処理後、処理は図20のステップS15に移行する。
ラベリング処理後、処理は図20のステップS15に移行する。
一方、ステップS14においては、蛍光画像から蛍光輝点の抽出が行われる(ステップS14)。このステップS14の処理は第1の実施の形態において図15を用いて説明したものと同様であるので説明を援用する。蛍光輝点の抽出後、処理は図20のステップS15に移行する。
図20のステップS15においては、抽出された細胞核の領域の情報と蛍光輝点の情報に基づいて解析処理が行われ、ROIにおける特定タンパクの発現量を示す特徴量が算出される(ステップS15)。このステップS15の処理は第1の実施の形態で図18を用いて説明したものと同様であるので説明を援用する。
次いで、算出された特徴量が表示部23に表示される(ステップS16)。ステップS16においては、図19に示した解析結果画面231と同様に、解析元の蛍光画像、蛍光画像を解析することにより得られた特徴量が表示された解析結果画面が表示される。解析元の蛍光画像には、指定されたROIの領域を示す枠線が表示される。また、解析結果画面には印刷ボタンや送信ボタンが設けられ、解析結果を印刷出力したり外部機器に出力したりすることが可能である。
このように、所定の蛍光標識材料による染色とともに組織切片にHE染色を行った場合は、蛍光画像のみを用いても、ROI内の特定タンパクの発現量を示す特徴量を算出することができる。この蛍光画像では、1枚の画像に細胞核を含む細胞の形態及び特定の生態物質の発現を示す蛍光輝点の双方を含むので、特徴量とともに表示することで、従来のように、明視野画像と蛍光画像の二つの画像を比較したり、二つの画像の位置合わせを行ったりすることなしに、医師は組織における細胞の形態、特定タンパクの発現状況、及びその特徴量を一度に把握することが可能となる。
以上説明したように、画像処理装置2Aによれば、制御部21は、組織切片における細胞の形態を表す細胞形態画像(明視野画像又は蛍光画像)から操作部22により解析対象のROIが指定されると、明視野画像又は蛍光画像から細胞核の領域を抽出するとともに、蛍光画像から特定タンパク質の発現を示す蛍光輝点を抽出する。そして、操作部22により指定されたROIに存在する細胞核の領域及び蛍光輝点に基づいて、指定されたROIにおける特定タンパクの発現量を示す特徴量を算出し出力する。
従って、ROIにおける細胞核及び蛍光輝点に基づいて算出された特定タンパクの発現を示す特徴量を医師に提供することができるので、医師は所望の領域の特定タンパクの発現量を定量的に把握することが可能となり、予後の予測や治療戦略が容易となる。
ここで、上述のように、癌化した細胞の細胞膜には、特定タンパク、例えばHER2タンパクの過剰発現が見られるので、ROIにおける細胞核1個当たりの特定タンパクの発現量を示す、ROI内の細胞1個当たりの蛍光輝点の数は、ROI内の細胞の癌の悪性度を定量的に示す特徴量といえる。よって、ROI内の細胞1個当たりの蛍光輝点の数を特徴量として出力することで、医師に予後の予測や治療戦略のための定量的な情報を提供することが可能となる。
また、特徴量を出力する際に、ROIの位置を示すアノテーションが重畳された細胞形態画像と蛍光画像の合成画像を併せて出力することで、ROI内の細胞の分布や大きさ等の状態や特定タンパク質の発現状況の把握が容易となる。
また、第2の実施の形態における画像処理装置2Aによれば、組織切片の細胞の形態を表すとともに組織切片における特定のタンパク質の発現を蛍光輝点で表す一枚の蛍光画像を用いてROIにおける特定タンパクの発現量を示す特徴量を算出し出力するので、複数画像の合成や位置合わせの処理を行うことなく、正確に特徴量を算出することができる。また、この蛍光画像を表示部23に表示することで、医師は、細胞核とタンパクの発現の双方を一枚の画像から容易に把握することが可能となる。
なお、上記実施の形態における記述内容は、本発明の好適な一例であり、これに限定されるものではない。
例えば、上記第1の実施及び第2の実施の形態においては、特定タンパクの例として乳癌におけるHER2タンパクを挙げたが、これに限定されない。診断対象となる病変(がん)種に応じて、蛍光画像を取得する際の生体物質認識部位を異なるものとすれば、病変種に応じた特定タンパクの発現量を定量的に示す特徴量を医師に提供することが可能となる。
また、上記の説明では、本発明に係るプログラムのコンピュータ読み取り可能な媒体としてHDDや半導体の不揮発性メモリ等を使用した例を開示したが、この例に限定されない。その他のコンピュータ読み取り可能な媒体として、CD-ROM等の可搬型記録媒
体を適用することが可能である。また、本発明に係るプログラムのデータを通信回線を介して提供する媒体として、キャリアウエーブ(搬送波)も適用される。
体を適用することが可能である。また、本発明に係るプログラムのデータを通信回線を介して提供する媒体として、キャリアウエーブ(搬送波)も適用される。
その他、病理診断支援システム100を構成する各装置の細部構成及び細部動作に関しても、発明の趣旨を逸脱することのない範囲で適宜変更可能である。
なお、明細書、請求の範囲、図面及び要約を含む2012年3月30日に出願された日本特許出願No.2012−078717号の全ての開示は、そのまま本出願の一部に組み込まれる。
医療の分野において、組織切片の顕微鏡画像を処理する医用画像処理装置として利用可能性がある。
100 病理診断支援システム
1A 顕微鏡画像取得装置
2A 画像処理装置
21 制御部
22 操作部
23 表示部
24 通信I/F
25 記憶部
26 バス
3A ケーブル
1A 顕微鏡画像取得装置
2A 画像処理装置
21 制御部
22 操作部
23 表示部
24 通信I/F
25 記憶部
26 バス
3A ケーブル
Claims (6)
- 組織切片における細胞の形態を表す細胞形態画像及び前記組織切片における特定のタンパク質の発現を蛍光輝点で表す蛍光画像を入力する入力手段と、
前記細胞形態画像から解析対象領域を指定するための操作手段と、
前記細胞形態画像から細胞核の領域を抽出する細胞核抽出手段と、
前記蛍光画像から前記特定のタンパク質の発現を示す蛍光輝点を抽出する蛍光輝点抽出手段と、
前記操作手段により指定された解析対象領域に存在する前記抽出された細胞核の領域及び蛍光輝点に基づいて、前記指定された解析対象領域における前記特定のタンパク質の発現量を示す特徴量を算出する特徴量算出手段と、
前記算出された特徴量を出力する出力手段と、
を備える医用画像処理装置。 - 前記特徴量算出手段は、前記操作手段により指定された解析対象領域における蛍光輝点の数、及び細胞核の個数の情報を取得し、取得した細胞核及び蛍光輝点の個数に基づいて、前記指定された解析対象領域における前記特定のタンパク質の発現量を示す特徴量を算出する請求項1に記載の医用画像処理装置。
- 前記特徴量算出手段は、前記指定された解析対象領域における細胞核1個あたりの蛍光輝点の数を前記特定のタンパク質の発現量を示す特徴量として算出する請求項2に記載の医用画像処理装置。
- 前記細胞形態画像と前記蛍光画像の合成画像を生成する合成画像生成手段を備え、
前記出力手段は、前記操作手段により指定された解析対象領域の位置を示すアノテーションが重畳された前記合成画像を前記特徴量とともに出力する請求項1〜3の何れか一項に記載の医用画像処理装置。 - 前記細胞形態画像及び前記蛍光画像は、前記組織切片の細胞の形態を表すとともに前記組織切片における特定のタンパク質の発現を蛍光輝点で表す一枚の画像からなる請求項1〜3の何れか一項に記載の医用画像処理装置。
- コンピュータを、
組織切片における細胞の形態を表す細胞形態画像及び前記組織切片における特定のタンパク質の発現を蛍光輝点で表す蛍光画像を入力する入力手段、
前記細胞形態画像から解析対象領域を指定するための操作手段、
前記細胞形態画像から細胞核の領域を抽出する細胞核抽出手段、
前記蛍光画像から前記特定のタンパク質の発現を示す蛍光輝点を抽出する蛍光輝点抽出手段、
前記操作手段により指定された解析対象領域に存在する前記抽出された細胞核の領域及び蛍光輝点に基づいて、前記指定された解析対象領域における前記特定のタンパク質の発現量を示す特徴量を算出する特徴量算出手段、
前記算出された特徴量を出力する出力手段、
として機能させるためのプログラム。
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