JPWO2012165356A1 - Thermosensitive polyamino acid or salt thereof - Google Patents

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直彦 嶋田
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    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
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    • C08G73/028—Polyamidoamines
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Abstract

生理学的条件で温度に応答し、生体機能性を有するUCST型の温度応答性高分子化合物を提供するとともに、その温度応答性材としての各種用途を提供する。少なくとも１０つのアミノ酸が重合してなるポリアミノ酸であって、当該ポリアミノ酸を構成するアミノ酸の全部または少なくとも４割が、一般式（Ｉ）で示されるカルバモイル化アミノ酸であることを特徴とするカルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩：（式中、ｐは１〜５の整数を意味する。）。The present invention provides a UCST-type temperature-responsive polymer compound that responds to temperature under physiological conditions and has biological functions, and also provides various uses as the temperature-responsive material. A polyamino acid obtained by polymerizing at least 10 amino acids, wherein all or at least 40% of the amino acids constituting the polyamino acid are carbamoylated amino acids represented by the general formula (I) Polyamino acid or a salt thereof: (wherein p represents an integer of 1 to 5).

Description

本発明は、生理学的条件下で、低温域では不溶で高温域では溶解するといった高温溶解型の温度感応性（感温性）を有するポリアミノ酸またはその塩、及びその用途に関する。   The present invention relates to a polyamino acid or salt thereof having a high temperature dissolution type temperature sensitivity (temperature sensitivity) that is insoluble in a low temperature range and soluble in a high temperature range under physiological conditions, and a use thereof.

従来より、水溶液中における低温溶解型（下限臨界共溶温度型：LCST型）の温度感応性高分子化合物に関する研究は数多くあり、その相転移メカニズムの解明から、相転移温度制御のための分子設計方法も明らかになっている。例えば、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド等の低温溶解型高分子化合物は、細胞分離(非特許文献１)やドラッグデリバリーシステム（非特許文献２）また細胞シート工学の基盤材料となり、再生医療に新風を起こす起爆剤となっている。   There have been many studies on temperature-sensitive polymer compounds of low-temperature dissolution type (lower critical eutectic temperature type: LCST type) in aqueous solutions. Molecular design for phase transition temperature control from elucidation of the phase transition mechanism The method is also clear. For example, low-temperature-soluble polymer compounds such as poly-N-isopropylacrylamide are used as a base material for cell separation (Non-patent Document 1), drug delivery systems (Non-patent Document 2), and cell sheet engineering, and generate new winds in regenerative medicine. It is a detonator.

一方、水溶液中または生理学的条件下で高温溶解型（上限臨界共溶温度型：UCST型）の温度感応性高分子化合物の開発は、工学分野において大きなインパクトを与える基盤的材料となるにも関わらず、これらに関する研究は極めて少ない。これは、水系でUCST挙動を示す高分子化合物の例が数例しかなく（非特許文献３〜５参照）、さらにこれらの多くは生理的条件、つまり生理的なｐＨ、塩濃度および温度の条件下において温度感応特性（感温性）を発現することができないことによる。   On the other hand, the development of temperature-sensitive polymer compounds of high-temperature dissolution type (upper critical eutectic temperature type: UCST type) in aqueous solution or physiological conditions is a fundamental material that has a great impact in the engineering field. There is very little research on these. This is because there are only a few examples of polymer compounds that exhibit UCST behavior in aqueous systems (see Non-Patent Documents 3 to 5), and many of these are physiological conditions, that is, physiological pH, salt concentration and temperature conditions. This is because the temperature-sensitive characteristic (temperature sensitivity) cannot be expressed below.

特開昭60−106803号公報JP-A-60-106803

Okano, T. et al., (1993) J. Biomed. Mater. Res., 27, 1243-1251Okano, T. et al., (1993) J. Biomed. Mater. Res., 27, 1243-1251 Kim, Y.-H. et al., (1994) J. Control. Release, 28, 148-152Kim, Y.-H. et al., (1994) J. Control. Release, 28, 148-152 Buscall, R. et al., (1982) Eur. Polym. J., 18, 967-974Buscall, R. et al., (1982) Eur. Polym. J., 18, 967-974 Schulz, D. N. et al. (1986) Polymer, 27, 1734-1742Schulz, D. N. et al. (1986) Polymer, 27, 1734-1742 Aoki, T. et al., (1999) Polymer. J., 31, 1185-1188Aoki, T. et al., (1999) Polymer. J., 31, 1185-1188 Hossein M. Ekrami et al.,(1995) Journal of Drug Tareting, Vol.2, pp.469-475Hossein M. Ekrami et al., (1995) Journal of Drug Tareting, Vol.2, pp.469-475

上記のことから、生理学的条件で応答する高温溶解型高分子化合物の構築が不可欠となっている。そこで本発明は、生理学的条件で応答し、生体機能性を有する高温溶解型の新規な感温性高分子化合物を提供することを目的とする。さらに本発明は、当該新規感温性高分子化合物の用途を提供することを目的とする。   From the above, it is indispensable to construct a high-temperature soluble polymer compound that responds under physiological conditions. Accordingly, an object of the present invention is to provide a novel temperature-sensitive polymer compound of high-temperature dissolution type that responds under physiological conditions and has biofunctionality. Furthermore, an object of this invention is to provide the use of the said novel thermosensitive polymer compound.

本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねていたところ、少なくとも１０のアミノ酸が重合してなるポリアミノ酸であって、当該ポリアミノ酸を構成するアミノ酸の全部または少なくとも４割が、下記一般式（Ｉ）：   The inventors of the present invention have been diligently studied to achieve the above object, and are polyamino acids obtained by polymerizing at least 10 amino acids, and all or at least 40% of the amino acids constituting the polyamino acids, The following general formula (I):

Figure 2012165356
Figure 2012165356

（式中、ｐは１〜５の整数を意味する。）
で示される、側鎖にカルバモイル基を有するカルバモイル化アミノ酸（言い換えると、側鎖にウレイド基を有するカルバモイル化アミノ酸）である、カルバモイル化ポリアミノ酸（以下、「C-PAA」ともいう）及びその塩が、生理学的条件、具体的には生理学的なｐＨ及び塩濃度の条件下で、所定温度（相転移温度）以上では溶解（相溶）しているものの、降温操作により当該温度より低くすると不溶化（非相溶）する、高温溶解型（UCST型）の挙動を示すことを見出し、さらに当該相転移温度は、例えばカルバモイル化ポリアミノ酸（C-PAA）の濃度を調整することで適宜制御ができることを見出した。(In the formula, p means an integer of 1 to 5.)
A carbamoylated polyamino acid (hereinafter also referred to as “C-PAA”), which is a carbamoylated amino acid having a carbamoyl group in the side chain (in other words, a carbamoylated amino acid having a ureido group in the side chain) and a salt thereof Is dissolved (compatible) at a predetermined temperature (phase transition temperature) or higher under physiological conditions, specifically physiological pH and salt concentration, but insolubilized when the temperature is lowered by the temperature lowering operation. It is found that the behavior of high-temperature dissolution type (UCST type), which is (incompatible), and the phase transition temperature can be appropriately controlled by adjusting the concentration of carbamoylated polyamino acid (C-PAA), for example. I found.

本願発明はかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の実施形態を包含するものである。   This invention is completed based on this knowledge, and includes the following embodiment.

（Ｉ）カルバモイル化ポリアミノ酸（C-PAA）またはその塩
（I-1）少なくとも１０つのアミノ酸が重合してなるポリアミノ酸またはその塩であって、当該ポリアミノ酸を構成するアミノ酸の全部または少なくとも４割が、下記一般式（Ｉ）で示される、側鎖にカルバモイル基を有するアミノ酸であることを特徴とする、カルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩： (I) A carbamoylated polyamino acid (C-PAA) or a salt thereof (I-1) A polyamino acid or a salt thereof obtained by polymerizing at least 10 amino acids, and all or at least 4 of the amino acids constituting the polyamino acid A carbamoylated polyamino acid or a salt thereof, wherein the split is an amino acid having a carbamoyl group in the side chain represented by the following general formula (I):

Figure 2012165356
Figure 2012165356

（式中、ｐは１〜５の整数を意味する。）。 (In the formula, p means an integer of 1 to 5).

（I-2）下記一般式（II）で示される、カルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩：   (I-2) A carbamoylated polyamino acid or a salt thereof represented by the following general formula (II):

Figure 2012165356
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（式中、Ｒ１はアミノ酸の側鎖、ｐは１〜５の整数、ｍは１０以上の整数、ｎは０.４≦ｎ≦１を満たす数を、それぞれ意味する。）。(In the formula, R 1 is an amino acid side chain, p is an integer of 1 to 5, m is an integer of 10 or more, and n is a number satisfying 0.4 ≦ n ≦ 1).

（II-3）少なくとも１０つのアミノ酸が重合してなるポリアミノ酸またはその塩であって、当該ポリアミノ酸を構成するアミノ酸の全部または少なくとも４割が、下記一般式（III）：   (II-3) A polyamino acid obtained by polymerizing at least 10 amino acids or a salt thereof, wherein all or at least 40% of the amino acids constituting the polyamino acid are represented by the following general formula (III):

Figure 2012165356
Figure 2012165356

（式中、ｐは１〜５の整数を意味する。）
で示されるアミノ酸であるポリアミノ酸またはその塩に、
シアン酸塩を反応させることによって製造される、
（I-1）または（I-2）に記載するカルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩。(In the formula, p means an integer of 1 to 5.)
In a polyamino acid or a salt thereof which is an amino acid represented by
Produced by reacting cyanate,
The carbamoylated polyamino acid or salt thereof described in (I-1) or (I-2).

（II）カルバモイル化ポリアミノ酸（C-PAA）またはその塩の製造方法
（II-1）少なくとも１０つのアミノ酸が重合してなるポリアミノ酸またはその塩であって、当該ポリアミノ酸を構成するアミノ酸の全部または少なくとも４割が、下記一般式（III）： (II) Method for producing carbamoylated polyamino acid (C-PAA) or a salt thereof (II-1) A polyamino acid or a salt thereof obtained by polymerizing at least 10 amino acids, all of the amino acids constituting the polyamino acid Or at least 40% of the following general formula (III):

Figure 2012165356
Figure 2012165356

（式中、ｐは１〜５の整数を意味する。）
で示されるアミノ酸であるポリアミノ酸またはその塩に、
シアン酸塩を反応させる工程を有する、
（I-1）または（I-2）に記載するカルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩の製造方法。(In the formula, p means an integer of 1 to 5.)
In a polyamino acid or a salt thereof which is an amino acid represented by
Comprising reacting cyanate,
A method for producing a carbamoylated polyamino acid or salt thereof according to (I-1) or (I-2).

（II-2）上記ポリアミノ酸またはその塩が、下記一般式（IV）で示されるポリアミノ酸またはその塩である、（II-1）に記載する製造方法：   (II-2) The production method according to (II-1), wherein the polyamino acid or a salt thereof is a polyamino acid represented by the following general formula (IV) or a salt thereof:

Figure 2012165356
Figure 2012165356

（式中、Ｒ１はアミノ酸の側鎖、ｐは１〜５の整数、ｍは１０以上の整数、ｎは０.４≦ｎ≦１を満たす数を、それぞれ意味する。）。(In the formula, R 1 is an amino acid side chain, p is an integer of 1 to 5, m is an integer of 10 or more, and n is a number satisfying 0.4 ≦ n ≦ 1).

（III）カルバモイル化ポリアミノ酸（C-PAA）またはその塩の用途
（III-1）（I-1）乃至（I-3）のいずれかに記載するカルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩を有効成分とする、感温性組成物。
（III-2）（I-1）乃至（II-3）のいずれかに記載するカルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩を有効成分とする、感温性分離材。
（III-3）下記の工程を有する水性２相分配法：
（1）被分離物を含む試料及び（I-1）乃至（I-3）のいずれかに記載するカルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩を、生理的に許容される溶液中に共存させる工程、及び
（2）上記溶液の温度を、カルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩の相転移温度より高い温度から低い温度にすることで、上記溶液を相分離させる工程。 (III) Use of carbamoylated polyamino acid (C-PAA) or salt thereof (III-1) The carbamoylated polyamino acid or salt thereof described in any one of (I-1) to (I-3) as an active ingredient A thermosensitive composition.
(III-2) A temperature-sensitive separation material comprising the carbamoylated polyamino acid or salt thereof according to any one of (I-1) to (II-3) as an active ingredient.
(III-3) Aqueous two-phase distribution method having the following steps:
(1) a step of allowing a sample containing an object to be separated and a carbamoylated polyamino acid or salt thereof according to any of (I-1) to (I-3) to coexist in a physiologically acceptable solution; and (2) A step of phase-separating the solution by changing the temperature of the solution from a temperature higher than a phase transition temperature of the carbamoylated polyamino acid or a salt thereof.

なお、ここで(2)の工程は、溶液の温度をカルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩の相転移温度よりも高温から低温にすることにより行ってもよいし、また溶液中のカルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩の濃度、ｐＨまたは塩濃度を制御することで、カルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩の相転移温度を、溶液の温度よりも低い温度から高い温度にすることにより行ってもよい。   Here, the step (2) may be performed by changing the temperature of the solution from higher to lower than the phase transition temperature of the carbamoylated polyamino acid or a salt thereof, or the carbamoylated polyamino acid or By controlling the concentration, pH or salt concentration of the salt, the phase transition temperature of the carbamoylated polyamino acid or salt thereof may be changed from a lower temperature to a higher temperature than the temperature of the solution.

（III-4）さらに下記の(3)の工程、または(3)と(4)の工程を有する、（III-3）に記載する水性２相分配法：
（3）(2)の相分離工程によって相分離された溶液について、被分離物が分配された相を、非分配相から分離し回収する工程、
（4）上記(3)の工程により分離回収した被分離物分配相から、被分離物を回収する工程。(III-4) The aqueous two-phase partition method according to (III-3), further comprising the following step (3) or (3) and (4):
(3) A step of separating and recovering the phase in which the separation target is distributed from the non-partitioned phase with respect to the solution phase-separated by the phase separation step of (2),
(4) A step of recovering the separated object from the separated substance distribution phase separated and recovered by the step (3).

（III-5）被分離物がタンパク質、細胞、アニオン性物質、カチオン性物質、水素結合性物質、及び疎水結合性物質からなる群から選択されるいずれか少なくとも１つである（III-3）または（III-4）に記載する水性２相分配法。   (III-5) The substance to be separated is at least one selected from the group consisting of proteins, cells, anionic substances, cationic substances, hydrogen bonding substances, and hydrophobic bonding substances (III-3) Or the aqueous two-phase partition method described in (III-4).

本発明が対象とする高温溶解型感温性を有するカルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩は、ポリアミノ酸を構成するアミノ酸の側鎖のすべてにカルバモイル基が結合している（「ウレイド基が結合している」ともいうことができる）ことを特徴とする。かかるカルバモイル化ポリアミノ酸は、少なくとも生理的条件で高温溶解型の感温性挙動を示し、特定の温度（相転移温度）よりも高い温度で溶解相を形成し、当該相転移温度よりも低い温度で不溶相を形成する性質を有している（例えば図１参照）。   In the carbamoylated polyamino acid or salt thereof having a high temperature dissolution type temperature sensitivity targeted by the present invention, a carbamoyl group is bonded to all side chains of the amino acid constituting the polyamino acid (“the ureido group is bonded). It can also be said that “is”. Such a carbamoylated polyamino acid exhibits a high-temperature dissolution type temperature-sensitive behavior at least under physiological conditions, forms a dissolved phase at a temperature higher than a specific temperature (phase transition temperature), and is lower than the phase transition temperature. And has the property of forming an insoluble phase (see, for example, FIG. 1).

このため、当該カルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩は、その生理的条件下における感温性を利用することで、生理的条件下における各種物質の捕捉や分離に、分離材として有効に用いることができる。特に、カルバモイル化ポリアミノ酸がカルバモイル化ポリオルニチン（CPLO）またはその塩である場合（式（Ｉ）または式（II）中、ｐが３であるC-PAAに相当する。）、当該カルバモイル化ポリオルニチンは、その構成アミノ酸（モノマー分子）がいずれも生体内に存在するアミノ酸であるオルニチンとシトルリンであるため、生体、特にヒトなどの哺乳類を含む動物に対して安全である。このため、一般式（Ｉ）または（II）で示されるカルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩は、例えば生化学的または生理学的材料（例えば、細胞やタンパク質等の生理活性物質）の分離、ＤＤＳ、薬剤放出、酵素の固定化、細胞培養、センシングなどに、有効に用いることができる。特に高温条件で変性したり活性が低下するなど、高温環境が好ましくない物質（例えば、細胞、遺伝子等の核酸、酵素や抗体などのタンパク質、その他のバイオプロダクトなど）については、本発明のカルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩によれば、相転移温度以下の低温条件下で、変性させたり活性を失うことなく、捕獲し分離（単離）することが可能である。   Therefore, the carbamoylated polyamino acid or a salt thereof can be effectively used as a separation material for capturing and separating various substances under physiological conditions by utilizing the temperature sensitivity under the physiological conditions. . In particular, when the carbamoylated polyamino acid is carbamoylated polyornithine (CPLO) or a salt thereof (corresponding to C-PAA in which p is 3 in formula (I) or formula (II)), the carbamoylated polyamino acid. Since ornithine is an ornithine and citrulline, both of which are amino acids (monomer molecules) in the living body, ornithine is safe for living bodies, particularly animals including mammals such as humans. Therefore, the carbamoylated polyamino acid represented by the general formula (I) or (II) or a salt thereof can be used, for example, for separation of biochemical or physiological materials (for example, physiologically active substances such as cells and proteins), DDS, drugs It can be effectively used for release, enzyme immobilization, cell culture, sensing and the like. For substances that do not favor high-temperature environments (eg, cells, nucleic acids such as genes, proteins such as enzymes and antibodies, and other bioproducts) such as denaturation and reduced activity especially under high-temperature conditions, the carbamoylation of the present invention According to the polyamino acid or a salt thereof, it can be captured and separated (isolated) under low temperature conditions below the phase transition temperature without being denatured or losing activity.

例えば生理的緩衝液（10mM Hepes-NaOH (pH7.5)＋150mM NaCl in water）中における本発明のカルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩について、温度℃と透過率％との関係、及び不溶相と可溶相との相転移を示す図である。For example, regarding the carbamoylated polyamino acid of the present invention or a salt thereof in physiological buffer (10 mM Hepes-NaOH (pH 7.5) +150 mM NaCl in water), the relationship between temperature ° C. and permeability%, and insoluble phase and solubility It is a figure which shows the phase transition with a phase. 製造例１で調製したカルバモイル化ポリオルニチン（CPLO-30K-93、カルバモイル化度n=0.93）とポリオルニチン（PLO-30K）の１Ｈ-ＮＭＲスペクトルを示す。「α」はα位のメチレンのプロトンのピーク、「β」はβ位のメチレンのプロトンのピーク、「γ」はγ位のメチレンのプロトンのピーク、「δ」はカルバモイル化されていないδ位のメチレンのプロトンのピーク、「δ’」はカルバモイル化されたδ位のメチレンのプロトンのピークを示す。1 shows 1 H-NMR spectra of carbamoylated polyornithine (CPLO-30K-93, degree of carbamoylation n = 0.93) and polyornithine (PLO-30K) prepared in Production Example 1. “Α” is the methylene proton peak at the α-position, “β” is the methylene proton peak at the β-position, “γ” is the methylene proton peak at the γ-position, and “δ” is the δ-position that is not carbamoylated. The methylene proton peak, “δ ′”, represents the carbamoylated methylene proton peak at the δ position. 生理的緩衝液（10mM Hepes-NaOH (pH7.5)＋150mM NaCl in water）におけるカルバモイル化ポリオルニチン（CPLO-30K-93（1mg/ml）、カルバモイル化度n=0.93）について、温度℃と透過率％との関係、及び不溶相と可溶相との相転移を示す図である（実験例１）。Temperature ℃ and permeability for carbamoylated polyornithine (CPLO-30K-93 (1mg / ml), degree of carbamoylation n = 0.93) in physiological buffer (10mM Hepes-NaOH (pH7.5) + 150mM NaCl in water) It is a figure which shows the relationship between% and the phase transition of an insoluble phase and a soluble phase (Experimental example 1). ポリDL-オルニチンをカルバモイル化したカルバモイル化ポリオルニチン（CPDLO-30K-95、カルバモイル化度n=0.84）を5.0mg/mlになるように溶解した生理的緩衝液（10mM Hepes-NaOH (pH7.5)＋150mM NaCl）について、５〜４０℃までの温度範囲での透過率％（500nm）を測定した結果を示す（実験例２）。A physiological buffer solution (10 mM Hepes-NaOH (pH 7.5) in which carbamoylated polyornithine (CPDLO-30K-95, degree of carbamoylation n = 0.84) obtained by carbamoylating poly DL-ornithine is dissolved to 5.0 mg / ml. ) +150 mM NaCl) shows the results of measuring the transmittance% (500 nm) in the temperature range from 5 to 40 ° C. (Experimental Example 2). （Ａ）カルバモイル化ポリオルニチン（CPLO-30K-88、カルバモイル化度n＝0.88）を各種濃度（0.125、0.25、0.5、1.0、2.5及び5.0mg/ml）になるように溶解した生理的緩衝液（10mM Hepes-NaOH (pH7.5)＋150mM NaCl）について、５〜７０℃までの温度範囲での透過率％（500nm）を測定した結果を示す（実験例３）。（Ｂ）カルバモイル化ポリオルニチン（CPLO-30K-93、カルバモイル化度n=0.93）を各種濃度（0.125、0.25、0.5、1.0、2.5及び5.0mg/ml）になるように溶解した生理的緩衝液（10mM Hepes-NaOH (pH7.5)＋150mM NaCl）について、５〜３０℃までの温度範囲での透過率％（500nm）を測定した結果を示す（実験例３）。（Ｃ）（Ｂ）で得られたCPLO-30K-93の高温溶解温度ＵＣＳＴ（℃）（相転移温度）を、生理的緩衝液中のCPLO-30K-93の濃度（mg/ml）を横軸にしてプロットした結果を示す。(A) A physiological buffer solution in which carbamoylated polyornithine (CPLO-30K-88, carbamoylation degree n = 0.88) is dissolved at various concentrations (0.125, 0.25, 0.5, 1.0, 2.5 and 5.0 mg / ml) The result of having measured the transmittance | permeability% (500 nm) in the temperature range to 5-70 degreeC about (10 mM Hepes-NaOH (pH7.5) +150 mM NaCl) is shown (experimental example 3). (B) A physiological buffer solution in which carbamoylated polyornithine (CPLO-30K-93, degree of carbamoylation n = 0.93) is dissolved at various concentrations (0.125, 0.25, 0.5, 1.0, 2.5 and 5.0 mg / ml). The result of having measured the transmittance | permeability% (500 nm) in the temperature range to 5-30 degreeC about (10 mM Hepes-NaOH (pH7.5) +150 mM NaCl) is shown (Experimental example 3). (C) The high temperature dissolution temperature UCST (° C) (phase transition temperature) of CPLO-30K-93 obtained in (B) is plotted next to the concentration (mg / ml) of CPLO-30K-93 in physiological buffer. The result plotted on the axis is shown. 生理的緩衝液（10mM Hepes-NaOH (pH7.5)＋150mM NaCl in water）におけるカルバモイル化ポリオルニチン（CPLO-150K-84（1mg/ml）、カルバモイル化度0.84）及びカルバモイル化ポリオルニチン（CPLO-150K-93（1mg/ml）、カルバモイル化度0.93）について、温度℃と透過率％との関係を示す図である（実験例４）。Carbamoylated polyornithine (CPLO-150K-84 (1 mg / ml), degree of carbamoylation 0.84) and carbamoylated polyornithine (CPLO-150K) in physiological buffer (10 mM Hepes-NaOH (pH 7.5) + 150 mM NaCl in water) It is a figure which shows the relationship between temperature degree C and the transmittance | permeability% about -93 (1 mg / ml) and carbamoylation degree 0.93 (Experimental example 4). （Ａ）カルバモイル化ポリオルニチン（CPLO-150K-84、カルバモイル化度n=0.84）を各種濃度（0.125、0.25、0.5、1.0、2.5及び5.0mg/ml）になるように溶解した生理的緩衝液（10mM Hepes-NaOH (pH7.5)＋150mM NaCl）について、５〜７０℃までの温度範囲での透過率％（500nm）を測定した結果を示す（実験例５）。（Ｂ）カルバモイル化ポリオルニチン（CPLO-150K-93、カルバモイル化度0.93）を各種濃度（0.125、0.25、0.5、1.0、2.5及び5.0mg/ml）になるように溶解した生理的緩衝液（10mM Hepes-NaOH (pH7.5)＋150mM NaCl）について、５〜７０℃までの温度範囲での透過率％（500nm）を測定した結果を示す（実験例５）。（Ｃ）（Ａ）で得られたCPLO-150K-84及び（Ｂ）で得られたCPLO-150K-93の高温溶解温度ＵＣＳＴ（℃）（相転移温度）を、生理的緩衝液中の各CPLO-150Kの濃度（mg/ml）を横軸にしてプロットした結果を示す。(A) A physiological buffer solution in which carbamoylated polyornithine (CPLO-150K-84, degree of carbamoylation n = 0.84) is dissolved at various concentrations (0.125, 0.25, 0.5, 1.0, 2.5 and 5.0 mg / ml) The result of having measured the transmittance | permeability% (500 nm) in the temperature range to 5-70 degreeC about (10 mM Hepes-NaOH (pH7.5) +150 mM NaCl) is shown (experimental example 5). (B) A physiological buffer solution (10 mM) in which carbamoylated polyornithine (CPLO-150K-93, carbamoylation degree 0.93) is dissolved at various concentrations (0.125, 0.25, 0.5, 1.0, 2.5 and 5.0 mg / ml). About Hepes-NaOH (pH7.5) +150 mM NaCl), the result of having measured the transmittance | permeability% (500 nm) in the temperature range to 5-70 degreeC is shown (Experimental example 5). (C) CPLO-150K-84 obtained in (A) and CPLO-150K-93 obtained in (B) are dissolved in the high temperature dissolution temperature UCST (° C.) (phase transition temperature) in each physiological buffer solution. The result of having plotted on the horizontal axis the density | concentration (mg / ml) of CPLO-150K is shown. カルバモイル化ポリオルニチン（CPLO-150K-93、カルバモイル化度n=0.93）、及び当該CPLO-150K-93をプロテアーゼＫ処理した分解物について、生理的緩衝液（10mM Hepes-NaOH (pH7.5)＋150mM NaCl in water）に溶解した条件下での、温度℃と透過率％（500nm）との関係、及び不溶相と可溶相との相転移を示す図である（実験例６）。For a carbamoylated polyornithine (CPLO-150K-93, carbamoylation degree n = 0.93) and a degradation product obtained by treating the CPLO-150K-93 with protease K, physiological buffer (10 mM Hepes-NaOH (pH 7.5) +150 mM) It is a figure which shows the relationship between the temperature degree C and the transmittance | permeability% (500 nm) and the phase transition of an insoluble phase and a soluble phase on the conditions melt | dissolved in NaCl in water (Experimental example 6).

１．カルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩、およびその製造方法
本発明が対象とするカルバモイル化ポリアミノ酸は、同一または異なる１０以上のアミノ酸が重合してなるポリアミノ酸であって、当該ポリアミノ酸を構成するアミノ酸の全部または少なくとも４割が、下記一般式（Ｉ）で示されるカルバモイル化アミノ酸であることを特徴とする。 1. A carbamoylated polyamino acid or a salt thereof, and a production method thereof The carbamoylated polyamino acid targeted by the present invention is a polyamino acid obtained by polymerizing 10 or more amino acids that are the same or different, and the amino acid constituting the polyamino acid. All or at least 40% are carbamoylated amino acids represented by the following general formula (I).

Figure 2012165356
Figure 2012165356

上記式中、ｐはポリアミノ酸の側鎖のメチレン基の数を表す。具体的には、ｐは１以上の整数を意味する。通常１〜５、好ましくは１〜４、より好ましくは２〜３、特に好ましくは３である。   In the above formula, p represents the number of methylene groups in the side chain of the polyamino acid. Specifically, p means an integer of 1 or more. Usually, 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 2 to 3, particularly preferably 3.

本発明のカルバモイル化ポリアミノ酸は１０以上のアミノ酸が重合してなるものである。かかるアミノ酸の重合度として、具体的には１０以上、好ましくは１０〜５０００、より好ましくは２０〜２０００、特に好ましくは２０〜１０００である。   The carbamoylated polyamino acid of the present invention is formed by polymerizing 10 or more amino acids. The degree of polymerization of such amino acids is specifically 10 or more, preferably 10 to 5000, more preferably 20 to 2000, and particularly preferably 20 to 1000.

上記式（Ｉ）において、カルバモイル化しているアミノ酸は、全アミノ酸のうち４０〜１００％（４〜１０割）の範囲である。生理的条件下で高温溶解型の温度感応性（感温性）を示すという観点から、好ましくは８４〜１００％（８.４〜１０割）であり、より好ましくは８７〜１００％（８.７〜１０割）である。   In the above formula (I), the carbamoylated amino acids are in the range of 40-100% (40-100%) of all amino acids. From the viewpoint of exhibiting high-temperature dissolution type temperature sensitivity (temperature sensitivity) under physiological conditions, it is preferably 84 to 100% (8.4 to 100%), more preferably 87 to 100% (8. 70-100%).

本発明が対象とするカルバモイル化ポリアミノ酸の一例として、下記一般式（II）で示される化合物を挙げることができる。   An example of the carbamoylated polyamino acid targeted by the present invention is a compound represented by the following general formula (II).

Figure 2012165356
Figure 2012165356

上記式中、ｍはポリアミノ酸の重合度を表す。具体的には、ｍは１０以上の整数を意味する。好ましくは１０〜５０００であり、より好ましくは２０〜２０００であり、特に好ましくは２０〜１０００である。   In the above formula, m represents the degree of polymerization of the polyamino acid. Specifically, m means an integer of 10 or more. Preferably it is 10-5000, More preferably, it is 20-2000, Most preferably, it is 20-1000.

上記式中、ｐはポリアミノ酸の側鎖のメチレン基の数を表す。具体的には、ｐは１以上の整数を意味する。通常１〜５、好ましくは１〜４、より好ましくは２〜３、特に好ましくは３である。   In the above formula, p represents the number of methylene groups in the side chain of the polyamino acid. Specifically, p means an integer of 1 or more. Usually, 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 2 to 3, particularly preferably 3.

上記式（II）中、ｎは本発明のカルバモイル化ポリアミノ酸を構成するアミノ酸全体に対するカルバモイル化アミノ酸の割合を表す。言い換えると、カルバモイル化ポリアミノ酸における側鎖アミノ基に対するカルバモイル基の導入度を意味する。具体的には、ｎは０.４≦ｎ≦１の数を示す。生理的条件で温感性を示すという観点から、好ましくは０.８４≦ｎ≦１であり、より好ましくは０．８７≦ｎ≦１である。具体的には、「ｎ×１００」は、カルバモイル化ポリアミノ酸を構成するアミノ酸全体（１００％）に対するカルバモイル化アミノ酸のパーセンテージ（％）を意味する。   In said formula (II), n represents the ratio of the carbamoylated amino acid with respect to the whole amino acid which comprises the carbamoylated polyamino acid of this invention. In other words, it means the degree of introduction of the carbamoyl group with respect to the side chain amino group in the carbamoylated polyamino acid. Specifically, n represents a number of 0.4 ≦ n ≦ 1. From the viewpoint of showing warmth sensitivity under physiological conditions, 0.84 ≦ n ≦ 1 is preferable, and 0.87 ≦ n ≦ 1 is more preferable. Specifically, “n × 100” means the percentage (%) of the carbamoylated amino acid to the total amino acid (100%) constituting the carbamoylated polyamino acid.

上記式中、Ｒ１はアミノ酸の側鎖を意味する。ここで示されるアミノ酸の側鎖としては、公知のアミノ酸、好ましくはタンパク質を構成するアミノ酸の側鎖をいずれも挙げることができる。制限されないが、例えば、タンパク質を構成するアミノ酸の側鎖として、下記表１に掲げる側鎖を挙げることができる。In the above formula, R 1 means a side chain of an amino acid. As the side chain of the amino acid shown here, any known amino acid, preferably the side chain of the amino acid constituting the protein can be mentioned. Although not limited, for example, the side chains listed in Table 1 below can be given as side chains of amino acids constituting the protein.

Figure 2012165356
Figure 2012165356

アミノ酸の側鎖として、好ましくは水素原子がアミノ基（-NH2）で置換されてなる直鎖状または分岐状の炭素数１〜６のアルキル基であり、より好ましくは水素原子がアミノ基（-NH2）で置換されてなる直鎖状または分岐状の炭素数２〜４のアルキル基であり、特に好ましくは水素原子がアミノ基（-NH2）で置換されてなる直鎖状または分岐状の炭素数３のアルキル基である。The side chain of the amino acid is preferably a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms in which a hydrogen atom is substituted with an amino group (—NH 2 ), and more preferably a hydrogen atom is an amino group ( -NH 2) is a linear or branched alkyl group having 2 to 4 carbon atoms formed by substituted with, particularly preferably a straight-chain or branched hydrogen atom becomes substituted with an amino group (-NH 2) It is an alkyl group having 3 carbon atoms.

本発明のカルバモイル化ポリアミノ酸の塩とは、当該カルバモイル化ポリアミノ酸を構成するアミノ酸（モノマー分子）中の側鎖アミノ基への付加塩を挙げることができる。かかる付加塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、ホスホン酸塩、酢酸塩等のカルボン酸塩類、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、クエン酸塩や酒石酸塩などオキシカルボン酸塩、安息香酸塩を例示することができる。好ましくは生体に安全な塩、例えば薬学的に許容される塩である。   Examples of the salt of a carbamoylated polyamino acid according to the present invention include an addition salt to a side chain amino group in an amino acid (monomer molecule) constituting the carbamoylated polyamino acid. Such addition salts include hydrochlorides, hydrobromides, hydroiodides, sulfates, phosphates, phosphonates, acetates and other carboxylates, methanesulfonate, p-toluenesulfonic acid. Examples thereof include oxycarboxylates such as salts, citrates and tartrates, and benzoates. Preferred is a salt that is safe for living organisms, for example, a pharmaceutically acceptable salt.

本発明のカルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩は、少なくとも１０以上のアミノ酸が重合してなるポリアミノ酸またはその塩であって、当該ポリアミノ酸を構成するアミノ酸の全部または少なくとも４割が、下記一般式（III）：   The carbamoylated polyamino acid or salt thereof of the present invention is a polyamino acid or salt thereof obtained by polymerizing at least 10 amino acids, and all or at least 40% of the amino acids constituting the polyamino acid are represented by the following general formula ( III):

Figure 2012165356
Figure 2012165356

（式中、ｐは前述の通り。）
で示されるアミノ酸であるポリアミノ酸またはその塩をシアン酸塩（MCNO）と反応させることで製造することができる。(In the formula, p is as described above.)
It can be produced by reacting a polyamino acid, which is an amino acid represented by the following formula, or a salt thereof with cyanate (MCNO).

その反応式の一例を示すと下記の通りである。   An example of the reaction formula is as follows.

Figure 2012165356
Figure 2012165356

（式中、ｍ、ｎ、ｐは前述の通り。MCNOはシアン酸塩を意味する。）
ここでポリアミノ酸は、Ｄ体またはＬ体のいずれの光学異性体であっってもよく、またはこれらの混合物、例えばＤ体とＬ体の等量混合物であるＤＬ体であってもよい。好ましくは、生体タンパク質を構成するＬ体である。また、ポリアミノ酸は、制限されないものの、好ましくは生体タンパク質を構成するαアミノ酸のポリマーである。(In the formula, m, n, and p are as described above. MCNO means cyanate.)
Here, the polyamino acid may be either D-form or L-form optical isomer, or a mixture thereof, for example, a DL-form that is an equivalent mixture of D-form and L-form. Preferably, it is L body which comprises biological protein. The polyamino acid is not limited, but is preferably a polymer of α-amino acid that constitutes a biological protein.

ここでポリアミノ酸の塩としては、カルバモイル化ポリアミノ酸の塩と同様に、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、ホスホン酸塩、酢酸塩等のカルボン酸塩類、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、クエン酸塩や酒石酸塩などオキシカルボン酸塩、安息香酸塩を例示することができる。好ましくは塩酸塩、硫酸塩、及びリン酸塩などの無機塩である。   Here, as the salt of polyamino acid, as in the case of carbamoylated polyamino acid, carboxylate such as hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, sulfate, phosphate, phosphonate, acetate, etc. Examples thereof include acid salts, methanesulfonate, p-toluenesulfonate, oxycarboxylate such as citrate and tartrate, and benzoate. Preferred are inorganic salts such as hydrochloride, sulfate, and phosphate.

なお、原料として使用するポリアミノ酸またはその塩の製造方法は既に公知であり、具体的には例えば非特許文献６記載に従って調製することができるし、また慣用のアミノ酸合成法を用いて合成することができる。なお、これらの製造方法を記載する文献（例えば、非特許文献６）は、援用により本件明細書の内容の一部として盛り込まれる。塩を含まないフリーのタイプのポリアミノ酸は、既知のポリアミノ酸の塩をアルカリで中和後、副生する中和塩を水に対して透析することで調製することができる。   In addition, the manufacturing method of the polyamino acid used as a raw material or its salt is already well-known, Specifically, it can prepare according to description of a nonpatent literature 6, for example, and it synthesize | combines it using a conventional amino acid synthesis method. Can do. In addition, the literature (for example, nonpatent literature 6) which describes these manufacturing methods is included as a part of the content of this specification by incorporation. A free type polyamino acid containing no salt can be prepared by neutralizing a salt of a known polyamino acid with an alkali and then dialyzing a neutralized salt produced as a by-product against water.

また、市販のポリアミノ酸 (塩フリー)を使用することもできる。かかる市販品としては、分子量約3万のポリL-オルニチン臭化水素酸塩（Sigma）, 分子量約15万のポリL-オルニチン臭化水素酸塩（Sigma）、分子量約3万のポリD-オルニチン臭化水素酸塩（Sigma）, 分子量約15万のポリD-オルニチン臭化水素酸塩（Sigma）、分子量約3万のポリDL-オルニチン臭化水素酸塩（Sigma）, 分子量約15万のポリDL-オルニチン臭化水素酸塩（Sigma）等を例示することができる。   Commercially available polyamino acids (salt-free) can also be used. Such commercially available products include poly L-ornithine hydrobromide (Sigma) having a molecular weight of about 30,000, poly L-ornithine hydrobromide (Sigma) having a molecular weight of about 150,000, poly D- Ornithine hydrobromide (Sigma), poly D-ornithine hydrobromide (Sigma) with a molecular weight of about 150,000, poly DL-ornithine hydrobromide (Sigma) with a molecular weight of about 30,000, molecular weight of about 150,000 Poly DL-ornithine hydrobromide (Sigma) and the like.

ポリアミノ酸を溶液にするために使用する溶媒としては、水、有機溶媒またはこれらの混合液を挙げることができる。有機溶媒としては、ポリアミノ酸の溶解性から極性溶媒であることが好ましく、例えばメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール等のアルコール類；アセトニトリル、ホルムアミド、N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、1,4-ジオキサン等を挙げることができる。反応に使用するポリアミノ酸溶液におけるポリアミノ酸濃度としては、制限されないが、通常１〜５０重量％、好ましくは２〜３０重量％、より好ましくは３〜２０重量％、特に好ましくは２〜１０重量％を挙げることができる。   Examples of the solvent used to make the polyamino acid into solution include water, an organic solvent, and a mixture thereof. The organic solvent is preferably a polar solvent in view of the solubility of the polyamino acid, for example, alcohols such as methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol; acetonitrile, formamide, N, N-dimethylformamide Dimethyl sulfoxide, tetrahydrofuran, 1,4-dioxane and the like. The polyamino acid concentration in the polyamino acid solution used for the reaction is not limited, but is usually 1 to 50% by weight, preferably 2 to 30% by weight, more preferably 3 to 20% by weight, particularly preferably 2 to 10% by weight. Can be mentioned.

ポリアミノ酸またはその塩と反応させるシアン酸塩（MCNO）としては、シアン酸カリウムやシアン酸ナトリウム等のシアン酸のアルカリ金属塩を好適に例示することができる。好ましくはシアン酸カリウムである。   Preferable examples of cyanate (MCNO) to be reacted with polyamino acid or a salt thereof include alkali metal salts of cyanic acid such as potassium cyanate and sodium cyanate. Preferably it is potassium cyanate.

かかるシアン酸塩の使用割合としては、上記ポリアミノ酸の側鎖アミノ基にカルバモイル基が所望の割合（導入率）（一般式中、ｎが0.4≦ｎ≦1）で導入されるように、化学量論的に必要な計算量を挙げることができる。シアン酸塩の使用割合として、具体的には、ポリアミノ酸１モルに対して、０．４〜１０モルになるような割合を挙げることができる。上限は１０モル以下であればよいが、好ましくは５モル以下、より好ましくは３モル以下である。下限はカルバモイル基の導入率（カルバモイル化度）に応じて対応するモル数に設定することができる（例えば製造例１の表１及び製造例２の表２参照）。例えば、カルバモイル化度を０．７〜０．７５程度にする場合には０．８モル程度、０．８〜０．９程度にする場合には１モル程度、０．９〜０．９５程度にする場合には１．２モル程度に設定調整することができる。   The cyanate is used in such a manner that the carbamoyl group is introduced into the side chain amino group of the polyamino acid at a desired ratio (introduction ratio) (where n is 0.4 ≦ n ≦ 1). The amount of calculation required stoichiometrically can be mentioned. Specifically, the proportion of cyanate used may be 0.4 to 10 moles per mole of polyamino acid. Although an upper limit should just be 10 mol or less, Preferably it is 5 mol or less, More preferably, it is 3 mol or less. The lower limit can be set to the number of moles corresponding to the introduction rate (carbamoylation degree) of the carbamoyl group (see, for example, Table 1 of Production Example 1 and Table 2 of Production Example 2). For example, when the degree of carbamoylation is about 0.7 to 0.75, about 0.8 mol, and about 0.8 to 0.9, about 1 mol, about 0.9 to 0.95 In the case of making it, the setting can be adjusted to about 1.2 mol.

ポリアミノ酸またはその塩とシアン酸塩（MCNO）とを反応させて、カルバモイル化ポリアミノ酸を製造するときは、まず、原料のポリアミノ酸またはその塩の溶液にシアン酸塩（MCNO）をゆっくりと滴下することが好ましい。このとき、溶媒にシアン酸塩（MCNO）を溶解させて、原料のポリアミノ酸またはその塩の溶液に滴下することもできる。この場合、シアン酸塩を溶解させるための溶媒は、通常、原料のポリアミノ酸を溶解させるための溶媒と同じである。ポリアミノ酸またはその塩とシアン酸塩（MCNO）との反応は、撹拌しながら行うことが好ましい。反応温度は、特に制限されないが、好ましくは０〜１００℃、より好ましくは３０〜６０℃に維持することが望ましい。反応時間も特に制限されないが、通常１２〜４８時間、好ましくは１２〜２５時間で、本発明のカルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩の溶液を得ることができる。   When a carbamoylated polyamino acid is produced by reacting a polyamino acid or a salt thereof with cyanate (MCNO), first, the cyanate (MCNO) is slowly dropped into the raw polyamino acid or salt solution. It is preferable to do. At this time, cyanate (MCNO) can be dissolved in a solvent and added dropwise to the raw polyamino acid or salt solution. In this case, the solvent for dissolving the cyanate salt is usually the same as the solvent for dissolving the raw polyamino acid. The reaction between the polyamino acid or a salt thereof and cyanate (MCNO) is preferably performed with stirring. The reaction temperature is not particularly limited, but is preferably maintained at 0 to 100 ° C, more preferably 30 to 60 ° C. Although the reaction time is not particularly limited, the solution of the carbamoylated polyamino acid or salt thereof of the present invention can be obtained usually in 12 to 48 hours, preferably in 12 to 25 hours.

反応終了後、副生したアルコールと反応溶媒を除去するために、反応溶液を、真空乾燥することにより、本発明のカルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩を、固体として得ることができる。   After the reaction is completed, in order to remove the by-produced alcohol and the reaction solvent, the reaction solution is vacuum-dried to obtain the carbamoylated polyamino acid of the present invention or a salt thereof as a solid.

また、本発明のカルバモイル化ポリアミノ酸の塩は、原料として、ポリアミノ酸の部分塩を用い、これとシアン酸塩（MCNO）とを、フリーのポリアミノ酸を用いた場合と同様に、反応させることにより、製造することができる。通常、原料のポリアミノ酸の部分塩とシアン酸塩とを反応させた場合、そのポリアミノ酸のＮＨで、塩を形成していないＮＨが、優先的にカルバモイル基で置換される。反応終了後、得られるカルバモイル化ポリアミノ酸の塩の溶液を、アセトン等の溶媒に加えて再沈することにより、本発明のカルバモイル化ポリアミノ酸の付加塩を、固体として取り出すことが可能となる。   Moreover, the salt of the carbamoylated polyamino acid of the present invention uses a partial salt of polyamino acid as a raw material, and this is reacted with cyanate (MCNO) in the same manner as in the case of using a free polyamino acid. Can be manufactured. Usually, when a partial salt of a polyamino acid as a raw material is reacted with cyanate, the NH of the polyamino acid is preferentially substituted with a carbamoyl group. After completion of the reaction, the resulting carbamoylated polyamino acid salt solution is added to a solvent such as acetone and reprecipitated, whereby the carbamoylated polyamino acid addition salt of the present invention can be taken out as a solid.

本発明のカルバモイル化ポリアミノ酸におけるカルバモイル化度（モル％）は、用いる原料のシアン酸塩の量に依存する。原料のポリアミノ酸の側鎖アミノ基に対し、等モル量のシアン酸塩を用いたときは、通常、ほとんどのアミノ基はカルバモイル化される。従って、原料として用いるシアン酸塩の量を調整することにより、本発明のカルバモイル化ポリアミノ酸のカチオン密度（またはカルバモイル基の密度、ウレイド基の密度ともいう）を調整することができる。なお、ポリアミノ酸のカルバモイル化度など、カルバモイル基の導入率（本発明化合物の生成率）は、ＮＭＲ測定により測定することができる（製造例１参照）。   The degree of carbamoylation (mol%) in the carbamoylated polyamino acid of the present invention depends on the amount of the starting cyanate. When equimolar amounts of cyanate are used with respect to the side chain amino group of the starting polyamino acid, most amino groups are usually carbamoylated. Therefore, by adjusting the amount of cyanate used as a raw material, the cation density (or carbamoyl group density or ureido group density) of the carbamoylated polyamino acid of the present invention can be adjusted. The introduction rate of the carbamoyl group (the production rate of the compound of the present invention) such as the degree of carbamoylation of the polyamino acid can be measured by NMR measurement (see Production Example 1).

また、本発明のカルバモイル化ポリアミノ酸の塩は、原料としてポリアミノ酸の塩を用いることで、製造取得することができる。   In addition, the carbamoylated polyamino acid salt of the present invention can be produced and obtained by using a polyamino acid salt as a raw material.

斯くして調製される本発明のカルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩は、少なくとも生理学的に許容される溶液中で、５〜６５℃の範囲、好ましくは５〜５０℃の範囲、より好ましくは５〜４０℃の範囲に相転移温度を有することを特徴とする。   The carbamoylated polyamino acid or salt thereof of the present invention thus prepared is in the range of 5 to 65 ° C., preferably in the range of 5 to 50 ° C., more preferably 5 to 5 ° C., at least in a physiologically acceptable solution. It has a phase transition temperature in the range of 40 ° C.

ここで「生理学的に許容される溶液」とは、生物個体やそれを構成する細胞が生存するために必要な条件を満たした溶液を意味する。対象とする生物個体としては微生物、動物及び植物を挙げることができるが、好ましくは植物及び動物、より好ましくはヒト等の哺乳類を含む動物であり、特に好ましくはヒトを含む哺乳類である。ヒトを含む哺乳類やそれを構成する細胞が生存するために必要な条件としては、制限されないものの、塩濃度として１〜１０００ｍＭの範囲、好ましくは50〜300ｍＭ，ｐＨとしてｐＨ４−１０、好ましくはｐＨ５−９の範囲を例示することができる。また溶液の種類としては、水を例示することができる。なお、「生理学的に許容される溶液」とは人工的に調製した溶液のみならず、生体内及び生体外などの存在場所にかかわらず、血液、リンパ液、組織液などの体液をも包含して意味するものである。   Here, the “physiologically acceptable solution” means a solution that satisfies the conditions necessary for the living individual and the cells constituting it to survive. Examples of the target organism individuals include microorganisms, animals, and plants, preferably plants and animals, more preferably animals including mammals such as humans, and particularly preferably mammals including humans. The conditions necessary for the survival of mammals including humans and the cells constituting them are not limited, but the salt concentration is in the range of 1-1000 mM, preferably 50-300 mM, pH is 4-10, preferably pH 5- Nine ranges can be illustrated. Moreover, water can be illustrated as a kind of solution. “Physiologically acceptable solution” includes not only artificially prepared solutions but also body fluids such as blood, lymph, and tissue fluids, regardless of where they exist in vivo and in vitro. To do.

ここで「５〜６５℃（または５〜５０℃、５〜４０℃）の範囲に相転移温度を有する」とは、感温性高分子化合物である本発明のカルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩が生理学的に許容される溶液中で不溶化し不溶相を形成する温度と、当該化合物またはその塩が上記溶液中で溶解し溶解相を形成する温度との境界温度が、５〜６５℃（または５〜５０℃、５〜４０℃）の範囲にあることを意味する。つまり「相転移」とは、上記溶液において本発明のカルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩によって形成される不溶相と溶解相との相転移を意味する。   Here, “having a phase transition temperature in the range of 5 to 65 ° C. (or 5 to 50 ° C. or 5 to 40 ° C.)” means that the carbamoylated polyamino acid of the present invention which is a thermosensitive polymer compound or a salt thereof is used. The boundary temperature between the temperature at which the compound or its salt dissolves in the solution and forms a dissolved phase by insolubilization in a physiologically acceptable solution to form an insoluble phase is 5 to 65 ° C. (or 5 ˜50 ° C., 5-40 ° C.). That is, “phase transition” means a phase transition between an insoluble phase and a dissolved phase formed by the carbamoylated polyamino acid of the present invention or a salt thereof in the above solution.

かかる「相転移温度」は、カルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩を少なくとも生理的に許容される許容される溶液、好ましくは少なくとも１ｍＭの塩を含有する水溶液に溶解し、降温させながら石英セル中で５００ｎｍの可視光の透過率を測定し、上記カルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩が完全に溶解しているときの清澄溶液の可視光の透過率を１００％とした場合に、これを降温したときに該透過率が減少し始める温度として求めることができる（例えば、図１参照）。   Such a “phase transition temperature” is obtained by dissolving a carbamoylated polyamino acid or a salt thereof in at least a physiologically acceptable acceptable solution, preferably an aqueous solution containing at least 1 mM salt, and reducing the temperature to 500 nm in a quartz cell. When the visible light transmittance of the clarified solution when the carbamoylated polyamino acid or salt thereof is completely dissolved is 100%, the temperature is lowered. It can be determined as the temperature at which the transmittance begins to decrease (see, for example, FIG. 1).

ここで塩とはKCl, NaCl, CaCl2, MgCl2, KBr, NaBr, Na2SO4, 及びMgSO4等を挙げることができるが、カルバモイル化ポリアミノ酸が、カルバモイル化ポリオルニチン（CPLO）である場合、好適には塩化ナトリウムを挙げることができる。Here KCl the salt, NaCl, CaCl 2, MgCl 2 , KBr, NaBr, Na 2 SO 4, and can be exemplified MgSO 4, etc., carbamoylated polyamino acid is the carbamoylation polyornithine (CPLO) In this case, sodium chloride can be preferably used.

２．感温性分離材
本発明の感温性分離材は、前述するカルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩を有効成分とするものであって、当該有効成分の特性に基づいて、同様に、少なくとも生理学的に許容される溶液中で、５〜６５℃、好ましくは５〜５０℃、より好ましくは５〜４０℃の範囲に相転移温度を有することを特徴とする。 2. Temperature-sensitive separation material The temperature-sensitive separation material of the present invention comprises the aforementioned carbamoylated polyamino acid or a salt thereof as an active ingredient, and based on the properties of the active ingredient, similarly, at least physiologically It is characterized by having a phase transition temperature in the range of 5 to 65 ° C, preferably 5 to 50 ° C, more preferably 5 to 40 ° C in an acceptable solution.

本発明の感温性分離材の相転移温度は、それを溶解する溶媒の種類、溶媒の塩濃度、ｐＨ、溶媒中の分離材の濃度、及び溶媒中の他成分の存在（例えば、アニオン性物質、カチオン性物質、水素結合性物質または疎水結合性物質などの存在及びその量）に応じて変動し得る。しかし、本発明の感温性分離材は、上記するように、カルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩を有し、少なくとも生理学的に許容される溶液中で、５〜６５℃、好ましくは５〜５０℃、より好ましくは５〜４０℃の範囲に相転移温度を有し、当該相転移温度よりも低い温度で不溶相を形成し、当該相転移温度よりも高い温度で溶解相を形成するものである。   The phase transition temperature of the temperature-sensitive separation material of the present invention depends on the type of solvent in which it is dissolved, the salt concentration of the solvent, the pH, the concentration of the separation material in the solvent, and the presence of other components in the solvent (for example, anionic properties). The presence and amount of the substance, the cationic substance, the hydrogen bonding substance or the hydrophobic bonding substance may vary. However, as described above, the temperature-sensitive separating material of the present invention has a carbamoylated polyamino acid or a salt thereof and is at least 5 to 65 ° C, preferably 5 to 50 ° C in a physiologically acceptable solution. More preferably, it has a phase transition temperature in the range of 5 to 40 ° C., forms an insoluble phase at a temperature lower than the phase transition temperature, and forms a dissolved phase at a temperature higher than the phase transition temperature. .

かかる感温性分離材の一例として、有効成分が前述するカルバモイル化ポリアミノ酸（II）のうち、ｐが３であるカルバモイル化ポリオルニチンであって、且つ当該カルバモイル基導入率（カルバモイル化度）が０.８４（n=0.84）以上である化合物またはその塩からなる感温性分離材を挙げることができる。より好ましい感温性分離材としては、ｍが１０以上、より好ましくは３０〜２０００であるカルバモイル化ポリオルニチンである（分子量に換算すると１０００以上、好ましくは３０００〜２０００００）。   As an example of such a temperature-sensitive separating material, the active ingredient is carbamoylated polyornithine in which p is 3 among the carbamoylated polyamino acids (II) described above, and the carbamoyl group introduction rate (degree of carbamoylation) is A temperature-sensitive separation material comprising a compound having a salt content of 0.84 (n = 0.84) or higher or a salt thereof can be used. A more preferable temperature-sensitive separating material is carbamoylated polyornithine in which m is 10 or more, more preferably 30 to 2000 (1000 or more in terms of molecular weight, preferably 3000 to 200000).

当該感温性分離材は、ｐＨ７．５の少なくとも１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する水溶液中で、１０〜４０℃、好ましくは１０〜３５℃の範囲に相転移温度を有し、当該相転移温度よりも低い温度で不溶相を形成し、当該相転移温度よりも高い温度で溶解相を形成する（実験例参照）。   The temperature-sensitive separation material has a phase transition temperature in the range of 10 to 40 ° C., preferably 10 to 35 ° C., in an aqueous solution containing at least 150 mM sodium chloride having a pH of 7.5. From the phase transition temperature, An insoluble phase is formed at a lower temperature, and a dissolved phase is formed at a temperature higher than the phase transition temperature (see Experimental Example).

ここで相転移温度は、前述するように、当該感温性分離材を少なくとも１ｍＭの塩を含有する水溶液に溶解し、降温させながら石英セル中で５００ｎｍの可視光の透過率を測定し、当該分離材が完全に溶解しているときの清澄溶液の可視光の透過率を１００％とした場合に、これを降温したときに該透過率が減少し始める温度として求められる。   Here, as described above, the phase transition temperature is measured by measuring the transmittance of visible light of 500 nm in a quartz cell while dissolving the temperature-sensitive separating material in an aqueous solution containing at least 1 mM salt and lowering the temperature. When the visible light transmittance of the clarified solution when the separating material is completely dissolved is 100%, it is obtained as the temperature at which the transmittance starts decreasing when the temperature is lowered.

ここで塩とはKCl, NaCl, CaCl2, MgCl2, KBr, NaBr, Na2SO4, 及びMgSO4等を挙げることができるが、カルバモイル化ポリアミノ酸が、ｐが３であるカルバモイル化ポリオルニチンである場合、好適には塩化ナトリウムを挙げることができる。Examples of the salt include KCl, NaCl, CaCl 2 , MgCl 2 , KBr, NaBr, Na 2 SO 4 , and MgSO 4, but the carbamoylated polyamino acid is a carbamoylated polyornithine in which p is 3. Is preferably sodium chloride.

上記塩の濃度の濃度としては、上記するように１ｍＭ以上であれば特に制限されない。好ましくは1〜３０００ｍＭであり、より好ましくは５０〜１０００ｍＭである。また、溶液中での感温性分離材の濃度は、カルバモイル化ポリアミノ酸の濃度に換算して、通常０.１ｍｇ/ｍｌ以上、好ましくは０.１〜３００ｍｇ/ｍｌ、より好ましくは０.１〜１００ｍｇ/ｍｌを挙げることができる。   The concentration of the salt is not particularly limited as long as it is 1 mM or more as described above. Preferably it is 1-3000 mM, More preferably, it is 50-1000 mM. Further, the concentration of the temperature-sensitive separating material in the solution is usually 0.1 mg / ml or more, preferably 0.1 to 300 mg / ml, more preferably 0.1, in terms of the concentration of the carbamoylated polyamino acid. ˜100 mg / ml can be mentioned.

また本発明の感温性分離材は、カルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩そのものをそのまま用いるもの（カルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩の単品またはその集合物）であってもよいが、カルバモイル化ポリアミノ酸を構成するアミノ酸残基（モノマー分子）に、分離しようとする被分離物に対して結合性を有するリガンドを、必要に応じてアルキレン基などの任意のリンカーを介して、固定化させた状態で用いることもできる。   The temperature-sensitive separating material of the present invention may be a carbamoylated polyamino acid or a salt thereof as it is (a carbamoylated polyamino acid or a salt alone or an aggregate thereof). A ligand having a binding property to the substance to be separated is immobilized on the constituent amino acid residue (monomer molecule) through an optional linker such as an alkylene group, if necessary. You can also

かかるリガンドとしては、ビオチン又はイミノビオチン（またはアビジンまたはストレプトアビジン）、抗体（または抗原）、分子シャペロン、糖鎖、レクチン、プロテインＡ、プロテインＧ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素（または酵素反応における基質）、受容体（または受容体に対するリガンド（アゴニスト若しくはアンタゴニスト））、競争阻害剤、補酵素等が例示される。   Such ligands include biotin or iminobiotin (or avidin or streptavidin), antibody (or antigen), molecular chaperone, sugar chain, lectin, protein A, protein G, DNA, RNA, enzyme (or substrate in an enzymatic reaction), Examples include receptors (or ligands (agonists or antagonists) for receptors), competitive inhibitors, coenzymes and the like.

カルバモイル化ポリアミノ酸に上記リガンドを結合する方法としては、制限されないが、例えば抗体（または抗原）、酵素または受容体などの蛋白質をリガンドとして結合させる場合、蛋白質にはカルボキシル基とカルバモイル化ポリアミノ酸の側鎖アミノ基との間でペプチド結合を形成させる方法を例示することができる。またリガンドのカルボキシル基をＮ-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）でエステル化して活性化エステル基とし、次いでカルバモイル化ポリアミノ酸の側鎖アミノ基とアミド結合を形成することによっても、リガンドとカルバモイル化ポリアミノ酸を結合させることができる。   The method for binding the ligand to the carbamoylated polyamino acid is not limited. For example, when a protein such as an antibody (or antigen), enzyme, or receptor is bound as a ligand, the protein has a carboxyl group and a carbamoylated polyamino acid. A method of forming a peptide bond with a side chain amino group can be exemplified. The ligand and carbamoylated polyamino acid can also be formed by esterifying the carboxyl group of the ligand with N-hydroxysuccinimide (NHS) to form an activated ester group and then forming an amide bond with the side chain amino group of the carbamoylated polyamino acid. Can be combined.

なお、リンカーとしては、特に制限されないが、前述するように炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜４、より好ましくは炭素数１〜３等の低級アルキレン基を例示することができる。   In addition, although it does not restrict | limit especially as a linker, As mentioned above, C1-C6, Preferably it is C1-C4, More preferably, a C1-C3 lower alkylene group etc. can be illustrated.

感温性分離材と併用するアニオン性物質としては、アニオン基を有する物質であれば特に制限されないが、例えば一価アニオンを有するフルオレセイン（FL）、二価アニオンを有するブロモフェノールブルー（BPB）、四価アニオンを有するトリパンブルー（TB）やエバンスブルー（EB）等のアニオン系色素を挙げることができる。   The anionic substance used in combination with the temperature-sensitive separating material is not particularly limited as long as it is a substance having an anion group. For example, fluorescein (FL) having a monovalent anion, bromophenol blue (BPB) having a divalent anion, Anionic dyes such as trypan blue (TB) and evans blue (EB) having a tetravalent anion can be exemplified.

また、感温性分離材と併用するカチオン性物質としては、カチオン基を有する物質であれば特に制限されないが、例えば、一価カチオンを有するエチジウムブロマイド、二価カチオンを有するプロピジウムアイオダイド、四価カチオンを有するTMPyP(テトラキス(1-メチルピリジニウム-4-イル)ポルフィリンp-トルエンスホナートを挙げることができる。   Further, the cationic substance used in combination with the temperature-sensitive separating material is not particularly limited as long as it is a substance having a cationic group. For example, ethidium bromide having a monovalent cation, propidium iodide having a divalent cation, tetravalent, etc. Mention may be made of TMPyP (tetrakis (1-methylpyridinium-4-yl) porphyrin p-toluenesulfonate having a cation.

本発明の感温性分離材の温度感応性（感温性）は可逆的であり、溶解と不溶化の繰返し変化によってもその温度感応性は保持されることが好ましい。   The temperature sensitivity (temperature sensitivity) of the temperature-sensitive separating material of the present invention is reversible, and it is preferable that the temperature sensitivity is maintained even by repeated changes in dissolution and insolubilization.

３．感温性分離材の用途
本発明の感温性分離材は、上記特性を利用することができる種々の用途や用法に適用することができる。例えば、水性二相分配法における分離・濃縮剤（後述（3-1）参照）、薬物放出剤における基材（薬物放出基材）（後述（3-3）参照）、ドラッグデリバリーシステムにおける運搬体（ドラッグデリバリーシステムキャリアー）、酵素や抗体を固定化するための担体（後述（3-2）参照）、細胞培養基材、光機能材料、センシング基材、として用いることができる。なお、当然ながら感温性分離材として、本発明のカルバモイル化ポリアミノ酸（II）またはその塩そのものを使用することもできる。以下の「感温性分離材」という用語は、「カルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩そのもの」を包含する意味で用いられる。 3. Uses of temperature-sensitive separation material The temperature-sensitive separation material of the present invention can be applied to various uses and usages in which the above characteristics can be utilized. For example, separation / concentration agent in aqueous two-phase distribution method (see (3-1) below), base material in drug release agent (base material for drug release) (see below (3-3)), carrier in drug delivery system (Drug delivery system carrier), carrier for immobilizing enzymes and antibodies (see (3-2) described later), cell culture substrate, optical functional material, sensing substrate. Of course, the carbamoylated polyamino acid (II) of the present invention or a salt thereof can be used as the temperature-sensitive separating material. The term “thermosensitive separating material” below is used to include “carbamoylated polyamino acid or a salt thereof”.

例えば、本発明の感温性分離材を、細胞培養基材またはその成分として用いる場合、それを当該感温性分離材の相転移温度よりも低い温度に設定して不溶相の状態で細胞を培養し、次いでそれを相転移温度よりも高い温度に調整して溶解相にすることで、液体化して細胞を回収することができる。例えば、本発明の感温性分離材を、ｐＨ変化や塩濃度変化に応答するセンサーの基材（センシング基材）として用いる場合、ｐＨや塩濃度変化を伴う生体内での反応を測定することが可能である。   For example, when the temperature-sensitive separation material of the present invention is used as a cell culture substrate or a component thereof, the cells are set in an insoluble phase by setting it to a temperature lower than the phase transition temperature of the temperature-sensitive separation material. By culturing and then adjusting it to a temperature higher than the phase transition temperature to make it a lysis phase, the cells can be recovered by liquefaction. For example, when the temperature-sensitive separation material of the present invention is used as a sensor base material (sensing base material) that responds to changes in pH or salt concentration, the reaction in vivo accompanying changes in pH or salt concentration is measured. Is possible.

（3-1）水性二相分配法
水性二相分配法は、本発明の感温性分離材を分離剤または濃縮剤として用いることにより実施することができる。具体的には、水性二相分配法は、本発明の感温性分離材を溶解した水性溶媒の温度を、当該感温性分離材の相転移温度より低くした際に形成されるコアセルベート層と水層に対する被分離物の親和性の差を利用して、被分離物を分離し濃縮する方法である。分離しようとする被分離物を含む試料（被分離試料）を、まず感温性分離材を溶解した水性溶媒に当該感性分離材の相転移温度より高い温度条件下で溶解させ、次いでこの温度を相転移温度より低い温度にすることでコアセルベート層及び水層を形成する。斯くして、被分離物はコアセルベート層及び水層に対する親和性の差によってどちらかの層により多く分配される。そこで、被分離物が分配された層から、当該被分離物を回収する。所望により、この操作を繰り返すことにより被分離物の回収率を増加することができる。 (3-1) Aqueous two-phase distribution method The aqueous two-phase distribution method can be carried out by using the temperature-sensitive separation material of the present invention as a separating agent or a concentrating agent. Specifically, the aqueous two-phase distribution method includes a coacervate layer formed when the temperature of the aqueous solvent in which the temperature-sensitive separating material of the present invention is dissolved is lower than the phase transition temperature of the temperature-sensitive separating material. This is a method of separating and concentrating the separated object by utilizing the difference in affinity of the separated object with respect to the aqueous layer. First, a sample containing a substance to be separated (separated sample) is dissolved in an aqueous solvent in which the temperature-sensitive separation material is dissolved under a temperature condition higher than the phase transition temperature of the sensitive separation material. The coacervate layer and the aqueous layer are formed by setting the temperature lower than the phase transition temperature. Thus, the separation is distributed more in either layer due to the difference in affinity for the coacervate layer and the aqueous layer. Therefore, the separation object is recovered from the layer to which the separation object is distributed. If desired, the recovery rate of the separation object can be increased by repeating this operation.

当該水性二相分配法は、特にコアセルベート層を形成する本発明の感温性分離材に対して親和性を有する被分離物の分離及び濃縮に好適に使用される。   The aqueous two-phase distribution method is particularly preferably used for separation and concentration of an object to be separated having an affinity for the temperature-sensitive separation material of the present invention that forms a coacervate layer.

具体的には、本発明において、水性二相分配法は、被分離物を含む試料（被験試料）と本発明の感温性分離材とを、生理学的に許容される溶液中に共存させ、次いで、当該溶液の温度を当該感温性分離材の相転移温度より高い温度から低い温度にすることによって実施することができる。本発明の感温性分離材に親和性を有する被分離物は、当該感温性分離材から形成されるコアセルベート層に分配されるため、当該コアセルベート層を、遠心により沈降させるかまたは透析すること等により濃縮することで、被験試料から被分離物を分離することができる。ここで塩としては、塩化ナトリウムや塩化カルシウムなどを例示することができるが、これに限定されない。他の塩としては、例えばKCL, NACL, MGCL2, KBr, NaBr, Na2SO4, MgSO4等を例示することができる。感温性分離材として、カルバモイル化ポリオルニチンまたはその塩そのものまたはそれを有効成分とする組成物を用いる場合、好ましい塩は塩化ナトリウムである。Specifically, in the present invention, the aqueous two-phase partitioning method comprises a sample containing a substance to be separated (test sample) and the temperature-sensitive separation material of the present invention in a physiologically acceptable solution, Subsequently, it can implement by making the temperature of the said solution into temperature lower than the temperature higher than the phase transition temperature of the said thermosensitive separation material. Since the substance to be separated having affinity for the temperature-sensitive separation material of the present invention is distributed to the coacervate layer formed from the temperature-sensitive separation material, the coacervate layer is sedimented by centrifugation or dialyzed. By concentrating by, for example, the separation object can be separated from the test sample. Examples of the salt include sodium chloride and calcium chloride, but are not limited thereto. Other salts can for example KCL, NACL, MGCL 2, KBr , NaBr, be exemplified Na 2 SO 4, MgSO 4, and the like. When a carbamoylated polyornithine or a salt thereof or a composition containing it as an active ingredient is used as the temperature-sensitive separating material, a preferred salt is sodium chloride.

被分離物の一例としては、タンパク質、細胞、水素結合性物質、疎水結合性物質、アニオン性物質、カチオン性物質などを挙げることができる。水素結合性物質としては、ＲＮＡやＤＮＡ等の核酸、またはアンチセンス核酸、siRNA、miRNA、リボザイム、RNAアプタマーなどの核酸誘導体を、また疎水結合性物質としてはパクリタキセル等の抗がん剤、またはカーボンナノチューブなどを例示することができる。   Examples of the separation object include proteins, cells, hydrogen bonding substances, hydrophobic bonding substances, anionic substances, and cationic substances. Examples of hydrogen-bonding substances include nucleic acids such as RNA and DNA, or nucleic acid derivatives such as antisense nucleic acids, siRNA, miRNA, ribozyme, and RNA aptamer. Hydrophobic substances include anticancer agents such as paclitaxel, or carbon. A nanotube etc. can be illustrated.

尚、水性二相分配法に適用される感温性分離材は、カルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩そのものを有効成分とするものであってもよいし、また分離しようとする被分離物と結合性を有するリガンドを、カルバモイル化ポリアミノ酸を構成するアミノ酸残基（モノマー分子）に、必要に応じてアルキレン基などの任意のリンカーを介して固定化したものを有効成分とするものであってもよい。   The temperature-sensitive separation material applied to the aqueous two-phase partitioning method may contain a carbamoylated polyamino acid or a salt thereof as an active ingredient, and may bind to an object to be separated. An active ingredient may be obtained by immobilizing a ligand having an amino acid residue (monomer molecule) constituting a carbamoylated polyamino acid via an optional linker such as an alkylene group, if necessary. .

かかるリガンドとしては、前述するように、ビオチン又はイミノビオチン（またはアビジンまたはストレプトアビジン）、抗体（または抗原）、分子シャペロン、糖鎖、レクチン、プロテインＡ、プロテインＧ、DNA、RNA、酵素（酵素反応における基質）、受容体（受容体に対するリガンド（アゴニスト・アンタゴニスト）、競争阻害剤、補酵素等が例示される。上記特異的な相互作用を行うことが知られている一組の具体例としては、抗原−抗体、酵素−基質（阻害剤）、各種の生理活性物質−受容体、ビオチン又はイミノビオチン−アビジンまたはストレプトアビジン、ＤＮＡ−ＤＮＡ（ＲＮＡ）等が挙げられる。これらの組は、天然分子同士に限らず、合成分子−天然分子、合成分子−合成分子も包含される。また、相互作用としては、静電相互作用、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用等の単独乃至組み合わせが挙げられる。   As described above, as described above, biotin or iminobiotin (or avidin or streptavidin), antibody (or antigen), molecular chaperone, sugar chain, lectin, protein A, protein G, DNA, RNA, enzyme (enzymatic reaction) Substrate), receptor (ligand (agonist / antagonist) for the receptor, competitive inhibitor, coenzyme, etc.) As a set of specific examples known to perform the above specific interaction, , Antigen-antibody, enzyme-substrate (inhibitor), various physiologically active substances-receptors, biotin or iminobiotin-avidin or streptavidin, DNA-DNA (RNA), etc. These groups are natural molecules. In addition to each other, synthetic molecules-natural molecules, synthetic molecules-synthetic molecules are also included. Electrostatic interaction, hydrophobic interactions, hydrogen bonds, and a single or combination of van der Waals, or like interactions.

本発明の水性二相分配法は、好ましくは５〜３６℃といった比較的低温域に相転移温度を有する温度感応性分離材を分離・濃縮剤として用いることができる方法であるため、微生物や細胞培養の生体物等のバイオプロダクトや、酵素や抗体や生理活性物質などタンパク質などを被分離物とするバイオセパレーションに好適に使用することができる。   The aqueous two-phase partitioning method of the present invention is preferably a method in which a temperature-sensitive separation material having a phase transition temperature in a relatively low temperature range of 5 to 36 ° C. can be used as a separation / concentration agent. It can be suitably used for bio-products such as living organisms in culture and bio-separation in which proteins such as enzymes, antibodies and physiologically active substances are separated.

（3-2）酵素または抗体の固定化基材、それを用いた反応方法
また本発明の感温性分離材は、酵素または抗体の固定化基材（固相）として用いることができ、これに酵素または抗体を固定化することにより、固定化酵素または固定化抗体を調製し、提供することができる。 (3-2) Immobilization substrate for enzyme or antibody, reaction method using the same , or thermosensitive separation material of the present invention can be used as an immobilization substrate (solid phase) for enzyme or antibody. An immobilized enzyme or an immobilized antibody can be prepared and provided by immobilizing an enzyme or an antibody on the substrate.

かかる固定化酵素及び固定化抗体は、イムノアッセイ法等の被験物質（タンパク質等）の定性または定量分析、タンパク質の精製、バイオリアクター構築のための有力な材料となる。この場合、カルバモイル化ポリアミノ酸（II）またはその塩としては、これを構成するアミノ酸残基（モノマー分子）に酵素に対して結合性を有するリガンドを、必要に応じてリンカーを介して固定化したものを用いることが好ましい。かかるリガンドとしては、前述するように、ビオチン又はイミノビオチンを好適に例示することができる。   Such immobilized enzymes and immobilized antibodies are effective materials for qualitative or quantitative analysis of test substances (proteins, etc.) such as immunoassay methods, protein purification, and bioreactor construction. In this case, as a carbamoylated polyamino acid (II) or a salt thereof, a ligand having an enzyme binding property to an amino acid residue (monomer molecule) constituting the carbamoylated polyamino acid (II) is immobilized via a linker as necessary. It is preferable to use one. As the ligand, biotin or iminobiotin can be preferably exemplified as described above.

固定化酵素は、本発明の感温性分離材（酵素固定化基材）に酵素を化学的に固定化することにより調製することができる。酵素の固定化方法としては、上記２で説明したカルバモイル化ポリアミノ酸（II）またはその塩にリガンド（酵素）を結合する方法を同様に用いることができる。斯くして調製した固定化酵素を、少なくとも生理学的に許容される溶液中において、その温度を感温性分離材の相転移温度より低い温度に設定することで酵素を固定化した感温性分離材（固定化酵素）を不溶相として相分離しておく。そして、必要に応じて、温度やｐＨ等を変化させて相転移温度より高い温度にすることで、固定化酵素を、基質を含む水溶液と相溶化することで、酵素反応を開始させることができる。   The immobilized enzyme can be prepared by chemically immobilizing the enzyme on the temperature-sensitive separation material (enzyme immobilization substrate) of the present invention. As an enzyme immobilization method, the method of binding a ligand (enzyme) to the carbamoylated polyamino acid (II) or a salt thereof described in 2 above can be used in the same manner. The temperature-sensitive separation in which the enzyme is immobilized by setting the temperature of the immobilized enzyme thus prepared to a temperature lower than the phase transition temperature of the temperature-sensitive separation material in at least a physiologically acceptable solution. The material (immobilized enzyme) is phase-separated as an insoluble phase. And if necessary, the enzyme reaction can be started by making the immobilized enzyme compatible with the aqueous solution containing the substrate by changing the temperature, pH, etc. to a temperature higher than the phase transition temperature. .

また固定化抗体も、本発明の感温性分離材（抗体固定化基材）に抗体を化学的に固定化することにより調製することができる。抗体の固定化方法としては、上記２で説明したカルバモイル化ポリアミノ酸（II）にリガンド（抗体）を結合する方法を同様に用いることができる。斯くして調製した固定化抗体を、少なくとも生理学的に許容される溶液であって上記抗体の抗原を含む溶液中において、その温度を感温性分離材の相転移温度より低い温度に設定することで抗体を固定化した感温性分離材（固定化抗体）を不溶相として相分離しておく。そして、必要に応じて、温度やｐＨ等を変化させて相転移温度より高い温度にすることで、固定化抗体を、抗原を含む水溶液と相溶化することで、抗原抗体反応を開始させることができる。また、抗体に代えてその抗原を感温性分離材に固定化して、水溶液に当該抗体の抗原を配合して、抗原抗体反応を行うこともできる。   An immobilized antibody can also be prepared by chemically immobilizing an antibody on the temperature-sensitive separation material (antibody-immobilized substrate) of the present invention. As a method for immobilizing an antibody, the method of binding a ligand (antibody) to the carbamoylated polyamino acid (II) described in 2 above can be similarly used. The immobilized antibody thus prepared is set to a temperature lower than the phase transition temperature of the thermosensitive separation material in at least a physiologically acceptable solution containing the antigen of the antibody. The temperature-sensitive separation material (immobilized antibody) on which the antibody is immobilized in (1) is phase-separated as an insoluble phase. And if necessary, the antigen-antibody reaction can be initiated by compatibilizing the immobilized antibody with an aqueous solution containing the antigen by changing the temperature or pH to a temperature higher than the phase transition temperature. it can. Alternatively, an antigen-antibody reaction can be performed by immobilizing the antigen in place of the antibody on a temperature-sensitive separation material and mixing the antigen of the antibody in an aqueous solution.

（3-3）薬物放出剤、薬物放出方法
また本発明によれば、上記感温性分離材を薬物と組み合わせることで薬物放出剤を提供することができる。当該薬物放出剤は、本発明の感温性分離材をいわゆるドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）のキャリアー（薬物の担持体）として用いるもので、本発明の感温性分離材と任意の薬物との組み合わせからなる。本発明の薬物放出剤は、本発明の感温性分離材が生理学的条件下で温度を制御することで可逆的に溶解及び不溶化し（相転移）、これに伴ってコアセルベートが消失したり形成したりするという特性を、薬物の放出及び保持の制御に応用したものである。本発明の薬物放出剤は、必要なときに必要なだけ薬物を投与しようというインテリゼント化製剤（インテリゼントＤＤＳ）に好適に用いられる。 (3-3) Drug-releasing agent, drug-releasing method and according to the present invention, a drug-releasing agent can be provided by combining the temperature-sensitive separating material with a drug. The drug-releasing agent uses the temperature-sensitive separation material of the present invention as a carrier (drug carrier) of a so-called drug delivery system (DDS), and is a combination of the temperature-sensitive separation material of the present invention and an arbitrary drug. Consists of. The drug-releasing agent of the present invention is reversibly dissolved and insolubilized (phase transition) by controlling the temperature of the temperature-sensitive separation material of the present invention under physiological conditions, and the coacervate disappears or forms accordingly. Is applied to the control of drug release and retention. The drug-releasing agent of the present invention is suitably used for an intelligent preparation (intelligent DDS) in which a drug is to be administered as needed when necessary.

本発明の薬物放出剤において、本発明の感温性分離材に各種薬物（例えば、アドレアマイシン、タキソール等の各種の抗ガン剤等）を担持または結合させる手段は、感温性分離材の水性溶液を、温度や濃度等の制御下で感温性分離材と所望の薬物を接触させる方法が挙げられる。具体的には、本発明の感温性分離材と各種薬物を、少なくとも生理学的に許容される溶液中で共存させ、当該溶液の温度等を制御することで、感温性分離材の相転移温度よりも低い温度にすることで、本発明の感温性分離材に各種薬物を担持または結合させることができる。次いで、温度等を制御することで、感温性分離材の相転移温度よりも高い温度にすることで、薬物放出剤の温度感応性分離材から各種薬物を放出させることができる。   In the drug release agent of the present invention, the means for supporting or binding various drugs (for example, various anticancer agents such as adreamycin, taxol, etc.) to the temperature-sensitive separation material of the present invention is an aqueous solution of the temperature-sensitive separation material. Examples thereof include a method in which a solution is brought into contact with a desired drug under the control of temperature, concentration and the like. Specifically, the temperature-sensitive separation material of the present invention and various drugs are allowed to coexist in at least a physiologically acceptable solution, and the phase of the temperature-sensitive separation material is controlled by controlling the temperature of the solution. By setting the temperature lower than the temperature, various drugs can be supported or bonded to the temperature-sensitive separation material of the present invention. Next, by controlling the temperature and the like, the various drugs can be released from the temperature sensitive separating material of the drug releasing agent by setting the temperature higher than the phase transition temperature of the temperature sensitive separating material.

この場合、感温性分離材として、カルバモイル化ポリアミノ酸（II）またはその塩をそのまま使用してもよいし、また前述するリガンドを、必要に応じてリンカーを介して固定化したカルバモイル化ポリアミノ酸（II）またはその塩を用いてもよい。   In this case, the carbamoylated polyamino acid (II) or a salt thereof may be used as it is as the temperature-sensitive separating material, and the above-mentioned ligand is immobilized via a linker as necessary. (II) or a salt thereof may be used.

また、本発明の薬物放出剤において、薬物を感温性分離材に担持または結合させる態様としては、好ましくは相転移温度よりも低い温度にすることで感温性分離材から形成されるコアセルベート層の内部または表面に、薬物を結合させる方法を挙げることができる。また、本発明の薬物放出剤は、薬物を感温性分離材に担持または結合させた状態で、更にカプセル、スポンジ、ゲル、リポソーム等の基材に収容または担持させる等、二次的な処理が施されていても良い。この場合も、温度等を制御することで、感温性分離材の相転移温度よりも高い温度にすることで、薬物放出剤の感温性分離材から形成されたコアセルベート層から各種薬物を放出させることができる。   In the drug release agent of the present invention, as a mode in which the drug is supported or bonded to the temperature-sensitive separation material, the coacervate layer formed from the temperature-sensitive separation material is preferably set to a temperature lower than the phase transition temperature. A method of binding a drug to the inside or the surface of can be mentioned. In addition, the drug release agent of the present invention is a secondary treatment such that the drug is supported on or bonded to a temperature-sensitive separation material, and further contained or supported on a substrate such as a capsule, sponge, gel, or liposome. May be given. In this case as well, various drugs are released from the coacervate layer formed from the temperature-sensitive separating material of the drug releasing agent by controlling the temperature etc. to a temperature higher than the phase transition temperature of the temperature-sensitive separating material. Can be made.

なお、本発明の薬物放出剤の投与形態も任意であり、その剤形により適宜選択される。例えば、経口剤、貼付剤、注射剤、点滴、坐剤等の剤形に応じて、経口投与、経皮投与、静脈内または筋肉内投与、及び直腸投与などが挙げられる。   In addition, the dosage form of the drug releasing agent of the present invention is also arbitrary, and is appropriately selected depending on the dosage form. For example, oral administration, transdermal administration, intravenous or intramuscular administration, and rectal administration may be mentioned depending on the dosage form such as oral preparation, patch, injection, infusion, suppository and the like.

水性二相分配法、酵素の固定化、薬物放出剤等において、標的物質や目的物の本発明の感温性分離材に対する結合は、イオンコンプレックスや電荷移動錯体を利用した結合、生化学的親和性等を利用した結合が好ましい。本発明の感温性分離材に結合した標的物質または目的物は、例えば、塩濃度制御、ｐＨ制御、阻害剤、基質等の制御、尿素、ＳＤＳなどの変性剤の制御、有機溶媒、金属イオンなどの制御、温度制御などの方法を適宜選定乃至組み合わせることにより結合強度を制御し、ひいては分配率、反応速度、薬物放出速度等を制御することができる。また、種々のリガンドの感温性分離材への固定化は、感温性分離材の繰返し再現性を保持するには共有結合であることが好ましいが、イオンコンプレックスや電荷移動錯体を利用した結合、生化学的親和性等を利用した結合であってもよい。   In aqueous two-phase partitioning method, enzyme immobilization, drug release agent, etc., the binding of target substance or target substance to the thermosensitive separation material of the present invention is binding using ion complex or charge transfer complex, biochemical affinity, etc. Bonding using is preferred. The target substance or target substance bound to the temperature-sensitive separation material of the present invention includes, for example, salt concentration control, pH control, control of inhibitors, substrates, etc., control of denaturing agents such as urea and SDS, organic solvents, metal ions The bond strength can be controlled by appropriately selecting or combining methods such as control, temperature control, etc., and thus the distribution rate, reaction rate, drug release rate, and the like can be controlled. In addition, immobilization of various ligands to the temperature-sensitive separation material is preferably a covalent bond in order to maintain the reproducibility of the temperature-sensitive separation material, but binding using an ion complex or a charge transfer complex. Alternatively, binding utilizing biochemical affinity may be used.

以下、製造例及び実験例を挙げて本発明の構成及び効果をより明確に説明する。但し、本発明はこれらの製造例及び実験例によって何ら制限されるものではない。   Hereinafter, the configuration and effects of the present invention will be described more clearly with reference to production examples and experimental examples. However, the present invention is not limited by these production examples and experimental examples.

製造例１
ポリアミノ酸としてポリ−Ｌ−オルニチン（Sigma社製）１００ｍｇをスクリュー管ビンに入れ、１Ｍイミダゾール緩衝液（ｐＨ７）１ｍｌに溶解し、５０℃に加熱し、これにシアン酸カリウム30.8〜46.2mｇ（オルニチン残基１モルに対して0.8〜1.2モル）を水１ｍLに溶解した液を適下して全量を３ｍｌにした。これを５０℃で２４時間、撹拌した。反応終了後、透析膜（MWCO：3,500）を用いて、室温で水（２回）、１％ＴＦＡ水溶液（１回）、及び水（２回）に対して透析して、副生した塩化カリウムを除き、凍結乾燥を行った。なお、ここではポリ−Ｌ−オルニチンとして、分子量が３×１０４のもの（式（Ｉ）中のｍが153のもの）を使用した（以下、これを「PLO-30K」ともいう）。 Production Example 1
100 mg of poly-L-ornithine (manufactured by Sigma) as a polyamino acid is placed in a screw tube bottle, dissolved in 1 ml of 1M imidazole buffer (pH 7), heated to 50 ° C., and 30.8 to 46.2 mg of potassium cyanate (ornithine) A solution obtained by dissolving 0.8 to 1.2 mol) in 1 mL of water with respect to 1 mol of the residue was appropriately adjusted to 3 ml. This was stirred at 50 ° C. for 24 hours. After completion of the reaction, by using dialysis membrane (MWCO: 3,500) and dialyzing against water (twice), 1% TFA aqueous solution (twice) and water (twice) at room temperature, by-produced potassium chloride The lyophilization was performed. Here, poly-L-ornithine having a molecular weight of 3 × 10 4 (m in formula (I) being 153) was used (hereinafter also referred to as “PLO-30K”).

凍結乾燥した高分子化合物（カルバモイル化ポリ−Ｌ−オルニチン：以下、「CPLO-30K」ともいう）１０ｍｇを０.１％ ＮａＯＤを含む重水中に加え、６０℃にて１Ｈ−ＮＭＲを測定し、カルバモイル基の導入率（カルバモイル化度）を決定した。１Ｈ−ＮＭＲ測定データの一例として、図２に、ポリ−Ｌ−オルニチン（PLO-30K）とカルバモイル化ポリ−Ｌ−オルニチン（CPLO-30K）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。カルバモイル化度は、約２.６ppm（カルバモイル化されていないメチレンのプロトンピーク：図２において「δ」として示す) と３.１ppm（カルバモイル化されたメチレンのプロトンピーク：図２において「δ’」として示す）のピークの面積比により、下式に従って算出した。
[数１]
カルバモイル化度（％）＝（δ’ / (δ+δ’) ) × １００％ 。10 mg of freeze-dried polymer compound (carbamoylated poly-L-ornithine: hereinafter also referred to as “CPLO-30K”) was added to heavy water containing 0.1% NaOD, and 1 H-NMR was measured at 60 ° C. The carbamoyl group introduction rate (carbamoylation degree) was determined. As an example of 1 H-NMR measurement data, FIG. 2 shows 1 H-NMR spectra of poly-L-ornithine (PLO-30K) and carbamoylated poly-L-ornithine (CPLO-30K). The degree of carbamoylation is about 2.6 ppm (proton peak of non-carbamoylated methylene: shown as “δ” in FIG. 2) and 3.1 ppm (proton peak of carbamoylated methylene: “δ ′” in FIG. 2). The peak area ratio was calculated according to the following formula.
[Equation 1]
Degree of carbamoylation (%) = (δ ′ / (δ + δ ′)) × 100%.

その結果を表２に示す。なお、カルバモイル化度をもとにサンプルコードを付けた。     The results are shown in Table 2. A sample code was attached based on the degree of carbamoylation.

Figure 2012165356
Figure 2012165356

製造例２
ポリアミノ酸として、分子量が３.０×１０４のポリ−Ｌ−オルニチン「PLO-30K」に代えて、分子量が１．５×１０５のポリ−Ｌ−オルニチン（Sigma社製）（式（II）中のｍが７６９のもの；以下、これを「PLO-150K」ともいう）を用いて、これを製造例１と同様に、種々の割合でシアン酸カリウムと反応させて（表２参照）、カルバモイル化ポリ−Ｌ−オルニチン（CPLO-150Kシリーズ）を製造した。そして、製造例１に記載する方法で、各カルバモイル化ポリ−Ｌ−オルニチンについてカルバモイル化度を求めた。 Production Example 2
As a polyamino acid, instead of poly-L-ornithine “PLO-30K” having a molecular weight of 3.0 × 10 4 , poly-L-ornithine having a molecular weight of 1.5 × 10 5 (manufactured by Sigma) (formula (II ) In which m is 769; hereinafter, this is also referred to as “PLO-150K”), and this is reacted with potassium cyanate in various proportions as in Production Example 1 (see Table 2). Carbamoylated poly-L-ornithine (CPLO-150K series) was produced. And the carbamoylation degree was calculated | required by the method described in manufacture example 1 about each carbamoylated poly-L-ornithine.

その結果を表３に示す。   The results are shown in Table 3.

Figure 2012165356
Figure 2012165356

製造例３
ポリアミノ酸としてポリ−ＤＬ−オルニチン（Mw = 30,000、Sigma社製）１００ｍｇをスクリュー管ビンに入れ、１Ｍイミダゾール緩衝液（ｐＨ７）１ｍｌに溶解し、５０℃に加熱し、これにシアン酸カリウムを、上記ポリ−ＤＬ−オルニチンのアミノ基に対して１.５等量となるように水に溶解して調製した水溶液を適下して全量を３ｍｌにした。これを５０℃で２４時間、撹拌した。反応終了後、透析膜（MWCO：3,500）を用いて、室温で水（２回）、１％ＴＦＡ水溶液（１回）、及び水（２回）に対して透析して、副生した塩化カリウムを除き、凍結乾燥を行った。なお、ここではポリ−ＤＬ−オルニチンとして、分子量が３×１０４のもの（式（Ｉ）中のｍが153のもの）を使用した。 Production Example 3
100 mg of poly-DL-ornithine (Mw = 30,000, manufactured by Sigma) as a polyamino acid was placed in a screw tube bottle, dissolved in 1 ml of 1M imidazole buffer (pH 7), heated to 50 ° C., and potassium cyanate was added thereto. An aqueous solution prepared by dissolving in water so as to be 1.5 equivalents with respect to the amino group of the poly-DL-ornithine was appropriately adjusted to a total volume of 3 ml. This was stirred at 50 ° C. for 24 hours. After completion of the reaction, by using dialysis membrane (MWCO: 3,500) and dialyzing against water (twice), 1% TFA aqueous solution (twice) and water (twice) at room temperature, by-produced potassium chloride The lyophilization was performed. Here, poly-DL-ornithine having a molecular weight of 3 × 10 4 (m in formula (I) is 153) was used.

そして、製造例１に記載する方法で、カルバモイル化ポリ−ＤＬ−オルニチン（以下、これを「CPDLO-30K-95」ともいう）についてカルバモイル化度を求めた。   Then, the degree of carbamoylation of carbamoylated poly-DL-ornithine (hereinafter also referred to as “CPDLO-30K-95”) was determined by the method described in Production Example 1.

その結果を表４に示す。   The results are shown in Table 4.

Figure 2012165356
Figure 2012165356

実験例１
製造例１において調製したCPLO-30K-93を、生理的緩衝液（10mM Hepes-NaOH (pH7.5)＋150mM NaCl in water）に１mg/ml濃度になるように溶解した。次いで、かかるCPLO-30K-93溶液を石英セルに入れ、溶液温度を70〜5℃の範囲で変化させ、その間の溶液の500nm波長における透過率(％)を紫外可視分光光度計によって測定した。なお、溶液の透過率％は下式から算出した。 Experimental example 1
CPLO-30K-93 prepared in Production Example 1 was dissolved in a physiological buffer (10 mM Hepes-NaOH (pH 7.5) +150 mM NaCl in water) to a concentration of 1 mg / ml. Next, the CPLO-30K-93 solution was put in a quartz cell, the solution temperature was changed in the range of 70 to 5 ° C., and the transmittance (%) at a wavelength of 500 nm of the solution was measured with an ultraviolet-visible spectrophotometer. In addition, the transmittance | permeability% of the solution was computed from the following formula.

[数２]
透過率（%） = 10 (- 吸光度) 。[Equation 2]
Transmittance (%) = 10 (-absorbance) .

結果を図３に示す。図３から分かるように、CPLO-30K-93は、生理学的低塩濃度の水溶液中で、約１８℃（相転移温度）を境界にしてそれよりも低い温度域では不溶化し、それよりも高い温度域では可溶化すること、つまり高温溶解型（上限臨界共溶温度型）の感温性高分子化合物であることが確認された。またこの相転移はシャープで可逆的であった。   The results are shown in FIG. As can be seen from FIG. 3, CPLO-30K-93 is insolubilized at a temperature lower than about 18 ° C. (phase transition temperature) in an aqueous solution with a physiologically low salt concentration, and higher than that. It was confirmed that it was solubilized in the temperature range, that is, it was a high temperature dissolution type (upper critical solution temperature type) temperature sensitive polymer compound. This phase transition was sharp and reversible.

また１８℃未満の低温条件下で不溶化状態にあるCPLO-30K-93を、10000rpmで３分間遠心分離することでCPLO-30K-93を沈殿させることができた。このことから、本発明のカルバモイル化ポリアミノ酸によれば、例えば、細胞やタンパク質などの生物材料や生理活性物質のように高温で失活または変性する物質を、生理学的な低温条件で活性を維持しながら、分離（バイオセパレーション）、捕捉または濃縮することが可能である。また本発明のカルバモイル化ポリアミノ酸は上記相転移温度以上にすることで可逆的に可溶化するため、それよりも低い温度条件下で捕捉または濃縮した物質は、その相転移温度以上に加温することで、当該高分子化合物から離脱させて回収することも可能である。すなわち、本発明のカルバモイル化ポリアミノ酸は、バイオセパレーションの材料（分離・濃縮剤）として有効に利用することができる。   Further, CPLO-30K-93 was precipitated by centrifuging CPLO-30K-93, which was insolubilized under a low temperature condition of less than 18 ° C., at 10000 rpm for 3 minutes. Therefore, according to the carbamoylated polyamino acid of the present invention, for example, biological materials such as cells and proteins, and substances that are deactivated or denatured at high temperatures, such as biologically active substances, remain active under physiological low temperature conditions. However, it is possible to separate (bioseparation), capture or concentrate. In addition, since the carbamoylated polyamino acid of the present invention is reversibly solubilized by raising the temperature to the above-mentioned phase transition temperature or higher, a substance captured or concentrated under a lower temperature condition is heated to the phase transition temperature or higher. Thus, it is possible to recover from the polymer compound. That is, the carbamoylated polyamino acid of the present invention can be effectively used as a bioseparation material (separation / concentration agent).

実験例２
実験例１と同様に、製造例３で調製したカルバモイル化ポリアミノ酸（CPDLO-30K-95）の相転移温度を調べた。 Experimental example 2
Similarly to Experimental Example 1, the phase transition temperature of the carbamoylated polyamino acid (CPDLO-30K-95) prepared in Production Example 3 was examined.

具体的には、カルバモイル化ポリオルニチン（CPDLO-30K-95）を、生理的緩衝液（10mM Hepes-NaOH (pH7.5)＋150mM NaCl）に、5mg/ml濃度になるように溶解した。次いで、かかる溶液を石英セルに入れ、溶液温度を40℃から5℃までの範囲で、1℃／分の速度で温度を下げながら、500nmにおける吸光度をUV-VIS分光光度計（吸光光度計）で測定し、実験例１と同様にして当該吸光度から透過率％を求めた。   Specifically, carbamoylated polyornithine (CPDLO-30K-95) was dissolved in a physiological buffer (10 mM Hepes-NaOH (pH 7.5) +150 mM NaCl) to a concentration of 5 mg / ml. The solution is then placed in a quartz cell, and the absorbance at 500 nm is measured with a UV-VIS spectrophotometer (absorptiometer) while the temperature of the solution is lowered from 40 ° C to 5 ° C at a rate of 1 ° C / min. The transmittance% was obtained from the absorbance in the same manner as in Experimental Example 1.

結果を図４に示す。図４に示すように、カルバモイル化度が95％（n=0.95）であるCPDLO-30K-95（5mg/mL）は、生理学的低塩濃度の水溶液中で、約１０.３℃（相転移温度）を境界にしてそれよりも低い温度域では不溶化し、それよりも高い温度域では可溶化すること、つまり高温溶解型（上限臨界共溶温度型）の感温性高分子化合物であることが確認された。またこの相転移はシャープで可逆的であった。   The results are shown in FIG. As shown in FIG. 4, CPDLO-30K-95 (5 mg / mL) having a carbamoylation degree of 95% (n = 0.95) is about 10.3 ° C. (phase transition) in a physiologically low salt aqueous solution. It is a temperature-sensitive polymer compound that is insoluble in a temperature range lower than that at the temperature) and solubilized in a temperature range higher than that, that is, a high-temperature soluble type (upper critical solution temperature type). Was confirmed. This phase transition was sharp and reversible.

この結果からわかるように、ポリ（L−アミノ酸）をカルバモイル化したポリアミノ酸のみならず、ポリ（DL−アミノ酸）をカルバモイル化したポリアミノ酸についても、生理的条件（10mM Hepes-NaOH (pH7.5)＋150mM NaCl）下で、１０〜３５℃の範囲に相転移温度を有する高温溶解型の挙動を示す。   As can be seen from these results, not only poly (L-amino acid) carbamoylated polyamino acid but also poly (DL-amino acid) carbamoylated polyamino acid, physiological conditions (10 mM Hepes-NaOH (pH 7.5 ) +150 mM NaCl), exhibiting a high-temperature dissolution type behavior having a phase transition temperature in the range of 10 to 35 ° C.

実験例３
製造例１で調製したカルバモイル化ポリアミノ酸（CPLO-30K-88、CPLO-30K-93）について、相転移温度に対するCPLO-30Kの濃度が及ぼす影響を評価した。 Experimental example 3
For the carbamoylated polyamino acids (CPLO-30K-88, CPLO-30K-93) prepared in Production Example 1, the effect of the concentration of CPLO-30K on the phase transition temperature was evaluated.

CPLO-30K濃度依存性
各種のCPLO-30K（CPLO-30K-88、CPLO-30K-93）の濃度を０.１２５〜０.５mg/mLの範囲で変化させながら、相転移温度（℃）を測定した。具体的には、各種のCPLO-30K（CPLO-30K-88、CPLO-30K-93）を、生理的緩衝液（10mM Hepes-NaOH (pH7.5)＋150mM NaCl）に、０.１２５〜０.５mg/mLの濃度になるように溶解し、かかる溶液を７０℃から５℃までの範囲で、１℃／分の速度で温度を下げながら、500nmにおける吸光度をUV-VIS分光光度計（吸光光度計）で測定し、当該吸光度から実験例１の方法に従って透過率％を求めた。０.１２５〜０.５mg/mL濃度の各種CPLO-30K（CPLO-30K-88、CPLO-30K-93）について得られた透過率に基づいて、透過率１００％の状態から降温させて透過率が減少し始める温度を相転移温度として決定した。 CPLO-30K concentration dependence While changing the concentration of various CPLO-30K (CPLO-30K-88, CPLO-30K-93) in the range of 0.125 to 0.5 mg / mL, change the phase transition temperature (℃) It was measured. Specifically, various CPLO-30K (CPLO-30K-88, CPLO-30K-93) were added to a physiological buffer (10 mM Hepes-NaOH (pH 7.5) +150 mM NaCl) in an amount of 0.125 to 0.00. Dissolve the solution to a concentration of 5 mg / mL, and measure the absorbance at 500 nm in a UV-VIS spectrophotometer (absorptiometry while reducing the temperature at a rate of 1 ° C./min in the range from 70 ° C. to 5 ° C. The transmittance% was determined from the absorbance according to the method of Experimental Example 1. Based on the transmittance obtained for various CPLO-30K (CPLO-30K-88, CPLO-30K-93) with a concentration of 0.125 to 0.5 mg / mL, the transmittance was lowered from the state of 100% transmittance. Was determined as the phase transition temperature.

結果を図５に示す。図５（Ａ）及び（Ｂ）において、横軸は相転移温度（℃）、縦軸は透過率％（波長500nm）を示す。また図５（Ｃ）は、CPLO-30K-93に関する結果（図５（Ｂ））から、相転移温度（℃）とCPLO-30K-93の濃度との関係を示した図であり、横軸はCPLO-30K-93の濃度（mg/mL）を、縦軸は相転移温度（℃）を示す。この結果から、０.１２５〜５mg/mL濃度のCPLO-30Kは、生理的緩衝液（10mM Hepes-NaOH (pH7.5)＋150mM NaCl）条件下、各CPLO-30Kの濃度が上昇するに伴い、相転移温度が上昇することがわかる。またこの結果から、本発明のカルバモイル化ポリアミノ酸を有効成分とする感温性分離材によれば、その濃度に応じて相転移温度を調整制御することができることがわかる。   The results are shown in FIG. 5A and 5B, the horizontal axis represents the phase transition temperature (° C.), and the vertical axis represents the transmittance% (wavelength 500 nm). FIG. 5C is a graph showing the relationship between the phase transition temperature (° C.) and the concentration of CPLO-30K-93 based on the results regarding CPLO-30K-93 (FIG. 5B). Indicates the concentration of CPLO-30K-93 (mg / mL), and the vertical axis indicates the phase transition temperature (° C.). From this result, 0.125 to 5 mg / mL concentration of CPLO-30K increases as the concentration of each CPLO-30K increases under physiological buffer conditions (10 mM Hepes-NaOH (pH 7.5) +150 mM NaCl). It can be seen that the phase transition temperature increases. Further, from this result, it can be seen that the phase transition temperature can be adjusted and controlled according to the concentration of the temperature-sensitive separating material containing the carbamoylated polyamino acid of the present invention as an active ingredient.

この結果からわかるように、カルバモイル化度が88％以上（n=0.88以上）のCPLO-30K（1mg/mL）は、生理的条件（10mM Hepes-NaOH (pH7.5)＋150mM NaCl）下で、〜３５℃の範囲に相転移温度を有する高温溶解型の高分子化合物である。   As can be seen from this result, CPLO-30K (1 mg / mL) with a degree of carbamoylation of 88% or more (n = 0.88 or more) under physiological conditions (10 mM Hepes-NaOH (pH 7.5) +150 mM NaCl) It is a high-temperature dissolution type polymer compound having a phase transition temperature in the range of ˜35 ° C.

実験例４
実験例１の結果に基づいて、製造例２で調製した各種のカルバモイル化ポリアミノ酸（CPLO-150K-84, CPLO-150K-93）の相転移温度を調べた。 Experimental Example 4
Based on the results of Experimental Example 1, the phase transition temperatures of various carbamoylated polyamino acids (CPLO-150K-84, CPLO-150K-93) prepared in Production Example 2 were examined.

具体的には、各種のカルバモイル化ポリオルニチン（CPLO-150K-84、CPLO-150K-93）を、生理的緩衝液（10mM Hepes-NaOH (pH7.5)＋150mM NaCl）に、１mg/ml濃度になるように溶解した。次いで、かかる溶液を石英セルに入れ、溶液温度を70℃から5℃までの範囲で、1℃／分の速度で温度を下げながら、500nmにおける吸光度をUV-VIS分光光度計（吸光光度計）で測定し、実験例１と同様にして当該吸光度から透過率％を求めた。   Specifically, various carbamoylated polyornithines (CPLO-150K-84, CPLO-150K-93) were added to physiological buffer (10 mM Hepes-NaOH (pH 7.5) +150 mM NaCl) at a concentration of 1 mg / ml. It dissolved so that it might become. The solution is then placed in a quartz cell, and the absorbance at 500 nm is measured with a UV-VIS spectrophotometer (absorptiometer) while decreasing the temperature at a rate of 1 ° C / min. The transmittance% was obtained from the absorbance in the same manner as in Experimental Example 1.

結果を図６に示す。図６に示すように、カルバモイル化度が84％(n=0.84)であるCPLO-150K-84（1mg/mL）は、生理学的低塩濃度の水溶液中で、約１２℃（相転移温度）を境界にしてそれよりも低い温度域では不溶化し、それよりも高い温度域では可溶化すること、つまり高温溶解型（上限臨界共溶温度型）の感温性高分子化合物であることが確認された。またこの相転移はシャープで可逆的であった。また、カルバモイル化度が0.93であるCPLO-150K-93（1mg/mL）は、生理学的低塩濃度の水溶液中で、約３１℃（相転移温度）を境界にしてそれよりも低い温度域では不溶化し、それよりも高い温度域では可溶化すること、つまり高温溶解型（上限臨界共溶温度型）の感温性高分子化合物であることが確認された。またこの相転移もシャープで可逆的であった。   The results are shown in FIG. As shown in FIG. 6, CPLO-150K-84 (1 mg / mL) having a carbamoylation degree of 84% (n = 0.84) is about 12 ° C. (phase transition temperature) in a physiologically low salt concentration aqueous solution. It is confirmed that it is a temperature-sensitive polymer compound of high temperature dissolution type (upper critical solution temperature type) that is insolubilized at a temperature range lower than that, and solubilized at a higher temperature range. It was done. This phase transition was sharp and reversible. In addition, CPLO-150K-93 (1 mg / mL) with a degree of carbamoylation of 0.93 is about 31 ° C (phase transition temperature) as a boundary in an aqueous solution with a physiologically low salt concentration. It was confirmed that the polymer was insolubilized and solubilized at a higher temperature range, that is, a high-temperature soluble type (upper critical solution temperature type) temperature-sensitive polymer compound. This phase transition was also sharp and reversible.

この結果からわかるように、カルバモイル化度が0.84以上のCPLO-150K（1mg/mL）は、生理的条件（10mM Hepes-NaOH (pH7.5)＋150mM NaCl）下で、１０〜３５℃の範囲に相転移温度を有する高温溶解型の高分子化合物である。   As can be seen from this result, CPLO-150K (1 mg / mL) with a carbamoylation degree of 0.84 or higher is in the range of 10 to 35 ° C. under physiological conditions (10 mM Hepes-NaOH (pH 7.5) +150 mM NaCl). It is a high-temperature dissolution type polymer compound having a phase transition temperature.

実験例５
製造例２で調製したカルバモイル化ポリアミノ酸（CPLO-150K-84、CPLO-150K-93）について、相転移温度に対するCPLO-150Kの濃度が及ぼす影響を評価した。 Experimental Example 5
For the carbamoylated polyamino acids (CPLO-150K-84, CPLO-150K-93) prepared in Production Example 2, the effect of the concentration of CPLO-150K on the phase transition temperature was evaluated.

CPLO-150K濃度依存性
各種のCPLO-150K（CPLO-150K-84、CPLO-30K-93）の濃度を０.１２５〜０.５mg/mLの範囲で変化させながら、相転移温度（℃）を測定した。具体的には、各種のCPLO-150K（CPLO-150K-84、CPLO-150K-93）を、生理的緩衝液（10mM Hepes-NaOH (pH7.5)＋150mM NaCl）に、０.１２５〜０.５mg/mLの濃度になるように溶解し、かかる溶液を７０℃から５℃までの範囲で、１℃／分の速度で温度を下げながら、500nmにおける吸光度をUV-VIS分光光度計（吸光光度計）で測定し、当該吸光度から実験例１の方法に従って透過率％を求めた。０.１２５〜０.５mg/mL濃度の各種CPLO-150K（CPLO-150K-84、CPLO-30K-93）について得られた透過率に基づいて、透過率１００％の状態から降温させて透過率が減少し始める
温度を相転移温度として決定した。 CPLO-150K concentration dependence While changing the concentration of various CPLO-150K (CPLO-150K-84, CPLO-30K-93) in the range of 0.125 to 0.5 mg / mL, the phase transition temperature (℃) It was measured. Specifically, various CPLO-150K (CPLO-150K-84, CPLO-150K-93) are added to a physiological buffer (10 mM Hepes-NaOH (pH 7.5) +150 mM NaCl) in an amount of 0.125 to 0.00. Dissolve the solution to a concentration of 5 mg / mL, and measure the absorbance at 500 nm in a UV-VIS spectrophotometer (absorptiometry while reducing the temperature at a rate of 1 ° C./min in the range from 70 ° C. to 5 ° C. The transmittance% was determined from the absorbance according to the method of Experimental Example 1. Based on the transmittance obtained for various CPLO-150K concentrations of 0.125 to 0.5 mg / mL (CPLO-150K-84, CPLO-30K-93), the transmittance was lowered from the 100% transmittance state. Was determined as the phase transition temperature.

結果を図７に示す。図７（Ａ）及び（Ｂ）において、横軸は相転移温度（℃）、縦軸は透過率％（波長500nm）を示す。また図７（Ｃ）は、CPLO-150K-84及びCPLO-150K-93に関する結果（図７（Ａ）及び（Ｂ））から、相転移温度（℃）とCPLO-150Kの濃度との関係を示した図であり、横軸はCPLO-150Kの濃度（mg/mL）を、縦軸は相転移温度（℃）を示す。この結果から、０.１２５〜５mg/mL濃度のCPLO-150Kは、生理的緩衝液（10mM Hepes-NaOH (pH7.5)＋150mM NaCl）条件下、各CPLO-150Kの濃度が上昇するに伴い、相転移温度が上昇することがわかる。またこの結果から、本発明のカルバモイル化ポリアミノ酸を有効成分とする感温性分離材によれば、その濃度に応じて相転移温度を調整制御することができることがわかる。   The results are shown in FIG. 7A and 7B, the horizontal axis represents the phase transition temperature (° C.), and the vertical axis represents the transmittance% (wavelength 500 nm). 7C shows the relationship between the phase transition temperature (° C.) and the concentration of CPLO-150K based on the results for CPLO-150K-84 and CPLO-150K-93 (FIGS. 7A and 7B). The horizontal axis represents the concentration of CPLO-150K (mg / mL), and the vertical axis represents the phase transition temperature (° C.). From this result, 0.125 to 5 mg / mL concentration of CPLO-150K increases with increasing concentration of each CPLO-150K under physiological buffer conditions (10 mM Hepes-NaOH (pH 7.5) +150 mM NaCl). It can be seen that the phase transition temperature increases. Further, from this result, it can be seen that the phase transition temperature can be adjusted and controlled according to the concentration of the temperature-sensitive separating material containing the carbamoylated polyamino acid of the present invention as an active ingredient.

この結果からわかるように、カルバモイル化度が84％以上（n=0.84以上）のCPLO-150K（1mg/mL）は、生理的条件（10mM Hepes-NaOH (pH7.5)＋150mM NaCl）下で、１０〜３５℃の範囲に相転移温度を有する高温溶解型の高分子化合物である。   As can be seen from this result, CPLO-150K (1 mg / mL) with a carbamoylation degree of 84% or more (n = 0.84 or more) under physiological conditions (10 mM Hepes-NaOH (pH 7.5) +150 mM NaCl) It is a high-temperature dissolution type polymer compound having a phase transition temperature in the range of 10 to 35 ° C.

さらに図７（Ｃ）の結果からわかるように、カルバモイル基の導入率（カルバモイル化度）が多くなるにつれて、生理的緩衝液（10mM Hepes-NaOH (pH7.5)＋150mM NaCl）条件下での相転移温度が高くなることがわかる。つまり、ポリアミノ酸のカルバモイル化度と相転移温度には相関関係があるため、所望の相転移温度を有するカルバモイル化ポリアミノ酸は、ポリアミノ酸に導入するカルバモイル基の数（カルバモイル化度）を適宜調整することによって、作製することができる。   Furthermore, as can be seen from the results in FIG. 7C, the phase under physiological buffer conditions (10 mM Hepes-NaOH (pH 7.5) +150 mM NaCl) increases as the introduction rate of carbamoyl group (degree of carbamoylation) increases. It can be seen that the transition temperature increases. In other words, since there is a correlation between the degree of carbamoylation of polyamino acids and the phase transition temperature, the number of carbamoyl groups (degree of carbamoylation) introduced into the polyamino acid is adjusted appropriately for carbamoylated polyamino acids having the desired phase transition temperature. By doing so, it can be manufactured.

実験例６
製造例２で調製したカルバモイル化ポリアミノ酸（CPLO-150K-93）をプロテアーゼで分解し、生成した分解物について感温性を評価した。 Experimental Example 6
The carbamoylated polyamino acid (CPLO-150K-93) prepared in Production Example 2 was decomposed with a protease, and the temperature sensitivity of the resulting decomposition product was evaluated.

具体的には、CPLO-150K-93を、生理的緩衝液（10mM Hepes-NaOH (pH7.5)＋150mM NaCl）に、1mg/mLの濃度になるように溶解し、この中にプロテイナーゼＫ（Sigma社製）を100μg/mlの割合になるように添加混合した。かかる溶液を３７℃で２時間インキュベートし、さらに５０℃で１０分間インキュベートした。反応終了後、得られた反応液を７０℃から５℃までの範囲で、１℃／分の速度で温度を下げながら、500nmにおける透過率（％）をUV-VIS分光光度計（吸光光度計）で測定した。   Specifically, CPLO-150K-93 was dissolved in physiological buffer (10 mM Hepes-NaOH (pH 7.5) +150 mM NaCl) to a concentration of 1 mg / mL, and proteinase K (Sigma) was dissolved therein. Were added and mixed so as to have a ratio of 100 μg / ml. This solution was incubated at 37 ° C. for 2 hours and further incubated at 50 ° C. for 10 minutes. After the reaction was completed, the transmittance (%) at 500 nm was measured with a UV-VIS spectrophotometer (absorptiometer while reducing the temperature of the obtained reaction solution in the range from 70 ° C to 5 ° C at a rate of 1 ° C / min. ).

結果を、分解前のカルバモイル化ポリアミノ酸（CPLO-150K-93）の結果と併せて、図８に示す。図８において、横軸は相転移温度（℃）を、縦軸は500nmにおける透過率（％）を示す。この結果から、カルバモイル化ポリアミノ酸（CPLO-150K-93）のプロテアーゼ分解物も、生理学的に許容される条件の水溶液中で、約２０℃（相転移温度）を境界にしてそれよりも低い温度域では不溶化し、それよりも高い温度域では可溶化すること、つまり高温溶解型（上限臨界共溶温度型）の感温性化合物であることが確認された。またカルバモイル化ポリアミノ酸は、分解により分子量が小さくなるに従って、相転移温度が低くなることが確認された。このことは、CPLO-30Kの相転移温度よりも、分子量の大きいCPLO-150Kの相転移温度のほうが高いことと共通している。   The results are shown in FIG. 8 together with the results of the carbamoylated polyamino acid (CPLO-150K-93) before decomposition. In FIG. 8, the horizontal axis indicates the phase transition temperature (° C.), and the vertical axis indicates the transmittance (%) at 500 nm. From this result, the protease degradation product of carbamoylated polyamino acid (CPLO-150K-93) is also at a temperature lower than that at about 20 ° C. (phase transition temperature) in an aqueous solution under physiologically acceptable conditions. It was confirmed that it was insoluble in the region and solubilized in the higher temperature range, that is, it was a high-temperature soluble type (upper critical solution temperature type) temperature-sensitive compound. It was also confirmed that the carbamoylated polyamino acid has a lower phase transition temperature as the molecular weight is reduced by decomposition. This is in common with the fact that the phase transition temperature of CPLO-150K having a large molecular weight is higher than the phase transition temperature of CPLO-30K.

以上の結果から、本発明のカルバモイル化ポリアミノ酸は、プロテアーゼで分解される前は高い相転移温度を有し、プロテアーゼで分解された後は相転移温度が低下する。この現象を用いることで、物質の溶解及び溶出を制御することができる。例えば、相転移温度がＡ℃であるカルバモイル化ポリアミノ酸に、それ未満の温度（Ｂ℃）で物質を捕捉させておく（不溶化状態）。次いで当該カルバモイル化ポリアミノ酸がプロテアーゼで分解される条件に置くことで、カルバモイル化ポリアミノ酸が分解されて低分子化され、その結果、相転移温度が低下する（Ａ℃→Ｃ℃）。そうすると、その相転移温度（Ｃ℃）がＢ℃よりも低い条件である場合（Ａ℃＞Ｂ℃＞Ｃ℃）、低分子化されたカルバモイル化ポリアミノ酸は可溶化し、その可溶化に伴って、当初カルバモイル化ポリアミノ酸に捕捉されていた物質が溶解し、溶出することになる。   From the above results, the carbamoylated polyamino acid of the present invention has a high phase transition temperature before being decomposed by protease, and the phase transition temperature is lowered after being decomposed by protease. By using this phenomenon, dissolution and elution of the substance can be controlled. For example, a carbamoylated polyamino acid having a phase transition temperature of A ° C. captures the substance at a temperature lower than that (B ° C.) (insolubilized state). Next, by placing the carbamoylated polyamino acid under conditions where it is decomposed by a protease, the carbamoylated polyamino acid is decomposed and reduced in molecular weight, and as a result, the phase transition temperature decreases (A ° C. → C ° C.). Then, when the phase transition temperature (C ° C.) is lower than B ° C. (A ° C.> B ° C.> C ° C.), the low-molecular-weight carbamoylated polyamino acid is solubilized. Thus, the substance originally captured by the carbamoylated polyamino acid is dissolved and eluted.

このように、本発明のカルバモイル化ポリアミノ酸若しくはその塩、またはこれを有効成分とする感温性分離材によれば、例えば、系の温度を変化できない場合でも、カルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩の濃度やその分子量を変えることで相分離させることができることがわかる。
Thus, according to the carbamoylated polyamino acid or salt thereof of the present invention, or the thermosensitive separation material comprising this as an active ingredient, for example, even when the temperature of the system cannot be changed, the carbamoylated polyamino acid or salt thereof can be used. It can be seen that phase separation can be achieved by changing the concentration and the molecular weight.

Claims (9)

少なくとも１０つのアミノ酸が重合してなるポリアミノ酸であって、当該ポリアミノ酸を構成するアミノ酸の全部または少なくとも４割が、下記一般式（Ｉ）で示される、側鎖にカルバモイル基を有するアミノ酸であることを特徴とする、カルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩：
Figure 2012165356
 （式中、ｐは１〜５の整数を意味する。）。
Polyamino acids obtained by polymerizing at least 10 amino acids, and all or at least 40% of the amino acids constituting the polyamino acids are amino acids having a carbamoyl group in the side chain represented by the following general formula (I) A carbamoylated polyamino acid or salt thereof, characterized in that:
Figure 2012165356
 (In the formula, p means an integer of 1 to 5).
下記一般式（II）で示される、カルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩：
Figure 2012165356
 （式中、Ｒ１はアミノ酸の側鎖、ｐは１〜５の整数、ｍは１０以上の整数、ｎは０.４≦ｎ≦１を満たす数を、それぞれ意味する。）。
A carbamoylated polyamino acid or salt thereof represented by the following general formula (II):
Figure 2012165356
 (In the formula, R 1 is an amino acid side chain, p is an integer of 1 to 5, m is an integer of 10 or more, and n is a number satisfying 0.4 ≦ n ≦ 1).
少なくとも１０つのアミノ酸が重合してなるポリアミノ酸またはその塩であって、当該ポリアミノ酸を構成するアミノ酸の全部または少なくとも４割が、下記一般式（III）：
Figure 2012165356
 （式中、ｐは１〜５の整数を意味する。）
で示されるアミノ酸であるポリアミノ酸またはその塩に、
シアン酸塩を反応させることによって製造される、請求項１または２に記載されるカルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩。
A polyamino acid obtained by polymerizing at least 10 amino acids or a salt thereof, wherein all or at least 40% of the amino acids constituting the polyamino acid are represented by the following general formula (III):
Figure 2012165356
 (In the formula, p means an integer of 1 to 5.)
In a polyamino acid or a salt thereof which is an amino acid represented by
The carbamoylated polyamino acid or salt thereof according to claim 1 or 2, produced by reacting cyanate.
少なくとも１０つのアミノ酸が重合してなるポリアミノ酸または塩であって、当該ポリアミノ酸を構成するアミノ酸の全部または少なくとも４割が、下記一般式（III）：
Figure 2012165356
 （式中、ｐは１〜５の整数を意味する。）
で示されるアミノ酸であるポリアミノ酸またはその塩に、
シアン酸塩を反応させる工程を有する、
請求項１または２に記載するカルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩の製造方法。
A polyamino acid or salt obtained by polymerizing at least 10 amino acids, wherein all or at least 40% of the amino acids constituting the polyamino acid are represented by the following general formula (III):
Figure 2012165356
 (In the formula, p means an integer of 1 to 5.)
In a polyamino acid or a salt thereof which is an amino acid represented by
Comprising reacting cyanate,
The manufacturing method of the carbamoylated polyamino acid or its salt of Claim 1 or 2.
上記ポリアミノ酸が下記一般式（IV）で示されるポリアミノ酸である、請求項４に記載する製造方法：
Figure 2012165356
 （式中、Ｒ１はアミノ酸の側鎖、ｐは１〜５の整数、ｍは１０以上の整数、ｎは０.４≦ｎ≦１を満たす数を、それぞれ意味する。）。
The production method according to claim 4, wherein the polyamino acid is a polyamino acid represented by the following general formula (IV):
Figure 2012165356
 (In the formula, R 1 is an amino acid side chain, p is an integer of 1 to 5, m is an integer of 10 or more, and n is a number satisfying 0.4 ≦ n ≦ 1).
請求項１または２に記載するカルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩を有効成分とする、感温性組成物。
A temperature-sensitive composition comprising the carbamoylated polyamino acid according to claim 1 or 2 or a salt thereof as an active ingredient.
請求項１または２に記載するカルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩を有効成分とする、感温性分離材。
A temperature-sensitive separating material comprising the carbamoylated polyamino acid according to claim 1 or 2 or a salt thereof as an active ingredient.
下記の工程を有する水性２相分配法：
（1）被分離物を含む試料及び請求項１または２に記載するカルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩を、生理的に許容される溶液中に共存させる工程、及び
（2）上記溶液の温度を、カルバモイル化ポリアミノ酸またはその塩の相転移温度より高い温度から低い温度にすることで、上記溶液を相分離させる工程。
Aqueous two-phase partitioning process with the following steps:
(1) a step of allowing a sample containing an object to be separated and a carbamoylated polyamino acid or salt thereof according to claim 1 or 2 to coexist in a physiologically acceptable solution; and (2) a temperature of the solution. A step of phase-separating the solution by changing the temperature from higher to lower than the phase transition temperature of the carbamoylated polyamino acid or salt thereof.
さらに下記の(3)の工程、または(3)と(4)の工程を有する、請求項８に記載する水性２相分配法：
（3）(2)の相分離工程によって相分離された溶液について、被分離物が分配された相を、非分配相から分離し回収する工程、
（4）上記(3)の工程により分離回収した被分離物分配相から、被分離物を回収する工程。
The aqueous two-phase partition method according to claim 8, further comprising the following step (3) or (3) and (4):
(3) A step of separating and recovering the phase in which the separation target is distributed from the non-partitioned phase with respect to the solution phase-separated by the phase separation step of (2),
(4) A step of recovering the separated object from the separated substance distribution phase separated and recovered by the step (3).
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