JPWO2010047133A1 - 細胞保存方法、及び細胞輸送方法 - Google Patents

Abstract

生細胞の機能を維持したい状態で生細胞を保存する細胞保存方法を提供する。細胞保存方法の一態様は、複数のマイクロ容器（１１）を有する細胞培養容器（２０）を用いて生細胞（４０）を保存する方法であって、生細胞を複数のマイクロ空間の表面に接着させて培養し、培養後、複数のマイクロ容器（１１）を覆うように、培地（５０）を細胞培養容器（２０）へ注入して保存する。適切な大きさの細胞培養容器に生細胞を接着させ、培養して、三次元構造体を形成させることにより、生細胞の三次元構造体を維持し、機能を維持した状態で生細胞を保存することが可能になる。

Description

本発明は、生細胞を保存する細胞保存方法、及び細胞輸送方法に関する。

組織から単離した細胞を試験、検査に用いる手法は、バイオテクノロジー関連分野では欠かせない方法となっている。疾病、病態の診断、新薬の探索及び薬効の判定、あるいは動物検査、植物検査、環境汚染物質の試験などに幅広く用いられている。そのため、バイオテクノロジー分野で使用される細胞類は、極めて多様化してきている。

単離した細胞は、直ちに試験に用いられる場合もあるが、多くの場合、培養皿や試験管のなかで細胞培養が行われる。この培養細胞を用いて、種々の検査が行われる。細胞培養試験に用いられる細胞培養株には、生体内での試験いわゆるin vivo試験と同様の薬剤感受性、毒性反応を示すことが要求される。すなわち、細胞培養容器の表面で規則性を有して配列された細胞間のネットワークを構築できることが必要とされる。また、細胞培養試験に用いられる細胞培養株は極めて高額であるため、細胞の生存率及び増殖速度の向上が望まれている。

上記細胞培養試験は、同一条件下、評価する薬物等の量、濃度などを変量し、その効果を測定するものである。そのため、細胞培養容器の材質、形状等も同一にする必要がある。この細胞培養容器としては、プラスチック製シャーレ、ガラス製シャーレ、容器内に固定されたガラスプレート、ウェルプレート等が一般的に用いられる。ウェルプレートには、６ウェル、１２ウェル、４８ウェル、９６ウェルの各プレート又はシャーレがある。これらは、一般に、プレート全体の大きさはほぼ同じであり、ウェル数が大きくなるほど、１ウェルのサイズが小さくなる。この１ウェルが１培養皿に相当する。また、最近の微量化への流れから、さらに小口径で多数の培養皿からなる３８４ウェルプレートも使用され始めている。これらの培養皿の底部は平坦な平板状であり、この底面を培養面として用いている。

しかしながら、組織細胞の培養に、従来の細胞培養容器を用いると、細胞が薄く伸びて方向性のない形態となる。また、細胞培養容器の表面にランダムに配置されるため、細胞間のネットワークは、複雑に交錯して形成される。そのため、生体内での細胞機能を再現できないという問題があった。例えば、肝細胞では肝機能を維持することで知られるスフェロイド状の肝細胞塊を形成しない。

上記問題を解決するため、平板状の培養面に特殊な高分子を固定化する方法（特許文献１参照）、特殊な装置を使用する方法（特許文献２参照）、高分子ゲル中で培養する方法（特許文献３参照）などが開示されている。

しかしながら、特許文献１に記載の方法では、固定化方法が煩雑で安定的に製造できず、高コストとなる問題があった。また、特許文献２に記載の方法では、培養方法が複雑であるのに関わらず、細胞塊の形成効率が悪く、高コストになる等の問題があった。特許文献３の方法では、細胞塊の大きさが制御できない、また、基盤としての操作性が煩雑であることなどの問題点があった。このようにこれらの方法は煩雑であり、安定的に製造できず、高コストとなっていた。

特許第３１７７６１０号公報 特開平７−７９７７２号公報 特開平８−３０８５６２号公報

生体より分離した生細胞は、生体と同様の環境で保存されることが望ましい。例えば、非凍結の肝細胞を保存する場合、平面状の培養プレートに肝細胞を接着させ、培地を満たし、保温（例えば２５〜３７℃）状態に置かれて保存されていた。しかしながら、平面で細胞を培養した場合、生体内の環境と大きく異なるため、細胞が有する本来の機能を消失させるという問題があった。また、培養中あるいは保存中の環境要因、例えば、振動・温度・ＣＯ_２濃度（培地のｐＨの変動）などにより、さらに細胞の機能が低下するという問題があった。

また、特許文献１または特許文献２に開示された方法で培養した細胞を保存すると、振動が生じた場合などに、細胞の剥離やゲルの崩壊による細胞死などが懸念されていた。このため、生細胞の三次元構造体を維持した状態で保存したまま輸送し、分離場所から離れた場所で利用することは困難であった。その一方で、組織から細胞を単離する機関と、試験、検査する機関とは異なることが多く、単離した細胞の機能を低下させずに保存し、輸送することが望まれていた。

本発明は、このような問題を解決するためになされたものであり、細胞機能を維持した状態で生細胞を保存する細胞保存方法、及び細胞輸送方法を提供することを目的とする。

本発明の細胞保存方法の一態様は、複数のマイクロ空間を有する細胞培養容器を用いて生細胞を保存する細胞保存方法であって、生細胞を前記複数のマイクロ空間の表面に接着させて培養し、前記培養後、前記複数のマイクロ空間を覆うように、培地を前記細胞培養容器へ注入し、前記細胞培養容器を、培地が漏れ出さないように密封して保存する。マイクロ空間の表面に生細胞を接着させ、培養に適したマイクロ空間を用いて培養して三次元構造体を各マイクロ容器内に形成させ、三次元構造体をマイクロ容器によって隔離した後、密封して保存することによって、生細胞を、機能を維持した状態で保存することが可能になる。

また、前記細胞培養容器は、４℃以上３７℃未満の温度に保たれて、前記生細胞が保存されることが好ましい。さらに、培養は、前記表面に接着され、かつ、各マイクロ空間の空間内に形成される三次元構造体の細胞集団が隔離される細胞数になるように培養することが好ましい。マイクロ空間を用いることによって、各マイクロ空間に培養させた生細胞が他のマイクロ空間の生細胞と接触することを防止できる。

前記複数のマイクロ空間は、底部面積が０．０１〜０．１ｍｍ^２であり、深さが２５〜１５０μｍであることが好ましく、また、前記生細胞は、肝細胞、膵ベータ細胞、心筋細胞、神経細胞、皮膚上皮細胞、軟骨細胞、骨細胞、組織幹細胞、ＥＳ細胞、及びｉＰＳ細胞のうちのいずれか、あるいは、組織幹細胞、ＥＳ細胞、及びｉＰＳ細胞のうちのいずれかから分化させた、肝細胞、膵ベータ細胞、心筋細胞、神経細胞、皮膚上皮細胞、軟骨細胞、及び骨細胞のうちのいずれかであることがより好ましい。

前記培養後、非接着細胞を除去してから前記培地を前記細胞培養容器へ注入することがより好ましく、前記生細胞の培養は、生細胞を接着させて培養した後、さらに培養して、増殖、伸展、または凝集させることが可能となることが好ましい。

細胞播種密度１×１０^２〜１×１０^６細胞／ｃｍ^２で、生細胞が前記複数のマイクロ空間に播種されたことがより好ましく、細胞播種密度１×１０^４〜１×１０^６細胞／ｃｍ^２であるのがより好ましい。前記複数のマイクロ空間に、生細胞が集積した細胞塊が形成されることが好ましく、前記細胞塊の直径は、３０〜２００μｍであることがより好ましい。

前記培地は、血清、増殖因子、及び血中成分の少なくとも一つを含むこと、酸素または二酸化炭素を透過させる膜を用いて前記細胞培養容器を密封すること、の少なくとも一つであることがより好ましい。

また、本発明に係る細胞輸送方法の一態様は、複数のマイクロ空間を有する細胞培養容器へ生細胞を保存して輸送する細胞輸送方法である。この輸送方法は、まず、生細胞を前記複数のマイクロ空間の表面に接着させて培養する。前記培養後、前記複数のマイクロ空間を覆うように、培地を前記細胞培養容器へ注入する。その後、前記細胞培養容器を、培地が漏れ出さないように密封する。そして、密封した前記細胞培養容器を、車両、船舶、または航空機のいずれかの輸送手段を用いて輸送する。この細胞輸送方法により、生細胞の機能を維持した状態で輸送することが可能になる。また、前記細胞培養容器は、４℃以上３７℃未満の温度に保たれることが好ましい。

本発明によれば、細胞機能を維持した状態で生細胞を保存する細胞保存方法、及び細胞輸送方法を提供することができる。

実施の形態に係る細胞培養容器の構成を示す平面図である。 実施の形態に係る細胞培養容器の構成を示すＩＩ−ＩＩ断面図である。 実施の形態に係る細胞培養容器の他の構成を示す平面図である。 実施の形態に係る細胞培養容器の他の構成を示すＩＶ−ＩＶ断面図である。 実施の形態に係る細胞培養容器のさらに他の構成を示す平面図である。 実施の形態に係る細胞培養容器のさらに他の構成を示すＶＩ−ＶＩ断面図である。 図５及び図６に示した細胞培養容器を用いて細胞を培養し、密封した状態例を示す図である。 実施例０６の結果を示す写真である。 実施例０７の結果を示す写真である。

本発明に係る細胞保存方法の一態様は、生細胞の培養に適する細胞培養容器を用いて生細胞をマイクロ容器に接着させて培養し、マイクロ容器内に三次元構造体を形成させ、培養後細胞培養容器に培地を満たして保存する。マイクロ容器は、生細胞の三次元構造体を形成させ、またその構造を維持させる。また、マイクロ容器は、内部に形成された生細胞の三次元構造体を他の生細胞の三次元構造体から隔離する。このため、生細胞を培養するマイクロ容器に適切なものを用いる必要がある。この保存に用いる細胞培養容器は、例えば、次のような容器を用いる。

細胞培養容器には凹凸パターンすなわち複数のマイクロ容器が形成されている。これにより、生体内と同様な立体的な細胞生育が可能であることに加え、各マイクロ容器内において、ばらつき無く細胞が凝集した形態で培養できる。また、マイクロ容器は、例えば、マイクロ容器を仕切る側壁（凸部）の高さを最適化することで、凝集した生細胞（例えば、肝細胞塊）をマイクロ容器内のみで培養することができる。ここで、マイクロ空間は、マイクロ容器よって形成される空間であり、より具体的には、平面上に形成された凹凸パターンによって形成される空間を指す。以降の説明では、マイクロ容器とマイクロ空間とを特に区別しない。

側壁により囲まれたマイクロ容器の寸法は、細胞を培養するために最適な範囲とすることが必要である。マイクロ容器の底部面積が大きすぎると、平板上での培養と同様、細胞は薄く伸び、立体構造とならない。一方、マイクロ容器の底部面積が小さすぎると、細胞を収容できなくなる。従って、空間の寸法は、培養する細胞種に応じて、一又は複数個が収容できる範囲とすることが好ましい。例えば、細胞が複数個集積した肝細胞塊を形成させる場合、その肝細胞塊が収納できる範囲とすることが好ましい。

側壁の高さは、マイクロ容器で培養する細胞を隣接するマイクロ容器へ移動させないために最適な範囲とすることが必要である。側壁の高さが低すぎると、細胞が側壁を乗り越えてしまい、培養に適さない。側壁の高さが高すぎると、作製が困難な上、物質拡散がしにくくなり培養環境が悪化してしまう。従って、側壁の高さは、細胞種に応じて、マイクロ容器内に配置された培養細胞を、そのマイクロ容器内において安定的に培養し続けられる範囲とすることが好ましい。

また、側壁に開口部を設け、複数のマイクロ容器を連通した構造とするにより、細胞への酸素や栄養分の供給及び細胞からの老廃物の除去を効率良く行うことができる。なお、培養する細胞種に応じ、側壁の高さ、マイクロ容器寸法、開口部の幅を適宜設定することにより、多様な培養系に適用することもできる。

また、本明細書では、生細胞は、生体組織から分離した細胞（＝初代培養細胞）の継代していない細胞をさす。生細胞には、凍結細胞と新鮮細胞の２種類が含まれる。また、株化細胞、その他ＥＳ細胞（Embryonic Stem cells）等全てが含まれる。新鮮細胞は初代培養細胞の凍結していないもののことをさす。

実施の形態
以下に、本発明の実施の形態について説明する。ただし、本発明が以下の実施の形態に限定される訳ではない。また、説明を明確にするため、以下の記載及び図面は、適宜、簡略化されている。

はじめに実施の形態に係る細胞保存用法に用いる細胞培養容器について説明し、続いて細胞保存方法について説明する。まず、細胞培養容器の構成例を、図１、２を用いて説明する。図１は、本実施の形態に係る細胞培養容器の構成を示す平面図であり、図２は図１のＩＩ−ＩＩ断面図である。図１に示すように、細胞培養容器１０はマイクロ容器１１、側壁１２、開口部１３を備える。細胞培養容器１０の培養面には、複数の側壁１２が網目状に形成されており、この側壁１２に四方を囲われた空間がマイクロ容器１１となる。また、各マイクロ容器１１の四辺に形成された側壁１２の各辺の中央部に、開口部１３が形成されている。

図１において、マイクロ容器１１の底部の幅ａ、マイクロ容器１１を区画するための側壁１２の幅ｂ、高さｃ、隣接するマイクロ容器１１が互いに連通するための開口部１３の幅ｄを示した。本発明における底部面積とは、マイクロ容器開口水平面（側壁１２上面と同一面）に垂直方向に上方から容器底へ平行光を照射した際の投影面積のことをいう。例えば、マイクロ容器の底がＵ字形状である場合、その開口面に垂直方向な上方より底に入射した平行光が投影する形状が底部面積となる。投影底部の長径及び短径とは、円及び楕円の場合、その重心を通る長軸及び短軸と円周との交点の各軸上の距離を長径及び短径といい、多角形の場合、その多角形の面積との差が最小となり各頂点を通る外挿円又は外挿楕円の長径および短径をいい、各頂点を通る外挿円又は外挿楕円を描けない場合は、最も多くの頂点を通る近似円又は楕円の長径および短径をいう。

マイクロ容器１１の底部形状は特に制限されるものではなく、正方形、円、多角形以外にも種々の形状を採用することができる。生体内での肝機能を再現する細胞培養には、この底部面積は０．０１ｍｍ^２〜０．１ｍｍ^２が好ましい。また、底部の長径が短径の１〜１．５倍であることが好ましい。さらに、等方的形状が好ましく、正方形であれば、例えば、相当直径１００μｍの肝細胞塊を形成させる場合、一辺の長さが１００μｍ〜３００μｍが好ましい。

マイクロ容器１１の水平面と側壁１２とがなす角度は、細胞が乗り上げない角度でなければならないため、側面の上部から５０％以上の部分は８０°〜９０°が好ましく、特に、８５°〜９０°であることが好ましい。

側壁１２の高さｃは、マイクロ容器１１で培養する細胞が乗り上げ隣接するマイクロ容器１１へ移動しなければよく、例えば、相当直径１００μｍの肝細胞塊を形成させる場合、５０μｍ〜１５０μｍが好ましい。

隣接するマイクロ容器１１を互いに連通するための開口部１３の幅ｄは、培養細胞が最初に播種されたマイクロ容器１１から隣接するマイクロ容器１１に移動できない程度であればよい。例えば、培養細胞の相当直径が２０μｍであれば、５〜１５μｍであることが好ましい。なお、開口部１３は必須ではなく、図３及び図４に示すように、マイクロ容器１１の四辺が側壁１２により完全に囲まれていてもよい。ここで、図３は、本実施の形態に係る他の細胞培養容器の構成を示す平面図であり、図４は図３のＩＶ−ＩＶ断面図である。

また、図５及び図６に示すように、本実施の形態に係る細胞培養容器は、所定数の複数のマイクロ容器からなる区画されたスポットを有していてもよい。ここで、図５は、本実施の形態に係るさらに他の細胞培養部の構成を示す平面図であり、図６は図５のＶＩ−ＶＩ断面図である。図５及び図６では、図３及び図４に示すマイクロ容器の構造を用いている例を示す。図５には、複数のマイクロ容器を区画化する側壁２４とその区画化されたスポット２３を示した。側壁２４の高さｄは、培養液や反応液等の上清液が乾燥せず保持できる容量であればよく、便宜設定すればよい。側壁２４を有することにより、各スポット２３で異なる培地を用いることも可能となる。また、図５及び図６において、側壁２４を有する構成例を示したが、側壁２４を備えていない構成であってもよい。

細胞培養容器上の凹凸パターンを作製する方法としては、特に限定されないが、例えば、モールドを用いた転写成形、３次元光造形、精密機械切削、ウェットエッチング、ドライエッチング、レーザ加工、放電加工等の方法が挙げられる。細胞培養容器の用途、要求される加工精度、コスト等を考慮してこれらの製造方法を適宜選択することが好ましい。

モールドを用いて転写成形方法の具体例としては、金属構造体を型として樹脂成形で凹凸パターンを形成する方法が挙げられる。この方法は金属構造体の形状を高い転写率で樹脂へ凹凸パターンに再現することが可能であり、また汎用の樹脂材料を使用することにより材料コストを低くできるので好ましい。このような金属構造体の型を用いる方法は、低コストであり、高い寸法精度を満足できる点で優れている。

上記金属構造体の製造方法としては、例えば、フォトリソグラフィによって作製されたレジストパターンや３次元光造形によって作製された樹脂パターンへのメッキ処理、精密機械切削、ウェットエッチング、ドライエッチング、レーザ加工、放電加工等が挙げられる。用途、要求される加工精度、コスト等を考慮して適宜選択すればよい。

上記で得られた金属構造体を型として用いて樹脂へ凹凸パターンを成形する方法としては、例えば、射出成形、プレス成形、モノマーキャスト成形、溶剤キャスト成形、ホットエンボス成形、押出成形によるロール転写等の方法を挙げることができる。生産性及び型転写性の観点から射出成形を採用することが好ましい。

細胞培養容器を構成する材料としては、自己支持性を有するものであれば特に制限されず、例えば、合成樹脂、シリコン、ガラス等が挙げられる。コスト面や顕微鏡観察による細胞視認性の観点から、透明な合成樹脂を材料とすることが好ましい。透明な合成樹脂としては、例えば、ポリメタクリル酸メチル、メタクリル酸メチル−スチレン共重合体等のアクリル系樹脂、ポリスチレン等のスチレン系樹脂、シクロオレフィン等のオレフィン系樹脂、ポリエチレンテレフタレート、ポリ乳酸等のエステル系樹脂、ポリジメチルシロキサン等のシリコーン系樹脂、ポリカーボネート樹脂等が挙げられる。このような樹脂には、透明性を損なわない範囲で着色剤、拡散剤、増粘剤等の各種添加剤を含んでいてもよい。

細胞培養容器は、容器表面の親水性、生体適合性、細胞親和性等を向上させることを目的として、凹凸パターン表面側に表面処理を行い、改質層及び／又はコーティング層が配されていてもよい。上記改質層を設ける方法としては、自己支持性を失う方法や１００μｍ以上の極端な表面荒れを起こす方法でなければ特に制限はないが、例えば、薬品処理、溶剤処理、表面グラフト重合によるグラフトポリマーの導入等の化学的処理、コロナ放電、オゾン処理、プラズマ処理等の物理的処理等の方法が挙げられる。またコーティング層を設ける方法としては、特に制限されるものではないが、例えば、スパッタ、蒸着等のドライコーティング、無機材料コーティング、ポリマーコーティング等のウェットコーティング等の方法が挙げられる。凹凸パターン上には、気泡の混入することなく培養液を注入するために親水性を付与することが望ましく、均一な親水性膜を形成させる方法として、無機蒸着が好ましい。

また、細胞親和性を考慮した場合には、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン等の細胞親和性タンパク質をコーティングすることがより好ましい。コラーゲン水溶液等を均一にコートするために、上述の親水性膜を形成させた後、コートすることが好ましい。通常、肝細胞培養においては、生体内環境を模倣して細胞外マトリックス表面での培養が望ましいため、上記のように均一な親水性無機膜を配した後に、培養細胞に適した細胞外マトリックスからなる有機膜を配することが特に好ましい。

また、上述した細胞培養容器を用いる細胞培養方法は、細胞を培養するマイクロ容器のみに細胞を配置させ、その空間内で生体内に類似した形態や機能を発現させるため、適切な細胞数を播種する必要があり、細胞播種密度１．０×１０^２〜１．０×１０^６細胞／ｃｍ^２が好ましく、細胞播種密度１．０×１０^４〜１．０×１０^６細胞／ｃｍ^２がより好ましい。例えば、マイクロ容器が正方形で、１辺が２００μｍの場合、５．０×１０^４〜５．０×１０^５細胞／ｃｍ^２が好ましい。このような条件のもと、直径が３０〜２００μｍに及ぶ肝細胞塊を得ることができる。

続いて、本実施の形態に係る細胞保存方法について説明する。細胞保存方法は、上述した複数のマイクロ容器を有する細胞培養容器を用いて生細胞を培養し、保存する。具体的には、まず、細胞培養容器の複数のマイクロ容器の表面に生細胞を接着させて培養する培養工程を行う。続いて、複数のマイクロ容器を覆うように、培地（培養液）を細胞培養容器へ注入して保存の準備をする保存準備工程を行う。このようにして作成された細胞培養容器を保存する（保存工程）。以下に各工程をより詳しく説明する。

まず、培養工程について説明する。生細胞は接着性の細胞を用いる。生細胞をマイクロ容器表面に接着させることにより、保存・輸送中に生細胞がマイクロ容器の表面等に衝突すること、マイクロ容器から流出することなどを防止できる。これにより、培養した生細胞の機能の損失を抑制したり、生細胞が培地から露出することによる乾燥、これに基づく細胞機能の低下などを防止する。

培養する生細胞は、実質細胞が用いられる。具体的には、肝細胞、膵ベータ細胞、心筋細胞、神経細胞、皮膚上皮細胞、軟骨細胞、骨細胞、組織幹細胞、ＥＳ細胞、及びｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cells）のうちのいずれかを用いる。あるいは、組織幹細胞、ＥＳ細胞、及びｉＰＳ細胞のうちのいずれかから分化させた、肝細胞、膵ベータ細胞、心筋細胞、神経細胞、皮膚上皮細胞、軟骨細胞、及び骨細胞のうちのいずれかを用いる。

培養工程には、（１）細胞を接着させる工程、（２）非接着細胞を除去する工程、（３）細胞をさらに培養し増殖または伸展または凝集させる工程を含む。非接着細胞を除去することにより、老廃物を除去し、培地が汚染されることを防ぐことができる。また、さらに培養増殖等により、生細胞を所望の細胞塊の大きさになるまで培養する。例えば、細胞凝集塊の直径が３０〜２００μｍになるまで増殖・進展・凝集させる。各マイクロ容器は、所望の細胞塊が入る大きさに設計される。このように、生細胞の培養は、生細胞が複数のマイクロ容器の表面に接着され（播種され）、かつ、各マイクロ容器の空間内に形成される三次元構造体の細胞集団が隔離される細胞数になるように培養する。

上述した工程により、マイクロ容器内に三次元構造体１個分の細胞数に相当する細胞集団を形成し、隔離する。ここでは、マイクロ容器内に形成される細胞集団（細胞塊）を１個分としている。生細胞は、マイクロ容器によって、生細胞の大きさより高い壁で隔離され、かつ、生細胞はマイクロ容器に接着している。このため、隣り合う三次元構造体と接することがない。これにより、非静置環境（輸送状態など）においても、生細胞に均一な三次元構造体を形成させ、または、維持させることができる。

次に、保存準備工程について説明する。培地は、培養した生細胞が乾燥しないような、また外気に触れないような量を注入する。保存中に用いる培地は、栄養成分を含む媒体であり、例えば、血清、あるいは増殖因子などの血中成分を含む。培地が含む成分は、保存する生細胞に応じて決定される。

また、細胞培養容器は、培地が漏れ出さないように密封手段によって密封される。細胞培養容器は、例えば、開口部分を有するシャーレ若しくはプレート、フラスコに複数のマイクロ容器が形成されたものである。密封にあたっては、細胞培養容器の上面の開口部分をフィルムまたはキャップなどの密封手段で覆い、生細胞を外部と隔離させた状態で保存する。密封手段は、液体や気体の流入を遮断する材質ものであってもよいし、二酸化炭素あるいは酸素と透過するものを用いてもよい。保存する生細胞や培養状態に応じて選択されればよい。また、生細胞を輸送する場合、培地が漏れ出さないように密封されることが必須となるが、静置状態で保存される期間には、培地の乾燥が防止できる程度に蓋をした状態であってもよいし、開口部分が空いた状態で保存する場合であってもよい。生細胞の保存状態に応じて、細胞培養容器が密封されていない状態であってもよい。

最後に保存工程について説明する。保存時には、細胞培養容器は、４℃以上３７℃未満の温度範囲のいずれかの温度に調整されるのが好ましく、６℃以上２５℃未満であるのがより好ましく、１０℃以上２０℃以下であるのがさらに好ましい。また、保存工程には、保存準備工程で作製した密封された細胞培養容器を輸送する期間も含まれる。輸送する期間にも温度調節が実施されるのが好ましい。

ここで、保存準備工程終了後の細胞培養容器の状態例を図７に示す。図７では、図５及び図６に示した細胞培養容器を用いて、培養工程及び保存準備工程を行った一例を示し、図６に示した断面図に断面図に生細胞４０と密封手段３０とを追加したものである。具体的には、細胞培養容器２０内の各マイクロ容器１１には、生細胞４０が接着され、培養されている。図７では、生細胞４０は黒塗りの丸で簡略化して示し、培地５０は、二点鎖線の位置まで入れられたことを示す。密封手段３０は、細胞培養容器２０を密封している。図７に示す培地の量は一例であり、例えば容器の３分の１の容積の培地を注入する場合であってもよいし、密封手段３０との間に空気層がなくなる状態まで培地を注入する場合であってもよい。培地の容量は、適宜生細胞の種類、培養状態などによって選択される。

以上説明したように、上記実施の形態の一態様によれば、特殊な高分子を用いることなく、生細胞を、硬いプラスチック状の培養基盤と接着させた状態で三次元構造を形成させて保存することができる。生細胞は、三次元構造体にすると細胞の機能が向上することが知られている。従って、生細胞を培養した後、機能を維持した状態で保存することが可能となる。

さらに、車両、船舶、航空機等の輸送手段を用いて細胞を輸送する場合、輸送中の環境要因、例えば、振動・温度・ＣＯ_２濃度（培地のｐＨの変動）などにより、さらに細胞の機能が低下すること、あるいは、輸送中に生じる振動によって、細胞の剥離やゲルの崩壊による細胞死などが懸念されていた。これらの問題についても本発明の実施の形態の一態様を適用することによって、生細胞の機能を維持して輸送することが可能となる。

例えば、生体から分離した新鮮肝細胞を他の場所に輸送する場合に本発明を適用することができる。特に、生体から分離した新鮮肝細胞は、所定時間（６０時間）しか生存しないとされている。このような場合にも新鮮肝細胞の三次元構造を維持し、機能を維持した状態で細胞を輸送することを可能にすることが期待できる。また、生体から分離した新鮮肝細胞を凍結した状態で輸送していた場合にも本発明の一態様を適用でき、凍結細胞を融解した後、本発明の方法を用いることで、非凍結状態で保存または輸送することを可能にすることが期待できる。さらに、生細胞の三次元構造をゲルなどの高分子を用いて輸送する場合には、ゲルが生細胞から剥がれたり、ゲルの形状が変形することによって生細胞の三次元構造が壊れることがあったが、本発明の一態様を適用することによって、三次元構造を維持し、機能を維持した状態で生細胞を輸送することを可能にすることが期待できる。

次に本発明に係る細胞培養方法の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

［実施例０１］
複数のマイクロ空間を有する細胞培養容器で保存した場合と平板で保存した場合の実施例

（培養容器）
＜実施例０１＞
図３、４に示す凹凸パターン形状であって、ａ＝２００μｍ、ｂ＝２０μｍ、ｃ＝５０μｍ、のパターンをフォトリソグラフィにより作製し、Ｎｉ電解メッキを行い、対応する凹凸形状を有する金型を得た。その金型を用い、ホットエンボス成形によりポリスチレン上に凹凸パターン形状の転写を行い、前記寸法の樹脂基材を作製した。その樹脂基材表面へ真空蒸着により二酸化ケイ素膜を１００ｎｍ形成させたフィルムを作製し、ポリスチレン製の培養底面のない２４穴プレートに、レーザ溶着法でフィルムを貼り付けた後、γ線滅菌を行い、２４ウェルの複数のマイクロ空間を有する培養容器を作製し保存試験に用いた。
＜比較例０１＞
市販（ベクトン・ディッキンソン製、ファルコン（登録商標））のγ線滅菌済み平面状２４ウェル培養プレートを保存試験に用いた。

（細胞培養）
ヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２（財団法人ヒューマンサイエンス研究資料バンク 資源番号ＪＣＲＢ１０５４）を、培養フラスコ（ＣＯＲＮＩＧＮ社製）を用い、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で、所定の細胞数まで増殖させた。培地は、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製）培地を用いた。増殖させた細胞を、０．２５％トリプシン溶液を用いて培養底面から剥離し、遠心分離法にて細胞を回収した。回収した細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液で、細胞濃度が４×１０^５個／ｍＬになるように調整し、各ウェルに５００μＬずつ添加した。その後、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で３日間培養した。

（保存試験）
実施例０１、比較例０１に示した培養容器を用いて、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で３日間培養した後、培地を吸引し、各ウェルに新たに５００μＬの１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を入れ、培養プレートをプラスチック製のフィルムで密閉した後、３７℃のインキュベータに入れ、２４時間保存した。

（分析：アルブミン分泌量の測定）
２４時間保存した後、培地を吸引し、各ウェルに１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を入れ３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で２日間培養した。培養後の上澄みを回収し、ヒトアルブミン分析ＥＬＩＳＡキット（Bethyl Laboratories社製）を用いて、２日間のヒトアルブミン量を測定した。

（結果）
表１にアルブミン分泌量を測定した結果を示した。実施例０１は、比較例０１の３倍の分泌量となった。

［実施例０２−０５］
保存温度についての実施例

（培養容器）
図３、４に示す凹凸パターン形状であって、ａ＝２００μｍ、ｂ＝２０μｍ、ｃ＝５０μｍ、のパターンをフォトリソグラフィにより作製し、Ｎｉ電解メッキを行い、対応する凹凸形状を有する金型を得た。その金型を用い、ホットエンボス成形によりポリスチレン上に凹凸パターン形状の転写を行い、前記寸法の樹脂基材を作製した。その樹脂基材表面へ真空蒸着により二酸化ケイ素膜を１００ｎｍ形成させたフィルムを作製し、ポリスチレン製の培養底面のない２４穴プレートに、レーザ溶着法でフィルムを貼り付けた後、γ線滅菌を行い、２４ウェルの複数のマイクロ空間を有する培養容器（培養プレート）を作製し保存試験に用いた。

（細胞培養）
ヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２（財団法人ヒューマンサイエンス研究資料バンク 資源番号ＪＣＲＢ１０５４）を、培養フラスコ（ＣＯＲＮＩＧＮ社製）を用い、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で、所定の細胞数まで増殖させた。培地は、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製）培地を用いた。増殖させた細胞を、０．２５％トリプシン溶液を用いて培養底面から剥離し、遠心分離法にて細胞を回収した。回収した細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液で、細胞濃度が４×１０^５個／ｍＬになるように調整し、培養容器の各ウェルに５００μＬずつ添加した。その後、細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で３日間培養した。

（保存試験）
３日間培養した後、培地を吸引し、各ウェルに５００μＬの１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を入れた。培養容器をプラスチック製のフィルムで密閉した後、以下の実施例の保存方法で保存した。保存中の庫内温度は温度センサーを用いて測定し、目的温度を保っていることを確認した。
＜実施例０２＞
１８℃の定温保温剤が入った保存容器（日立物流社製）を用い、２４時間保存した。このときの庫内の温度は、１８℃±０．５℃であった。
＜実施例０３＞
６℃の定温保温剤が入った保存容器（日立物流社製）を用い、２４時間保存した。このときの庫内の温度は、６℃±０．５℃であった。
＜実施例０４＞
発泡スチロール製の容器の中に氷を入れ、その上に培養容器を置き２４時間保存した。このときの培養容器底面の温度は０℃±０．５℃であった。
＜実施例０５＞
３７℃のインキュベータに入れ、２４時間保存した。

（分析）
２４時間保存後、培地を吸引し、各ウェルに１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を入れ、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で２４時間培養した。その後、倒立顕微鏡を用いて観察を行い、任意の視野について、３０〜２００μｍの細胞塊が形成された数をカウントし、以下の式で細胞塊形成率を算出した。また、保存前の細胞塊形成率についても同様の方法で算出した。

ただし、（式１）において、
「１視野内マイクロ空間の個数」は、１視野（任意の範囲の視野）に存在するマイクロ空間（マイクロ容器）の個数をいう。
「細胞塊が形成された１視野内マイクロ空間個数」は、１視野内マイクロ空間のうち、３０〜２００μｍの細胞塊が形成されているマイクロ空間の個数をいう。

（結果）
表２に細胞塊形成率を示した。保存前の細胞塊形成率は、８０〜１００％であった。実施例０２（１８℃）では、保存前の形態がほぼ完全に保たれていた。実施例０３（６℃）は、細胞塊形成率が低下するものの、６０％〜８０％の形態が維持されていた。実施例０４（０℃）は３０％と形成率が低くほとんど形態が維持されなかった。実施例０５（３７℃）は２５％と形成率が一番低く、ほとんど形態が維持されなかった。
この結果から、保存温度は、１０℃以上２０℃以下が好ましく、１８℃が特に好ましいことがわかった。

［実施例０６、０７］
細胞密度についての実施例

（培養容器）
実施例０６、０７は、実施例０２−０５と同じ培養容器を使用した。

（細胞培養）
ヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２（財団法人ヒューマンサイエンス研究資料バンク 資源番号ＪＣＲＢ１０５４）を、培養フラスコ（ＣＯＲＮＩＧＮ社製）を用い、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で、所定の細胞数まで増殖させた。培地は、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製）培地を用いた。増殖させた細胞を、０．２５％トリプシン溶液を用いて培養底面から剥離し、遠心分離法にて細胞を回収した。回収した細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液で、実施例に示した細胞濃度に調整し、培養容器の各ウェルに５００μＬずつ添加した。その後、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で３日間培養した。

＜実施例０６＞
細胞を播種する際、細胞濃度を４×１０^５個／ｍＬに調整し、以下に示す保存条件で保存した。
＜実施例０７＞
細胞を播種する際、細胞濃度を４０×１０^５個／ｍＬに調整し、以下に示す保存条件で保存した。

（保存条件）
３日間培養した後、培地を吸引し、各ウェルに５００μＬの１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を入れ、培養プレートをプラスチック製のフィルムで密閉した後、１８℃の定温保温剤が入った容器（日立物流社製）に入れ、２４時間保存した。

（分析）
（アルブミン分析）
２４時間保存した後、培地を吸引し、各ウェルに１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を入れ３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で２日間培養した。培養後の上澄みを回収し、ヒトアルブミン分析ＥＬＩＳＡキット（Bethyl Laboratories社製）を用いて、２日間のヒトアルブミン分泌量（ｎｇ／ｍＬ／２ｄａｙｓ）を測定した。次に、０．２５％のトリプシン溶液で細胞を剥離し、トリパンブルーで生細胞の値を算出、１０^５個あたりの値を、以下に記載の表３のアルブミン分泌量とした（ｐｇ／１０^５／２ｄａｙｓ）。
（形態観察）
２４時間保存した後、培地を吸引し、各ウェルに１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を入れ３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で、２４時間、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で培養した後、倒立顕微鏡を用いて形態を観察した。

（結果）
図８Ａ、８Ｂは、保存容器から取り出した後、２４時間、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で培養した時の写真である。
実施例０６（図８Ａ）では球状の細胞塊が形成されているのに対し、実施例０７（図８Ｂ）ではマイクロ空間内に細胞が密に詰まった状態で塊となり、死んだ細胞が区画外で凝集していた。表３にアルブミン分泌量を示した。アルブミン分泌量については、実施例０６は実施例０７の約２．８倍という高い値を示した。

なお、本発明は上記に示す実施の形態に限定されるものではない。本発明の範囲において、上記実施形態の各要素を、当業者であれば容易に考えうる内容に変更、追加、変換することが可能である。

１０、２０ 細胞培養容器
１１ マイクロ容器
１２ 側壁
１３ 開口部
２３ スポット
２４ スポットの側壁
３０ 密封手段
４０ 生細胞
５０ 培地

Claims (15)

1. 複数のマイクロ空間を有する細胞培養容器を用いて生細胞を保存する細胞保存方法であって、
   生細胞を前記複数のマイクロ空間の表面に接着させて培養し、
   前記培養後、前記複数のマイクロ空間を覆うように、培地を前記細胞培養容器へ注入し、
   前記細胞培養容器を、培地が漏れ出さないように密封して前記生細胞を保存する細胞保存方法。
2. 前記細胞培養容器は、４℃以上３７℃未満の温度に保たれて前記生細胞が保存されることを特徴とする請求項１記載の細胞保存方法。
3. 前記培養は、前記表面に接着され、かつ、各マイクロ空間の空間内に形成される三次元構造体の細胞集団が隔離される細胞数になるように培養することを特徴とする請求項１または２記載の細胞保存方法。
4. 前記複数のマイクロ空間は、底部面積が０．０１〜０．１ｍｍ^２であり、深さが２５〜１５０μｍであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の細胞保存方法。
5. 前記生細胞は、肝細胞、膵ベータ細胞、心筋細胞、神経細胞、皮膚上皮細胞、軟骨細胞、骨細胞、組織幹細胞、ＥＳ細胞、及びｉＰＳ細胞のうちのいずれかであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の細胞保存方法。
6. 前記生細胞は、組織幹細胞、ＥＳ細胞、及びｉＰＳ細胞のうちのいずれかから分化させた、肝細胞、膵ベータ細胞、心筋細胞、神経細胞、皮膚上皮細胞、軟骨細胞、及び骨細胞のうちのいずれかであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の細胞保存方法。
7. 前記培養後、非接着細胞を除去してから前記培地を前記細胞培養容器へ注入することを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の細胞保存方法。
8. 前記生細胞の培養は、生細胞を接着させて培養した後、さらに培養して、増殖、伸展、または凝集させることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の細胞保存方法。
9. 細胞播種密度１×１０^２〜１×１０^６細胞／ｃｍ²で、生細胞が前記複数のマイクロ空間に播種されたことを請求項１乃至８のいずれか一項に記載の細胞保存方法。
10. 前記複数のマイクロ空間に、生細胞が集積した細胞塊が形成されていることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか一項に記載の細胞保存方法。
11. 前記細胞塊の直径は、３０〜２００μｍであることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の細胞保存方法。
12. 前記培地は、血清、増殖因子、及び血中成分の少なくとも一つを含むことを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の細胞保存方法。
13. 酸素または二酸化炭素を透過させる膜を用いて前記細胞培養容器を密封することを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の細胞保存方法。
14. 複数のマイクロ空間を有する細胞培養容器へ生細胞を保存して輸送する細胞輸送方法であって、
    生細胞を前記複数のマイクロ空間の表面に接着させて培養し、
    前記培養後、前記複数のマイクロ空間を覆うように、培地を前記細胞培養容器へ注入し、
    前記細胞培養容器を、培地が漏れ出さないように密封し、
    密封した前記細胞培養容器を、車両、船舶、または航空機のいずれかの輸送手段を用いて輸送する細胞輸送方法。
15. 前記細胞培養容器は、４℃以上３７℃未満の温度に保たれることを特徴とする請求項１４記載の細胞輸送方法。

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