JPWO2009116266A1 - ウイルス感染細胞の検出・同定法及びキット - Google Patents
ウイルス感染細胞の検出・同定法及びキット Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2009116266A1 JPWO2009116266A1 JP2010503771A JP2010503771A JPWO2009116266A1 JP WO2009116266 A1 JPWO2009116266 A1 JP WO2009116266A1 JP 2010503771 A JP2010503771 A JP 2010503771A JP 2010503771 A JP2010503771 A JP 2010503771A JP WO2009116266 A1 JPWO2009116266 A1 JP WO2009116266A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- labeled
- nucleic acid
- cells
- antibody
- virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
- G01N33/56994—Herpetoviridae, e.g. cytomegalovirus, Epstein-Barr virus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/01—DNA viruses
- G01N2333/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
- G01N2333/05—Epstein-Barr virus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
ペプチド核酸(Peptide nucleic acid:PNA)はグリシン骨格が塩基に共有結合した構造をとり、DNA・RNAより安定であり且つ核酸にハイブリダイズできる。このPNAを蛍光標識してプローブとして用い、フローサイトメトリー(FCM)でEBV感染細胞を検出する技術が報告されている(非特許文献1)。このPNAプローブは病理組織診断キットとして市販されており、現在では臨床にて広く用いられている(Epstein-Barr Virus (EBER) PNA Probe/Fluorescein、Code No. Y5200、Dako社)。EBV特異的PNAプローブを用いた上記キットは、スライドに固定した病理組織に用いるために開発されたものであり、血液や浮遊細胞を検体とした検出・診断に適したものではない。また、そのような使用は予定されていない。
T. Just et al., J Virol Methods 73(1998) 163-174
これらの問題点を解決すべく各種実験を施行した。まず、タンパク質用の様々な固定溶液を比較し、最適な固定条件を見出した。一方、ホルムアミドの濃度に注目して検討を行い、最適なハイブリダイゼーション条件を見出した。また、蛍光強度の増幅を図ることによって、検出感度を改善することに成功した。さらに、EBV陽性B細胞株、T細胞株、NK細胞株、臨床検体(末梢血単核球)にFCM/ISH法を適用し、EBER-1と細胞表面抗原の多重染色に成功した。
本発明は主として以上の成果・知見に基づき、次の通りである。
[1] 以下のステップ(1)〜(5)を含む、ウイルス感染細胞を検出及び同定する方法:
(1)標的細胞特異的な細胞表面抗原に対する、第1標識物質で標識された第1標識抗体を検体に添加し、反応させるステップ;
(2)RNA安定化剤の存在下、タンパク質を固定化するステップ;
(3)界面活性剤で処理するステップ;
(4)標的ウイルスに特異的な核酸に対する標識核酸プローブを添加し、ハイブリダイゼーションさせるステップ;
(5)フローサイトメトリーによって、第1標識抗体と標識核酸プローブの両方で標識された細胞を検出するステップ。
[2] 標的ウイルスがエプスタイン・バール・ウイルスである、[1]に記載の方法。
[3] 標的ウイルスに特異的な核酸が、エプスタイン・バール・ウイルスがコードする小RNA(EBER)である、[2]に記載の方法。
[4] 標的細胞がB細胞、T細胞又はNK細胞である、[1]〜[3]のいずれか一項に記載の方法。
[5] 検体が血液検体である、[4]に記載の方法。
[6] RNA安定化剤が酢酸である、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の方法。
[7] ステップ(2)を、酢酸濃度が0.5 %(v/v)〜2.0 %(v/v)の条件下で実施する、[6]に記載の方法。
[8] ステップ(2)における固定化剤としてパラホルムアルデヒドを用いる、[6]又は[7]に記載の方法。
[9] 界面活性剤が非イオン系界面活性剤である、[1]〜[8]のいずれか一項に記載の方法。
[10] ステップ(4)を、ホルムアミド濃度が15 %(v/v)〜25 %(v/v)の条件下で実施する、[1]〜[9]のいずれか一項に記載の方法。
[11] 標識核酸プローブが標識ペプチド核酸(PNA)である、[1]〜[10]のいずれか一項に記載の方法。
[12] ステップ(4)に続いて、
(4−1)標識核酸プローブの標識部分に対する、第2標識物質で標識された第2標識抗体を添加し、反応させるステップを行い、
ステップ(5)では、第1標識抗体と第2標識物質の両方で標識された細胞が検出される、[1]〜[11]のいずれか一項に記載の方法。
[13] ステップ(4)に続いて、
(4−1)標識核酸プローブの標識部分に対する、第2標識物質で標識された第2標識抗体を添加し、反応させるステップと、
(4−2)第2標識抗体に対する、第3標識物質で標識された第3標識抗体を添加し、反応させるステップを行い、
ステップ(5)では、第1標識抗体と第3標識物質の両方で標識された細胞が検出される、[1]〜[11]のいずれか一項に記載の方法。
[14] 第2標識物質が、Alexa Fluor(登録商標)488、Oregon Green(登録商標)-488、Rhodamine-123、Cy2、CYBR(登録商標) Green I、及びEGFPからなる群より選択される蛍光色素であり、
第3標識物質が、Alexa Fluor(登録商標)488、Oregon Green(登録商標)-488、Rhodamine-123、Cy2、CYBR(登録商標) Green I、及びEGFPからなる群より選択される蛍光色素である、[13]に記載の方法。
[15] 第2標識物質と第3標識物質が同一である、[13]又は[14]に記載の方法。
[16] 標的細胞特異的な細胞表面抗原に対する、第1標識物質で標識された第1標識抗体と、
エプスタイン・バール・ウイルスに特異的な核酸に対する標識核酸プローブと、
標識核酸プローブの標識部分に対する、第2標識物質で標識された第2標識抗体と、
第2標識抗体に対する、第3標識物質で標識された第3標識抗体と、
を含む、エプスタイン・バール・ウイルス感染細胞の検出及び同定用キット。
(1)標的細胞特異的な細胞表面抗原に対する、第1標識物質で標識された第1標識抗体を検体に添加し、反応させるステップ;
(2)RNA安定化剤の存在下、タンパク質を固定化するステップ;
(3)界面活性剤で処理するステップ;
(4)標的ウイルスに特異的な核酸に対する標識核酸プローブを添加し、ハイブリダイゼーションさせるステップ;
(5)フローサイトメトリーによって、第1標識抗体と標識核酸プローブの両方で標識された細胞を検出するステップ。
ステップ(1)では所定の抗体を用意して抗原抗体反応を行い、抗原抗体複合体を形成させる。標的細胞特異的な細胞表面抗原に対する標識抗体が用いられる。「標的細胞特異的な細胞表面抗原」とは、標的細胞の細胞表面に発現し、当該細胞であることを確認するための指標として利用可能な抗原タンパク質のことをいう。細胞表面抗原の例を挙げると、CD2(T細胞、NK細胞)、CD3(T細胞)、CD4(ヘルパーT細胞)、CD8(キラーT細胞)、CD16(NK細胞)、CD19(B細胞)、CD20(B細胞)、CD21(B細胞)、CD34(骨髄幹細胞)、CD40(B細胞)、CD40L(T細胞)、CD80(B細胞、樹状細胞、マクロファージ)、HLAクラスII抗原(B細胞、マクロファージ、T細胞など)、CD56(NK細胞)、CD86(B細胞、樹状細胞、マクロファージ)、CD161(NK細胞、T細胞)、TCRαβ(T細胞)、TCRγδ(T細胞)、iNKT(NKT細胞)である。細胞表面抗原については例えばZola H, Swart B, Banham A, et al. "CD molecules 2006 - Human cell differentiation molecules." Journal of Immunological Methods, 2006.、Zola H, Swart B, Boumsell L, et al. "Human Leucocyte Differentiation Antigen nomenclature: update on CD nomenclature. Report of IUIS/WHO Subcommittee." Journal of Immunological Methods, 275, 2004, p.p. 1-8.、Human Cell Differentiation Moleculesの公式サイト(ウェブページ)等に詳しい。尚、説明の便宜上、「標的細胞特異的な細胞表面抗原」のことを以下では「標的抗原」と略称する。「標的細胞」は、標的ウイルスの種類や検出・同定結果の用途等に応じて適宜選択される。標的細胞の例はB細胞、T細胞、NK細胞、NKT細胞、マクロファージ、樹状細胞、赤芽球、骨髄幹細胞、骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、多核白血球、及び巨核芽球である。
一方、モノクローナル抗体については次の手順で調製することができる。まず、上記と同様の手順で免疫操作を実施する。必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で免疫動物から抗体産生細胞を摘出する。次に、得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合してハイブリドーマを得る。続いて、このハイブリドーマをモノクローナル化した後、目的タンパク質に対して高い特異性を有する抗体を産生するクローンを選択する。選択されたクローンの培養液を精製することによって目的の抗体が得られる。一方、ハイブリドーマを所望数以上に増殖させた後、これを動物(例えばマウス)の腹腔内に移植し、腹水内で増殖させて腹水を精製することにより目的の抗体を取得することもできる。上記培養液の精製又は腹水の精製には、プロテインG、プロテインA等を用いたアフィニティークロマトグラフィーが好適に用いられる。また、抗原を固相化したアフィニティークロマトグラフィーを用いることもできる。更には、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、硫安分画、及び遠心分離等の方法を用いることもできる。これらの方法は単独ないし任意に組み合わされて用いられる。
尚、標的抗原に対する抗体が市販されている場合、これを利用することにしてもよい。
特定のウイルス疾患の罹患可能性を調べる目的において広く本発明を適用可能であり、被検者も特に限定されない。例えば特定のウイルス疾患に罹患していることが疑われる者、他の方法により特定のウイルス疾患に罹患していると判断された者、特定のウイルス疾患の患者、骨髄移植を受けた者、健常者などが被検者となる。尚、ここでの「健常者」とは、本発明の検出・同定法を適用する時点において、特定のウイルス疾患に罹患しているとの判断が行われていない者のことをいう。
ステップ(1)に続くステップ(2)では、RNA安定化剤の存在下、タンパク質を固定化する。尚、原則として、洗浄処理後にステップ(2)を行う。
「RNA安定化剤」は、タンパク質の固定に伴うRNAの分解を防止する目的で添加される。RNA安定剤として好ましくは酢酸を用いる。タンパク質の固定化への影響を考慮して酢酸濃度が設定される。本発明者らの検討の結果、酢酸濃度が0.5 %(v/v)〜2.0 %(v/v)のときに良好な結果がもたらされることが判明した。そこで、好ましくは当該濃度範囲を採用する。また、最適な酢酸濃度は1%(v/v)であった。そこで、更に好ましくは当該酢酸濃度で固定化を実施する。
ステップ(2)に続くステップ(3)では界面活性剤で処理する。即ち、膜透過処理を行う。尚、原則として、洗浄処理後にステップ(3)を行う。
所期の目的、即ち細胞の形態を保持しつつ細胞膜及び核膜の透過性が増大し、標識核酸プローブの取り込みが可能になること、を達成可能な限り、界面活性剤の種類や濃度などは特に限定されない。このような目的の膜透過処理には非イオン系界面活性剤が適する。非イオン性界面活性剤としてポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンラウリルエーテルが挙げられ、具体的にはTWEEN(登録商標)20、NP-40(Nonidet P-40)、Triton(登録商標) X-100を例示することができる。界面活性剤の濃度は例えば0.1%(v/v)〜1.0%(v/v)とする。
ステップ(3)に続くステップ(4)では、標的ウイルスに特異的な核酸に対する標識核酸プローブを添加し、ハイブリダイゼーションさせる。尚、原則として、洗浄処理後にステップ(4)を行う。
標識核酸プローブは、標的ウイルスに特異的な核酸に対して特異的にハイブリダイズする限り、配列、構成分子の種類などは特に限定されない。「標的ウイルスに特異的な核酸」とは、当該ウイルスに固有の配列からなり、当該ウイルスの検出に利用可能な核酸のことをいう。例えば、標的ウイルスがEBVであれば、EBVがコードする小RNA(EBER)が「標的ウイルスに特異的な核酸」に該当する。尚、EBERにはEBER-1とEBER-2があるが、好ましくはEBER-1である。EBER-1の方が約10倍発現量が多いからである。
RajiのEBER遺伝子(EBER-1):配列番号1
B95-8のEBER遺伝子(EBER-1):配列番号2
GDIのEBER遺伝子(EBER-1):配列番号3
AG876のEBER遺伝子(EBER-1):配列番号4
SNU-265のEBER遺伝子(EBER-1):配列番号5
SNU-20のEBER遺伝子(EBER-1):配列番号6
AkataのEBER遺伝子(EBER-1):配列番号7
GGCAGCGTAGGTCCT(配列番号8)
このプローブ配列の位置を表1に示す。また、このプローブ配列は表2に示すように、他のEBVウイルス株でも保存されていた。
尚、EBERを標的とした標識PNAプローブ(Epstein-Barr Virus (EBER) PNA Probe/Fluorescein、Code No. Y5200、Dako社)が市販されている。標的ウイルスがEBVのときには当該プローブを「核酸標識プローブ」として用いることができる。
次のステップ(5)において標識核酸プローブをフローサイトメトリーで直接検出しない場合(例えば、後述のステップ(4−1)を行う態様の場合)、蛍光色素以外の標識物質(例えばビオチン)を用いてもよい。
ステップ(4)に続くステップ(5)では、フローサイトメトリー(FCM)によって、第1標識抗体と標識核酸プローブの両方で標識された細胞を検出する。尚、原則として、洗浄処理後にステップ(5)を行う。
ステップ(5)の結果、第1標識抗体と標識核酸プローブの両方で標識された細胞が検出されれば、検体中にウイルス感染細胞が存在し、且つその細胞種が標的細胞と同一であることになる。一方、標識核酸プローブで標識された細胞が検出されるものの、第1標識抗体で標識された細胞が検出されなければ、検体中にウイルス感染細胞が存在するが、その細胞種が標的細胞と異なることになる。また、標識核酸プローブで標識された細胞が検出されないとの検出結果は(第1標識抗体で標識された細胞の検出結果に拘わらず)、検体中にウイルス感染細胞が存在しないことを示す。
上述のように、ステップ(1)において二つ以上の細胞表面抗原を標的にすれば、二つ以上の細胞表面抗原の発現を指標として細胞種の判別を行うことができる。
このように第2標識抗体を用いて間接的な検出を行うことにすると、シグナルが増強し、検出感度やS/N比の向上が図られる。
特に、ウイルス疾患の早期診断に利用可能であるという点において本発明の検出・同定法はその有用性が高い。早期診断が可能になれば、早い段階での医療介入が可能となり、治療効果の向上や予後の改善などがもたらされる。
表面抗原というタンパク質への抗原抗体反応と、EBER-1というRNAへのハイブリダイゼーション反応を連続して行うため、タンパク質・RNAの両方を安定化する固定条件が重要となる。
タンパク質用の固定溶液(ホルマリン、パラホルムアルデヒド、市販の固定溶液など)を数多く試すとともに、温度条件や反応時間などを検討した結果、1%(v/v)酢酸/4%(w/v)パラホルムアルデヒド/PBSを使用し、4℃、40分間固定したときが最適であることを最終的に見出した。根拠となった結果を以下に示す。
EBV感染細胞株であるRaji細胞を、PE標識した抗CD21抗体(Raji細胞はB細胞であるから表面抗原CD21陽性)と反応させ、その後、種々の条件で細胞を固定し(パラホルムアルデヒドは4%(w/v)とし、酢酸濃度を1%刻みで変化させた)、続いてFITC標識EBER-1-PNAプローブ(Dako社、Y5200)を用いin situハイブリダイゼーションを実施した。その後、フローサイトメトリー(ベクトン・ディッキンソン社、FACSCaliberを使用)で蛍光強度を測定した。酢酸濃度が1%の時のPEの蛍光強度が最も高かった(表3)。酢酸濃度の上昇に伴いFITCの蛍光強度は増したが、酢酸濃度1%でも十分な蛍光強度が得られた(表3)。ここには示していないが、酢酸濃度を0.5%刻みで同様の検討を行った結果、酢酸濃度が0.5%(v/v)〜2%(v/v)の範囲にあるとき、タンパク質・RNAの両方が良好に検出できた。
フローサイトメトリーとin situハイブリダイゼーションを組み合わせた検出・同定法(FCM/ISH法)の確立のためには、PNAプローブが特異的にEBER-1にハイブリダイズし、且つ表面抗原抗体複合体が脱落・変性しないという条件を決定することも重要である。鋭意検討の末、ハイブリダイゼーション反応の最適な条件として、10 mM NaCl、5 mM Na2EDTA、50 mM Tris-HCl(pH 7.5)、20%(v/v)ホルムアミド存在下で、56℃、60分反応させる条件を見出した。根拠となった結果を以下に示す。
EBV感染細胞株であるRaji細胞を、PE標識した抗CD21抗体と反応させた後、種々の条件で細胞を固定した。続いてin situハイブリダイゼーションを行い、フローサイトメトリーで蛍光を測定した。バックグラウンドの減少に最も影響を与えるホルムアミド濃度について0%(v/v)〜30%(v/v)まで5%刻みで検討した。以下に示したごとく、ホルムアミドが25%(v/v)以上の場合には、PE標識抗CD21抗体の検出が顕著に不良となり、表面抗原抗体複合体が脱落・変性していることが明らかであった(表4)。尚、ホルムアミド濃度が15%(v/v)〜25%(v/v)の範囲にあるとき、表面抗原とEBER-1の双方が良好に検出でき、20%(v/v)の時が最もバランスがよかった。
市販のPNAプローブ(FITC標識EBER-1-PNAプローブ(Dako社、Y5200))は蛍光の弱いFITCを用いているためシグナルは弱く、フローサイトメトリーでも検出が難しい。
FITCにて標識されたPNAプローブのシグナルを増強するため、ハイブリダイゼーション反応後、二次抗体Alexa Fluor(登録商標)488標識Anti-FITC rabbit IgG(Invitrogen社:A11090)、次いで三次抗体Alexa Fluor(登録商標)488標識Anti-rabbit goat IgG(Invitrogen社:A11034)と、それぞれ室温、20分反応させた。その結果、二次抗体、三次抗体の濃度がいずれも2.5μg/mLの時にシグナル/バックグランド比が高くなり、極めて強いシグナルが得られることがわかった。この根拠となった結果の一部を以下に示す。
EBV陽性のRaji細胞およびEBV陰性のBJAB細胞を固定し、FITC標識EBER-1-PNAプローブ(Dako社、Y5200)を用いin situハイブリダイゼーションを行い、二次抗体のみ又は二次抗体と三次抗体の両者で増幅したときの蛍光強度と、増幅前の蛍光強度を比較した。Raji細胞では、三次抗体を用いたときにシグナルの顕著な増幅を認めた(図1、左)。一方、BJAB細胞では蛍光強度の増幅は認められなかった(図1、右)。
EBV陽性B細胞株Raji、EBV陰性B細胞株BJABを様々な比率(Raji 100%, 10%, 1%, 0.1%, 0.01%, 0.001%)で混ぜたサンプルを用いてFCM/ISH法を行い、EBV陽性細胞の検出限界を検討した。図3に示したごとく、EBV陽性細胞混合比率0.01%まで検出できた(0.001%では0%[BJAB100%]との間に差を認めていない)。このことは末梢血単核球1万個に1個のEBV感染細胞があれば、このシステムで検出できることを示している。
各反応について、以上の検討によって見出された最適条件を採用し、EBV陽性B細胞株、T細胞株、NK細胞株、臨床材料(末梢血単核球)を検体として、FCM/ISH法で細胞表面抗原とウイルス特異的mRNAであるEBER-1との多重染色を試みた。表面抗原に関しては、2種類の蛍光色素PE及びPC5を用いて染色した。EBER-1の標識に関しては、FITC標識EBER-1-PNAプローブによるハイブリダイゼーション反応の後、二次抗体Alexa Fluor(登録商標)488標識Anti-FITC rabbit IgG(Invitrogen社:A11090)、次いで三次抗体Alexa Fluor(登録商標)488標識Anti-rabbit goat IgG(Invitrogen社:A11034)を反応させた。このようにして、PE、PC5及びAlexa Fluor(登録商標)488による多重染色を行った。具体的な操作手順を以下に示す。
(1)細胞数の調整
1mlあたり1×106個となるようPBS/2%FCSで細胞数を調整した。200μlずつ1.5mlチューブに移した(チューブあたり2×105個)。遠心処理後(5000rpm、1分)、上清を吸引除去した。臨床材料として用いた患者末梢血は、患者および親権者から同意を得た後に採血し、常法に従い単核球を分離し実験に用いた。尚、以下の操作は部屋を暗くして行なった。
(2)抗原抗体反応
細胞をPBS/2%FCS 40μlに再浮遊させた後、蛍光標識(PE又はPC5)抗体10μlを加え、4℃、60分間、反応させた。1ml PBS/2%FCSを添加した後、遠心(5000rpm、1分)し、上清を捨てた。この洗浄操作を合計2回行った。
(3)固定化
300μlの1%(v/v)酢酸/4%(w/v)パラホルムアルデヒド/PBSを加え、軽くピペッティングし、4℃、40分間、反応させた。
(4)細胞の洗浄
遠心(6000rpm、2分)した後、上清を捨てた。1ml PBS加え撹拌した後、遠心し(6000rpm、2分)、上清を吸引除去した。
(5)膜透過処理
0.5%(v/v)TWEEN(登録商標)20/PBSを50μl入れた後、10分間、室温で放置した。
(6)ハイブリダイゼーション
遠心(5000rpm、1分)後、上清を吸引除去した。バッファー(最終濃度が10 mM NaCl, 5 mM Na2EDTA, 50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 20% (v/v)ホルムアミド)12.5μlとプローブ(Epstein-Barr Virus (EBER) PNA Probe/Fluorescein(Code No. Y5200、Dako社)又は当該プローブに添付の陰性コントロールPNAプローブ)25μlを添加し、細胞を再浮遊させた後、56℃、60分、反応させた。
(7)細胞の洗浄
1mlの0.5%(v/v)TWEEN(登録商標)20/PBSを加え撹拌した後、56℃、10分、反応させた。遠心(5000rpm、1分)後、上清を捨てた。1mlの0.5%(v/v)TWEEN(登録商標)20/PBSを加え撹拌した後、56℃、30分、反応させた。
(8)Alexa標識二次抗体の反応
Alexa Fluor(登録商標)488標識Anti-FITC rabbit IgG (Invitrogen社:A11090)を200μl加えた。室温で20分、反応させた(抗体の最終濃度は2.5μg/ml)。1mlの0.5%(v/v)TWEEN(登録商標)20/PBSを加え撹拌した後、遠心(5000rpm、1分)し、上清を捨てた。この洗浄操作を合計2回行った。
(9)Alexa標識三次抗体の反応
Alexa Fluor(登録商標)488標識Anti-rabbit goat IgG (Invitrogen社:A11034)を200μl加えた。室温で20分、反応させた(抗体の最終濃度は2.5μg/ml)。1mlの0.5%(v/v)TWEEN(登録商標)20/PBSを加え撹拌した後、遠心(5000rpm、1分)し、上清を捨てた。この洗浄操作を合計2回行った。
(10)フローサイトメトリー解析
0.5mlの0.5%(v/v)TWEEN(登録商標)20/PBSを加え撹拌した後、フローサイトメトリー解析に供した(ベクトン・ディッキンソン社、FACSCaliberを使用)。
SNK6についての検出結果を図5に示す。EBV陽性NK細胞株であるSNK6は表面抗原のCD2、CD56、HLA-DRが陽性であり、CD3、CD16、CD19が陰性であった。
ヒト臨床検体についての検出結果を図6に示す。ヒト臨床検体(慢性活動性EBV感染症患者の末梢血)についてもEBER-1と細胞表面抗原の多重染色が可能であり、EBV感染細胞の同定できた。患者A・Bの末梢血それぞれ約8%・7%がEBVに感染しており、感染細胞はいずれもCD3陽性のT細胞と考えられた。
図7に示す通り、種痘様水疱症を伴う慢性活動性EBV感染症患者末梢血中に1.7〜25.9%のEBER陽性細胞を認めた。また、これらの患者ではCD3+CD4-CD8-TCRγδ+T細胞にEBVが感染していた(図8〜10)。このように、本願発明の方法がEBV関連疾患の診断のみならず発症病理の解明に役立つことが示された。
本発明は特にEBV感染細胞の検出・同定に有用である。ここで、日和見リンパ腫はAIDSや臓器・骨髄移植に合併する致死的なEBV関連疾患である。日和見リンパ腫は、末梢血中のEBV感染細胞の増加と、感染細胞がB細胞であることが診断根拠となる。従来は、リンパ節を生検し組織中のEBV感染細胞を同定していたため、侵襲が強い上に診断にも時間がかかった。末梢血を検体として本発明を適用すれば、侵襲がない上に極めて短時間で感染細胞の定量と同定が同時に可能である。ところで、近年、日和見リンパ腫の治療にはB細胞モノクローナル抗体であるリツキシマブ(Rituximab)が用いられている。本発明の検出・同定法の結果を利用すれば日和見リンパ腫の早期診断が可能となり、より早い段階で治療を開始することができる。また、本発明の検出・同定法は治療効果の判定にも有用である。本発明の検出・同定法の適用が想定されるEBV関連疾患は、日和見リンパ腫以外にも、鼻性NKリンパ腫、ホジキンリンパ腫、NK白血病、T細胞性リンパ腫、慢性活動性EBV感染症、伝染性単核球症など多岐にわたる。
使用する核酸プローブを適宜選択・変更すれば、様々なウイルス疾患(HIV感染症、サイトメガロウイルスなど血液細胞に感染するウイルス疾患)へ本発明を適用可能である。このように本発明はその汎用性及び応用可能性が極めて高く、ウイルス関連疾患の診断・治療分野での多大な貢献が期待される。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
Claims (16)
- 以下のステップ(1)〜(5)を含む、ウイルス感染細胞を検出及び同定する方法:
(1)標的細胞特異的な細胞表面抗原に対する、第1標識物質で標識された第1標識抗体を検体に添加し、反応させるステップ;
(2)RNA安定化剤の存在下、タンパク質を固定化するステップ;
(3)界面活性剤で処理するステップ;
(4)標的ウイルスに特異的な核酸に対する標識核酸プローブを添加し、ハイブリダイゼーションさせるステップ;
(5)フローサイトメトリーによって、第1標識抗体と標識核酸プローブの両方で標識された細胞を検出するステップ。 - 標的ウイルスがエプスタイン・バール・ウイルスである、請求項1に記載の方法。
- 標的ウイルスに特異的な核酸が、エプスタイン・バール・ウイルスがコードする小RNA(EBER)である、請求項2に記載の方法。
- 標的細胞がB細胞、T細胞又はNK細胞である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 検体が血液検体である、請求項4に記載の方法。
- RNA安定化剤が酢酸である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(2)を、酢酸濃度が0.5 %(v/v)〜2.0 %(v/v)の条件下で実施する、請求項6に記載の方法。
- ステップ(2)における固定化剤としてパラホルムアルデヒドを用いる、請求項6又は7に記載の方法。
- 界面活性剤が非イオン系界面活性剤である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(4)を、ホルムアミド濃度が15 %(v/v)〜25 %(v/v)の条件下で実施する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 標識核酸プローブが標識ペプチド核酸(PNA)である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(4)に続いて、
(4−1)標識核酸プローブの標識部分に対する、第2標識物質で標識された第2標識抗体を添加し、反応させるステップを行い、
ステップ(5)では、第1標識抗体と第2標識物質の両方で標識された細胞が検出される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。 - ステップ(4)に続いて、
(4−1)標識核酸プローブの標識部分に対する、第2標識物質で標識された第2標識抗体を添加し、反応させるステップと、
(4−2)第2標識抗体に対する、第3標識物質で標識された第3標識抗体を添加し、反応させるステップを行い、
ステップ(5)では、第1標識抗体と第3標識物質の両方で標識された細胞が検出される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。 - 第2標識物質がAlexa Fluor(登録商標)488、Oregon Green(登録商標)-488、Rhodamine-123、Cy2、CYBR(登録商標) Green I、及びEGFPからなる群より選択される蛍光色素であり、
第3標識物質がAlexa Fluor(登録商標)488、Oregon Green(登録商標)-488、Rhodamine-123、Cy2、CYBR(登録商標) Green I、及びEGFPからなる群より選択される蛍光色素である、請求項13に記載の方法。 - 第2標識物質と第3標識物質が同一である、請求項13又は14に記載の方法。
- 標的細胞特異的な細胞表面抗原に対する、第1標識物質で標識された第1標識抗体と、
エプスタイン・バール・ウイルスに特異的な核酸に対する標識核酸プローブと、
標識核酸プローブの標識部分に対する、第2標識物質で標識された第2標識抗体と、
第2標識抗体に対する、第3標識物質で標識された第3標識抗体と、
を含む、エプスタイン・バール・ウイルス感染細胞の検出及び同定用キット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010503771A JP5429679B2 (ja) | 2008-03-21 | 2009-03-17 | ウイルス感染細胞の検出・同定法及びキット |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008073384 | 2008-03-21 | ||
JP2008073384 | 2008-03-21 | ||
PCT/JP2009/001173 WO2009116266A1 (ja) | 2008-03-21 | 2009-03-17 | ウイルス感染細胞の検出・同定法及びキット |
JP2010503771A JP5429679B2 (ja) | 2008-03-21 | 2009-03-17 | ウイルス感染細胞の検出・同定法及びキット |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2009116266A1 true JPWO2009116266A1 (ja) | 2011-07-21 |
JP5429679B2 JP5429679B2 (ja) | 2014-02-26 |
Family
ID=41090681
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010503771A Expired - Fee Related JP5429679B2 (ja) | 2008-03-21 | 2009-03-17 | ウイルス感染細胞の検出・同定法及びキット |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20110065094A1 (ja) |
JP (1) | JP5429679B2 (ja) |
WO (1) | WO2009116266A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6127972B2 (ja) * | 2011-09-09 | 2017-05-17 | コニカミノルタ株式会社 | 組織染色方法 |
WO2013146741A1 (ja) * | 2012-03-30 | 2013-10-03 | コニカミノルタ株式会社 | 組織染色方法 |
KR102532080B1 (ko) * | 2018-07-12 | 2023-05-11 | 베크만 컬터, 인코포레이티드 | 고정 가능한 생존력 염료 및 그 용도 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100488131B1 (ko) * | 2001-07-07 | 2005-05-06 | (주)푸드바이오테크 | 알레르기 진단용 단백질 칩과 알레르기 유발원의 검출방법 및 알레르기 유발 항체의 검출 방법 |
CA2711736A1 (en) * | 2008-01-18 | 2009-07-23 | Medimmune, Llc | Cysteine engineered antibodies for site-specific conjugation |
-
2009
- 2009-03-17 US US12/933,736 patent/US20110065094A1/en not_active Abandoned
- 2009-03-17 WO PCT/JP2009/001173 patent/WO2009116266A1/ja active Application Filing
- 2009-03-17 JP JP2010503771A patent/JP5429679B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2009116266A1 (ja) | 2009-09-24 |
US20110065094A1 (en) | 2011-03-17 |
JP5429679B2 (ja) | 2014-02-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Serafini et al. | Epstein-Barr virus latent infection and BAFF expression in B cells in the multiple sclerosis brain: implications for viral persistence and intrathecal B-cell activation | |
Delfau-Larue et al. | Targeting intratumoral B cells with rituximab in addition to CHOP in angioimmunoblastic T-cell lymphoma. A clinicobiological study of the GELA | |
Ruokonen et al. | Intraocular antibody synthesis against rubella virus and other microorganisms in Fuchs' heterochromic cyclitis | |
Duus et al. | Wild-type Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus isolated from the oropharynx of immune-competent individuals has tropism for cultured oral epithelial cells | |
Kimura et al. | Identification of Epstein-Barr virus (EBV)–infected lymphocyte subtypes by flow cytometric in situ hybridization in EBV-associated lymphoproliferative diseases | |
Rodriguez-Pla et al. | No detection of parvovirus B19 or herpesvirus DNA in giant cell arteritis | |
US20210301357A1 (en) | Comprehensive and comparative flow cytometry-based methods for identifying the state of a biological system | |
Walling et al. | Epstein-Barr virus infection of Langerhans cell precursors as a mechanism of oral epithelial entry, persistence, and reactivation | |
Huh et al. | A pathologic study of Hodgkin's disease in Korea and its association with the Epstein‐Barr virus infection | |
US20140178968A1 (en) | Genetic variant of cytomegalovirus (cmv) | |
JP5429679B2 (ja) | ウイルス感染細胞の検出・同定法及びキット | |
De Rossi et al. | HIV-1 induces down-regulation of bcl-2 expression and death by apoptosis of EBV-immortalized B cells: a model for a persistent" self-limiting" HIV-1 infection | |
Jarrett et al. | The role of viruses in the genesis of Hodgkin lymphoma | |
Ammatuna et al. | Detection of Epstein‐Barr virus (EBV) DNA and antigens in oral mucosa of renal transplant patients without clinical evidence of oral hairy leukoplakia (OHL) | |
Khan et al. | Phenotype and frequency of Epstein–Barr virus‐infected cells in pretreatment blood samples from patients with Hodgkin lymphoma | |
US20040082005A1 (en) | Localization of human cytomegalovirus nucleic acids and proteins in human cancer cells | |
NO874573L (no) | Nucleinsyreprober for paavisning av latent humant cytomegalovirus i blodprodukter. | |
Kasprzak et al. | Epstein-Barr virus (EBV) infection in B-cell non-Hodgkin's lymphomas in children: virus latency and its correlation with CD21 and CD23 molecules. | |
US9696308B2 (en) | Use of at least one biomarker for the in vitro prognosis or diagnosis of lymphoproliferative episodes associated with the Epstein-Barr virus (EBV) | |
Preciado et al. | Epstein barr virus associated pediatric nasopharyngeal carcinoma: Its correlation with p53 and bcl‐2 expression | |
Razzaque et al. | Detection of human herpesvirus 6 sequences in lymphoma tissues by immunohistochemistry and polymerase chain reactions | |
Chapenko et al. | Infection of b-herpesviruses (CMV, HHV-6, HHV-7): role in postrenal transplantation complications | |
Aghbash et al. | Immune-checkpoint expression in antigen-presenting cells (APCs) of cytomegaloviruses infection after transplantation: as a diagnostic biomarker | |
Jun et al. | Development of two potential diagnostic monoclonal antibodies against human cytomegalovirus glycoprotein B | |
Fallatah | Immune Responses to BK Polyomavirus in Healthy Donors and Renal Transplant Recipients |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120312 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130819 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131009 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20131106 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20131123 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5429679 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |