NO874573L - Nucleinsyreprober for paavisning av latent humant cytomegalovirus i blodprodukter. - Google Patents

Description

Kryssreferanse til beslektede søknader

Foreliggende patentsøknad er en delvis fortsettelse av U.S. patentsøknad nr. 726.454 innlevert 29. april 1985, som selv er en delvis fortsettelse av U.S. patentsøknad nr. 607.387 innlevert 4. mai 1984 fra hvilke teknikkene herved er innlemmet ved referanse.

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av en human cytomegalovirus (HCMV)-DNA-probe, og anvendelsen av en slik probe for å påvise HCMV i en kroppsprøve. Oppfinnelsen er spesielt anvendelig i sikteanalyse av blodprodukter for tilstedeværelse av HCMV forut for blodoverføring.

Bakgrunn

A. Cytomegalovirusinfeksjon

Cytomegalovirus-innleiringssykdom (CID), alminnelig utbredt spyttkjertel-virussykdom, cytomegali og innleiringssykdom, er synonymer for en sykdom forårsaket av cytomegalovirus (CMV)-infeksjon. CMV er et artsspesifikt stoff med fysiokjemiske og elektronmikroskopiske karakter-istika av et herpesvirus. Humant cytomegalovirus (HCMV)

ble først isolert i fibroblastisk vevskultur i midten av 1950-årene fra spebarn med CID og fra kjertelvev hos barn i skolealderen. En cytopatisk effekt ble konstatert i vevskultur som varkarakterisert vedstore intranucleære inn-leiringer. Utbredelsen av dette virus tilveiebragte grunn-laget for utviklingen av spesifikke, serologiske undersøk-elser som vil beskrives.

Cytomegalovirusinfeksjon er utbredt i hele verden. Cytomegalovirus forårsaker imidlertid ikke en sterkt smittsom infeksjon. Således forblir et betydelig antall individer mottagelige for infeksjonen i sitt voksne liv. CMV er isolert fra spytt, de øvre luftveier, urin, melk, hals-sekreter, sæd, avføring og sirkulerende leukocytter i blod. Viruset overføres sannsynligvis ved intim kontakt med et smittet individ, eller ved tilførsel av blod fra en asymptomatisk blodgiver.

CMV er forbundet med et bredt spektrum av kliniske sykdommer fra utydelig infeksjon til alvorlig medfødt sykdom. Weller, T., N. Engl. J. Med., 285, 203 og 267 (1971).

F.eks. forekommer sykdom hos pasienter som undergår immunundertrykkende terapi, og hos de som er gjenstand for opportunistiske infeksjoner. Faktisk har CMV blitt den mest vanlige infeksjon etter transplantasjon av fremmed benmarg og er en viktig, avgjørende faktor for hvorvidt transplantasjonsfremgangsmåten lykkes eller mislykkes [Neiman et al., J. Infect. Dis., 136, 754 (1977)].

Blant voksne mennesker som gjennomgår immunundertrykkende terapi etter nyre-homotransplantasjon, utvikler over 90% en aktiv cytomegalovirusinfeksjon dersom de har cytomegalovirus-antistoff forut for operasjon. Omtrent halvparten av de serumnegative pasienter blir senere smittet når de undergår immunundertrykkende terapi. Serumnegative mottagere som mottar en nyre fra en serumpositiv giver, utvikler nesten bestandig en postoperativ infeksjon og utvikler sannsynligvis symptomer.

HCMV-infeksjon er også innberettet å forårsake hjernebetennelse som forekommer hyppigere hos immunundertrykte pasienter [Dorfman, Neurology, 2_3 , 136 (1974): Kauffman et al., Am. J. Med., 724 (1979); Schober et al., Lancet. _1, 962 (1973). Dokumentasjon av denne diagnose av HCMV-infeksjon er hindret på grunn av vanskeligheten for å gjenvinne virus fra cerebrospinalvæsken (CSF) eller hjernevev, og har i stedet vært avhengig av histologisk undersøkelse av smittede vev.

Eksempler på HCMV-hjernebetennelse varierer fra tilfeller som omfatter immunundertrykte pasienter etter mottagelse av organtransplantasjoner [Bale, Arch. Neurol., 41, 310 (1984)] innbefattet nyre [Schneck, J. Neuropathol. Exp. Neurol., 2_4, 415 (1965)] til pasienter som er rammet av ervervet immunmangelsyndrom (AIDS) [Levy et al.,

J. Neurosurgery, 6i_l, 9 (1984); Moskowitz et al., Arch. Pathol. Lab. Med., 108, 867 (1984); Nielsen et al., Am. J. Clin. Pathol., 82, 678 (1984); Snider et al., Ann. Neurol., 14., 403 (1984)].

Spesielt er en type cytomegalovirusinfeksjon beskrevet hos pasienter som har mottatt blodoverføringer. Denne tilstand, referert til som post-transfusjon-CMV-mononucleose, opptrer to til fire uker etter blodoverfør-ingen .

Ervervet cytomegalovirusinfeksjon er også blitt forbundet med autoimmun hemolytisk sykdom, ulcerøse skader av mage og tarmkanalen, post-transplantasjons-lungebetenn-else og trombocytopenisk purpura. For hovedmengden av CMV-infeksjoner ervervet etter fødselen, foregår imidlertid helbredelse uten vesentlige komplikasjoner.

Det er ført indirekte bevis på en viktig rolle for lymfocytter i human cytomegalovirus (HCMV)-infeksjon.

F.eks. har individer med HCMV-mononucleose atypiske lymfocytter, og in vitro-undersøkelser avslører nedsatte lymfocyttfunksjoner. [Rinaldo et al., J. Infect. Dis. 136,

667 (1977); Carney et al., J. Infect. Dis. 144, 47 (1981); og Rinaldo et al., J. Infect. Dis. 141 (1980)]. HCMV-infeksjoner kan overføres fra friske donorer ved blodover-føring. [Stevens et al., J. Am. Med. Assoc, 221, 1341

(1970) ; Armstrong et al., Transfusion, 3^, 159 (1971);

Lang et al., N. Engl. J. Med., 278, 1147 (1968); Lang et al., Ibid, 280, 1149 (1969); Prince et al., Ibid., 284, 1125

(1971) ; og Lang et al., Transfusion (Philadelphia), 17,

391 (1977)] (70% av voksne mennesker er serumpositive med henblikk på HCMV). Imidlertid er det kun nylig vist at en liten prosentdel (1-5%) av lymfocytter smittet in vitro med HCMV, uttrykker øyeblikkelig-tidlige og tidlige proteiner [Rice et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 8JL, 6134

(1984)], og at en latent CMV-infeksjon i lymfocytter kan vises ved hjelp av proteinekspresjon og RNA-påvisning [Schrier et al., Science, 230, 1048 (nov. 1985)].

Tidligere forsøk på å definere infeksjonen av lymfocytter med HCMV er blitt hindret av forskjellige faktorer som innbefatter anvendelse av langsiktige laboratoriestammer av HCMV som synes å være mindre smittsomme enn nye, kliniske rendyrkinger [Rice et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 8_1, 6134 (1984)], infeksjonens ukjente natur [J. Pagano, J. Infect. Dis., 132, 209 (1975)] og mangelen på følsomme metoder for å påvise lave nivåer av virus i en liten prosentdel celler. Enn videre er en karakteristisk egenskap for herpesvira, virusets evne til å vedvare i vertsvevet i mange år etter den første infeksjon, og senere bli reaktivert under forårsakelse av sykdom, f.eks. HSV-1, HSV-2 og varicella zoster virus (VZV) i sensoriske ganglier, og EBV

i B-lymfocytter. Selv om CMV synes å forårsake en livslang infeksjon, er setet for den latente infeksjon ukjent. I

den murine CMV-modell kan virus gjenvinnes fra aktiverte B-celler som viser tegn på at lymfocytter ikke bare er involvert i sykdommens tilstand og overføring, men også

kan være et sete for vedvaring av virus.

Diagnosen av cytomegalovirusinfeksjon i en pasient med mononucleose-lignende symptomer kan fastslås ved isolering av virus fra smittede vev. Antistoffer dannet som svar på infeksjon med et CMV, kan påvises ved nøytraliser-ing (NT), komplement-fiksering (CF), immunfluorescens og blodplate-agglutinering (PA)-fremgangsmåter. [Se Weller,

T. H., N. Engl. J. Med., 285, 203 (1971)]. Serologiske undersøkelser som for tiden er tilgjengelige, må imidlertid tolkes med forsiktighet når CMV-infeksjon diagnostiseres,

på grunn av kryssreaksjoner med andre celle-tilknyttede herpesvira, og fordi CF-antistoff viser tendens til å variere i stor grad i normale individer. I tilelgg, som vist i figur 9, oppviser noen HCMV-serumpositive individer ikke noe påviselig virus i blodet.

Det eksisterer ingen tilfredsstillende behandling for cytomegalovirusinfeksjoner. Anvendelse av cortico-steroider, gammaglobulin og antivirale medikamenter som deoxyuridin, floxuridin, cytosin arabinosid og adenin-arabinosid, er innberettet å ha tvilsom, gunstig eller ingen effekt -på det kliniske forløp. Men disse rapporter er vanskelige å vurdere på grunn av det lille antall be-handlede individer, det store antall faktorer som virker samtidig og variabiliteten av virusutskillelse i individer undersøkt på forskjellige tidspunkter.

B. HCMV- genomet

Genomet av HCMV-stamme AD169 er et lineært, dobbelt-trådet DNA-molekyl med en størrelse på omtrent 235 kbp (kilobasepar). Se figur 1 heri; Weststrate et al.,

J. Gen. Virol. , 4j), 1 (1980) og Fleckenstein et al., Gene, 18, 39 (1982). Dette molekyl inneholder to entydige strenger av DNA benevnt U og U„ som er avgrenset av et par inverterte gjentagelser. Weststrate et al., J. Gen.

Virol., 4_9, 1 (1980). DNA tilhørende forskjellige stammer av HCMV, viser 80% homologi ved hjelp av reassosiasjonskinetikk. Huang et al., Yale J. Biol. Med., _49, 29 (1976). Imidlertid viser HCMV-DNA mindre enn 5% homologi med

herpes simplex virus type 1 og 2 (hhv. HSV-1 og HSV-2), og med murin og menneskeape-cytomegalovira. Huang et al.,

J. Virol., 13, 642 (1974).

Transkripsjon av de viktigste laboratoriestammer (Davis, Towne og AD169) kan inndeles i tre separate faser. DeMarchi, Virology, 114, 23 (1981); Wathen et al., J. Virol., 41, 462 (1982) og McDonough et al., Virology, 125, 31

(1983). RNA-artene transkribert forut for proteinsyntese, er betegnet øyeblikkelig-tidlig (IE) RNA og transkriberes i avgrensede områder av genomet. DeMarchi, Virology,

114, 23 (1981); og Wathen et al., J. Virol., 4JL, 462

(1982). Etter starten av virusproteinsyntesen transkriberes en annen klasse av RNA-arter, tidlig RNA, gjennom hele genomet, men hovedsakelig på de inverterte, terminale gjentagelser. Wathen et al., J. Virol., 41, 462 (1982).

De sene RNA transkriberes etter starten av virus-DNA-

replikasjon.

HindiII E-fragmentene av HCMV-stamme AD169 [kartenheter på 0,06 til 0,16, Nelson et al., J. Virol., 43,

83 (1982)] inneholder 90% av kodingsområdet for transkripsjon av øyeblikkelig-tidlig RNA. Wathen et al., J. Virol., 41, 462 (1982) og McDonough et al., Virology, 4_1, 462

(1982). Fire rikelig transkriberte IE-RNA (1,9 kb, 2,2 kb, 2,3 kb og 5,0 kb) og to mindre vesentlige transkripsjoner dannes i dette område. Jahn et al., J. Virol., _4_9, 363

(1984) . (Se figur 2) .

Et av de mest beskrevne gener i HCMV-genomet er

det viktige IE-genet. Denne transkripsjonsenhet danner et 1.9 kb RNA som er beliggende mellom et Sstl- og BamHI-sete, som er beliggende på Hindlll E-fragmentet av AD169-genomet.

[Nelson et al., Mol. Cell. Biol., 6, 452 (1986)]. Dette budbringer-RNA (mRNA) er den mest tallrike traskripsjon i IE-området og koder for det viktige IE 72.000 dalton (72 K) protein [som beskrevet av Stinski et al., J. Virol., 46, 1 (1983)] som kan påvises ved hjelp av det monoklonale antistoff L-14. Rice et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81, 6134 (1984).

Monoklonalt antistoff (mab) L-14 reagerer spesifikt med CMV-smittede celler. Spesielt reagerer mab L-14 med et protein som kommer til syne tidlig etter CMV-infeksjon (innen 3 timer) og forblir lokalisert til cellekjernen gjennom hele infeksjonssyklusen. Hybridomet som danner mab L-14, ble innlevert 3. mai 1984 ved the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland og ble gitt ATCC registreringsnummeret HB 8554.

Nylig viste en strukturanalyse av dette 1,9 kb mRNA fra Towne-stammen, at transkripsjonen var et spleiset molekyl som inneholdt -4 exoner med hhv. 1341, 185, 88 og 121 nucleotider. Stenberg et al., J. Virol., 4_9, 190

(1984). Dette IE-protein er fortrinnsvis forbundet med kromatin, og det er foreslått at dette protein spiller en hovedrolle ved påvirkning av transkripsjon av andre virus gener. Stinski et al., J. Virol., _4_6, 1 (1983). Rotte-2-celler mikroinjisert med kloner som innkoder dette IE-gen, ble vist å hurtig uttrykke (innen 2 timer) 72 K-proteinet ved hjelp av immunfluorescens under anvendelse av E-3 monoklonalt antistoff. Goldstein et al., Infect. and Immun., _38, 273 (1982) .

Disse resultater antyder at selv om HCMV har et begrenset vertsområde, er ikke ekspresjon av det viktige IE-gen avhengig av replikasjon av viruset. I løpet av en tillatt infeksjon er imidlertid transkripsjon av det 1,9 kb IE RNA ikke påviselig etter 48 timers etter-infeksjon som viser en tidsbestemt regulering av genet. Nelson et al., Mol. Cell. Biol. 6, 452 (1986).

C. Virus- diagnostiske fremgangsmåter

Tradisjonelle virus-diagnostiske fremgangsmåter består karakteristisk av virusisolering og serologistudier. Når ømfintlige cellekulturer anvendes, kan visse vanlige vira som herpes simplex, enterovira og influensavira, isoleres innen 1 til 4 dager. Imidlertid kan andre vira, som innbefatter cytomegalovira, kreve 7 til 14 dager eller lengre for isolering. Således, mens virusisolering forblir standarden mot hvilken andre virus-diagnostiske teknikker måles, er utviklingen av mer hurtige fremgangsmåter påkrevet.

En ideell, hurtig, diagnostisk fremgangsmåte ville innbefatte den direkte undersøkelse av kliniske prøver med et erholdt resultat i løpet av timers innsamling. Elek-tronmikroskopi er anvendt for hurtig virusdiagnose, men den er for dyr, tidkrevende og ufølsom for å anvendes i rutine-sikteanalyse av store antall prøver. I mange år konsentrerte virus-diagnostiske fremgangsmåter seg om virusantigen-påvisning og innbefattet immunfluorescens, radioimmunanalyse, immunperoxydase og i den senere tid, enzym-bundet immunsorbentanalyse. Disse fremgangsmåter er anvendt direkte på kliniske prøver, på biopsi og autopsi-vev, og på cellekulturer etter virusinokulering og forsterk- ning, for å erholde hurtigere resultater. Vanligvis har disse fremgangsmåter imidlertid ikke vært så følsomme som virusisolering når de er anvendt direkte på kliniske prøver.

Mange forskjellige polynucleinsyre (polynucleotid)-hybridiseringsteknikker er utviklet i løpet av årene for å undersøke strukturen og ekspresjonen av cellulære og virusgener. I de siste få år er polynucleinsyre- og hybridiseringsteknologi anvendt til klinisk virologi, både for hurtig diagnose ved anvendelse av kliniske prøver, og for studier av virus-patogenese.

Fordelene av polynucleinsyrehybridisering innbefatter dens spesifisitet ved at merkede polynucleinsyre-prober smelter sammen med komplementære polynucleotidsekvenser i en analyseprøve, og dens sensitivitet, basert på den sterke tiltrekningskraft av komplementære sekvenser overfor hverandre. Hybridisering kan også anvendes, som beskrevet heri, for å påvise ikke-replikerende virusinfek-sjoner som er forfeilet eller latente.

DNA-molekylet er i sin naturlige tilstand bygget opp av to tråder tvunnet spiralformet rundt hverandre, med hver base spesifikt bundet ved hjelp av hydrogenbindinger til en komplementær base på den andre tråden. F.eks. er thymin bestandig bundet ved hjelp av hydrogenbindinger til adenin, og guanin er alltid bundet ved hjelp av hydrogenbindinger til cytosin. Hydrogenbindingene mellom basene kan brytes ved oppvarming slik at de to DNA-trådene fullstendig adskilles fra hverandre. Dissosiasjonen av DNA (også benevnt denaturering eller smelting) finner sted ved en temperatur som er karakteristisk for hver DNA. Smelte-temperaturen (T ) av hver DNA varierer med guanin pluss cytosin-innholdet og med lengden av DNA, med ionestyrken av oppløsningen, og med tilstedeværelsen av organiske oppløs-ningsmidler som formamid. F.eks., for hver 1% formamid i reaksjonsblandingen, reduseres vanligvis Trø med. 0,7 grader Celsius (C).

Når de etterlates i oppløsning ved en temperatur under T , kolliderer de dissosierte, enkle polynucleinsyre- trådene med komplementære partnere, og dersom betingelsene er riktige, dannes igjen dobbeltrådede spiraler. Reasso-siasj- > onshastig^ heten er maksimal ved 25°C under T mfor dette

DNA.

Reassosiasjon eller sammensmelting av et polynucleotid bestemmes primært av polynucleotidkonsentrasjonen og inkubasjonstiden. Andre faktorer som påvirker reassosia-sjonshastigheten, er kompleksiteten av polynucleotidet (hastigheten synker med økende kompleksitet), ionestyrken av oppløsningen (økende ionestyrke øker reassosiasjons-hastigheten) , og tilstedeværelsen av polymerer med høy molekylvekt som dextransulfat, som kan øke reassosiasjons-hastigheten fra 3 til 100 ganger.

Stabiliteten av reassosiert, dobbeltrådet polynucleotid avhenger av til hvilken grad de to tråder er sammensatt av komplementære basesekvenser som i sin tur bestemmer hvor godt de to trådene er hydrogenbundet. Når hybridisering foregår under strenge betingelser, vil bare utpreget komplementære tråder smelte sammen. Under betingelser med lav strenghet kan det forekomme dannelse av hybrider med noen grad av base-mistilpasning. Betingelser med lav strenghet kan være anvendelige når det er fordelaktig å påvise beslektede, men ikke identiske, polynucleinsyresekvenser. Dette er utført med humane papillomavira, herpes simplex virus type 1 og 2, adenovira, enterovira og rotavira.

I standard fremgangsmåter blandes en merket, enkel-trådet polynucleinsyre "probe" som inneholder den spesifikke sekvens eller sekvenser som er komplementære til sekvensen(e) som er ettersøkt, med en denaturert (dissosiert) prøve av DNA eller RNA. Under passende betingelser smelter den merkede probe sammen med komplementære nucleinsyresekvenser i prøven, under dannelse av dobbeltrådede "hybrider", som nå inneholder merket. Ved hjelp av forskjellige kjente fremgangsmåter kan enkel- og dobbel-trådede polynucleinsyrer adskilles, og merket kan kvantiteres.

Kort sammendrag av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår en polynucleotidprobe til human cytomegalovirus (HCMV), en fremgangsmåte for fremstilling av en probe, og anvendelsen av en slik probe for analysering med henblikk på tilstedeværelse av HCMV i en human kroppsprøve.

Et mål for den foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for påvisning av latent humant cytomegalovirus i en human kroppsprøve. Denne fremgangsmåte innbefatter følgende trinn: (a) blanding av en prøve av preparert, permeabilisert, human cellulær kroppsprøve som perifere, mbnonucleære blodceller (PBM), f.eks. lymfocytter, med en rekombinant HCMV-avledet polynucleotidprobe hvis sekvens korresponderer med enten den ene eller begge gener uttrykt som en øyeblikkelig-tidlig eller sen RNA-transkripsjon av viruset, i en mengde som er tilstrekkelig for å smelte sammen med ethvert komplementært polynucleotid som er til stede; dvs. av de preparerte, permeabiliserte celler blandes med et polynucleotid ifølge foreliggende oppfinnelse som innbefatter et indikeringsmiddel; (b) vedlikeholdelse av blandingen under hybridiseringsbetingelser i en tidsperiode tilstrekkelig for sammensmelting av proben med ethvert komplementært polynucleotid som er til stede i den blivende prøve; (c) adskillelse av den sammensatte probe og komplementære sekvens fra enhver usammensatt probe; og (d) analysering for tilstedeværelse av et signal fra indikeringsmidlet.

Et annet mål for den foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant HCMV-avledet plasmid eller probe. Denne fremgangsmåte innbefatter følgende trinn: (a) fordøyelse av Hindlll E-fragmentet av en HCMV-stamme DNA med restriksjon-endonuclease EcoRI, for å tilveiebringe fragmenterte, lineære DNA-segmenter innbefattet et EcoRI J-fragment på 10 kb, som vist i figur 3; (b) ligering av EcoRI J-fragmentet inn i EcoRI-setet av et plasmid for å tilveiebringe et rekombinant HCMV-avledet plasmid; (c) kloning av det rekombinante plasmid i et passende replikasjonsmedium, slik som en bakterie, for å tilveiebringe en mengde av det rekombinante plasmid tilstrekkelig for anvendelse som en probe; og (d) kobling av et indikeringsmiddel til plasmidet eller EcoRI J-fragmentet derav for å danne proben. Det dannede/rekombinante plasmid blir således klonet (replikert) i et replikasjonsmedium for å danne en større mengde av dette plasmid. Det klonede, rekombinante HCMV-avledede plasmid, eller EcoRI J-fragment, gjenvinnes fra replikasjonsmediet og kobles til indikeringsmidlet for anvendelse som en DNA-probe.

I en annen praktisk utforming innbefatter foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant HCMV-avledet plasmid eller probe som omfatter følgende trinn: fordøyelse av det tidligere beskrevne EcoRI J-fragment-inneholdende, rekombinante HCMV-avledede plasmid med restriksjonsendonuclease PstI, for å tilveiebringe fragmenterte, lineære DNA-segmenter, innbefattet et Pstl m-fragment på 1,8 kb, som vist i figur 4, og ligering av Pstl m-fragmentet inn i Pstl-setet av et annet plasmid for å tilveiebringe et annet rekombinant HCMV-avledet plasmid. Dette andre plasmid klones karakteristisk i et passende replikasjonsmedium for å tilveiebringe mer av plasmidet, og et indikeringsmiddel kobles til det dannede plasmid, eller i det minste til Pstl m-fragmentdelen derav, for å danne den ønskede probe.

I enda en annen praktisk utforming av den foreliggende oppfinnelse kan en ovennevnt fremgangsmåte videre innbefatte følgende tilleggstrinn: fordøyelse av det først-nevnte, rekombinante, HCMV-avledede EcoRI J-fragment-inneholdende plasmid med restriksjonsendonucleaser Bglll og BamHI for å tilveiebringe fragmenterte, lineære DNA-segmenter, innbefattet et BgllI- BamHI-fragment med 475 baser som vist i figur 4; og ligering av BgllI- BamHI-fragmentet inn i BamHI-setet i polykjederen til plasmid pUCl8, for å tilveiebringe et tredje rekombinant HCMV-avledet plasmid. Et indikeringsmiddel bindes til plasmidet eller i det minste til BgllI- BamHI-delen derav for å danne proben.

En RNA-probe fremstilles ved fordøyelse av det ovenfor beskrevne, tredje rekombinante HCMV-avledede plasmid med Eco-RI og PstI-endonucleaser for å tilveiebringe et EcoRI- Psti-fragment som vist i figur 3, som innbefatter det tidligere nevnte BgllI- BamHI-fragment med 475 baser. Dette EcoRI- Pstl-fragment ligeres deretter inn i de respektive seter av et in vitro transkripsjonsplasmid, som pSP65,

for å danne et fjerde plasmid. Dette fjerde plasmid klones deretter i et passende replikasjonsmedium for å fremstille mer av det. Det dannede plasmid lineariseres deretter med en passende endonuclease, og en RNA-probe fremstilles fra det dannede, lineariserte plasmid ved en in vitro utløpende transkripsjonsreaksjon, utført under tilstedeværelse av ett eller flere passende, merkede ribonucleinsyre-trifos-fater.

En ytterligere praktisk utforming av den foreliggende oppfinnelse innbefatter en fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant HCMV-avledet plasmid eller probe som innbefatter følgende trinn: (a) fordøyelse av det først-nevnte, rekombinante, HCMV-avledede EcoRI J-fragment-inneholdende plasmid med restriksjonsendonuclease BamHI og EcoRI, for å tilveiebringe fragmenterte, lineære DNA-segmenter som innbefatter et BamHI- EcoRI-fragment med 4,2 kb som vist i figur 3; og (b) ligering av BamHI- og EcoRI-setene i polykjederen til plasmid pUC19 for å tilveiebringe et femte, rekombinant, HCMV-avledet plasmid. Dette femte plasmid klones karakteristisk i et passende replikasjonsmedium for å tilveiebringe mer av plasmidet, og et indikeringsmiddel kobles til det dannede plasmid eller i det minste til BamHI- EcoRI-fragmentdelen derav for å danne den ønskede probe.

Enda en annen praktisk utforming av den foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant HCMV-avledet plasmid og en probe som har sammen heng med et sent gen-proteinprodukt som omfatter de følg-ende trinn: (a) fordøyelse av EcoRI A pluss D (A-D)-fragmentet av en HCMV-stamme DNA med restriksjonsendonuclease BamHI R-fragmenl med 6,6 kb, som vist i figur 5; og (b) ligering av BamHI R-fragmentet inn i BamHI-setet i polykjederen til plasmid pUC19 for å tilveiebringe et sjette, rekombinant, HCMV-avledet plasmid. Dette sjette plasmid klones karakteristisk i et passende replikasjonsmedium for å tilveiebringe mer av plasmidet, og et indikeringsmiddel bindes til det dannede plasmid, eller i det minste til BamHI- EcoRI-fragmentdelen derav, for å danne den ønskede probe.

I enhver av de praktiske utforminger beskrevet heri, kan HCMV-stammen innbefatte en av de hyppig anvendte HCMV-stammer som innbefatter Davis, Towne og AD169; og plasmidene kan utvelges fra pACYC184, pUC18, pUC19, den såkalte "Riboprobe" vektor pSP65 og andre plasmider eller kosmider som er velkjente for den dyktige tekniker.

Hvert av de tidligere beskrevne HCMV-avledede plasmider klones fortrinnsvis i et replikasjonsmedium som en encellet organisme som E. coli, for å danne en større mengde av plasmidet i mediet. Det klonede, HCMV-avledede plasmid gjenvinnes deretter fra replikasjonsmediet.

For anvendelse som DNA-prober kobles de klonede, gjenvundne plasmider operativt til et indikeringsmiddel, som angitt, som er i stand til å indikere tilstedeværelsen av proben sammensmeltet med HCMV-nucleinsyre i celler som skal undersøkes. Kobling av et indikeringsmiddel til plasmidet for å danne DNA-proben kan utføres på en rekke måter, men "nick-translasjon" er den foretrukne fremgangsmåte.

Andre mål for den foreliggende oppfinnelse innbefatter de rekombinante, HCMV-avledede plasmider og prober. De som utgangsmateriale foretrukne, rekombinante, HCMV-avledede plasmider (PJN201 og pCM3) som er anvendelige ved fremstilling av plasmider og prober ifølge den foreliggende oppfinnelse, er deponert i American Type Culture Collection

(ATCC) i Rockville, Maryland, og er tildelt de følgende ATCC registreringsnummere, hhv. og .

Disse plasmider ble oppbevart i E. coli og ble deponert på

ifølge Budapestavtalen.

Et videre mål for denne oppfinnelse er et diag-

nostisk analysesystem for påvisning av tilstedeværelsen av HCMV i en biologisk prøve. Et slikt analysesystem er spesielt anvendelig ved sikteanalysering av blodprodukter med henblikk på latent HCMV forut for overføring av én eller flere blodbestanddeler.

Systemet omfatter minst én beholder, og innbefatter

som en aktiv bestanddel, en mengde av en indikeringsmiddel-bundet, rekombinant, HCMV-avledet probe ifølge den foreliggende oppfinnelse, som korresponderer i sekvens til et øyeblikkelig-tidlig proteingen som er tilstrekkelig for å

reagere med og smelte sammen med komplementære nucleinsyresekvenser i prøven.

En øyeblikkelig-tidlig, gen-rettet probe er spesielt anvendelig for påvisning av en latent HCMV-infeksjon.

En kombinasjon av prober, en rettet mot det øyeblikkelig-tidlige gen for 72 K-proteinproduktet, og en rettet mot genet for et sent proteinprodukt, er foretrukket for påvisning av infeksjon i en pasient hvor det ikke er kjent hvorvidt infeksjonen er på stadiet for transkribering av øyeblikkelig-tidlige gener, eller den har fremskredet til et transkripsjonsstadium i hvilket de sene gener, men ikke de øyeblikkelig-tidlige gener, uttrykkes. Således innbe-

fatter et annet diagnostisk system minst to beholdere hvor den ene innbefatter det ovenfor nevnte aktive stoff,

og den andre innbefatter, som aktiv bestanddel, en mengde av en indikeringsmiddel-bundet, HCMV-avledet probe ifølge den foreliggende oppfinnelse, rettet mot et sent gen-proteinprodukt, tilstrekkelig for å reagere med og smelte sammen med komplementære nucleinsyresekvenser i prøven.

Indikeringsmidlet kan innbefatte radioisotoper som

3 32 14 35

H, P, C og S. Et annet spesielt anvendelig indikeringsmiddel er biotin som kan danne en biotin-merket probe som er stabil i opptil to år når den lagres ved -20°C. Biotin-inneholdende prober anvendes karakteristisk sammen med avidin-inneholdende, forsterkende og visualiserende reagenser.

Kort beskrivelse av tegningene

De følgende figurer omfatter en del av den foreliggende oppfinnelse:

Figur 1 viser et fysisk kart av EcoRI-fragmentene

av HCMV DNA, stamme AD169, som angir de relative posisjoner av virus DNA-fragmentsekvensene anvendt heri for in situ hybridisering, såvel som de tallrikt transkriberte RNA som dannes av EcoRI A-, D- og J-fragmentene.

I den nedre del av figuren illustreres også et sammensatt kart som viser de omtrentlige posisjoner av EcoRI-restriksjonsendonuclease-spaltningsseter, og bokstav-betegnelsene for fragmentene som dannes ved disse spalt-ninger. Kartet vises i den motsatte retning i forhold til det som er vist i Fleckenstein et al., Gene, 1_8 , 39 (1982) ,

på side 44.

Figur 2 er et kart av HindiII E DNA-fragmentet av HCMV stamme AD169, illustrert fra venstre mot høyre, og i retningen fra 5'-enden til 3'-enden, som innbefatter kodingsområdet for øyeblikkelig-tidlig RNA som transkriberes før proteinsyntese. Omtrentlige posisjoner av EcoRI- og BamHI-restriksjonsendonuclease-spaltningsseter innen HindiII E-fragmentet er illustrert, og likeledes de omtrentlige posisjoner av de seks RNA-transkripsjoner fra dette område. Figur 3 er et skjematisk diagram som viser under-kloningen av forskjellige segmenter av HCMV EcoRI J-fragmentet som er inneholdt i Hindlll E-fragmentet som er til stede i det rekombinante plasmid pJN201 beskrevet av Nelson et al., J. Virol., £3:83-91 (1982). I denne skjematiske fremstilling er 10 kb EcoRI J-fragmentet isolert fra pJN201 og klonet inn i vektoren pACYC18 4 for å danne plasmidet identifisert som EcoRI J-5018. Også vist er den følgende kloning av EcoRI J-fragmentet inn i vektoren pUC18 for å tilveiebringe et første rekombinant HCMV-avledet plasmid EcoRI J-pUC18; kloningen av et Pstl m-fragment inn i vektoren pUC18 for å tilveiebringe et andre rekombinant HCMV-avledet plasmid Pstl m-pUC18; kloningen av et Bglll-BamHI-fragment inn i vektoren pUC18 for å tilveiebringe et tredje rekombinant HCMV-avledet plasmid 1,9 Bglll- BamHI-pUC18; kloningen av et EcoRI- Pstl-fragment som inneholder BgllI- BamHI-fragmentet inn i "Riboprobe^vektoren pSP65 for å tilveiebringe et fjerde rekombinant plasmid HCMV-avledet med betegnelsen 1,9 BglII- BamHI-pSP65; og kloningen av BamHI- EcoRI-fragmentet som er beliggende ved 5<1->enden av EcoRI J-fragmentet i forhold til 1,9 kb IE RNA-transkripsjonen, inn i vektoren pUC19 for å tilveiebringe et femte rekombinant HCMV-avledet plasmid pIE BamHI-RI. Figur 4 er et restriksjonsendonuclease-kart, illustrert fra venstre mot høyre og i retningen fra 5<1->enden til 3'-enden, som viser kodingsområdet fra EcoRI J DNA-fragmentet av Hindlll E-fragmentet av HCMV-stamme AD169. Omtrentlige posisjoner for Pstl-, Sstl-, Bglll- og BamHI-restriksjonsendonuclease-spaltningsseter innen EcoRI J-fragmentet er illustrert, på samme måte som de omtrentlige posisjoner av Pstl m-fragmentet og BglII- BamHI-fragmentet. Figur 5 er et skjematisk diagram som viser kloningen av et HCMV 6,6 kb BamHI-fragment med benevnelse BamHI R,

inn i BamHI-setet av den plasmide vektor pUC19, under dannelse av det rekombinante plasmid pC MBamR. BamHI R-fragmentet er avledet fra den plasmide vektor pCM3 som inneholder de kombinerte HCMV 33 kb EcoRI A pluss D (A-D)-fragmenter som er klonet inn i kosmid pHC79 [Fleckenstein et al., Gene, _18 , 39 (1982)] ved hjelp av reaksjon med BamHI, for å tilveiebringe fragmenterte, lineære DNA-segmenter, innbefattet 6,6 kb BamHI R-fragmentet. Det rekombinante plasmid pC MBamR, er anvendelig når det er bundet til et indikeringsmiddel som en DNA-probe for det sene 4,0 kb HCMV RNA.

Figur 6 inneholder et sammensatt bilde fra åtte fotomikrografer som er merket 1-8. Felt 1 viser in situ hybridisering av perifere, mononucleære blodceller (PBM)

35

fra HCMV-serumpositiv donor A ved anvendelse av en S-merket probe med betegnelse pUC18- EcoRI J ved en forstørrelse på 20x. Felt 2 illustrerer en del av felt 1 ved en for-størrelse på lOOx. Felt 3 viser resultatene av et in situ hybridiseringsforsøk hvor det anvendes den ovenfor beskrevne pUC18- EcoRI J-probe og PBM fra donor A som ble behandlet med 0,1 M NaOH i en periode av 30 minutter ved 37°C forut for hybridisering. Felt 4 viser PBM fra en HCMV-serum-negativ donor hybridisert med probe pUC18- EcoRI J. Felt 5 er lignende felt 1 med unntak av at PBM var fra HCMV-serumpositiv donor B. Felt 6 viser celler fra donor B som på forhånd ble utvalgt ved hjelp av FACS med henblikk på 0KT4-markøren og deretter hybridisert som i felt 5. Felt 7 viser celler fra donor B som på forhånd ble utvalgt av FACS med henblikk på 0KT8-markøren, og deretter hybridisert med<35>S-merket pUC18- EcoRI J-probe. Felt 8 viser PBM fra

35

donor B hybridisert med S-merket pUC18.

Figur inneholder en sammensatt avbildning fra tre fotomikrografer som viser in situ hybridisering til tynnsnitt av HCMV-infisert nyre ved anvendelse av HCMV øyeblikkelig-tidlige eller sene genprober.

Tynnsnitt av nyren til en HCMV-infisert pasient

ble erholdt, preparert med formalin, innstøpt i paraffin

35

og utsatt for in situ hybridisering ved anvendelse av S-merkede HCMV-avledede prober, og motfarget med hematoxylin som beskrevet i avsnittet for materialer og fremgangsmåter. Ramme A viser hybridisering ved anvendelse av den øyeblikkelig-tidlige HCMV-gen-avledede probe, EcoRI J (400x);

ramme B viser hybridisering ved anvendelse av den sene HCMV-gen-avledede probe, pCM3 (400x); og ramme C viser ingen hybridisering.når det anvendes en negativ kontrollprobe, pUCl8 (250x).

Figur 8 inneholder en fotomikrograf som viser

in situ hybridisering til tynnsnitt av HCMV-infisert, human

hjerne, ved anvendelse av HCMV øyeblikkelig-tidlige genprober. Paraffin-innstøpte snitt av periventrikulært vev

35

ble in sxtu hybridisert med den S-merkede HCMV øyeblikkelig-tidlige genprobe, EcoRI J, og motfarget med hematoxylin,

som beskrevet i det følgende (400x).

Figur 9 er et diagram som illustrerer variasjoner

i hybridisering til PBM fra normale HCMV-serumpositive donorer (G, R, B, P og S) ved anvendelse av den øyeblikkelig-tidlige EcoRI J-probe som beskrevet i avsnittet for materialer og fremgangsmåter. Gjentatte analyser i løpet av en periode på 1 år ved in situ hybridisering av PBM fra asymptomatiske, normale, serumpositive donorer viste at hybridiseringsnivåene enten kan være stabile for et gitt individ, eller de kan variere i løpet av tiden. Ordinat-enhetene er gitt som prosentdelen av celler som utviste positiv hybridisering med proben, mens abscissen illustrerer månedene i 1985 og 1986, i hvilke PBM ble erholdt fra donorene.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

I. Definisjoner

Polynucleinsyren (polynucleotid)-prober som er anvendelige heri, er anvendt sammen med et "indikerings-merkingsmiddel", "indikeringsmiddel", "indikeringsgruppe" eller et "merke" som alle er betegnelser som anvendes om hverandre. Indikeringsgruppen eller merket er anvendt i forbindelse med proben som et middel for å signalisere (bestemme) at et komplementært HCMV DNA eller RNA har bundet seg til proben.

De ovenfor nevnte betegnelser er anvendt heri for å innbefatte enkle atomer og molekyler som er bundet til proben, enten disse atomer eller molekyler er anvendt alene eller i forbindelse med ytterligere reagenser. Slike indikeringsgrupper eller merker er i seg selv velkjente i biokjemi og utgjør en del av den foreliggende oppfinnelse bare i det omfang de anvendes sammen med ellers nye prober, fremgangsmåter og/eller systemer.

Det signal-tilveiebringende merke som anvendes, er operativt koblet til proben, som diskutert i det følgende.

Betegnelsen "operativt koblet" anvendes heri for å bety at en enhet er koblet til en annen enhet slik at den normale funksjon av begge enheter ikke er vesentlig svekket. Hvor et merke er operativt koblet til et polynucleotid i

en probe, virker således polynucleotidet ved å binde seg til en komplementær polynucleotidtråd, og indikeringsmidlet virker ved å vise at parring og sammensmelting av probe-tråden og den komplementære tråd har funnet sted. Der hvor en polynucleotidtråd er operativt koblet inn i en vektor ved hjelp av ligering, er den dannede, rekombinante vektor i stand til replikasjon. Hver gang en enhet er beskrevet heri som å være koblet til en annen enhet, er det å forstås at disse enheter er operativt koblet enten ordet "operativt" er anvendt eller ikke.

Indikeringsgruppen kan være, eller den kan anvende, et biologisk aktivt enzym som pepperrot-peroxydase (HRP) eller glucoseoxydase. Der hvor den viktigste indikeringsgruppe er et enzym som HRP eller glucoseoxydase, er tilleggsreagenser påkrevet for å visualisere det faktum at et kompleks er dannet mellom proben og en komplementær tråd av nucleinsyre. Slike tilleggsreagenser for HRP innbefatter hydrogenperoxyd og et oxyderings-fargestoff-for-stadium som diaminobenzidin. Et tilleggsreagens som er anvendelig sammen med glucoseoxydase, er 2,2'azino-di-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsyre) (ABTS).

Radioaktive grunnstoffer tilveiebringer en annen, spesielt foretrukket gruppe merke, og er anvendt heri som eksempler på anvendelige merker. Et eksempel på et radio-merkingsmiddel som kan anvendes i den foreliggende oppfinnelse, er et radioaktivt grunnstoff som gir utsendelse av betastråler. Grunnstoffer som selv avgir betastråler, 3 14 32 35 ..

som H, C, P og S, representerer indikeringsgrupper som består av en klasse av radioaktive grunnstoffer som gir utsendelse av betastråler.

Betegnelsen "probe" anvendes heri i betydningen av en polynucleotidsekvens av DNA eller RNA som inneholder et koblet indikeringsmiddel, som diskutert ovenfor, som er komplementært til et budbringer-RNA eller til en enkel tråd av DNA som innkoder et protein som et øyeblikkelig-tidlig eller sent protein manifestert ved hjelp av HCMV.

En probe anvendes i form av en enkel tråd av polynucleinsyre, men er for letthets skyld noen ganger henvist til heri som det dobbelt-trådede molekyl, slik som et indikeringsmiddel-bundet plasmid. Som redegjort for annet sted heri, fremstilles den enkelt-trådede probe fra det dobbelt-trådede molekyl ved oppvarming og hurtig avkjøling på forhånd eller etter blanding av proben med den biologiske prøven som skal undersøkes.

En probe beskrevet heri, anvendes i en polynucleotid-hybridiseringsundersøkelse i hvilken en enkelttrådet probe smelter sammen med en komplementær tråd av et annet polynucleotid inne i en celle. Slike hybridiseringsundersøk-elser er velkjente i teknikken som in situ hybridiserings-undersøkelser. I slike hybridiseringsfremgangsmåter må både proben og dens ettersøkte, komplementære polynucleotidsekvens være enkelttrådet, som allerede beskrevet.

Der hvor proben inneholder DNA-molekyler, må den smeltes for å danne enkelttrådede molekyler. Der hvor det komplementære, ettersøkte polynucleotid også er et DNA-moleky 1 , må dette molekyl også smeltes før proben kan smelte sammen med det. Der hvor en DNA-probe anvendes for å hybridisere til et ettersøkt DNA, må således begge de dobbelttrådede molekyler smeltes en gang i løpet av under-søkelsen slik at denønskede sammensmelting kan finne sted. Disse smeltingstrinn kan utføres uavhengig, eller etter at begge de dobbelttrådede molekyler er blandet sammen.

Der hvor en DNA-probe anvendes for å lete etter

RNA som diskuteres i det følgende, behøver bare DNA-proben smeltes for anvendelse. Imidlertid kan den dobbelttrådede DNA-probe og RNA inne i cellen også smeltes etter sammen- blanding, hvis ønsket. Ingen smelting er nødvendig hvori en RNA-probe anvendes for å lete etter et komplementært RNA, fordi RNA-prober er enkelttrådet slik som et ettersøkt RNA.

I tillegg, mens polynucleotider som er ettersøkt i Southern eller Northern hybridiseringsavtrykk er relativt tilgjengelige for proben, er polynucleotider ettersøkt i en in situ hybridiseringsundersøkelse, relativt beskyttet av celleveggen. Som en konsekvens prepareres og permeabiliseres cellene som undersøkes, forut for utførelsen av hybridis-eringsundersøkelsen. Forskjellige fremgangsmåter for permeabilisering av undersøkte celler er velkjente i teknikken. En spesiell fremgangsmåte er vist i det følgende.

I tillegg behandler noen teknikere de undersøkte celler med en protease som trypsin, chymotrypsin og proteinase K. Den spesielle fremgangsmåte for permeabilisering anvendt i en in situ hybridseringsfremgangsmåte, er et spørsmål om valg som kan innvirke på kvantitative bestemmelser, men vanligvis ikke innvirke på kvalitative bestemmelser.

Uttrykket "hybridiseringsbetingelser" når det anvendes sammen med en vedlikeholds-tidsperiode, anvendes heri i betydningen av at en probe og den biologiske prøve som skal undersøkes, blandes sammen under betingelser som tilveiebringer permeabiliserte celler, enkelttrådede, sammen-smeltbare molekyler som er hensiktsmessige, og at den således dannede blanding vedlikeholdes under temperaturbetingelser og i en tidsperiode som er tilstrekkelig for proben og ethvert komplementært polynucleotid som er til stede i prøven, til å smelte sammen og danne et dobbelttrådet molekyl. Slike tids- og temperaturbetingelser er velkjente i teknikken og belyses ved eksempler heri i in situ hybri-diseringsundersøkelsene som beskrives i det etterfølgende.

Betegnelsen "vektor" anvendes heri som et synonym for et kloningsredskap og innbefatter et plasmid, kosmid, fag-DNA eller andre polynucleotidsekvenser som er i stand til å replikere i et replikasjonsmedium som en bakterie eller gjær. En vektor erkarakterisert vedat den inneholder ett eller et lite antall restriksjonsendonuclease- gjenkjennelsesseter, ved hvilke polynucleotidsekvensen kan deles opp på en determinerbar måte uten tap av en vesentlig biologisk funksjon for vektoren, f.eks. replikasjon, dannelse av kappe-proteiner eller tap av aktivator eller bindingsseter, og vektoren er viderekarakterisert vedat den inneholder en markør som er passende for anvendelse ved identifikasjonen av transformerte celler, f.eks. tetra-cyclinresistens eller ampicillinresistens.

Plasmider som er ekstrakromosomale, cykliske polynucleotider, anvendes heri som tjenlige eksempler på vektorer. En plasmidvektor som ikke inneholder en HCMV-avledet polynucleotidsekvens, henvises heri vanligvis til som et "plasmid", mens en plasmidvektor som inneholder en HCMV-avledet sekvens, henvises heri vanligvis til som et "rekombinant plasmid".

De følgende forkortelser og symboler anvendes heri.

bp - basepar

kb - 1000 bp

K - kilodalton

M^ - tilsynelatende relativ molekylær masse

DNA - deoxyribonucleinsyre

cDNA - komplementær DNA

RNA - ribonucleinsyre

mRNA - budbringer-RNA

replikon - enheten som kontrollerer de enkelte replika-sjonshandlinger; det har et utspring ved hvilket replikasjon settes i gang, og det kan ha en terminal ved hvilken replikasjonen stopper.

Når det anvendes i en sammenheng som beskriver eller avbilder nucleotidsekvenser, avbildes purin-eller pyrimidin-basene som danner nucleotidsekvensen, som følger:

A - deoxyadenyl

G - deoxyguanyl

C - deoxycytosyl

T - deoxythymidyl

II. Plasmide vektorer

Humant cytomegalovirus (HCMV)-infeksjoner kan over-føres via blod og er vist å påvirke lymfocyttfunksjoner som tidligere omtalt. Infeksjon av lymfocytter med CMV synes å forårsake en uutviklet eller latent infeksjon [Rice et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81, 6134 (1984); og Schrier et al., Science, 230, 1048 (1985)], hvis natur ennå ikke er definert. Ifølge den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en in situ hybridiserings fremgangsmåte (beskrevet i det etterfølgende) en følsom og presis fremgangsmåte for påvisning av en uutviklet CMV-infeksjon i humane, perifere, mononucleære celler (PBM) slik som lymfocytter. Anvendelse av fremgangsmåten tillater definisjon av virusets tilstand og bistår i den kliniske evaluering av individer i fare for åpenbar CMV-infeksjon. Spesielt kan transkripsjonen av HCMV-RNA (mRNA), kjent for å dannes ved forskjellige stadier av virusreplikasjon, nå bestemmes.

For å påvise virus-nucleinsyre i latent (eller uutviklet) smittede celler, ble nærmere bestemt klonede virusfragmenter utvalgt som prober fra områder av HCMV-genomet som hyppig transkriberes i disse celler under en uutviklende infeksjon. Uttrykkene "latent tilstand", "latent infeksjon", "ikke tillatt infeksjon" og "uutviklet infeksjon", som anvendt heri i forskjellige grammatikalske former, betyr at viruset ikke kan påvises i vev eller sekreter ved hjelp av vanlige celledyrkningsforsøk, men ikke desto mindre vedvarer i en ikke-replikerende tilstand eller ved et ikke-påvisbart, muligens periodisk tilbake-vendende, replikasjonsnivå.

De fleste HCMV-ikke tillatt smittede celler viser en blokkering i ekspresjonen av sene virusgener. Rice et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81, 6134 (1984);

DeMarchi, J. M., Virology, 129, 287 (1983) og LaFemina et al., J. Gen.. Virol., 6_4 , 373 (1983). Således ble rekombinante HCMV-prober som inneholder kodeområder for tidlige gener, utviklet som beskrevet i det følgende.

Fremgangsmåten for fremstilling av rekombinante plasmider innbefatter vanligvis spaltning av et isolert vektorplasmid ved ett eller flere spesifikke seter ved hjelp av en restriksjonsendonuclease, f.eks. EcoRI, Pstl, BamHI, Bglll og lignende. Plasmidet, som er et sirkulært DNA-moleky 1 , omdannes således til et lineært DNA-molekyl ved hjelp av enzymet som deler de to DNA-trådene ved et spesifikt sete. Andre ikke-vektor-DNA spaltes på lignende måte med det samme eller et lignende enzym. Den lineære vektor eller deler av denne og lineære ikke-vektor-DNA,. kan covalent kobles under dannelse av en enkel sirkel av enkelt-, dobbelt- eller delvis enkelt/delvis dobbelt-trådet DNA, ved hjelp av deres blanding og reaksjon med et annet enzym kjent som en polynucleotid ligase, som er velkjent.

Innledningsvis ble klonede fragmenter fra det viktigste øyeblikkelig-tidlige område av HCMV (HindiII E-fragment) undersøkt heri ved anvendelse av den ovenfor beskrevne rekombinante DNA-teknologi. Kloningen av Hindlll E-fragmentet av HCMV-stamme AD169 er tidligere beskrevet.

[Nelson et al., J. Virol., _4_3 , 83 (1983)] og er henvist til som plasmid pJN201. Imidlertid er ideen med å anvende det klonede fragment som en del av en DNA-probe for en latent eller uutviklet infeksjon av PBM, ikke beskrevet deri.

HindiII E DNA-fragmentet av HCMV AD169 inneholder f.eks. omkring 21,5 kb [Fleckenstein et al., Gene, JU8, 39

(1982) ], og omkring 90% av kodningsområdet for transkripsjon av øyeblikkelig-tidlig (IE) RNA [Wathen et al., J. Virol., _41, 462 (1982) og McDonough et al., Virology, 125, 31

(1983) ]. Fire hyppig transkriberte IE RNA (1,9 kb, 2,2 kb, 2,3 kb og 5,0 kb) og to mindre betydelige transkripsjoner

(4,0 kb og 7,0 kb), dannes i dette område. Jahn et al.,

J. Virol., _49, 363 (1984). (Se figur 2).

Et underfragment av HindiII E DNA-fragmentet, kjent i teknikken som EcoRI J-fragmentet med en størrelse på omtrent 10 kb, ble spleiset inn i vektoren pACYC184

(ATCC 37033) i EcoRI-setet av kloramfenicol-resistensgenet, og den dannede, plasmide vektor benevnt EcoRI J-5018, ble klonet i E. coli. Som vist i figur 3, er dette EcoRI J-fragment også spleiset inn i EcoRI-setet av den plasmide vektor pUC18 for å danne plasmidet betegnet EcoRI J-pUC18 som tilveiebringer bedre utbytter av rekombinant plasmid ved påfølgende vekst (kloning) i bakterier som E. coli, som er replikasjonsmediet anvendt for å fremstille mengder av plasmid DNA som er anvendelig som prober.

De dannede, klonede plasmider eller deres EcoRI J-fragmenter når de er koblet til et indikeringsmiddel, er nyttige i sikteanalyseringen av infisert celle-DNA og RNA av en rekke årsaker. Spesielt inneholder EcoRI J-fragmentet ikke humane gjentagende sekvenser som nylig er kartlagt i ADl69-genomet. Derfor tilveiebringer ikke dette fragment falske, positive resultater som anvendelse av andre genome sekvenser kan. Ruger et al., J. Gen. Virol., 6_5, 1351

(1984) og McDougall et al., J. Invest. Derma., 83^, 725

(1984) .

I tillegg inneholder EcoRI J-fragmentet kodingsområdet for det viktigste 1,9 kb IE RNA. Dette mRNA er den mest hyppige transkripsjon i IE-området og koder for det viktigste IE-protein med en Mr på omkring 72.000 dalton (72 K) [som beskrevet av Stinski et al., J. Virol., 4_6, 1

(1983)], påvist ved hjelp av det monoklonale antistoff L14. Ettersom, som beskrevet av Huang et al., Yale J. Biol. Med., 49, 29 (1976), de forskjellige stammer av HCMV deler 80% homologi ved reassosiasjonskinetikk (det meste av hetero-geniteten er til stede i gjentagelsesområdene), foretrekkes en probe som innbefatter en nucleotidsekvens som koder for 72 K-proteinet for å sikteanalysere vev med henblikk på HCMV-sekvenser.

Som beskrevet i det følgende, kryss-hybridiserer EcoRI J-fragment DNA dessuten ikke med andre herpes virus-DNA (f.eks. HSV-1, HSV-2 eller EBV). EcoRI J-fragmentet inneholder også kodingssekvensen for 2,3 kb IE RNA og deler av kodingssekvensene for de to mindre betydelige transkripsjoner (7,0 kb og 4,0 kb). Jahn et al., J. Virol., _49, 363 (1984).

Som vist i figur 3, ble, for å øke følsomheten, mindre og mer spesifikke prober utviklet fra sekvenser som kodet for det viktigste 1,9 kb IE RNA. Som tidligere beskrevet, er det viktigste 1,9 kb IE RNA en spleiset transkripsjon som inneholder fire exoner med hhv. 1341, 185, 88 og 121 nucleotider. Således er baser som er til stede i genomet, ikke til stede i mRNA som translateres til protein. Stenberg et al., J. Virol., 4_9, 190 (1984). Tre restrik-sjonsendonucleasefragmenter er underklonet fra EcoRI J-fragmentet for å øke følsomheten i påvisning av dette 1,9 kb IE mRNA.

Et restriksjonsendonuclease-kart som avbilder kodingsområdet for denne transkripsjon, er vist i figur 4. Et 1,8 kb Pstl-fragment ( Pstl m) fra EcoRI J-fragmentet av HCMV ble ligert inn i polykjederen av en annen plasmid vektor pUC18 under dannelse av den plasmide vektor med betegnelse Pstl m-pUC18. Pstl m-fragmentet inneholder kodingssekvensen for ett av exonene som er beliggende ved 5'-enden av genet. Dette restriksjonsfragment inneholder også et aktivatorområde for genet og en forsterkningsfaktor som er like så effektive som forsterkerne til SV40 og polyoma.

Et annet klon som også er avbildet i figur 4, betegnet 1,9 kb Bglll- BamHI, ble fremstilt fra 3'-enden av det viktigste 1,9 kb IE-genet. Dette fragment med omtrent 475 basepar ble ligert inn i polykjederen av enda en annen plasmid vektor pUC18 under dannelse av den plasmide vektor med betegnelsen 1,9 BglII- BamHI-pUC18. Denne plasmide vektor inneholder deler av kodingssekvensen for 1341-base-exonet av transkripsjonen.

I tillegg kan dette 475 bp BgllI- BamHI-fragment klones inn i pSP65 "Riboprobe"-vektoren. Dette rekombinante plasmid tillater in vitro-syntesen av RNA som er komplementært til 1,9 kb IE-transkripsjonen.

Et annet klon som også er avbildet i figur 3, med betegnelse pIE BamHI-RI, ble fremstilt fra 5'-enden av EcoRI J-fragmentet i forhold til det viktigste 1,9 kb IE-gen. Dette omtrent 4,2 kb fragment ble ligert inn i polykjederen av en annen plasmid vektor pUC19 ved vektorens BamHI- og EcoRI-seter under dannelse av plasmidet pIE BamHI-RI. Figur 3 illustrerer kloningen av disse fragmenter. Ved anvendelse av klonene som inneholder disse tre fragmenter; dvs. plasmide vektorer som inneholder de omtrent 1,8 kb Pstl m-, de omtrent 475 base Bglll- BamHI- og de omtrent 4,2 kb BamHI-EcoRI-fragmenter, kan prober fremstilles som har tilstrekkelig høye spesifikke aktiviteter for å påvise det viktigste 1,9 kg IE RNA som transkriberes under den ikke tillatte, latente infeksjon.

Den foreliggende oppfinnelse innbefatter også i tillegg, som vist i figur 5, en HCMV DNA-probe for bestemm-else av hvorvidt sene gener uttrykkes i humane kroppsprøver som vevsbiopsier og perifere blodlymfocytter. Den sene genprobe anvendes fortrinnsvis i forbindelse med en av de tidligere beskrevne IE-prober for å påvise infeksjon ved stadier i tillegg til IE-latent infeksjon, selv om en sen genprobe ifølge oppfinnelsen også kan anvendes alene for å konstatere infeksjon ved stadier senere enn under IE-trans-krips jon, og i fravær av erholdelig virus.

Et omtrent 6,6 kb BamHI-fragment (betegnet BamHI R) fra HCMV-stamme AD169, ble klonet inn i BamHI-setet av polykjederen i plasmid vektor pUC19 under dannelse av plasmidet betegnet pC MBamR. Denne del av HCMV-genomet transkriberes under den sene fase av infeksjonen og er inaktiv under den tidlige fase av infeksjonen. DeMarchi,

Virology, 114, 23 (1981); Wathen et al., J. Virol., 41, 462

(1982) og McDonough et al., Virology, 125, 31 (1983).

Dessuten viser RNA hybrid-utvelgelsesundersøkelser at

BamHI R-fragmentet koder for de 61 K og 71 K sene polypeptider Nowak et al., Virology, 134, 91 (1984).

Ved anvendelse av disse kloner ble HCMV DNA påvist ved in situ hybridisering av tillatt infiserte celler i hjernene hos pasienter med ervervet immunmangelsyndrom (AIDS), i nyrene hos nyretransplantasjonspasienter og i RNA i perifere, mononucleære blodceller fra naturlig, uutviklende infeksjon [Schrier et al., Science, 230, 1048

(nov. 1985)] og beskrevet i det følgende.

Således utgjør et mål for oppfinnelsen en ny, rekombinant plasmid vektor som vesentlig består av en øyeblikkelig-tidlig DNA-sekvens, utvalgt fra gruppen bestående av (1) det omtrent 10 kb EcoRI J-fragment av Hindlll E-fragment av HCMV-genomet, (2) det omtrent 1,8 kb Pstl m-fragment av EcoRI J-fragmentet av HCMV-genomet, (3) det omtrent 4,2 kb BamHI- EcoRI-fragment av EcoRI J-fragmentet av HCMV-genomet, (4) det omtrent 4 75 bp BamHI- Bglll-fragment av EcoRI J-fragmentet av HCMV-genomet, (5) EcoRI-Psti-fragmentet som inneholder dette BamHI- Bglll omtrent 475 bp-fragment, og (6) det omtrent 6,6 kb BamHI R-fragment fra A-D EcoRI-fragmentet av HCMV-genomet som er operativt ligert inn i en passende plasmid vektor.

Vektorene anvendt her, hvori de nye polynucleotidsekvenser er ligert og replikert, er spesielt foretrukne vektorer. De spesielle vektorer anvendt heri for ligering og replikasjon, er tilgjengelige i handelen. F.eks. er kosmid pHC79, og plasmide vektorer pUC18 og pUC19, tilgjengelige fra Bethesda Research Laboratories, Life Technologies, Inc., Gaithersberg, MD; "Riboprobe" plasmid vektor pSP65 er tilgjengelig fra Promega Biotec, Madison, WI; og plasmid vektor pACYC184 er tilgjengelig fra

American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD. Restriksjonskart for hver av disse vektorer er publisert

og er velkjente i teknikken.

Et bredt område av ytterligere anvendelige vektorer er kommersielt tilgjengelig, og likeledes er passende verts- replikasjonsmedia. Vektorer som kan tjene som eksempler, både plasmider og bakteriofager og verter, er tilgjengelige fra American Type Culture Collection i Rockville, MD, og er listeførte i dens CATALOGUE OF BACTERIA, PHAGES AND and rDNA VECTORS, 16. utgave, 1985. I tillegg er anvendelige plasmider, kosmider og kloningsvektorer oppført som tilgjengelige i kataloger fra Boehringer Mannheim Biochemicals i

Indianapolis, IN; Bethesda Research Laboratories, Inc. i Gaithersberg, MD, og Pharmacia, Inc. i Piscataway, NJ.

Andre passende vektorer inn i hvilke en av de ovenfor beskrevne DNA-sekvenser kan ligeres og deretter replikeres, inneholder ett eller flere seter som kan spaltes av restriksjonsenzymer, slik at en ønsket DNA-sekvens kan operativt ligeres deri. Slike vektorer kan replikeres i et replikasjonsmedium slik som en encellet organisme som E. coli, S. cerevisiae eller lignende. Vektoren inneholder et replikon som er forenlig med replikasjonsmediet slik at den ligerte DNA-sekvens kan formeres av vektoren.

For dette formål kobles transkripsjonsaktivatorer

og forsterkere operativt til DNA-sekvensen i nær beliggenhet til 5'-terminalen av denne. Aktivatoren kan være endogen til vektoren eller exogen til vektoren, noe som er tilfelle med forsterkersekvensen som er til stede i Pstl m-fragmentet beskrevet ovenfor, som når dette fragment ble ligert inn i plasmid vektor pUC18, tilveiebragte den dannede plasmide vektor med en aktivator og forsterker.

III. Nucleinsyreprober

En nucleinsyreprobe; dvs. et indikeringsmiddel som er operativt koblet til et polynucleotid som er komplementært til et polynucleotid som er gjenstand for undersøkelse;

dvs. en sekvens som koder for et øyeblikkelig-tidlig protein, eller for et sent protein av HCMV, utgjør et annet mål for den foreliggende oppfinnelse. Probens polynucleinsyre kan være DNA eller RNA som beskrevet tidligere, men for å

lette beskrivelsen anvendes DNA-inneholdende prober som

eksempler.

En nucleinsyreprobe ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter et plasmid eller en polynucleinsyre som inneholder et operativt bundet indikeringsmiddel. Dette indikeringsmiddel er koblet til en polynucleotidsekvens av selve det rekombinante plasmid, eller av den HCMV-relaterte poly-nucleotiddel av det rekombinante plasmid. Hvor dette plasmid fjernes for anvendelse som probe, består dette vesentlig av (1) EcoRI J-fragmentet av HindiII E-fragmentet av genomet av HCMV som inneholder omtrent 10 kb, (2) Pstl m-fragmentet av dette EcoRI J-fragment som inneholder omtrent 1,8 kb; (3) det omtrent 4,2 kb BamHI- EcoRI-fragment av EcoRI J-fragmentet av HCMV-genomet; (4) BamHI- Bglll-fragmentet av dette J-fragment som inneholder omtrent 475 bp; (5) EcoRI- Psti-fragmentet som inneholder BamHI-BgllI-fragmentet flankert av rester av pUC18 polykjeder-setet; og (6) BamHI R-fragmentet på omkring 6,6 kb fra A-D EcoRI-fragmentet av HCMV.

Det koblede indikeringsmiddel innsettes fortrinnsvis i en ønsket DNA-sekvens ved hjelp av den såkalte "nick translasjon"-fremgangsmåte ifølge Rigby et al., J. Mol. Biol., 113, 237 (1977), som er velkjent. Ved denne fremgangsmåte brytes DNA-sekvensen delvis (innsnittes) på ett eller flere steder og gjendannes deretter ved anvendelse av E. coli-DNA-polymerase I sammen med ett eller flere passende indikatormiddel-bundne, merkede nucleotider.

I de spesielle eksempler som følger, ble radiomerkede nucleotider anvendt som indikeringsmiddel. Disse radiomerkede nucleotider var 5'-[alfa- 3 5S-thio ] deoxyadenosm-trifosfat og 5'-[alfa- 3 5S-thio]deoxycytosin-trifosfat.

Et annet passende indikeringsmiddel for probene ifølge den foreliggende oppfinnelse anvender et biotinylert nucleotid og et enzym som pepperrot-peroxydase (HRP) koblet til avidin. Et kommersielt tilgjengelig biotin/avidin-system er solgt under varemerket "Detek" I- hrp av Enzo Biochem. Inc., i New York, NY, og anvender 2'-deoxyuridin-trifosfat-5-allylamin-biotin i forbindelse med HRP koblet til Strepavidin. Anvendelsen av de ovenfor nevnte og andre eksemplifiserte, biotinylerte uridin-trifosfatderivater i DNA-prober er beskrevet i Brigatie et al., Virology, 126, 32

(1983) .

Der hvor den anvendte probe er et RNA-molekyl, inkorporeres indikeringsmidlet for probene i molekylet under in vitro-transkripsjon. Et tjenlig eksempel på slike in vitro transkripsjonssystemer er "Riboprobe" vektor pSP65 fra Promega Biotec (Madison, WI).

I ytterligere et annet system kan radioaktiv fosfor, 32

P, anvendes som indikeringsmiddel. Her er radiomerket inkorporert i alfa-fos^fatet av et nucleotid-trifosfat som er innbefattet i replikasjonsmediet når et plasmid som skal fremstilles til en DNA-probe, klones. Et radioaktivt carbonatom, 14 C, eller hydrogenatom,<3>H, kan ogsa inkorporeres i et ønsket nucleotid-trifosfat som blandes inn i replikasjonsmediet.

Etterfølgende "nick-translasjon", in vitro-transkrips jon eller replikasjon i et passende radionucleotid-inneholdende medium, adskilles den dannede probe fra uinkorporerte nucleotider, medium og cellulær debris. Typiske separeringsfremgangsmåter anvender roterende kolonner og passering gjennom sorteringskolonner, som også er anvendt for gjenvinning av plasmid.

Mens en probe som er dannet av DNA kan hybridiseres til DNA i en celle, er den tilstedeværende mengde av DNA

for et spesielt gen, for hvilket hybridisering ettersøkes, vanligvis så liten at den er vanskelig å påvise, spesielt dersom færre enn alle de tilstedeværende celler inneholder DNA av interesse, som er tilfellet med HCMV-infeksjon. I

tilfelle av HCMV er imidlertid mRNA som koder for IE 72 K-proteinet, spesielt hyppig selv i uutviklet infiserte celler. Resultater beskrevet i det følgende, illustrerer binding (sammensmelting) av en DNA-probe beskrevet heri, med en HCMV-avledet RNA i HCMV-infisert PBMS, nyre og hjerne. Proben som korresponderer til mRNA som rikelig translateres sent i infeksjonen av tillatt infiserte celler, binder seg

også på samme måte til RNA i disse celler.

IV. Diagnostiske fremgangsmåter og systemer

En fremgangsmåte for påvisning av latent humant cytomegalovirus i en human, cellulær kroppsprøve slik som PBM, som f.eks. lymfocytter, omfatter ifølge foreliggende oppfinnelse følgende trinn: blanding av en prøve som inneholder preparerte, permeabiliserte, humane celler som PBM, med en rekombinant HCMV-avledet, øyeblikkelig-tidlig probe ifølge foreliggende oppfinnelse; vedlikeholdelse av blandingen under hybridiseringsbetingelser i en tidsperiode som er tilstrekkelig for sammensmelting av proben med komplementær DNA og RNA (polynucleinsyrer) som er til stede i prøven som foreligger, under dannelse av et kompleks; adskillelse av proben som har dannet kompleks med dens komplementære sekvens fra enhver probe som ikke har dannet kompleks; og undersøkelse med henblikk på tilstedeværelse av et signal fra indikeringsmidlet.

Lignende trinn følges under anvendelse av en sen genprobe ifølge den foreliggende oppfinnelse, i tilfellet i hvilken transkripsjonen av sene gener skal påvises. Begge prober kan anvendes adskilt på parallelle prøver som vevsprøver hvor infeksjonens tilstand skal undersøkes.

Prøvestørrelser for slik in situ hybridisering er velkjent i teknikken og eksemplifiseres i det følgende. Der hvor mikroskoppreparatglass anvendes som et substrat på hvilket PBM som skal undersøkes, prepareres, anvendes vanligvis 20.000 til 30.000 pr. preparatglass. Alternativt der vev som nyrevev eller hjernevev skal undersøkes, prepareres tynnsnitt som beskrevet i avsnittet for materialer og metoder.

Mengden av anvendt probe og vedlikeholdsperioden for hybridisering er hovedsakelig en funksjon av indikeringsmidlet, og dens mengde som er operativt koblet i proben. Angerer et al., Nuc. Acids Res., 9, 2819 (1981)/beskrev

anvendelse av hhv. 0,1-1,0 nanomol av 3 H poly U og<3>H

poly C ved 1,4 Ci/millimol og 2,0 Ci/millimol, med hybri-diseringstiden 1 time. På den annen side beskrev Brahic et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, _7_5, 6125 (1978), anvendelse av 2 nanogram pr. preparatglass av [ HjcDNA med en spesifikk aktivitet på 2x10 o cpm/mikrogram for å påvise 10 til 20 kopier av virus-RNA i en 48-60 timers hybridiseringstid. Brigati et al., Virology, 126 , 32 (1983), beskrev anvendelse av 10-20 mikroliter aliquoter med innhold av 20 mikrogram/milliliter av biotinylert DNA-probe for virus-DNA i celler med en 12-16 timers hybridiseringstid.

Undersøkelsen for tilstedeværelse av indikeringsmidlet finner sted etter adskillelse av all ureagert probe fra den mengde probe som har reagert og dannet kompleks med en komplementær sekvens. Denne adskillelse utføres vanligvis ved vask eller rensing med vann eller en annen passende væske.

Selve undersøkelsen avhenger av indikeringsmidlet bundet til proben. Der hvor indikeringsmidlet er et radio-merke, er autoradiografi eller scintillasjonstelling teknikker som er de valgte redskaper. Der merket er et enzym som anvendes for å danne et farget produkt som i noen biotinylerte prober, anvendes farge-fotomikroskopi for å tilveiebringe en varig opptegnelse av forsøket. Fluorescerende indikatorer kan også kobles til strepavidin som anvendes med en biotinylert probe for å tilveiebringe for-søket i sammenheng med fluorescens-fotomikroskopi som beskrevet av Brigati et al., Virology, 126, 32 (1983).

Et annet mål for foreliggende oppfinnelse er et diagnostisk analysesystem i form av et sett for påvisning av tilstedeværelsen av HCMV i en human, cellulær kropps-prøve som PBM, nyre eller hjerne. For PBM er et slikt analysesystem spesielt anvendelig ved sikteanalysering av blodprodukter med henblikk på HCMV forut for blodoverføring.

Systemet omfatter minst én beholder eller pakke

og innbefatter som en aktiv bestanddel, en mengde av en rekombinant,øyeblikkelig-tidlig, HCMV-avledet probe ifølge

den foreliggende oppfinnelse, som er tilstrekkelig for å reagere med og smelte sammen med komplementære nucleinsyresekvenser i prøven.

Det ovenfor beskrevne, diagnostiske system er spesielt anvendelig ved påvisning av tilstedeværelsen av en latent HCMV-infeksjon i blodprodukter. Der tilstanden av en HCMV-infeksjon er ønskelig å undersøke, er et annet diagnostisk system anvendelig.

Dette andre diagnostiske system omfatter minst to beholdere eller pakker og innbefatter som aktive bestanddeler (a) de aktive bestanddeler av det ovenfor beskrevne diagnostiske system og (b) en mengde av en rekombinant,

sen, HCMV-avledet probe ifølge foreliggende oppfinnelse, som er tilstrekkelig for å reagere med og smelte sammen med komplementære nucleinsyresekvenser i prøven.

Indikeringsmidlet for signalisering av reaksjonen mellom det rekombinante plasmid eller DNA-probe og de komplementære nucleinsyresekvenser i prøven, kan innbefatte

32 14 3 35

radioisotoper som P, C, H og S. Et annet anvendelig indikeringsmiddel er biotin, som allerede beskrevet, som kan danne en biotin-merket probe som er stabil i opptil to år når den lagres ved -20°C. Biotin-inneholdende prober er vanligvis anvendt med avidin-inneholdende, forsterkende og visualiserende reagenser, som også allerede er beskrevet. Der et indikeringsmiddel som krever ytterligere ett eller flere reagenser, som HRP, er det koblede indikeringsmiddel, kan disse ytterligere reagenser også innbefattes i systemet.

V. Resultater

A. HCMV-infeksjon i perifere, mononucleære

blodceller

De erholdte resultater ved anvendelse av en tidligere beskrevet probe og fremgangsmåte som anvender lymfocytter som den cellulære, humane kroppsprøve, viser at perifere, mononucleære blodeller fra asymptomatiske, HCMV-serumpositive og T-celle vegetativ formerings-positive donorer, syntetiserer polynucleinsyresekvenser som hybridiserer til: a) en del av genomet som er sterkt transkribert under øyeblikkelig-tidlige perioder av infeksjonen og også til b) fragmenter fra områder transkribert sent i den replikative syklus. Disse prober oppdager ikke sekvenser i uinfiserte eller HSV-infiserte fibroblaster. Andelen av blodceller som hybridiserer, varierte fra individid til individ (1/50 - 1/200), og fordi signalet ble redusert ved hydroxydion-hydrolyse og RNAase, kan det sluttes at RNA er polynucleinsyresekvensene som syntetiseres av individene hvis PBM ble undersøkt, og at RNA er polynucleinsyresekvensene som påvises av probene.

Disse observasjoner forutsetter en relativt aktiv, om enn en latent og ikke produktiv, tilstand for viruset i naturlig infeksjon og angir en rolle for en lymfocytt som et sete for opprettholdelse av HCMV-infeksjon i verten. Observasjonene beskrives i det følgende.

Undersøkelse av PBM fra åtte individer som var serumpositive overfor HCMV, og tolv som var serumnegative, ga de følgende resultater. Sterk hybridisering med pUC18-EcoRI J-proben ble funnet i 2% av PBM (flekker med innhold av IO<4>celler ble avsøkt) fra to av de åtte asymptomatisk serumpositive individer (figurer 6, feltene 1 og 5). Dette hybridiseringsnivå var vedvarende gjennom flere måneder i seks til åtte forskjellige prøver for hvert individ. Hverken vektorplasmidene pUC18 eller pUC19 (figur 6, felt 8), eller en HSV-2-probe ( BgllI-fragment C) bandt seg til disse celler. Hybridisering med den EcoRI J-inneholdende probe ble funnet i 0,03 til 1% av PBM fra de andre seks serumpositive individer.

Celler fra 11 av de 12 serumnegative individer viste ingen hybridisering til den ovenfor beskrevne HCMV-probe, men 0,1% av cellene fra det 12. individ hybridis-erte til proben. Antistoffet kan ha vært fraværende i dette individ fordi virusprotein var utilstrekkelig for å frembringe et svar, eller fordi individet ikke reagerte på dette virus. En lignende mangel på påvisbart antistoff er observert i en delmengde av pasienter som er infisert med human T-celle lymfotropisk virus, type III (som bestemt ved kultur av virus) Salahuddin et al., Lancet 1984-11,

1418 (U84) .

Behandling med 0,1M NaOH (figur 6, felt 3) eller ribonuclease (100 ug/ml, 30 minutter, 37°C) reduserte signal betydelig og viste at hybridisering primært fant sted med HCMV RNA. Varmebehandling (100°C i 2 minutter) ga ingen økning av hybridiseringssignal i PBM.

I motsetning til dette økte en lignende behandling av akutt infiserte fibroblaster signalet, formodentlig ved hybridisering av proben til denaturert virus-DNA. Dyrkning av lymfocytter fra hybridiserings-positive donorer på tillatte fibroblaster frembragte ingen cytopatiske effekter; disse resultater er i overensstemmelse med mange observasjoner som viser at HCMV-infiserte lymfocytter danner få, om noen, infektiøse virioner under slike betingelser.

For å bestemme hvorvidt en spesifikk underpopula-sjon av PBM skjulte HCMV, ble en fluorescens-aktivert celle-sorterer (FACS) anvendt for å adskille celler fra et serum-positivt (2% PBM-positivt) individ. Lymfocyttene ble farget med antistoffer som påviste de to viktigste T-celle underpopulasjoner, 0KT4 og 0KT8. Selv om denne teknikk tilveiebringer få celler, overskrider renheten av popula-sjonene 97%.

Resultater fra tre slike undersøkelser viste at

en høyere prosentdel av HCMV-hybridiserende celler bar 0KT4-markøren (2,4%) enn 0KT8-antigenet (0,8%) (figur 6,

felt 6 og 7) (i useparert blod var 44% av cellene OKT 4 og 18% var 0KT8). Denne observasjon viser ikke bare noen grad av selektivitet av HCMV-infeksjon, men bekrefter at lymfocytter, spesielt i PBM-preparatene, er infisert og inneholder HCMV RNA.

Hvorvidt HCMV RNA er til stede i andre PBM-underpopulasjoner, gjenstår å undersøkes. Foreløpige resultater tyder på at monocytter også uttrykker IE HCMV-transkripsjonen.

I en videre undersøkelse ble PBM fra normale HCMV-serumpositive donorer erholdt i en tidsperiode på et år og undersøkt for å bestemme hvorvidt hybridiseringsnivåer ved anvendelse av en EcoRI J-fragment-inneholdende. probe, holdt seg stabile for et gitt individ, eller varierte med tiden. Som det kan sees i figur 9, viste PBM fra to donorer (G og R) ingen hybridisering og ingen forandring i løpet av den undersøkte tidsperiode. PBM fra donor S for-ble på et forholdsvis høyt hybridiseringsnivå, mens PBM

fra donor P startét med en forholdsvis høy prosentdel av hybridiserende celler og gikk deretter tilbake til et upåvisbart nivå ved slutten av undersøkelsesperioden. PBM fra donor B viste et økende antall av hybridiserende celler.

Faktorene som kontrollerer disse forandringer, er stadig under undersøkelse. Til tross for de ukjente variasjons-kontrollerende faktorer, viser de fremlagte resultater i denne avdeling videre at serumpositivitet eller serumnegativitet alene ikke tilveiebringer en fullstendig beskrivelse av HCMV-sykdomstilstanden.

Den tidligere beskrevne probe er også vist å påvise polynucleotider i HCMV-infiserte fibroblaster. Proben påviste ikke et polynucleotid i uinfiserte eller HSV-infiserte fibroblaster.

B. Sammenligning av øyeblikkelig-tidlig og sen RNA-transkripsjon av HCMV- gener i nyre Nyrebiopsier ble innhentet under forløpet av nyre-transplantasjonsterapi av HCMV-serumnegative transplanta-sjonsmottagere. Disse biopsiprøver ble sorteringsanalysert med henblikk på øyeblikkelig-tidlig og sen HCMV RNA-transkripsjoner ved in situ hybridisering.

Som vist i tabell 1, utviser ikke donornyrer før transplantering ("Pre-transplantasjon") reaktivitet innen noen av de anvendte prober. Omkring 1 måned etter implan-tering ("Post-transplantasjon") spredte imidlertid HCMV- infeksjonen seg inn i nyren og ble påvist på forskjellig måte avhengig av den anvendte probe. Videre ble HCMV-infisert vev påvist i forhold mellomøyeblikkelig-tidlig og sen som var forskjellig fra det tidligere mønster av påviselig infeksjon etter 2 til 3 uker med eksperimentell anti-HCMV-terapi ved anvendelse av utforskningsmedikamentet "Foscarnet" ("Post-Foscarnet").

^Hybridiseringsintensitet-skala = 0 (intet signal) til ++++ (mest intens), målt ved antall infektiøse sentre i et gitt mikroskopisk prøvefelt. Vevsprøver ble erholdt fra pasienter og preparert som beskrevet i avsnittet for materialer og metoder.

<2>Prober: RIJ = EcoRI J-fragment fra det HCMV-øyeblikkelig-tidlige gen; pCM3 = EcoRI A-D-fragmenter fra det HCMV-sene gen; pUC = pUC18 plasmidkontroll.

3"-" angir at ingen prøve er avgitt for undersøkelse fra denne pasient.

4"N.D." angir en prøve som ikke er undersøkt, således ingen data.

I løpet av tid kan mønsteret av øyeblikkelig-tidlig og sen probereaktivitet forskyve seg avhengig av pasienten. I spesielle tilfelle utviser infiserte nyrer også en sterkere reaktivitet med øyeblikkelig-tidlig probe enn med sen probe, mens i andre tilfeller observeres det motsatte.

Denne praktiske utforming med påvisning av HCMV ved hjelp av en kombinasjon av øyeblikkelig-tidlig og sen probe, antydes av de ovenfor beskrevne data, i hvilke noen få tilfeller viser hybridisering til én probe, men liten eller ingen hybridisering med den andre. Se f.eks. pasient E "Pre-Foscarnet", eller pasientene C og G "Post-

Foscarnet".

Eksempler på graden av hybridisering og omfanget av HCMV-infeksjon i disse nyrebiopsier er vist i figur 7. Tynnsnitt fremstilt fra HCMV-infiserte pasienter ved "Pre-Foscarnet"-stadiet, ble in situ hybridisert til enten HCMV øyeblikkelig-tidlig (ramme A), sen (ramme B) eller ikke-HCMV kontrollprobe (ramme C). Ramme A inneholder den høyeste grad av hybridisering (++++), ramme B inneholder mindre (+++), og ramme C viser ingen hybridisering.

Disse data angir at selv om prober fra enten øyeblikkelig-tidlige eller sene HCMV-gener er effektive til påvisning av HCMV RNA-transkripsjoner, foretrekkes en kom-binert modalitet som anvender både øyeblikkelig-tidlige og sene HCMV-prober hvor målet er å påvise HCMV-infeksjon, snarere enn å skjelne tillatt fra latent HCMV-infeksjon.

C. HCMV-infeksjoner i hjerne er påviselig

ved hjelp av in situ hybridisering

Tynnsnitt av paraffin-innstøpt hjernevev ble analysert ved in situ hybridisering under anvendelse av den øyeblikkelig-tidlige HCMV-genprobe, EcoRI J, som beskrevet

i det etterfølgende. Som vist i figur 8, viste hjernevev som ble analysert på denne måte, tallrike celler med tette bunnfall av sølvkorn. Disse celler var mest konsentrert ved randen av det periventrikulære område, men ble også ; funnet dypere inn i hjernen. Kontrollhybridiseringer i hvilke proben gjenkjente HSV-genene, var ensartet negative, noe som også var tilfelle med hybridiseringer med anvendelse av CMV-proben på snitt fra normale hjerner.

VI. Materialer og metoder

A. HCMV- infiserte kulturer og vev

CMV-stamme AD169 (ATCC VR-538) ble oppbevart i

Flow 5000 fibroblaster (Flow Laboratories; McLean, VA) som beskrevet av Nelson et al., J. - Virol., 4_3, 83 (1982), innbefattet heri ved referanse. Til anvendelse ved infeksjon av fibroblaster ble infiserte fibroblaster sonikert, det cellulære avfall ble fjernet ved sentrifugering, og den flytende fase som inneholdt viruset, ble tilsatt uinfiserte kulturer ved et flerfold av infeksjon (MOI)

på omtrent 3:1. Infiserte og uinfiserte fibroblaster ble anvendt som kontroller for in situ hybridisering og ble behandlet på lignende måte som lymfocyttene. Humane, perifere, mononucleære blodceller (PBM) ble erholdt fra normale serumpositive og serumnegative donorer, og ble isolert på "Ficoll-Hypaque"-gradienter.

Serumpositivitet ble bestemt ved en enzym-bundet immunosorbent analyseteknikk (ELISA) med anvendelse av tørkede, infiserte fibroblaster som antigen, som beskrevet i Rice et al., J. Infect. Dis., 147, 1055 (1983). Serum som ga dobbelt så stor respons (med enheter målt som optisk tetthet) på HCMV-infiserte, sammenlignet med uinfiserte, fibroblaster, ble definert som serumpositive overfor CMV. Vegetativ formering av T-celler i forhold til HCMV (2x bakgrunn) etter 5 dagers dyrking var i samsvar med resultatene fra ELISA. PBM erholdt på denne måte, kan anvendes direkte og utspres på objektglass for in situ hybridisering, eller de kan dyrkes for senere anvendelse, eller de kahvidere adskilles ved hjelp av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) som beskrevet herunder.

Adskillelse av PBM-cellepopulasjoner ved hjelp av FACS i underpopulasjoner ble utført ved anvendelse av biotinylert 0KT4- eller 0KT8-antistof f (Beckton-Dickinson, Mountain View, CA). Kort beskrevet, 2x10 PBM ble vedlike-holdt i omtrent 40 minutter ved 0°C i antistoff fortynnet 1:10 i fosfatbufret saltvann (PBS) ved omtrent 1x10<7>celler/ml. Celler ble vasket to ganger i PBS som på forhånd var avkjølt til 0°C og ble deretter inkubert i 30 minutter i fluorescerende isothiocyanat-koblet avidin (Becton-Dickinson) ved en fortynning på 1:50 i PBS. Celler ble deretter vasket i PBS, resuspendert i 3 ml PBS og sortert på et FACS ruteinndelt sett for å velge ut bare de meget sterkt fargede celler (Oldstone et al., Virology, 127, 426

(1983)). Celler erholdt på denne måten ved hjelp av FACS, ble deretter anvendt for in situ hybridisering på en lignende måte som lymfocyttene.

Formalinpreparerte og paraffin-innstøpte hjernevevs-prøver ble innhentet ved autopsi fra en pasient som led av AIDS, og ble tilveiebragt av dr. CA. Wiley (Dept. of Pathology, University of California, San Diego, CA). Formalinpreparerte og paraffin-innstøpte nyrebiopsier ble innhentet fra pasienter som gjennomgår nyretransplantasjons-terapi og ble tilveiebragt av dr. Lars Olding (Patologi-avdelingen, Karolinska Institituttet, Stockholm, Sverige). Transplantasjonsterapi innbefattet behandling, etter nyre-implantasjon, med utforskningsmedikamentet fosfonoformat (Foscarnet).

B. Hybridisering

In situ hybridisering ble utført ved modifiserte fremgangsmåter ifølge Brahic et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 7_5, 6125 (1978) og Angerer et al., Nucleic Acids Res., 9, 2819 (1981).

Kort beskrevet ble humane, perifere, mononucleære blodceller erholdt fra normale serumpositive og serumnegative donorer, og ble isolert på "Ficoll-Hypaque"-gradienter.

Celler som skulle anvendes direkte, ble vasket tre ganger i PBS, justert til 10x10^ celler pr. milliliter, og mengder på 5 til 10 mikroliter ble utspredt på syre-rensede, polylysin-overtrukne objektglass, fremstilt som beskrevet i det følgende. Objektglass ble deretter vedlike-holdt i luft i en tidsperiode tilstrekkelig for de utspredte celler for å tørke. Lufttørkede celler på objektglass ble deretter preparert i 15 minutter med perjodat-lysin-para-formaldehyd (PLP) som beskrevet i McLean et al., J. Histo-chem. Cytochem. , 22^, 1077 (1974), renset to ganger i PBS, dehydrert ved vaskinger med graderte forhold av vann til ethanol opp til 95% ethanol, og lagret ved 4°C.

Mikroskop-objektglass ble syrerenset og polylysin-overtrukket for anvendelse som substrat for å underholde prøver til in situ hybridisering. Kort beskrevet, ble objektglass bløtet opp 4 til 24 timer i kromsyre i fargings-stativ av rustfritt stål. Etter rengjøring ble objektglassene renset i 4 timer med springvann og deretter vasket tre ganger i avionisert vann. Rengjorte og rensede objektglass ble bløtet opp i 30 minutter i 0,01% polylysin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO #P7886), renset tre ganger i destillert vann, tørket ved 37°C og bakt ved 80°C

i 1 time.

Vevsnitt av paraffin-innstøpt nyre eller hjernevev ble preparert for in situ hybridisering ved å snitte opp prøven i tykkelser på omkring 5 til 10 mikrometer. De dannede tynnsnitt ble anbragt flytende på destillert vann som holdt 45°C og som inneholdt 1,0% av Elmers hvitt lim.

De flytende prøver ble plukket opp ved anvendelse av de polylysin-overtrukne objektglass og lufttørket over natten.

Som en videre preparering for in situ hybridisering ble prøvene hydrert og permeabilisert. Vevsnitt ble avparaffinisert ved vask med xylen tre ganger i 10 minutter hver. Alle prøver, enten de er preparerte PBM, fibroblaster eller snitt, ble deretter rehydrert ved vaskinger i graderte forhold av ethanol til vann i omtrent 1 minutt pr. vask i de følgende serier: 100%, 95%, 70%, 50% og 30%, hvori alle oppløsninger med unntak av 100% ethanol inneholdt 0,33 M ammoniumacetat.

Prøver ble preparert for permeabilisering ved å vaskes to ganger i destillert vann i omtrent 1 minutt hver, deretter en vask i 0,2 M HC1 i omtrent 10 minutter, ytterligere to vaskinger i destillert vann som nevnt ovenfor, deretter én vask i 1% "Triton" X-100 [polyoxyethylen (9)-octylfenyl ] i 1,5 minutter, og sluttelig 2 skyllinger i destillert vann i 1 minutt hver, hvori alle skyllinger beskrevet ovenfor, ble utført ved romtemperatur. Fibroblaster og tynnsnitt, men ikke PBM-prøvene, ble deretter behandlet med proteinase K (1 mikrogram/ml i 20 mM Tris-HCl og 2 mM CaCl2> i 20 minutter ved 37°C, og ble deretter bløtet opp i 4 minutter i PLP ved romtemperatur. Alle prøver ble deretter vasket i PBS-glycin (2 gram/liter glycin), vasket en gang i PBS og gradvis dehydrert til omtrent 100% ethanol, ved hvilken tid prøvene er ferdige for tilsetning av hybridiserings-probeblanding.

Hybridiserings-probeblandingen besto av 50% avionisert formamid, 5X Denhardts oppløsning, 5X hybridiser-ingssalter (0,9 M NaCl, 50 mM NaH2P04 og 5 mM EDTA),

10% dextransulfat, heparin (30 enheter/ml), 0,1% "Triton" X-100, laksespermie-DNA (500 mikrogram/ml) og BHK celle-

RNA (250 mikrogram/ml).<35>S-merkede prober ble tilsatt til en konsentrasjon av 0,25 til 0,5 mikrogram/ml (1x10 g cpm/ mikrogram), og hele blandingen ble kokt i 2 minutter og deretter avkjølt på is. Dithiothreitol ble deretter tilsatt til en konsentrasjon av 10 mM.

Oppløsningen ble plassert på de ovenfor beskrevne, preparerte celler, dekket med tynne plater eller dekk-remser av "Gel-bond" (FMC Corporation, Rockland, ME), og forseglet med gummilim. Hybridisering ble utført ved inkubering (blanding og vedlikehold) av celleprobe-blandingen i 18 timer ved 37°C i et fuktet kammer.

Etter inkubering ble dekkstrimlene fjernet, og objektglassene ble vasket med: 2X SSC (0;3 M NaCl, 0,03 M natriumcitrat) i 30 minutter ved 21°C, 30 minutter med IX SSC ved 21°C, 10 minutter med 0,1X SSC ved 60°C, 20 minutter med 0,1X SSC ved 37°C og 5 minutter med 2X SSC. Cellene ble deretter dehydrert ved anvendelse av ethanol og tørket. Objektglassene ble dyppet i Kodak NTB-2-emulsjon, eksponert i 3-4 dager ved 4°C og deretter fremkalt med Kodak D19 fremkaller og standard fikseringsmiddel. Der hvor det angis, ble prøvene deretter motfarget med hematoxylin.

C. Plasmider

Plasmider ble dyrket enten i verten (ATCC 33694) bakterie E. coli HB101 for pHC79, eller E. coli JM83

(ATCC 35607). Plasmider pUC18 og pUC19 var gaver fra dr. R. Gelinas (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA). Plasmid pACYC184 ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, MD, #37033), og "Riboprobe" vektor pSP65 ble erholdt fra Promega Biotec, Madison, WI. Celler som inneholdt plasmider, ble dyrket i Luria-buljong [1,0% tryptonbuljong (Difco Laboratories), 0,5% gjærekstrakt (Difco) og 1,0% natriumklorid] og ble forøket under logaritmisk vekst ved tilsetning av kloramfenicol (170 mikrogram pr. ml) pr. milliliter av Luria-buljong (LB).

Dyrkningsmediet innbefattet rutinemessig antibio-tika for å opprettholde selektivt trykk på de tilstedeværende plasmider i deres vertsbakterie, og valget av anti-biotika, avhenger av det dyrkede plasmid. E. coli som inneholdt plasmide vektorer pUC18, pUC19 og pSP65, ble dyrket i den foran beskrevne L-buljong som inneholdt 100 mg/ml ampicillin, og E. coli som inneholdt pACYC184, ble dyrket på lignende måte med unntak av at 25 mg/ml tetracyclin ble anvendt.

Plasmid DNA ble fremstilt ved en modifikasjon av den alkaliske lyse-fremgangsmåte [Birnboim et al.->

Nucleic Acids Res., 1_, 1513 (1979)], og ble videre renset ved likevektssentrifugering gjennom cesiumklorid-gradienter som inneholdt ethidiumbromid.

Ligering av virusfragmentene og transformering av bakteriene med ligert plasmid ble utført som beskrevet av Jahn et al., J. Virol., 4_9, 363 (1984), og Nelson et al., J. Virol. , 4_3 , 83 (1983) . Hver virus-DNA-innsetning ble identifisert etter endonucleasefordøyelse ved hjelp av elektroforetisk comigrering med fordøyelsesprodukter av kosmid-klonet virus-DNA ifølge fremgangsmåten beskrevet av Fleckenstein et al., Gene, 18, 39 (1982), og ble bekreftet ved "Southern blot"-hybridiseringer til forskjellige DNA-fragmenter av virion-DNA ifølge fremgangsmåten til Southern, E. M., J. Mol. Biol., 98, 503 (1975).

1) Kloning av EcoRI J- fragmentet

Under henvisning til figur 3 ble EcoRI J-fragmentet subklonet fra Hindlll E-fragmentet av HCMV-stamme AD169 ved fordøyelse av DNA tilhørende plasmid vektor pJN201 (beskrevet nedenfor) med restriksjonsendonucleasen EcoRI (New England Biolabs, Inc., Beverly, ME), isolering av DNA fra lavtsmeltende agarose (Bethesda Research Laboratories, Life Technologies, Inc., Gaithersberg, MD; heretter benevnt BRL), og ligering av det omtrent 10 kb J-fragment-DNA inn i EcoRI-setet av enten den plasmide vektor pACYC184 eller pUC18 under dannelse av plasmide vektorer EcoRI J-5018 og EcoRI J-pUC18.

Plasmid pJN201 er en sammensetning av HindiII E HCMV-fragmentet ligert inn i plasmid pHc79 som er tilgjengelig fra BRL og ble fremstilt som beskrevet i Nelson et al., J. Virology, 4^3 , 83 (1982). Oppbygningen av pACYC184-plasmidet er beskrevet i Chang et al., J. Bac-teriol. , 134 , 1141 (1978), som er innbefattet heri ved referanse. Dette plasmid er tilgjengelig fra ATCC som 37033. Plasmidene pUC18 og pUC19 er også tilgjengelige fra BRL.

EcoRI er en restriksjonsendonuclease isolert fra Escherichia coli RY13 som gjenkjenner og spalter det følg-ende sete i en nucleotidsekvens: G AATTC. I overensstemmelse med konvensjonelle regler skrives nucleotidsekvenser fra venstre mot høyre og i retningen fra 5'-enden til 3<1->enden.

Bakterier som inneholder den pACYC184 rekombinante, plasmide vektor EcoRI J-5018, ble dyrket i LB-media som inneholdt 25 mikrogram pr. milliliter (mikrogram/ml) tetracyclin, mens de bakterier som inneholder pUC18 rekombinante vektorer, ble dyrket i media som inneholdt 100 mikrogram/ml ampicillin.

2) PstIm- pUC18 og 1, 9 BglII- BamHI- pUC18- kloner

Igjen under henvisning til figur 3 ble Pstl m-fragmentet inneholdende omtrent 1,8 kb, subklonet fra

EcoRI J-fragmentet av HCMV-stamme AD169 ved fordøyelse av EcoRI J-pUC18-plasmidet med Pstl (New England Biolabs, Inc., Beverly, Maine), isolering av 1,8 kb DNA-fragmentet betegnet "m", og ligering av Pstl m DNA-fragmentet inn i Pstl-setet av ytterligere pUC18 under dannelse av det rekombinante Pstl m-pUC18.

Pstl er en restriksjonsendonuclease isolert fra Providencia stuartii 164 som gjenkjenner og spalter det følgende sete i en nucleotidsekvens: CTGCA G.

Det 475 bp BgllI- BamHI-fragment ble subklonet fra EcoRI J-fragmentet av den EcoRI J-pUC18 plasmide vektor

ved fordøyelse av den klonede vektor-DNA med endonucleasene Bglll og BamHI (New England Biolabs, Inc.). 475 bp-fragmentet ble isolert og ligert inn i BamHI-setet av polykjederen av enda mer pUC18 under dannelse av det 1,9 BglII- BamHI-pUC18 plasmid.

Bglll er en restriksjonsendonuclease som er isolert fra Bacillus globigii som gjenkjenner og spalter de følg-ende nucleotidsekvenser: A GATCT. V. Pirrotta, Nucleic Acids Res., 3, 1747 (1976).

Under henvisning til figur 3 ble det omtrent

4,2 kb BamHI- EcoRI-fragment subklonet fra EcoRI J-fragmentet av den EcoRI J-pUC18 plasmide vektor ved fordøyelse av den klonede vektor-DNA med endonucleasene BamHI og EcoRI. 4,2 kb-fragmentet ble isolert og ligert inn i BamHI- og EcoRI-setene av pUC19 under dannelse av det rekombinante pIE BamHI-RI.

BamHI er en restriksjonsendonuclease isolert fra Bacillus amyloliquefaciens H som gjenkjenner og spalter det følgende sete i en nucleotidsekvens: G GATCC. Roberts et al., Nature, 265, 82 (1977).

3) Oppbygning av pSP65 1, 9 Bglll- BamHI

Det pSP65-l,9 BgllI- BamHI-plasmid er oppbygd ved fordøyelse av 1,9 BglII- BamHI-pUC18-plasmidet med EcoRI

og Pstl. Det dannede fragment inneholder 475 bp Bglll-

BamHI-fragmentet og likeledes relativt korte sekvenser

fra polykjederen på hver side av BamHI-setet. Det dannede fragment som inneholder omtrent 515 basepar, er isolert og ligert inn i EcoRI- og Pstl-setene av "Riboprobe" pSP65. Den dannede, plasmide vektor, betegnet pSP65-l,9 Bglll-BamHI, er linearisert og transkribert med RNA-polymerase

3 5 3 2

under tilstedeværelse av 5'-alfa- S-eller alfa- p-merkede ribonucleotider under dannelse av en radiomerket RNA-probe.

4) Oppbygning av pCMBamR- klonet

Under henvisning til figur 5 ble BamHI R-fragmentet av HCMV-stamme AD169 subklonet fra kosmidet pCM3, beskrevet av Fleckenstein et al., Gene, JL8 , 39 (1982), og inneholdende EcoRI A pluss D (A-D)-fragmentene klonet i kosmid pHC79, ved fordøyelse av klonet med BamHI. 6,6 kb BamHI-fragmentet ble isolert og ligert inn i BamHI-setet av pUC19 under dannelse av den plasmide vektor med betegnelse pC MBam R. BamHI-fragmentet ble vist av Nowak et al., Virology, 134, 91-104 (1984), å kode for de 61K og 71K sene polypeptider. (Se figur 1).

D. Polynucleotidprober

Polynucleotidprober av DNA ble fremstilt fra de ovenfor beskrevne plasmider som følger. En passende plasmid vektor ble nick-translatert etterfulgt av frem-gangsmåtene ifølge Rigby et al., J. Mol. Biol., 113, 237

(1977), ved inkorporering av 5'-[alfa- 3 5S-thio Jdeoxy-adenosin-trifosfat og 5'-[alfa- 3 5S-thio]deoxycytosin-trifosfat (650 Ci/mM) (Amersham Corp., Arlington Heights, IL). DNA polymerase I ble anskaffet fra New England Biolabs Inc., Beverly, MA.

Det dannede nick-translaterte DNA ble adskilt fra nucleotidene ved hjelp av roteringskolonner (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) som ble rotert i 2 minutter og deretter passering gjennom "Sephadex G-50 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) ved 1200xg. Ved anvendelse av EcoRI J-pUC18-proben som eksempel, ble en spesifikk aktivitet på 1x10 g cpm pr. mikrogram DNA erholdt.

Kontrollprober ble på lignende måte fremstilt fra plasmid pUC18 eller et plasmid med innhold av Bglll C-fragmentet fra HSV-2-stamme 333. Dette fragment korresponderer til HSV-genomet ved omkring 0,43 til omkring 0,58 kartenheter som beskrevet av Jariwalla et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77, 2279 (1980).

De foregående beskrivelser er tilsiktet å være illustrerende til den foreliggende oppfinnelse, men er ikke begrensende. Tallrike variasjoner og modifikasjoner kan gjennomføres uten å fjerne seg fra ånden og rammen til oppfinnelsen.

Claims (14)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant HCMV-avledet plasmid, karakterisert ved: (a) fordøyelse av HindiII E-fragmentet av genomet av en HCMV-stamme med restriksjonsendonuclease EcoRI for å tilveiebringe fragmenterte, lineære DNA-segmenter som innbefatter et EcoRI J-fragment som inneholder omkring 10 kb; og (b) ligering av EcoRI J-fragmentet inn i EcoRI-setet av et plasmid for å tilveiebringe et rekombinant HCMV-avledet plasmid.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant HCMV-avledet plasmid, karakterisert ved: (a) tilveiebringelse av et første rekombinant HCMV-avledet plasmid som inneholder det omtrent 10 kb EcoRI J-fragment av HCMV-genomet; (b) fordøyelse av EcoRI J-fragmentdelen av det første rekombinante HCMV-avledede plasmid med restriksjonsendonuclease Pstl for å tilveiebringe fragmenterte, lineære DNA-segmenter, innbefattet et Pstl m-fragment som inneholder omtrent 1,8 kb; og (c) ligering av Pstl m-fragmentet inn i Pstl-setet av et plasmid for å tilveiebringe et andre rekombinant HCMV-avledet plasmid.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant HCMV-avledet plasmid, karakterisert ved: (a) tilveiebringelse av et første rekombinant HCMV-avledet plasmid som inneholder det omtrent 10 kb EcoRI J-fragment av HCMV-genomet; (b) fordøyelse av EcoRI J-fragmentdelen av det første rekombinante HCMV-avledede plasmid med restriksjons endonucleaser Bglll og BamHI for å tilveiebringe fragmenterte, lineære DNA-segmenter innbefattet et omkring 475 bp BglII- BamHI-fragment; og (c) ligering av BgllI- BamHI-fragmentet inn i BamHI-setet av et polykjeder-sete-inneholdende plasmid, for å tilveiebringe et andre rekombinant HCMV-avledet plasmid.

4. Fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant HCMV-avledet plasmid, karakterisert ved: (a) tilveiebringelse av et første rekombinant HCMV-avledet plasmid som inneholder det omtrent 475 bp BgllI- BamHI-fragment av EcoRI J-fragmentet av HCMV-genomet ligert inn i et polykjedersete av plasmidet, polykjeder-setet innbefatter restriksjonsendonuclease-spaltningsseter for BamHI-, Bglll-, EcoRI- og Ps_tl-restriks jonsendonuclease; (b) fordøyelse av det første rekombinante plasmid med restriksjonsendonucleaser EcoRI og Pstl for å tilveiebringe fragmenterte, lineære DNA-segmenter innbefattet et EcoRI-Pstl-fragment som inneholder BgllI- BamHI-fragmentet; og - (c) ligering av EcoRI- Psti-fragmentet inn i hhv. EcoRI- og Pstl-setene av et plasmid under dannelse av et andre rekombinant HCMV-avledet plasmid.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant HCMV-avledet plasmid, karakterisert ved: (a) tilveiebringelse av et første rekombinant HCMV-avledet plasmid som inneholder den omtrent 10 kb EcoRI J-fragmentdelen av HCMV-genomet; (b) fordøyelse av EcoRI J-fragmentdelen av det første rekombinante HCMV-avledede plasmid med restriksjonsendonucleaser BamHI og EcoRI for å tilveiebringe fragmenterte, lineære DNA-segmenter innbefattet et BamHI- EcoRI-fragment som inneholder omtrent 4,2 kb; og (c) ligering av det omtrent 4,2 kb BamHI- EcoRI-fragment inn i hhv. BamHI- og EcoRI-setene av et plasmid under dannelse av et andre rekombinant HCMV-avledet plasmid.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant HCMV-avledet plasmid, karakterisert ved: (a) tilveiebringelse av et første rekombinant HCMV-avledet plasmid som inneholder de omtrent 33 kb A-pluss D-fragmenter av en HCMV-stamme; (b) fordøyelse av A-pluss D-fragmentdelene av det første rekombinante plasmid med restriksjonsendonuclease BamHI for å tilveiebringe fragmenterte, lineære DNA-segmenter innbefattet BamHI R-fragmentet som inneholder omtrent 6,6 kb; og (c) ligering av det omtrent 6,6 kb BamHI R-fragment inn i BamHI-setet av et plasmid for å danne et andre rekombinant HCMV-avledet plasmid.

7. Rekombinant HCMV-avledet plasmid som inneholder en HCMV-avledet sekvens,karakterisert vedat den vesentlig består av en sekvens utvalgt fra gruppen som består av det omtrent 10 kb EcoRI J-fragment av HindiII E-fragmentet av HCMV-genomet, det omtrent 1,8 kb Pstl-fragment av EcoRI J-fragmentet av HCMV-genomet, det omtrent 4,2 kb BamHI- EcoRI-fragment av EcoRI J-fragmentet av HCMV-genomet, det omtrent 475 bp BamHI- BglII-fragment av EcoRI J-fragmentet av HCMV-genomet, og det omtrent 6,6 kb BamHI R-fragment av EcoRI A-pluss D-fragmentet av HCMV-genomet.

8. Diagnostisk analysesystem for påvisning av tilstedeværelse av HCMV i en human, cellulær kroppsprøve,karakterisert vedat systemet innbefatter som en aktiv bestanddel i minst én beholder, en mengde av en indikeringsmiddel-bundet, rekombinant HCMV-avledet poly nucleotidprobe som i sekvens korresponderer med et øyeblikkelig-tidlig proteingen som er tilstrekkelig for å reagere med og smelte sammen med en komplementær nucleinsyresekvens i prøven.

9. Diagnostisk system ifølge krav 8,karakterisert vedat proben inneholder det omtrent 10 kb EcoRI J-fragment av HindiII E-fragmentet.

10. Diagnostisk system ifølge krav 8,karakterisert vedat det videre innbefatter en andre beholder som inneholder, som aktiv bestanddel, en mengde indikeringsmiddel-bundet, rekombinant HCMV-avledet polynucleotidprobe som i sekvens tilsvarer et sent proteingen som er tilstrekkelig for å reagere med og smelte sammen med en komplementær nucleinsyresekvens i prøven.

11. Fremgangsmåte for påvisning av en latent, human cytomegalovirusinfeksjon i en human prøve av PBM,karakterisert vedde følgende trinn: (a) blanding av en human, cellulær kroppsprøve med en mengde av en indikeringsmiddel-bundet, rekombinant HCMV-avledet polynucleotidprobe som i sekvens tilsvarer et øyeblikkelig-tidlig proteingen, eller et sent proteingen, som er tilstrekkelig for å reagere med og smelte' sammen med en komplementær nucleinsyresekvens i prøven; (b) vedlikeholdelse av blandingen under hybridiseringsbetingelser i en tidsperiode som er tilstrekkelig for proben til å reagere med og smelte sammen med komplementære polynucleinsyrer i cellene til prøven, og danne et kompleks; (c) adskillelse av komplekset av sammensmeltet probe og komplementær polynucleinsyre fra enhver ukompleks probe; og (d) analysering med henblikk på tilstedeværelse av komplekset.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11,karakterisert vedat proben tilsvarer et øyeblikkelig-tidlig proteingen, og at proben vesentlig består av en polynucleinsyresekvens utvalgt fra gruppen bestående av den omtrent 10 kb sekvens av EcoRI J-fragmentet av HCMV-genomet, det omtrent 1,8 kb Pstl m-fragment av EcoRI J-fragmentet av HCMV-genomet, det omtrent 4,2 kb BamHI- EcoRI-fragment av EcoRI J-fragmentet av HCMV-genomet, og det omtrent 475 bp BamHI- BgllI-fragment av EcoRI J-fragmentet av HCMV-genomet.

13. Fremgangsmåte^ifølge krav 11,karakterisert vedat den humane kropps-prøve er en vevsprøve, en første vevsprøve blandes sammen med en probe som i sekvens tilsvarer et øyeblikkelig-tidlig proteingen, og en parallell, andre vevsprøve blandes sammen med en probe som i sekvens tilsvarer et sent proteingen som vesentlig består av det omtrent 6,6 kb BamHI R-fragment fra A pluss D EcoRI-fragmentet av HCMV-genomet .

14. Polynucleotidprobe,karakterisert vedat den vesentlig består av en rekombinant polynucleotidsekvens av et HCMV-avledet, øyeblikkelig-tidlig gen eller et sent gen koblet til et indikeringsmiddel, den øyeblikkelig-tidlige genprobe består vesentlig av en sekvens utvalgt fra gruppen bestående av det omtrent 10 kb EcoRI J-fragment av Hindlll E-fragmentet av HCMV-genomet, det omtrent 1,8 kb Pstl-fragment av EcoRI J-fragmentet av HCMV-genomet, det omtrent 4,2 kb BamHI- EcoRI-fragment av EcoRI J-fragmentet av HCMV-genomet, og det omtrent 475 bp BamHI- BglII-fragment av EcoRI J-fragmentet av HCMV-genomet, og hvori den sene genprobe vesentlig består av det omtrent 6,6 kb BamHI R-fragment av EcoRI A-pluss D-fragmentet av HCMV-genomet.